JPS60238764A - 癌凝固促進物質に対する抗体及びその使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は、生物学的試料、例えばヒト及び動物の血清
、血漿、組織抽出物及び組織学的断片中の蛋白質分解性
凝固促進酵素の非常に高感度で且つ特異的なイムノアッ
セイに関する。この酵素の存在は悪性疾患の示標であり
、この発明のイムノアッセイは癌の診断試験として使用
される。

数年の間、研究者は、癌の診断的目安として使用するた
めの、腫瘍細胞に特異的な物質を同定することを追求し
てきた。１９７０年に、Ｂｕｂｅｎｅｋ等は、Ｉｎｔ、
　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ　５　：　３１０（１９７０）に
おける報告で、癌患者からの血清が腫瘍細胞表面抗原に
結合する抗体を含有することを明らかにした。次いで、
多くの抗原がヒト黒色腫表面及び他の新生物細胞上に見
出されることが報告された。

これらの抗原の幾つかは正常胎児組織、例えばヒト結腸
癌及び胎児臓器上皮に共通な抗原であると同定された。

胎児組織は「未分化細胞」から成り、そして新生物細胞
は「脱分化細胞」であるから、腫瘍抗原又は腫瘍胎児抗
原についての容認される作用仮説は次の通シである。あ
る種の蛋白質が、未分化状態において細胞により発現さ
れ、そしてこれらの蛋白質の発現は、未分化細胞が正常
細胞に分化する場合に抑制される。これらの正常細胞が
悪性化の過程で脱分化すれば、遺伝情報が抑制解除され
、そしてこれらの腫瘍抗原が再び発現される。他の学説
は、正常成人組織中の部分的に分化した「幹」細胞が発
癌剤によりその部分的に分化した状態に維持され、そし
てこれらの部分的に分化した細胞は制御されない状態で
増加することができる。いずれの場合には、悪性化によ
シ、未分化細胞圧関連する蛋白質抗原の遺伝的発現が生
ずることが認識される。

過去２０年の間に多くの腫瘍抗原が同定され、そして特
徴付けられた。これらの内、最も注目すべきものは癌胎
児性抗原（ＣＥＡ　）、α−フェトプロティン（ＡＦＰ
）、及びリンパ芽球性白血病関連抗原（ｃＡＬＬＡ　）
である。癌胎児性抗原（（ＪＡ）は最初Ｇｏｌｄ及びＦ
ｒｉｅｄｍａｎ　（Ｊ、　ＥＸＩＴ、　Ｍｅｄ。

１２１：　４３９（１９６５）：］によシ記載された。

彼らはこれを結腸癌及び胎児胃腸管組織中に検出した。

（ＪＡは高分子（１８０〜２００ｋｄ）蛋白質でちゃ、
そして４５〜５７チの炭水化物と３０〜４６係の蛋白質
とから成る。ＣＥＡ、又はＣＥＡ様物質は、正常な結腸
等積々のムチン産生正常上皮組織によシ産生される。さ
らに、種々の非悪性疾患、例えば消化性潰瘍（１０１、
肺臓炎（２７１、炎症性腸疾患（１５〜４０　％　）、
肝疾患、例えば肝炎、黄痕、胆道疾患及び硬変（２０〜
８０チ）が（ＪＡの血漿レベルの上昇と関連する。さら
に、（ＪＡレベルは種々のタイプの悪性疾患、例えば胃
腸管（３０チ）、胃癌（７２係）、膵臓癌（８８係）、
乳房癌（２４％）、肺及び呼吸器腫瘍（３０％）及び婦
人科腫瘍（ＩＯＬ）の予知として広く研究された［：　
Ｊ、Ｄ、　Ｂｅａｔｔｙ等、　Ｐｒｏｇ。

Ｃｌ１ｎ、　Ｃａｎｃｅｒ　８　：　９　（１９８２）
　］。しかしながら、転移疾患及び第４期癌を有する患
者は、転移疾患又は早期悪性疾患を有しない患者に比べ
て高いレベルを有するようであるが、腫瘍のタイプ及び
大きさと血漿ＣＥＡレベルとの間の密接な相互関係はな
いようである。ＣＥＡレベルは乳房癌及び直腸癌の追跡
研究において有用であった。腫瘍がＣＦＡ−陽性であれ
ば、ＣＥＡレベルの監視が疾患の治療の効果についての
重要な情報をもたらすことが見出された。

α−フェトプロティンは、血清アルブミンのアミノ酸組
成と類似するアミノ酸組成を有する約７０　ｋｄの蛋白
質であり（１１，１２）、そして胎児肝により産生され
、そして羊水及び母体血清中に検出される。α−フェト
プロティンは肝細胞癌中にも存在することが見出された
。ＡＦＰは、肝癌を有する患者の約８０４、奇形癌を有
する患者のｔ′！！とんど全部、胃癌を有する患者の１
５係、結腸直腸癌を有する患者の３係、肝癌を有する患
者の２４係、及び胆道癌を有する患者の２５係の血清に
おいて上昇する［　Ｒｕｄｄｏｎ、　Ｓｅｍ１ｎ、　０
ｎｃｏｌ。

９：４１６（１９８２）、及びＭｃＩｎｔｉｒｅ等。

Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｇ、　３５　：　９９１　（１９７
５）　］。ＡＦＰは肝臓に対する種々の損傷の結果とし
て、そして悪性疾患において上昇する。癌、及び上昇し
たＡＦＰレベルを有するように見える少数の非癌性疾患
についてＡＦＰは目ふけ上高い予知のための価値を有す
るにもかかわらず、腫瘍の目安としてのＡＦＰの全体的
価値は低い。

最近、急性リン・ぐ芽球性白血病患者の特定における有
効性を決定するために急性リンパ芽球性白血病抗原が研
究された（　Ｒ１ｔｚ等ｅ　Ｎａｔｕｒｅ。

２８３：５８３（１９８０））。初期の研究はｅＡＬＬ
Ａが急性白血病細胞に特異的であることを示唆したが、
最近になって、その抗原が、正常腎上皮及び黒色腫を含
む正常細胞上に見出された。白血病の診断マーカーとし
てのその効率もまた確実に確立されてはいない。

