JPS6115897A - ヒト肝癌細胞を特異的に認識するモノクロ−ナル抗体 - Google Patents
ヒト肝癌細胞を特異的に認識するモノクロ−ナル抗体Info
- Publication number
- JPS6115897A JPS6115897A JP59134556A JP13455684A JPS6115897A JP S6115897 A JPS6115897 A JP S6115897A JP 59134556 A JP59134556 A JP 59134556A JP 13455684 A JP13455684 A JP 13455684A JP S6115897 A JPS6115897 A JP S6115897A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- monoclonal antibody
- hybridoma
- liver cancer
- producing
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
- C07K16/3038—Kidney, bladder
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
- C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業−にの利用分野）
明細■−の浄書（内容に変更なし）
本発明はヒト肝癌細胞を認識するモノクローナル抗体（
以下ＭｏＡｈと略記することがある）、および該モノク
ローナル抗体を産生するバイブリド９−マ、並びに該バ
イブリド９−マを用いたモノクローナル抗体の製造法、
さらには該モノクローナル抗体の利用に関する。特に、
本発明はヒト肝癌細胞を正常細胞と区別して特異的に認
識するとともに、生体内で肝癌細胞のみを傷害する作用
を持つモノクローナル抗体に関する。
以下ＭｏＡｈと略記することがある）、および該モノク
ローナル抗体を産生するバイブリド９−マ、並びに該バ
イブリド９−マを用いたモノクローナル抗体の製造法、
さらには該モノクローナル抗体の利用に関する。特に、
本発明はヒト肝癌細胞を正常細胞と区別して特異的に認
識するとともに、生体内で肝癌細胞のみを傷害する作用
を持つモノクローナル抗体に関する。
（従来技術）
１９７５年、Ｋ’ｔｉｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎは、
マウスミエローマＰ３にの誘導変異株であろＰ３Ｘ６３
−Ａｇ８（ＨＧＰＲＴ欠損株）と、抗ヒツジ赤血球マウ
ス抗体産生細胞よりハイノリド−マを作製し、このハイ
プリド−マが自律増殖性と抗ヒツジ赤血球抗体産生能を
共に有していることを報告した。この研究で示された、
単一抗原決定基のみを認識する均一な抗体、即ちモノク
ローナル抗体の概念は、免疫学、医学、薬学、生物学の
分野で太いに注目を集めた。１９７７年Ｗｉｓｔａｒ研
究所のＨ、Ｋ ｏｐｒＯｗｓｋｉらは、明細書の浄書（
内容に変更なし） ウィルス又は悪性腫瘍に対するＭｏｔｈを産生ずるハイ
フリド−マを作製し、Ｍｏｋｂの試薬としての有用性、
有効性を示すと共に治療薬としての可能性を示唆した。
マウスミエローマＰ３にの誘導変異株であろＰ３Ｘ６３
−Ａｇ８（ＨＧＰＲＴ欠損株）と、抗ヒツジ赤血球マウ
ス抗体産生細胞よりハイノリド−マを作製し、このハイ
プリド−マが自律増殖性と抗ヒツジ赤血球抗体産生能を
