JPH11501003A - ノンタイプアブルヘモフィルスの高分子量表面タンパク - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 免疫原性を示すノンタイプアブルヘモフィルスインフルエンザ菌の高分子量表面タンパクおよびこれをコード化する遺伝子を記載している。特には、２個の免疫優性高分子量タンパク、ＨＭＷ１およびＨＭＷ２、をコードする遺伝子をクローンし、発現させ、配列決定し、一方では、高分子量タンパク、ＨＭＷ３およびＨＭＷ４、をコードする遺伝子をクローンし、発現させ、配列決定した。

Description

【発明の詳細な説明】 ノンタイプアブルヘモフィルスの高分子量表面タンパク 発明の分野 本発明は、ノンタイプアブルヘモフィルスの高分子量タンパクに関する。 発明の背景 ノンタイプアブルヘモフィルスインフルエンザ(non-typeable Haemophilus in fluenzae)菌は、既知のヘモフィルスインフルエンザ莢膜抗原に対する抗血清と の反応性の欠如により定義される非被包生物体である。 これらの生物体は、通常ヒトの上部気道に存在し、感染症、例えば中耳炎、副 鼻孔炎、結膜炎、気管支炎および肺炎感染の原因となることが多い。これらの生 物体は、多糖類莢膜を持たないので、Ｈｉｂ細菌莢膜多糖類に対する現在のヘモ フィルスインフルエンザ菌タイプｂ（Ｈｉｂ）ワクチンによってはコントロール されない。しかし、ノンタイプアブル菌株は、細菌の抗体を誘発ができる表面抗 体を生産する。２種の主要な外膜タンパクであるＰ２およびＰ６がヒト血清殺菌 活性の目標として同定されている。しかし、Ｐ２タンパクの配列には変動があり 、特にノンタイプアブルヘモフィルス株に著しいことが知られている。このよう に、Ｐ２ベースのワクチンは、生物体のすべての菌株に対して防御を与えるとは 限らない。 これまで、バレンカンプら（Barenkamp，et al.，Pediatr．Infect．Dis．J. ，9:333-339，1990）は、ヒトの回復期血清中に存在する抗体の主要な目標と考 えられる一群の高分子量（ＨＭＷ）タンパクが同定している。一連の中耳単離体 を試験すると、大部分の菌株において１種または２種のこのようなタンパクの存 在が明らかになった。しかし、本発明以前に、これらのタンパクの構造は、かか るタンパクの純粋な単離体としては知られていない。 発明の要旨 発明者たちは、高分子量（ＨＭＷ）ヘモフィルスタンパクの特性をさらに検討 して、基本型のノンタイプアブルヘモフィルス株から、２種の免疫優性ＨＭＷタ ンパク（ＨＭＷ１およびＨＭＷ２と称する）をクローン化、発現およびコーディ ングする遺伝子を配列決定し、また、別のノンタイプアブルヘモフィルス株から 、２種の免疫優性ＨＭＷタンパク（ＨＭＷ３およびＨＭＷ４と称する）をクロー ン化、発現およびコーディングする遺伝子を殆ど完全に配列決定した。 従って、本発明の一つの実施例では、ノンタイプアブルヘモフィルス株、特に タンパクＨＭＷ１、ＨＭＷ２、ＨＭＷ３およびＨＭＷ４をコーディングする遺伝 子、ならびにノンタイプアブルヘモフィルス株による起こされる疾患に対して免 疫能力を有するタンパクの変異体または断片を精製、単離したコーディングする 遺伝子を提供する。他の実施例では、本発明は、これらの遺伝子でコード化され たノンタイプアブルヘモフィルスインフルエンザ菌の高分子量タンパクを提供す る。 図面の簡単な説明 図１は、タンパクＨＭＷ１をコーディングする遺伝子のＤＮＡ配列である（配 列番号１）。 図２は、タンパクＨＭＷ１の誘導アミノ酸のＤＮＡ配列である（配列番号２） 。 図３は、タンパクＨＭＷ２をコーディングする遺伝子のＤＮＡ配列である（配 列番号３）。 図４は、タンパクＨＭＷ２の誘導アミノ酸のＤＮＡ配列である（配列番号４） 。 図５Ａは、ＨＭＷ１またはＨＭＷ２構造遺伝子を含む代表的な組換えファージ の制限酵素切断地図であり、構造遺伝子の位置は、影付きの棒で示してある。 図５Ｂは、Ｔ７発現ベクターｐＴ７−７の制限酵素切断地図である。 図６は、ヌクレオチド３５１〜４９５８（ＯＲＦａ）（図１参照）から成るｈ ｍｗ１遺伝子の遺伝子集団のＤＮＡ配列（配列番号５）、ならびにＯＲＦ ｂ ：ヌクレオチド５１１４〜６７４８およびｃ：ヌクレオチド７０６２〜９０１１ を含む３’隣接領域内の２種の別の下流遺伝子である。 図７は、ヌクレオチド７９２〜５２２２（ＯＲＦａ）（図３参照）から成るｈ ｍｗ２遺伝子の遺伝子集団のＤＮＡ配列（配列番号６）、ならびにＯＲＦ ｂ： ヌクレオチド５３７５〜７００９およびｃ：ヌクレオチド７２４９〜９１９８を 含む３’隣接領域内の２種の別の下流遺伝子である。 図８は、タンパクＨＭＷ３をコーディングする遺伝子の部分ＤＮＡ配列である （配列番号７）。 図９は、タンパクＨＭＷ４をコーディングする遺伝子の部分ＤＮＡ配列である （配列番号８）。 図１０は、タンパクＨＭＷ１、ＨＭＷ２、ＨＭＷ３およびＨＭＷ４の誘導アミ ノ酸配列の比較表である。 発明の詳細な説明 それぞれ図１および３に示したＨＭＷ１およびＨＭＷ２をコーディングする遺 伝子のＤＮＡ配列は、約８０％が同一であり、遺伝子の最初の１２５９塩基対は 同一である。図２および図４に示した２種のＨＭＷタンパクの誘導アミノ酸配列 は、約７０％が同一である。さらに、コード化したタンパクは、ボルデテラペル トゥシス(Bordetella pertussis)の血球凝集素表面タンパクに抗原的に関連して いる。ボルデテラペルトゥシ スの血球凝集素（ＦＨＡ）に対して作製したモノクロナール抗体は、両方の高分 子量タンパクを認識することが発見された。このデータは、ＨＭＷおよびＦＨＡ タンパクが近似した生物学的機能を果たすことを示唆している。ＨＭＷ１および ＨＭＷ２タンパクの誘導アミノ酸配列は、ＦＨＡタンパクの場合と類似している 。これらの抗体的に関連しているタンパクは、大部分のヘモフィルスのノンタイ プアブル菌株から生産されることが知られている。