腫瘍マーカーとしての可能性が研究されている腫瘍関連
抗原がそのほかに多数存在する。次のヒトの癌に対する
腫瘍マーカーが）（＠ｌｌｓｔｒｏｍ等。

Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　Ｓｅｍ１ｎ　Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈ
ｏｌ　５　：　１２７（１９８２）により総説されてい
る：黒色腫、神経芽細胞腫、神経膠原、結腸直腸癌、胃
癌、乳房癌、腕癌、膵臓癌、卵巣癌、ウイルム（Ｗｉｌ
ｍ）腫瘍、腎細胞病、膀胱の移行細胞癌、骨肉腫、子宮
頚部癌、及びリンノｅ腫。これらの腫瘍の抗原はほとん
ど特徴付けられておらず、そして臨床癌を診断するため
のそれらの可能性について注意深い研究はなされていな
い。これらのいずれについても、腫瘍マーカー、又は癌
の診断的指示薬としての価値が証明されていない。

癌凝固促進物質は最初、悪性疾患に関連する異常血液凝
固を開始する物質を追求するための本発明者の研究中に
同定された。この蛋白質は均一に精製されそして特徴付
けられた。凝固連鎖中でファクターｘｌ直接活性化する
ことにより凝固を開始せしめるのはジスティングロチア
ーゼである。

癌凝固促進物質は炭水化物を有しないようであり〔１モ
ルのシアル酸（５ｔａｔｉｃ　ａｃｉｄ　）又はヘキソ
ース１モル癌凝固促進物質〕、マウス、ラビット及びヒ
）を含むすべての種からの該物質は６８．０００分子量
を有する。癌凝固促進物質は１．５Ｍアガロースダル涙
適過カラムらディトぜリウムにおいて溶出し、この蛋白
質はこのタイプのｒルｐ過操作中に、非常に高分子量（
１，５Ｘ１０’ドルトン）の複合体に凝集することが示
される。

このものけ６８　ｋｄの分子量、及び４．８の等電点を
有する単一ポリベゾチドである。このものは水銀及びヨ
ウド酢酸によ勺阻害され、この性質はジスティングロチ
アーゼに特異的である。種々のタイプの腫瘍における癌
凝固促進活性の分布を決定するため、種々のヒト肺癌抽
出物、それらの正常組織の対応物、及び形質転換細胞の
種々の血清不含培養媒体、及びこれらの正常細胞の対応
物の媒体を試験した。癌凝固促進活性は悪性細胞の抽出
物、及び形質転換された細胞からの組織培養培地中に存
在するが、正常細胞抽出物、及び正常細胞を培養した血
清不含培地及び培養物中には存在しないことが見出され
た。

癌凝固促進物質抗原に対する抗体を開発するのがこの発
明の目的である。

この発明の第２の目的は、生物学的試料、例えば血清、
血漿、組織抽出物、尿、及び組織学的断片中の癌凝固促
進物質抗原についてのイムノアッセイを行うための該抗
原に対する抗体の使用に関する。

この発明の最後の目的は、生物学的試料中のこの抗原の
レベルを高い感度、特異性及び信頼性をもって定量する
ために、癌凝固促進物質抗原についての抗体及びイムノ
アッセイを開発することである。

精製癌凝固促進抗原は、ラビッ）Ｖ２癌、ヒト羊膜−絨
毛膜組織又は他の細胞から分離した。簡単に記載すれば
、組織、例えば外科的に取り出したラビットｖ２癌を、
ペロナール緩衝液で３回抽出し、抽出物を一緒にし、そ
して１０倍に濃縮し、そして癌凝固促進物質抗原の分離
源として使用した。最初の精製技法に続き４段階のクロ
マトグラフ操作全行う。この操作には、ベンズアミジン
−セファロースアフィニティークロマトグラフィー、１
．５Ｍアガロースゲル濾過カラムクロマトグラフィー、
第２のベンズアミジン−セファロースアフィニティーカ
ラムクロマトグラフィー、フェニル−セファロース疎水
性アフィニティークロマトグラフィーカラム段階が含ま
れる。この方法により精製された蛋白質は癌凝固促進物
質のすべての適切な酵素的性質及び化学的性質を有し、
そして後の例に記載する標準法によりヤギを免疫するた
めの抗原として使用される。部分精製されたヤギ抗体標
品ヲシアノグンブロミドで活性化したセファロースに結
合せしめ、そして１．５Ｘ２０ｃｒｎのイムノアフィニ
ティークロマトグラフィーカラムを調製する。

第２の精製技法において、抽出サンプルヲ２０ｍＭヘロ
ナール緩衝液中でイムノアフィニティー樹脂に適用し、
カラムを回転する車輪上におき、そして−夜回転を続け
てサンプルと樹脂を十分に混合する。次の朝、カラムを
固定し、そしてカラムｆ　２０　ｍＭベロナール緩衝液
で、すべての未結合蛋白質がカラムから除去される壕で
洗浄する（２８０ｎｍにおける吸光が緩衝液のそれと同
じになるまで）。このために２５０〜３５０ｒｒＬｌの
緩衝液が必要である。とのカラムｋ　、２０　ｍＭペロ
ナール緩衝液中に溶解した５係デオキシコレ−）１００
ｄＫより洗浄する〔デオキシコレ−トケアセトン：水（
３：１）から再結晶化する必要がある〕。次に３〜４カ
ラム容量の２０ｍＭペロナール緩衝液で洗浄する。これ
によシすべての吸着蛋白質がカラムから取り出される。

カラム１１００ｍ／の３　Ｍ　Ｎａ５ＣＨで溶出し、次
に５０〜１００ｍ１のペロナール緩衝液で溶出する。

溶出液を、２０ｍＭビス−トリス−ゾロ・ｆ７緩１ｉ（
ｐＨ６，５）に対して直接、５℃にて一夜透析する。

透析された溶出液をアミコンＰＭＩＯ限外濾過膜上で濃
縮し、そして後に記載する方法によシ活性を測定する。

３部４試行ごとにカラム’ｒ５ＭＮａＳＣＨにより洗浄
し、そしてペロナール緩衝液によシ再平衡化する。この
イムノアフィニティ一方法により大部分の汚染蛋白質が
癌凝固促進物質必ら除去される。

