JPH11502124A - オールインワン核酸増幅アッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 増幅された標的配列の検出用ハイブリダイゼーションプローブが増幅反応中に存在することを特徴とする、核酸増幅による標的核酸配列の検出方法。

Description

【発明の詳細な説明】 オールインワン核酸増幅アッセイ 発明の分野 本発明は、核酸増幅アッセイ、特に、伸長プライマーとは異なる配列を有し、 意図した標的配列の全部又は一部に相補的であるハイブリダイゼーションプロー ブの存在下、プライマー伸長による増幅を行うことを特徴とする核酸増幅アッセ イに関する。 発明の背景 試験サンプルに存在する可能性のある標的核酸配列の増幅・検出方法は現在ま でに当業界周知である。このような方法には、米国特許第４，６８３，１９５号 及び米国特許第４，６８３，２０２号に記載のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ） 、欧州特許出願公開第３２０，３０８号に記載のリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、 欧州特許出願公開第４３９，１８２号に記載のギャップＬＣＲ（ＧＬＣＲ）、国 際公開ＷＯ９３／２０２２７に記載の複合ＬＣＲなどがある。これらの方法は、 遺伝学、分子生物学及び生化学の分野と同様に医学診断分野に広く適用される。 一般的に、増幅反応は感度が高いが、特にＰＣＲに関する一 つの欠点は非特異的でありうるということである。換言すれば、ＰＣＲは標的配 列と非標的配列を増幅することが知られている。しかし、この欠点は、内部ハイ ブリダイゼーションプローブを用いて、増幅された標的配列を増幅された非標的 配列と区別することによって除くことができる。一般的に、内部ハイブリダイゼ ーションプローブは、標的配列の一つの領域に相補的であり、プライマー配列と 相補的な領域とは異なる核酸配列である。このような配列を用いて、増幅産物と ハイブリダイゼーションさせ、標的増幅産物と非標的増幅産物を区別することが できる。内部ハイブリダイゼーションプローブを選択して増幅産物の非プライマ ー領域とハイブリダイゼーションさせるならば、ＰＣＲの更なるレベルの特異性 が達成される。 例えば、内部ハイブリダイゼーションプローブで被覆した固相を、標的配列と 非標的配列の両方を含みうるＰＣＲ反応産物（アンプリコンとも言われる）と接 触させることができる。しかし、適切なハイブリダイゼーション条件下、内部ハ イブリダイゼーションプローブは増幅標的配列には結合するが増幅非標的配列に は結合しないであろう。それ故、標的配列と非標的配列は互いに分離することが でき、標的配列を検出できる。この タイプの捕捉と検出は一般的に、増幅標的配列を増幅非標的配列と区別すること に有効である。 しかし不幸にも、このタイプのアッセイは一般的に、別々の区画又は容器で、 プローブ／アンプリコン ハイブリッドを形成させて行われていた。それ故、コ ンタミネーションが起りうる、上記区画間の試薬と反応物質の移転が必要である 。増幅反応が標的配列のコピーを産生できる場合、コンタミネーションはこれら の反応の信頼性をかなり失わせる。例えば、唯一の外部標的配列が本来標的配列 を含んでいない試験サンプルに夾雑しても、当該唯一の外部標的配列により偽陽 性の結果が生じうる。コンタミネーションは、複数の試験サンプルを近接でアッ セイする臨床環境において特に問題となる。 従って、コンタミネーションの可能性を最小化し、容易に自動化できる特異的 増幅反応の必要性がある。 発明の概要 本発明は、標的核酸配列の検出方法であって、 （ａ）核酸増幅試薬、ハイブリダイゼーションプローブ、及び標的核酸配列を含 む核酸を含有する可能性のある試験サンプルを含む反応混合液を形成すること； 但し、 （ｉ）増幅試薬による伸長のときに、プライマーにより、標的配列又はその 一部に相補的な核酸配列を含む核酸が得られるように、増幅試薬が、サンプル核 酸に相補的で且つサンプル核酸にハイブリダイゼーションできる核酸配列を含む 増幅プライマーを含み； （ii）ハイブリダイゼーションプローブが、標的配列に相補的な配列の一 部に相補的で且つプライマー核酸配列とは異なる、伸長不能核酸配列を含む； （ｂ）該混合液を増幅条件下に置き、標的配列に相補的な核酸配列を含む少なく とも一種の核酸を生成させること； （ｃ）プローブを、標的配列に相補的な核酸配列を含む核酸にハイブリダイゼー ションさせ、プローブと該核酸を含む複合体を形成させること； （ｄ）サンプル中の標的配列の存在を示すものとして複合体の存在を検出するこ と； の各工程を含むことを特徴とする該方法である。 