JPS5980646A - ヒトγ型インタ−フェロンの精製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、新規ポリペプチドおよびその用途督こ関する
。

背景技術 ケーラーとミルスタインにより開発され〔ネイチャー、
２５６，４９５（１９７５）：］、近年盛んになって来
たハイブリドーマを用いたモノクローナル抗体の製造法
は、各々の抗原決定基に対し。

単一特異性を示す抗体が得られることや、籾精製柳品に
対して得られた抗体について吸収操作を必要としないこ
となどのすぐれた特徴をもっている。

またこの他に、抗体取得という面からもｉ’　／’％イ
ブリドーマの腹水化により、制力価の抗体が、自由に、
多量に、しかも常に均質な標品を再現性よく得らｉｌる
など多くの利点がある。この様な意味からハイブリドー
マによるモノクローナル抗体取得の手法は、多方直にわ
たってその有用性が高く評価されている。また、その使
い万も単に抗原検出にとどまらず、抗体カラム作製を通
じて、微量成分の精製に用いたり、（ネイチャー、２８
５゜□ ４４６（１９８０）］、更には１診断薬、治療薬への応
用〔ヨーロピアン　ジャーナル　オブ　イムノロジー、
９．９４（１９７９））も展開されている。

ヒトのインターフェロン（ＩＦＮ）には、抗原的に異な
るα、β、γ型の少くとも３種のタイプが存在すること
が知られているしネーチャー。

２８６．１１０（１９８０）’）。γ型インターフェロ
ン（ＩＦＮ−γ）については、マイト−ジエンや抗原刺
激によって、主としてＴリンパ球から産生されることが
判っており、別名免疫インターフェロン（１−ＩＦＮ）
とも呼ばれている（ザインターフェロン　システム、ス
ブリンガー社。

ニューヨーク、１９７９年〕。ＩＦＮ−’Ｔは生体内で
・種々の免疫反応にともなって産生されることが予想さ
れ、免疫調節に重要な役割を果たしていると考えられて
いる。また、ＩＦＮ−γの性質としては、α型インター
フェロン（ＩＦＮ−α）やβ型インターフェロン（ＩＦ
Ｎ−β）と抗原性が異なることや、誘起剤の種類が異な
ることの他に、酸や熱に対する安定性が態いことなども
判っている（ザ　イン多−フエロンシステム、スブリン
ガー社、ニューヨーク、１９７９年〕。

一般的にＩＦＮは、生体の産生ずる抗ウィルス作用をも
つものとして定義されているが１．この他に多くの生物
活性をもつことが証明されており。

特に抗腫瘍効果を有する点で注目されている（ブラッド
、５５，７１１（１９８０）；同誌、５６゜８７５（１
９８０））。腫瘍の増殖を抑制する方法として、腫瘍細
胞の増殖を直接抑制する方法と。

宿主の免疫反応を介して１間接的に腫瘍を抑制する方法
が考えられ、後者の場合１例えばナチュラルキラーｉ胞
（ＮＫ）や、マクロファージの活性化、或いはキラーＴ
細胞の活性化などが考えられる。実際、ＩＦＮには直接
作用の他に、この様な棚々の免疫増強活性があることが
証明されているしバイオケミ力　エト　バイオフイジカ
　アクタ。

５１６．２８１（１９７８）］。ＩＦＮ−γはインビト
ロでのこれら抗腫瘍につながる各種の活性、およびイン
ビボに於ける抗腫瘍活性が、ＩＦＮ−αやＩＦＮ−βに
比べ遥かに高いことから、その重要性が強（指摘されて
いる〔セルラーイムノロジー、４９，８９０（１９８０
）、１０然ｑながら、インビトロで誘尋されるＩＦＮ−
γの力価は一般に低いことや適切なＩＦＮ−γ産生株細
胞がほとんどないこと、さらに熱や酸に対する安定性が
悪いため精製がむつかしいことなどのためにＩＦＮ−γ
の大量生産および精製はＩＦＮ−αやＩＦＮ−βに比べ
大幅に遅れている。

ごく最近、天然のＩＦＮ−γが単一に出来たという報告
があるが（プロシジング　オブ　ナショナル　アカデミ
−オブ　サイエンス、７９゜１８２０（１９８２）：１
．活性の回収が大罠悪く、より効果的な精製法が待望さ
れている。

−万最近に至り、ヒトＩＦＮ−γ遺伝子のクローニング
が報告され、少くともＩＦＮ−γの一種として１県４６
個のでミノ酸から成る約１７キロダルトンの分子種が、
大屍菌で作られる様になった（ネーチャー、２９５，５
０８（１９８２）；ヌクレイツク　アシツズ　リサーチ
、ｍＯ，２４８７（１９８２ン〕が、天然に産生される
ＩＦＮ−γについては１種々の分子量のものが報告され
て居り、その分子種間の対応関係は未だ不明である。

この様な視点から、各種のＩＦＮ−γに対するモノクロ
ーナル抗体を得ることは、分子種間の対応をつけるのに
重要なだけでなく、天然の、或いは遺伝子組み換え法に
よる大腸菌などで作ら愕′たＩＦＮ−γを精製する上に
極めて強力な武器となる。ごく最近に至り、天然のＩＦ
Ｎ−γに対するモノクローナル抗体の取得が報告された
しネーチャー、２９６，２５８（１９８２ン〕が、ＩＦ
Ｎ−γが複数の分子種から成っている場合、遺伝子の組
み換え法によりクローン化された分子種に対するモノク
ローナル抗体を取得することは極めて重要となる。

発明の開示 本発明者らは、構造遺伝子のヌクレオチド配列から推定
されたヒトＩＦＮ−γのアミノ酸配列に関する報告しヌ
クレイツク　アシツズ　リサーチ１０．２４８７（１９
８２）：］をもとに、そのアミノ酸配列のＣ末端側の部
分構造を有するＨ−Ｘ−Ｎｙｓ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｇｉ
ｎ　Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　Ｐｂｅ　Ａｒｇ（Ｑ Ｇ　Ｉ　ｙ−ｙ−ｏＨ（１） （Ｎン 〔式中、Ｘは結合手またはＩｌｅ　Ｇｌｎ　Ｖａｌ　Ｍ
ｅｔＡｌａ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ａｌａ
　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ（Ｑ Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ａｒｇで示されるペプチド鎖において
そのＣ末端から数えて１〜１６個のアミノ酸を有すにお
いてそのＮ末端から数えて１〜５個のアミノ酸を有する
ペプチドもしくはアミノ酸残基を示す〕で表わされるポ
リペプチドを化学的に合成し、さらにキャリヤー蛋白と
化学結合させ蛋白複合体とした。

ここで得られたポリペプチドまたは蛋白複合体で哺乳動
物を免疫し、取り出した肺臓細胞と同種または異種のリ
ンパ球様細胞とを細胞融合によりハイブリドーマとし、
これをクローン化した。

ここで得られたハイブリドーマを哺乳動物に接種し、モ
ノクローナル抗体を生成蓄積せしめ、これを採取して前
記のポリペプチドに対するモノクローナル抗体を製造し
た。

さらに、ここで得られるモノクローナル抗体を利用し、
租ヒトＩＦＮ−γ含有物からヒトＩＦＮ−γを精製する
方法およびラジオイムノアッセイ（ＲＩ　Ａ　）法なら
びにエンザイムイムノアツセイ（ＥＩＡ）法によりヒト
ＩＦＮ−Ｔを検出する方法を確立し、本発明を完成した
。

すなわち１本発明は、新規ポリペプチド中、その蛋白複
合体、新規クローン化されたハイブリドーマ、新規モノ
クローナル抗体およびこれらの製造法、さらに該モノク
ローナル抗体の用途を提供するものである。

前記ポリペプチド（１）に関し、ＹはＡｒｇ　ＡｒｇＡ
ｌａ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎであることが好ましく、とりわけ
これに加えＸがＬｙｓ　Ａｒｇであることが好ましし）
また、ポリペプチド（１）はアミノ酸残基数としてとり
わけ１５〜２５個であることが好ましい。

当該ポリペプチドは、ペプチド合成の常套手段で製造し
うる。同相合成法、液相合成法のいずれによってもよい
が、液相合成法が有利な場合が多い。このようなペプチ
ドの合成の手段は、たとえば、”　Ｔｂｅ　Ｐｅｐｔｉ
ｄｅｓ　”　第１巻（１９６６）。

５ｃ１１ｒ６ｄｅｒ　ａｎｄ　Ｌｕｂｋｅ著、　Ａｃａ
ｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、、　Ｕ
、Ｓ、Ａ、、あるいは゛ペプチド合成″、泉屋ら著、丸
善株式会社（１９７５）。

あるいは゛′生化学実験講座、第１巻、２０７頁−４０
０頁”矢島治明著、東京化学同人株式会社（１９７７年
）に目己載されており、たとえば、アジド法、クロライ
ド法、酸無水物法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エ
ステル法、ウッドワード試薬Ｋを用いる方法、カルボジ
イミダゾール法。

酸化還元法、ＤＣＣ／アディティブｃ例、　ＨＯＮＢ。

ＨＯＢｔ、　ＨＯ５ｕ　　）法などがめげられる。

ポリペプチド（１）は、いずれも保護されていてもよい
、（ａ）ポリペプチドの一部に相当する反応性カルボキ
シル基を有する原料と、（ｂ）ポリペプチド（１）の残
部に相当する反応性アミノ基を有する原料をペプチド合
成の常套手段で縮合させ、生成する縮合物が保護基を有
する場合、その保護基を常套手段で脱ｒｐ、させること
により製造しうる。

原料の反応に関与すべきでない官能基の保護および保護
基、ならびにその保護基の脱離、反応に関与する官能基
の活性化などもまた公知のものあるいは手段から適宜選
択しうる。

原料のアミノ基の保護基としては、たとえばカルボベン
ゾキシ、ｔ−ブチルオキシカルボニル。

ｔ−アミルオキシカルボニル、インボルニルオキシカル
ボニル、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル、２−
クロル−ベンジルオキシカルボニル。

アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル
、フタリル、ホルミン、０−ニトロフェニルスルフェニ
ル、ジフェニルホスフィノチオイル。

４−メトキシ−２，８，６−トリメチルベンゼンスルホ
ニルなどがあげられる。カルボキシル基の保護基として
は、たとえばアルキルエステル（例、メチル、エチル、
プロピル、ブチル、ｔ−ブチルなどのエステル基〕、ベ
ンジルエステル基、ｐ−ニトロベンジルエステル基、ｐ
−メトキシベンジルエステル基、ｐ−クロルベンジルエ
ステル基、ベンズヒドリルエステル基、カルボベンゾキ
シヒドラジド基、ｔ−ブチルオキシカルボニルヒドラジ
ド基、トリチルヒドラジド基などがあげられる。

アルギニンのグアニジノ基の保護基としては。

たとえばニトロ基、トシル基、ｐ−メトキシベンゼンス
ルホニル基、カルボベンゾキシ、イソボルニルオキシカ
ルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、４−メトキ
シ−２，６−シメチルベンゼンスルホニル基、ペンタメ
チルベンゼンスルホニル基等が例示される。また、その
グアニジノ基は。

酸Ｃ例、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、塩
酸、硫酸などン塩の形で体膜してもよい。

スレオニンおよびセリンの水酸基は、たとえばエステル
化またはエーテル化によって体膣することができる。こ
のエステル化量こ適する基としてはたとえばアセチル基
などの低級アルカノイル基。

ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボ
ニル基、エチルオキシカルボニル基などの炭酸から誘導
される基などがあげられる。またエーテル化に適する基
としては、たとえばベンジル基、テトラヒドロピラニル
基、ｔ−ブチル基などである。しかしながらスレオニン
の水酸基は必ずしも仔獲する必要はない。メチオニンは
スルホキサイドの形で保護しておいてもよい。原料のカ
ルボキシル基の活性化されたものとしては、たとえば対
応する酸無水物、アジド、活性エステル（ペンタクロロ
フェノール、ｐ−ニトロフェノール。

Ｎ−ハイドロキシサクシンイミド、Ｎ−ハイドロキシベ
ンズトリアゾール、Ｎ−ハイドロキシ−５−ノルボルネ
ン−２，８−ジカルボキシイミドなどとのエステルンな
どがあげられる。ペプチド結合形成反応は脱水剤（例、
ジシクロへキシルカルボジイミド、カルボジイミダゾー
ル等のカルボジイミド試薬ンの存在下に実施しうる場合
がある。

本ペプチド縮合反応は溶媒の存在下に行うことができる
。溶媒としては、ペプチド縮合反応に使用しうろことが
知られている・ものから適宜選択されうる。たとえば無
水または含水のジメチルホルムアミド、ジメチルスルホ
キサイド、ピリジン。

クロロホルム、ジオキサン、ジクロルメタン、テトラハ
イドロフラン、酢酸エチル、Ｎ−メチルピロリドンある
いはこれらの適宜の混合物などがあげられる〇 反応温度はペプチド結合形成反応に使用されうろことが
知られている範囲から適宜選択され、シ１刊當約−４０
℃−約６０℃、好ましくは約−２０℃−約θ℃の範囲か
ら適宜選択される。

水縮合反応終了後、生成物が保護基を有している場合、
それは常法により離脱できる。かかる常法としては、た
とえば還元的方法（例１パラジウム黒等の触媒を用いる
水素添加、液体アンモニア中金属ナトリウムによる還元
）、アシドリシス（例、トリフルオロ酢酸、フッ化水素
、メタンスルホン酸あるいは、チオアニソール等の含硫
化合物の存在下、上記の酸あるいは、その混合物による
アシドリシス）などがあげられる。

上記のようにして製造された本発明のペプチドは１反応
終了後混合物から５通常のペプチドの分離手段、抽出９
分配、カラムクロマトグラフィーなどにより採取できる
〇 ポリペプチド（１）とキャリヤー蛋白との蛋白？（１合
体に関し、キャリヤー蛋白の押類およびキャリヤーとハ
プテン（この場合ペプチド）との混合比は。

キャリーヤーにカプリングさせて免疫したハプテンに対
して抗体が効率よく出来れば、どの様なものをどの様な
比率でカプリングさせてもよいが、例えば牛血清アルブ
ミンや牛サイログロブリン等を重量比でハプテン１に対
し０．１〜２０．好ましくは１〜５の割合でカブルさせ
る方法が用いられる。

また、ハプテンとキャリヤーのカプリングには、種々の
縮合剤を用いることが出来るが、グルタルアルデヒドや
カルボジイミド等・が好都合に用いられる。

ポリペプチド（１）または蛋白複合体を用０て免疫する
に際し、免疫する哺乳動物は１羊、山羊、兎。

モルモット、ラット、マウス等の実験動物が使われるが
、モノクローナル抗体を得るためには、ラット、マウス
が好ましい。免疫方法は、例えばマウスを免疫する場合
、皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮肉等のいずれのル
ートからでも可能であるが、王として皮下、腹腔内、静
脈内に（とりわけ皮下ン注入するのが好ましい。また、
免役間隔。

免疫量等も可変度は毘く、種々の方法が可能であるが１
例えば２週間隔で２〜６回免疫し、最終免疫後、１〜５
日、好ましくは２〜４日後のｊ片臓却１胞を用いる方法
がまく用いられる。免疫量は１回にペプチド足として、
マウス当りＯ１μｆ以上、好ましくは１１０７ｔ〜３０
０μｐ用いることが望ましい。

又１胛）面を摘出する前に、部分採血を行い、血中の抗
体価の上昇を駕認した上で、＋ｉ’Ａ！ＩＥ刊１１泡を
用いる融合実験を行うことが望ましい。

上記昌！臓細胞とリンパ球様細胞との細胞Ｍ＝ｈ合は、
例えば摘出したマウスの牌＋１１４４１１胞を、ヒポキ
サンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラー
ゼ欠損（ＨＧＲＲＴ　　）や、チミジンキナーゼ欠損（
ＴＫ）の様なマーカーを持ったＪ＋ＭｖＪな同種または
異種（好ましくは同種〕のミエローマ等の４リンパ球様
細胞株との間で融合させる。融合には。

センダイウィルス、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ　
）句・の融合剤が用いられる。もちろんジメチルスルホ
キシドＣＤＭＳＯ）その他の融合促進剤を加えることも
可能である。ＰＥＧの重合度は、ふつう１０００〜６０
００．時間は０．５〜３０分。