ＨＭＷ１遺伝子により発現さ れるタンパクに対して生成した抗血清は、ＨＭＷ２タンパクおよびボルデテラペ ルトゥシスＦＨＡの双方を認識する。本発明は、ボルデテラペルトゥシスＦＨＡ に対して抗原的に関連するノンタイプアブルヘモフィルスの単離および精製され た高分子量タンパクを含むが、これらは天然源から得られるかまたは組換え法に より生産できる。 標準法により、ノンタイプアブルＨＭＷの既知の菌株のファージゲノムライブ ラリーを作製し、ＨＭＷに対する高濃度抗血清を用いて高分子量タンパクを発現 するクローンをライブラリーからスクリーニングした。多数の反応性が強いＤＮ Ａをプラーク精製し、Ｔ７発現プラスミド中にサブクローンした。これらはすべ てＨＭＷ１およびＨＭＷ２と表した２種の高分子量タンパクのいずれかを発現し 、これらは見掛け分子量それ ぞれ１２５および１２０ｋＤａで、それぞれ４．６ｋｂおよび４．４ｋｂのオー プン読み取り枠によりコード化されていることが分かった。 ＨＭＷ１またはＨＭＷ２のいずれかを発現する代表的なクローンをさらに特性 試験し、遺伝子を単離、精製および配列決定した。ＨＭＷ１のＤＮＡ配列は図１ であり、これに相当する誘導アミノ酸配列は図２である。同様に、ＨＭＷ２のＤ ＮＡ配列は図３であり、これに相当する誘導アミノ酸配列は図４である。単離さ れたタンパクの部分精製およびＮ末端配列分析から、発現されたタンパクは、端 を切り取られていることが分かったが、これはこれらの配列が双方の全長ＨＭＷ １およびＨＭＷ２遺伝子生成物の残基番号４４２から開始するからである。 ｈｍｗ１およびｈｍｗ２遺伝子に関するサブクローニング試験から、ＨＭＷタ ンパクの正しいプロセシングには、別の下流遺伝子の生成物が必要であることが 分かった。ｈｍｗ１およびｈｍｗ２遺伝子のいずれもそれぞれｂおよびｃと称す る２個の別の下流オープン読み取り枠（ＯＲＦ）が隣接していることが分かった （図６および７参照）。 ｂＯＲＦは長さ１６３５ｂｐであり、ｈｍｗ１の場合にはヌクレオチド５１１ ４から６７４８にわたっており、ｈｍｗ２の場合にはヌクレオチド５３７５から ７００９にわたっており、これらの誘導アミノ酸配列は９９％が同一である。誘 導アミノ酸配列は、Ｐ．ミラビリス(mirabilis)およびＳ．マルケスケンス(marc escens)の同種溶血素の分泌および活性化のために必要なタンパクをコード化す る２個の遺伝子の誘導アミノ酸配列と類似性が認められた。 ｃＯＲＦは長さ１９５０ｂｐであり、ｈｍｗ１の場合にはヌクレオチド７０６ ２から９０１１、ｈｍｗ２の場合にはヌクレオチド７２４９から９１９８にわた っており、これらの誘導アミノ酸配列は９６％が同一である。ｈｍｗ１のｃＯＲ Ｆは、一連の９ｂｐ直接縦列反復が前置されている。プラスミドサブクロン中で は、ｈｍｗ１のｂおよびｃＯＲＦの中断は、誤ったプロセッシングおよびｈｍｗ １遺伝子構造遺伝子生成物の分泌となる。 ２種の高分子量タンパクを単離および精製すると、チンチラ類の中耳炎に対し て部分的な防御性があり、また．アドヘシン(adhesin)として機能することが分 かった。これらの結果は、ノンタイプアブルヘモフィルスインフルエンザワクチ ンの成分として、このような高分子量タンパクおよびその他のヘモフィルスイン フルエンザ菌のノンタイプアブル株の構造関連タンパクの有用性を示している。 本特許で提供するタンパクは良好な交さ反応性抗原 であり、また大部分のノンタイプアブルヘモフィルス菌株中に存在するので、こ れらのＨＭＷタンパクは、汎用ＨＭＷワクチンの主要な成分となることができる 。事実、これらのタンパクは、ノンタイプアブルヘモフィルス菌株が起こす耳炎 、副鼻孔炎、および気管支炎に対する防御抗原として使用できるだけでなく、骨 髄炎に対する複合ワクチン中の防御Ｈｉｂ多糖類に対する担体としても使用でき る。またこのタンパクは、他の生物体からの他の抗原、ハプテンおよび多糖類の 担体としても使用でき、かかる抗原、ハプテンおよび多糖類に免疫を誘発する。 別のノンタイプアブルヘモフィルス菌株（ＨＭＷ３およびＨＭＷ４と称する） の２種の高分子量タンパクをコード化するヌクレオチド配列は、大部分が解明さ れており、図８および９に示す。ＨＭＷ３は見掛けの分子量１２５ｋＤａを有し 、ＨＭＷ４は見掛けの分子量１２３ｋＤａを有している。これらの高分子量タン パクは、ＨＭＷ１およびＨＭＷ２タンパクおよびＦＨＡに抗原的に関連している 。ＨＭＷ３の配列解析は約８５％が終了しており、ＨＭＷ４は95％が完了してお り、いずれの遺伝子の５’末端の短い部分の配列解析は未了である。 図１０は、本発明で同定している４種の高分子量タンパクの誘導アミノ酸配列 の多重配列比較である。こ の比較から分かるように、同じペプチド配列の部分が比較の全体にわたって現れ ており、ＨＭＷ３はＨＭＷ１に対してより緊密に類似しており、ＨＭＷ４はＨＭ Ｗ２との近似の方が高い。この情報は、各種のノンタイプアブルヘモフィルス菌 株からの高分子量タンパク間のかなりの数の配列の相同性を強く示唆している。 さらに、ＨＭＷ１またはＨＭＷ２または双方の発現を欠失しているノンタイプ アブルヘモフィルスインフルエンザ菌株の変異体を構成し、培養したヒト上皮細 胞に接着するこれらの能力を試験した。ｈｍｗ１およびｈｍｗ２遺伝子集団を大 腸菌(E ．coli)中で発現させ、インビトロの接着性を試験した。この実験の結果 は、ＨＭＷ１とＨＭＷ２の双方が接着を仲介し、従ってアドヘシンであり、また この機能はその他のヘモフィルスインフルエンザ菌の表面構造が存在しない場合 でも存在することを証明している。 高分子量タンパクの単離および精製により、本発明者は通例のエピトープマッ ピングにより主要な防御エピトープを決定し、完全な合成または組換えワクチン 中に組み込むためにこれらの決定因子に相当するペプチドの合成ができた。従っ て、本発明は、ノンタイプアブルヘモフィルスインフルエンザ菌の高分子量タン パクの少なくとも１種の防御エピトープに相当するアミノ酸配列を有する合成ペ プチドも含む。