本発明はまた、試験サンプル中の核酸配列の存在の検出用キットであって、 （ａ）標的配列の相補配列に相補的な伸長不能ハイブリダイゼ ーションプローブ；及び （ｂ）標的配列に相補的な増幅プライマー； を含む一種以上の適切な容器を含むことを特徴とする該キットに関する。 本明細書記載の方法は、試験サンプル中の標的核酸配列の検出方法であって、 標的核酸配列の特異的検出を可能とする該方法を提供する。検出できる二本鎖産 物の産生が唯一の反応容器中で行うことができることに利点を有する。結果とし て、コンタミネーションの可能性は最少化され、本方法は容易に自動化され易い 。 一般的に、本発明の方法は核酸増幅反応での使用に適切であり、特にＰＣＲで の使用によく適している。 標的配列の一部に相補的な増幅プライマー核酸配列は検出標識か捕捉標識を有 することが好ましい。あるいは、プライマーは標識を全く有せずに、検出できる デオキシヌクレオチド三リン酸の添加の工程で、プライマー伸長産物は検出標識 又は捕捉標識で機能化できる。 同様に、ハイブリダイゼーションプローブは検出標識か捕捉標識を有すること が好ましい。プライマーとプローブは、プロ ーブが伸長不能であり、プライマー配列とは異なる融解温度を有するという点で 区別できる。 典型的には、ハイブリダイゼーションプローブと増幅プライマーもしくはその 伸長産物は異なるタイプの標識を有する。即ち、増幅プライマー又はその伸長産 物が検出標識を有する場合、ハイブリダイゼーションプローブは捕捉標識を有し 、増幅プライマー又はその伸長産物が捕捉標識を有する場合、ハイブリダイゼー ションプローブは検出標識を有する。標準的不均一系免疫アッセイ技術を用いて 、プローブ／一本鎖アンプリコンメンバー複合体を検出できる。 本発明の方法はまた、ＮＡＳＢＡや鎖置換増幅などの他の増幅技術での使用に も適している。これらの、そして他の増幅方法は全般的に、Wolcott Advances i n Nucleic Acid based Detection Methods，Clin．Microbiology Reviews，Vol 5，No.4,pp370-386(1992)（引用により本明細書に含まれるものとする）で考察 されている。 図面の簡単な説明 図１（ａ）〜（ｅ）は、本明細書記載の方法の具体例のスキームである。 発明の詳細な説明 一般的にいうと、本発明は、標的核酸配列を含む可能性のある試験サンプルと 、増幅プライマーを含む増幅反応試薬、及びアンプリコン配列の内部領域とハイ ブリダイゼーションできるハイブリダイゼーションプローブを接触させる工程を 含む。本明細書記載の方法に基づき用いられるプローブとプライマーは、捕捉標 識と検出標識で標識される。ここで、プローブは１つのタイプの標識で標識され 、プライマーは他のタイプの標識で標識される。更に、プローブ配列がプライマ ー配列より低い融解温度を有するように、プライマーとプローブを選択する。増 幅試薬、ハイブリダイゼーションプローブ及び試験サンプルを増幅条件下に置き 、標的配列の存在下、標的配列のコピー（アンプリコン）を、プローブのＴｍ超 の温度で産生させる。通常の場合、アンプリコンは二本鎖である。標的配列とそ の相補鎖を増幅するように、プライマーを用いるからである。次に、二本鎖アン プリコンを熱変性させて、一本鎖アンプリコンメンバーを産生させる。 変性後、混合液を冷却し、即ち再生させ、プローブと一本鎖アンプリコンメン バー間の複合体を生成できるようにする。変 性温度からの、プローブが一本鎖アンプリコンに結合する温度までの温度低下速 度は、好ましくは急速度であり（例えば８〜１５分）、特に酵素ポリメラーゼが プライマー伸長のために活性である温度範囲ではそうである。この急速冷却によ って、冷却の間で、一本鎖アンプリコンに再結合しえたプライマーの伸長が防止 されるばかりでなく、一本鎖アンプリコンに結合するプローブのかなりの量が得 られることを本発明者らは見出した。驚くべきことに、プローブと一本鎖のアン プリコンの両方のＴｍ未満の温度への急速冷却後、ハイブリダイゼーションプロ ーブと一本鎖アンプリコンによって形成される複合体を容易に検出できることを 、本発明者らは見出した。プライマーによって産生される一本鎖アンプリコンの 融解温度は、プローブの融解温度より高いので、混合液を冷却するとき、二本鎖 アンプリコンの再形成は、より起り易く、一本鎖アンプリコンとプローブの両方 のＴｍ未満に温度を下げるときに、アンプリコンはプローブと競合し、プローブ が一本鎖アンプリコンと結合するのを防止するか、又はプローブが結合した後、 プローブを置換えるということを予期することもできた。