JPS60180585A - キトサナ−ゼの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、カルボキシメチルセルロースに基質特異性を
有するキトサナーゼの製造法に関するもので、本発明の
製造法により得られるキトサナーゼは、バチルス属に属
するものとしては新規なもので、病態検査におりるリゾ
チーム及びβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの測定
基質であるＮ−アセチルキＩ−オリゴ糖の中間体である
ギトオリゴ糖を製造する上で極めて有用な酵素である。

従来、カルボキシメチルセルロースに基質特異性を有す
るキトサナーゼとしては、例えば、ミキソバクター（Ｍ
ｙｘｏｂａｃｔｅｒ）　Ａ　Ｌ　−１の生産するキトサ
ナーゼ〔アラン　ヘンジス（Ａｌｌａｎ　Ｈｅｄｇｅｓ
）及びアール、ニス、ウォルフ（Ｒ，Ｓ、　Ｗｏｌｆｅ
　）、ジャーナル　オブ　バクテリオロジー（Ｊｏｕｒ
ｎａｌｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　）　、１２０
巻、Ｎ１１２．８４４〜８５３頁（’１９７４））が知
られている。

そして、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する細菌
のキトサナーゼとしては、カルボキシメチルセルロース
に基質特異性を有しないキトサナーゼは知られているが
〔富永嘉男及び辻阪好夫、バイオヒミカ　エト　バイオ
フィジカ　アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉ
ｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ　）　、４１０巻、１４５
〜１５５頁（１９７５））、カルボキシメチルセルロー
スに基質特異性を有するキトサナーゼの存在は知られて
いないのが実情である。

そこで本発明者は、広く自然界よりカルボキシメチルセ
ルロースに基質特異性を有するキトサナーゼを生産し得
る微生物の検索を行った結果、土壌中より分離したバチ
ルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓ　）に
属する１菌株が、カルポキシメチルセルロースに基質特
異性を有するキトサナーゼを菌体外に効率良く生産する
こと等の知見を得た。

本発明は、上記知見に基づきなされたもので、バチルス
属に属しカルボキシメチルセルロースに基質性−異性を
有するキトサナーゼを生産しうる微生物を培地に培養し
、培養物より該キトサナーゼを採取することを特徴とす
るキトサナーゼの製造法を提供するものである。

以下、本発明のキトサナーゼの製造法を詳述する。

本発明のキトサナーゼの製造法に使用する菌としては、
バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属し、カルボキシメ
チルセルロースに基質特異性を有するキトサナーゼを生
産する微生物であれば如何なる菌でも良く、またこれら
の菌の変種若しくは変異株でも良い。

そして、その微生物の具体例としては、バチルス５ｐＩ
ＩｋＬ９９　５が挙げられる。

上記バチルス５ｐＮａ９９−５は、土壌中より新たに検
索して得た菌株で、その菌学的性質は、以下に示す通り
である。

バチルスＳ　隘９９−５の　“・　ｒ （ａ）形態顕微鏡的観察 （肉汁寒天培地で３０℃、１６時間培養）■細胞の形及
び大きさ： １、０〜１．４　μｍ　Ｘ　３．０〜５．２　Ａｌ　ｍ
の桿菌である。

■細胞の多形性の有無：連鎖状になり易い。

■運動性の有無： 周鞭毛を有し、運動性を有する。

■胞子の有無： 特別な胞子のう細胞を形成しない球形〜楕円形（０，９
２〜１．１７μｍＭ１．１７〜１．６７μｍ）の胞子が
細胞の中央に存在する。

■ダラム染色色：陽性 ■抗酸性：陰性 （ｂ）各培地における生育状態 ■肉汁寒天平板培養： ３０℃、２４時間の静置培養により不透明で厚く、直径
約２．５〜６．０　ｍｍの円形コロニー。

光沢はなく、色素は産生しない。

■肉汁寒天斜面培養： 生育は良好で、■肉汁寒天平板培養の記載に同じ。

■肉汁液体培養： 培地表面に菌膜を生じ、長時間経過すると菌膜は、沈澱
する。

■肉汁ゼラチン穿刺培養： 温度２４℃、２４時間の静置培養で僅かに生育し、ゼラ
チンは液化される。

■リドマスミルク： ３０℃、２日間で青変し、凝固せず、長期間では脱色す
る。

（Ｃ１生理的性質 ■硝酸塩の還元：還元する。

■脱窒反応： 陽性（生育するがガスの発生は認められない。）■ＭＲ
テスト：陽性 ■ｖｐテスト：陽性 ■インドールの生成：陰性 −■硫化水素の生成：陰性 ■デンプンの加水分解：陽性 ■クエン酸の利用： クリステンセン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ　）培地では
、利用し、コーザー（Ｋｏｓｅｒ　）培地では、未利用
。

