JPS5826319B2 - コウソサヨウニヨル オンドヘンカノソクテイホウホウホウ オヨビ ソウチ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 近年生物学的系や酵素反応の研究のために、特に一般的
な分析手段として微量熱量測定法（ｍｉ−ｃｒｏｃａｌ
ｏｒｉｍｅｔｒｙ）を使用することに相当な関心が寄せ
られ、高感度で正確な微量熱量計（ｍ ｉ −ｃｒｏｃ
ａ ｆｏｒ ｉｍｅ ｔｅｒ ）が市販されている。

本発明は）酵素サーミスタ（ｅｎｚｙｍｅ ｔｈｅｒ
−ｍｉｓｔｅｒ）と呼ぶことができる手段を使用するこ
とによって、酵素を含む生物学的系の熱分析を行う方法
に関する。

酵素が電極のまわりの液体フィルム中に配置されるか、
あるいは、ポリマーフィルム内に不動に保持されるよう
になっている酵素電極（ｅｎｚｙｍｅｅｌｅｃｔｒｏｄ
ｅ）の場合のように、本発明においても検出器は反応の
行なわれる位置の直ぐ近くに配置される。

そして酵素の反応に基因する温度変化はたんばく質の微
小雰囲気（ｍｉｃｒｏｅｎｖｉ ｒｏｎｍｅｎｔ）内で
非常に顕著であるので、容易に測定することができる。

例えば、グルタルアルデヒドと交鎖結合した酵素（ｇｌ
ｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ ｃｒｏｓｓ １ｉｎｋｅｄ
ｅｎｚｙｍｅ）で熱検出器もしくはサーミスタを覆う
か、またはサーミスタを囲む透析袋（ｄｉ ａｌｙｓｉ
ｓ ｂａｇ）に酵素を入れることによって、たんばく質
を熱検出器ないしはサーミスタに直接固定することが提
案されている。

この場合、温度変化は検出できるが、酵素活動の効率が
低いこと、あるいは膜を通しての基質／生成物の拡散障
害が問題を提起する。

その上、大きい熱損失がある。

本発明によれば、マトリックス結合酵素（ｍａ−ｔｒｉ
ｘ−ｂｏｕｎｄ ｅｎｚｙｍｅ ）を含む流路によって
熱検出器を包囲し、酵素の作用によって影響される基質
（５ｕｂｓｔｒａｔｅ）をこの流路を通過させることに
よって、好結果が得られる。

本発明は酵素の作用によって生じる温度変化を測定する
ための方法および装置に関するものである。

不動化された酵素のベッドからなる流路に直接熱検出器
を配備することにより優れた結果が得られた。

熱検出器を約１ ｍ ｌの酵素を保持したガラス玉を含
んだマイクロカラム（４０ｍｉｘ６ｍｍ）のほぼ中央に
配置したとき、相当な熱応答が被試験酵素のトリプシン
、アビラーゼ、ウレアーゼによって得られた。

熱検出器は、らせん状ループの形状に形成された流路内
に配置することもでき、この場合も好結果が得られた。

生物学的系内に存在する酵素は例えばアルキルアミノガ
ラス（ａｌｋｙｌ ａｍｉｎｏ ｇｌａｓｓ）のような
ガラスあるいはプラスチックのビード上に固定させる（
ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ）ことができる。

コノ場合、酵素は−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２の腕を介して
ガラスに結合される。

酵素はまた多孔性ポリアクリルアミドに被包させること
もできる。

以下図面を参照して本発明の詳細な説明する。

第１図に示すように、本発明の装置は熱検出器としてサ
ーミスタ１３を有する。

このサーミスタとしては、例えば、米国、オハイオ州、
イエロースプリンゲスインストルメント社（Ｙｅ ｌ
ｌｏｗ Ｓｐｒ−ｉｎｇｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃ
ｏ、）製プレシジョンサーミスタＹＳＩＡ４４１０６（
抵抗値は２５°Ｃで１０にΩ〕を使用できる。

このサーミスタは電子温度測定器ｌ ４ （Ｋｎａｕｅ
ｒ、Ｗｉ ５ｓｅｎｓｃｈａｆ ｔｌ １ｃｈｅｒ Ｇ
ｅｒ’１−ｔｅｂａｕ 、 Ｗ、 Ｂｅｒ ｌ ｉｎ
）に接続されている。