ｐ−クロロマーキュリ−ベンゾニー）　（ＰＣＭＢ　）
オルガノマーキュリ−アガロースカラム（Ａｆｆｉ−ｇ
ｅ１５０１）をビオ−ラドから購入する。ビオ−ラド技
術情報に従ってカラムを調製する。カラムをビス−トリ
ス−プロパン緩衝液（ｐ’（６，５）中で平衡化する。

サンプルをカラムに適用し、セしてカラムｆｔ２０　ｍ
Ｍビス−トリス−プロパン緩衝液でゆりくシ洗浄する。

２８０　ｎｍにおける吸収がビス−トリス−ゾロパン緩
衝液のそれと同じになったとき、カラム’！ｉ−１−５
Ｏの１Ｍ尿素、及び水中１憾トウイーンで洗浄し、そし
て次に２０　ｍＭビスートリスーグロパン緩衝液で十分
に洗浄し、カラムからすべての残留トウィーンー尿素を
完全に除去する。カラムｋ　ＨｇＣｌ２又はグルタチオ
ンで溶出し、そして各溶出物ｋ　２０　ｍＭビスートリ
スーグロパン緩衝液中で直接、４℃にて一夜、緩衝液を
数回取り換えながら透析する。サンプルをＰＭＩ　Ｏ限
外濾過膜上で濃縮し、そして上記のようにして活性を点
検する。ヤギイムノアフィニティーカラム及びＰＣＭＢ
アフィニティーカラムふらの精製サンプル１ｓＤｓ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動により評価し、そして各
サンプルの蛋白質含量をロウ！Ｊ　−（Ｌｏｗｒｙ　）
蛋白質測定法によシ測定する。サンプル中の活性はサン
ダルに１　ｍＭ　ＨｇＣ４２ｆ加えることによシ保存す
る。ＨｇＣｌ２は後の使用のために活性を阻害しそして
保存するであろう。

次に、例によシこの発明をさらに具体的に説明する。但
しこれによりこの発明の範囲を限定するものではない。

例１〜５には癌凝固促進物質の精製について記載する。

例１．材料 ジインプロピルフルオロホスフェート（ＤＦＰ）の０．
５Ｍストック溶液を乾燥イノゾロビルアルコール中に調
製し、そしてＤＦＰ処理のためサンプル中に１：１００
に稀釈した。ラビッ）Ｖ２癌のクロロホルム−メタノー
ル（３：１）抽出（Ｃａｎａｄｉａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ
　ｏｆ　ＢｉｏｃｈｅｍｉｅａｌＰｈｙｓ１ｏ１ｏｇｙ
３７：９１１．１９５７参照のこと）により粗燐脂質を
得た。ラビット脳スロンぎグラスチン、及びルッセ、Ｉ
Ｉ／　（Ｒｕｓ＋５ｅｌｌ　）のマムシ毒ヲ凝固系にお
ける標準として、及び酵素的性質を癌凝固促進物質と比
較するための代表的凝固促進物質として使用した。粗う
ビット脳ケフプリン、ペロナール緩衝液、並びにファク
ター■及びＸ全欠くウシ血漿は市販のものを入手した。

最初の血液を針を通して廃棄し、そして１６００Ｘｇに
て５分間ずつ２回遠心分離することにより血球全除去し
、４部の新鮮なウシ血漿に３．８％クエン酸ナトリウム
中に１つに集めた。

ベンズアミジン−セファロースアフィニティー樹脂は、
ε−アミツカグロン酸をシアノｒンブロミドで活性化し
たセレアロースに結合せしめ、そして１００叩のｐ−ア
ミノベンズアミジンに２ｇのヘキサノイルセファロース
に、可溶性カルデジイミドと共に、２４時間ｐＨ４，７
５に保持しながら結合せしめることにより調製した。樹
Ｐを蒸留水により十分洗浄した後、１×１１ｃｒｎのカ
ラムに充填し、そして５０　ｍＭ　ＮａＣ６及び１　ｍ
ＭＥＤＴＡ　ｆ含有する１０ｍＭペロナール緩衝液（ｐ
Ｈ７，８）で平衡化した。このカラムの流速は０．５　
ｍ７！／分でありた。

ダル濾過カラム（１，５Ｘ１００ｃｒｎ）ｔｌ、５部ア
分ロースで充填し、そしてｏ、５ｍｙ／ｍｌの粗燐脂質
を含有するＰ）（７，８の１０ｍＭペロナール緩衝液で
平衡化し、そして過剰の燐脂質を含有しないように１０
ｍＭペロナール緩衝液（ｐＨ７，８）で洗浄した。

このカラムの流速は約ＩＴｎｌＺ分であった。

フェニル−セファロース疎水性クロマトグラフィーカラ
ム（１×５ｃｒｎ）は、ｏ、ｓｍｙ／ｍｌの粗燐脂質を
含有する１０ｍＭペロナール緩衝液（ｐＨ７，８）中で
平衡化し、過剰の燐脂質をペロナール緩衝液で洗浄除去
し、そして最後にｌＱｍＭベロナール緩衝液（ｐＨ７，
８）により平衡化した。カラムは０．２ｄ／分の流速で
使用した。

ｐ−クロロマーキュリアルベンゾエート−アガロースア
フィニティー樹脂は、樹脂ｋ、２５　ｍＭ２〔Ｎ−モル
ホリン〕−エタンスルホンａ緩ａｙ（ｐＨ６，８）中で
平衡化することにより調製した。

平衡化した樹脂を、１×１０ｃｒｎのカラムに充填した
。流速は約ｘ、０ｒＲ１／分であった。

すべてのカラムクロマトグラフィーの溶出は２８０　ｎ
ｍの吸光によシ監視し、そして精製の各段階からの一緒
にした画分サンプルのアリコートの蛋白質含量は常法に
より測定した。