濃度は１０％〜８０％等が用いられるが、好ましい条件
の一例として、ＰＥＧ６０００を３５〜５５％で４〜１
０分処理することにより、効率よく融合させることが出
来る。融合細胞は、ヒポキサンヂンーアミノブテリンー
チミジン培地ＬＨＡＴ培す１ハ；ネイチャー、２５６，
４９５（１９７５，）Ｅ等を用いて１選択１１りに増殖
させることが出″＋？る。

増夕＝して来た細胞の培養上清は、目的とする抗体外生
があるか否かについてスクリーニングを行うことができ
るが、抗体価のスクリーニングは次の様に行うことが出
来る。即ち、この場合には。

まず第１段階として免疫したペプチドに対する抗体ｐｆ
ｉ生の有無を、ＲＩＡ法またはＥＩＡ法等の方法で調べ
ることが出来るが、これらの方法についても郡々の変法
が可能である。好ましい測定法の一例として、ＥＩＡを
用いる一つの方法について述べる。セルロースピース等
の担体に１例えばウサギ抗マウスイムノグロブリン抗体
を常法に従ってカプリングさせておき、これに汗用ボし
たい培養上清や、マウスの血清を加え、一定時間、定温
（以下４〜４０℃を示す）で反応させる。この後。

反応物をよく洗った後、酵素で標識したペプチド（酵素
とペプチドを常法に従いカプリングさせた後精製）を加
え、一定時間、定温で反応させる。

反応物をよく洗った後、酵素基質を加え、−疋時間、定
温で反応させ、その後、生成発色物を吸光度または蛍光
度等で測定することが出来る。

選択培地で増殖を示し、かつ免疫に用いたペプチドに対
する抗体活性のみられたウェルの細胞は。

限界稀釈法等によりクローニングを行うことが望ましい
。クローン化された細胞の上清について同様にスクリー
ニングを行い抗体価の高いウェルの細胞を増やすことに
より、免疫したペプチドと反応性を示すモノクローナル
抗体産生ハイブリドーマクローンが得られる。

次にこれらクローンの産性する抗体が免疫に用いたペプ
チドだけでなく、ＩＦＮ−１分子そのものと反応性を示
すか否かを調べる必要があるが。

このためには、標識されたＩＦＮ−７を用いたＲＩＡ法
またはＥＩＡ法を用いて反応性を調べる方法や、生物活
性（ＩＦＮ−γ活性）がこの抗体により吸収されるか否
かを見る方法等が用いられる。後者の場合はＩＦＮ−γ
を精製する必要がないので有利に用いることが出来る。

有利に用いられる一例を次に述べるが、もちろんこの他
にもプロティンＡを用いて免疫沈降物を除いた上清中の
残存ＩＦＮ−γ活性を測定する方法等も可能である。例
えばウサギ抗マウスイムノグロブリン抗体をセルロース
ピース等の担体に常法に従いカプリングさせておき、こ
れに測定したいハイプリードーマ上清またはマウスの血
清を加え、一定時間、定温で反応させる。この後反応物
をよく洗い一定量のＩＦＮ−γを加える。ＩＦＮ−γと
して例えばヒト末梢血リンパ球からレクチンとホルボー
ルエステル等で誘導したＩＦ’Ｎ−γを含む培養上清や
、組み換え体で大腸菌等で作らせたＩＦＮ−γを含む抽
出液等を用いることが出来る。ＩＦＮ−γを加えた後、
一定時間、定温で反応させた後。

反応上清中に含まれるＩＦＮ−γの活性を測定する。こ
の様にして目的とする抗体Ｑ月ＦＮ−γ活性の吸収能を
測定することが出来る。

このようにしてクローン化されたハイブリドーマは、液
体培地中または哺乳動物のＭ腔内で増殖させる。具体的
には例えば、液体培地たとえばＲＰＭＩ−１６４０に０
．１〜４０％の牛血清を加えた培地等で２〜１０日間、
好ましくは８〜５日同培養することにより、培養液から
該モノクローナル抗体を得ることができるが、この他に
マウス等の適切な哺乳動物の腹腔内に＃種し、細胞を増
殖させ、腹水を採取することにより、細胞培養上清より
も遥かに高力価の抗体を、多量に効率よく取得すること
が出来る。このためには１例えばマウスの場合、ミネラ
ルオイル等を前もって接種したＢＡＬＢ／ｃ　　等のマ
ウスにｌＸ１０４〜ｌＸｌ０’個、好ましくは５Ｘ１０
’〜　２Ｘ１０’［のハイブリドーマを腹腔内等に接種
し、７−２０日後。

好ましくは１０〜１４日後に腹水液等を採取する。

腹水に生成蓄積した抗体は１例えば硫安分画。

ＤＥＡＥ−セルロースカラムクロマト等により。

容易にモノクローナル抗体を純粋な免疫グロブリンとし
て単離することが出来る。

本発明のモノクローナル抗体は、下記の性状を有する。

（１）免疫に用いたポリペプチド（１）と結合する。

＋２１１ＦＮ−１分子と結合し、ＩＦＮ−αやＩＦＮ−
βとは結合しない。

（３）　　オフタロニー法による検定によりＩｇＧ２ｂ
またはＩｇＧ１のサブクラスの抗体に屈する。

＋４＋５ｎｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動におい
て、標準免疫グロブリンのＨ鎮およびＬ　１１１４に完
全に一致する２本のバンドのみを示す。

なお本モノクローナル抗体は？全に製造、使用。

保管することができる。

本発明により得られるモノクローナル抗体は。

ＥＩＡ法（イムノケミストリー、１５，４２９（１９７
１））或いはＲＩＡ法しサイエンス。

１５８．１５７０（１９６８））を活用することにより
、生体中の、或いは試＃！管内での微慧のＩＦＮ−γの
検出に用いることが出来ることの他に、たとえば抗体カ
ラムを作製することにより。

令名大変困難とされていた天然の、或いは遺伝子組みか
えにより作られるＩＦＮ−γを、非常Ｇこ効率良く精製
するのに使用することが出来る。

ＩＦＮ−γの検出のためには、−例として、測定したい
ＩＦＮ−γを含む資料又は標準ＩＦＮ−γを予め１例え
ば放射性ヨード又は酵素等により標識した当該モノクロ
ーナル抗体と反応させ次いで免疫複合体を沈降させるべ
く例えばプロティンＡを加え、一定時間反応させた後、
免役沈降物の放射活性又は酵素活性を測ることによりＩ
ＦＮ−γの承を簡便に測定することができる。また、抗
原による競合法を用いる場合は１例えばポリペプチド（
１）を放射性ヨード又は酵素標識し、これと一定量の無
標識の本発明モノクローナルの抗体を反応させる際に、
測定したいＩＦＮ−γを含む資料を共存させ１次いで、
免疫複合体を沈降させたり。

あるいは抗マウス抗体に結合させることにより、ＩＦＮ
−γを定地することができる。ここで用いる放射性ヨー
ドまたは酵素標識体としては、ポリペプチド（１）の代
りに精製したＩＦＮ−ｒを使うことも出来る。

また抗体による競合法を用いる場合は１例えば部分Ｉｎ
！されたＩＦＮ−γまたはポリペプチド（１）をマイク
ロトレイ等の同相に固定する。固定する方法としては、
例えば、０．１Ｍの重ソウを含ｆＪするリン酸緩衝液に
ＩＦＮ−Ｔまたはポリペプチド（１）を０．１／ＩＩ　
〜１００μｆ／ｍｆｆ　　濃度好ましくは１０〜２０　
／Ｉｔ／／ｍ（ｌ　ニ浮遊さセコ（７）１００１１ｅ　
　’ｒ：マイクロトレイの各ウェルに入れ２４時間処理
するこ８７℃で１時間又は４℃で２００時間反応せたも
のを加え、さらに放射性ヨードまたは酵素標識した抗゛
７ウス　ウサギ抗体等を加えることによりＩＦＮ−γを
定量することができる。これら一連のＥＩＡ法において
酵素ｍ識した抗マウス　ウサギ抗体等を用いた場合は、
いわゆるＥＬＩＳＡ（エンザイム　リンクド　イムノ　
ソーベント　アッセイ）法によりマルチスキャン（フロ
ー社）等を用いた迅速アッセイ法が可能となる。また、
抗原認識部位の異なる２種のハイブリドーマクローンの
産生ずるモノクローナル抗体を用いた場合は。

いわゆるサンドウィッチ法しヨーロピアン　ジャーナル
　オブ　バイオケミストリー、７Ｊ４５９（１９７６）
］による、より１ト１１便なＩＦＮ−γの測定が可能と
なる。もちろん、これらのＥ　Ｉ　Ａ。

ＲＩＡを利用したＩＦＮ−γの定量に適切な抗体さえ得
られれば１種々の変法が可能であり、上記した方法に限
定されるものではない。

ＩＦＮ−γの精製のためには＋　ｆｌ’ｉ′４製した当
該抗体を例えば活性化したアガロースゲルピースの様な
適切な担体に常法に従ってカプリングさせた後、カラム
に充め、培」〔上清或いは破さいした菌体等の粗ＩＦＮ
−γを含む資料をカラムにか’ｊ＊　ｌ！＋Ｈさせた後
、洗浄し、その後例えばＫＳＣＨの様な力すトロピック
試薬、或いはＩＦＮ−γの失活のない程度の弱酸性条件
で溶出させる方法躯により、効率よく粗製できる。

抗体カラムの作製は１例えばハイブリドーマを接種した
腹水等から純粋に精製した本発明のモノクローナル抗体
を適切な担体とカプリングさせることにより、以下の様
な方法でできる。

用いる担体は、カプリングの後（ζＩ　ＦＮ−７が特異
的に効率よく吸着され、その後適切な浴出が可能なもの
であればどの様なものでもよいが、−例として蛋白の一
級アミンが結合し易い様に活１性化されたアガロースゲ
ルビーズ、例えばアフィゲル−１０（バイオラド社製）
などが以下に述べる様な方法で好都合に用いられる。ア
フィゲル−１０と抗体との反応は、０．００１−ＩＭ、
好ましくは０．１　Ｍのバイカーボネ２ト等の１ｍ　衝
１７．中で反応を行なう。反応条件は０°〜２０℃、１
０分〜２４時間、種々のｐＨが可能であるが、好ましく
は、４℃、４時間、ｐＨ８〜１０の条件が用いられる。

混合するアフィゲル−１Ｏと抗体の量比は。

アフィゲル１ｍｅに対し抗体塾が約５０ｍ１位迄は−−
３０ｐ３の抗体が好都合に用いられる。この柱にしてで
きた抗体−担体結合物は１反応に用いた緩・衝液でよく
洗った後、数日放置するか、もしくは最終濃度０．０５
Ｍのエタノールアミン・塩酸をＩＪｌｌえ４℃で１時間
反応させる等の方法により、残存する未反応の活性基を
ブロックした後、適切なカラムにつめることにより、抗
体カラムとして使用できる。

上記した抗体カラムで精製するに際しては、たとえばヒ
ト免役インターフェロン蛋白３ｈ　ｇ有￥、ｔ　’！−
’Ｊを中性附近の緩衝液、たとえばリン酸緩Ｍｉ肢やト
リス・塩酸緩衝液に溶解して抗体カラムに段々させる。

次にカラムを同じ緩衝液で洗浄したのち。

ＩＦＮ−γを溶出する。溶出液としては、弱酸性溶液た
とえば酢酸溶液、ポリエチレングリコールを含む溶液、
資料にくらべ抗体に、より結合し易いペプチドを含む溶
液、高濃度塩溶液などおよびこれらの組み合せた溶液な
どが用いられ、ヒトＩ−ＩＦＮの分解をあまり促進しな
いものが好ましい。

カラム溶出液は、常法により緩衝液で中和すん必要によ
り再度上記の抗体カラムによる精製操作を行なうことが
できる。

ここで得られるヒトｘ−ｒＦＮ蛋白質ｍ液は透析に付し
、必要によりこれを凍結乾燥により粉末とすることがで
きる。凍結乾燥に際しては、ソルビトール、マンニトー
ル、テキストロース、マルトース、グリセロールなどの
安定剤を加えることができる。

かくして得られるヒト免疫インターフェロン蛋白質はヒ
ト羊膜由来ＷＩＳＨ細胞に対する水泡性口内灸ウィルス
（ＶＳＶ）の細胞変性効果阻止試験によるウィルス活性
測定において１０’Ｕ／ｍｐ以上の比活性を示すもので
ある。

なおここでＩＦＮの活性としてのＵ／ｍ　（！　（ユニ
ット／ｒｒＪ）の出し万は以下の様に行った。ユニット
の確定した国際標準ＩＦＮ−αと白諦球由来の粗ＩＦＮ
−γをヒト羊膜由来ＦＬ細胞株に対するＶＳＶの細胞変
性効果阻止試験を月１いて測定し、その力価の比較から
白血球由来粗ＩＦＮ−γの力価を決定しＩＦＮ−γの標
準品とした。目ＩＪりとする資料中のＩＦＮ−γの力！
＋［ｉ　）’＋’定のためには、富にこの標準Ｉ　ＦＮ
−Ｔを並べて前述のＷＩＳＨ−ｖＳＶの系でアッセ・ｆ
を行い、その比率から力価を算出した。

本発明で精製処迎されるヒト免疫インターフェロン蛋白
質は、たとえば一般式 ％式％ （１） 〔式中、ＡはＮｅｔまたは結合手を示し、ｚ、　ｌ　Ｚ
２はそれぞれＣｙｓまたは１／２Ｃｙｓを示すコのアミ
ノ酸配列からなるポリペプチドを含有するものである。

本発明の精製、処理によれば当該ポリペプチドを乾燥品
基準で９０％以ととりわけ９５％以り含ン蛋白質を得る
ことができる。

１）ＳＤ’Ｓ−ポリアクリルアミドゲル（１７，５％）
電気泳動による分子量測定で１７，０００±ｉ、ｏｏ。

を示す。

２）アミノ末端アミノ酸としてシスティンもしく【１ハ
ーフシスチンまたはメチオニンを有する。

８）　１１＝１．ｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−５ｅ
ｒ−ＧＩｎ−Ｓｉｅｔ　−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｇ
ｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−５ｅｔ　−Ｇ　Ｉ　ｎ
−＜）Ｈに対するモノクローナルｍ＋体と結合する。

本発明により精製されたヒト免袖インターフェロン蛋白
質は従来の方法で得られるＩ　−Ｉ　Ｆ　Ｎへ同様の目
的に同様の用法により使用できるが、従来品に比し、夾
雑蛋白質９発熱物質が少ないので。

注射剤原体等としてより安全に使用される。

本発明により製造されるヒトＩ　−Ｉ　ＦＮ蛋白質は抗
ウィルス、抗腫瘍、細胞ｔＩＪ殖抑制および免ブψ増強
作用を示す。本発明により！Ｐ、ＩＪ貨されるヒトＩ−
ＩＦＮ蛋白質は減菌水、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）
、生理食塩水その他公９３１の生地学的に許容される担
体と混合することができ、非経口的に又は局所に投与す
ることができる。例えば、成人１日当り１０万〜１伯ユ
ニツト、好ましくは５０．００万〜６０００万ユニツト
を静注又は筋注などにより投与することができる。

本発明のヒトＩ−ＩＦＮ蛋白質を含有する製剤は、塩、
希釈剤、アジュバント、他の相体、バッファー、結合剤
、界面活性剤、保存剤のような生理的に許容される他の
活性成分も含有していてもよい。非経口的投与用製剤は
、滅菌水溶液又は生理学的に許容される溶媒との懸濁液
アンプル、または生理学的に許容される希釈液で用事希
釈して使用しうる滅菌粉末（通常Ｉ−ＩＦＮ溶液を凍結
乾燥して得られる）アンプルとして提供される。

さらに上記したヒト免疫インターフェロン蛋白質を含有
する製剤は、ＩＦＮ−ｇまたはＩ　ＦＮ−βまたはイン
ターロイキン２などのリンホカインのような他の活性成
分を本発明物質に対し１〜９９％を含有していてもよい
。

本明細書において、アミノ酸、ペプチド、保穫基、活性
基、その他に関し略号で表示する場合。

それらはＩ（ＩＰＡＣ−ＩＵＢ（Ｃｏｍｍ１ｓｓｉｏｎ
ｏｎ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒ
ｅ　）による略号あるいは当該分野における慣用略号に
基づくものであり。