温度変化に基因するサーミスタの抵抗変化は、この電子
温度測定器の超安定高感度増幅器を備えたホイートスト
ーンブリッジで測定される。

温度変化はレコーダ１７ （Ｗ＋Ｗレコーダ３００１Ｋ
ｏｎｔｒｏｎ、ＺＭｒ ｉｃｈ、Ｓｗｉ ｔｚｅｒｌａ
ｎｄ）に直接記録される。

この装置はｏ、ｏ２℃の温度変化（Ｊ、Ｔ）でレコーダ
の全目盛ないしはフルスケール（１００ｍＶ沖振れを示
す。

サーミスタ１３はプラスチック管１１、好ましくはエポ
キシ樹脂によって接着されたポリビニル管（内径１ ｍ
ｍ ）のらせん状ループ１２に底を付けて内径４ｍｍの
容器を形成し、この容器内に配置する。

サーミスタはこの容器内のパラフィン油中に挿入される
。

パラフィン油は低い熱容量の液体として知られ、良好な
熱接触を与える。

ループ１２は空気が満された二重壁容器２２内に収容さ
れる。

この容器はらせん状ループ１２に連結された入口１８お
よび出口１９と、サーミスタ１３を挿入する開口以外は
閉封されている。

この測定セル全体はタンクｌ ５ （Ｈｅｔｏｔｈｅｒ
ｍ、０．５ＰＧ ６２３ＵＯ，Ｈｅｔｏ Ｂｉｒｋｅｒ
’６ｄ、Ｄｅｎｍａｒｋ）の恒温浴２０内に配置される
。

入口管１８の一端部は恒温浴中に低く配置され、流入し
てくる流体の温度を調節するために多数のループ１６に
形成され、その流体を導入するためのポンプ２１に連結
される。

上述の装置によって、二種の酵素、トリプシンとアビラ
ーゼを試験した。

標準サーミスタを必要としないことが判明した。

ループ（総容積１８０μｌ）は約１００ｍｇ（含水重量
）の酵素を保持したガラスビードを収容し、この系中に
ぜん動ポンプ（ＬＫＢ Ｂｅｃｋｍａｎ、Ｐｅｒｐｅｘ
）によって１０ｍ１／ｈの低速度で基質溶液を通した。

マトリックス結合酵素は管内にポンプで容易に導入する
ことができ、グラスファイバーのプラグによって管から
の流出を防止することができる。

緩衝および基質溶液は三方弁によりセル内に導入した。

二種の酵素すなわちトリプシン（シグマ、２回結晶化、
３６ユニツ）／ｍｇ）とアビラーゼ（シグマ、ジャガイ
モ、品質１ 、１０００Ｕ（５’−ＡＴＰアーゼ−活性
）１０．４１７グラム乾燥重量；５′−ＡＴＰ２．４Ｕ
／ｍｇ 、５’ −ＡＤＰ２．９Ｕ／ｍｇ、５／−Ａ
Ｍ Ｐ ０．０５ Ｕ／ｍｇ ）はライ−トール（Ｗｅ
ｅｔａｌｌ）によって開発された方法により、２．５％
グルタルアルデヒドによって活性化したあと、アルキル
アミノガラスの微粒子ないしビード（直径７０〜１５０
μ、細孔直径７００Ａ）に別々に結合させた。

トリプシン（１５ｍｇ）とアビラーゼ（５０ｍｇ）を０
．５グラムの乾燥したガラスビードに結合させた。

ループは各別の分光測定により、全酵素活性約３ユニツ
ト（トリプシン）あるいは１．５ユニツト（アビラーゼ
）を保有した。

第２ａ図はガラスに結合されたトリプシンを収容した系
内に、０．１Ｍトリス−塩酸ｐＨ８，０中におケルベン
ゾイル−Ｌ−アルギニンエチルエステル（ＢＡＥＥ）の
６ｍＭ溶液１．０ｍｌのパルスを注入して得られた結果
を示すグラフである。

この測定および以下に述べる測定においては、レコーダ
のフルスケールが０．１℃の温度変化に対応するような
感度範囲が選定された。

第２ｂ図は上記系に上記と同じ溶液を連続して流通させ
たときの反応を示す。

この場合、記録された温度変化が第２ａ図の場合よりも
幾分高いのは、上記パルス中に存在する基質の量が、流
体マイクロカロリメータにより従来間らかにされている
ように、熱平衡を与えるのに十分でないという事実に基
づく。

トリス緩衝液の代りに０．１ Ｍ ＩＪン酸塩緩衝液（
ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ）ｐＨ８，０中で反
応を行わせると、温度応答（変化）は前者の場合より低
かった。

ここで強調されるべきことは、エステルの加水分解反応
の、（Ｈ値は普通零に近く、記録された全熱量は主とし
て生成された酸から緩衝液へのプロトン移動（ｐｒｏｔ
ｏｎ ｔｒａｎｓｆｅｒ）によるということである。