例３．癌凝固促進物質の分離源 若いニューシーラントホワイトラビット（２に９）の腿
筋肉にｖ２癌細胞を注射し、そして動物体重及び腫瘍の
大きさを、動物の体重が減少を始め、そして腫瘍が大き
くなるまで、１週間に２回ずつ監視した。動物の死に先
立って腫瘍を外科的に摘出した。腫瘍の大きさは５０〜
１００１９の範囲であった。この腫瘍ヲ０．５〜１ｍの
厚さに切って表面積を広くシ、そして２０ｍＭペロナー
ル緩衝液（ｐＨ７，８）中に３時間ずつ、緩衝液を取り
替えながら入れた。凝固促進活性のファクター■依存性
を測定するためにファクター■除去ウシ血漿を使用し、
この場合、ポジティブ対照及びネガティブ対照としてそ
れぞれルッセル（Ｒｕ５ｓｅｌｌ　）のマムシ毒及びラ
ビット脳スロンデグラスチンを使用した。ファクター■
除去ウシ血漿中でのＤＦＰ感受性及び活性は、酸素の特
性を同定する際及び正常組織スロンゲプラスチンから癌
凝固促進物質を区別するために、精製操作を通して使用
される２つの基準とした。

癌凝固促進物質による純粋なウシ−ファクターＸの方向
活性化（ｄｉｒｅｃｔｉｏｎ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　
）　ｆ決定するために２段階凝固アッセイを用いた。第
１段階は０．５ｍの５０　ｍＭ　Ｔｒｉｍ　−ＨＣＬ緩
衝液（ｐＨ７，８）中に０．６４μＩの精製ウシファク
ターＸｔ含有せしめた。この緩衝液は１０　ｒｒＭｉ　
ＣａＣｌ２及び０、１５　Ｍ　ＮａＣＬ、２０　Ｉｌｌ
の塩水中１０μｇの粗うビット脳ケファリン、及び５〜
１０ｎｇの精製癌凝固促進物質を含有し、癌凝固促進物
質とファクターＸの比率を１＝６０〜１：１２８とした
。精製したサンプルの１部分を５　ｍＭ　ＤＦＰ　Ｋ調
整し、２５℃にて３０分間インキュベートシ、そしてア
ッセイの第１段階に加えた。部分精製ルッセルのマムシ
毒標準を塩水によ５１：１００，０００に稀釈し、そし
てファクターＸと比率１：３２０，０００において使用
した。第１段階の反応混合物のアリコート（１００ｍＪ
）ｉｏ時間を含む種々の時間間隔で採取し、そして第２
段階において、ファクター■及びファクターＸが除去さ
れたウシ血漿１００μｌ及び１００μｌの２０　Ｔｎｈ
ｌ　ＣＩＬＣＺ２と混合することによりファクターＸａ
について測定した。ファクターＸサンプル中でファクタ
ーＸａが検出されれば、これらｋ　２５　ｍＭ　ＤＦＰ
　で処理してファクターＸａを不活性化し、そして次に
透析して、使用前に残留ＤＦＰを除去した。

癌凝固促進物質によるファクターＸの直接的蛋白分解質
活性化を可視的に示すために、１０ｍＭＣａ　Ｃｔ２及
び０．１５　Ｍ　ＮａＣ６ｆ含有する５０ｍＭＴｒｉｓ
−ＨＣＬ緩衝液（ｐ）１７．８）１５μを中１９μｇの
精製ウシファクターＸ１及び５μノの塩溶液中２．５μ
Ｉの粗うビット脳ケフプリンｉ０．３８μｇの癌凝固促
進物質と共にインキヤペートした。対照実験において、
同じ反応条件中で１３．６μｇのファクターＸ’ｅ９０
ｐｇのルッセルのマムシ毒とインキュベートシた。３０
秒１．５時間目、及び１５時間目にアリコート（１０μ
Ａｈ採り、そして２μｌの０、０５　Ｍ　ＦＪＤＴＡを
加え、そしてβ−メルカプトエタノール不含サンプル溶
液１／４容積に加え、１２．５チドデシル硫酸ナトリウ
ムーポリアクリルアミドダル電気泳動分析に付した。

例４８分離操作 段階１： 濃縮した粗腫瘍抽出物を、ベンズアミジンアフィニティ
ークロマトグラフィーカラムに適用し、そして非結合蛋
白質を、５０　ｍＭ　ＮａＣＡ及び１ｍＭ１１ｍＤＴＡ
を含有する１９ｍＭペロナール緩衝液（ｐＨ７，９）ｅ
用いて、カラムから洗浄除去した。結合した蛋白質は１
．０Ｍプロピオン醗により溶出した。

酸溶出画分を、４　Ｎ　ＮａＯＨにより直接ｐＨ７，５
とし、あるいはこれらを同容量の０．５Ｍペロナール緩
衝液（ＦｋＸ８．０）中に集めてプロピオン酸を部分的
に中和し、そして次にＮａＯＨによりｐＨ７，５とした
。

すべてのＤＦＰ感受性、ファクター■非依存性凝固活性
を酸溶出液中に回収した。凝固促進物質含有画分を一緒
にし、限外濾過膜（ＰＭ−１０）上で約２０倍に濃縮し
、そして１０ｍＭペロナール緩衝液（ＰＩ−１７，８）
に対して透析してゾロピオン酸ナトリウム全除去した。

凝固促進活性の回収量は１００係より犬であったが、こ
れはおそらく、腫瘍抽出物生え存在するプロテアーゼ阻
害物質が除去されたためであろう。

段階２： アフィ巨ティーカラムからの、蛋白質濃度６〜１０■／
ｄを有する濃縮及び透析をされた酸溶出ピークｔ　１．
５　Ｍアガロースゲル濾過カラムに適用した。カラムを
１０ｍＭペロナール緩衝液（ｐＨ７，８）で溶出した。