■無機窒素の利用： アンモニアは利用するが、硝酸塩は未利用。

［相］色素の生成：陰性 ■ウレアーゼ：陽性 ＠オキシダーゼ：陰性 ０カタラーゼ：陽性 ■生育の範囲： 生育温度：１０〜４５℃、至適温度：２６〜３０℃、至
適ｐＨ：５〜８゜ ［相］酸素に対する態度：好気性 ＠ｔｏ−Ｆテスト：＃ｉ１酵性 ■糖類から酸及びガスの生成： 酸の生成　ガスの生成 （１）シーアラビノース　−− （２）Ｄ−キシロース　−− （３）０−グルコース　十　− （４）Ｄ−マンノース　十　−−− （５）　［１−フラクトース　十　− り６）Ｄ−ガラク１〜−ス　−− （７）麦芽糖　十　− （８）シヨ　糖　十　− （９）乳　糖　−− （１０）　ｌ−レバロース　＋　− （１１）ローソルビット　−− （Ｌ２）　Ｄ−マンニット　−　− （１３）イノジット　−− （１４）グリセリン　士　− （１５）デンプン　十　− （ｄ）その他の性質 ■サブロー培地、７％食塩肉汁培地及び嫌気的寒天培地
では、いずれも生育する。

■エラグヨーク反応、チロシン分解及びカゼイン分解は
、いずれも陽性。

■ビタミン要求性及びフェニルアラニンの脱アミノ反応
は、いずれも陰性。

上記バチルス５ＰＮ１９９　５の菌類学的諸性質を「パ
ージエイズ・マニュアル・デターミネイティブ・バクテ
リオロジー」第８版（１９７４年）の分類と対比すると
、菌の大きさ、ＶＰ反応：陽性、胞子の位置形状、糖か
らの酸の生成、食塩耐性及び嫌気的条件下における生育
等より、バチルスｓｐ！１ｋ１９９５は、バチルス・セ
レウスに分類される。

しかしながら、バチルス・セレウスの標準株には、本キ
トサナーゼの生産が認められず、この点で、上記菌株（
バチルス５ｐＮｎ９９−５）は、バチルス・セレウスと
相異するため、これを新菌株と認め、バチルス５ｐＮａ
９９−５と命名した。

尚、上記バチルス３９Ｎ［１９９５は、工業技術院微生
物工業技術研究所に微工研菌寄第７４５０号（ＦＥＲＭ
　Ｐ−７４５０）として寄託されている。

本発明に於いて、カルボキシメチルセルロースに基質特
異性を有するキトサナーゼの生産に使用される培地とし
ては、炭素源、窒素源、無機物等より選択されたものを
適量含有する培地であれば、合成若しくは天然培地等如
何なるものでも使用可能である。

上記炭素源及び窒素源としては、例えば、ペプトン、カ
ザミノ酸、大豆の酵素分解物、酵母エキス、肉エキス等
のものが挙げられる。

更に、無機物としては、例えば、ナトリウム、カリウム
、マンガン、マグネシウム、カルシウム、鉄等の塩類が
使用できる。

そして、本発明においては、上記した培地を用い、これ
にカルボキシメチルセルロースに基質特異性を有するキ
トサナーゼを生産し得る微生物を接種することにより、
該キトサナーゼを産生させることができるが、更に、上
記培地中に、例えば、キトサンを塩酸、硫酸等の無機酸
の希薄溶液若しくはクエン酸、酢酸等の有機酸溶液を用
いて溶液状に熔解した溶液、又は該溶液にキトサナーゼ
等の酵素或いは塩酸、硫酸等の酸類を更に添加し、キト
サンを部分的に加水分解したものを添加すれば、本キト
サナーゼの生産量を著しく増収することができる。