その例を次に挙げる。また、アミノ酸などに関し光学異
性体がありうる場合は、特に明示しなければ５体を示す
ものとする。

ＤＮＡ　　：デオキシリボ核酸 Ａ　　：アデニン Ｔ　　：チミン Ｇ　　ニゲアニン Ｃ：シトシン ＲＮＡ　　：リポ核酸 ｄＡＴＰ　：デオキシアデノシン三すン酸ｄＴＴＰ：デ
オキシチミジン三リン酸 ｄＧＴＰ　：デオキシグアノシン三すン酸ｄｃＴＰ：デ
オキシシチジン三リン酸 ＡＴＰ　　：アデノシン三リン酸 ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ　　ニドデシル硫酸ナトリウム Ｇｌｙ　ニゲリシン Ａｌａ　　：アラニン Ｖａｔ　　：バリン Ｌｅｕ　　Ｃ口・イシン １１ｅ　　：イソロイシン Ｓｅｒ　　：セリン Ｔｈｒ　　：スレオニン Ｃｙｓ　　ニジスティン Ｍｅｔ　　；メヂオニン Ｇｌｕ　　：グルタミン酸 Ａｓｐ　　：アスパラギン酸 Ｌｙｓ　　：リジン Ａｒｇ　　：アルギニン Ｈｊｓ：ヒスチジン Ｐｈｅ　　；フェニールアラニン ”ｒｙｒ　　：チロシン ’Ｉ’ｒｐニトリブトファン Ｆ’ｒＯニブロリン Ａｓｎ　　；アスパラギン Ｇｌｎ　　：グルタミン Ｚ　　：カルボベンゾキシ Ｂｏｃ　　：ｔ−ブトキシカルボニル Ｍｔｒ’　　：４−メトキシ−２，８，６−）リメヂル
ベンゼンスルホニル Ｐｍ６　　：ペンタメチルベンゼンスルポニルＯＢｕ：
ｔ−ブチルエステル ＯＮＢ　　：Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，
８−ジカルボキシイミドエステル ＤＣＣ：Ｎ、↑Ｊ′−ジシクロへキシルカルボジイミド ＤＣＵ　　：Ｎ、Ｎ’−ジシクロへキシルウレアＨＯＮ
Ｂ：Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，８−ジカ
ルボキシイミド ＨＯＢｔ：Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾールＣＨＡ　
　ニジクロヘキシルアミン ＤＣＨＡニジシクロヘキシルアミン ＴＥ−Ａ：）リエチルアミン ＴＦＡ：　トリフルオロ酢酸 ＭＳＡ　　：メタンスルホン酸 ＴＨＦ　　、テトラヒドロフラン ＤＭＦ　　：ジメチルホルムア芝ド ＭｅＯＨ：メタノール Ａｃ０Ｅｔ：酢酸エチル り下、実施例および参考例により本発明をより具体的に
説明するが１本発明はこれらに制限されるものではない
。

以下の実施例において、薄層クロマトグラフィ−は、メ
ルク社製シリカゲルブレー）　６０　Ｆ２．４又は、フ
ナコシ薬品社製セルロースプレート、アビセルＳＦを用
い、下記の腰囲溶媒を用いた。

Ｒｆ’：クロロホルム：メタノール：酢酸＝９＝１：０
．５ Ｒｆ”：６Ｍエチル：ビリジンニ酢酵：水＝３０．１０
：８：５ Ｒｆ３＝クロロホルム：メタノール：水＝７＝８：０．
５ Ｒｆ’：　ｎ−ブタノール：ピリジン：酢酸：水＝８０
：２０：６：２４ Ｒｆ　Ｒ、酢酸エチル：ｎ−ブタノール：酢酸：水＝１
：１：１：１ 実施例１ （ｌ　）Ｚ−５ｅｒ−Ｇｌｎ−ＯＢｕ　の製造Ｚ−Ｇｌ
ｎ−ＯＢｕｔ１０．１　ｔをメタノール５００ｍｅに溶
解し、パラジウム黒を触媒に水素気流中で還元した。触
媒をろ去し、溶媒を留去した残留物をＺ−５ｅｒ−ＯＨ
７，５１、ＨＯＮＢ６．８　ｆとともにＤＭＦ　２５０
ｍｅｌこ溶解し、氷冷した。水冷下にＤＣＣ７，１１Ｍ
を加え、０℃で４時間室温で１２時間攪拌した。析出し
たＤＣＵをろ去し、溶媒を留去ののち残留物をＡｃ０Ｅ
ｔ　８００ｍＪに抽出し。

４％Ｎ　ａ　ＨＣＯ３水、０．２Ｎ塩酸、水で洗い、無
水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去し、析出した
結晶をゴーチルでろ取し、乾燥ののちＣＨ３ＣＮより再
結晶した。収量６．５ｆｔ収率５１．２％。

ｍｐ、９７−１００℃　、　　Ｌα：］　”ニー２４．
１°　（ｃ＝０．４０゜メタノール３　、　Ｒｆｌ　Ｏ
，６４ 元元素析　Ｃ２ｏ　Ｈ２９０ｙ　Ｎａとして計算値：Ｃ
，５６，７２；Ｈ，６，９０；Ｎ、９．９２実験値：　
Ｃ，５６，２１；　Ｈ，６，７２；　Ｎ、９．７６（Ｉ
Ｉ）　Ｚ−Ａｌａ−５ｅｒ−Ｇｉｎ−ＯＢｕ　　の製造
Ｚ−５ｅｔ−Ｇｉｎ−ＯＢｕ　　４．２８１をメタノー
ル８００ｍｇに溶解し、パラジウム黒を触媒に水素気流
中で還元した。触媒をろ去し、溶媒を留去した残留物を
Ｚ−Ａｌａ−０８２，８４ｔ、ＨＯＮＢ２．２１ととも
に。

ＡｃＯＥｔ２００ｍｅとジオキサン２００ｍｅ、ＤＭＦ
１０Ｇｍｇの混合溶媒ｆζ溶解し、氷冷した。冷却下に
ＤＣＣ２，８８Ｆ　を加えて０℃で４時間、室温で１２
時間攪拌ののち、ＤＣＵをろ去し、溶媒を留去した。残
留物１こＣＨ３ＣＮとエーテルを加え結晶としろ取、乾
燥ののちＣＨ３ＣＮより再結晶した。

収ｊＱ＆７２Ｆ、収率７５．８％、ｍｐ、１６５−１７
０℃、〔α〕〒−４１，２°（Ｃ冨０．５０．メタノー
ル）。

ＲｆｌＯ，６０ 元素分析　Ｃ２ｓ　）１３４０８　Ｎ４として計算値、
Ｃ，５５，８６；Ｈ，６，９８；Ｎ、１１．８８￥験値
；Ｃ，５５，５８；　Ｈ，６，７４；　Ｎ、１１．１２
（川）Ｚ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−Ａｌａ−３ｅｒ−Ｇｌｎ
−（）Ｂｕ　　　の製造 Ｚ−Ａｌａ−５ｅｒ−Ｇｌｎ−ＯＢｕ　　８．４６１を
メタノール８００ｍｅに溶解し、パラジウム黒を触媒に
水素気流中で還元した。触媒をろ去し、溶媒を留去した
残留物を、Ｚ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ　）−０Ｈ−ＣＨＡ　４
．５４１からｍ１１１’ＪＪ４したＺ−Ａｒｇ　（Ｐｍ
ｅ　）（）Ｈ，ＨＯＢ　ｔ　１．９１とともにＤＭＦ１
５０ｍｅに溶解し氷冷した。冷水下にＤＣＣｌ、１ｇを
加え、０℃で４時間、室温で１５時間攪拌した。Ｉ）　
ＣＵをろ去し、溶媒を留去し残留物にＡｃ０Ｅｔを加え
ゲル状の沈澱を得、ろ取した。乾燥後、メタノールとＡ
ｃ０Ｅｔより再沈澱した。収量４．５５ｆ、収率７５．
５％、ｍｐ、１８０−５ １８４℃、（α：ｌ　Ｄ−２４，１°（ｃ＝０．２６．
メタノール）　、　Ｒｆ’　０．５７ 元素分析　Ｃ４０Ｈ！１゜０１１　Ｎｇ　Ｓ−２ＦＴｚ
　Ｏとして針脚値：　Ｃ，５５，２２；　Ｈ，７，０７
；　Ｎ、　１２．８８　；Ｓ、３．６９ 実験値：　Ｃ，５５，２８；　Ｈ，６，９３：Ｎ、１２
．５４；Ｓ、８．４８ （ｉＶ）　Ｚ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−
Ａｌａ−５ｅｒ　−Ｇｌｎ−ＯＢＩＩ　　の製造 Ｚ　Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−Ｉ〜１ａ−３ｅｒ−Ｇｌ　ｎ−
０Ｂｕ　　４．８　ｆをメタノール４００ｍｅに溶解し
、パラジウム黒を触媒に水素気流中で還元しｔ二。触媒
をろ去し、ｋＳ媒を留去した残留物を、Ｚ−Ａｒｇ（Ｐ
ｍｅ）イ）Ｈ・ＣＩ’ＩＡ８．２４１より調製したＺ−
Ａｒｇ（Ｐｍｅ　）（））！　、　ＴＴＯＢ　ｔｌ、４
２ｆとともにＤＭＦ２００ｍｅに？（”ｊ解し水冷した
。冷却下にＤＣＣｌ、４１ｐを加え０℃で４時間。

室温で２０時間担押した。ＤＣＵをろ去し、溶媒を留去
した残留物にＡｃ０Ｅｔを加え沈澱をｔ翫ろ取した。乾
燥後、メタノールとＡｃ０Ｅｔより、再沈澱した。収量
４．４Ｆ、収率７１．７％、ｍｐ、１２５−１８０℃　
、　（α）　２５−１８．０°（ｃ＝０．４０゜メタノ
ール）　、　Ｒｆ’　０．６８ 元素分析　Ｃｓｙ　Ｈｓｇ０１４ＮＩ２　Ｓ２°Ｈ２０
としてｉｆ’算値：　Ｃ，５４，９６；１１，７．１２
；Ｎ、１８．５０；Ｓ、５．１５ 実１映値；　Ｃ，５４，６６；　Ｈ，６，９２；　Ｎ、
１３．８２；Ｓ　、　５．８４ （Ｖ）　Ｚ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−Ｇｌｙ−ＯＢｕ　　の
製造Ｚ−Ｇｌｙ−ＯＢｕｔ１８．　ＯｙをＭｅＯＨ５０
０ｍｆ’にとかし、Ｐｄ黒を触媒としで、水素気ｂ１ｆ
中、接；Ｅぽ４元した。伸１１奴を７ｆｊ別し、Ｐ液を
減圧’＋’ｆ：’！　７．ｉ’ｉ　ｔ／　ｌ残ｆ７ｆ物
をＤ　Ｍ　Ｆ　２００ｍｇにとかした。これに、Ｚ−Ａ
ｒｇ（Ｐｍｅ）−（）Ｈ−Ｃ１（Ａ２０．０　ｇより調
製、シたＺ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）べ）Ｈ，ＨＯＢ　ｔ５．
４　ｆ　を加えて水冷し、ＤＣＣ８，２ｆを加えて４８
時間かき屁ぜた。析出しｔこＤＣＵを戸別し、′ｌ？縮
後、−ＡｃＯＥｔ　５００ｍ１ｌ’にとかした。、へｃ
ＯＥｔ層８４％Ｎ　ａ　ＨＣＯ：＋　　水　１０ｉｐク
エン酸水で洗浄後、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥しＦコ。濃縮後
、石油ベンジンを加えて沈澱として沖取した。

収−ｔｉｌｌ　９．８　Ｆ　（９６，８％）。ｍｐ、７
１−７８℃。

３ 〔σ−ＩＤ＋０．２°（ｃ＝０．９　、　ＤＭＦ　）　
、　Ｒｆ’０．６２ 元素分析　Ｃ３１Ｈ２Ｓ　０７　Ｎ５　Ｓ　として計算
値、Ｃ，５８，９８；Ｈ，７，１８；Ｎ、１１：０９；
Ｓ、５．０８ 実験イ直　：Ｃ，５９，４２；　　Ｈ，７−５８；　　
Ｎ、１０．９５；Ｓ、４．８４ （Ｖｌ）　Ｚ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−Ｇｌｙ−Ｏ
Ｂｕ’のＨａＺ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−Ｇｌｙ−ＯＢｕ　
　１０．　ＯｆをＭｅＯＨ５００ｍｅ中、接触還元した
のち、ＤＭＦ８００ｍｆｆに転Ｍした。これにＺ−Ｐｈ
ｅ−ＯＨ４゜７２１゜ＨＯＢｔ２．８５ｙを加えて水冷
し、　ＤＣＣ８，５９ｆを加えて、１５時間かきまぜた
。析出したＩ）　ＣＵを炉別し、Ｐ液を濃縮後、残留物
５−ＡＣＯＥｔ４００ｍｇにとかした。ＡｃｏＥｔ層は
、４％Ｎ　ａ　ＨＣＯ，水。

１０％クエン酸水で洗浄し＋　Ｎ　ａ２　Ｓ　０４で乾
燥し總濃縮後、エーテルを加えて結晶として瀘取し、Ｍ
ｅＯＨ−エーテルより再結晶した。収量ｌＯ，５１（８
５，８％）。ｍｐ、１０１−１０８℃、ＣＱ！ＩＤ−８
８°　（ｃ　＝０．９　、　ＤＭＦ　）　、　Ｒｆ’　
０．６４元素分析　Ｃ４ｏ　Ｈ５４０１１Ｎ６Ｓ　とし
て訓算値：Ｃ，６１，６７；Ｈ，６，９９；Ｎ、１０．
７９；Ｓ　、　４．１２ 実側−プ）イこ−、Ｃ，６１，６６；　　Ｈ，６，５６
；　　Ｎ、　　１０．９８　；Ｓ、４．１４ （Ｖｉｌ）　Ｚ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−
Ｇｌｙ−（）１３ｕｔの製造 Ｚ−ｐＨｃ−ＡｒｇＣＰｍｅ　）−（；Ｉｙイ）ＢＬＩ
　　５．５９をＭｅ’０Ｈ８００ｒｎｅ中、接ＦｊＪｌ
還元したのち、ＤＭＦ８００ｍｅに転Ｍした。これに、
　、Ｚ−Ｌｅｕ−ＯＨＤＣＩＡ　　８．８１！より調製
したＺ−Ｌｅｕ−ＯＨ，ＨＯＮＢ　　１．４７　ｆを加
えて水冷し、ＤＣＣｔ６８ｙを加えて４８時間かきまぜ
ｔこ。析出したＤＣＵを戸別し、濃縮後。

Ａｃ０Ｅｔ　８００ｍ／にとかした。Ａｃ０Ｅｔ胴は、
４％Ｎ　ａ　）ＩＣＯ３水、１０％クエン酸水で洗浄し
。

Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。濃縮後、エーテルを加えて粉
末として戸数した。収量６．２　ｔ　（９８，８％）２
６−１５．５°（ｃ＝ ｍｐ、１７１−１７８℃、〔α〕Ｄ Ｏ１９、ＤＭＦ　）　、　Ｒｆｌ　０．６４元素分析　
０４６　Ｈａｌ＋　０９　Ｎ７　Ｓ剖算値、Ｃ，６１，
９３；）（，７，８４；　Ｎ、ｌｏ、９９；Ｓ　、　８
．５９ 実験値：　Ｃ，６２０２；Ｈ，７，３７；　Ｎ、１１．
０８；Ｓ、８．５９ （Ｖｉａ）Ｂｏｃ−Ｍｅｔ−１，ｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ
（Ｐｍｅ）−Ｇｌｙ−ＯＢｕｔの製造 Ｚ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）イン１ｙ−ＯＢ
ｕ　　６．ＯｙをＭｅＯＨ２００ｍｇ　中、接触還元し
たのら、Ｌ’１ＭＦ１５０ｍｅに転層した。これに、Ｂ
ｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ・ＤＣＩＡ８．Ｏｙより調製したＢ
　ｏ　ｃ−Ｍｅ　ｔ　−ＯＨ。

ＨＯＮＢｌ、８９ｐを加えて水冷し、　Ｉ）ＣＣ１，５
！ｇを加えて１５時間かきまぜた。析出したＤ　ＣＵを
戸別し、濃縮後、ｎ−ＢｕＯＨ−ＡｃＯＥｔにとかし、
１０％クエン酸水で洗浄し、Ｎ；１１２ｓＯ４で乾・燥
した。濃縮後、エーテルを加えて結晶としてＰ取した。