かかるペプ チドは種々の長さであり、これは高分子量タンパクの一部を構成し、関連生物体 に対して、直接または接合の一部のどちらかにより免疫を誘発し、そのため関連 疾患に対する防御のためのワクチンを構成できる。 本発明は、ノンタイプアブルヘモフィルス菌株により起きる疾患に対して防 御する免疫学的能力を保持するタンパクの変異体または断片も提供する。変異体 は、遺伝子の部分的欠失または変異および生成した変性遺伝子の発現により構成 され、タンパクの変異を起こす。 実施例 実施例１ 急性中耳炎にかかった小児の中耳液からの純粋カルチャー中で、ノンタイプア ブルヘモフィルスインフルエンザ菌株５および１２を単離した。染色体ＤＮＡの Ｓａｕ３Ａ部分制限消化体をスクロース勾配上で作製して、タンパクＨＭＷ１お よびＨＭＷ２をコード化する遺伝子を与える１２菌株からの染色体ＤＮＡを作製 した。９〜２０ｋｂｐの範囲のＤＮＡ断片を含む画分をプールし、λＥＭＢＬ３ アームに結合してライブラリーを作製した。連結混合物は、インビトロでパッケ ージし、大腸菌ＬＥ３９２のＰ２溶解産物中でプレート増幅した。 プラスミドサブクローニング試験のために、リボソ ーム結合サイトおよび多重クローニングサイトから上流側のＴ７遺伝子１０タン パクに対する翻訳開始サイトでＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターΦ１０を含 むＴ７発現プラスミドｐＴ７−７中に、代表的な組換えファージからのＤＮＡを サブクローンした（図５Ｂ参照）。 ＤＮＡ配列解析は、ジデオキシ法により行い、ＨＭＷ１遺伝子の両方のストラ ンドおよびＨＭＷ２遺伝子の単一ストランドを配列決定した。 反応性ファージクローンにより生成した組換えタンパクを同定するために、ウ エスターン(Western)免疫ブロット分析を行った。ＬＥ３９２細胞中で成長する ファージ溶解産物またはＹＴプレート上のＬＥ３９２細胞のローンから直接取り 出したプラークは、電気泳動の前にゲル電気泳動試料緩衝液中に溶解させた。７ ．５％または１１％ポリアクリルアミド変性レムリ(Laemmli)ゲル上で、ドデシ ル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ーポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。タン パクをニトロセルロースシート上に移行させた後に、高分子量タンパクに対する 高濃度抗体を含む大腸菌吸収ヒト血清試料、次いでアルカリ性ホスファターゼ接 合ヤギ抗ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）２次抗体を順番に用いてシートを試験 した。健康な成人からの血清は、ノンタイプアブルヘモフィルスインフルエンザ 菌 の表面暴露高分子量タンパクに対する高濃度の抗体を含んでいる。ＬＥ３９２細 胞を用いて十分に吸収させた後に、スクリーニング抗血清としてこのような血清 試料を使用した。 組換えプラスミドで形質転換させた大腸菌により生産された組換えタンパクを 同定するために、関係するプラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳ の形質変換のために使用した。変換させた菌株は、ｍｌ当たりにアンピシリン５ ０μｇを含むＬブイヨン中でＡ₆₀₀が０．５となるまで培養した。次いで、ＩＰ ＴＧを１ｍＭまで添加した。１時間後、細胞を取り出し、細胞の音波処理体を作 製した。試料のタンパク濃縮物は、ビシンコニニック酸(bicinchoninic acid)法 で測定した。総タンパクの100 μｇを含む細胞音波処理体は、電気泳動試料緩衝 液中に溶解させ、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法を行い、ニトロセ ルロースに移行させた。次いで、大腸菌吸収成人血清試料、次にアルカリ性ホス ファターゼ接合ヤギ抗ヒトＩｇＧ２次抗体を順番に用いてニトロセルロースを試 験した。 相同型および非相同型ノンタイプアブルヘモフィルスインフルエンザ菌株が、 クローン化したＨＭＷ１遺伝子（ｒＨＭＷ１）によりコード化したタンパクに抗 原的に関連する高分子量タンパクを発現する否かを測 定するために、ウエスターン免疫ブロット分析を実施した。細菌細胞の音波処置 体を電気泳動試料緩衝液中に溶解させ、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳 動を行い、ニトロセルロースに移行させた。ポリクロナールラビットｒＨＭＷ１ 抗血清、次いでアルカリ性ホスファターゼ接合ヤギ抗ラビットＩｇＧ２次抗体を 順次用いてニトロセルロースを試験した。 最後に、ノンタイプアブルヘモフィルス株がボルデテラペルトゥシスの糸状血 球凝集素タンパクに抗原的に関連する高分子量タンパクを発現する否かを測定す るために、ウエスターン免疫ブロット分析を実施した。ウエスターンブロットに よる細胞音波処理体の試験のために、糸状血球凝集素を認識するネズミ免疫グロ ブリンＧ（ＩＧｇ）抗体であるモノクロナール抗体Ｘ３Ｃを使用した。検出には アルカリ性ホスファターゼ接合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を用いた。 組換えタンパク抗血清を生成させるために、上記のように、大腸菌ＢＬ２１（ ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳをｐＨＭＷ１−４を用いて形質転換させ、組換えタンパク の発現はＩＰＴＧを用いて誘導させた。細菌細胞の細胞音波処理体を作製し、１ ０，０００ ｘ ｇで３０分間遠心分離して上清とペレット画分に分離した。組 換えタンパクは、ペレット画分を用いて分画した。