培養温度は、例えば、通當２５〜３３℃、好ましくは、
２７〜３０℃の温度範囲で、初発ｐｉ（は、通常６．０
〜７．５好ましくはｐＨ６，５程度である。

このような培養条件下に、例えば１５〜４８時間、好ま
しくは２０〜２４時間通気攪拌培養等をすることにより
培養物中に本キトサナーゼが生成蓄積する。

次いで、本キトサナーゼは、菌体外酵素である−ので、
上記のようにして得られた培養物から、例えば、通常の
遠心分離、濾過処理等の除菌手段により菌体を除去すれ
ば、本キトサナーゼを含有する粗酵素液を得ることがで
きる。

また更に、上記粗酵素液より、本キトサナーゼを分離、
精製するには、例えば、ＳＥ−セファデックスによるカ
ラムクロマトグラフィー、硫安による分画沈澱或いはセ
ファデックスによるゲル濾過等、酵素の通雷の分離、精
製手段によれば良く、その結果、純化された本酵素を得
ることができる。

以上の如くして得られる本酵素（キトサナーゼ）の理化
学的性質を示すと、以下の通りである。

（１）作用及び基質特異性 キトサン、カルボキシメチルセルロース及びグリコール
キトサン等に作用し、それら基質のβ−１、４結合を加
水分解する。そして、本酵素をキトサンに作用させた場
合、分解初期には、４．５量体が生成され、最終的には
、２，３Ｍ体が生成されると同時に極めて僅かにグルコ
サミンも生成される。

しかしながら、アヒセル、グリコールキチン及びキシラ
ン等のβ−１，４結合には作用しない。

（２）至適ｐＨ及び安定ｐＨ 第１図に示すとおり、０．１Ｍ酢酸緩衝／＆（０，２Ｍ
食塩含有）中での至適ｐＨは、キトサンでは５．０であ
った。

また安定ｐＨの範囲は、第２図に示すとおり・５〜１０
である。尚、この範囲は、各ｐＨの緩衝液（ｐＨ１，５
〜３．０では０．１　Ｍグリシン−塩酸緩衝液、ｐＨ３
，５〜５．５では０．２　Ｍ酢酸−水酸化ナトリウム緩
ｉ★ｉ液、ｐＨ６，０〜８．５では０．１　Ｍクエン酸
−０，２Ｍリン酸水素ナトリウム緩衝液、２及びｐＨ９
，０〜１２．０では０．１Ｍグリシン−水酸化ナトリウ
ム緩ｉｈ液を使用した。）中において温度５０℃で１０
分間加熱処理した後の残存酵素活性を測定してめたもの
である。

（３）力価の測定法 ０．２Ｍ食塩を含有する酢酸緩衝液（ｐＨ５，０）に熔
解した０、　２％のキトサン溶液２０ｍ１に、適量の酵
素含有液０．２ｍｌを添加し、温度３０℃で酵素反応を
行って、経時的に酵素反応液の粘度の低下を測定し、そ
の比粘度の逆数が時間当たり示す増加割合が酵素単位で
ある。〔アクタ　ケミ力　スカンジナヒカ（Ａｃｔａ　
Ｃｈｅｍｉｃａ　５ｃａｎｄｉｎａｖｉｃａ　）　、第
３巻、１４０５頁（１９４９））。

（４）作用適温の範囲 第３図に示すとおり、作用適温の範囲は、２０〜８０℃
であり、これは、各温度のキトサン溶液に、本酵素を添
加し１０分間作用させた際の酵素活性を測定してめたも
のである。

＋６１１１＋、温度などによる失活の条件第４図に示す
とおり、０．２Ｍの酢酸緩ｉ胴液（ｐ１１５．０）中に
おい”ζ１０分間の熱処理では、温度５５℃より失活し
始め、温度６０　”Ｃ迄は徐々に失活し７、それ以上で
は急速に失活し、温度７５℃ではほとんど失活する。

温度５０°Ｃで１０分間の加熱処理では、ｐｌ＋５．５
〜１０の範囲で安定であり、それより酸性側では徐々に
失活し、一方、アルカリ性側では急速に失活する。

（６）阻害、活性化及び安定化 種々の金属イオン及び阻害剤の含有溶液（２，０Ｍ含有
）（酢酸ｋｍ　ｆｊｊ液、ｐＨ５，０）中温度４０　’
Ｃで３０分間保持した後の残存活性を第１表に示す。