代わりに、増幅混合液 の急速冷却のときに、プローブは、プローブ／アンプリコン複 合体の検出に十分な程度まで、一本鎖アンプリコンメンバーに結合できることを 本発明者らは見出した。明らかに、プローブと一本鎖アンプリコンを冷却すると き、実際にプローブは優先的に結合する。この優先的結合は、プローブの過剰下 にプライマー配列が存在しているときでさえ起る故に、この優先的結合は特に驚 くべきことである。 本発明は、検出に必要なハイブリダイゼーションプローブが、増幅反応中既に 存在し、検出用プローブを加えるために反応容器を開ける必要がないことを特徴 とする核酸増幅アッセイを可能なものとする。 プローブ／一本鎖アンプリコンメンバーハイブリッドが形成された後、それら を検出する。標準的不均一系アッセイ形式は、プライマーとプローブ上にある検 出標識と捕捉標識によりハイブリッドを検出するのに適している。ハイブリッド は捕捉標識により固相試薬に結合でき、検出標識により検出できる。検出標識が 直接、検出可能である場合、固相上のハイブリッドの存在は、必要ならば標識が 検出可能な信号を発生させ、その信号を検出することにより検出できる。標識が 直接、検出可能でない場合、捕捉されたハイブリッドは、直接的に検出可能な標 識 に結合する結合メンバーを一般的に含むコンジュゲート(conjugate)と接触させ ることができる。コンジュゲートは複合体（complex）に結合し、複合体上に存 在するコンジュゲートは直接的に検出可能な標識で検出できる。即ち、固相試薬 上のハイブリッドの存在は測定できる。当業者は、非ハイブリッドアンプリコン 又はプローブ、及び非結合コンジュゲートを洗い流すために、洗浄工程を用いる ことができることを理解するであろう。 典型的には、試験サンプルは、標的配列を含有する可能性のある任意のもので ある。患者から標本を採取し、必要ならば、その中に含まれる細胞を破砕し核酸 を放出させることなどの、当業界で周知の方法により、試験サンプルを調製でき る。説明が簡潔であるように、本明細書では、標的配列を一本鎖として説明する 。しかし、このことは、標的配列が実際には二本鎖であるが、増幅プライマー配 列とのハイブリダイゼーションの前に、その相補鎖から簡単に分離される場合も 含むものとする。ＰＣＲを本方法で用いる場合、標的配列の末端は通常既知であ り、ＬＣＲ又はその変法を本方法で用いる場合、標的配列は通常全部既知である 。典型的には、標的配列は、例えばＲＮＡ又 はＤＮＡなどの核酸配列である。 本明細書で提供する方法は、温度サイクル反応を行う周知の増幅反応、特にＰ ＣＲとＧＬＣＲに有用である。典型的には、増幅反応ではプライマーを用い、ず っと大きい核酸配列の通常一小部分である標的核酸配列のコピーを繰返し生成さ せる。プライマーはそれ自体、標的配列の一部に相補的で、増幅条件下、標的配 列の相補的部分にハイブリダイズするか、又は結合する核酸配列である。典型的 には、標的配列のコピーは、ポリメラーゼ活性又はリガーゼ活性を有する酵素を 別々に、又は組合せて用い、ハイブリダイズしたプライマーにヌクレオチドを加 えるか、及び／又は隣接したプライマーペアを連結させることを特徴とするプラ イマー伸長及び／又は連結の方法によって生成される。モノマー又は予め形成さ れたオリゴマーとして、プライマーに付加されるヌクレオチドはまた、標的配列 に相補的である。 プライマーが十分に伸長するか、及び／又は連結すると、プライマーは、例え ば反応混合液を相補的核酸鎖が解離する“融解温度”に加熱することにより、標 的配列から分離する。標的配列に相補的な配列が形成される。 次に、新しい増幅サイクルを行い、二本鎖配列を分離し、プライマーをそれぞ れの標的にハイブリダイズさせ、ハイブリダイズしたプライマーを伸長及び／又 は連結させ、並びに再分離させることによって、標的配列数を更に増幅させるこ とができる。増幅サイクルで生成される相補的配列は、プライマー又はプローブ 伸長の鋳型として働き、標的配列数を更に増幅させることができる。典型的には 、反応混合液のサイクルを１５〜１００回、より典型的には２５〜５０回行う。 このようにして、標的配列及びその相補配列の多数のコピーが生成される。増幅 条件下、標的配列が存在するとき、プライマーは標的配列の増幅を開始する。 一般的に、標的鎖の一部及びその相補鎖に相補的な２種のプライマーをＰＣＲ で用いる。ＬＣＲでは一般的に、４種のプライマー（そのうちの２種は標的配列 に相補的であり、同様にそのうちの２種は標的相補鎖に相補的である）を用いる 。