共に有していることを報告した。この研究で示された、
単一抗原決定基のみを認識する均一な抗体、即ちモノク
ローナル抗体の概念は、免疫学、医学、薬学、生物学の
分野で太いに注目を集めた。１９７７年Ｗｉｓｔａｒ研
究所のＨ、Ｋ ｏｐｒＯｗｓｋｉらは、明細書の浄書（
内容に変更なし） ウィルス又は悪性腫瘍に対するＭｏｔｈを産生ずるハイ
フリド−マを作製し、Ｍｏｋｂの試薬としての有用性、
有効性を示すと共に治療薬としての可能性を示唆した。
殊に抗悪性腫瘍抗体の作製の報告は、癌特異抗原を特異
的に認識している可能性から、それまで正常細胞へのダ
メージを免れなかった癌の治療という臨床分野に大いに
注目された。
的に認識している可能性から、それまで正常細胞へのダ
メージを免れなかった癌の治療という臨床分野に大いに
注目された。
即ち、癌特異抗原を特異的に認識する抗体によれば、た
とえ同一個体から発生した細胞であっても、正常細胞に
対する反応性は無く、癌細胞のみを特異的に識別するこ
とができる。この抗体自身が細胞傷害性をもつか又は、
この抗体に制ガン剤を結ひつければ、癌細胞のみを標的
とした治療ができると期待された。
とえ同一個体から発生した細胞であっても、正常細胞に
対する反応性は無く、癌細胞のみを特異的に識別するこ
とができる。この抗体自身が細胞傷害性をもつか又は、
この抗体に制ガン剤を結ひつければ、癌細胞のみを標的
とした治療ができると期待された。
この期待を実現−ｒべく、種々の癌細胞に対するＭｏｋ
ｂの作成が試みられて米た（ Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ。
ｂの作成が試みられて米た（ Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ。
ｋｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ７５３４０５ （１９７８）
； Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｔ、 Ａｃａｄ。
； Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｔ、 Ａｃａｄ。
Ｓｅｔ、 ７６１４３８ （１９７９） ； Ｐｒｏｃ
、Ｎａｔｌ、ｋｃａｄ、Ｓｃｉ。
、Ｎａｔｌ、ｋｃａｄ、Ｓｃｉ。
７７ ６８４１ （１９８０） ； Ｂｒ、
Ｊ、Ｇａｎｃｅｒ ４３ ６９６ （１９８１））。
Ｊ、Ｇａｎｃｅｒ ４３ ６９６ （１９８１））。
しかし、得られたＭＯＡｂは正常細胞との交叉反応性を
示すなど、必ずしも癌特異抗原のみを認識しているとは
限らないこと、また、癌特異的である場合でも、この抗
体でｉｎ ｖｉｖｏ系における癌の治療を試みたところ
、一部の白血病などには効果を納めたが、肝癌を代表と
する固型癌には治療効果が認められないことが判明した
（ ＧａｎｃｅｒＲｅｓ、 ４０３１４７（１９８０）
； Ｂｌｏｏｄ ５８１４１ （１９８１） ）。
示すなど、必ずしも癌特異抗原のみを認識しているとは
限らないこと、また、癌特異的である場合でも、この抗
体でｉｎ ｖｉｖｏ系における癌の治療を試みたところ
、一部の白血病などには効果を納めたが、肝癌を代表と
する固型癌には治療効果が認められないことが判明した
（ ＧａｎｃｅｒＲｅｓ、 ４０３１４７（１９８０）
； Ｂｌｏｏｄ ５８１４１ （１９８１） ）。
したがって、癌の治療に使用しうる抗体の条件として、
第一に癌細胞に特異的であり、正常細胞との反応性を持