高分子量を有する４個の主要なピークが現われ、このピ
ークはＤＦＰ感受性凝固促進活性のほとんどを含有して
いた。主要な凝固促進物質ピーク務らの画分を一緒にし
、限外濾過にょシ約５倍に濃縮し、そして精製の次の段
階に移した。

この段階からの活性の回収はしげしげ１００１よシ大と
なったが、これはおそらく、阻害物質がさらに除去され
たためであろう。

段階３： 濃縮された凝固促進物質ピークをベンズアミジンアフィ
ニティー樹脂に適用し、少量の非結合蛋白質を、５０　
ｍＭＮａＣ６及びｌ　ｍＭ　ＥＤＴＡ　ｆ含有する１０
ｍＭペロナール緩衝液（ｐＨ７，８）を用いてカラムか
ら洗浄除去し、そして樹脂に、又は結合蛋白質に吸着し
た蛋白質を、１１０ｎ１ペロナール緩衝液（ｐＩ（７，
８）中０．１１トリトンＸ−１００でカラムを洗浄する
ことにより除去した。最初のベロナール緩衝液を用いて
カラムからトリトンＸ−１００を洗浄し、３０ｄの０１
０５Ｍゾロピオン酸を用いて幾らかの凝固活性を含む弱
く結合したプロテアーゼを溶出し、そして次に４０ゴの
０．５Ｍ７’ロビオン酸を用いて残りの結合蛋白質を取
り出した。酸溶出物を直接ｐＨ７，５に調整し、又は段
階１において記載したように０．５Ｍペロナール緩衝液
中に集めてプロピオン酸を部分的に中和した。サンゾル
全１１０１ＴＩベロナール緩衝液に対して透析すること
によジプロピオン酸ナトリウムを除去し、そして限外濾
過により濃縮した。凝固促進活性は非結合蛋白質サング
ル中に全く回収されず、そしてトリトンＸ−１００によ
り溶出された蛋白質を用いて活性はほとんど又は全く回
収されなかった。約３０係の凝固促進活性が０．０５Ｍ
酸溶出液中に回収され、残シフ０係は０．５Ｍ酸溶出液
中に存在し、これを次の精製段階に用いた。この精製段
階からの酸溶出物は、部分精製癌凝固促進物質に対する
抗体に対する免疫電気泳動上で単一の免疫沈澱バンドを
形成したが、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動により分析した場合、３〜４の蛋白質
性不純物を含有していた。

段階４： 第２のベンズアミジンアフィニティーカラムから溶出さ
れたサンプル約１．Ｑ罰ｉ、２０ｍＭペロナール緩衝液
（ｐＨ７，７）中でＰＣＭＢアフィニティー樹脂に適用
し、そしてカラムｆ　４　Ｑ　ｍｌのＭｇＳ緩衝液（ｐ
Ｈ６，８）、４０ｍ１！の１Ｍ尿素及びＭｇＳ緩衝液中
１チトウイーン２０で洗浄し、カラムから原票及びトウ
ィーンを除去するために２０ゴのＭｇＳ緩衝液で洗浄し
、カラムの残留蛋白質を除去するために３５ｍ１の０．
１ｍＭジチオスレイトール、３５ｍＡ’の５ｍＭジチオ
スレイトール、３５　ｍｌの１０ｍＭ０ｍＭジチオスレ
イトール最後に３５ｍ７の１００ｍＭジチオスレイトー
ルで洗浄した。カラム必ら溶出する蛋白質’ｔ”　２８
０　ｎｍの吸光によシ連続的に監視した。蛋白質ピーク
を別々に集め、そして限外濾過膜上で約１０倍に濃縮し
、そしてＭＥＳ緩衝液に対して透析してジチオスレイト
ールを除去した。

各洗浄において蛋白質゛が溶出し、少量の凝固促進物質
活性が０．１　ｍＭ　ＤＴＴ中に溶出し、そして活性の
主要ピークが５ｍＭ溶出液中に溶出した。

段階５： Ｐ　ＣＭＢ−セファロースカラムからの、濃縮及び透析
された凝固促進物質サンプル’ｉ、１０μｍ１／１ｒＬ
ｌの粗燐脂質を含有する１０ｍＭベロナール緩衝液（ｐ
）（７，８）中でフェニル−セファロース疎水性アフィ
ニティーカラムに適用した。サンプル全１０分間にわた
ってカラムと平衡させ、そして非結合蛋白質ｆ　１０　
ｍＭペロナール緩衝液（ｐＨ７，８）により溶出した。

凝固促進物質はペロナール緩衝液中１０’ｌジメチルス
ルホキシドによシ溶出し、限外適過によシ濃縮し、そし
てペロナール緩衝液に対して透析してジメチルスルホキ
シドを除去した。

約２０係の凝固促進活性がペロナール緩衝液中に回収さ
れたが、ジメチルスルホキシド溶出液は一般に残シ８０
チの活性のほとんどを含有しており、そしてドデシル硫
酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により
単一の蛋白質バンドを示した。

分離操作は、今まで見出されていない、又は蛋白質の常
用の分離において期待される多数の変法を用いる。

精製操作の第２段階は、２■蛋白質／ｍｌサンプルより
高濃度に濃縮された場合に凝固促進酵素が凝集するとい
う観察を利用した。これは、はとんどのセリンプロテア
ーゼについて共通なカクトオフ分子貴である１５０，０
００より小さい分子ｔを有する他の蛋白質から凝固促進
物質を解放することを可能にする。デル濾過カラムクレ
マトグラフィーに続いて、ベンズアミジンアフィニティ
ークロマトグラフィ一段階を反復したが、吸着された不
純物は非イオン性洗剤（０，１％ｌＪ）ンＸ−１００）
で除去し、そして低レベルのプロピオン酸（０，０５Ｍ
）を用いて、幾らかの癌凝固促進物質を含む弱く結合し
たプロテアーゼを溶出し、そして次に０．５Ｍグロビオ
ン酸を用いて残シのプロテアーゼをカラム必ら取シ出し
た。最終疎水性アフィニティークロマトグラフィ一段階
により非常に精製された蛋白質が得られた。粗抽出物中
に存在する阻害物質が凝固促進活性をマスクし、そして
凝固促進活性の不安定性がゆるやかではあるが連続的な
活性の喪失をもたらすので、全体的精製及び回収率を正
確に算出することは不可能でありた。しふしながら、精
製過程の最終生成物は均一な癌凝固促進酵素のようであ
った。さらに、カラムをあらかじめ平衡化するために燐
脂質を使用し、そして精製中のサングル（精製された酵
素を含む）に日常的に加えた。これは凝固促進因子の安
定性及び活性の両方を改良することが示されたからであ
る。