これはトリスおよびリン酸緩衝液のプロトン化（ｐｒｏ
ｔｏｎｉ ｚａｔ １ｏｎ）において、発生する熱につ
いて文献の示す値、それぞれＪＨ−−４７，４８ＫＪ／
ｒｎｏ ｌおよび−４，７４ＫＴ／ｍｏ １に対応して
いる。

第３図においてはピーク（ＪＴ”Ｃ）の高さく△−△）
が固定されたトリプシンに加えられる基質の量（１〜８
ｍＭ溶液１ｍ１）の関数として表わされている。

はぼ直線的な関係が記録されたＡＴと添加された基質の
量との間に現われている。

１μｍｏｌの基質を添加したあとで得られる応答はＡＴ
が０．０１℃で、これはレコーダのダイヤグラムのフル
スケール値（ＡＴ＝０．１°Ｃ）の１０％に相当し容易
にかつ再現可能に検出される。

ピークの下の積分面積（・−・）を添加された基質の量
に対してプロットするか、あるいは曲線の最大傾斜をプ
ロットしても、同様な関係が得られる。

加えられたエステルは、ガラスに結合されたトリプシン
を、収容したループを、通過させることによって、使用
されたすべての濃度において、完全に加水分解されるこ
とを流出液の分光分析によって示すことができる。

ＡＴＰ（アデノシン三リン酸）をガラスに結合されたア
ビラーゼによって刃口水分解したときのＪＴは、基質の
濃度の関数として検知された。

酵素調製液は５’−ＡＴＰａｓｅ 、 ５’−ＡＤＰａ
ｓｅ ｓ ５’−ＡＭＰａｓｅ（総活性の約１％）を含
み、反応によってＡＴＰからＡＭＰ（アデノシン−５′
−リン酸）が生成された。

第４図は添加されたＡＴＰ（０，１ＭベロナールＨＣｌ
、 １ ｍＭＣａＣｌ ２ 、ｐＨ６，７中における
１〜８ｍＭ溶液１ｍ１） と記録されたＡＴ（℃）（
△−ム）との間のほぼ直線的な関係を示す。

この場合もトリプシンの場合と同様に、添加された基質
の量とピークの積分面積（・−・）あるいは曲線の最大
勾配との間にも直線関係が得られた。

対照実験において無機リン酸塩におけるＡＴＰ８μｍｏ
ｌを含む溶液１ｍｌのパルスを加えたあと、流出液を分
析した。

このＡＴＰの濃度において検出された無機リン酸塩の量
は、添加されたすべてのＡＴＰがループ通過後完全にＡ
ＭＰに加水分解されたことを示した。

発生した熱が真に特定の酵素反応の結果であって、例え
ば基質の稀釈による熱効果に基づくものではないことを
間接的に証明するために、１０ｍＭＢＡＥＥ溶液１ｍｌ
のパルスをループに刃口えた。

温度変化は伺ら記録されなかった。

また１０ｍＭＡＴＰ溶液の１ｍｌのパルスをトリプシン
を含んだループに与えたが、はんのわずかな温度応答（
アビラーゼによる総熱量の５％以下）しか記録されなか
った。

要約すると、二つの酵素反応において測定された温度変
化は基質の量を１μｍｏｌまで正確に測定できるのに十
分な程度の大きさである。

トリス緩衝液におけるプロトン化熱（ｐｒｏｔｏｎｉｚ
ａｔ １ｏｎｈｅａｔ） に関する報告に基づいて次
の計算を行うことができる。

６ｍＭＢＡＥＥ溶液１０ｍ１／ｈの流れが８００ μＷ
（０，ＯＬ ６７Ｘ １０−６ｍｏｌ／ｓｅｃ Ｘ４７
．８Ｘ１０３Ｊ）の熱を発生するので、記録されたＡＴ
の値０，０７°Ｃ（第２ｂ図）は〜０，０１℃のふれが
１００μＷに対応することを意味する。

この結果は特別に改造された流通セルを備えた市販の改
良された流通カロリーメータによって得られる感度と比
較して優れている。

検出器を反応場所のごく近くに配置することにより、従
来のマイクロカロリーメータにおいて必要であった特殊
なシールドや熱電対（ｔｈｅｒｍｏｐｉ ｌｅ）は不要
となる０ 本発明の酵素サーミスタは多くの利点を有している。

