JPS58148896A - Ｄｎａ等微量自動合成装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この発明ｉｌｌ、　ＤＮＡ等ｓｉｔ自動合成装蓋に関し
、特にＤＮＡま九はＲＮＡの微量自動合成に好適な装置
を提供する。

ＤＮＡの合成法として、いわゆるジエステル法。

トリエステル法、ホスファイト法と改ＪＩＬ発展がなさ
れ、さらにこれらの方法を利用し、固形支持体を用いる
固形支持体法が各種の利点を有することから多用される
に到っている。一方、固形支持体法に用いられる反応器
（反応カラム）は、試薬溶液との混合・接触面からみて
、固形支持体を入れ九反応器自体を振盪させるタイプ、
同反応器に試薬溶液を循環させるタイプ、同反応器に多
量の試薬溶液を一過性に通過させるタイプ０８種類が知
られている。しかし、いずれのタイプも種々の欠点があ
る。まえ、一方従来の自動合成装置では、固形支持体の
量として１００１１以上ＭＡｖｈるスケールがほとんど
であ＃）、合成すべきＤＮＡの必要量。

原料の保躾基付ヌクレオチドなどの試薬が鳥価であるこ
となどの観点から、よ勢小さなスケールでの自動合成装
置が望まれてい友。

この発明の発明者は、種々検討の結果、全知の自動合成
装置を数置することに成功した。

かくして、この発明によれば反応器が、上部に試薬ｓ液
等供給口を有し、内部下方ＫＤＮム等合成用の固形支持
体を載置可能でかつ試薬溶液を透過しつるフィルタを有
し、底部に排液口を有し、フィルタ上に容積８０μｍ〜
８００μｍの反応部空間を有する容器にて構成されると
共に、反応器に入れられ友上記支持体の量に応じた量で
試薬溶液を供給しうる試薬溶液供給手段を具備してなる
ＤＮム等微量自動合成装置が提供される。

この発明の装置の主な特徴は、（１）反応器を振盪させ
るなどの混合・接触のための特別な動作を行わせる手段
を不要にすること、（Ｍ）固体支持体として１ＯＩＩＩ
〜５０Ｍ１位のスケールで、を九ＤＮムとして縮合１０
回位で０．３〜２　ｓ　ｒｎｏ１位のスケールでの合成
が可能な反応システムを提供できること。

（助使用する試薬溶液が固体支持体の体積に対し５〜７
倍程度ですみ、かつそれに適した供給手段を提供するこ
とにある。

以下、図に示す実施例に基いてこの発明を詳説する。な
お、これによりこの発明が限定されるものではない。

第１図に示す（１）は、この発明を適用したホスホトリ
エステル法によるＤＮム黴量自動合威値装である。

反応器（２）は内径８■、鳥さ１０■Ｏ円箇状の本体（
３）の上方にすりばち状７う／ジ（４）を設けた容器で
ある。すりばち状７ランジ（１）には、多数の試薬溶液
等供給用のノズルが挿着された栓（ｉ）が装着されてい
る。そこで、本体（３）の頭部開口が試薬溶液等供給口
（６）となる。本体（１）の内部下方にはｊラスフィル
タのごときフィルタ（７）が嵌着され、さらに底部には
排液口（８）が設けられている。フィルタ（１）は、ポ
リスチレン、シリカビーズのごとき支持体（９）を載置
できる（透過させない）もので、試ａｍ液、＃Ｉ媒、ガ
スを透過させるものである。フィルタ（７）の上部空間
が反応部ｔ１６Ｋｔｋｋ）、約４５０μＩＯ容積の空間
である。

試薬溶液は全部で８種類ある。（ロ）〜（ロ）は各種の
ヌタレオチド試薬で、それぞれ塩基としてアデニン、シ
トシン、グアニ／、チミンを有している。

（イ）は縮合剤で、２−４−６−）９メチルベンゼンス
ルホニル−３−二トロトリアゾリド（輩８Ｎ’ｆ’）の
ピリジン溶液である。（２）は保農基脱離剤で、イソプ
ロパツールと塩化メチレンの混合溶媒に臭化亜鉛を溶解
し友溶液である。輪はマス中ング用試薬で、無水酢酸と
ピリジンの混合液である。−はマスキング用縮合剤で、
ジメチルアミノピリジンとピリジンの混合液である。

