JPS60243025A - コレラトキシンサブユニツトｂの製造法 - Google Patents
コレラトキシンサブユニツトｂの製造法Info
- Publication number
- JPS60243025A JPS60243025A JP59097513A JP9751384A JPS60243025A JP S60243025 A JPS60243025 A JP S60243025A JP 59097513 A JP59097513 A JP 59097513A JP 9751384 A JP9751384 A JP 9751384A JP S60243025 A JPS60243025 A JP S60243025A
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cholera toxin
- antibody
- ctsu
- toxoid
- purified
- Prior art date
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- Pending
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-
- Y02A50/472—
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、細胞股上のガングリオシドＧＭ、の定量や、
コレラに対するワクチンとして有用な、コレラトキシン
サブユニツ）Ｈの製造法に関するものである。
コレラに対するワクチンとして有用な、コレラトキシン
サブユニツ）Ｈの製造法に関するものである。
コレラトキシン（以下ＣＴと略す）は分子量が約８４０
００の多量体で％ １ケのサブユニットＡ（以下ＣＴＳ
Ｕ−Ａと略す）と、５ケのサブユニットＢ（以下ＣＴＳ
Ｕ−Ｂと略す）から描成されている。このうちＣＴＳＵ
−Ａは、コレラトキシンの毒素活性に直接的に関与する
部分であ、９．ＣＴＳＵ−Ｂはリセブターに結合する部
分とされている。このＣＴＳＵ−Ｂは、単独では毒性を
持たないことが明らかにされておシ、コレラのワクチン
とじては非常に有用な物質である。
００の多量体で％ １ケのサブユニットＡ（以下ＣＴＳ
Ｕ−Ａと略す）と、５ケのサブユニットＢ（以下ＣＴＳ
Ｕ−Ｂと略す）から描成されている。このうちＣＴＳＵ
−Ａは、コレラトキシンの毒素活性に直接的に関与する
部分であ、９．ＣＴＳＵ−Ｂはリセブターに結合する部
分とされている。このＣＴＳＵ−Ｂは、単独では毒性を
持たないことが明らかにされておシ、コレラのワクチン
とじては非常に有用な物質である。
又、近年ガングリオシドＧＭ、のｉが、正常細胞に比べ
油化した細胞では少なくなっていることが報告ばれてい
る。ＣＴＳＵ−ＢはこのガングリオシドＧＭ、と特異的
に結合することが知られておシ、ガングリオシドＧＭ、
の定量への応用も考えられ注目されている物質でもある
。
油化した細胞では少なくなっていることが報告ばれてい
る。ＣＴＳＵ−ＢはこのガングリオシドＧＭ、と特異的
に結合することが知られておシ、ガングリオシドＧＭ、
の定量への応用も考えられ注目されている物質でもある
。
ＣＴＳＵ−Ｂを得るには、まずＣＴを精製し、これを史
にＣＴＳ［Ｊ−Ａ 、及びＣＴＳＵ−Ｂに分離する方法
が知られている。
にＣＴＳ［Ｊ−Ａ 、及びＣＴＳＵ−Ｂに分離する方法
が知られている。
このＣＴは、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａ
ｅ）培張物から分離精製する方法が一般的である。従来
ＣＴを得るためには、コレラ菌の培養物から菌体成分を
除いたいわゆる培養上清を、ゲルクロマトグラフィーに