例５．ダル電気泳動及び等電点電気泳動分析的ポリアク
リルアミドスラブグル電気泳動を、１０係ダル又は１２
．５係ダルを用いてｐＨ８，９において行った。サンプ
ルのアリコート（４部）ｋ、０．１２５　Ｍ　Ｔｒｉｓ
−塩基中に１０チのメルカプトエタノール、１０係のド
デシル硫酸ナトリウム、４０係のグリセロール及び０．
０１％のビロニｙ　（ｐｙｒｏｎｉｎ　）Ｙを含有する
サンプル緩衝液１部に加えた。メルカプトエタノールを
除去した同じ試料緩衝液中に非−還元サンプルを調製し
た。サンプルを２分間沸騰水中で加熱し、そしてグルに
適用した。純凝固促進物質の分子量を、既知分子量の蛋
白質の電気泳動的移動を決定することによシ測定した。

分析的ポリアクリルアミドグル等電点電気泳動を、標準
ＬＫＢ法に従って、既成の４４ＬＫｌ”ルを用いて行っ
た。純凝固促進物質の等電点を、既知の等電点を有する
蛋白質の位置によシ、及び０．１Ｍ　ＫＣＬ溶液を含有
する０、５ｃｒｎグル片のｐＦ（２測定することによっ
て一勾配を決定することにより、決定した。

精製された癌凝固促進物質は、広ＰＨ範囲（ｐＨ３，５
〜９．５）の分析用ポリアクリルアミドゲル等電点電気
泳動グル上で、約４．８及び４．９のｐＩにおいて１対
の蛋白質バンドとして現れた。狭い…範囲（ｐＨ４，０
〜６．５）のグル上での分析によりｐＩ４．９の蛋白質
バンドが２つの蛋白質バンドに分かれ、癌凝固促進物質
の３種のアイソザイムが存在することが示唆された。

代表的な精製についての、精製過程における凝固促進活
性量（ラビット脳スロンデゾラスチンのミリ当量；　ｍ
ｅｑ　ＲＢＴ　）及び蛋白質含量（Ｔｎ９　）　’ｅ次
の第１表に示す。比活性（ＳＡ　；　ｍｅｑ　ＲＢＴ　
／〜蛋白質）、活性の回収率（チ）、及び比活性の増加
（精製）を、得られたデータホら計算した。１００チを
超える回収率はおそらく、精製中に凝固促進物質阻害剤
が除去されるためであろうと信じられる。

以下会白 この精製法により得られた酵素は約６８，０００の分子
量を有し、そして電気泳動がβ−メルカゾトエタノール
による還元によって影響を受けないので、単一ポリペプ
チド鎖であると信じられる。

分析的ドデシル硫酸ナトリウム−？リアクリルアミドデ
ル電気泳動によシ試験した場合、単一蛋白質バンドが観
察された。さらに、この酵素は、ファクターＸ’に活性
化する点において他の凝固酵素と異る。精製された癌凝
固促進物質をフロイントのアジュバントに懸濁し、そし
てこれをヤギに注射することにより、電気泳動において
単一の免疫沈澱バンドを供する凝固促進物質特異的抗体
を得ることができた。この抗体はイムノアフィニティー
クロマトグラフィーのごとき技法によシ精製することが
でき、そして常用のＲＩＡ又は酵素イムノアッセイ診断
法による体液中の癌凝固促進物質の測定において使用す
ることができた。

例６．抗−癌凝固促進物質羊ＩｇＧ １００μｙの精製ＣＰを等容量の完全７０インドアジユ
バント中に乳化し、そしてヤギのを柱にそって多数の部
位に皮下注射した。３０〜５ｏμＩの精製ＣＰｆ等容量
の完全フロインドアジュバント中に懸濁し、そして同様
にしてヤギに注射することＫより、３週間間隔で追加免
疫した。毎月頚静脈穿刺により血液サンプルを得、そし
て交差免疫拡散によシ抗体について試験した。４ケ月後
、抗体価が１：１６に達した。この抗体し４ルは少なく
とも１２ケ月続いた。ヤギ抗体（ポリクローナルＩｇＧ
免疫グロブリン）ヲ、標準法による硫酸アンモニウム沈
澱及びＤＥＡＥ−セルロースイオン交換クロマトグラフ
ィーにより部分精製した。部分精製した抗体はラビット
血清蛋白質に対する抗体を含有することが見出された。

これはおそらく、ラビッ）Ｖ２癌の精製ｃｐ標品の微量
の汚染物によるものであろう。これらの汚染抗体を除去
するため、ラビット血清をシアノダンプロミドで活性化
したセファロースに結合せしめて正常ラビット血清蛋白
質アフィニティーカラムを形成し、そして部分的に精製
したヤギ抗体標品を正常ラビット血清カラムに通し汚染
抗体を除去した。得られたヤギＩｇＧ標品は、正常ラビ
ット血清と交差反応する抗体を含有していなかった。こ
れらの部分精製ヤギ抗体を、免疫アフィニティークロ゛
マドグラフィーのため、及びイムノアッセイ系において
使用した。

上記の第２の精製技法を用いながら、精製したＣＰ　Ｋ
よシマウスを免疫し、Ｙｅｌｔｏｎ等。

Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｌｂｏｄｉｅｓ　（Ｋｅ
ｎｎｅｔｔ等１編）７゜レナムプレスにューヨーク）、
１９８０．３〜１７頁により記載されているようにして
Ｂ細胞抗体を生成せしめた。但し、・・イブリドーマ抗
体を生じさせる他の方法全使用することもできよう。