ペレット画分からのタンパク １ｍｇを用いて隔週にラビ ット１匹を皮下免疫したが、最初の投与はフロイントの完全アジュバントを用い て行い、以後の投与にはフロイントの不完全アジュバントを用いた。第４回の注 射の後、ラビットを放血した。ウエスターンブロット試験に用いる前に、クロー ニングベクターのみで形質転換したホスト大腸菌株の音波処理体を用いて抗血清 を十分に吸収させた。 ＨＭＷ１と糸状血球凝集素との間の抗原測定の分配を評価するために、ウエル 当たりにデュルベッコ(Dulbecco)のリン酸塩緩衝液中の糸状血球凝集素４μg/ml 溶液60μｌを用いて、酵素リンク免疫吸着剤試験（ＥＬＩＳＡ）プレート（Cost ar，Cambridge，Mass.）を室温で２時間被覆した。希釈血清を加える前に、デュ ルベッコのリン酸塩緩衝液生理食塩水中の１％ウシ血清アルブミンを用いてウエ ルを１時間ブロックした。デュルベッコのリン酸塩緩衝液生理食塩水中の０．１ ％ブリジ(Brij，Sigma，St．Louis，Mo.)中でｒＨＭＷ１抗血清を順次希釈し、 室温で３時間培養した。洗浄した後に、ペルオキシダーゼ接合ヤギ抗ラビットＩ ｇＧ抗体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて室温で２時間培養し、引き続きＨ₂Ｏ₂０． ０３％を含み、０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．２中の濃度０．５ ４ｍｇ／ｍｌの２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンツチアゾリン−６−ス ルホン酸）（Sigma）を用い て展開した。吸収度は、自動化したＥＬＩＳＡリーダーで読み取った。 ＨＭＷ１またはＨＭＷ２を発現する組換えファージは、下記のようにして回収 した。高分子量タンパクに対する高濃度の抗体を含む大腸菌吸収ヒト血清試料を 用いて、高分子量タンパクを発現するクローンに関して、ヘモフィルスインフル エンザ菌株１２ゲノムライブラリーをスクリーニングした。 反応性が弱いものと同時に、多数の反応性が強いクローンが同定された。２０ 種の反応性が強いクローンをプラークで精製し、組換えタンパクの発現に関して ウエスターンブロットで試験した。いずれの反応性が強いクローンもＨＭＷ１お よびＨＭＷ２と呼ばれる２種の高分子量タンパクのうち１種を発現した。ＨＭＷ １およびＨＭＷ２溶解産物中の主要な免疫反応性タンパクバンドは、見掛けの分 子量それぞれ１２５および１２０ｋＤａで移行した。主要バンドの他に、それぞ れの溶解原は、見掛けの分子量がより高い少量のタンパクバンドを含んでいた。 分子量１２０ｋＤａ以下のＨＭＷ２溶解産物中のタンパクバンドは、現れないこ ともあり、タンパク分解生成物と想像された。λＥＭＢＬ３クローニングベクタ ーのみを感染させたＬＥ３９２の溶解産物は、同じ血漿試料を用いて免疫学的に スクリーニングすると非反応性であった。従って、観 察された活性は、交さ反応性大腸菌タンパクまたはλＥＭＢＬ３コード化タンパ クによるものではなかった。さらに、組換えタンパクは非特異的に単に結合した 免疫グロブリンではなかったが、これはタンパクは、ヤギ抗ヒトＩｇＧ接合体単 独、正常なラビット血清または多数の健康な幼生からの血清と反応性ではないか らである。 ＨＭＷ１またはＨＭＷ２組換えタンパクのいずれかを発現する代表的なクロー ンをさらに特性試験した。２種のファージ型の制限酵素切断マップは互いに異な り、ＨＭＷ１およびＨＭＷ２構造遺伝子をコード化する領域を含んでいた。図５ Ａは、ＨＭＷ１およびＨＭＷ２構造遺伝子を含む代表的な組換えファージの制限 酵素切断マップである。構造遺伝子の位置は、影を付けた棒で指示した。 ＨＭＷ１プラスミドサブクローンは、Ｔ７発現プラスミドＴ７−７を用いて構 成した（図５ＡおよびＢ）。ＨＭＷ２プラスミドサブクローンも構成し、これら の後者のサブクローンを用いた結果は、ＨＥ１構成体の結果と似ていた。 ＨＥ１構造遺伝子の転写の近似的な位置および方向は、最初にプラスミドｐＨ ＭＷ１を用いて決定した（図５Ａ）。このプラスミドは、λＨＭＷ１からの８． ５−ｋｂ ＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ断片をＢａｍＨＩ− およびＳａｌＩ−切断Ｔ７−７に挿入して構成した。ｐＨＭＷ１を用いて形質転 換した大腸菌は、見掛けの分子量１１５ｋＤａを有する免疫反応性組換えタンパ クを発現し、これはＩＰＴＧを用いると強く誘導性であった。このタンパクは、 親ファージにより発現する１２５−ｋＤａの主要タンパクよりも著しく小さく、 いずれも融合タンパクとして発現したか、またはカルボキシ末端で切り取られた ことを示している。 構造遺伝子の３’末端をさらに正確に位置決定するために、ｐＨＭＷ１構成体 の３’末端から順次切り取って、別のプラスミドを構成した。プラスミドｐＨＭ Ｗ１−１は、ＰｓｔＩを用いてｐＨＭＷ１を消化し、得られた８．８ｋｂ断片を 単離し、再結合して構成した。プラスミドｐＨＭＷ１−２は、ＨｉｎｄＩＩＩを 用いてｐＨＭＷ１を消化し、得られた７．５ｋｂ断片を単離し、再結合して構成 した。プラスミドｐＨＭＷ１−１またはｐＨＭＷ１−２のいずれかを用いて形質 転換した大腸菌も、見掛け分子量１１５ｋＤａを有する免疫反応性組換えタンパ クを発現した。これらの結果は、構造遺伝子の３’末端は、ＨｉｎｄＩＩＩサイ トの５’末端であることを示している。 遺伝子の５’末端をさらに正確に位置決定するために、プラスミドｐＨＭＷ１ −４およびｐＨＭＷ１−７を構成した。プラスミドｐＨＭＷ１−４は、上流の３ ． ８ｋｂ ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨｉ断片を含むｐＴ７−７誘導プラスミド中に、λ ＨＭＷ１からの５．１ｋｂ ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片をクローニングし て構成した。