よって精製するＦｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎＬｏｓｐａｌｌ
ｕｔｏの方法（Ｊ、 ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔａｎｃｅ Ｄ
ｉｓ、 １２１ 。
ｅ）培張物から分離精製する方法が一般的である。従来
ＣＴを得るためには、コレラ菌の培養物から菌体成分を
除いたいわゆる培養上清を、ゲルクロマトグラフィーに
よって精製するＦｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎＬｏｓｐａｌｌ
ｕｔｏの方法（Ｊ、 ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔａｎｃｅ Ｄ
ｉｓ、 １２１ 。
６３〜７２ 、１９７０ ）が用いられていた。
この方法は１分子量の差を利用したゲルろ過法によるも
ので、その精製工程には何回かの試料の濃縮操作を要す
る。そのため、工業的な生産を行う場合には多大な設備
が必要となり、実用的な方法とは言（へ難Ｉへ。
ので、その精製工程には何回かの試料の濃縮操作を要す
る。そのため、工業的な生産を行う場合には多大な設備
が必要となり、実用的な方法とは言（へ難Ｉへ。
一方、精製されたＣＴから更にＣＴＳＵ−Ｂを得る方法
としては、以下の方法が知られている。
としては、以下の方法が知られている。
すなわち、ＣＴが比較的不安定な蛋白質であり。
加熱、振ｆｆ１．ｐＨの変動等の物理的、化学的な作用
によって、容易にＣＴＳＵ−Ｂのみから成るトキソイド
を形成する性質をオＵ用したものである。加熱、振盪、
ｐＨ変動等の処理をＣＴに加え、形成されたトキソイド
をゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフ
ィー、等電点電気泳動等の方法で分取することによって
ＣＴＳＵ−Ｂを得るのである。これらの方法では、純度
の点では満足すべきＣＴＳＵ−Ｂを得ることも可能であ
るが、収率が悪く、また操作に必要な時間、設備、費用
の点で多くの問題を有し、工業的生産には不向きである
といわざるをえなか。
によって、容易にＣＴＳＵ−Ｂのみから成るトキソイド
を形成する性質をオＵ用したものである。加熱、振盪、
ｐＨ変動等の処理をＣＴに加え、形成されたトキソイド
をゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフ
ィー、等電点電気泳動等の方法で分取することによって
ＣＴＳＵ−Ｂを得るのである。これらの方法では、純度
の点では満足すべきＣＴＳＵ−Ｂを得ることも可能であ
るが、収率が悪く、また操作に必要な時間、設備、費用
の点で多くの問題を有し、工業的生産には不向きである
といわざるをえなか。
本発明者らは、かかる現状に鑑み鋭意研究した結果本発
明に致ったものである。
明に致ったものである。
本発明は、ａ、まずＣＴ含有培養上清から、抗原抗体反
応を利用した。込わゆるイムノアフィニティークロマト
グラフィーを用いて精製ＣＴを得。
応を利用した。込わゆるイムノアフィニティークロマト
グラフィーを用いて精製ＣＴを得。
ｂ、この精製ＣＴを、ｐＨの操作と加熱処理によって、
ＣＴＳＵ−Ａからなるプロコレラジェノイドと、ＣＴＳ
Ｕ−Ｂからなるトキソイドとに変換し。
ＣＴＳＵ−Ａからなるプロコレラジェノイドと、ＣＴＳ
Ｕ−Ｂからなるトキソイドとに変換し。
Ｃ８更に上記プロコレラジェノイドと上記トキソイドと
を、超遠心分離法によシ分離し、ＣＴＳＵ−Ｂを得る工
程からなるＣＴＳＵ−Ｂの製造法である。
を、超遠心分離法によシ分離し、ＣＴＳＵ−Ｂを得る工
程からなるＣＴＳＵ−Ｂの製造法である。
本発明におけるＣＴ精製用のイムノアフィニティークロ
マトグラフィーは、架橋アガロースゲル等の水不溶性担