簡単に記載すれば、４０μｇの精製抗原を等容量の完全
７０インドアジユバントに懸濁し、そしてＢａ１ｂ／Ｃ
マウスに皮下注射した。次に、不完全フロインドアジュ
バントに懸濁した３５μｇ及び１０μｇの抗原を１ケ月
間隔で２回皮下注射した。更後の皮下免疫から３週間後
、塩水中１０μｇ１７０μ仄及び７０μｇの抗原を腹腔
内投与することによシ３日間隔で３回腹腔内免疫し、２
週間後、血液サンゾルを後目窩採血により採取し、そし
て交差免疫拡散により血清抗体について試験し、抗体の
存在を確認し、最終版腔内免疫（４０μｍ１）ｋ行い、
そして３日後に動物を殺した。

リンパ球を取り出し、そして５（１／リエチレングリコ
ールと共に、マウス黒色腫細胞系のＰ３／Ｘ６３　ＡＣ
３，６５３株とハイブリダイズせしめた（１７．１８）
。バイブリド細胞を、２×１０個の正常ネズミ牌細胞を
フィーダ一層として有する９６ウエルミクロタイターグ
レートに入れ、そして培養物ｉ　ＨＡＴ培地中で４週間
増殖せしめることによりバイブリド形成していない黒色
腫細胞を除去した。ミクロタイターウェルからの培地を
抗体産生細胞についてスクリーニングするためにｇＬＩ
ｓＡｆｆｉ使用した。この測定において、精製抗原をミ
クロタイターウェルの表面に吸着せしめ、ウェルｉ　２
　％　ＢＳＡでブロックし、そして培地をウェル中で３
７℃にて１時間インキュベートシ、アルカリホスファタ
ーゼでラベルしたラビット抗マウス免疫グロブリン標品
を加えて、抗原に結合した抗体を同定した。陽性ウェル
を２×１０正常牌細胞の存在下に拡げた。拡げたウェル
を再試験し、そして陽性ウェルを低密度において２個以
上クローニングし、ハイブリッド細胞の純粋で安定な世
代集団を得、これを実験に使用した。３個のクローンを
同定した。各クローンは癌凝固促進物質抗原に対するＩ
　ｇＭｋ抗体を生産した。

ハイブリッド細胞ムら得られたＩｇＭサンプル（組織培
養細胞からの培地として、又は腹水として）は凝固促進
活性を含有していた。代表的な実験において、Ｂａ１ｂ
／Ｃマウスに０１５ｄのブリステン（ｐｒｉｇｔｅｎｅ
　）　ｆ注射してその免疫系を減感した。３週間後、マ
ウスに２×１０個のハイブリドーマ細胞を腹腔内投与し
、そして腹水を、腹腔針により、マウスが死ぬまで２日
間隔で３回又は４回取り出した。腹水を、凝固促進活性
、ファクター■−依存性血漿における活性及び水銀によ
る阻害について測定した。凝固促進活性は、癌凝固促進
物質のそれとして仮に特徴付けられた。癌凝固促進物質
は腫瘍胎児性抗原であると信じられ、そしてバイブリド
細胞は悪性細胞系（黒色腫株）から生ずるため、抗原が
ノ・イブリド細胞といかに関連するかを理解することが
できる。従ってまた、ＩｇＭ抗体が腹水中で抗原と結合
し、アッセイ系においてこれを免疫的に不活性にするこ
とも確すらしい。従って、抗原をこの抗体から分離して
、抗体が他のサンプル中の抗原と免疫的に反応するよう
にすることが必要であった。腹水に３Ｍ濃度の尿素を加
え、そしてあらかじめ３Ｍ尿素により平衡化した１、５
Ｍアガーロースｒル濾過カラム１×９０のに適用した。

サンプルをカラムから３Ｍ尿素において溶出し、そして
第１ピーク（ゲイドデリウム）をＩｇＭ及び凝固促進活
性について測定した。

このものは凝固促進活性全含有せず、そしてＩｇＭのす
べてを含有していた。カラムからの第２ピークは凝固促
進活性を含有し、そしてＩｇＭｉ含有しなかった。第１
ピークからの両分を一緒にし、５ｒｒＬＭＴｒｉｓ　−
ＨＣｔ緩衝液に対して、少なくとも３回液を取り替えな
がら透析し、サンプルをアミコンＸＭ５０限外濾過膜上
で濃縮し、そして遠心チ一一ブ中で１夜冷却した。次の
朝、試験管中に沈澱が生成した。これを遠心分離によシ
取や出し、そしてＰＢＳに再懸濁した。再懸濁したサン
プルは免疫反応性１ｇＭ画分を含有することが見出され
た。少量は上清中に残留していた。この精製Ｉ　ｇＭ　
’ｔ”　、対照ブランクとして２チ正常ヒト血清を用い
て、精製した抗原に対して測定し、そしてサングルとブ
ランクとの比率１０〜２０が得られた。未精製腹水は、
サンプルとパックグラウンドの比率２〜４を供し、上清
液はサンプルとパックグラウンドとの比率６〜１０を供
した。次に、この精製１ｇＭをイムノアッセイにおいて
使用した。抗原−抗体複合体を解離せしめるための他の
方法が存在し、これら全分離することができる。これら
の方法にはより高い尿素濃度、低Ｐ）′１（ＰＩ（２〜
３．５）、５Ｍグアニジ７−　ＨＣｌ、高ＰＨ（ＰＨＩ
　Ｏ１５〜１２）、及び解離剤と一調整との組合わせが
含まれる。抗体−癌凝固促進物質抗原複合体全分離する
ためのこれらの方法のすべてがこの明細書の開示に含ま
れる。