ｐＨＭＷ１−４を用いて形質転換した大腸菌は、見掛け分子量約１ ６０ｋＤａを有する免疫反応性タンパクを発現した。タンパク生成はＩＰＴＧを 用いて誘導できるけれども、これらの形質転換体におけるタンパク生成のレベル は、上記のｐＨＭＷ１−２を用いる形質転換体のレベルよりも著しく低かった。 プラスミドｐＨＭＷ１−７は、ｐＨＭＷ１−４をＮｄｅＩおよびＳｐｅＩを用い て消化して構成した。この二重消化により生成した９．０−ｋｂｐ断片を単離し 、平滑断端化し、再度結合した。ｐＨＭＷ１−７を用いて形質転換した大腸菌も 、見掛け分子量１６０ｋＤａを有する免疫反応性タンパクを発現し、これはｐＨ ＭＷ１−４形質転換体により発現したタンパクと同じ大きさのタンパクであった 。この結果は、ＨＭＷ１構造遺伝子のための開始コドンは、ＳｐｅＩサイトの３ ’であることを示している。ＤＮＡ配列解析もこの結論を確認した。 上記のように、λＨＭＷ１ファージクローンは１２５ｋＤａの主要な免疫反応 性バンドを発現し、一方、遺伝子の全長と考えられる部分を含むＨＭＷ１プラス ミドクローンのｐＨＭＷ１−４およびｐＨＭＷ１−７ は、約１６０ｋＤａの免疫反応性タンパクを発現した。この大きさの違いは、意 外である。一つの可能な説明は、ＨＭＷ１遺伝子生成物の正しいプロセシングの ために必要な別の遺伝子がサブクローニング操作の間に欠失したという説明であ る。この可能性を解明するために、プラスミドｐＨＭＷ１−１４を構成した。こ の構成体は、ｐＨＭＷ１をＮｄｅＩおよびＭｌｕＩを用いて消化し、ｐＨＭＷ１ −４から単離した７．６ｋｂｐ ＮｄｅＩ−ＭｌｕＩ断片を挿入した。この構成 体は、ＨＭＷ１遺伝子全長と同時に最初のＨＭＷ１ファージ中に存在したＨＭＷ １遺伝子のＤＮＡ３’を含んでいた。このプラスミドで形質転換した大腸菌は、 見掛け分子量１２５および１６０ｋＤａの主要免疫反応性タンパクと同時に別の 分解生成物を生成した。１２５および１６０ｋＤａバンドは、ＨＭＷ１ファージ 溶解産物中で検出した主要および小さい免疫反応性バンドと同一であった。重要 なことには、ｐＨＭＷ１−１４構成体は、非誘導条件において大量のタンパクを 発現し、これはこれまでの構成体では観察されなかった状況であった。 １２５および１６０ｋＤａタンパクの間の関係は必ずしも明らかではない。下 記の配列解析からは、ＨＭＷ１遺伝子は１５９ｋＤａのタンパクをコード化する と予想できることを明らかにしている。１６０ｋＤａ タンパクは、成熟した１２５ｋＤａタンパクの前駆型であり、一つのタンパクか ら他のタンパクへの転換は、２個の下流遺伝子の生成物に依存すると考えられて いる。 ＨＭＷ１遺伝子の配列解析（図１）から、４，６０８−ｂｐのオープン読み取 り枠（ＯＲＦ）がヌクレオチド３５１のＡＴＧコドンに始まり、ヌクレオチド４ ９５９のＴＡＧ停止コドンに終わることが明らかになった。配列ＡＧＧＡＧを有 する推定リボソーム結合サイトは、推定開始コドンより１０ｂｐほど上流側で開 始する。他の５個の枠内ＡＴＧコドンは、ＯＲＦ開始から２５０ｂｐ以内に位置 するが、どの前にも代表的なリボソーム結合サイトは存在しない。ＯＲＦの５’ 隣接領域は、７−ｂｐ配列ＡＴＣＴＴＴＣを１６回反復する一連の直接縦列反復 を含む。これらの縦列反復は、推定開始コドンの１００ｂｐ５’で止まっている 。ロー独立転写ターミネーターの８０ｂｐ逆転反復特性が存在し、これはヌクレ オチド４９８３、推定転写停止の２５ｂｐ５’から開始する。多重停止コドンは 、ＯＲＦの上流および下流側の双方の３個の読み取り枠内に存在する。ＨＭＷ１ 遺伝子によりコード化されたタンパクの誘導アミノ酸配列（図２）は、分子量１ ５９，０００であり、ＨＭＷ１−４およびＨＭＷ１−７形質転換体により発現す るタンパクの見掛け分子量と 良く一致している。アミノ末端の誘導アミノ酸配列は、典型的なシグナル配列は 示していない。ｐＨＭＷ１の生成に使用されたＢａｍＨＩサイトは、ヌクレオチ ド配列のｂｐ１７４３〜１７４８から成っている。ＢａｍＨＩサイトの下流のＯ ＲＦは、１１１ｋＤａのタンパクをコード化すると予想されており、これはｐＨ ＭＷ１をコード化する融合タンパクの見掛け分子量として予想された１１５ｋＤ ａと良く一致する。 ＨＭＷ２遺伝子の配列（図２）は、４，４３１−ｂｐのＯＲＦから成り、ヌク レオチド３５２のＡＴＧコドンから始まり、ヌクレオチド４７８３のＴＡＧ停止 コドンで終わっている。ＨＭＷ２遺伝子のＯＲＦの最初の１，２５９ｂｐは、Ｈ ＭＷ１遺伝子の配列と同一である。その後、配列は変化を始めるが、全体として ８０％が同一である。ＨＭＷ２配列のヌクレオチド９３における塩基１個の追加 を除き、ＨＭＷ１およびＨＭＷ２遺伝子の５’隣接領域は、それぞれの開始コド ンから上流側３１０ｂｐは同一である。従って、ＨＭＷ２遺伝子では、同じ縦列 反復の組およびＨＭＷ１遺伝子の５’に存在する同じ推定リボソーム結合サイト が先行している。ＨＭＷ１ＯＲＦに同定された３’と同一の推定転写ターミネー ターが認められ、これはヌクレオチド４８０４から開始する。２個の遺伝子の長 さの相違は、ヌクレオチド位置３８３９から始まるＨ ＭＷ２配列中の１８６−ｂｐギャップが主な原因である。ＨＭＷ２遺伝子でコー ド化されたタンパクの誘導アミノ酸配列（図４）は、分子量１５５，０００を有 し、ＨＭＷ１遺伝子の誘導アミノ酸配列と７１％が同一である。 ＨＭＷ１およびＨＭＷ２双方の誘導アミノ酸配列（図２および４）は、ボルデ テラペルトゥシスの表面関連タンパクであるこの生物体の糸状血球凝集素の誘導 アミノ酸配列との配列類似性を証明している。ＨＭＷ１糸状血球凝集素配列比較 のための当初および最適化ＴＦＡＳＴＡスコアは、それぞれ８７および１８６で あり、ワードサイズは２であった。比較のｚスコアは、４５．８であった。ＨＭ Ｗ２糸状血球凝集素配列比較のための当初および最適化ＴＦＡＳＴＡスコアは、 それぞれ６８および１９６であった。