体に、精製したＣＴでウサギ、モルモット等を免疫して
得た抗ＣＴ抗体を、公知の方法で結合させたものである
。ここで用いる不溶性担体は、親水性かつ水不溶性のも
のであれば特に限定されるものではなく１例えば架橋デ
キストランゲル、架橋ポリアクリルアミドゲル等を使用
しても何ら問題は無い。又抗ＣＴ抗体も免疫血清から得
られたものに特に限定されるものではなく。
マトグラフィーは、架橋アガロースゲル等の水不溶性担
体に、精製したＣＴでウサギ、モルモット等を免疫して
得た抗ＣＴ抗体を、公知の方法で結合させたものである
。ここで用いる不溶性担体は、親水性かつ水不溶性のも
のであれば特に限定されるものではなく１例えば架橋デ
キストランゲル、架橋ポリアクリルアミドゲル等を使用
しても何ら問題は無い。又抗ＣＴ抗体も免疫血清から得
られたものに特に限定されるものではなく。
いわゆるモノクローン抗体を利用することも可能である
。
。
このようにして得られた抗ＣＴ抗体結合水不溶性担体を
、カラム法、あるいはバッチ法によりコレラ菌の培養上
清と反応させる。反応後、形成されたＣＴ−抗ＣＴ抗体
結合水不溶性担体複合体を、とのＣＴ−抗ＣＴ抗体免疫
複合体に影響の無い。
、カラム法、あるいはバッチ法によりコレラ菌の培養上
清と反応させる。反応後、形成されたＣＴ−抗ＣＴ抗体
結合水不溶性担体複合体を、とのＣＴ−抗ＣＴ抗体免疫
複合体に影響の無い。
例えばｐＨ６〜９のリン酸緩衝液等で洗浄する。
つづいて、上記複合体にポリペプチド分子の水素結合を
開裂しうるカオトロピック剤を加えて。
開裂しうるカオトロピック剤を加えて。
ＣＴ−抗ＣＴ抗体完投複合体を解離させ、ＣＴ含有分画
を得る。ＣＴ−抗ＣＴＦｒ、体の結合を解離させるには
％ｐＨの低い緩衝液を用いることも可能であるが、ＣＴ
は低いｐＨのもとでは不安定なので、やけりカオトロピ
ック剤の使用が好ましい。
を得る。ＣＴ−抗ＣＴＦｒ、体の結合を解離させるには
％ｐＨの低い緩衝液を用いることも可能であるが、ＣＴ
は低いｐＨのもとでは不安定なので、やけりカオトロピ
ック剤の使用が好ましい。
カオトロピック剤と１−７では、８〜ＩＯＭの尿素水溶
液、５〜６Ｍのグアニジン塩酸塩水溶液、２〜３Ｍのチ
オシアンナトリウム、又はチオシアンアンモニウム水溶
液等が挙げられるが特に限定されるものではない。
液、５〜６Ｍのグアニジン塩酸塩水溶液、２〜３Ｍのチ
オシアンナトリウム、又はチオシアンアンモニウム水溶
液等が挙げられるが特に限定されるものではない。
得られたＣＴ含有分画は、適当な緩衝液で透析して混入
したカオトロピック剤を除去し、精製ＣＴとする。特に
保存の必要がある場合には、これを凍結乾燥することも
可能である。
したカオトロピック剤を除去し、精製ＣＴとする。特に
保存の必要がある場合には、これを凍結乾燥することも
可能である。
以上のようにして精製されたＣＴは、電気泳動的にも均
一なものであシ、加えて動物に対する免疫原性、細胞毒
性等の緒特性において、従来の方法で得られたものと同
等の性状を示した。
一なものであシ、加えて動物に対する免疫原性、細胞毒
性等の緒特性において、従来の方法で得られたものと同
等の性状を示した。
このＦｌＩ製ＣＴを加熱すると、ＣＴは、まず巨大な分
子量を持つ会合体を形成するが、これを更に加熱すると
ＣＴＳＵ−Ｂのみからなる トキソイドが遊離してくる
。
子量を持つ会合体を形成するが、これを更に加熱すると
ＣＴＳＵ−Ｂのみからなる トキソイドが遊離してくる
。
ＣＴよりＣＴＳＵ−Ｂからなるトキソイドを遊離はせる
には、上記の方法の他に、高濃度カオトロピック剤やｐ
Ｈ４以下の緩衝剤で透析後１弱い加熱処理を加えて残存
するＣＴを熱会合させる方法等が挙げられる。
には、上記の方法の他に、高濃度カオトロピック剤やｐ
Ｈ４以下の緩衝剤で透析後１弱い加熱処理を加えて残存