上記のプライマーセットと酵素の他に、核酸増幅反応混合液はまた、周知の他 の試薬を含有しえ、それらは、マンガン、マグネシウム、塩、ニコチンアミドア デニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）などの酵素補因子、及び例えばデオキシアデニ ン三リン酸、デオ キシグアニン三リン酸、デオキシシトシン三リン酸、デオキシチミン三リン酸な どのデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）などである（これらに限定され ない）。 増幅プライマーが標的配列の増幅を開始するが、ハイブリダイゼーションプロ ーブは増幅に関与しない。ハイブリダイゼーションプローブは一般的に、核酸配 列又は非荷電核酸アナログ（例えば国際公開ＷＯ９２／２０７０２で開示のペプ チド核酸、米国特許第５，１８５，４４４号、第５，０３４，５０６号、及び第 ５，１４２，０４７号に記載のモルホリノアナログなど）である。プローブの有 する標識のタイプにより、増幅反応で生成されるアンプリコンを捕捉又は検出す るために、プローブを用いる。プローブは、標的配列の増幅に関与せず、そのた め更なるｄＮＴＰがプローブに付加できないことを意味する“伸長不能”にする 必要がありうる。通常、基本的に、自然に、アナログは伸長不能であるが、核酸 プローブも伸長不能にすることができる。ヒドロキシル基がもはや伸長に関与で きないように、プローブの３′末端を修飾することによって、核酸プローブを伸 長不能にすることができる。例えば、プローブの３′末端を捕捉標識又は検出標 識で機能化して、ヒドロキシル基を消費又 はブロックすることができる。あるいは、３′ヒドロキシル基を単純に切断、置 換、又は修飾できる。米国特許出願第０７／０４９，０６１号（1993年４月19日 出願）は、プローブを伸長不能にするために用いることができる修飾を記載して いる。 本明細書記載の方法で、プライマーとプローブの比は重要ではない。プローブ かプライマーを過剰に反応混合液に加えることができ、一方の濃度が他方の濃度 より大きくすることができる。あるいは、プライマーとプローブを等濃度で使用 できる。しかし、好ましくはプライマーは、プローブの過剰下、反応混合液に加 える。プライマーとプローブの比は、例えば５：１〜２０：１が本発明では好ま しい。 上記のように、プライマーとプローブの長さは変りうるが、プローブ配列がプ ライマー配列より低い融解温度を有するように、プローブ配列を選択する。その ために、一般的に、プライマー配列はプローブ配列より長い。典型的には、プラ イマー配列の長さは２０〜５０ヌクレオチドの範囲、より典型的には２５〜３０ ヌクレオチドの範囲である。典型的プローブの長さは１０〜２５ヌクレオチドの 範囲であり、より典型的には１５〜２０ヌクレオチドの範囲である。 プライマーとプローブを合成する種々の方法は当業界周知である。同様に、プ ライマー又はプローブへの標識の結合方法も当業界周知である。例えば、通常の ヌクレオチドホスホルアミダイト化学と Applied Biosystems,Inc.,(Foster Cit y,CA)、Dupont(Wilmington,DE)、又は Perseptive(Bedford,MA)から市販の装置 を用いて、所望の核酸プライマー又はプローブを合成するのは定型的仕事である 。本発明のプライマー又はプローブのようなオリゴヌクレオチドを標識する多数 の方法が報告されている。Enzo Biochemical(New York)と Clontech(Palo Alto) の両社はプローブ標識技術を報告し、市販した。例えば、第１級アミンを、３′ -Amine-ON CPG^TM(Clontech,Palo Alto,CA)を用い３′オリゴ末端に結合できる。 同様に、第１級アミンを、 きる。通常の活性化及び結合化学を用いアミンを種々のハプテンと反応させるこ とができる。更に、同時係属中の米国特許出願第６２５，５６６号（1990年12月 11日出願）及び米国特許出願第６３０，９０８号（1990年12月20日出願）は、そ れぞれ５′末端と３′末端でのプローブの標識方法を教示している。 国際公開ＷＯ９２／１０５０５（1992年６月25日公開）及びＷＯ９２／１１３ ８８（1992年６月９日公開）は、それぞれ、５′末端と３′末端でのプローブの 標識方法を教示している。オリゴヌクレオチド標識の一つの公知の方法によれば 、標識−ホスホルアミダイト試薬を調製し用いて、合成の間にオリゴヌクレオチ ドに標識を付加する。例えば、Thuong,N.T.ら、Tet.Letters,29(46):5905-5908( 1988)；又は Cohen,J.S.