たぬこと、および第二にｉｎ ｖｉｖ。
第一に癌細胞に特異的であり、正常細胞との反応性を持
たぬこと、および第二にｉｎ ｖｉｖ。
において実際に癌細胞に対する傷害性を有することか要
求されるが、このような要求を同時に満足し、癌の治療
薬として有効なＭｏＡｂは未だ報告されていない。なか
でも、本発明が提供１〜だ肝癌細胞の治療に有用なＭＯ
Ａｈについての報告はない。
求されるが、このような要求を同時に満足し、癌の治療
薬として有効なＭｏＡｂは未だ報告されていない。なか
でも、本発明が提供１〜だ肝癌細胞の治療に有用なＭＯ
Ａｈについての報告はない。
今日、肝癌の治療は切除術の適用が多くを占めているが
、切除術による治療には限界がある。すなわち、肝の７
（）〜８０％は切除可能と言われるが、肝硬変合併例の
場合、切除後に肝再生の期待できない症例もあり、この
ような場合、切除が肝硬変をさらに進行させる。化学療
法剤等の薬剤を用いた肝癌の治療法においても、投与の
時期、方法、部位を工夫するなど種々の方法が試みられ
ているが、未だに確立した方法や満足できる治療効果を
示す例は得られていない。このため肝癌細胞のみを特異
的に認識し、死滅させることのできるＭＯＡｈの開発が
特に望まれている。
、切除術による治療には限界がある。すなわち、肝の７
（）〜８０％は切除可能と言われるが、肝硬変合併例の
場合、切除後に肝再生の期待できない症例もあり、この
ような場合、切除が肝硬変をさらに進行させる。化学療
法剤等の薬剤を用いた肝癌の治療法においても、投与の
時期、方法、部位を工夫するなど種々の方法が試みられ
ているが、未だに確立した方法や満足できる治療効果を
示す例は得られていない。このため肝癌細胞のみを特異
的に認識し、死滅させることのできるＭＯＡｈの開発が
特に望まれている。
（発明が解決しようとする問題点）
本発明者らは、掘υｔυＯ系においても肝癌細胞を特異
的に認識し、および死滅させうるＭ〇八すの作製とその
診断・治療薬への利用を目的として研究を行った結果、
ヒト肝癌細胞に対する特異的な細胞傷害性を有し、１ｎ
ｖｉｖｏでも顕著な抗腫瘍活性を示すＭｏＡＡの開発に
成功し、本発明を完成した。
的に認識し、および死滅させうるＭ〇八すの作製とその
診断・治療薬への利用を目的として研究を行った結果、
ヒト肝癌細胞に対する特異的な細胞傷害性を有し、１ｎ
ｖｉｖｏでも顕著な抗腫瘍活性を示すＭｏＡＡの開発に
成功し、本発明を完成した。
（発明の構成）
本発明の抗体は、ヒト肝癌細胞を特異的に認識するモノ
クローナル抗体である。
クローナル抗体である。
本発明の抗体は、ヒト肝癌細胞で免疫された哺乳動物か
ら取り出した抗体産生細胞と、適当な動物由来の腫瘍細
胞とを融合させ、目的抗体を生産する融合細胞をクロー
ン化して得られる、本発明のバイブリド゛−マを培養し
て製造されろ。
ら取り出した抗体産生細胞と、適当な動物由来の腫瘍細
胞とを融合させ、目的抗体を生産する融合細胞をクロー
ン化して得られる、本発明のバイブリド゛−マを培養し
て製造されろ。
ては、マウス、ラット、ウサギ、モルモット等一般に用
いられている動物が使用できる。例えばマウスに抗原と
するヒト肝癌細胞を腹腔内又は皮下等に接種することに
より免疫する。接種は１回当り１０６〜Ｉ Ｑ ７ｃｅ
ＬＬｓ／ｍ、ｏｌＬｓｅで１〜２週毎に数回くり返す。
いられている動物が使用できる。例えばマウスに抗原と
するヒト肝癌細胞を腹腔内又は皮下等に接種することに
より免疫する。接種は１回当り１０６〜Ｉ Ｑ ７ｃｅ