収量６．２　ｆ　（９８，１％）。ｍｐ、１９２−１．
９５℃。

（α）２６−１９．７°（ｃ＝１．０　、　ＤＭＦ　）
　、　Ｒｆ”Ｏ１６４ 元素分析　Ｃ４５Ｈｖａ０１゜Ｎｌｌ５２　として計算
値：　Ｃ，５８，２７；　Ｈ，７，７４；　Ｎ、１１．
８８；Ｓ、６．４８ 実験値：（二、５８．４８；Ｈ，７，７９；Ｎ、１１．
８４；Ｓ、５．９８ （ＩＸ）　Ｂｏｃ−Ｇｉｎ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−
Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−Ｇ　Ｉ　Ｙ−ＯＨの製造 Ｂｏｃ→（ｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ　）
−Ｇｌｙ（）Ｂｕｔ５．５ｊ’ｉこＴ　Ｆ　Ａ　５０　
ｍ　ｆｔを加え、室温で１０分間振りまぜたのち濃縮し
、エーテルを加えてＰ敗し乾燥した。これを、ＤＭＦ５
０ｍｅにとかして水冷し、ＴＥＡｌ、８ｍｇを加えた。

これにＢｏｃ−Ｇｌｎ−ＯＨ１，８５１、ＨＯＮＢ　　
１．４９　ｆ　、　ＤＣＣｌ、９０＃より調製したＢｏ
　ｃ−Ｇ　ｌ　ｎ−０ＮＢを加え、１５時間かきまぜた
。濃縮後、ＡｃＯＨを加え。

Ａｃ０Ｅｔを加えて沈澱として戸数した。収量６゜８、
（８９，８％）。ｍｐ、１８１−１８８℃（分解）。

（α）　’、７−１９．６°（ｃ＝１．０　、　ＤＭＦ
　）　、　Ｒｆ”０．８０ 元素分析　Ｃ４９Ｈ７ｓＯｔｚＮｔｏＳｚ　として計算
値：Ｃ，５５，４５；　Ｈ，７，２２；　Ｎ、１８．２
０；Ｓ、６．０４ 実験値：　Ｃ，５５，８９；　Ｈ，７，１７；　Ｎ、１
８．８４；Ｓ、６．２０ （Ｘ）　Ｚ　５ｅｒ−＋ＪＨＮＨＢｏｃ　の製造Ｚ−５
ｅｔ−（）Ｈ１０，０１、ｔ−プチルカルバゼー）６．
２ｆをＤＭＦ　　１５０ｍｅにとかして水冷し、ＨＯＮ
Ｂ　　８．０１　、　ＤＣＣ９，８ｙを加えて１５時間
かきまぜた。析出したＤＣＵを戸別し、濃縮後。

Ａｃ０Ｅｔに転溶した。Ａｃ０ＥｔＮは、４％ＮａＨＣ
０，４水、１０％クエン水氷１０浄し、　Ｎａ２５Ｏｚ
で乾燥した。濃縮後、エーテルを加えて結晶として枦取
した。収量’１．Ｂ　ｆ　（５０，４’ｈ）　　ｍｐ、
９５−９８℃。

〔α〕２６−６．２°（ｃ＝０．８　、ＤＭＦ　）　、
Ｒｆ”０．６２ 元素分析　Ｃ１ａＨ２ｓ　０ｓＮｓ　として計算値：　
Ｃ，５４，８８；　Ｈ，６，５６；　Ｎ、１１．８９実
験値：　Ｃ，５４−７７；Ｈ，６，８８；Ｎ、１２．２
９（ＸＩ）　Ｚ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ　）−５ｅｒ−ＮＨＮ
Ｈ−Ｂｏｃの製造Ｚ−５ｅｒ−ＮＨＮＨ−Ｂｏｃ　８．
９　ｐをＭｅＯＨ８００ｍｅ中接触還元したのち、ＤＭ
Ｆ５０ｍｇに転溶した。

これに、Ｚ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−０Ｈ−ＣＨＡ　　６．
２１より調製したＺ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−ＯＨ，ＨＯＢ
ｔＬｓ’ｆを加えて水冷し、　ＤＣＣ２，８ＩＩを加え
て１５時間かきまぜた。析出したＤＣＵを戸別し、濃縮
後、ＡｃＯ，Ｅｔにとかした。ＡｃｏＥｔ層は、４％Ｎ
ａＨＣＯ＋水、１０％クエ水酸１０洗浄し、　Ｎａ２Ｓ
”０．で乾燥した。濃縮後エーテルを加えて、沈澱とし
てＰ取する。収ｔＴ、４５１　（９８，７％）ｏ　ｔｌ
ｐ、１’ＯＯ−１０１℃、（α〕２６．．９°（ｃ　＝
　１．２’　、　Ｄ　Ｍ　Ｆ　＞。

Ｒｆ’０．５１ 元素分析　Ｃｓ　３Ｈ４１１０！ｌ　Ｎ７　Ｓ　　とし
て削算組：　Ｃ，５５，０６；　ＩＬ６．８６；　Ｎ、
１８．６２；８　４．４６ 実験値：　Ｃ，５５，４９；　Ｈ，６，９４；　Ｎ、１
Ｂ、１４；Ｓ　、　８．８６ （Ｘｆｉ）　Ｚ−Ｌｙｓ（Ｍｔｒ　）−Ａｒｇ（Ｐｍｅ
　）−８ｅｔ　−ＮＨＮＨ−Ｂｏｃ　　の製造 Ｚ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−８ｅｒ−ＮＨＮＨ−Ｂｏａ　　
８．９　ｔをＭ　ｅｏｌ−１８００ｍｅにとかし、接触
還元したのち、ＤＭＦ５０ｍｇ　　に転溶した。これに
、　Ｚ−Ｌｙｓ（Ｍｔｒ）−ＯＨ・ＤＣＨＡ　　８．４
　ｙより調製したＺ−Ｌｙ　ｓ　（Ｍ　ｔ　ｒ　）−〇
）］　。

ＨＯＢｔ　Ｏ，８８ＩＩ　　を加えて水冷し、　ＤＣＣ
１，８４ｙを加えて２０時間かきまぜＩこ。析出したＤ
ＣＵを戸別し、濃Ｍ後、ハｃＯＥｔを加えて粉末として
戸数し＊　ｈｌ　ｅ　ＯＨＡ　ｃ　ＯＥ　ｔより再結晶
した。収１ｉｉ５、ｔｆ（９８，４％）。ｍｐ、１０８
−１０５℃。

〔σ　］　　”：　、−７，２°　（Ｃ＝０．８　　、
　　ＤＭＦ　　）　　　、　　Ｒｆ’０．５７ 元素分析　Ｃ４０ＨＦ２０１ａＮａ　８２　　としてｉ
ｔ　ｌＥ［値：　Ｃ，５Ｆ、、５０；　Ｈ，６，９４；
　Ｎ、１１．８９；Ｓ、６．０５ 実験値：　Ｃ，５５，７０；　Ｈ，７，１５；　Ｎ、１
１．６０；Ｓ、５．６８ （Ｘｉｌｉ）　　Ｚ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ　）−Ｌｙｓ（Ｍ
ｔｒ　）−Ａ、ｒｇ（Ｐｍｅ　）＝Ｓ　ｅ　ｒ　−ＮＩ
（ＮＨ７Ｂ　ｏ　ｃ　　Ｏ：）製造Ｚ−Ｌｙｓ（Ｍｔｒ
）−Ａｒｇ（Ｐｍｅ、）−５ｅｔ−ＮＨＮＨ−１３ｏｃ
４．８ＩｆｅＭｅＯＨ８０Ｑｍｅ　にとかし、接触？４
　元したのち、ＤＭＦ　Ｔｏｍｇに転溶した。これに、
ｚ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−０Ｈ−ＣＨＡ　２．８　ｆより
調製したＺ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−０Ｈ，ｌｌ０Ｂｔ　０
．７４　ｆを加えて氷冷し。

ＤＣＣｌ、１２ｐを加えて１５時間かきまぜｔ−０析出
したＩ）ＣＵをンＦｊ＞ｉｌＪ　Ｌ　濃＃：後、Ａｃ０
Ｅｔにとかし、Ａｃ０Ｅｔ７Ｂ°１を４％ＮａＨＣＯ３
水、１０％クエン順水順法浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し
た。濃縮後、エーテルを加えて沈澱として戸数し、Ｍｅ
（丹■−エーテルより再沈澱しｔこ。収量５．８Ｆ（８
９，８％）、６ ｍｐ、１８６−１１３７℃　［ａ　：］　Ｄ６−６°（
Ｃ＝１．０　、　ＤＭＦ　）　、　Ｒｆｌ　０１５８元
素分析　Ｃｓ　ａ　ＨｇＱ　０１６　Ｎ１３５３として
、ｉｌ？直：Ｃ，５５，５６；　　見、６．９９；　　
Ｎ、１２．７６；Ｓ、６．７４　　　　′− 実暖イ〔・Ｉ：　Ｃ，５５，８４；　Ｈ，？、０７；　
Ｎ、１２．５θ；Ｓ、１３．５９ （ＸｉＶ）　　Ｚ−Ｌｙｓ（Ｍｔｒ）−Ａｒｇ（Ｐｍｅ
）−Ｌｙｓ（Ｍｔｒ）−Ａｒ　ｇ　（、Ｐｍｅ　）　−
５ｅ　ｒ−ＮＨＮＨ−Ｂｏ　ｃの２ｒ’Ｊ　！Ｚ−Ａｒ
ｇ（Ｐｍｅ）−Ｌｙｓ（Ｍｔｒ）−Ａｒｇ（Ｐｍｅ　）
　−５ｅｒ　−ＮＩＬＮＨ−Ｂｏｃ　　８．　Ｏｊ’を
ＭｅＯＨ１５０ｍｅにとかし、接触還元したのち、ＤＭ
Ｆ　６０ｍｆｆに転溶した。これに、　Ｚ−Ｌｙｓ（Ｍ
ｔｒ）−０Ｈ−ＤＣＨＡ　　１．５４　ｙより調製しｔ
こ７．−Ｌｙｓ（Ｍｔｒ）−０１４，ＨＯＢｔ　Ｏ，３
１１をヵ１１えて水冷し、ＤＣＣＯ，５７ｐを加えて１
５時間かきまぜた。析出しなＪ、）　ＣＵを炉別し、澱
縮後ｉ　Ａｃ０Ｅｔにとかし、　ＡｃＯＥｔＪｍ’ｅ４
％〜ａＨｃＯ３７Ｊ＜　、　ｌ　０％クエン酸水で洗浄
し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。ｄ、゛１縮後、エーテル
シ加えて結晶として戸数し、Ａｃ０Ｅｔより再結晶Ｌ４
．ｍ。収ｊｉｌ；　２．７０９　（７２，８％）６ ｍｐ、１２８−１２５℃　Ｃａ　〕Ｄ５．９°（ｃ　＝
　１゜１　、　ＤＭＦ　）　、　［１ｏ、＋５７元累分
析−Ｃ８２１−Ｉ］２３０２ＯＮ１５Ｓ４　　として４
ｗ値：Ｃ，５５，７８；Ｈ，７，０２；Ｎ、１１．８９
；Ｓ、７．２６ 実験飴：Ｃ，５５，８９；　Ｈ，７，８Ｊ　Ｎ、１１．
７２；Ｓ、７．０８ （ＸＶ）　Ｂｏｃ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−
ＡｒｇＣＰｍｅ）−Ｇｌｙ−Ａ、ｒｇ（Ｐｍｅ　）−Ａ
ｒｇ（Ｐｍｅ　）−Ａｌａ−５ｅｒ−Ｇｉｎ−（）Ｂｕ
　　の製造 Ｚ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−Ａｒｇ（Ｐｍｅ）−Ａｌａ−９
ｅｒ−Ｇｌｎ　−０Ｂｕｔ　１０　ｆをＭｅＯＨ１００
ｍｇ　　＋ことかし、接触還元したのちＤ）、ｌＦ２０
ｔｒ＋４？に転〃ノした。これに１Ｈｏｃ−Ｇｌｎ→４
　ｅ　ｔ−Ｌｅ　ｕ−Ｐｈ　ｅ−Ａｒｇ　（Ｐｍｅ）−
Ｇ　Ｉ　ｙ　−（）Ｉ　ＩＯ，８５９、ＨＯＢｔ　１８
５ｍＦ　　を加えて水冷し。

ＤＣＣ２ｌｏｍｆを加えて２０時間かきまぜた。析出し
たＤＣ（Ｊを炉別し、濃縮後、ＭｅＯＨを加えて沈澱と
してＰ取した。収量１．５０ｆ（８７，４％）。

６ ｍｐ、２１Ｇ−２１７Ｃ（分解）　、　　ｌ　ａ　）　
ＤＩ　Ｌ　８゜（ｃ＝　１．０　、　ＤＭＦ　）　、　
Ｒｆ’　０．４８元素分析　Ｃｏｇ　）ｉｔ５４０２３
　Ｎ２２　Ｓ４　　として訓算伝：　Ｃ，５６，０９；
　Ｈ，７，２７；　Ｎ、１４．４２；Ｓ、６．００ 実幅１１ぐｌ：　Ｃ，５４，８１；　Ｈ，７，８８；　
Ｎ、１４．２３；Ｓ、５．７９ （ＸＶｌ）Ｈ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−３ｅ
ｒ−Ｇｌｎ−、：・１ｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−
Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−３ｅｒ−’ｌ；ｉｎ
イ）Ｈの製造 Ｂｏｃ−Ｇｉｒｌ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ（
Ｐｍｅ　）−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（Ｐｍｅ　）−Ａｒｇ（Ｐ
ｍｅ　）−Ａｌ　ａ−５ｅｒ−Ｇｌｎ−（ンＢｕ　ｔｌ
、ＯｇにＴＦＡ　１０ｍｅを加え、室ｌ晶で５０分間振
りム■ぜｔこのら、ム亀縮し、エーテルを加えてｔｌ１
段としてシ戸１反し、乾・力詐した。

一万、　　Ｚ−Ｉ−ｙ　ｓ　（Ｍｔ　ｒ　）−Ａｒｇ（
Ｐｍｅ　）−Ｌｙｓ　（Ａ４ｔ　ｒ　）−Ａｒｇ（Ｐｍ
ｅ）−５ｅｒ−ＮＨＮＨ−Ｂｏｃ　　　０．８Ｂｙ　　
　＋こＴ”　　Ｆ　　Ａ１０ｍ／　　を加えて室（旭で
１０分：’！ｌ（、毀り＋１シぜｔこのち、濃縮し、エ
ーテルを汀えて沈ｌ采として沖取し乾ガ・たした。これ
をＤＭＦ　１０ｒｎｌ？にとかし、ドライアイス−アセ
トンでンｔ、苅１後、　　６．２Ｎ、ｉ（ＣＩ／ＡＩ：
０ＥｔＯ，２８ｍ６　、４Ｊｆｉ硝酸イソアミル（０，
０７５＋ｎＲ）ｆ加え、−２５°〜−２０℃で２０分１
１１１イ！べつｔこ（ヒドラジンテスト：陰性）。これ
を再びドラ−イアイス−アセトンで冷却し、”［’ＥＡ
０．２５ｍ（’を加えて中和し７ｔこ。アミン成分をＤ
ｈＩＦ４０ｍ（１！にとがし、水冷しＴＥＡｏ、１６ｎ
ｌ　を加えたのち１グｒ′１（こ−１１四ノしたアジド
溶液を加えて、４℃で７２時間０１き才ぜた。反応液を
、希酢酸水にそそぎ、折１１ツしたゲルをＰ取し、含水
Ｃ，Ｉｌ、　ＣＮで洗浄した。収・に１．．４０　ｆ　
（８１，５％）、Ｒｆ’　０．０９゜このうち４ＱＯｍ
ｇ’ｅＯ，１５Ｍへ（ＳＡ’２含＆ＴＦＡ−チオアニソ
ール−メチルスルフィド（８：１：１）６０ｍｅにとか
し、室温で２時間振りまぜたのち、　Ａ　Ｃ０Ｎ１１４
４．００　ｍ　ｌ　　を加えて濃縮し、エーテルを加え
て沈澱としｉｌＪ取し、乾燥した。これを少量のｌＮＡ
ｃＯＨにとカルセファデックスＧ−２５のカラム（２，
２Ｘ１２０ｃｍ）　に付した。ｌＮＡｃＯＨで溶出し１
６０μｅ−２６０μｅの分画ヲｊ４％　？ｉｂて凍結乾
燥し、ついでアンバーライ）ＩＲＡ−４１０（酢酸型）
のカラムを通し、凍結乾燥した。