ら、発行済米国特許出願第０７／２４６，６８８号（NT IS ORDER No.PAT-APPL-7-246,688）(1989)を参照されたい。好ましくは、プロー ブを３′末端と５′末端で標識する。 固相試薬は典型的には、固相に結合した“特異的結合メンバー”を含む。本明 細書で用いる特異的結合メンバーは、結合ペアの一メンバー、即ち、１種の分子 が、例えば化学的又は物理的手段を介し、他方の分子に特異的に結合することを 特徴とする２種の異なる分子を意味する。抗原及び抗体という特異的結合ペアの 他に、他の特異的結合ペアには、アビジンとビオチン；それぞれ米国特許出願第 ０８／０４９，８８８号（1993年４月21日出願）と米国特許出願第０８／０８４ ，４９５号（1993年７月１日出願）に記載のアダマンタンとカルバゾールなどの ハプテンとハプテンに特異的な抗体；相補的ヌクレオチド配列；上記のような相 補的核酸アナログ；酵素補因子又は基質と酵素などがある（これらに限定される ものではない）。 固相とは、不溶であるか、又は次段階の反応で不溶にされることができる物質 を指す。固相は、固相試薬を形成するために、結合メンバーを引付け、及び固定 化する固有の能力で選択できる。あるいは、固相は、固相試薬を形成するために 、結合メンバーを引付け、固定化することができる更なるレセプターを保持でき る。更なるレセプターには、結合メンバー又は結合メンバーに結合した荷電物質 と反対電荷の荷電物質がある。更には、レセプター分子は、固相上に固定化され （固相に結合した）、特異的結合反応を介し、別の結合メンバーを固定化できる 特異的結合メンバーでありうる。レセプター分子は、アッセイの実行前に、又は アッセイの実行中に、固相物質への結合メンバーの間接的結合を可能なものとす る。固相は、例えばラテックス、プラスチック、誘導体化プラスチック、磁気も しくは非磁気金属、試験管のガラスもしくはシリコン表面、マイクロタイターウ エル、シート、ビーズ、微粒子、チップ、及び当業者公知の他の形態でありうる 。固相はまた、必要なときに、コンジュゲ ートが接近できる十分な多孔性を有する適当な多孔性物質でありうることが考え られ、それは本発明の範囲内である。微孔性構造が一般的に好ましいが、水和状 態のゲル構造を有する物質も使用できる。ニトロセルロースの多孔性構造は、結 合メンバーを含む種々の試薬に対し、優れた吸収性と吸着性を有する。ナイロン も同様の性質を有し、適切なものである。このような物質は、フィルム、シート 、もしくはプレートなどの適切な形態で使用できるか、あるいは紙、ガラス、プ ラスチックフィルム、もしくは織物などの適切な不活性担体上に被覆できるか、 又は該不活性担体に結合できるか、又は該不活性担体に薄片として積層すること ができる。結合メンバーを固相に結合させる方法は、通常の方法から選択できる し、当業者は選択できる。 捕捉標識は、プライマー又はプローブが保持し、固相試薬の特異的結合メンバ ーと結合ペアを形成する特異的結合メンバーでありうる。プライマー又はプロー ブ自体が捕捉標識として機能しうることは、勿論理解されよう。例えば、固相試 薬の結合メンバーが核酸配列である場合、それがプライマー又はプローブの相補 的部分に結合し、それによって固相にプライマー又はプローブを固定化するよう に、それは選択できる。プローブ自 体が結合メンバーとして機能する場合、プローブが、一本鎖アンプリコンメンバ ーに相補的でない配列又は“テール(tail)”を含むことを当業者は理解しよう。 プライマー自体が捕捉標識として機能する場合、プライマーの少なくとも一部は 固相上の核酸とハイブリダイズするためには空いている。プローブがプライマー 配列に十分には相補的ではないようにプローブが選択されるからである。 検出標識という用語は、検出できる性質又は特徴を有する分子又は部分を指す 。検出標識は、例えば放射性同位元素、発蛍光団、化学発光団、酵素、コロイド 粒子、蛍光性微粒子などによって直接検出可能でありうる。あるいは、標識は、 例えば特異的結合メンバーなどによって間接的に検出可能でありうる。直接的標 識は、標識の検出を可能とするように、例えば基質、引金試薬、光などの更なる 成分を必要としうる。上記のように、間接的標識を検出のために使用する場合、 間接的標識は典型的には、コンジュゲートと組合せて使用する。典型的には、コ ンジュゲートは、直接的に検出可能な標識に結合している特異的結合メンバーで ある。固相試薬合成と同様に、コンジュゲート合成のための結合化学は当業界周 知であり、例えば、特異的結 合メンバーの特異的結合性又は標識の検出可能性を壊さない任意の化学的方法及 び／又は物理的方法でありうる。 