以下余白 例８．イムノアッセイ 癌凝固促進物質の定量のだめの２つの別々のイムノアッ
セイ法を開発した。

第１のイムノアッセイ系は、直接ＥＬＩＳｋであシ、こ
の方法におりては、抗原を室温にて２時間、９６ウエル
イムロンＩミクロタイタープレートにおいて、ウェルの
表面に吸着せしめ、ウェルを燐酸緩衝化トウィーン−２
０ですすぎ、ウェルのオープンサイトを燐酸緩衝液中２
係正常ヒト血清によシ３７℃にて１時１間ブロックし、
そしてウェルを０．０５チトウイーン２０含有２０　ｍ
Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７，５）で３回洗浄した。精製した
ＩｇＭ抗体を燐酸緩衝液中に１：２００に稀釈し、そし
て５０μノを各ウェルに加え、そして３７℃にて１時間
インキュベートした。ウェル’ｋ、０．０５４トウイー
ン含有燐酸緩衝液（ＰＴＢ　）にょ９３回洗浄した。

アルカリホスファターゼラベルラビット抗マウスＩｇＭ
抗体（７）１〜１０００稀釈物全各ウエルに加え、３７
℃にて１時間インキュベートシ、ウェルをＰＴＢ　、並
びに０．１　”５ｉ’　／Ｉｌｌ　（Ｄ　ＭｇＣｌ２・
６　Ｈ２Ｏ及び０．２’％　ＮａＮ５ｆ　含有する１０
ｑｂジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ９，８）中ｐ−ニ
トロフェニルホスフェ−）　（５ｍｇ／ｒｎｌ　）　１
００μｍにより洗浄し、そして３７℃にて４５〜９０分
間（色の強度が読取りに適当になるまで）インキュベー
トシ、そしてブレ）　’ｅ　４０５　ｎｍの吸収を測定
するダイナチク（Ｄｙｎａｔｅｃｈ　）ミクロタイター
プレートリーダー上で読み取った。

第２のＥＬＪＳＡ法（サンドイッチ又は二重抗体ＥＬＩ
ＳＡ）においては、イムノロンＩミクロタイタープレー
ト全１〜４０，０００稀釈の部分精製ヤギＩｇＧＫより
てコートし、そして２５℃にて２時間インキュベートシ
、ウェルを燐酸緩衝化塩溶液（ＰＢＳ　）で１回洗浄し
、そしてウェル中のオープンサイトを燐酸緩衝液中２係
ヒト血清によりブロックした。

ウェルｉ　ＰＴＢにより３回洗浄し、５０μｌの抗原サ
ンプル（通常ＰＴＢ＋０．１５ＭＮλＣｔにより１：２
稀釈する）を各ウェルに加え、そして２５℃にて２時間
インキユベートシ、ウェルを再度ＰＴＢで洗浄し、ＰＢ
Ｔ中１〜２００稀釈のＩｇＭ５０μ４を加え、そして２
５℃にて２時間インキュベートし、そして上記のように
してＩｇＭ量を測定した。

これらの測定法の両者を用いて精製抗原、正常ヒト血清
に加えた精製抗原、癌患者からの血清、腫瘍抽出物、及
び他の生物サングルを測定した。

第１の測定法はよシ精製されたサンプルについてより良
好に機能し、第２の測定法は血清のごときサンプル、及
びウェル表面への結合に関して抗体と競争する他の蛋白
質を多数含有する蛋白質のサンプルのために良好に機能
した。これは、抗原が生物サンプルからヤギ抗体上に吸
着され、そして抗原の量を定量するのにモノクローナル
抗体が使用されたからである。両ＥＬＩＳＡ法は１０■
の精製抗体を検出することができた。

１１ｓＡ法は、生物サンプル中の癌凝固促進物質抗原の
測定に用いることができる種々のイムノアッセイ法の１
つである。他の方法には、ラジオイムノアッセイ法、イ
ムノインヒビジョンアッセイ法、イムノフルオレセント
アッセイ法及び免疫沈澱測定法が含まれ、これらすべて
のアッセイ法においては、癌凝固促進物質の定量のため
に抗体が使用され、これらの方法はこの発明の測定法に
含まれると理解すべきである。

癌の診断のための、この発明のｇＬＩｓＡの有効性を証
明するために、証明されている癌患者からの多数の血清
サンゾルを盲検試行により試験した。

第１図に、実施したイムノアッセイから得られたデータ
及び評価された癌の種類、試験された個体の数、正しく
同定されたサンプルの数、及び正しく同定されたサンプ
ルの係ヲ示す。

以下余白 第　２　表 胃腸管　３３　３１　９４ 呼、吟外　２９　２４　８３ 乳　房　３５　２６　７４ 前立腺　６　６　１００ 骨　４　４　１００ リンパ腫　６５８３ 膵　ｐｉＡ　８７８８ そ　の　他　１２　９　７５ 正常対照　１０７　９８　９２ 良性疾患対照　１０　１０　１００ 以上の記載から、当業者は容易にこの発明の本質的特徴
を理解し、そしてその本質及び範囲から種々の変法を行
うことができない。従ってこのような変法はすべてこの
発明の範囲内のものである。

特許出願人 ユニバージティー　ノ２テンツ。

インコーホレイティド 特許出願代理人 弁理士　青　木　朗 弁理士　西　舘　和　之 弁理士　福　本　積 弁理士　山　口　昭　之 弁理士　西山雅也

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、約６８，０００の分子量及び約４．８の等電点を有
   し、そして血液ファクターＸを活性化することができる
   単一ポリにプチド蛋白質であることを特徴とする癌凝固
   促進物質。 ２、モノクローナル抗−癌凝固促進物質抗体。 ３、抗−癌凝固促進物質抗体を含んで成る、生物学的試
   料由来の癌凝固促進物質抗原測定用試薬。 ４、前記抗体がモノクローナル抗−癌凝固促進物質抗体
   である特許請求の範囲第３項記載の試薬。 ５、抗−癌凝固促進物質抗体を含んで成る試薬を生物学
   的試料に添加することを含んで成る、生物学的試料中の
   癌凝固促進物質抗原の定量方法。 ６、生物学的試料が血清、血漿、組織抽出物、尿、及び
   組織学的断片から成る群から選ばれる特許請求の範囲第
   ５項記載の方法。 ？、、ｉ？ＩＪクローナル抗−癌凝固促進抗体。