するＣＴを熱会合させる方法等が挙げられる。
こうして得られたＣＴの会合体からトキソイドが分離し
たＣ Ｔ Ｓ Ｕ−Ａの熱会合物（プロコレラジェノイ
ド）と、ＣＴＳＵ−Ｂからなるトキソイドの混合物を、
３００．０００ Ｋｇ、２０時間遠心分離し。
たＣ Ｔ Ｓ Ｕ−Ａの熱会合物（プロコレラジェノイ
ド）と、ＣＴＳＵ−Ｂからなるトキソイドの混合物を、
３００．０００ Ｋｇ、２０時間遠心分離し。
その上清を分取すればＣＴＳＵ−Ｂからなるトキソイド
が容易に得られる。この時、遠心管に予め塩化セシウム
や臭化カリウム等の高密度溶液を入れておくと、遠心後
の沈澱と上清液の分離がより完全に行なわれる。
が容易に得られる。この時、遠心管に予め塩化セシウム
や臭化カリウム等の高密度溶液を入れておくと、遠心後
の沈澱と上清液の分離がより完全に行なわれる。
上記の方法で得られたＣＴＳＵ−Ｂは、従来の方法で得
られたものと純度の点で劣るものではなく、又収率の点
では非常に成績の良いものであった。
られたものと純度の点で劣るものではなく、又収率の点
では非常に成績の良いものであった。
以下、実施例に基いて本発明を更に詳細に説明するが、
本発明はこれに限定されるものではない。
本発明はこれに限定されるものではない。
実施例１．ＣＴ分離用イムノアフィニティークロマトグ
ラフカラムの調製 アガロース（ファルマシア社製Ｓ＠ｐｈａｒｏｓｅ ４
Ｂ）５００ｍｌを０．００１ ＮのｍＭに懸濁した後。
ラフカラムの調製 アガロース（ファルマシア社製Ｓ＠ｐｈａｒｏｓｅ ４
Ｂ）５００ｍｌを０．００１ ＮのｍＭに懸濁した後。
グラスフィルターの上で０６１Ｍ塩化ナトリウム含有０
．１ Ｍ炭酸水素す） １ウム緩衝液（ｐＨ８，６゜以
下カップリングバッファーとする）で洗浄した。
．１ Ｍ炭酸水素す） １ウム緩衝液（ｐＨ８，６゜以
下カップリングバッファーとする）で洗浄した。
これを臭化シアン法により活性化し、１係抗ＣＴ抗体５
００ ｍｌを加えてｉ晩撹拌し、カップリングを行った
。抗ＣＴ抗体は、精製ＣＴを家兎に免疫して得られた抗
血清から、硫安分画法１・こよって精製した免疫グロブ
リンを用いた。反応後１反応液をグラスフィルターでろ
過し、カップリングパ・ソファ−で洗浄し７た。このと
きる液に残った抗ＣＴ抗体を測定し１反応した抗ＣＴ抗
体の量をめたところ、９９チ以上がアガロースに結合し
ていた。つづｂて、残存活性基をブロックするために１
Ｍエタノールアミンと室温で反応させた後。
００ ｍｌを加えてｉ晩撹拌し、カップリングを行った
。抗ＣＴ抗体は、精製ＣＴを家兎に免疫して得られた抗
血清から、硫安分画法１・こよって精製した免疫グロブ
リンを用いた。反応後１反応液をグラスフィルターでろ
過し、カップリングパ・ソファ−で洗浄し７た。このと
きる液に残った抗ＣＴ抗体を測定し１反応した抗ＣＴ抗
体の量をめたところ、９９チ以上がアガロースに結合し
ていた。つづｂて、残存活性基をブロックするために１
Ｍエタノールアミンと室温で反応させた後。
０．１Ｍ塩化ナトリウム含有０．１Ｍ酢酸緩衝液とカッ
プリングバッファーで数回洗浄し、これをカラムに充填
してＣＴ分離用イムノアフィニティークロマトグラフカ
ラムとした。
プリングバッファーで数回洗浄し、これをカラムに充填
してＣＴ分離用イムノアフィニティークロマトグラフカ
ラムとした。
実施例２．ＣＴの分離
コｖ−’ｙ菌（Ｖ 、 ｃｈｏｌｅｒａｅ Ｉｎａｄａ
５６９ Ｂ ） の培養上清５７（ＣＴを約１５０
ｍｇ含有）を実施例、１で調製したＣＴ分離用イムノア
フィニティークロ、マドグラフカラム（匂下爪にカラム
とする）に通した後、０．１Ｍ塩化す） ＩＩウム含有
０．０５ Ｍリン酸緩衝液で充分に洗浄してカラム内の
培地成分等の不純物を除去した。つづいて３Ｍチオシア
ンナ） ＩＩウムで抗ＣＴ抗体に結合したＣＴを溶離さ