一つの利点は、このシステムの一部をなすマトリックス
結合酵素調製物が安定で繰返し使用できることである。

例えば、ガラスに結合されたトリプシンの場合、１０日
間の長い分析期間でも熱の発生に何ら減少は見られなか
った。

また酵素が変性すると、これを簡単にループから除去し
てループに新しい酵素を充填することができる。

分析手段としての酵素サーミスタの固有の有効性はもち
ろん明らかであるが、他の分野例えば親和クロマトグラ
フィのためのモデルシステムとしても使用できる。

本発明は更に臨床分析、例えば尿素、ぶどう糖の分析に
も使用でき、迅速な分析を行うことができる利点を有し
ている。

更に本発明は連続した工程の測定、ペニシリンの製造に
おける醗酵工程にも用いることができる。

本発明の酵素サーミスタは生物学的系の熱分析のための
従来の装置よりも安価である。

本発明は更に次のような利点を有する。

分光光度計による測定では透明な溶液を必要とするが、
本発明の測定は不透明な溶液、例えば着色溶液、あるい
は微粒子を含む溶液においても行うことができる。

本発明では分光測定にしばしば必要とされる附加的な酵
素を使用せずに、一次的な酵素反応に関連して測定を行
うことができる。

本発明では一つの溶液に含まれる種々の物質を直列接続
された異ったサーミスタを用い同一基質溶液を使用して
測定できる。

従って被測定溶液の量が少くてすむ。

このことは、例えば血液分析のような医学的な応用に有
利である。

本発明の熱検出器は万能検出器であり、基質の量だけで
なく酵素の量も測定できる。

このことも医学的利点である０ 本発明が好適に使用できる酵素の例としてはペニシリナ
ーゼ、ウレアーゼ、グルコース酸化酵素およびトリプシ
ンやアビラーゼのようなエステラーゼ（ｅｓ ｔｅｒａ
ｓｅ ）がある０ 以下本発明の実施例を要約する。

（１）マトリックス結合酵素を含む流路によって熱検出
器を包囲し、前記酵素によって影響される基質を含む流
体を前記流路を通し、前記検出器によって検出された温
度変化を前記検出器に接続された温度測定装置によって
測定することを特徴とする酵素作用に基づく温度変化の
測定方法。

（２）前記基質を含む流体が通される流路に前記熱検出
器を配備したことを特徴とする（１）項の方法。

（３）前記流路によって形成された望ましくはらせん状
ループに前記熱検出器を配置したことを特徴とする（１
）項の方法。

（４）マトリックス結合酵素を収容するための好ましく
はらせん状ループ部分１２を有するとともに流体の流路
を形成する管１１と；前記ループ部分によって包囲され
た熱検出器１３と；この熱検出器に接続された温度測定
装置１４と；前記ループ部分が収容される好ましくは空
気で満たされた断熱容器２２と；この容器と流入流体の
温度を調節するために前記流路の流入側の長い部分とが
収容された恒温槽とからなることを特徴とする酵素作用
に基づく温度変化の測定装置。

（５）前記らせん状ループ部分が円筒状容器に形成され
この容器に収容された低い熱容量の液体内に前記熱検出
器を配置したことを特徴とする（４）項の装置。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の装置の概略構成図、第２ａ図、第２ｂ
図、第３図および第４図は第１図の装置による測定結果
を示すグラフである。 １１・・・・・・プラスチック管、１２・・・・・・ら
せん状ループ、１３・・・・・・熱検出器（サーミスタ
）、１４・・・・・・温度測定装置、１５・・・・・・
タンク、２０・・・・・・恒温浴、２１・・・・・・ポ
ンプ、２２・・・・・・二重壁容器。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ マトリックス結合酵素を含む流路によって熱検出器
   を包囲し、前記酵素の作用を受ける基質を含む液体を前
   記流路に導入し、前記検出器によって検出された温度変
   化を前記検出器に接続された温度測定装置によって測定
   することを特徴とする酵素作用による温度変化の測定方
   法。 ２ マトリックス結合酵素を収容するための好ましくは
   らせん状ループ部分を有し、液体の流路を形成する管と
   ；前記ループ部分によって包囲された熱検出器と；この
   検出器に接続された温度測定装置と：前記ループ部分を
   収納する好ましくは空気で充たされた断熱容器と；この
   断熱容器を収容する恒温槽とからなることを特徴とする
   酵素作用による温度変化の測定装置。 ３ マトリックス結合酵素を収容するための好ましくは
   らせん状ループ部分を有し、液体の流路を形成する管と
   ；前記ループ部分によって形成され低い熱容量の物質を
   収容する容器と；この容器内に配置された熱検出器と；
   この検出器に接続された温度測定装置と：前記容器を収
   納する好ましくは空気で充たされた断熱容器と；この断
   熱容器を収容する恒温槽とからなることを特徴とする酵
   素作用による温度変化の測定装置。