JPS5863393A - リボノフラノシル又はデオキシリボフラノシルプリン誘導体の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はヌクレオシドホスホリラーゼの作用を利用して
次の一般式（りで表わされるリボフラノシル又はデオキ
シリボフラノシルプリン誘導体を製造する方法に関する
。

（式中のＸは水素原子、塩素原子、水酸基、アミノ基、
メルカプト基、メチル基、エチル基、Ｙは水素原子、塩
素原子、水酸基、アミ７基、メルカプト基であり、Ａ、
Ｂは炭素原子または窒素原子であり、かつＡが窒素原子
のとき、Ｂは炭素原子を、Ａが窒素原子のとき、Ｂは炭
素原子を表わし、更に２は水素原子または水酸基である
。）一般式（ＩＩに於てＡが窒素原子（Ｂは炭素原子）
、ＸおよびＹが水素原子、２が水酸基である９−β−Ｄ
−リボフラノシルプリンはネプラリンと呼ばれる抗生物
質であり、茸の成分として填隙され、その後ＤＮＡ合成
阻害作用を有することが報告されている（　Ｖ、　Ｂｏ
ｈｒ、　Ｂｌｏｅｈｉｍｉ＋　Ｂｉｏｐｈｉｍｌ＋　Ａ
ｅｔａ５１９、　１２５（１９７８））。また、Ａが窒
素原子（Ｂは炭素原子）、ｘがノルカプト基、Ｙが７ミ
ノ基である９−β−Ｄ−リボフラノシルチオグ７ノシン
または９−β−Ｄ−Ｍ−デオキシリポフラノシルチオグ
７ノシンは抗癌作用を有することが知られており（Ｒ，
Ｊ、　８ｅｈｉｔ窓・ｒ　ａｔ　ｍｌ。

Ｅｘｐ＠ｒ１ｍｅｎｔａｌ　Ｃｈ＠ｍｏｔｈ＠ｒａｐｈ
ｙ　４　、　１３４（１９６６））、その製造法として
化学合成法が知られている（　Ｆｏｘ　ａｔ　ａｌ、　
Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｗ、　Ｓｏｅ。

８０、　１６６９〜１６７５（１９５Ｂ））。更に、Ａ
が炭素原子、Ｂが窒素原子、Ｘが水酸基、Ｙが水素原子
、２が水酸基であるアブリノールリボシド（９−β−Ｄ
−リボフラノシルー４− ｈｙｄｒｏｘｙｐｙｒａｚｏｌｏ　（３、４−ｄ　）　
ｐｙｒｉｍｊｄｉｎ＊　）は原虫体内で特異的に活性化
されて殺虫効果を発現するユニークな寄生虫駆除剤とし
て知られている（　Ｄ、　Ｊ、　Ｎｅｌｇｏｎ　ａｔ　
ａｌ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、。

２５４、　１１５４４（１９７９））。

本発明者等はヌクレオシドホスホリラーゼの作用につい
て研究を進めていくうち、一般式（１）で表わされるプ
リン誘導体にリボース−１−リン酸、デオキシリポース
−１−リン酸又はそれらの供与体の混合液にヌクレオシ
ドホスホリラーゼを加えて４０〜７０ｃの温度で作用す
ると効率良くプリン誘導体をリボフラノシル化またはデ
オキシリボフラノフル化できることを発見し、本発明を
完成するに至った。

即ち、本発明は、下記一般式＋１）で示されるプリン誘
導体および（＆）リボース−１−リン酸もしくはヌクレ
オシドホスホリラーゼの作用によりリボース−１−リン
酸を生成するリボース供与体または（ｂ）デオキシリボ
ース−１−リン酸もしくはヌクレオシドホスホリラーゼ
の作用でデオキシリボース−１−リン酸を生成するデオ
キシリポース供与体を含む水溶液に、ヌクレオシドホス
ホリラーゼを添加し、該水溶液を４０〜ｔＯＣに保持し
て式１茸）のりボフラノシルまたはデオキシリボフラノ
シルプリン誘導体を生成せしめることを特徴とするりボ
フラノシルまたはデオキシリボフラノシルプリン誘導体
の製造法に係るものである。