ＬＬｓ／ｍ、ｏｌＬｓｅで１〜２週毎に数回くり返す。
最終免疫後１〜５日目日日臓を摘出し、抗体産生細胞と
して使用する。次に、この抗体産生細胞と融合させてハ
イプリドーマを得るための親細胞として、ヒポキサンチ
ン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損
（Ｈ（、ＰＲＴ −）あるいはチミジンキナーゼ欠損（
ＴＫ−）の様な、適切な選択マーカーを持ったミエロー
マ等の腫瘍細胞株を用意し、これと抗体産生細胞とを融
合させてハイプリド−マを作製する。
して使用する。次に、この抗体産生細胞と融合させてハ
イプリドーマを得るための親細胞として、ヒポキサンチ
ン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損
（Ｈ（、ＰＲＴ −）あるいはチミジンキナーゼ欠損（
ＴＫ−）の様な、適切な選択マーカーを持ったミエロー
マ等の腫瘍細胞株を用意し、これと抗体産生細胞とを融
合させてハイプリド−マを作製する。
ハイブリドーマ作製は、培地として、イーグルのＭＥＭ
、グル〈ツコの改良ＭＥＭ、ＲＰＭ１１．６４０などの
通常よく使用されているものに１０％０３（ｃａｌｆ
ｓｅｒｒｔｍ、）又は５％Ｆ ＯＳ （ｆｅｔａｌ ｃ
ａｌｆ ｇｅｒｕｍ ）」−５％Ｏ８、あるいは１０％
ＦＯ８を加える。親細胞の通常の維持は、上記のいずれ
でも良いが、ハイブリドーマ作製には１０％ＦＯ８が望
ましい。
、グル〈ツコの改良ＭＥＭ、ＲＰＭ１１．６４０などの
通常よく使用されているものに１０％０３（ｃａｌｆ
ｓｅｒｒｔｍ、）又は５％Ｆ ＯＳ （ｆｅｔａｌ ｃ
ａｌｆ ｇｅｒｕｍ ）」−５％Ｏ８、あるいは１０％
ＦＯ８を加える。親細胞の通常の維持は、上記のいずれ
でも良いが、ハイブリドーマ作製には１０％ＦＯ８が望
ましい。
まず、親細胞であるミエローマ等の腫瘍細胞と牌細胞と
を］：５の比率で用意する。融合剤としては、ＨＶ Ｊ
（Ｈｅｍａｇｇｌａｔｉｎ、ａｔｉｎｇ ｖｉｒｕｓ
ｏｆ Ｊａｐａｎ 。
を］：５の比率で用意する。融合剤としては、ＨＶ Ｊ
（Ｈｅｍａｇｇｌａｔｉｎ、ａｔｉｎｇ ｖｉｒｕｓ
ｏｆ Ｊａｐａｎ 。
別名５ｅｎｔｌａｉ ｖｉｒｕｓ ） 、ポリエチレン
グリコール（ＰＥＧ）などを使用する。特にＰＥＧ１０
０Ｏの３０％〜５０％程度が良い。融合株のＨＡＴ セ
レクションの方法は、既に一般化されているので省略す
る。生じるハイブリド−マのスクリーニング法は、主に
培養−ヒ清を用い、間接ロゼツト法（ＳＰＡ −ｂｉｎ
ｃｌ−３ＲＢＣ法とも呼ばれる。Ｓ Ｐ Ａ ： Ｓ
ｔａｐｈｙｌｏｃｏ −ｃｃｕ、ｓ ａ７ＬｒｅＩＬｓ
ｐｒｏｔｅｉｎｋ 、 ５ＩＲＢＣ： ５ｈｅｅｐ
ＲｅｄＢｌｏｏｄＧｅｔに免疫実験操作法■Ｐ ２３７
５ 、１９７９ 、日本免疫学金線）’＋ ＥＬＩＳ
Ａ法（Ｅｎｚｙｍｅ １ｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏ−ｓ
ｏｒｈｅｎｔ ａｓｓａｙ ） （ＤｙｎａｔｅｃＡ法
）など、公知の方法な用いて目的の免疫グロブリンを分
泌しているハイブリドーマのクローンをひろいあげる。
グリコール（ＰＥＧ）などを使用する。特にＰＥＧ１０
０Ｏの３０％〜５０％程度が良い。融合株のＨＡＴ セ
レクションの方法は、既に一般化されているので省略す
る。生じるハイブリド−マのスクリーニング法は、主に
培養−ヒ清を用い、間接ロゼツト法（ＳＰＡ −ｂｉｎ
ｃｌ−３ＲＢＣ法とも呼ばれる。Ｓ Ｐ Ａ ： Ｓ