第　１　表 上表より明らかな如く、Ｆｅ＋＋及びＰｂ＋＋により強
力に阻害され、Ｎｉ＋＋、Ｚｎ＋＋、Ｃｕ”、ｃｄ＋４
、ｃｏ＋＋、Ｃａ　”、Ｈｇ＋＋、ＰＣＭＢ及びＮ−エ
チルマレイミド等では、微弱〜微少に阻害さ　れノこ。

（７）精製方法 本酵素の分離、精製は、常法により行うことができ、例
えば、ＳＰ−セファデックス、硫安による分画沈澱、セ
ファデックスＧ−ｉｏｏによるゲル濾過等の精製手段を
単独若しくは適宜組み合わせて用いることができる。

（８）分子量 ０、０５　Ｍ燐酸カリウム緩ｉＩｉ液（０，１Ｍ食塩含
を）を使用してセファデックスＧ−１００のカラムによ
るゲル濾過法により測定した結果、約３０，０００〜３
１．０００であった。

（９）ポリアクリルアミドゲル電気泳動第５図に示すと
おり、ポアサイズ７．５％のアクリルアミドゲル（ｐＨ
４，０）を用いて常法によりアクリルアミドディスク電
気泳動を行った結果、単一なバンドであることが確認さ
れた。

θ０）等電点 アクリルアミド′ゲル焦点電気泳動法により等電点を測
定した結果は、９，６であった。

以上の如く本発明によれば、従来、バチルス属の細菌と
しては、生産することが未公知で、且つカルボキシメチ
ルセルロースに基質特異性を有するキトサナーゼを菌体
外に効率良く生産せしめ、容易に採取することができる
ので産業上極めて有意義である。

そしてまた、本酵素（キトサナーゼ）は、病態検査にお
けるリゾチーム及びβ−Ｎ−アセチルグル１号ミニダー
ゼの測定基質であるＮ−アセチルキトオリゴ糖の中間体
であるキトオリゴ糖を製造する上で極めて有用なもので
ある。

尚、該キトオリゴ糖を常法によりアセチル化することに
より容易にＮ−アセチルキトオリゴ糖に誘導することが
できる。

以下、本発明を、実施例及び本発明で製造されたキトサ
ナーゼの使用例を挙げて説明する。

実施例１ キトサン０．２％、ポリペプトン１％、Ｋ２ＨＰＯ４０
，２％、ＮａＣ１Ｏ，２５％、ＭｇＳＯ４・、７Ｈｚ、
ＯＯ，０２％、Ｆｅ５０４０、０００５％及びＣ’ａ　
Ｃ１２・２　Ｈ２００，０００５％を含有させて構成し
た液体培地（ｐＨ６，５）２０００ｍｌを常法により滅
菌したものに、バチルスｓｐ　Ｎｏ、９９−５　（ＦＥ
ＲＭ　Ｐ−７４５０）を接種した後、温度３０°Ｃで２
０時間通気攪拌培養し、培養物を得た。

次いで、培養物を、常法により遠心分離処理し、除菌し
てカルボキシメチルセルロースに基質特異性を有するを
キトサナーゼ含有上澄液１７００ｍ１を得た。

尚、上澄液中の本キトサナーゼ活性は、１．８０単位で
あった。

実施例２ 実施例１と全く同様にして得た上澄液２０００ｍ１に、
蒸溜水２０００ｍ１を添加し、上澄液を倍量に希釈した
後、２Ｎ塩酸を用いて希釈液のｐＨを７゜４に稠整した
。

次いで、希釈液を、０．０１Ｍ燐酸カリウム緩衝液（ａ
ｌｌ　７．４　）で平衡化したＳＥ−セファデックス（
Ｓｅｐｈａｄｅｘ）　Ｃ−５０を充填したカラム（直径
４゜０ｃｍＸ長さ２５ｃｍ）に通じて本キトサナーゼを
吸着させた後、０．０８５Ｍの食塩を添加した０、０１
Ｍ燐酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，４＞　５００ｍｌを上
記カラムに通じて洗浄し、更に、０．２Ｍ食塩を含有す
る０、０１Ｍ燐酸カリウム緩衝液（（ｐＨ７，４）　５
００ｍ１を上記カラムに通じ、吸着されている本キトサ
ナーゼを溶出して本キトサナーゼ含有液を得た。該含有
液中の本キトサナーゼ活性は２８０μｍにおける吸光度
１．０当たり９３単位であった。