せ、更にこれを、０．１Ｍ塩化ナトリウム含有０．０５
Ｍ １１ン酸緩衝液で充分に洗浄してカラム内の培地
成分等の不純物を除去した。つづいて、３Ｍチオシアン
ナトリウムで抗ＣＴ抗体に結合したＣＴを溶離させ、更
にこれを０．１ Ｍ塩化ナトリウム含有０．０５ Ｍ
ＩＪン酸緩衝液で回収した。得られた溶出液を、０．１
Ｍ塩化す） ＩＪウム含有０．０５ Ｍ１１ン酸緩衝液
で透析して、チオシアンナトリウムを除去し精製ＣＴを
得た。これを凍結乾燥１てＣＴの量を測定したところ、
１５０ ｍｇであり。
５６９ Ｂ ） の培養上清５７（ＣＴを約１５０
ｍｇ含有）を実施例、１で調製したＣＴ分離用イムノア
フィニティークロ、マドグラフカラム（匂下爪にカラム
とする）に通した後、０．１Ｍ塩化す） ＩＩウム含有
０．０５ Ｍリン酸緩衝液で充分に洗浄してカラム内の
培地成分等の不純物を除去した。つづいて３Ｍチオシア
ンナ） ＩＩウムで抗ＣＴ抗体に結合したＣＴを溶離さ
せ、更にこれを、０．１Ｍ塩化ナトリウム含有０．０５
Ｍ １１ン酸緩衝液で充分に洗浄してカラム内の培地
成分等の不純物を除去した。つづいて、３Ｍチオシアン
ナトリウムで抗ＣＴ抗体に結合したＣＴを溶離させ、更
にこれを０．１ Ｍ塩化ナトリウム含有０．０５ Ｍ
ＩＪン酸緩衝液で回収した。得られた溶出液を、０．１
Ｍ塩化す） ＩＪウム含有０．０５ Ｍ１１ン酸緩衝液
で透析して、チオシアンナトリウムを除去し精製ＣＴを
得た。これを凍結乾燥１てＣＴの量を測定したところ、
１５０ ｍｇであり。
これは周込た培養上清に含まれるＣＴの全量である。
実施例３．ＣＴＳＵ−Ｂの製造
実施例１．及び２．の操作によって得られたＣＴ３００
ｍｇを０．１ Ｍリン酸緩衝液２０ｍ１ で溶解１−
１これを透析用セルロースチューブへ充填した。
ｍｇを０．１ Ｍリン酸緩衝液２０ｍ１ で溶解１−
１これを透析用セルロースチューブへ充填した。
このセルロースチューブを、０．１Ｍグリシン−塩酸緩
衝液（ｐＨ３，２） ５１１の中に浸漬して、４℃で一
晩透析を行ないＣＴをトキソイド化した。翌日このセル
ロースチューブの内容物を６０℃の水浴で１０分間加熱
処理し、残ってｂるＣＴを完全にトキソイド化した後、
遠心管に移して遠心分離用ローター（株式会社日立製作
所ＭＲＰ ６５Ｔ型）にセットし、超遠心装置（株式会
社日立製作所製７０Ｐ７３型）を用い、１０℃で６５．
００Ｏｒｐｍ（約３００゜０００ ｘ ｇ ） ２０時
間遠心分離を行った。
衝液（ｐＨ３，２） ５１１の中に浸漬して、４℃で一
晩透析を行ないＣＴをトキソイド化した。翌日このセル
ロースチューブの内容物を６０℃の水浴で１０分間加熱
処理し、残ってｂるＣＴを完全にトキソイド化した後、
遠心管に移して遠心分離用ローター（株式会社日立製作
所ＭＲＰ ６５Ｔ型）にセットし、超遠心装置（株式会
社日立製作所製７０Ｐ７３型）を用い、１０℃で６５．
００Ｏｒｐｍ（約３００゜０００ ｘ ｇ ） ２０時
間遠心分離を行った。
遠心分離終了後、沈澱物が混入しないように上清を分弊
し、これを０．１ＭＩＪン酸緩衝液で透析した。更に、
微細な浮遊物を除去するため、メンブランフィルタ−で
ろ過し、凍結乾燥して精製ＣＴＳＵ−Ｂ ２００ ｍｇ
を得た。
し、これを０．１ＭＩＪン酸緩衝液で透析した。更に、
微細な浮遊物を除去するため、メンブランフィルタ−で
ろ過し、凍結乾燥して精製ＣＴＳＵ−Ｂ ２００ ｍｇ
を得た。
上記実施例から明らかなように、ゲルろ適法を中心とし
た従来のＣＴＳＵ−Ｂの製造法に比べ１本発明は回収率
が高い、操作が簡便、工業化が容易である等、多くの利
点を有する。
た従来のＣＴＳＵ−Ｂの製造法に比べ１本発明は回収率
が高い、操作が簡便、工業化が容易である等、多くの利
点を有する。
特許出願人 栄研化学株式会社
手続補正書Ｃ方式）
％式％
１、事件の表示
昭和５９年特許願第９７５１３号