一般的に、プローブ／一本鎖アンプリコンメンバー複合体は、不均一系免疫ア ッセイを行うために通常使用される技術を用い Laboratories; Abbott Park,IL)で使用するプロトコルに基づき、検出を行う。 本発明の具体例を、図１（ａ）〜１（ｅ）に基づき説明する。図１（ａ）に示 すように、標的配列１０を含有する試験サンプル、プライマー２０を含む増幅試 薬、及びハイブリダイゼーションプローブ３０を容器４０に加え、反応混合液を 形成する。試薬の添加後、反応混合液を増幅条件に置き、図１（ｂ）に示すよう に、標的鎖６０のコピーを産生させる。次に、図１（ｂ）の混合液を加熱し、一 本鎖アンプリコンメンバー７０を示す図１（ｃ）で示すように、二本鎖アンプリ コンを熱的に解離できる。次に、図１（ｃ）の混合液を冷却し、プローブ３０を 一本鎖アンプリコンメンバー７０に結合させ、図１（ｄ）に示すように、プロー ブ／一本鎖アンプリコンメンバー複合体８０を形成させる。図１（ｅ）は、複合 体の検出方法を示す。図１（ｅ） に示すように、複合体を固相試薬９０に固定化し、コンジュゲート１００を複合 体に固定化する。次に、固相試薬上の複合体の存在は、試験サンプル中の標的配 列の存在を示すものとして検出できる。 以下の実施例は、本発明を更に説明するために記載するが、本発明を制限する ものではない。 実施例 本発明を詳細に、特定の具体例を上げて説明するが、本発明の思想と範囲から 離れることなく種々の変化と修飾がこのような具体例になされうることは、当業 者に自明であろう。更に、上記の全ての特許と文献は引用により本明細書に含ま れるものとする。 以下の実施例で、新規な肝炎ＧＢウイルス（ＨＧＢＶ）ＤＮＡオリゴマーのプ ライマーとプローブを用いて、肝炎ＧＢウイルスの検出のための本発明の使用を 示す。これらのＤＮＡプライマーとプローブは、配列番号１、配列番号２、配列 番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列 番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号 １４、及び配列番号１５として同定し てある。配列番号１、２、３、４及び５は、ＨＧＢＶの５′非翻訳領域（ＮＴＲ ）に特異的である。配列番号６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４及 び１５は、ＨＧＢＶのＮＳ３領域に特異的である。ＨＧＢＶの５′ＮＴＲ領域に 特異的なＨＧＢＶプライマーは配列番号１と配列番号２である。ＨＧＢＶのＮＳ ３領域に特異的なＨＧＢＶプライマーは配列番号６と配列番号７である。実施例１．ＨＧＢＶ ＮＴＲ プライマーセットによる増幅 標的特異的プライマー検出プローブを設計し、オリゴヌクレオチドハイブリダ イゼーションＰＣＲによる上記標的配列を検出した。これらのプライマーは配列 番号１と配列番号２である。Ａ．ＮＴＲプライマーセット 標的配列を、ＮＴＲプライマーセット（配列番号１と配列番号２）を用いて増 幅し、標準的シアノエチルホスホルアミダイト結合化学を用い、５′末端でアダ マンタンによりハプテン化した。 次に、表１に示す異なるハイブリダイゼーションプローブを用い、増幅産物を 検出した。ヒト胎盤ＤＮＡ（ｈｐ ＤＮＡ；Sigma,St.Louis,MO）を用い、反応 性を評価した。 ^★ＮＴＲプラスミド（クローンｐＨＧＢＶ−Ｃクローン＃１）を、the American Type Culture Collection，12301 Parklawn Drive，Rockville，Maryland 2085 2に、1994年11月８日に、ブダベスト条約下寄託され、寄託日から３０年間、又 は寄託に対する最終の要求から５年間、又は米国特許の有効期間のいずれか長い ほうの期間維持される。本明細書記載の寄託菌及び他 の寄託物質は便宜のためにのみ提供され、本明細書記載の教示から本発明を実施 することを要求されない。ｐＨＧＢＶ−Ｃクローン＃１は A.T.C.C受託番号6971 1を与えられた。寄託物質の全てのＨＧＢＶ ｃＤＮＡ配列は引用により本明細 書に含まれるものとする。Ｂ．プラスミドの説明 １００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．３、５００ｍＭ ＫＣｌからなる１ ０× ＰＣＲ緩衝液(Perkin Elmer,Foster City,CA)を用い、下記のように、Ｐ ＣＲ伸長を反応１〜１２（表１参照）で行った。ＭｇＣｌ₂最終濃度は２ｍＭ、 ヌクレオチド最終濃度は約２００μＭであった。表１の反応条件を表２に示す。 ^★反応は以下のように増幅させた：９５℃ ２′ １サイクル；９４℃ １′／ ５５℃ １′／７２℃ １′ ３０サイクル；９５℃ ５′，１５℃ 浸漬。反 応混合液を９５℃に５分間維持後、プローブハイブリダイゼーションを、増幅反 応温度を以 下の様に９５℃から１５℃に１１分かけて下げることにより、本発明に基づき行 った。 Laboratories，Abbott Park,ILから入手可能）で検出した。これらの実験のデー タを表３に示す。表３のデータは、ＨＧＢＶ標的配列の特異的増幅と検出を示し た。 ^★反応は表１の反応に対応する。実施例２．ＮＳ３プライマーセットによる増幅 Ａ．ＮＳ３プライマーセット 標的配列を、ＮＳ３プライマーセット（ＮＳ３ Ｓ１及びＮＳ３ Ａ１、それ ぞれ配列番号７及び６）を用いて増幅し、実施例１に記載のように５′末端をア ダマンタンでハプテン化した。増幅産物を、表４に記載の異なるハイブリダイゼ ーションプローブを用い検出し、標準シアノエチル結合化学を用いて３′末端を カルバゾールでハプテン化した。ヒト胎盤ＤＮＡ（ｈｐＤＮＡ；Sigma,St.Louis ,MO）を用い、非特異的増幅／ハイブリダイゼーションを評価した。反応性を、 ヒトｐｈｐ ＤＮＡ又はリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ；Boehringer Mannheim，Indianapolis ，IN）を用い評価した。 Ｂ．ＮＳ３プラスミドの説明 ＰＣＲ伸長を、２５０ｍＭ ビシン、５７５ｍＭ酢酸カリウ ム、４０％（ｗ／ｖ）グリセロール，ｐＨ８．２、最終濃度２．５ｍＭのＭｎ（ ＯＡｃ）₂からなる５×ＥＺ緩衝液(Perkin Elmer,Foster city CA)を用いて行っ た。ヌクレオチド濃度は２００μＭであった。表５の反応条件は表５の下に示す 。 ＮＳ３プラスミド（クローンｐＨＧＢＶ−Ｃクローン＃１）を、the American Type Culture Collection，12301 Parklawn Drive，Rockville，Maryland 2085 2に、1994年11月８日に、ブダベスト条約下寄託され、寄託日から３０年間、又 は寄託に対する最終の要求から５年間、又は米国特許の有効期間のいずれか長い ほうの期間維持される。本明細書記載の寄託菌及び他の寄託物質は便宜のために のみ提供され、本明細書記載の教示から本発明を実施することを要求されない。 ｐＨＧＢＶ−Ｃクローン＃１はA.T.C.C受託番号69711を与えられた。寄託物質の 全てのＨＧＢＶ ｃＤＮＡ配列は引用により本明細書に含まれるものとする。 ^★サイクリング／ハイブリダイゼーション条件：９５℃ ２′ １サイクル；９ ４℃ １′／５５℃ １′／７２℃ １′ ３０サイクル；９５℃ ５′，１５ ℃浸漬；^★★ サイクリング／ハイブリダイゼーション条件：５５℃ ３０′，９４℃ ２ ′ １サイクル；９４℃ １′，５５℃ １′，７２℃ １′ ３５サイクル； ９７℃ ５′，１５℃浸漬；^★★★ サイクリング／ハイブリダイゼーション条件：９４℃，２′ １サイクル ；９４℃ １′，５５℃ １′，７２℃ １′ ３５サイクル；９７℃，５′， １５℃浸漬。 反応混合液を９５℃に５分間維持した後、実施例１に記載の方法により、増幅反 応温度を９５℃から１５℃に１１分で下げることによって、プローブハイブリダ イゼーションを、本発明に基づき行った。 テムで検出した。これらのデータを表６に示す。表６のデータは、ＨＧＢＶ標的 配列の特異的増幅と検出を示した。 ^★反応は表４の反応に対応する。 “ＩＶＤＵ３００”はＧＢウイルスを含むことが知られているサンプルであっ た。それを下記のように試験した。陰性対照は正常血清であった。 Ａ．ＨＧＢＶ５′ＮＴＲ検出 標的配列（表７）を、実施例１に記載のプライマー（配列番号１及び２）及び 検出プローブ（配列番号３及び４）を用いて ＰＣＲ増幅させた。この実験では、プライマーの濃度は０．２５ｍＭ（３．０× １０¹³分子）であり、検出プローブの濃度は０．０１ｍＭ（１．２×１０¹²分子 ）であった。更に、ｒＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ０．０２５ユニット／ｍＬ（ 合計５ユニット）とｒＲＮＡが合計２０ｎｇ存在した。 逆転写反応を６０℃で３０分間行った。産物を、以下のサイクリング条件下Ｐ ＣＲ増幅させた：９４℃ １分／５５℃ １分／７２℃ １分で４０サイクル。 次に、オリゴマーハイブリダイゼーション工程は９５℃ ５′、１５℃浸漬であ った。反応混合液を９５℃に５分間維持した後、実施例１に記載の方法に従い増 幅反応温度を９５℃から１５℃に１１分で下げることによって、プローブハイブ リダイゼーションを本発明に基づき行った。 