一般式（１） （式中のＸは水素原子、塩、素原子、水酸基、アミノ基
、メルカプト基、メチル基、エチル基、Ｙは水素原子、
塩素原子、水酸基、７ミノ基、メルカプト基であり、ま
たＡおよびＢは炭素原子もしくは窒素原子であり、かっ
＾が窒素原子のとき、Ｂは炭素原子、Ａが炭素原子のと
き、Ｂは窒素原子である。） 本発明で使用されるヌクレオシドホスホリラーゼはプリ
ンヌクレオシドまたはピリミジンヌクレオシドを加リン
酸分解してプリン塩基とリボース−１−リフ＃またはピ
リミジン塩基とリボース−１−ｙン酸を生じせしめる作
用を有する酵素であり、プリンヌクレオシドに作用する
プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、ビリミジンヌクレ
オシドニ作用するウリジンホスホリラーゼ、チミジンホ
スホリラーゼ等のピリミジンヌクレオシドホスホリラー
ゼが用いられ、動物組織より抽出したものあるいは微生
物菌体より抽出したもの等その起源を問わず、使用する
ことができる（特開昭５６−８６９５）。

酵素は精製した酵素である必要はなく、微生物起源の酵
素を使用する場合にはヌクレオシドホスホリラーゼを生
産する能力を有する微生物を栄養培地で培養して得られ
る微生物画体をそのまま便用することができる。その他
、微生物のアセトン乾燥菌体、菌体の摩砕物、超音波処
理物、界面活性、トルエンあるいはリゾチーム等で処理
した菌体等の菌体処理物、更に該菌体処理物から抽出し
た粗酵素標品および天然、合成ポリマーに回覧化゛した
菌体も同様に使用することができる。

上記ヌクレオシドホスホリラーゼを生産する能力を有す
る微生物としては具体的には次のような微生物が使用さ
れる。

シュードモナスΦデイミヌｌ　　　　ＡＴＣＣ１１５６
ｇ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ’　ｄｉｍｌｎｔ＋ｔａ）
フラボバクテリウム・レーナヌム　　　　ＣＣＭ　　２
９８（Ｆｌａｖｏｂａｅｔｅｒｉｕｍ　　ｒｈ＠ｎａｎ
ｕｍ）アクロモバクタ−・ラフチウム　　ＣＣＭ　　６
９（Ａｅｈｒｏｍｏｂａｃｔ＊ｒ　ｌａｅｔｉｕｍ）サ
ルモネラ・スフットムエレリ　ＡＴＣＣ８７５９（８ｍ
１ｍｏｎｅｌｌａ　ｓｅｂｏｔｔｍｕｅｌｌｅｒｉ）（
Ｐｒｏｔｅｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ）（Ｍｉ、ｃｒｏｃ
ｏｃｅｕａ　　ｌｕｔ＠ｕａ）（Ｂａａ目１ｕａ　ｓｕ
ｂｔｌｌｌｉｍ）（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔ＠ｒ　ｓｌｍ
ｐｌｅｘ）ブレビバクテリウム・イマリオフイリウム　
　ＡＴＣＣ１４０６８（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ
　　ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｉｕｍ）アルカリゲネス・
ファエカリス　　ＡＴＣＣ１６１７３（Ａ１ｃａｌｉｇ
＠ｎｓｓ　ｆａｓｅａｌｉｍ）スポーサルシナｅウレア
エ　　　　ＡＴＣＣ６４７３（８ｐｏｒＯｓａｒｃｉｎ
ａ　ｕｒ＠ａ＠）一般式（１）のプリン誘導体と反応す
るリポース供与体またはデオキシリポース供与体はヌク
レオシドホスホリラーゼによる加リン酸分解によってリ
ポース−１−リン酸もしくはデオキシリポース−１−リ
ン酸を生成するリポースもしくはデオキシリポース誘導
体であり、リポース供与体としてはアデノシン、イノシ
ン、グアノシン、キサントンン、ウリジン、シチジン、
オロチジン　等のりポスクレオシド類が用いられ、デオ
キシリポース供与体としてはデオキシアデノシン、デオ
キシイノシン、デオキシアデノシン、デオキシ７チジン
、デオキシチミジン等のデオキシリボヌクレオシド類カ
用いられる。その他これらのヌクレオシド類にリン酸の
結合したりポアクレオチド類およびデオキシリボヌクレ
オチド類も使用することができる。