後者の比較のｚスコアは、４８．７であっ た。当初および最適化ＴＦＡＳＴＡスコアおよびｚスコアの大きさは、ＨＭＷ１ およびＨＭＷ２遺伝子生成物と糸状血球凝集素との間に存在する生物学的に重要 な関係を示唆した。ＨＭＷ１、ＨＭＷ２および糸状血球凝集素遺伝子の誘導アミ ノ酸配列を整列して比較すると、これら３個の配列のアミノ末端で類似性が最も 著しい。想定されたペプチド配列中の最初のアミノ酸２２個中の１２個は、同一 である。その上、これらの配列は、共通のアミノ酸部 分Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ、および最初のアミノ酸２００個内 に配列が同じ短い部分を数カ所有する。 実施例２ ＨＭＷ１−糸状血球凝集素の関係をさらに検討するために、ＨＭＷ１−４組換 えタンパク（ｒＨＭＷ１）に対して生成した抗血清の精製糸状血球凝集素を認識 する能力を評価した。ｒＨＭＷ１抗血清は、糸状血球凝集素に対して投与量依存 性のＥＬＩＳＡ反応性を示した。免疫前ラビット血清は、この試験で最低の反応 性を示した。ウエスターンブロット試験でもｒＨＭＷ１抗血清を試験し、この系 でも精製糸状血球凝集素との弱いが明瞭な反応性を示した。 ＨＭＷ１遺伝子生成物に相当する天然ヘモフィルスタンパクを同定し、またＨ ＭＷ１をクローンする遺伝子生成物に抗体的に関係するタンパクが、他のタイプ アブルヘモフィルスインフルエンザ菌の間でどの程度共通かを決定するために、 ウエスターンブロット法によりｐＨＭＷ１抗血清を用いてヘモフィルス菌株のパ ネルをスクリーニングした。抗血清は、それぞれＨＭＷ１およびＨＭＷ２遺伝子 の推定成熟タンパク生成物である相同型株１２中の１２５および１２０ｋＤａの 双方を認識した。 非相同型ノンタイプアブルヘモフィルスインフルエ ンザ菌株のスクリーニングに用いると、ｒＨＭＷ１抗血清は、１２５の疫学的に 関係がない菌株の７５％中の高分子量タンパクを認識した。一般に、抗血清は、 １００から１５０ｋＤａの範囲内で相同型株のそれぞれに相同型株と類似してい るが同一ではないタンパクバンドの１個または２個と反応した。 モノクロナール抗体Ｘ３Ｃは、ボルデテラペルトゥシスの糸状血球凝集素タン パクに対するネズミＩｇＧ抗体である。この抗体は、チャイニーズハムスター卵 巣細胞およびカルチャー内のＨｅＬａ細胞へのボルデテラペルトゥシスの結合を 抑制することができ、精製糸状血球凝集素による赤血球の血球凝集を抑制するで あろう。ウエスターンブロット試験を実施し、このモノクロナール抗体を上記の ノンタイプアブルヘモフィルスインフルエンザ菌株の同じパネルに対してスクリ ーニングした。モノクロナール抗体Ｘ３Ｃは、組換えタンパク抗血清が認識する ノンタイプアブルヘモフィルスインフルエンザ菌株１２中の高分子量の双方のタ ンパクを認識した。その上、モノクロナール抗体は、組換えタンパク抗血清によ り認識されるものと同じ非相同型ノンタイプアブルヘモフィルスインフルエンザ 菌株のサブセット中のタンパクバンドも認識した。場合によれば、糸状血球凝集 素モノクロナール抗体は、組換えタンパク抗血清が認識する２本のバンドの内の １本のみを認識するようにも見える。全体として、モノクロナール抗体Ｘ３Ｃは 、我々が収集したノンタイプアブルヘモフィルスインフルエンザ菌株の約３５％ 中のｒＨＭＷ１抗血清が認識するものと同じ高分子量タンパクバンドを認識した 。 実施例３ 細菌接着におけるこれらのタンパクの役割を試験するために、ＨＭＷ１、ＨＭ Ｗ２または双方のタンパクを発現しない変異体を構成した。下記の方針を用いた 。ｐＨＭＷ１−１４（実施例１参照、図５Ａ）をＢａｍＨＩを用いて消化し、次 いでｐＵＣ４Ｋからの１．３ｋＤａ ＢａｍＨＩ断片上で単離したカナマイシン カセットに結合させた。得られたプラスミド（ｐＨＭＷ１−１７）は、ＸｂａＩ を用いて消化して直線化し、ノンタイプアブルヘモフィルスインフルエンザ菌株 １２中で形質転換し、次いでカナマイシン抵抗性コロニーを選んだ。一連のこれ らのコロニーのサザン(Southern)分析は、２個の形質転換体の集団を確認し、そ の１個はＨＭＷ１構造遺伝子中への挿入、他はＨＭＷ２構造遺伝子中への挿入で あった。引き続く試験のために、これらの群のそれぞれからの１個の変異体を選 出した。 下記の手順により、双方のタンパク発現が欠失している変異体を回収した。ｐ ＨＭＷ−１５中のＨＭＷ１ 構造遺伝子の３’部分にある２個のＥｃｏＲＩサイトの間のＤＮＡの２．１ｋＤ ａ断片を除いた後、ｐＵＣ４Ｋからのカナマイシンカセットを１．３ｋＤａ Ｅ ｃｏＲＩ断片として挿入した。得られたプラスミド（ｐＨＭＷ１−１６）をＸｂ ａＩを用いて消化して直線化し、菌株１２中に形質変換し、引き続き再びカナマ イシン抵抗性コロニーを選択した。これらのコロニーの代表的試料のサザン分析 から、８ケース中の７ケースで、ＨＭＷ１およびＨＭＷ２の遺伝子座の双方への 挿入が起きていたことが分かった。このような変異体の１個を以後の試験のため に選出した。 意図している表現型を確認するために、組換えＨＭＷ１タンパクに対するポリ クロナール抗血清を用いるウエスターンブロット分析により変異体株を試験した 。親株は、１２５−ｋＤ ＨＭＷ１および１２０−ｋＤ ＨＭＷ２タンパクの双 方を発現した。反対に、ＨＭＷ２’変異体は、１２０−ｋＤタンパクを発現せず 、また、ＨＭＷ１変異体は、１２５−ｋＤタンパクを発現しなかった。二重変異 体は、いずれのタンパクも発現しなかった。総細胞溶解産物、外膜プロファイル およびコロニーの形態によると、野生型株および変異体は、その他は相互に同一 であった。透過型電子顕微鏡観察によると、４種のいずれの菌株もピリは発現し なかった。 野生型株１２のチャン(Chang)上皮細胞への接着能力を試験した。この試験で は、細菌をブイヨンに接種し、約２ｘ１０⁹ｃｆｕ／ｍｌの密度まで成長させた 。上皮細胞単層に約２ｘ１０⁷ｃｆｕを接種し、１６５ｘｇで５分間軽く遠心分 離し、細胞と上皮細胞との接触を助けた。