シリ／シボ／プ（ロ）〜（２）は、それぞれ切換コック
叫〜翰を介して上記試薬溶液Ｑυ〜に）を吸入し、反応
器（２）へ供給しうる。

シリフジポンプ（ハ）〜（７）のプランジャはそれぞれ
グランジャ駆動機Ｗ（ホ）〜に）で駆動される。

グランジャ駆動機ｍ（ホ）は、パルスモータ６◇と、そ
れにより回転されるネジ軸（２）と、そのネジ軸（２）
の回転により移動してプランジャ（ｌｌａ）を上下させ
るナツト−とからなっており、パルスモータ（ロ）ハマ
イクロコンピュータのごとき制御回路−でパルス制御さ
れている。他のプランジャ駆動機構−〜■も同様の構造
である。

−〜（至）は溶媒で、それぞれ乾燥用揮発性溶媒のテト
ラヒドロフラｙ（ＴＨＦ）、洗浄用溶媒のビリジ／、同
じく洗浄用溶媒のイソプロパツールと塩化メチン／の混
合液である。これらｉｌＩ媒−〜−および前記試薬溶液
（至）〜−は、窒素ｊス圧によってそれぞれ弁−〜−を
介して反応ａ（２）に供給されうる。

弁−は、窒素ガスで反応１！　（り内をブローする丸め
に、窒素ガスを直接反応器（２）へ供給するものである
。なお窒素ガスは塩化カルシウムのごとき乾燥剤−で乾
燥されている。

制御回路−は、前述のようにグラ／ジャ制御機構（２）
〜（至）を制御する外に、切換コック（２）〜曽、弁−
〜−２排液弁輪および排気弁ｆ４ｏ作動を制御する。ま
た、操作卓（至）を介してオペレータと対話を行う。

ＤＮ五合成に際しては、まず栓（６）をはずして反応器
（り内に、ＤＮＡ分子の末端部分のみを結合し九支持体
（９）を入れる。この量は、九とえば支持体（９）がポ
リスチレン粉体の場合には１０１１１〜５０ｑが好適で
ある。栓（５）を元に戻し先後、入れ九支持体（９）の
量などを操作車（至）を介して制御回路＠に入力し、つ
いでスタート指令を入力する。

すると制御回路−は、弁−、ｗ、　ｆ４．−を作動して
イソプロパツールと塩化メチレ／の混合溶媒−を反応器
（２）Ｋ供給し、支持体（９）を洗浄する。つま９、弁
−２輪を開いて溶媒−を供給し、弁−１輌會閉じたのち
、しばらくおいて弁−１輪を開いて排液し、弁−、ＩＩ
ｔ閉じる。これを数目行う。

この洗浄ののち、弁−１−を作動して保躾基脱離剤ＯＳ
ｔ反応器（２）に供給し、所定時間おいたのち、弁−２
ｆ４を作動して排液する。

支持体（９）に結合されてい九ＤＮＡ分子の末端部分の
反応基は、あらかじめ保護基としてジメトキシトリチル
基（Ｄ　Ｍ　’Ｉ’ｒ）をつけられてブロックされてｉ
るが、上記動作によって所定部位のＤＭＴｒが脱離され
る。

次に制御回路−は、再び弁−、Ｍ、　ｆ４．−を作動し
てイソプロパツールと塩化メチレンの混合溶媒（至）を
反応器（２）に供給し、支持体（１１）を洗浄する。

さらに弁−、ｗ、　ｔｏ、　ｕを作動してピリジン（２
）で反応器（ｚ）内を洗浄する。

ついｆ弁−、ｍ、　（ＩＩ、　＠を作動して’ＴＨＦ＠
で反応器（２）内を洗浄し、次に弁−１鱒を作動して窒
素ガスで反応器（２）内を数分間ブローする。これによ
如反応器（２）内は完全に乾燥される。

制御回路−は、合成しようとするＤＮＡの塩基配列に基
いて、異なる塩基を一つ４つのヌクレオチド試薬（ロ）
〜（ロ）から１つのヌクレオチド試薬を選択し、それに
対応する切換コツタおよびプランジャ駆動機構を作動し
、まえ排気前輪を作動してそのヌクレオチド試薬溶液を
反応ｅ）に供給する。