ｔａｐｈｙｌｏｃｏ −ｃｃｕ、ｓ ａ７ＬｒｅＩＬｓ
ｐｒｏｔｅｉｎｋ 、 ５ＩＲＢＣ： ５ｈｅｅｐ
ＲｅｄＢｌｏｏｄＧｅｔに免疫実験操作法■Ｐ ２３７
５ 、１９７９ 、日本免疫学金線）’＋ ＥＬＩＳ
Ａ法（Ｅｎｚｙｍｅ １ｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏ−ｓ
ｏｒｈｅｎｔ ａｓｓａｙ ） （ＤｙｎａｔｅｃＡ法
）など、公知の方法な用いて目的の免疫グロブリンを分
泌しているハイブリドーマのクローンをひろいあげる。
クローンは徐々にふやし、ｌ Ｏ” ｃａｌｌｓ／７Ｂ
ｅに達した時点でサブクローニングを行なう。バイブリ
ド−々の単一性を吟味するため、９６穴のマイクロウェ
ルにフィーダーレイア−（ｆｅｅｄ、ｅｒ １ａｙｅｒ
）としてＩＥ常な牌細胞をおよそ］ （１” ｃｅｌ
ｌｓ／ｗｅｌｌまいた」−にハイブリドーマを一穴に１
個より多くならないように（−穴平均確率として０１個
）まき、約１週間培養後生育してくるクローンについて
再びスクリーニングを行なう。このサブクローニングを
くり返−ｔことにより、単一性の本発明ハイブリド−マ
を得ろ。
ｅに達した時点でサブクローニングを行なう。バイブリ
ド−々の単一性を吟味するため、９６穴のマイクロウェ
ルにフィーダーレイア−（ｆｅｅｄ、ｅｒ １ａｙｅｒ
）としてＩＥ常な牌細胞をおよそ］ （１” ｃｅｌ
ｌｓ／ｗｅｌｌまいた」−にハイブリドーマを一穴に１
個より多くならないように（−穴平均確率として０１個
）まき、約１週間培養後生育してくるクローンについて
再びスクリーニングを行なう。このサブクローニングを
くり返−ｔことにより、単一性の本発明ハイブリド−マ
を得ろ。
尚、融合の親細胞としての腫瘍細胞は、マウスミエロー
マ細胞に限られることな（、例えば特願昭５８−７７４
４号に本出願人が開示したハイプリドーマ作製用ヒトメ
ラノーマ細胞ラインを用し・でもよい。
マ細胞に限られることな（、例えば特願昭５８−７７４
４号に本出願人が開示したハイプリドーマ作製用ヒトメ
ラノーマ細胞ラインを用し・でもよい。
次に、本発明の肝癌に特異的なモノクローナル抗体を製
造するために、上記で得られたハイブリドーマを培養容
器中（掘υ１ｔｒｏ）又は動物体内（ｉｎｖｉυＯ）で
培養する。ｉＢ ｖｉｔｒθ系で培養する場合、培地は
先に述べた通常培地にＯ８又はＦｅ２を添加したもので
よ（、この培地で３〜５日培養の後、培養上澄よりＭｏ
Ａｈを得る。ｉｎ ｖｉｖｏ系による培養では、・・イ
ブリドーマを哺乳動物の腹腔に接種し、７〜１４日後に
腹水を採取し、これよりＭ ｏ Ａ ｈを得る。ｉｎ
ｖｉｖｏ系での培養の場合、■ｖｉｔｒｏ系での培養に
比べて遥かに多量の抗体を効率的に取得ｌ−うろので好
ましい。
造するために、上記で得られたハイブリドーマを培養容
器中（掘υ１ｔｒｏ）又は動物体内（ｉｎｖｉυＯ）で
培養する。ｉＢ ｖｉｔｒθ系で培養する場合、培地は
先に述べた通常培地にＯ８又はＦｅ２を添加したもので
よ（、この培地で３〜５日培養の後、培養上澄よりＭｏ
Ａｈを得る。ｉｎ ｖｉｖｏ系による培養では、・・イ
ブリドーマを哺乳動物の腹腔に接種し、７〜１４日後に
腹水を採取し、これよりＭ ｏ Ａ ｈを得る。ｉｎ
ｖｉｖｏ系での培養の場合、■ｖｉｔｒｏ系での培養に
比べて遥かに多量の抗体を効率的に取得ｌ−うろので好
ましい。
こう［〜て得られた培養」二澄又は腹水からのＭｏＡｂ
の精製は、硫安分画、ｐｒｏｔｅｉｎＡセファロースカ
ラム等の公知の方法を適宜組合せて、例えば後記実施例