これをさらにＴＳＫ−ＬＳ　−４１０のカラＡ　（２，
３−４ｘ７．５ｃｍ＋２．１４Ｘ８０ｃｍ）を用いるＨ
　Ｐ　Ｌ　Ｃで精製し、目的物を得た。収量４５η〔α
、：１２４４５．９゜（ｃ　＝　０．７　、０．ｌＮＡ
ｃＯＨ）Ｒｆ’（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）　　０．２０ア
ミノ酸分析：　Ｌｙｓ　１．７１．　Ａｒｇ　４．７１
．　Ｓｅｒ　１．６９゜Ｇｌｕ　２、ｘ２．　Ｇｌｙ　
１．００　、　Ａｈａ　１．０８．　Ｍｅｔ　Ｏ，ｊ＋
２．Ｌｅｕｌ、８０　、　Ｐｈｅ　１．０８　（平均回
収率７７％）実施例２ キャリヤー蛋白とポリペプチド複合体のｆ２ｒＡ実施例
１（ＸＶＩ）で得たポリペプチドとサイログロブリン（
以下ＴＧ）との結合を、グツドフレンドらの方法に準じ
て行なったしサイエンス、１４４゜１８８４（１９６４
））。即ち、当該ポリペプチド２．５　ｍ　ｇをＴＧ８
．７５’ｌと混合し＋２ｙｌの６０’ｍＭのフォスフェ
ートバッファーを加え、氷水中でまく攪拌した。これに
カルボジイミド塩酸塩８０．４１Ｆを蒸留水２００μｅ
に溶かしたものを１滴ずつゆっくりと加えた後、８時間
氷水中で攪拌しながら反応させた。反応後、蒸留水で透
析を充分に行ない、凍結乾燥を行なって蛋白抜合体４．
７グを得た。

実施例８ 抗体検出のためのＥ　Ｉ　Ａ用抗原の調製ＥＩＡ用抗原
の調製は芯用らの方法（ジャーナル　オブ　バイオケミ
ストリー、Ｔ９，２８８（１９７６）］の方法に準じて
行った。

（１）　　ポリペプチドへのマレイミド基の導入実施例
１　（ＸＶＩ）で得たポリペプチド（８５０ｎｍｏＪｅ
ｓ）を１　ｄの１１００ｒｎフオスフエートバツフアー
ｐＨ６，８に渚解し、Ｎ−（４−カルボキシシクロヘキ
シルメチル）マレイＥＦのＮ−ヒドロキシサクシニミド
エステル５８６μｐ　（１，７５μｍｏｌｅｓ）と７０
μｅ　のＮ、Ｎ−ジメチルクロマミドｆｅ４Ｈニ加え混
合し、８０℃で８ｏ分橙拌して反応後、セファデックス
Ｇ−２５カラムで分画を行ないマレイミド基の導入され
たポリペプチド分画１８５ｎｎｏ　Ｉ　ｅ　ｓ　　を得
た。

≦？− （１１）　　マレイミド基導入ポリペプチドとβ−Ｄガ
フクトシダーゼとの結合 実施例８（１）で得たマレイミド基導入ポリ鏝ブチド１
６．５ｎｍｏｌｅｓとβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ８゜８
ｎｍｏｌｅｓを混合し、４℃で１８時間反応後。

４１２．５ｎｍｏｌｅｓ　のβ−メルカプトエタンール
で反応を停止させた。β−Ｄ−ガラクトシダーゼと結合
したポリペプチドは、セファロース６Ｂカラムで分画を
行ない、以下の実験に使用した。

実施例４ ＥＩＡ法 実施例２で得た蛋白複合体で免疫したマウス血清あるい
はハイブリドーマ上清中の抗体活性の検出はＥＩＡ法を
用いて行なった〔イムノファーマコロジ・−，１，８（
１９７８））。すなわち、血清めるいはハイブリドーマ
上ａをバッファーＡ（２０ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４，１０
０ｍＭ　ＮａＣ１，０，１％ＮａＮ３　、１ｍＭ　Ｍｇ
Ｃ１２、ｐＨ７，０）　　で希釈し、この１００μｅを
とり、実施例８で得たポリペプチド誘導体１００μｅと
よく混合し、２４℃で２４時間反応させた。反応後、ウ
ザギ抗マウスＩｇＧを結合した８％セルロース１００　
／ｌ　１１を加えて２４℃、４時間反応させた。反応後
、セルロースを０．５％ツイーン２０を含んだバッファ
ーＡでよく洗浄し、４−メチレンペリフェリルーβ−Ｄ
−ガラクトシド２０μｇ／ｍｇを５００μｅ　加え、８
７℃で２時間反応後、１００ｍＭカーボネートバッファ
ー（ｐＨ１０，５）を８１加えて反応を停止し、上清中
の蛍光強度を蛍光計で測定した〔エキサイチージョン８
６５ｎｍ、エミッション４５０ｎｍ）。

実施例５ 免疫 ７〜８週令のＢＡＬＢ／Ｃ雌マウス６匹各々に抗原とし
て実施例２で得た蛋白複合体の、タンパク量として、４
０Ｆｇをフロイントコンプリート　アジュバントとよく
混合し、皮下に接種した（初回免疫）０初回免疫の２週
後、同量の抗原をフロインドインコンプリート　アジュ
バントとよく兄合し、皮下に接種した（二θで免疫）。

さらに、その２週後、二次免役と同様の方法で三次免疫
を行なった。三次免疫の６日後、マウスから血故を部分
採収し、血清中の抗体価を実施例４記載のＥ　Ｉ　Ａ法
で測定しｔコ。このうち、高い抗体価を示したγ−２マ
ウスに対して１２０μｇの抗原を９．５　ｄの食塩水に
〃Ｉ解させたものを静脈内に接Ｃｎすることにより最終
免疫を行なった。各マウスの抗体価ｉは第１表に示した
。

第１表 免役しｔこマウスの抗ペプチド抗体価 １）血清の希釈は１／１０００ ２）血清の希釈は１／６８００ 幻　血清の希釈は１／７８００ ４）−二検出不可能 ５）　　Ｎ、Ｄ、、検索せず Ｂ／Ｔ：（結合した酵素活性／加えた全ｔＩＹ素活性）
　ｘ　１００ 実施例６ 細胞融合 実施例５記載の方法で免役を行ない、最終免暗の３日後
のγ−２マウスから１鉾臓を摘１月し、ステンレスメツ
シュで圧迫、濾過し、イーグルズ・ミニマム・エッセン
シャルメデイウム（ＭＥＭ月と浮遊させ、肺臓細胞浮遊
液を得た。細胞融合に用いる細胞として、ＢＡＬＢ／Ｃ
マウス由来ミエローマ細胞Ｐ３−ｘ６８．Ａｇ　８．Ｕ
ｌ（Ｐ８Ｕｌ）　　を用いた〔カレント　トピックス　
イン　マイクロバイオロジー　アンド　イムノロジー、
８１．１（１９７８））。細胞融合は、原注しネイチャ
ー。

２５６、．４９５（ｔ９７５）：］に準じて行なつ！ら
即ち、ｉｉｉ’４Ｎ妹１）胞およびＰ２Ｏ３をそれぞれ
血清を含有しないＭ　Ｅ　Ｍで８度洗浄し、肺臓細胞と
Ｐ８Ｏ１数の比率を５＝１になるよう混合し′Ｃ１８０
０回転で１５分間遠心を行なって細胞を沈澱させた。

上清を充分に除去した後、沈澱を軒くほぐし、４５％ポ
リエチレングリコール（ＰＥＧ）６０００（コツホライ
ト社製）を９．８ｍｌ加え、８７℃温水槽中で７分間静
置して融合を行なった。融合微細ＩＪ）、ｇに毎分２ｍ
ｌの割合でＭ　Ｅ　Ｍを添加し、合ｉ１１２−のＭ　Ｅ
　Ｍを加えた後６００回転１５分間遠心して上清を除去
した。この細胞沈澱物を１０％牛脂児血清を含有するＲ
ＰＭ１１６４０　メディウム（ＲＩ’ＭＩ　１６４０−
１０ＦＣ５）にＰ２Ｏ３が１　ｍｌ当り２Ｘ１０’個に
なるように浮遊し、２４穴マルチデイシユ（リンプロ社
製）に１ウエル１　ｚｌずつ１４４ウエルに播種した。

播種後、細胞ケ３７℃で５％炭酸ガスフラン器中培養し
た。２４時ｊｆ５］接ＨＡＴＣヒポキサンチンＩ　Ｘ　
１０−’　ｌｆｖ［、アミノブチリ７４　Ｘ　１０−’
Ｍ　、チミジン１．６　Ｘ　１０　　’Ｍ　）を含んだ
ＲＰＭＩ　１６４０−１０ＦＣ５培地（ＨＡＴ培地）を
１ウェル当り］、　ｖｔｌずつ添加することにより、Ｈ
ＡＴ選択培養を開始した。１１　Ａ、　Ｔ　＞ｆｉ４１
ｉ！培養は、培養１ｒｌ始８，５．７日後に同波を１ゴ
捨てたあと、１　ｗｅのＨＡＴ培訓を象加することによ
り継続し稀ハイブリドーマの増殖は、細胞融合ケ、１０
〜１４日で認められ、培養液が黄裂：したとき（約１×
１０　’／　ｍｌ　）　、上清を採取し、ＥＩＡ法で、
抗体の有無を検索した。このようにして　／”ｔイブリ
ドーマの増殖が認められた１４１ウエルの上清を調べた
ところ、２ウエル（７２−１１、７２−１００）　　に
強い抗体活性、２ウエル（γ２−６２．γ２−７０）に
弱い活性を認めた。

実施例７ クローニング 抗体活性が陽性を示した３ウエル（γ２−１．１゜６２
．１００）の各／）イブリドーマを、　Ｉ！１１！界希
釈法によってクローニングを行な′つた。即ちハイブリ
ドーマが２個／　ｙｒｔになるようＲＰＭＩ　１６４０
−２０ＦＣ５に浮遊させ、９６六マイクロプレート（ヌ
ンク社ｆＲ）にｌウェル当り０．１　ｓｌずつ分注した
。

分注する際、フィーダー細胞としてＢＡＬＢ／Ｃマウス
の胸腺細胞をウェル当り５　ｘ　１０’４ＩＡＩになる
よウニ加えた。このようにして、約２週間該には利１胞
の増殖が認められるようになり、上滑を採取して、抗体
の有無を実施例４記載のＥＩＡ法で調べた。その結果、
γ２−１１では１９クローン中８クローン、γ２−６２
では５４クローン中８クローン。

γ２−１００では４７クローン中５クローンに抗体活性
を認めた（第２表）。

モノクローナル抗体のＩＦＮ−γに対する結合能 モノクローナル抗体のＩＦＮ−γに対する結合能は１次
の方法で仙討した。即ち、ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体を
結合させた８％セルロース溶液８００　μｇに、７２−
１１．７２−６２．７２−１００　由来のそれぞれ２〜
８４のクローン細胞の培養上洛を各々８００ｚ１１１１
１工、室温で１８〜２０時１ハ反応させた。反応後セル
ロースを生理食塩水でよく洗浄し、５５０Ｕ／ｓ＜の下
記により得ｊ、：　ｌ　、　Ｆ、、　Ｎ−γを加え、８
−４時間反応させた。反応後、Ｊ：清を採第　２　衣 クローン化されたハイブリドー マの抗ペプチド抗体活性 Ｂ／Ｔ　：　（結合した酵素活性／加えた全酵素活性う
×　１００ 取し上清中のＩＦＮ−ｒ活性をマイクロプレートを用い
た４！ｔ！胞変性効果（ＣＰＥ）リーデング法で測定し
た。、（アプライド　マイクロバイオロジー。

１６．１７０６（１９６８）。すなわち、９６穴マイク
ロプレート（ヌンク社製）全てのウェルに６０μｅのＭ
ＥＭを入れ、最初のウェルにＩＦＮサンプルを５０μＣ
加え′Ｃ１連続的に２倍希釈・を行なった。このように
した各ウェルに、ＷＩＳＩ＠胞を２０％ＦＣ５含＠ＭＥ
Ｍに１　ｍｌ当り４　Ｘ　１０　’＠ニなるよう副整し
た細胞浮遊液５０μｅを加え、２４時間、８７℃、炭酸
ガスフラン器で培養した。培養後、水泡性口内炎ウィル
スにュー　シャーシー株ンを２０００ＴＣＩＤｓｏ（テ
イツシューカルチュアインフエクテイングドーズ５０）
になるようλｉＥＭで調整し、その５０μｅを各々のウ
ェルに加え、８７℃、炭酸ガスフラン器内で培養した。

約３５時間後、ＩＦＮサンプルを加えていないウェルの
細胞が１００％ＣＰＥを起こしすこ時点で、各ウェルの
ＣＰＥを顕微鏡で個察し、５０％のＣＰＥを起こしてい
るウェルのＩＦＮ−サンプルの６釈救の逆数をもってＩ
ＦＮの力価とした。

ＩＦＮ−γサンプルとして用いたものは、ヒト末梢血リ
ンパ球を、コンカナバリンＡ４０μｇ　／　ｗｅと１２
−０−テトラデカノイルホルボール−１８アセテート１
５１　ｇ／ＩＩｔ　　で刺激して７２時間後に採取した
上清で、この培養上清１ｍｔ中にはヒトＩＦＮ−γ（酸
、ｐＨ処即に不安定）を４４００ユニツト含有していた
。もし、クローン細胞の培養上清中にＩＦＮ−ｒに対し
て結合能を持つ抗体が存在していれば、後で加えたＩＦ
Ｎ−γ活性は、セルロース上の抗体に結合し、上清中の
活性は低減される筈である。結果は、γ２−１１のクロ
ーンの上清中に比較的強いＩＦＮ−γ結合能が認められ
、加えたＩＦＮ−γ（５５０Ｕ／譚ｌ）の５０〜７５％
が抗体に結合した（第８表）。

実施例９ モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの腹水化 第８表 モノクローナル抗体によるＩＦＮ−γ活性の吸収能かし
め９．５　ｍｌのミネラルオイルを腹腔内に投与してお
いたＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に接種することにより
腹水化を行った。ハイブリドーマを腹腔に投与して１０
日後、腹水を採取して抗体価をＥＩＡ法で測定したとこ
ろ、ｉｏ’倍希釈まで抗体活性を示した。なお、当該ク
ローン細胞の培養上清中の抗体活性は、１０４倍希駅ま
で１−否められているが、ｍ水化することにより約ｌ　
Ｑ　Ｑ　ＱＰｉ稈度抗体活性が上昇した。

実施例１０ モノクローナル抗体の情調 実施例９で得られた腹水４　ｙｌを出発材料として、ス
テーリンら（ジャーナル　オブ　バイオロジカルケミス
トリー、２５６．９７５０（１９８１）：］の方法に準
じてモノクローナル抗体を情調した。

まず腹水からフィブリン様物質を除去するため１０．０
００回転１５分間遠心した後、リン酸緩絢液−食塩水Ｃ
ＰＢＳ　：　８．１ｍ　Ｍ−Ｎ２Ｈ４ＰＯ４、１，５ｍ
ＭＫＨｚＰＯ４，２，７ｍＭＫＣｌ、１８７ｍＭＮａＣ
！　、ｐＨ７，２）で２８０１ｍの紫外部吸収（Ａ２ｓ
ｏ）が１２〜１４の値を示す濃度に希釈した。希釈後サ
ンプルに飽和硫酸アンモニウム溶液を４７％の濃度にな
るように加え、４℃で１篭拌しながら６０分間塩析を行
ない、その後遠心（１０，０００回転、１５分間）を行
なって沈澱物を得た。沈澱物を５０ｍＭ　ＮａＣ１含有
２０ｍＭ）リス緩衝溶液（ｐＨ７，９）に浴遊し、同ｍ
液２ｇｌζ対して透析を行なった。２時間後、２ｅの新
しい同じ透析液に換え、さらに１５時間透析を行なった
。透析後、沈澱を１５）を去するため１０．０００回転
１５分間遠心を行ない、上清をＡ２１１１゜の値が２０
〜８０の濃度になるように調整した。このサンプルを充
分量の５０ｍＭ−ＮａＣ１含有トリス緩衝溶液で順化し
た８　Ｔｄ　ＣＤ　ＤＥＡＥセルロースカラム（ワット
マンＤＥ５２　）にかけ、５０ｍＭＮａＣｌ含百トリス
緩＠溶液を用いて１．５ｙｌ１分の流出速度で分画を行
なった。この条件下では、抗体活性は主とし、て素通り
分画に認められた（第１図）。