２、発明の名称
コレラトキシンサプユニツ）Ｂの製造法３、補正をする
者 事件との関係 特許出願人 郵便番号 １１３ 昭和５９年７月１１日（発送日昭和５９年７月３１日）
５、補正の対象 明細書全文 ６、補正の内容 穎書に最初に添付した明細証の浄書・別紙のとおシ（内
容に変更なし）。
者 事件との関係 特許出願人 郵便番号 １１３ 昭和５９年７月１１日（発送日昭和５９年７月３１日）
５、補正の対象 明細書全文 ６、補正の内容 穎書に最初に添付した明細証の浄書・別紙のとおシ（内
容に変更なし）。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 コレラトキシンを含有する液体からコレラトキシンサプ
ユニツ）Ｂを製造する方法において少なくとも ａ、抗コレラトキシン抗体を、生化学的に不活性な水不
溶性担体に担持させる工程。 ｂ、上記担体にコレラトキシンを含有する液に’Ｅ−加
工、コレラトキシンと抗コレラトキシン抗体トを反応さ
せてコレラトキシン−抗コレラトキシン抗体−水不溶性
担体複合体を形成させ、コレラトキシンに混入する培地
成分を洗浄除去したのち。 コレラトキシンのみを溶出させ、精製コレラトキシンを
得る工程。 Ｃ６得られた精製コレラトキシンを処理してコレラトキ
シンサブユニットＢのみから成るトキソイドと、コレラ
トキシンサプユニツ）Ａから成るプロコレラジェノイド
とに変換させる工程、ｄ、上記トキソイドと、上記プロ
コレラジェノイドとの混合物から、超遠心分離法により
トキソイドを分離する工程、 の各工程を含むことを特徴とするコレラトキシンサブユ
ニットＢの製造法
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59097513A JPS60243025A (ja) | 1984-05-17 | 1984-05-17 | コレラトキシンサブユニツトｂの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59097513A JPS60243025A (ja) | 1984-05-17 | 1984-05-17 | コレラトキシンサブユニツトｂの製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60243025A true JPS60243025A (ja) | 1985-12-03 |
Family
ID=14194334
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59097513A Pending JPS60243025A (ja) | 1984-05-17 | 1984-05-17 | コレラトキシンサブユニツトｂの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60243025A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02503914A (ja) * | 1987-04-29 | 1990-11-15 | プレジデント アンド フェロウズ オブ ハーバード カレッジ | コレラワクチン |
-
1984
- 1984-05-17 JP JP59097513A patent/JPS60243025A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02503914A (ja) * | 1987-04-29 | 1990-11-15 | プレジデント アンド フェロウズ オブ ハーバード カレッジ | コレラワクチン |
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