式（１１のプリン誘導体をリボフラノシル化またはデオ
キシリボフラノシル化する反応は、式（１）のプリン誘
導体と（−）リポース−１−リン酸もしくはリポース供
与体またｔ、ｉ　（ｂ）デオキシリポース−１−リン酸
もしくはデオキシリホース供与体を０．１〜１．０％含
有する水溶液にヌクレオシドホスホリラーゼを加え（０
，１〜５．０単位／１１）、該水溶液のｐＨを４．０〜
１０．０の範囲に調整した後４０〜７０Ｃに保持するこ
とによって行われ、時々攪拌しながら１．０〜２０時間
反応させると、反応液中Ｖこ目的とするりポフラノシル
プリン誘導体が著量蓄積される。

このリボフラノシル化反応はプリンヌクレオシドホスホ
リラーゼによって触媒されるが、リポースまたはデオキ
シリホース供与体としてピリミジンまたはデオキシピリ
ミジンヌクレオシド類を使用する場合、プリンヌクレオ
シドホスホリラーゼにはピリミジンヌクレオシドからリ
ポース−１−リン酸を生成しないので、この場合にはプ
リンヌクレオシドホスホリラーゼとピリミジンヌクレオ
シドホスホリラーゼを併用することが必要である。

幸いなことに、前記微生物のなかにはクレブシェラ・ニ
ューモニアＡＴＣＣ９６２１，エシェリヒア−２！ｌＡ
ＴＣＣ１０７９８等両方の酵素をバランス良く生産する
ものが含まれでいるので、このような微生物菌体を使用
すれば良く、両酵素の製造方法は特開昭６６−８６９５
号公報実施例１に配賦されている方法に従って行えば良
い。

本発明の方法では反応温度は２０〜７０Ｃの範囲であれ
ば良いが、温度が高い方が反応速度が早いので４０〜７
０Ｃの範囲が望ましい。特に微生物菌体を酵素源として
使用する場合、温度が４０Ｃ未満のときには反応が遅い
ばかりでなく副反応を伴うため長時間反応させても反応
収率が低く、その上副反応會こよって生ずる副生物の除
去に手間がかかるので不利であるので４０Ｕ〜７０Ｕと
高くすることが必要である。

反応液より生成物を採取する方法は公知の方法に従って
行えば良く、遠心分離等によって不溶性物質を除去し、
水や有機溶媒に対する溶解度差を利用する方法やイオン
交換クロマトグラフィー等にヨッて分離することがテキ
ル。

以下、実施例にて説明する。

実施例オ 酵母ｚキスｏ、ｓ　ｔ／ｄｉｓ　ヘプ）　７１．０　ｆ
　／　ｄｌ。

肉エキス１．０ｆ／ｄｌおよび食塩０．５ｔ／ｄｔを含
むｐＨ７，２の液体培地１００ｓｄを５００ｙｄ容の坂
ロフラスコに入れ１２０Ｃで１ｏ分間滅菌した。この培
地に、ウリジンホスホリラーゼおよびプリンヌクレオ７
ドホスホリラーゼを生産する能力を有するエシェリヒア
・コリＡＴＣＣ１ｔ１７Ｑ８　をｔ白金耳接種し、３０
ｃにて２４時間振盪培養を行った。培養液を遠心分離し
て菌体を集め、生理食塩水で洗滌した後０．０５　Ｍ　
！Ｊン酸緩絢液（ｐＨ７，０）・′：１゜ に懸濁した（　１０　ｏ　ｑ／ｍｌ、湿潤菌体重量）。

この菌体懸濁液０．５ｍ（ウリジンホスホリラーゼ０．
５単位、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ活性０．３
単位）を下記の組成の反応液０．５ｄ＃＋：加え、これ
を第１表に示す各温度に保ち、その間時々振盪して５時
間反応を行い、次いで１ＧＯｎで５分間加熱し反応を停
止した。

反応液の組成 ウリジン　　　　　　　　　　４．０ｆｌｄｔプリン又
はチオグアニン　　０．４〃 Ｋｌ（、ＰＯ４０，８ｇ 各反応液中の９−β−Ｄ−リボフラノシルプリン又は９
−β−Ｄ−リボフラノシルチオグ７ノシンの生成量を高
速液体クロマトグラフィーにより定量した。定量は日立
製作所■６３５型（カラム：　Ｚｉｐａｘ　８ＣＸ　　
５００　ｇ　）を使用し、温度４０ｃ。

圧力ｔｏｏｈ／ｃｊ、流速２０ｄ／分の条件で０．０１
Ｍリン酸１カリ溶液な溶離液とし、オーセンティク標品
（シグマ社製）を対照として行った。その結果を第１表
に示す。