たとえば、塩基としてアデニンを持つヌクレオチドがＤ
ＮＡ塩基配列として次に必要ならば、（ロ）のヌクレオ
チド試薬溶液を選択し、切換コック（至）およびプラン
ジャ駆動機構−を作動し、排気前輪を作動してシリ／ジ
ボンプ−によって軸を反応１！　（りに供給する。

ま九同時に、切換コツタ＃Ｊシよびプランジャ駆動機ｌ
１ｌｌＩ曽を作動し、シリンジポンプ■によって縮合剤
（２）を反応器（りＫ供給する。

供給量は、ヌクレオチド試薬溶液と縮合剤の含計量が支
持体（９）を膨潤するのに充分な最低量となるように制
御される。具体的にはたとえば支持体（９）がポリスチ
レン粉体の場合には支持体１１６りに、ヌクレオチド試
薬的３ｓ／、＠合剤約２−とする。言うまでもなく、こ
れら最低量の試薬溶液中に充分に試薬を含むように一度
調整しておくことが必要である。

上記動作によって、支持体（９）に結合されてい友ＤＮ
Ａ分子の末端部分の所定部位に所望の塩基をもつヌクレ
オチドが連結される。なお、そのヌクレオチドの５水酸
基は、予め保繰基のＤ　Ｍ　Ｔｒによ松ブロックされて
いる。

支持体（９）がポリスチレン粉体の場合、支持体ＩＩ当
りに約０．１　ｍ　ｖｎｏｌｌのＤＮＡ分子の末端部分
が結合されており、その＃チとんどＫＵ上記のように新
たなヌクレオチドが連結される。しかしながら数９！穆
度は未反応で残る場合がある。この丸め制御装置軸は次
のように未反応の５水酸基にマスキングを行う。すなわ
ち、一定時間ののち、弁−１ｍ、　輪、ｔｉを作動して
ピリジン■にて反応器（２）内を洗浄する。次に、弁−
２＠を作動してマメ中ンダ用試薬−を反応器（２）に供
給する。を九同時に弁−を作動してマス中ンダ用縮合剤
（ハ）を反応１１　（りに供給する。

上記動作によりマスキングを行つ圧嵌、制御−路一は、
弁−１−１輪１輪を作動して反応器体）内をピリジン（
２）にて洗浄する。

ここまでの動作により、予め支持体（９）に結合されて
い九ＤＮＡ分子の末端部分に新九に１つのヌクレオチド
を連結する１りａｔイクルが終了する。

制御回路−は、弁−１−２御、１１を作動してインプロ
パノ−羨と塩化メチレンの混合溶媒−を供給する前記保
躾基脱離動作から上記マスキング−作までの合成すイク
ルを繰返し、操作卓■で入力された目的ＤＮＡを合成す
る。

さて、上記実施例ＯＤＮム合成装置（１）Ｋよれば、従
来と異なって、試薬溶液ＱＥ）〜（至）は常に支持体の
量に基いて算出される最低量で供給されて、かつ混合・
接触操作は行われない。そこで試薬消費量が節約される
と共に混合・接触操作用Ｏ装置も不１’になりて−る。

このように改良したのは、反応器（２）の反応部顛を小
型化すると共に、フィルタ（７）の上に支持体（９）ｔ
ｇ置し、上方から試薬溶液（ロ）〜に）を供給し、底部
から排液するようにしたためである。すなわち排液前輪
を閉じたまま試薬溶液を上方から供給すれば、その試薬
溶液は支持体（９）に含まれてこれを膨潤すると共にフ
ィルタ（７）より上の反応部（イ）内にとどまって下方
へ落ちない。従って、供給した全ての試薬溶液が反応に
参加し、デッドスペースに溜まるものが無くなる。この
結果、供給量は蛾低量で充分になり、また混合・接触操
作も無用になるわけである。

なお、新たなヌクレオチドを連結する反応の前に反応器
（２）内を完全に乾燥させて縮合反応を阻害する水分を
とり、反応効果を上げること本試−薬の節約に役立って
いる。