５％ＣＯ₂中３７℃で５分間培養した 後、ＰＢＳを用いて単層を５回洗浄して非接着生物体を除き、次いでＰＢＳ中の トリプシン−ＥＤＴＡ（トリプシン０．０５％、ＥＤＴＡ０．５％）で処理して 、これらのプラスチック担持体から離した。ウエル内容物を撹拌し、所定数の細 菌が単層当たりに接着しているように、固体媒体上に希釈物をプレートした。単 層当たりの接着ｃｆｕの数を培養した接種ｃｆｕの数で割って算出した。 下記の表１（明細書の末尾に添付した表）から分かるように、この株は著しく 効果的に接着し、接種材料のほぼ９０％が単層に結合した。ＨＭＷ１を発現する がＨＭＷ２は発現しない変異体（ＨＭＷ２’）による接着も非常に効果的であり 、野生型株の接着と同程度であった。反対に、ＨＭＷ２を発現するがＨＭＷ１は 発現しない変異体（ＨＭＷ１’）による接着は、野生型よりも約１５倍も低下し た。二重変異体（ＨＭＷ１’／ＨＭＷ２’）による接着もさらに低下し、野生型 より約５０倍、ＨＭＷ１変異体より約３倍低下した。 これらを総合して考えると、これらの結果は、ＨＭＷ１タンパクおよびＨＭＷ２ タンパクが両方共チャン上皮細胞への接着に影響を与えることが示唆される。重 要なことは、これらの細胞群への最適な接着にはＨＭＷ１を必要とするがＨＭＷ ２はそうではないと思われることである。 実施例４ プラスミドｐＨＭＷ１−１６およびｐＨＭＷ１−１７（実施例３参照）を用い 、実施例３に記載した１２菌株に用いた場合と同様の手順に従って、３種のノン タイプアブルＨＭＷ株５変異体を単離したが、これらの第一はカナマイシン遺伝 子をｈｍｗ１類似（ｈｍｗ３と称する）位置に挿入し、第二はｈｍｗ２類似（ｈ ｍｗ４と称する）位置に挿入したもの、第二は双方の位置に挿入したものであっ た。予想されたように、ウエスターン免疫ブロット分析は、ｈｍｗ１類似位置に カナマイシンカセットを挿入した変異体は、ＨＭＷ３の１２５ｋＤａタンパク発 現性を失い、一方ｈｍｗ２類似位置に挿入した変異体は、ＨＭＷ４の１２３ｋＤ ａタンパク発現性を失った。二重挿入変異体は、いずれの高分子量タンパクの発 現もできなかった。 下記の表１に示したように、野生型株５は高いレベルの接着性を示し、単層に 対して接種材料の８０％近くが接着した。ＨＭＷ１類似タンパクの発現における 変異体欠失による接着も非常に高かった。反対に、ＨＭＷ１類似タンパクを発現 できない変異体による接着は、野生型より約５倍低く、二重変異体による接着は 、さらに低下した（約２５倍）。ギムザ(Giemsa)染色試料試験により、これらの 観察を確認した（記載せず）。従って、菌株５を用いた結果は、菌株１２および ＨＭＷ１およびＨＭＷ２タンパクを用いた知見を確証している。 実施例５ ＨＭＷ１およびＨＭＷ２タンパクの接着機能を確認し、またＨＭＷ１およびＨ ＭＷ２の効果を他のＨＭＷインフルエンザとは独立して試験するために、プラス ミドｐＨＭＷ１−１４およびｐＨＭＷ１−２１を用いて、それぞれｈｍｗ１およ びｈｍｗ２遺伝子集団を大腸菌ＤＨ５α中に導入した。対照として、クローニン グベクターのｐＴ７−７も大腸菌ＤＨ５α中に導入した。ウエスターブロット分 析によると、ｈｍｗ１遺伝子を含む大腸菌ＤＨ５αは、１２５ｋＤａタンパクを 発現したが、一方ｈｍｗ２遺伝子を含む同じ菌株は、１２０ｋＤａタンパクを発 現したことが明らかになった。ｐＴ７−７を含む大腸菌ＤＨ５αは、組換えＨＭ Ｗ１に対する抗血清と反応しなかった。透過型電子顕微鏡により、いずれの大腸 菌株上にもピリまたはその他の表面付属物を認められなかった。 大腸菌株による接着を定量化し、野生型ノンタイプアブルヘモフィルスインフ ルエンザ菌株１２による接着と比較した。下記の表２に示すように、ベクターの みを含む大腸菌ＤＨ５αの接着は、菌株１２の接着の１％以下であった。反対に ｈｍｗ１遺伝子集団を含む大腸菌ＤＨ５αは、菌株１２の接着と同程度の接着を 示した。ｈｍｗ２遺伝子を含む大腸菌ＤＨ５αの接着は、菌株１２の接着より約 ６倍低かったが、ｐＴ7-7のみを含む大腸菌ＤＨ５αによる接着よりは２０倍高 かった。これらの結果から、ＨＭＷ１およびＨＭＷ２タンパクは、チャン結膜細 胞への接着を独立して仲介する能力があることを示している。これらの結果は、 実施例３および４に記載したヘモフィルスインフルエンザ変異体を用いた結果と 一致し、チャン表皮細胞を用いた場合には、ＨＭＷ１はＨＭＷ２よりもさらに効 果的なアドヒシンであることと一致した。 ｐＴ７−７、ｐＨＭＷ１−１４またはｐＨＭＷ２−２１を含む大腸菌ＨＢ１０ １を用いた実験は、ＤＨ５α誘導体を用いた結果を確認した（表２参照）。 実施例６ 下記のようにして、ノンタイプアブルヘモフィルスインフルエンザ菌（ＮＴＨ Ｉ）株１２からＨＭＷ１およびＨＭＷ２を単離、精製した。冷凍原料カルチャー からのノンタイプアブルヘモフィルス菌をチョコレー トプレート上に線接種し、５％ＣＯ₂を含む培養器中で３７℃で一晩培養した。 ヘミンおよびＮＡＤそれぞれ１０μｇ／ｍｌを追加した脳−心臓滲出（ＢＨＩ） ブイヨンのスターターカルチャー５０ｍｌっをチョコレートプレート上の生育物 に接種した。スターターカルチャーは、光学密度（Ｏ．Ｄ．＝６００ｎｍ）が０ ．６〜０．８に達するまで培養し、次いで、フラスコ当たりにＢＨＩを８〜１０ ｍｌ追加した６個の５００ｍｌフラスコに、スターターカルチャー中の細菌を接 種するために用いた。５００ｍｌフラスコ中で細菌をさらに５〜６時間培養し、 これによりＯ．Ｄ．は１．５以上に達した。１０，０００ｒｐｍで１０分間カル チャーを遠心分離した。 ０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１Ｍ Ｎａ₂ＥＤＴＡ、０．０１Ｍトリス、５０ μＭ １，１０−フェナントロリン、ｐＨ７．５から成る抽出液２５０ｍｌの全 量中に細菌ペレットを再懸濁させた。細菌は音波処理その他で分裂させなかった 。