抗体の確認にはラエムリらの方法（ネイチャー。

２２７．６８０（１９７０））に準じて５ＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気法＠（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）法を用
いた。すなわち、硫安塩析−ＤＥＡＥセルロースカラ１
１で分画したいくつかのフラクションを、各々２−メル
カプトエタノールで還元を行ない１７％ＳＤＳゲル、８
０ボルト、２４時間泳動を行なった。その結果、抗体活
性に一致して、分子量約５５キロダルトン前後に■■鎖
、約２８キログルトン前後にＬ鎖の２つのバンドが認め
られた（第２図）。このように糖製された抗体フラクシ
ョン１７がＩＦＮ−γに対して、結合能を示すかどうか
を実施例８の方法に従ってＩＦＮ−γ２２００Ｕ／舞ｌ
を加えて検索したところ、Ｉ　ＦＮ−γの約５０％が抗
体に結合性を示すことが判明した（第４表）。

第４表 実施例１１ モノクローナル抗体の属するサブクラスγ２−１１．１
　モノクローナル抗体の属するＩｇＧサブクラスは、実
施例ｉｏの方法で精製したフラクション１７を１０倍に
希釈し、ヤギ抗マウヌＩｇＧ１．　Ｇ２ａ、　Ｇ２ｂ、
　Ｇ８抗体（マイル社）との寒天内沈降反応法（オフタ
ロ二−法：イムノロジカルメソッド　ゲル−ディフュー
ジョン　テクニック、ブラックウェル、オックスフォー
ド、１９６４年）で検討した。結果は、モノクローナル
抗体とヤギ抗マウスＩｇＧ２ｂ抗体との間に著明な１つ
のバンドが認められ、他の抗ＩｇＧ抗体との間には、バ
ンドの形成はみられなかった。従って、当該モノクロー
ナル抗体は、ＩｇＧ２ｂに属するものであることが判明
した（第５表）。

実施例１２ 実施例１Ｏの要領で精製された素通り分画のモノクロー
ナル抗体２５ｍ（６５，８３Ｆ）を０．１ＭＮａＨＣＯ
！　、　ｐＨ８，８溶液に対して一晩透析を行つｔムー
万、アフィゲル」１ｏ（バイオ・□ラド社）２５第５表 モノクローナル抗体のＦ４するサブクラスｚｌをグラス
フィルターを用いて充分水洗を行った後、０．１ＭＮａ
ＨＣＯ３ｐＨ８，３溶液に浮遊させ間記抗体とを元合し
、４℃で４時間、ゆっくりｉ；・７拌しながら反応させ
た。その後、４℃で一晩放ＩＫルだ後、グラスフィルタ
ーヲ用い’Ｔ：　０．］、Ｍ　Ｎ　ａＨｃＯＡｐＨ８，
８溶液でよく洗浄した。反応させたゲルに０、ＩＭｆｆ
−タノール７ミ：／　、　０．１５Ｍ　Ｎａ　Ｃ＋を含
む溶液（ｐＨ８，０）を２５鯉ｌ加え、４℃、１時間振
とうし、残存するかも知れない未反応の活性基をブロッ
クした。その後ゲルをＰＢＳでよく洗浄し′。

０．１％Ｎ　ａ　Ｎ３を含むＰＢＳ２５１１／に懸濁し
、４℃で保存した。加えた抗体量と回収されたＰ液中の
抗体量から、ゲル１　ｙｘｌ当り２８６ｑの抗体が結合
していることが判明した。この様にして得た反応物をカ
ラムに充め、抗体カラムとして使用した。

実施例１８ 参考例４で得た上清６０１１を１ｍＭＥＤＴＡ　。

０．１５Ｍ　ＮａＣｌを含む２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ
、ｐＨ７，６（ＴＥＮ）で１５０ｇ／　　に希釈したの
ち、実施例１２の方法で調製した抗ＩＦＮ−γ抗体カラ
ム（９＊ｔ）にかけた。ＴＥＮで十分洗浄したのち。

さらに０．０１％ノニデツー）Ｐ−４０（、シェル社製
）０．５ＭＮａＣｌを含むＴＥＮで洗浄した。次にｏ、
２５Ｍ　ＮａＣｌ　　を含む０．１　Ｍ酢酸でＩＦＮ−
７を溶出し、溶出液はただちに１ＭトリスＨＣｌｐＨ７
，６で中和した。得られた溶液を蒸留水に対し４℃、１
６時間透析し、これをアセトン−ドライアイスで凍結後
凍結乾燥に付し粉末とした 結果は以下の通りであった。

蛋白質全活性　　比活性　１ｔｊ収率 （ＴＩｙ）、　　（ＵＪ　　　（ｕ／ｑ）　　　Ｃ％）
溶菌液上清　　２５０．８　４ｘｌＯ’　　１．６ｘｉ
Ｏ’　　　−抗体力ラム処９　　　２．０１．５ｘｌＧ
”　　７．５ｘｌＯ’　　　８７．５ここで得られた最
終のヒト免Ｂ２インターフェロン蛋白質め比活性（ＷＩ
ＳＨ細胞に対するＶＳ■の細胞変性効果１１［１止試１
１ケによるウィルス’／ｒ’３　性６１１Ｊ　疋による
（前出））は７．５ｘｌＯ’Ｕ／＃であった。この蛋白
質の性状は下記のとおりでめった。

ヒト免疫インターフェロン蛋白質の性状（１）分子量 実施例１Ｂで得られた蛋白ｒイを２−メルカプトエタノ
ールで処理して５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（１７
，５％）電気泳動（１５ｍＶ、６時間）にかけ、クマジ
ーブルーで染色したところ、蛋白質は単一のバンドとし
て擢認できた（第８図）。

なお同時に泳動させた分子量マーカーの泳動距ｒ＠１ト
と蛋白質の泳動距離との関係から蛋白質の分子量は１７
，０００±１，０００と推定された（第４図）。−万、
２−メルカプトエタノールで処理しなかった蛋白質は分
子量８８，０００±２，０００の位１ｚにもう一本のバ
ンドが検出された。この値はＩＦＮ−γの分子量１７，
００９±１，０００の約２倍に相当することから、この
バンドはＩＦＮ−γの二量体に由来すると拷えられる。

（１１）　　アミノ酸分析 実加ｉ？Ａ１　Ｂで得られた蛋白質をガラス製加水分解
用試鹸管にとり、２００倍量（Ｖ／Ｗ　）の４％チオグ
リコール酸を含む定沸定塩酸を加えて、減圧下に封管し
たのち、１１０℃で２４．４８．７２時間加水分解した
。加水分解後、開管し、塩酸を減圧下で除去し、残渣を
０．０２Ｎ塩醒に溶解して日立製８８５型編速アミノ酸
分析計（こよりアミノ酸分析を実施した。

シスチンおよびシスティンは、ハースの方法しメソツズ
　オブ　エンチモロジ−１１、１９７（１９６７））に
従い、上記蛋白質を過ギ酸酸化しｒｓのち１上記と１ｍ
様に２４時間加水分解して。

アミノ酸分析計によりシスティン酸として定量した。ア
ミノ酸分析値は、２４．４８および７２時間の加水分解
で得られた値を平均して求めた。（Ｉ」し、セリン、ス
レオニン、チロシンおよびトリプトファンの値は加水分
解時間をθ時間ｆこ外挿して求めた。その結果を第６表
に示す。

第６表 （ｌｉｉｌ　　アミノ末ｐ１６１アミノ酸分析実施例１
３で得られた蛋白質をハースの方法しメソツズ　オブ　
エンチモロジ−１１，１９７（１９６７））ｌこ従って
過ギ酸酸化したのち、エドマン分解法の着氷らによる笈
法（ヨーロピアンジャーノール　オブ　バイオケミスト
リー、８゜１８９（１９６９））によりそのア（）末端
アミノ酸分析を実施した。生成したフェニルチオしダン
トインーアミノ酸（ＰＴＨ−アミノ酸）はウルトラスフ
ェア−０１）　Ｓカラムしアルテックス社１費（ｌＪ、
ｓ、Ａ、）　、　４．６　Ｘ　２５０ｍｍ　、　粒子径
５／１ｍ’：ｌを用い、アルチャーの方法（アルテック
ス　クロマトグラム、８，８（１９８０））により、パ
リアン製高速液体クロマトグラフ５０４０％　（ｌＪ、
ｓ、Ａ、）で同定、定Ｉｉｌ　シ／コ。その清果、ＰＴ
Ｈ−メチオニンスルホンおよびＰＴＩＩ−システィン酸
が検出された。

上記実施例より明らかなように本発明の精製法によれば
、　？−５Ｘ　１０’Ｕ／＃以上の比活性を有する実質
的に純粋なヒト免疫インターフェロン蛋白質を製造する
ことができる。

以下にγ−８マウスより得たモノクローナル抗体を用い
た成績を示す。

実施例１４ 三次と同様の方法で四次免疫を行ない四次免疫の２週後
、実施例５と同様に１２０μｇの抗原を０．５ｄの食塩
水に溶解させたものを静脈内に接種することにより最終
免疫を行なった。

実施例１５ 細胞融合 実施例１４に記載した最終免疫の８日後のγ−８マウゑ
から肺臓を摘出し、実施例６記戦の方法で細胞融合なら
びにＨＡＴ選択培養を行なった。

その結果４８ウエルに、ハイブリドーマの増殖を認め、
実施例４に記載のＥＩＡ法で抗体の有無を検索したとこ
ろ、２ウエル（γＢ−１１、γ８−１９）に強い抗体活
性を認めた。

実施例１６ クローニング 抗体活性が強面性を示した２ウエル（γ８−１１゜γ８
−１９）の各ハイブリドーマを、実施例７記載ノ方法で
クローニングを行なった。その結果。

γＢ−１１では２１クローン中９クローン、γ８−１９
では２５クローン中１５クローンに抗体活性を認めた（
第７表）。

実施例１７ モノクローナル抗体のＩＦＮ−ｒに対する結合能 モノクローナル抗体のＩＦＮ−γに対する結合能は、実
施例８に記載の方法で検討した。イ目し。

本実施例で用いたＩＦＮ−γサンプルは、ヒトＩＦＮ−
γ遺伝子をプラスミドに組み込んで大腸菌で発現させた
もの（リコンビナントＩＦＮ−γ；参考例４参照）で、
ｌ１００Ｕ／露ｌになるよう調製した。結果は、γＢ−
１１．１．γＢ−１９，２０クローンの上清中に強いＩ
ＦＮ−γ結合能が認められ、加えたＩＦＮ−γの約９０
％が抗体に結合し第７表　クローン化されたハイブリド
ーマの抗ペプチド抗体活性 Ｂ／Ｔ　：　（結合した醇累活性／加えた全酵素活性）
Ｘ１００第８表　　モノクローナル抗体によるリコンビ
ナントＩＦＮ−γ活性の吸収能 実施例１８ モノクローナル抗体ｉ７）属するサブクラス”ｒ８−１
１．１　、　γＢ−１９．２０クローン所用胞を。

実施例９に記載の方法で腹水化を図り、得られた腹水に
つき、実施例１０記載の方法で精製を行なった。得られ
たモノクローナル抗体のサブクラスは、実施例１１記載
の寒天内沈降反応法で逆打した。結果は、γ８ｆｌ　１
　、１．１ｇ−１９，２０何れのモノクローナル抗体と
も、ヤギ抗マウスＩｇＧ１抗体との間に茗明なバンドが
認められ、他の抗ＩｇＧ抗体との間には、バンドの形成
はみられなかった。

従って、γ８−１１．１　　γ８−１９．２０　　モノ
クローナル抗体は、　　ＩｇＧ１に属するものであるこ
とが判明した（第９表ン。

第９表 モノクローナル抗体の属するサブクラス実施例１９ ＥＩＡ法によるＩＦＮ−γの定量法１ モノクローナル抗体ｆこ対する（ａ）　Ｉ　Ｆ　Ｎ−γ
と（ｂ）同相に固定されたＴＦＮ−γとの競合にぼる定
量法 実施例１３で示された大賜菌で発現させた後精製したＩ
ＦＮ−γを１６μ９／ｍｌになるよう０１Ｍ重炭酸ナト
リウムを含有したリン酸緩衝液（ｐＨ８，０）に浮遊さ
せ、この１００μｅを９６ウエルマイクロプレートの各
ウェルに分注し、４℃で２４時間反応させた。反応後、
ウェルの余剰の結合部位をふさぐため２％牛血清アルブ
ミン含有リン酸緩衝液を１００μｅずつ分注し、４℃で
２４時間処理し、ＥＬＩＳＡに使用するプレートを作製
した。

以上のように調製したプレートに、最大量結合する抗体
の約５０％量の抗体を含む１００μｅの抗体（γ８−１
１．１）溶液と種々の濃度（７５，８Ｘ１０”。

１．２５Ｘ１０３，５Ｘ１０’、２Ｘ１０’、８Ｘ１０
’Ｕ／ｍ／　）にに１．旬製したりコンビナンドＩ　Ｆ
Ｎ−７を８７℃で１時間反応させた混合液を加え、室温
で８時１１ｆ’１反応させた。反応後リン酸緩衝液でよ
く洗浄し、ホースラデイシュペルオキシダーゼでラベル
したヤギ抗マウスＴｇＧ抗体を１００μｅ加え、室温で
８時間反応させた。反応終了後、ウェルをリン酸緩衝液
でよく洗浄し、１０ｇ１の０．１　Ｍクエン酸緩衝液に
２２岬のオルソフェニレンジアミン、１０μｅの過酸化
水素を加えた基質ｆｅｆ液１００μｅを加えて酵素反応
を室温で１５分行ない、４硯定硫酸で反応を停止させた
。停止に７≧ハマルチスキャン（タイ・本Ｅ１．ＩＳＡ
法を用いることにより３Ｘ１０２〜５×１０３Ｕ／ｍｌ
のＩＦＮ−γ含有液中のＩＦＮ−γが定量されることが
判明した。

実施例２０ ＥＩＡ法によるＩＦＮ−γの定帆法頁 モノクローナル抗体に対する（ａ３　Ｉ　Ｆ　Ｎ−γサ
ンプルと（ｂ）酵素標識した本発明ペプチドとの競合に
よる定量法 実施例２０−（＋） 参考例４でｔ’ｔられたリコンビナントＩＦＮ−γを種
々の濃度（６４，８２０，１，６Ｘ１０”、８Ｘ］０３
゜５ｘｌＯ’、２ｘｌＯ’Ｕ／胃ｌ　）に調製し、この
１００μｅを一足量のγ８−１１．１．γＢ−１９，２
０抗体含官液１００μｅと室温で２時間反応させた。こ
れに実施例８で得られた酵素結合ポリペプチド誘導体を
１００μｅ加え、４℃で４８時間反応さぜた。反応終了
後、この混合物を、ウサギ杭マウスＩｇＧ抗体ヲ結合さ
一＋ｌｔこａ％ナセルース溶液１００μｅに加工。

室温で４時間反応させた。反応後、実施例４で記載した
のと同様の方法で酵素反応を行な０、蛍光強度を測定し
た。その結果、モノクローナル抗体（γ８−１１．１．
γ８−１９．２０）への酵素結合ポ１ノペブチド誘導体
の結合は、８２０Ｕ／＊／のＩＦＮ−ｒ存在下でわずか
に阻害され、　８　Ｘ　１０３Ｕ／ｓｄ　穿在下では、
はぼ完全に阻害された（第１０図）。従って本方法を使
用することにより、８２０−・８×１０３Ｕ／ｇ／のＩ
ＦＮ−γ含有液中のＩＦＮ−γの定ぺが可能となった。

実施例２０−（ｉｌ） 実施例２０−（１）と原理的には同じである力５、マル
チスキャンを用いて、自動的に迅速に多数のサンプルを
測定出来る方法として以下の笈法を行つ９６大のマイロ
プレート用プレート（ヌンクーウ酸ｅｊ、ｉ液ｐＨ８，
ｏ　）２０ｏ１を注入し４℃で１晩放置した。液を除い
た後、１％２のＢＳＡを含む０．０２Ｍリン酸緩衝液（
ｐＨ７，４）８００μｇを注入し、室温で８時間数１ｔ
’ｊ後、液を除去した。