２に記載した様にして行なうことができる。
の精製は、硫安分画、ｐｒｏｔｅｉｎＡセファロースカ
ラム等の公知の方法を適宜組合せて、例えば後記実施例
２に記載した様にして行なうことができる。
以下、実施例を示すが、これらは特に示さない限り、下
記の条件で行なった。
記の条件で行なった。
培養条目二二５％ＧＯ２，９５％ａｉｒ、湿度約１００
％。
％。
温度３７°Ｃ
培 地： ＲＰＭＩ］６４０ ＋ＩＯ％ＦＣ８（Ｃｊ
・６社オーストラリア製） 動 物： ＢＡＬＢ／Ｃ系マウス（雌 ４週令）明細
書の浄７）（内容に変更なし） 又はＢＡＬＢｌｏＡ−ｒＬｕ／ＪＧＲ系ヌード９マウス
（雌 ６週令） （いずれも日本フレアより購入） 細胞系 ：ヒト肝癌細胞 ＨＧ ｃ−４−ｑウスミニｏ
−マＰ３Ｘ６３−’Ａ！１８．６５３（いずれも、大学
、研究機関等でよく 用いられており、容易に人手１〜うるものである） 実施例１ ハイプリドーマの作成 りＡＬＢ／し系マウスに、ヒト肝癌培養細胞（ＨＣＣ−
４）１０７個／マウスを１週１回、４週間に亘り腹腔内
接種し、最終接種後３日目に牌臓を摘出し、膵臓細胞浮
遊液を調製した。すなわち、ステンレスメツシュで圧迫
、沖過し、培地に浮遊させた。融合の親細胞として、Ｂ
ＡＬＢ／６系マウス由来ミｘ ｏ −−ｒ Ｐ３Ｘ６３
−Ａｇ３．６５３ヲ１０７細胞培養して準備した。
・６社オーストラリア製） 動 物： ＢＡＬＢ／Ｃ系マウス（雌 ４週令）明細
書の浄７）（内容に変更なし） 又はＢＡＬＢｌｏＡ−ｒＬｕ／ＪＧＲ系ヌード９マウス
（雌 ６週令） （いずれも日本フレアより購入） 細胞系 ：ヒト肝癌細胞 ＨＧ ｃ−４−ｑウスミニｏ
−マＰ３Ｘ６３−’Ａ！１８．６５３（いずれも、大学
、研究機関等でよく 用いられており、容易に人手１〜うるものである） 実施例１ ハイプリドーマの作成 りＡＬＢ／し系マウスに、ヒト肝癌培養細胞（ＨＣＣ−
４）１０７個／マウスを１週１回、４週間に亘り腹腔内
接種し、最終接種後３日目に牌臓を摘出し、膵臓細胞浮
遊液を調製した。すなわち、ステンレスメツシュで圧迫
、沖過し、培地に浮遊させた。融合の親細胞として、Ｂ
ＡＬＢ／６系マウス由来ミｘ ｏ −−ｒ Ｐ３Ｘ６３
−Ａｇ３．６５３ヲ１０７細胞培養して準備した。
融合は、既存法（Ｎａｔｕｒｅ ２５６４９５ （１９
７５））に準じて以下の様に行なった。
７５））に準じて以下の様に行なった。
上記で調製したマウス肺臓細胞５×ｌＯ７個とミエロー
マ細胞ｌ×１０７個とを遠心分離チューブに混合し、遠
心したのち」−清をすて、ＲＰＭ１１６４ｆ）で４０％
（で調製したｓ９１Ｊエチレングリコール（ＰＥ（１０
００、和光紬薬）をパックになった細胞の」−に約０．
５ ｍｌ加え、３分静置したのち、５ ＋） ０７′ｐ
ｍで３分間遠心分離し、そののち培地をゆつ（す５ｍ６
程度加え、再度遠心分離し、上清をすてた。次に、’］
：’ −７５（ＦａｌｃｏｎＡ６３０２４ ）に、ゆる
やかにすべての細胞をうつしとり、約４０ｍ１になるよ
うに培地を加え、−晩培養する。次の日にこの培養液を
細胞も含めてすべて遠心チューブに移し取り、遠心分離
を行ない上清をすてた。次にＨＡＴ培地（ＲＰＭ１１６
４０培地、１０％ＦＧＳに終濃度でヒポキサンチイ１０
−４Ｍ、アミノプテリン４Ｘ１０−７Ｍ、チミジン１．
６ Ｘ １０−５Ｍを加える）を４０ｍ１加え、よく攪
拌した後、９６穴マイクロプレート（Ｇｏｓｔａｒ、
／１６３５９６）に約１００ ｔｉｌ／ ｗｅｌｌ宛加
えた。コノ状態で１週間培養すると３０〜５０％程度の