次いで、上記の本キトサナーゼ含有液を常法によりグイ
アフロ０Ｍ−０５膜（アミコン社製）を用いて濃縮した
後、これを、０．０５Ｍ燐酸カリウム緩衝液（０，１Ｍ
食塩含有）で平衡化したセファデックスＧ−１００を充
填したカラム（直径３．５ＣｍＸ長さ１００ｃｍ）に通
じて本キトサナーゼを吸着させた。

次いで、０．０５Ｍ燐酸カリウム緩衝液を通じて、吸着
されているキトサナーゼを溶出し、本キトサナーゼ活性
部を収集したところ、本キトサナーゼ活性は、２８０μ
ｍ吸光度当たり１３６単位であった。

尚、培養液からのキトサナーゼの回収率は、３５％であ
った。

このようにして得た本キトサナーゼをｐＨ４，０のアク
リルアミドディスク電気泳動にかけたところ、混在蛋白
質によるバンドは、全く観察されず、単一バンドのみが
観察され、純化された本キトサナーゼであることが確認
された。

使用例 温度５０℃の温水４Ｉ２、キトサン粉末２０ｇ及び４Ｎ
塩酸１０ｍ１を、攪拌機（新東科学■製）中で４時間攪
拌混合してすべてのキトサンを溶解させ、キトサン溶液
を得た。このキトサン溶液に、氷酢酸６ｇ及び食塩１０
ｇを添加溶解し、そのｐＨを３０％水酸化ナトリウム水
溶液を用いて５．０に調整した後、これに、前記実施例
２で得られた本キトサナーゼ溶液（２，６３単位／ｍｌ
）　５ｍｌを混和し、温度４０℃で３０分間反応させて
反応液を得た。

次いで、上記反応液を、薄膜式濃縮機（東京理化器械側
製）により反応液量がＩＩ２となる迄濃縮した後、これ
を、温度３０℃に保持しつつ更に前記実施例２で得られ
た本キトサナーゼ溶液３０ｍ１と混和して８時間反応さ
せ、キトサン酵素分解物（該分解物中のキトオリゴ糖７
．７ｇ）を得た。

尚、該キトサン酵素分解物中のキトオリゴ糖を分離し分
析することは困難であるため、上記のキトオリゴ糖の生
成量７．７ｇは、該キトサン酵素分解物中のキトオリゴ
糖を、下記の方法でアセチル化し、得られたＮ−アセチ
ルキトオリゴ糖の生成量を逆算して算出した値である。

（キトオリゴ糖のアセチル化） 上記のキトサン酵素分解物のｐｎを３０％水酸化ナトリ
ウム水溶液を使用して７．０に調整した後、これに、炭
酸水素ナトリウム１０ｇを混和し、温度２℃に氷冷し、
更に、無水酢酸１０ｍ１を５回に分割して３０分間で添
加し、温度２℃で１時間反応を行ってから、この反応液
を温度３０　”ｃで１゜分間放置し、３０％水酸化ナト
リウム水溶液を用い°ζ該反応液の１１１を７．０に調
整した。

次いで、上記反応液を温度９５℃で３分間保持した後、
直ちに濾過し、濾液と沈澱物とに分別し、更に分別した
沈澱物を熱水を用いて洗浄して洗浄液を得、該洗浄液及
び上記濾液を合わせて合計１．４βの溶液を得た。この
ようにして得た溶液中には、９．６８のＮ−アセチルキ
トオリゴ糖が含有されていた。

また、上記溶液中のＮ−アセチルキトオリゴ糖を高速液
体クロマトグラフィー（９鴫島津製作所製）により分別
分析した結果、単量体、２量体、３量体、４量体及び５
量体の重量比は、夫々１：１０：２１：３Ｆ）：２９で
あった。

【図面の簡単な説明】

第１図は本酵素の至適ｐｌ＋、第２図は安定ｐＨ範囲、
第３図は作用適温の範囲、第４図は温度にょる失活の条
件、第５図はアクリルアミドディスク電気泳動を夫々示
す図である。 ＬＪ 譬Ｓ図 ＋二＝］］−

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）バチルス属に属し、カルボキシメチルセルロース
   に基質特異性を有するキトサナーゼを生産し得る微生物
   を培地に培養し、培養物より該キトサナーゼを採取する
   ことを特徴とするキトサナーゼの製造法。