＋２１モノクロ一ナル抗体γＢ−１１，１吸−任プレー
トの作製 ０．１％ＢＳＡを含む０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ１
５０μｅ注入しｆコ。４℃で１晩放高後、八を除去し、
０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７−４）で８１す１洗浄
し、抗体吸着プレートを作製した。

（３）操作法 被検試料あるいは標準ＩＦＮ−γを緩ｆ・１液ＡＣ０，
１Ｍ　ＮａＣｌ、１ｍＭＭｇＣｈ、０．１％ＢＳＡ。

０．１％ＮａＮ３　を含むｐＨ７の０．０２　Ｍリン酸
緩衝液）で適当な濃度に希釈し、各々を（２）で作製し
たプレートの各穴Ｇこ７６μｅずつ注入する。次に緩衝
液Ａで１８０倍に希釈した実施例８の酵素標識体の６μ
ｅをプレートの各穴に注入する。バラフィルムをかけ８
７℃１時間反応、引き続き室温で８時間反応させた。反
応液を除去後、０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）
７５μｅで４回洗浄した。

発色反応のため、プレートの各穴に緩衝ｉＡで調製しｒ
、＝　１．５　ｑ　／　ｍｅの４〜ニトロフェニル−β
−Ｄ−ガラクトピラノシド（和光紬薬、特級）１５０μ
ｅを注入して、室温で１晩反応させた。０．４Ｍ炭酸緩
衝液（ｐＨ１０，５）１００μｅを各穴に加えて、発色
反応を停止し、４０５ｎｍの吸光度をマイクロタイトレ
ージョンブレート用光度計チテルテックマルチスキャン
（フロー社（米国）％）で測定した。

第１１図にＩＦＮ−γの標準曲線を示した。第１０表で
ＩＦＮ−γを含む６種類の被検試料につ動を示したが、
変動係数７．４％と良好な結果を与えた。

第１０表 第１１表 実施例１８，１９および２０　（＋）　、　（ｉＤで使
用した租ＩＦＮ−γ含有上清は以下の参考例で示す方法
により得られた。

参考例１ （＋）　　ヒトＩ−ＩＦＮをコードするｍＲＮＡの分ン
＠きヒト末梢血より調製したリンパ球を１２−０−テト
ラデカノイルホルボール−１８−アセテート（ＴＲＡ）
（１５ｎｇ／＊ｔ　）とコンカナバリンＡ（４０１’ｇ
／ｌｘｔ　）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地（１，０％
の牛胎児血清を含む）で８７℃培養し、Ｉ−ＩＦＮを誘
導させた。２４時門後、この誘導したｌＸｌ０（固のヒ
トリンパ球をチオグアニジン変性溶ｉ（５Ｍグアニジン
チオシアネート、５％メルカプトエタノール、　５０ｍ
Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＪ　ｐＨ７，６。

１０ｍＭ　ＥＤＴＡ　）中でテフロンホモゲナイザーに
よって破Ｉｆ性した後Ｎ−ラウロイリルザルコシン酸ナ
トリウムを４９６になるように加え、均質化した混合物
を５．７Ｍ塩化セシウム溶液Ｌ　５．７　Ｍ塩化セシウ
ム、９．１　Ｍエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）６
ｒｒｌＪ１に重層し、ベックマン５Ｗ２７のローターを
用いて１５．℃で２４００Ｏｒｐｍ８０．時間辿心処坤
を行い、ＲＮＡ沈誠を？（また。

このＲＮＡ沈澱を０．２５％Ｎ−ラウロイルザルコシン
酸ナトリ、ラム溶液にとかした後、エタノールで沈澱さ
、せｉ　　８．．８呼のＲＮＡＪｅ得た。このＲＮＡを
高塩浴液Ｌ　０．５Ｍ　ＮａＣｅ　、　１０ｍＭ　Ｔｒ
　ｉ　ｓ　４１ＣｅｐＨ，，７Ｊ、　ｌｒａＭ　Ｅｌ）
ＴＡ、　ＯＪ％ＳＯ８：］中でオリゴ（ｄＴ）セルロー
スカラムに吸着させ、ポリ（イ）を含むｍＲＮＡを低塩
溶液（１０ｒｎＭ　Ｔｒ　ｉ　ｓ　−ＨＣＩ　−ｐＨ７
，６、１ｍＭ、　Ｅｌ）ＴＡ　、　０．８％ＳＤＳ　）
で浴出させるこやにより、ポリ囚を含むｍＲＮＡ　７０
０μｇを分取した。

このｍＲＮＡを更にエタノールで沈澱させ、０２Ｉｌｌ
の溶液（１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｈｃｌ　ｐＨ７，６，２ｍ
ＭＥＤＴＡ、０．８％５ＤＳ）に溶かし、６５℃で２分
向処理して１０〜８５％例糖密度勾配遠心処理（べ一り
マニ／Ｓ、Ｗ２７のローターを用いて２０℃。

２５（１００ｒ−ｐＨ１で２１時間遠心分離）すること
により分画化して２２分画を得た。この各分画につきＲ
ＮＡの一部ずつを、アフリカッメガエルの卵母細胞ｆこ
注入し１合成される蛋白質中のインターフェロン活性〔
ヒト羊膜由来ＷＩＳＨｆｌ胞に対する水泡性口内炎ウィ
ルス（ＶＳＶ）の細胞変性効果阻止試験を用いて測定し
た。抗ウィルス活性（ザインターフェロン　システム、
スプリンガー社。

ニューヨーク、］１ｊゴ、１９７９年〕を測定し。

分画１２（沈降定数Ｓ値は１２−１４５を示したうＥζ
１９５ユニット／μｇＲＮＡの活性を検出し７た。

このようにして得た分画１２のｍＲＮＡは約２０μｇで
あった。

（１１）　　、１４４　、Ｎｒ″（ＤＮＡの合成上記で
得たｍＲＮＡおよび逆転写酵素を用い、１００　ｔｉ　
ｅの反応液Ｃ５ｔ１ｇのｍＲＮＡ、５０μｇオリゴ（ｄ
Ｔ）、１００ユニツトの逆転写酵素ｌ　　１　ｍ　ｈｒ
ずつのｄＡＴＰ、　ｄＣＴＰ、　ｄＧＴＰお誹びｄＴＴ
Ｐ、　８ｍＭＭｇｃ１２．５０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭ　
ジチオスレイトール、　５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐ
Ｈ８，ｆｌｌ　）中で４２℃、１時間インキュベートし
た後に、フェノールで除蛋白し、０．ＩＮ＋ＤＮａＯＨ
で７０℃、２０分処理してＲＮＡを分解除去した。

（ＩＩ）　　二重鎖ＤＮＡの合成 ここで合成された単鎖の相補ＤＮＡを５０７１　ｅの反
応液（ｍＲＮＡとオリゴｄＴを含まｆｆい以外は上記と
同じ反応液〕中で４２℃２＋＋６：間反応させることに
より二重鎖ＤＮＡを合成した。

（＋ｖ）　ｄｃティルの付加 この二ｆｆ１ｌ　Ｄ　Ｎ　Ａ　ｆこヌクレアーゼｓ１を
５０μｇの反応液（二重酬１）ＮＡｏ、１Ｍ酢酸ナトリ
ウムｐＨ４，５，０，２５ｊｓｉ　１’１ａＣ１，１，
５ｍＭ　ＺｎＳＯ４１６ｏユニツトのＳｌヌクレアーゼ
）中で室１ｊ１？（ａ　０分間作用させ、フェノールで
除蛋白し、エタノールでＤＮＡを沈澱させた後、これに
ターミナルトランスフェラーゼを５ｏμｅの反応液（二
正錆ＤＮＡ、０．１４λＩカコジル酸カリ、ｏ、８八４
Ｔｒｉｓ（塩基）ｐＨ７，６，２ｍＭジチオスレイトー
ル。

１ｍＭ　ＣＯＣｌ２　、０．１５ｍＭ　ｄＣＴＰ、　８
０　ｊ−ニットターミナルトランスフェラーゼ）中で８
分間３７℃で作用させ二重鎖ＤＮＡの３′両＠ｌこ約２
０飼のデオキシシチジン鎖を伸長させた。これらの一連
の反応で約８００ｎｇのデオキシシチジン鎖をもっｔこ
二重鎖ＴＪＮＡを得た。

（Ｖ）　　大腸菌プラスミドの開裂ならびにｄＧテイル
のイ」加 一万、１０μｇの大腸菌プラスミドｐＢＲ８２２１）　
Ｎ　Ａ、　Ｅ制限酵素ＰｓｔＩを５０ｐ（１（１’Ｊ）
反応液〔］０μｇ　　Ｉ）ＮＡ、　　５０ｍＭＮａＣ１
，６ｍＭ　Ｔｒｉｓ４（ＣＩ（ｐＨ７，４）、６ｍＭＭ
ｇＣＩ２．６ｍＭ　２−メルカプトエタノール、１００
μｇ／ｌｖ牛血清アルブミン。

２０ユニツトのＰｓｔｌｌ中で３時間３７℃で作用させ
てｐＢＲ８２２Ｊ）ＮＡ中に１ケ所存在するＰｓｔＩｉ
ｔＪ？　ｎ！ｆ１１部位を切断し、フェノールで除蛋白
した後。

ターミナルトランスフェラーゼを５０　／ｌ　ｇの反応
液［［ＮＡ３．Ｏμｇ、ｏ、ｔ４Ｍカコジル酸力１ハ　
０８ＭＴｒｉｓ（塩基）ｐＨ７，６，２ｍＭｍデジチオ
スレイトール　’　ｍＭ　ＣＯＣｌ２．０．１５ｍＭ　
ｄＧＴＰ　　、３０ユニツトターミナルトランスフエラ
ーゼ〕中で８分向８７℃で作用させ上記プラスミドｐＢ
１１２２ＤＮＡの８′両端に約８個のデオキシグアニン
鎖を延長させた。

（Ｖｌ）ｃＤＮＡの会合ならびに大腸菌の形質変換この
ようにして得られた合成二Ｎｆ鎖ＤＮＡ　Ｏ，１ｓ　ｇ
と上記プラスミドｐＢＲ８２２０，５μｇを０．ＩＭ　
ＮａＣ１，５０ｍＲイＴｒｉｓ　−ＨＣｌ　　ｐＨ７Ｕ
、　　１ｍＭ　　ＥＤＴＡよりなる溶液中で６５℃２分
間、４５℃２時間加熱しその後除冷して会合さｔｔＥｎ
ｅａらの方法１−Ｊ。

Ｍｏ＋、Ｂｉｏｌ、９６，４９５（１９７５）〕に従っ
て大腸菌χ１７７６を形質転換させｔ：。

（Ｖｌｌ）ｃＤＮＡ　含有プラスミドの小羨こうして約
８５００のテトラサイクリン耐性株が単離され、これら
各々のＤＮＡをニトロセルロースフィルターの上に固定
した。〔プロシーデイングオブ　ナショナル　アカデＥ
−４イエンスＵＳＡ　７２．８９６１（１９７５）］−
万、ゴエデルらの報告（ネイチャー、２９５゜５０８（
１９８２））、のＩ−ＩＦのアミノ酸配列をもとにして
アミノ＠ＡＩ　−５（Ｃｙｓ４ｙｒ−Ｃｙｓ・ＧＩｎ−
Ａｓｐ　　）及びアミノ酸Ａ　７７−８２　（Ｌｙｓ−
ＧＩｒｒＡｓｐ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ’Ｖａｌ　　）より推
測できる塩基配列ＡｃＧＴＴｃＡＴ’ｊ、ＴＣｇＴＣ’
ｊＴ　”ンをトリエステル法人 （フレアら、プロシーディング　オブ　ナショナル　ア
カデミ−サイエンス　ＵＳＡ、　７５　、５７６５Ｃ１
９’１８）’３を用いて化学合成した。このオリゴヌク
レオチドに対してＴ４ポリヌクレオチドカイネースを用
いて５０μｅ　の反応液（オリゴヌクレオチド０．２μ
ｇ、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ８，０，５，０ｍ
ＭＭｇｃ１２．１０ｍＭメルカプトエタノール。

５０Ｉｌｃｉγ−”２ＰＡＴＰ、８ユニツトＴ４ポリヌ
クレオチドカイネース）中で１時間８７℃で反厄させ、
５・末端を８２Ｐ　で標識した。仁の標識されたオリゴ
ヌクレオチドをプローブとしてＬａｗｎらの方法（ヌク
レイツク　アシツズ　リサーチ、９゜６１０８（１９８
１））に従って上記のニトロセルロースフィルター上に
固定したりＤＮＡ　に会合させ。

オートラジオグラフィーに才って上記二種類のオリゴヌ
クレオチドプローブに反応する菌株を４個単１４１１　
Ｌ、、　？、＝。これらの菌株の各々の菌体からプラス
ミドＤＮＡ　をアルカリ法（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ　Ｈ，Ｃ
，＆Ｄｏｌｙ、Ｊ、、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒ
ｅｓ、、　？　、　１５１８′（１９７９））　　によ
って単離した。次にプラスミドＤＮＡの挿入部を制限酵
素ＰｓｔＩにより切り出し。

分離したプラスミドのうちでその挿入部の長さの最も長
い断片を含むものをえらび、このプラスミドをｐＨＩＴ
８７０９と名ずけた。

次にこのｐＨＩＴ８７０９プラスミドに挿入されたｃＤ
ＮＡ配列の一次構造（塩基配列）をジヌクレオチド合成
鎖停止法とＭａｘａｍ−（１；ｉ　１ｂｅｒｔの方法に
よって決定した。その−次構造は第５図の通りであツタ
。ｐＨＩ′ｒ８７０９　（７）　Ｉ　Ｆ　Ｎ　−７暗号
領［（：Ｉ）’ンＡ、　８１〜Ａ１４６）の塩基配列は
公告文献〔ヌクレイツク　アシツズ　リサーチ、　１０
　、２４８７（１９８２）中の第８図〕に記載されたも
のと同一であった。

参考例２ （１）発現プラスミドとして大腸菌のトリプトファン合
成のプロモータ一部分しプロモーター、オペレーターを
含むＤ　Ｎ　Ａ断片、２７６塩基対、ベネットら、ジャ
ニナル　オブ　モレキュラーバイオロジー、１２１，１
１８（１９７８））を含むプラスミドｐｔｒｐ６０１　
（ベクターはｐＢＲ８２２）を構築し一万、プラスミド
ｐＢＲ８２２を制限酵素Ｅｃｏ’ＲＩおよび制限酵素Ａ
ｖａ　Ｉで切断し、得らｌｌたテトラサイクリン耐性遺
伝子を含むＥ’ｃ　ｏ　ＲＩ　−Ａ、　ｖ’ａ　Ｉ断□
片ののりしろ部分をＤＮＡポリメラーゼＩラージフラグ
メントでうめた。この断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用い
てｐｔｒｐ６０１のＰｖｕｌの切断部位に結合させｐｔ
ｒｐ７０１を構築した（第６図）。　　□（１１）　　
次にｐｔｒｐ７０１に２ケ所存在する制限酵素Ｃ１ａｌ
切断部位の一つを消去するため、ｐｔｒｐ７０１をＣ１
ａＩで部分分解して二つのＣＩ、ｑｌ　ｖＩ断部位のう
ち一万のみが切断されたものを得た、生じたありしろ部
分をＤＮＡポリメラーゼＩ’５−シフラグメンｌ−でう
めたのち、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで再度結合させてｐｔｒ
ｐ　７７１を得た〔第６図）。　　　　′（１１０ｐＨ
ＩＴ８７０９を制限酵素ＰｓｔＩで切断してＩＦＮ−γ
の構造遺伝子を含むＰｓｔｌ断片を得總この断片を制限
酵素ＲｓｔＮＩで部分方縁し、ＩＦＮ−γ溝造遺伝子内
にあるＢｓｔＮ１部位あ切断されたＢｓ　ｔＮＩ−Ｐｓ
　ｔ　Ｉ断片を得た。ＢｓｔＮＩ４ＪＪ断部位ののりし
ろ部分をＤＮＡポリメラーゼ１ラージフラグメントでう
めたのち、０１１述したトリエステル法によって化学合
成した蛋白合成開始コドンＡＴＧを含むオリゴヌクレオ
チドアダプター Ｃ’ＧＡＴＡＡＴＧＴＧＴＴＡＣＴＧＣＣＴＡＴＴＡＣ
ＡＣＡＡＴＧＡＣＧＧ をＴ４ＤＮＡリガーゼで結合さ・せた。