再懸濁させた細胞を氷上に置き、０℃で６０分間放置した。再懸濁させた細胞 を４℃において１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、不変の細胞および細 胞残さを除いた。上清を４℃において１０，０００ｒｐｍで６０分間遠心分離し 、上清を再び集め、０．０１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０に対して４℃で一 晩透析した。 ４℃において１０，０００ｒｐｍで１０分間試料を遠心分離し、透析の間に溶 液から沈殿した不溶性の残さを除いた。０．０１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ６． ０を用いて予め洗浄したＣＭセファロースカラム１０ｍｌに上清を適用した。こ のカラムに適用した後、０．０１Ｍリン酸ナトリウムを用いてカラムを洗浄した 。０．０１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０中の０〜０．５Ｍ ＫＣｌ勾配を用 いると、タンパクは上昇したので、ゲル試験のために画分を採取した。高分子量 タンパクを含むこれらの画分を同定するために、カラム画分のクーマシー(Cooma ssie)ゲルを採取した。高分子量タンパクを含む画分をプールし、ゲル透過カラ ムの試料として用いるために体積１〜３ｍｌまで濃縮した。 リン酸塩緩衝生理食塩水、ｐＨ７．５、を用いて、セファロースＣＬ−４Ｂゲ ル濾過カラムを平衡化させた。濃縮した高分子量タンパク試料をゲル透過カラム に適用し、カラム画分を採取した。クーマシーゲルは、高分子量タンパクを含む 画分を同定するためにカラム画分上で実施した。高分子量タンパクを含むカラム 画分をプールした。 相同菌株により起こした実験のための中耳炎に対して防御性があるか否かを測 定するために、タンパクを試験した。 フロイントアジュベント中のＨＭＷ１−ＨＭＷ２タ ンパク混合物４０μｇを３回毎月チンチラに皮下注射した。最後の注射の一カ月 後に、ＮＴＨＩ株１２の３００ｃｆｕを用いて、動物に尿道(intrabullar)接種 により抗原投与した。 感染は、対照動物では５匹中５匹、免疫化動物では１０匹中５匹に発生した。 感染した動物中で、抗原投与後７日において、中耳液中の細菌数の幾何平均は、 対照動物で７．４ｘ１０⁶個、免疫化動物で１．３ｘ１０⁵個であった。 免疫化の後の血清抗体力価は、非感染も感染動物も同程度であった。しかし、 免疫化動物中の感染は、均等に起こっており、ＨＭＷタンパクの発現中の細菌の ダウンレギュレーションの外観であり、免疫学的圧迫に対して反応する細菌選択 を示唆していた。 免疫化による防御は完全ではないようにこのデータは見えるが、このデータは 、ＨＭＷアドヒシンタンパクが多成分ＮＨＴＩワクチンの一つの成分となる可能 性がある重要な防御抗原であることを示唆している。 上記に用いた３００ｄｆｕより低い抗原投与量で、チンチラについてこの動物 抗原投与試験を繰り返した。この場合には、完全な防御が達成された。これらの 実験で、ＨＭＷ１−ＨＭＷ２混合物２０μｇを用いて、ＡｌＰＯ₄の存在下で第 １日、第２８日、第４２日に動物５匹を免疫化した。血液試料を第５３日に採取 し、 抗体反応を検査した。第５６日に、１０ｃｆｕのヘモフィルスインフルエンザ菌 株１２を動物の左耳に投与した。耳の感染を第４日に検査した。群３中の動物４ 匹はヘモフィルスインフルエンザ菌株１２に従来から感染しており、第二回投与 の少なくとも一カ月前に回復していた。結果を下記の表Ａに示す。 実施例７ ＨＭＷ１から多数の合成ペプチドを誘導した。次いでこれらのペプチドに対し て抗血清を生成させた。このペプチドＨＭＷ１−Ｐ５に対する抗ペプチド抗血清 は、ＨＭＷ１を認識した。ＨＭＷ１のアミノ酸１４５３〜１４８１に相当するペ プチドＨＭＷ１−Ｐ５は、配列ＶＤＥＶＩＥＡＫＲＩＬＥＫＶＫＤＬＳＤＥＥＲ ＥＡＬＡＫＬＧ（配列番号９）を有し、図１０の塩基１４９８〜１５７６である 。 この知見は、ＤＮＡ配列および誘導タンパクが正しい読み取り枠中で解釈され ており、免疫原性を発生できるペプチドが配列から誘導できることを証明してい る。 開示の要約 この開示は、要約すると、ノンタイプアブルヘモフィルスの高分子量タンパク 、これをコーディングする遺伝子およびこのタンパクを含むワクチンを提供する ものである。この発明の範囲内で変形も可能である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:92） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 セントジーム、ジョーゼフ、ウィリアム、 ザ サード アメリカ合衆国、63117 ミズーリ州、セ ントルイス、バークシャー ドライヴ 45

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．中耳炎、副鼻孔炎、気管支炎を含むノンタイプアブルヘモフィルスインフル エンザ菌により起きる疾患に対するワクチンであって、タンパクＨＭＷ１、ＨＭ Ｗ２、ＨＭＷ３またはＨＭＷ４であるノンタイプアブルヘモフィルスインフルエ ンザ菌の高分子量タンパク、またはその免疫学的性質を保持している上記のタン パクの変異体または断片、または上記のタンパクのアミノ酸配列に相当するアミ ノ酸配列を有する合成ペプチドの有効量、およびこれに対する生物学的担体から 成るワクチン。 ２．上記のタンパクが、図１（配列番号１）に示したＤＮＡ配列によりコード化 され、図２（配列番号２）の誘導アミノ酸配列を有し、かつ見掛けの分子量１２ ５ｋＤａを有するＨＭＷ１である、請求項１記載のワクチン。 ３．上記のタンパクが、図３（配列番号３）に示したＤＮＡ配列によりコード化 され、図４（配列番号４）の誘導アミノ酸配列を有し、かつ見掛けの分子量１２ ０ｋＤａを有するＨＭＷ２である、請求項１記載のワクチン。