第１表　リボフラノシルプリンの生成量（■／ｄｌ　）
２０　　　　　　　　１３０　　　　　　　　１２５２
５　　　　　　　　１５０　　　　　　　　１５５３０
　　　　　　　　１７３　　　　　　　　１８Ｇ３５　
　　　　　　　１９２　　　　　　　　１９３４０　　
　　　　　　　２３３　　　　　　　　　２２５４５　
　　　　　　　　２３８　　　　　　　　　２４０５０
　　　　　　　　２４０　　　　　　　　２５３５５　
　　　　　　　　２５５　　　　　　　　　２７０６０
　　　　　　　　　２６５　　　　　　　　　２８Ｇ６
５　　　　　　　　２５０　　　　　　　　２６０７０
　　　　　　　　　　３５　　　　　　　　　　１５（
１）　　９−β−Ｄ−リボフラノシルプリン（ネプラリ
ン） ＠）　　９−β−Ｄ−リボフラノシルチオグ７ノシ実施
例２ 実施例１のウリジンの代りにデオキシチミジンを用いて
実施例１と同様の反応を行い、反応液中に生成するデオ
キシフラノシルプリン誘導体の生成量を実施例１と同様
の高速液体クロマトグラフィーで定量した。その結果を
第２表に示す。

２０　　　　　　　　　１１５　　　　　　　　　１２
７２５”’　　　　　　　１１８’　　　　　　　　　
１３３３０　　　　　　　　　１４２　　　　　　　　
　１４５３５　　　　１６５　　　　１７２ ４０　　　　　　　　１８２　　　　　　　　１９５４
６　　　　２００　　　　２０５ ５０　　　　２１５　　　　２２０ ５５　　　　２２０　　　　２３０ ６０　　　　２２　Ｓ　　　　　、、　２３　Ｓ６５　
　　　２２０　　　　２３５ ７０　　　　　４０　　　　　２８ ＠　９−β−Ｄ−２−チオキシリボフラノシルプリン （転）　９−β−Ｄ−２−デオキシリボフラノンルチオ
グ７ノシン 実施例３ 第３表に示す微生物を実施例１と同様の方法で培養した
。得られた培養液を遠心分離して一体を集め、生理食塩
水で洗滌した後、夫々０．０５　Ｍ　）リス塩酸繰向液
（ｐｔｉｓ、ｏ）ｃ懸濁し、湿菌体濃度１００Ｑ／ｗｊ
の菌体懸濁液をｉ４製した。この菌体ＩＩｌ濁液０．５
−に、リポース−１−リン酸バリウム塩４０ｆ／ｄｉと
プリン誘導体としてプリン、チオグアニン、チオヒボキ
サンチン又はロビンス等の方法（Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｕ
ｍ、　８ｏｅ、　７８．　７８４（１９５６））に従っ
て調製したアロプリノール（４−ｂｙｄｒｏｘｙｐｙｒ
ａｚｏｌｏ　（３、４−ｄ　）　ｐｙｒｉ；１ｄｉｎａ
　）を０．４　ｔ／ｄｌ含む上記緩衝液０．５−を加え
時々攪拌しながら４１（ ＳＯＣに一６時間保持して酵素辱応を行った。反応液を
１００ｔ：’で５分間加熱した後反応液中に生成したり
ボフラノシル誘導体の生成量を実施例１と同様の高速液
体クロマトグラフィーで定量した。

その結果を第３表に示す。

第３表　リボフラノシルプリン誘導体の生成量（ｑ／ｌ
ｉｔ　）（１）　　９−β−Ｄ−リボフラノシルプリン
ω）　９−β−Ｄ−リポフラノシルチオグ７二ン（Ｖ）
　　９−β−Ｄ−リボフラノシルチオヒポキサンテン （ＶＯ２−β−り、−リボフラノンルー４−７１イドロ
キシビラゾロ（３，４−ｄ）ピリミジン実施例４ タレプシエラ・ニューモニエ（Ｋｌ・ｂａｉ＠ｌｌａｐ
ｎｅｕｍｏｎｉａｅ　）　　Ａ　Ｔ　ＣＣ９６２１をブ
イロン培地で培養して得た一体から特開昭５６−８６９
８の実施例１の方法に従ってウリジンホスホリラーゼお
よびプリンヌクレオシドホスホリラーゼを調整した。