−万、上記アダプターを結合させたＩＦＮ−γ遺伝子を
ｐｔｒｐ７７１を制限酵素Ｐｓｔｌと制限１ｉ↑素Ｃ１
ａｌで切断して得た断片をトリプトフナンブロモータの
下流に挿入してＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合させ、
ＩＦＮ−γ発現プラスミドｐＨＩＴｔｒｐＨ０１を構築
した（第７図）。

（ＩＶ）　　ｐＨＩＴ　ｔｒｐ　１１０１をさらに改良
して次の通りｐＨＩＴｔｒｐ２１０１を構築した。

まずｐｔｒｐ６０１を制限酵素Ｃ１ａｌおよび制限酵素
Ｈ’ｐ　ａ　ｌで処理してｔｒｐプロモータを含むＣ１
ａｉ−Ｈｐａｌ断片Ｑ、８８Ｋｂを得た。この断片を、
ＣＩａｌで切断しアルカリホスファターゼ処理したｐＨ
ＩＴｔｒｐＨＯＨ１ｍＴ４ＤＮＡ　リガーゼを用いて結
合させｔｒｐプロモーターが二つ直列に入ったｐＨＩＴ
ｔｒｐ　２１０１を芋％ｆこ（第８１網）。

このプラスミドｐＨＩＴ−Ｌｒｐ２１０１　を用いてＣ
ｏ　ｈ　’ｅ　ｎらの方法し前出〕に従って、大腸菌２
９４を形質転換させ、このプラスミドを含む菌株Ｅ。

ｃｏ１ｉ２９４／ｐ）ＩＩＴ−ｔｒｐ２１０１　　をｆ
Ｗ４こ。

参考例８ Ｅ、ｃｏｌ　１２９４／ｐＨＩＴｔｒｐ２１０１を８１
℃ｇ／Ｉｌｌノテトラザイクリン、０４％カザミノｆｌ
、１％グルコースを含むＭ９培地２００震１　　を分注
した１ｅマイヤー中で８７℃で培養し、生育がＫＵ２２
０に達した時（ζ８β−インドリ−ルアクリル酸（Ｉ　
Ａ７’、、　）を３０μｇ／Ｗｌになるように加えて更
に４時間培養した。

参考例４ 参考例８で得られた培養液１．２ｅを遠心分離して菌体
を集め、これを６０ｍの１０％シュクロースを含む０．
０５Ｍ　Ｔｒ　ｉ　ｓ　−Ｈｅ　ｌ　ｐＨ７，６ニ懸濁
した。

この菌体懸濁液に０，２Ｍフェニル−メチル−スルフォ
ニルフル副ライド（ＰＭＳＦ　）　０．３　ｙｌ　、　
５　’Ｉ’ｔ（ＮａＣＩ　２．４　ｍｌ　、　０．２　
Ｍ　ｊ’−チレンジアミンテトラアセテ・−ト（ＥＤＴ
Ａ）２．４にｔ、１Ｍスペルミジン２．４ｕｔ、５ダ／
　ｙｌリゾチーム２．４　ｍｌを加え０℃で１時間数ｈ
イしたのち、３７℃で５分処理し、これを更にアルチッ
ク社（米国）製超音波破砕器で０℃８０秒処理した。

この溶菌液を１０５，０００ｘｒ　　で１時間遠心分部
して上清６６ｗ１を集めた。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１０における本発明のモノクローナル抗
体のＤＥＡＥセルロースカラムにおける浴出パターンを
示し、゛第２図は実施例１Ｏにおけるモノクローナル抗
体の電気泳動の結果を示す。 第８図は実施例１８の後に示した本発明の精製法で得ら
れるヒト免疫インターフェロン蛋白質の電気泳動の結果
を、第４図は実施例１３の後に同様に示した分子峨測定
の結果をボす。第５図は参考例１（Ｖｌｌ）で得られｔ
：　ｐＨＩＴ８７０９　フラスミＦの一次構造（塩基配
列）を、第６図は参考例２（１）（１１）のｐｔｒｐ７
０１およびｐｔｒｐ７７１　、第７図は参考例２　（ｉ
ｌ）のｐＨＩＴｔｒｐＨＯ１、第８図は参考例２（ｖ）
のｐＨＩＴｔｒｐ２１０１　のそれぞれ構築図を。 第９図は実施例１９によるモノクローナル抗体に対する
（ａ）リコンビナントＩＦＮ−γサンプルと（ｂ）同相
に固定されたＩＦＮ−γとの競合を示す。第１０図およ
び第１１図はそれぞれ実施例２０−（１）。 ２０−（ｉ：）によるモノクローナル抗体に対する（ａ
）　ＩＦＮ−γ資料と（ｂ）酵素標識された本発明のペ
プチドとの競合を示す。 上記実施例に開示しているマウスＢハイブリドーマγ２
−１１．１およびマウスＢハイブリドーマγ８−１１．
１は、パスツール研究所〔フランス国パリ〕のＣ，Ｎ、
Ｃ，Ｍ、にそれぞれ寄託番号ＡＩ　−２４２およびＡ、
Ｉ　　２４８として寄託されている。 竿３図 ３　　蚤令１℃（２−メルｐ７・トニタノールフト庖井
扛］ド〕＄を図 相対捗動浅 ［ソソナー、ム、　　　　　　　　　　　　　（／ゲ　
り！ρ）＄６目 ＥｃｏＲｒ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｐ
ｙｕ　Ｉｆ＄７図 洟１０’ｌ易 ソフンビナントＩＦＮ−ｆ叡（ｖ／ｍ））ム　、キック
σ−１νＦＬしＰクー１９２０優先権主張　＠１９８２
年１１月２２日［相］世界知的所有権機関（ＷＯ）・モ
ナコ（ＭＣ） ［有］ＰＣＴ／ＪＰ８２１００４４４ ９１９８２年５月３１日［相］世界知的所有権機関（Ｗ
Ｏ）・モナコ（ＭＣ） ■ＰＣＴ／ＪＰ８３１００１００ ０発　明　者　市森有三 堺市浜寺元町５丁７２８番地 ０発　明　者　脇舛光廣 吹田市山手町３丁目１７番Ｂ−５１ ０号

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）式 （） ％式％ （） （） 〔式中、Ｘは結合手またはＩｌｅ　Ｇｌｎ　ＶａｌＭｅ
   ｔ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ａｌａ
   　Ａｌａ（Ｃ） Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ａｒｇで示されるペ
   プチドａｔこおいてそのＣ末端から数えて１〜１６個の
   アミノ酸を有するペプチドもしくはアミ（Ｎｌ ）酸残基を示し、ＹｌｃｔＡｒｇ　Ａｒｇ　Ａｌａ　５
   ｅｒ（Ｃ） Ｇｌｎで示されるペプチド鎖においてそのＮ末端から数
   えて１〜５個のアミノ酸を有するペプチドもしくはアし
   人酸残基を示す〕で表わされるポリペプチド。 （２）ＹがＡｒｇ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎで
   ある特許請求の範囲第１項記載のポリペプチド。 項または第２項記載のポリペプチド。 （４）　　いずれも保護されていてもよい、（ａ）式％
   式％ （） （１） （式中、Ｘは結合手またはＩｌｅ　Ｇｌｎ　Ｖａｌ八４
   へｔ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ａｌ
   ａ　Ａｌａ（Ｃ） Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ａｒｇで示されるペ
   プチド鎖においてそのＣ末端から数えて１〜１６個のア
   ミノ酸を有するペプチドもしくはアミ■ ノ酸Ｗｃ１Ｊｉ、’に示シー　Ｙｌ；ｌＡｒｇ　Ａｒｇ
   　Ａｌａ　５ｅｒ（Ｃ）− Ｇｌｎでボされるペプチド鎖においてそのＮ末端から数
   えて１〜５個のアミノ酸を有するペプチドもしくはアミ
   ノ酸残基を丁すって表わされるポリペプチドの一部に相
   当する反応性カルボキシル基を有する原料と、（ｂ）ポ
   リペプチド（１）の残部に相当する反応性アミノ基を有
   する原料とを縮合し、生成する縮合物が保護基を有する
   場合はその保護基を脱〜εすることを特徴とするポリペ
   プチド（１）の製Ｍ法。 請求の範囲第４項記載の製造法。 （６）ｘがＬｙｓ　Ａｒｇである特許請求の範囲第４項
   または第５項記載の製造法。 （７）式 ％式％ （） ド鎖においてでのＣ末端から数えて１〜１６個のアミノ
   酸を有するペプチドもしくはアミ■ から数えて１〜６個のアミノ酸を有するペプチドもしく
   はアミノ酸残基を示す〕で表わされるポリペプチドとキ
   ャリヤー蛋白との蛋白複合体。 （８）キャリヤ蛋白が牛サイログロブリンである特許請
   求の範囲第７項記載の蛋白複合体。 （９）式 ％式％ （ （） （式中、Ｘは結合手またはＩｌｅ　Ｇｌｎ　ＶａｌＭｅ
   ｔ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ａｌａ
   　Ａｌａ（Ｑ １、ｙｓ　”Ｉ’ｈｒ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ａｒｇでホさ
   れるペプチド鎖においてそのＣ末端から数えて１〜１６
   （Ｃ） Ｇｉｎで示されるペプチド鎖においてそのＮ末端から数
   えて１〜５４ｖＡのアミノ酸を有するペプチドもしくは
   アミノ酸残基を示す〕で表わされるポリペプチドを、キ
   ャリヤー蛋白とカップリングすることを特徴とするポリ
   ペプチド（１）とキャリヤー蛋白との蛋白複合体の製造
   法。 （Ｃ） Ａｒｇ　　Ｇｌｙ−Ｙ−ＯＨ（１） ■ 〔式中、Ｘは結合手またはｌｉｅ　Ｇｌｎ　ＶａｌＭｅ
   ｔ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　ｆ’ｒｏ　Ａｌ
   ａ　ＡｌａＬｙｓ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ａｒｇで
   示されるペプチド鎖においてそのＣ末端から数えて１−
   １６個のアミノ酸を有するペプチドもしくはアミ軸 ）酸残基を示しｓ　ＹｌｉＡｒｇ　Ａｒｇ　Ａｌａ　５
   ｅｒ（Ｃ） Ｇｉｎで示されるペプチド鎖においてその凶末端から数
   えて１〜５個のアミノ酸を有するペプチドもしくはアミ
   ノ酸残基を示す〕で表わされるポリペプチドまたはポリ
   ペプチド（１）とキャリヤー蛋白との蛋白複合体で免疫
   した哺乳動物の肺臓細胞と、（ｂ）同種または異種のリ
   ンパ球様細胞とからなるクローン化されたハイプリード
   ーマ。 Ｃ１，）　　哺乳動物がマウスである特許請求の範囲第
   １０項記載のハイブリドーマ。 ０の　リンパ球様細胞がミエローマである特許請求の範
   囲第１０項記載のハイブリドーマ。 σ３（ａ）式 ％式％ （ 〔式中、Ｘは結合手またはＩｌｅ　Ｇｉｎ　ＶａｌＭｅ
   ｔ　　Ａｌａ　　Ｇｌｕ　　Ｌｅｕ　　Ｓｅｒ　　Ｐｒ
   ｏ　Ａｌａ　　Ａｌａ（Ｃ） Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ａｒｇでポされるペ
   プチド鎖においてそのＣ末端から数えて１〜１６個のア
   ミノ酸を有するペプチドもしくはアミ■ ノ酸残基を示し、ＹはＡｒｇ　Ａｒｇ　Ａｌａ　５ｅｒ
   （Ｃ） Ｇｉｎで示されるペプチド鎖においでそのＮ末端から数
   えて１〜５個のアミノ酸を有するペプチドもしくはアミ
   ノ酸残基を示す〕で表わされるポリペプチドまたはポリ
   ペプチド（１）とキャリヤー蛋白との蛋白複合体で免疫
   した哺乳動物の肺臓細胞と、　（ｂ）同種または異種の
   りンパ球様細胞とを細胞融合し、クローニングすること
   を特徴とする該肺臓細胞と該リンパ球様細胞とからなる
   クローン化されたバイブ□ リドーマ、の製造法。 ０４式 ％式％ （） （ 〔式中、Ｘは結合手またはＩｌｅ　Ｇｌｎ　ＶａｌＭｅ
   ｔ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ａｌａ
   　ＡｌａＬｙｓ　Ｔｌ１ｒ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ａｒｇで
   示されるペプチド鎖においてそのＣ末端から数えて１〜
   １６個のアミノ酸を有するペプチドもしくはアミ製 ノ酸残基を示し、ＹはＡｒｇ　Ａｒｇ　Ａｌａ　５ｅｒ
   （Ｑ Ｇｌｎで示されるペプチド鎖においてぞのＮ末端から数
   えて１〜５個のアミノ酸を有するペプチドもしくはアミ
   ノ酸残基を示す〕で表わされるポリペプチドに対するモ
   ノクローナル抗体。 ０１Ｇ　　ヒトγ型インターフェロンと結合する特許請
   求の範囲第１４項記載のモノクローナル抗体０ ０．１　　オフタロニー法による検定によりＩ　ｇＧ２
   　ｂのザブクラスに属する特許請求の範囲第１４項記載
   のモノクローナル抗体。 ０η　オフタロニー法による検定によりＩｇＧ１のサブ
   クラスに属する特許請求の範囲第１４項記載のモノクロ
   −Ｊル抗体〇 〇榎　（ａ）式 ％式％ （１） 〔式中、Ｘは結合手またはＩｌｅ　Ｇｌｎ　ＶａｌＭｅ
   ｔ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ａｌａ
   　Ａｌａ（Ｃ） Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ａｒｇで示されるペ
   プチド鎖においてそのＣ末端から数えて１〜１６個のア
   ミノ酸を有するペプチドもしくはアミ的 ノ酸残基を示し、ＹはＡｒｇ　Ａｒｇ　Ａｌａ　５ｅｒ
   （Ｏ Ｇｉｎで示されるペプチド鎖においてそのＮ末端かう数
   えて１〜５個のアミノ酸を膏するペプチドもしくはアミ
   ノ酸残基を示す〕で表わされるポリペプチドまたはポリ
   ペプチド（１）とキャリヤー蛋白との蛋白複合体で免疫
   した踊乳動物の胛廐細胞と、（ｂ）同種または異種のリ
   ンハ球様細胞とからなるクローン化されたハイブリード
   マを液体培地中または哺乳動物の腹腔内で増殖し、モノ
   クローナル抗体を生成、蓄積せしめ、これを採取するこ
   とを特徴とするポリペプチド（１）に対するモノクロー
   ナル抗体の製造法。 ００　　哺乳動物がマウスである特許請求の範囲第１８
   項記載の製造法。 ■　租ヒトγ型インターフェロン含有物を式％式％ （ 〔式中、Ｘは結合手またはＩｌｅ　Ｇｌｎ　ＶａｌＭｅ
   ｔ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ａｌａ
   　Ａ、１ａ（Ｑ Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ａｒｇで示されるペ
   プチド鎖においてそのＣ末端から数えて１〜１６個のア
   ミノ酸を有するペプチドもしくはアミ（へ） ノ酸残基を示し、ＹはＡｒｇ　Ａｒｇ　Ａｌａ　５ｅｒ
   （Ｃ） Ｇｉｎで示されるペプチド鎖においてそのＮ末端から数
   えて１〜５個のアミノ酸を有するペプチドもしくはアミ
   ノ酸残基を示す〕で表わされるポリペプチドに対するモ
   ノクローナル抗体を用いて精製することを特徴とするヒ
   トγ型インターフェロンの精製法。 しυ　粗ヒトγ型インターフェロン含有物を・担体にカ
   ップリングしたモノクローナル抗体によるアフィニティ
   ーカラムクロマトグラフィー処理する特許請求の範囲第
   ２０項記載の精製法。 （ホ）抗体として式 ％式％ （） ） 〔式中、Ｘは結合手またはＩｌｅ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ鎖に
   おいてそのＣ末端から数えて１〜１６釧のアミノ酸を有
   するペプチドもしくはアミノ■ 酸残基を示し、ＹはＡｒｇ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　
   Ｇ（ｑ ｉｎで示されるペプチド鎖においてそのＮ末端から数え
   て１〜５個のアミノ酸を有するペプチドもしくはアミノ
   酸残基を示す〕で表わされるポリペプチドに対するモノ
   クローナル抗体を用いることを特徴とするラジオイムノ
   アッセイ法またはエンザイムイムノア゛ンセイ法による
   ヒトγ型インターフェロンの検出法。