穴にコロニーが認められた。１週間以後より、適宜ＨＴ
培地（ＨＡＴ培地よりアミノプテリンを除いた組成をも
つ）を１滴（約２５〜３０μｌ）各穴に加えた。
マ細胞ｌ×１０７個とを遠心分離チューブに混合し、遠
心したのち」−清をすて、ＲＰＭ１１６４ｆ）で４０％
（で調製したｓ９１Ｊエチレングリコール（ＰＥ（１０
００、和光紬薬）をパックになった細胞の」−に約０．
５ ｍｌ加え、３分静置したのち、５ ＋） ０７′ｐ
ｍで３分間遠心分離し、そののち培地をゆつ（す５ｍ６
程度加え、再度遠心分離し、上清をすてた。次に、’］
：’ −７５（ＦａｌｃｏｎＡ６３０２４ ）に、ゆる
やかにすべての細胞をうつしとり、約４０ｍ１になるよ
うに培地を加え、−晩培養する。次の日にこの培養液を
細胞も含めてすべて遠心チューブに移し取り、遠心分離
を行ない上清をすてた。次にＨＡＴ培地（ＲＰＭ１１６
４０培地、１０％ＦＧＳに終濃度でヒポキサンチイ１０
−４Ｍ、アミノプテリン４Ｘ１０−７Ｍ、チミジン１．
６ Ｘ １０−５Ｍを加える）を４０ｍ１加え、よく攪
拌した後、９６穴マイクロプレート（Ｇｏｓｔａｒ、
／１６３５９６）に約１００ ｔｉｌ／ ｗｅｌｌ宛加
えた。コノ状態で１週間培養すると３０〜５０％程度の
穴にコロニーが認められた。１週間以後より、適宜ＨＴ
培地（ＨＡＴ培地よりアミノプテリンを除いた組成をも
つ）を１滴（約２５〜３０μｌ）各穴に加えた。
ある程度コロニーが生育した後に（１０〜１４日後）培
養上澄を用い、間接ロゼツト法でスクリーニングを行な
い、目的のヒト肝癌（ＨＣｃ−４）に対し、抗体を分泌
しているかどうか検討１−だ。この結果、４つのコロニ
ーがＨｅ ｃ−４に対する抗体を分あしていた。次に、
この４つのコロニーについてサブクローニングを行なっ
た。即ち、９６穴マイクロプレートにフィーダ一層（ｆ
ｅｅｄｅｒ １ａｙｅｒ ）として未処理のＢＡＬＢ／
・、−系マウス牌細胞１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌをま
いた上に、上記で得られたコロニーの細胞を０．１ ｃ
ｅｌｌ、Ａｎｅｌｌとなる様に加え、１週間培養した。
養上澄を用い、間接ロゼツト法でスクリーニングを行な
い、目的のヒト肝癌（ＨＣｃ−４）に対し、抗体を分泌
しているかどうか検討１−だ。この結果、４つのコロニ
ーがＨｅ ｃ−４に対する抗体を分あしていた。次に、
この４つのコロニーについてサブクローニングを行なっ
た。即ち、９６穴マイクロプレートにフィーダ一層（ｆ
ｅｅｄｅｒ １ａｙｅｒ ）として未処理のＢＡＬＢ／
・、−系マウス牌細胞１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌをま
いた上に、上記で得られたコロニーの細胞を０．１ ｃ
ｅｌｌ、Ａｎｅｌｌとなる様に加え、１週間培養した。
得られたクローンについてスクリーニング及びサブクロ
ーニングを行ない、最終的にＨＣＧ−４に対するモノク
ローナル抗体を産生ずる４つのバイブリド９−マを得た
。このうちの１つのハイノリドーマをＨＹ−２０１４と
命名し、これから得られるモノクローナル抗体をＨＣ−
２０１４と命名した。次に、ＨＣ−２０１４の精製法に
ついて述べる。
ーニングを行ない、最終的にＨＣＧ−４に対するモノク
ローナル抗体を産生ずる４つのバイブリド９−マを得た
。このうちの１つのハイノリドーマをＨＹ−２０１４と
命名し、これから得られるモノクローナル抗体をＨＣ−
２０１４と命名した。次に、ＨＣ−２０１４の精製法に