Laboratories,Abbott Park,ILから入手可能）で検出した。これらの実験のデー タを表７に示す。表７のデータは、ＨＧＢＶ標的配列の特異的増幅と検出を示し た。 ^★QLAgen,Inc.(CA)から得られた QLAgen 核酸精製法^★★ Biotecx(Houston,TX)からの RNAzol B 核酸精製法 Ｂ．ＨＧＢＶ ＮＳ３検出 標的配列（表８）を、実施例２に記載のプライマー（配列番号６及び７）及び 検出プローブ（配列番号１４及び１５）を用いてＰＣＲ増幅させた。この実験で は、プライマーの濃度は０．２５ｍＭ（３．０×１０¹³分子）であり、検出プロ ーブの濃度は０．０１ｍＭ（１．２×１０¹²分子）であった。更に、ｒＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ０．０２５ユニット／ｍＬ（合計５ユニット）とｒＲＮＡが 合計５００ｎｇ存在した。 逆転写反応を６４℃で１０分間／６２℃で１０分間／６０℃で１０分間／５８ ℃で１０分間／５６℃で１０分間／５４℃で１０分間／５２℃で１０分間／５０ ℃で１０分間行った。産物を、以下のサイクリング条件下ＰＣＲ増幅させた：９ ４℃ １ 分／５５℃ １．５分で４０サイクル。次に、オリゴマーハイブリダイゼーショ ン工程は９５℃ ５′、１５℃浸漬であった。反応混合液を９５℃に５分間維持 した後、実施例１に記載の方法に従い増幅反応温度を９５℃から１５℃に１１分 で下げることによって、プローブハイブリダイゼーションを本発明に基づき行っ た。 Laboratories,Abbott Park,ILから入手可能）で検出した。これらの実験のデー タを表８に示す。表８のデータは、ＨＧＢＶ標的配列の特異的増幅と検出を示し た。 ^★QLAgen,Inc.(CA)から得られた QLAgen 核酸精製法^★★ Biotecx(Houston,TX)からの RNAzol B 核酸精製法

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ラフラー，トーマス・ジー アメリカ合衆国、イリノイ・60048、リバ テイービル、パインハースト・コート・ 1964 (72)発明者 マーシヤル，ロナルド・エル アメリカ合衆国、イリノイ・60099、ジオ ン、ウインスロツプ・コート・900 (72)発明者 サスタチエク，ジヨアン・シー アメリカ合衆国、ウイスコンシン・53406、 ラシーン、ケンブリツジ・レイン・5617、 ユニツト・５

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 標的核酸配列の検出方法であって、 （ａ）核酸増幅試薬、ハイブリダイゼーションプローブ、及び標的核酸配列を含 む核酸を含有する可能性のある試験サンプルを含む反応混合液を形成すること； 但し、 （ｉ）増幅試薬による伸長のときに、プライマーにより、標的配列又はその 一部に相補的な核酸配列を含む核酸が得られるように、増幅試薬が、該サンプル 核酸に相補的で且つハイブリダイゼーション可能な核酸配列を含む少なくとも一 種の増幅プライマーを含み； （ii）ハイブリダイゼーションプローブが、標的配列に相補的な配列の一 部に相補的且つプライマー核酸配列とは異なる、核酸配列を含む； （ｂ）該混合液を増幅条件下に置き、標的配列に相補的な核酸配列を含む少なく とも一種の核酸を生成させること； （ｃ）プローブを、標的配列に相補的な核酸配列を含む核酸にハイブリダイゼー ションさせ、プローブと該核酸を含む複合体 を形成させること； （ｄ）サンプル中の標的配列の存在を示すものとして複合体の存在を検出するこ と； の各工程を含むことを特徴とする該方法。 ２． プローブの融解温度がプライマーの融解温度と異なるように、プローブと プライマーが異なる温度を有することを特徴とする請求項１に記載の方法。 ３． プライマーの融解温度がプローブの融解温度より高いことを特徴とする請 求項１に記載の方法。 ４． プライマーが検出標識を含み、プローブが少なくとも一種の捕捉標識を有 することを特徴とする請求項１に記載の方法。 ５． プローブが、プローブの３′末端と５′末端に捕捉標識を有することを特 徴とする請求項１に記載の方法。 ６． 該混合液の増幅をＰＣＲで行うことを特徴とする請求項１に記載の方法。 ７． 試験サンプル中の核酸配列の存在を検出するためのキットであって、 （ａ）標的配列の相補配列に相補的な伸長不能ハイブリダイゼーションプローブ ；及び （ｂ）標的配列に相補的な増幅プライマー； を含む一種以上の適切な容器を含むことを特徴とする該キット。