変形実施例として社、反応器（２）をロート状にしたも
の、樽状にしたもの、また反応部叫の容積をＢＯ＃Ｉｊ
〜８００μｌの間で変化したものが挙けられる。

他の実施例としては、ホスホモノトリアゾリド法やホス
７了イト法、あるい祉ジエステル法によるＤＮム等合成
鋏装にこＯ発明を適用しえものが挙げられる。

固体支持体＠）０他ｔ）ｆ４トしテｉｔ、Ｋｅｌ−Ｆ−
ｇスチレン、シリカゲル、ポ９アタリルモル７オリドな
どがある。これらの支持体は粒ａＳＯ〜３００ＩＩＳＳ
度ｏ４ｏが好ましい。

以上の脱明から理解されるように、この発明のＤＩム等
微量自動合威懐装によれば、高価な合成用試薬の無駄な
消費が抑えられてランニングラストが安価に＆る効果が
ある。まえ、混合・接触操作も不要となる。さらに、必
要量だけの微量合成ができ、無駄がない。

【図面の簡単な説明】

第１Ｉ！１はζｏｌ案ＯＤＭム眸自勅黴量合成値置装一
実施例であるＤＮム黴量自動合成装置０ＩＩＩ成説明図
である。 （１）ＤＮＡ微量自動合成装置、（り−・・反応器、（
３）・・・本体、　　　　　　（４）・・・フラン２部
、（６）・・・試薬溶液等供給口、（７）・・・フィル
タ、（８）・・・排欲目、　　　　　（９）・・・支持
体、叫・・・反応部、 ９す〜四、（１４〜−リ・・・試薬溶液、（ト）〜（４
）−・切換コック、（ハ）〜（ハ）・・・シリンジポン
プ、に）〜に）・・・プランジャ駆動機構、−・−・制
御回路、（至）〜（２）・・・婢媒、　　　−〜−１ｆ
４−・・・弁。 丁　　続　　ン山　　＋ｌ　　　ｔ７Ｍ１：Ｉａ’ｌ　
Ｉ　ｉ艮口°　６杉　用人　殿１　ツ１ｆ′１の入車 昭和５７年特許願第３０８８７号 ２．１を明の８拘１ １）へΔ′！！ｉ微−自動合成装置 ：３　補１１をづる石 ＄１９どの関係　　特許出願人 ｆｌ　　Ｉｆｌｉ　　　５；４都市中ｈ４ト？Ｏ１１京
町通　条トルーノ船人町３７８番地名　称　　　（１９
９）株式会着易１４！製作曹　　　　（ほか１名）代人
者績地　願力 ・１代１！１人〒ｉ）：３０ Ｉｆ　　１９１　　　大阪山北層西人満：３１１１１　
３りＡ−ター・ワンじル１）、鋪１１命令の（」イ・１
　　（自発）０　補１１に」、り増加４る弁明の故 ９、前記以外の補止をｆる者 事件との関係　　′１棉９出験人 住　ＰＪｉ　　　大阪市福島区福島３Ｊｌｊ１１３９月
氏　名　　　湧水薬品株式会社 代表考　　湧水　低助 午、Ｉ１１′１ｏＩ４水の範囲 １．　反応器が、Ｖ部【ご試薬浴液等供給ｆ１をイ」（
−７、内部Ｌ　／］にｌ）　Ｎ　Ａ等合成用の固形支持
体を載置ｕＪ能Ｃ−かつ試薬ｍ欲を通過しうるフィルタ
を有し、底部（こＩＪ［故［」をｈし、フィルタＬｈに
微麺容柚のに応Ｍ空聞を石づる′＃器ｋ【構成されると
共に５反応器に入れられた１記支持体の皺に応じた鰯（
試薬ｆｄ欲を供給しつる試薬ｍ油供給手段を貝鍋［（シ
シるＬ）　Ｎ　Ａ　’Ｓ微−自動合成鋏装。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、反応器が、上部に試薬溶液等供給口を有し、内部下
   方にＤＮＡ等合成用の固形支持体を載置可能でかつ試薬
   溶液を透過しうるフィルタを有し、底部に排液口を有し
   、フィルタ上方に容積８０μｍ〜８００μｌの反応部空
   間を有する容器にて構成されると共に、反応器に入れら
   れた上記支持体の量に応じ走置で試薬溶液を供給しつる
   試薬溶液供給手段を具備してなるＤＮＡ等微量自動合成
   装置。