ウリジン３０ｍＭ、第４表に示すプリン誘導体１０ｍＭ
、！１ン酸３０ＥＩＩＭを含む水溶液に上記ウリジンホ
スホリラーゼ５．０単位およびプリンヌクレオシドホス
ホリラーゼ４．ｓｉ１位を加え６０Ｃで５時間反応を行
った。反応液中に生成したプリンヌクレオシド誘導体を
実施例１と同様の高速液体クロマトグラフィーで定量し
た。その結果を第４表に示す。

第　　４　　表 ２．６−ジクロルプリン　　　２．６−シクロルプリン
リポシド　　　　５５２−クロルプリン　　　　　　２
−クールプリンリボシド　　　　　　　４８２−メチル
ヒポ午サンチン　　２−メチルヒボキサンチンリボシド
　　　　７５２−メチルプリン　　　　　　２−メチル
プリンリボシド　　　　　　　３８２−メチル７デニン
　　　　　２−メチルアデニンリボシド　　　　　　８
０実施例５ リボース−１−リン酸バリウム塩１ｏｔ／ｄｌ。

プリン０．２ｆ／ｄｌｓ）リス−塩酸緩衝液５０ｍＭ。

およびプリンヌクレオシドホスホリラーゼ０．Ｓ単位／
ｄを含みｐＨ７，ＯＫ調節した反応液１００ｍをＳＯＣ
に６時間保持し、その間時々攪拌した。

得られた反応液に酢酸を加□１え”Ｙ−ｐ　Ｈ４，０に
調節し、遠心分離して不溶性物質を除去した。次いで、
これをセファデックスＧ−１０（商標）を用いてゲル濾
過を行って不純物を除去し溶出液区分を濃縮し１３０．
■の粗結晶を得た。これを水で再結晶を行い８０１１９
の結晶を得た。このものの紫外吸収スペクトルは第１図
に示す通りであり、その他ＮＭＲマススペクトルおよび
赤外吸収スペクトルはオーセンティクなネプラリンのそ
れと一致し、ネプラリンと同定された。

Ｅ記反応に於て、プリンの代りにチオグアニンを用いて
同様の反応を行い、得られた反応液を上記同様、セファ
デックス処理することによってチオグアノシンの結晶（
ｌｓｏ■）を得た。

この結晶標品の紫外吸収スペクトルは第２図に示すとお
りであり、ＮＭＲスペクトルおよび赤外吸収スペクトル
もオーセンティクなチオグアノシンと一致し１このもの
がチオグアノシンであることが確認されたつ

【図面の簡単な説明】

小 第１図および第２図は実施例５で得られたネブラリンお
よびチオイノシンの紫外吸収スペクトル図である。 特許出願人　味の索株式会社 第１図 （ｎｍ） 第１頁の続き ■Ｉｎｔ、　Ｃ１，３識別記号　　　庁内整理番号／Ｃ
１２Ｒ１／２２ １／２６５ １／３７ １／３８ １／４２ ０発　明　者　小林忠雄 横浜市金沢区六浦３−３９−２３ ■発　明　者　山中茂 横浜市南区大岡３−４０−１３ ０発　明　者　上村晃 逗子市池子２−２５−１９

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 下記一般式（１）で示されるプリン誘導体および（轟）
   リボース−１−リン酸もしくはヌクレオシドホスホリラ
   ーゼの作用でリポース−１−リン酸を生成するリポース
   供与体または（ｂ）デオキシリポース−１−リン酸もし
   くはヌクレオシドフォスホリラーゼの作用でデオキシリ
   ポース−１−リン酸を生成するデオ午シリポース県８−
   俸一−を含む水溶液Ｃヌクレオシドフォスホリラーゼを
   添加し、該水溶液を４０〜７０Ｃに保持して式（１１の
   化合物の９位にリボフラノシル又はデオキシリボフラノ
   シル基の結合したりボフラノシルプリン誘導体を生成せ
   しめることを特徴とするりポフラノクル又はデオキシリ
   ボフラノシルプリン誘導体の製造法。 一般式鬼Ｉ） （式中Ｘは水素原子、塩素原子、水酸基、アミノ基、メ
   ルカプト基、メチル基、エチル基、Ｙは水素原子、塩素
   原子、水酸基、アミノ基、メルカプト基であり、Ａおよ
   びＢは炭素原子または窒素原子であり、かつＡが窒素原
   子のとき、Ｂは炭素原子を、Ａが炭素原子とき、Ｂは窒
   素原子を表わす。）