ついて述べる。
明細ｄ）の浄書（内容に変更なし）
実施例２ ’ｋＡｏｋｂの精製および特異性の検討α
）ＢＡＬＢ／Ｃ系マウスの腹腔にＱ、５ ｍｌのブリス
テン（ミネラルオイル）を投与し、７日後にＨＣ−２０
１４産生ハイノリド一マ５×１０６個を腹腔に接種し、
腹水化を行った。接種の２週間後に腹水を採取し、以下
の方法でＭｏｔｈの精製を行なった。
）ＢＡＬＢ／Ｃ系マウスの腹腔にＱ、５ ｍｌのブリス
テン（ミネラルオイル）を投与し、７日後にＨＣ−２０
１４産生ハイノリド一マ５×１０６個を腹腔に接種し、
腹水化を行った。接種の２週間後に腹水を採取し、以下
の方法でＭｏｔｈの精製を行なった。
まず、得られた腹水３０ｍ１を１０，０１１ ＋） ７
戸、 １５ｍ１ｎ遠心後上清に、硫酸アンモニウムを３
３３％の濃度となるように加え、４℃６１Ｊ ｍ１ｒＬ
塩析した。
戸、 １５ｍ１ｎ遠心後上清に、硫酸アンモニウムを３
３３％の濃度となるように加え、４℃６１Ｊ ｍ１ｒＬ
塩析した。
１０．０００７７１ｍ １５ ｍｉｎ遠心後、沈殿物を
ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕ、ｆｆｅｒ −５ａ
ｌｉｎｅ ； ３，１ｍＭ−ＮａＨ２ＰＯ４１，５７７
ＬＭＫＨ２ＰＯ４、２，７ｍＭＫＣｌ、 １３７ｍＭＮ
αＣｌ。
ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕ、ｆｆｅｒ −５ａ
ｌｉｎｅ ； ３，１ｍＭ−ＮａＨ２ＰＯ４１，５７７
ＬＭＫＨ２ＰＯ４、２，７ｍＭＫＣｌ、 １３７ｍＭＮ
αＣｌ。
ＰＨ７，２） ５ｍｌに溶解し、同液３ノに対して一晩
透析を行なった。透析後Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａセファロー
スカラムにかけ、０．１Ｍ酢酸−ＰＢＳ 溶液で溶出し
、浴出液を０．１ Ｎ ＮａＯＨで中和した。
透析を行なった。透析後Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａセファロー
スカラムにかけ、０．１Ｍ酢酸−ＰＢＳ 溶液で溶出し
、浴出液を０．１ Ｎ ＮａＯＨで中和した。
精製されたＭＯＡｈは一８０℃フリーザーで凍結保存ヒ
た。
た。
ｂ）次に、上記σ）で作製したＭＯＡｈのＨＣＧ−４お
よび他の種々の腫瘍細胞に対する反応性について、ＥＬ
ＩＳＡ法および間接ロゼツト法により検討した。
よび他の種々の腫瘍細胞に対する反応性について、ＥＬ
ＩＳＡ法および間接ロゼツト法により検討した。
抗原として次の細胞を用いた。
ＨＣｃ−４抗体産生に用いたヒト肝癌細胞Ａ３４９
ヒト肺癌細胞 ＫＡＴＯｌ［ヒト胃癌細胞 ＡＺ５２１ ／／ ８Ｍ３１４ ヒト結腸癌細胞 これらの抗原を、５倍〜３１２５倍の５倍希釈列のＭｏ
Ａｂ ＨＣ−２０１４と反応させて、ＥＬＩＳＡ法にお
ける反応性を調べた。ＥＬＩＳＡ法には、ザイメド社β
−ｑａｌａｃｔｏ、９ｉｄａｓｅキット（丸首より購入
）を使用した。その結果、第４図に示したように、ＨＣ
−２０１４は抗原であるＨＣＣ−４ヒト肝癌細胞にのみ
反応した。
ヒト肺癌細胞 ＫＡＴＯｌ［ヒト胃癌細胞 ＡＺ５２１ ／／ ８Ｍ３１４ ヒト結腸癌細胞 これらの抗原を、５倍〜３１２５倍の５倍希釈列のＭｏ
Ａｂ ＨＣ−２０１４と反応させて、ＥＬＩＳＡ法にお
ける反応性を調べた。ＥＬＩＳＡ法には、ザイメド社β
−ｑａｌａｃｔｏ、９ｉｄａｓｅキット（丸首より購入
）を使用した。その結果、第４図に示したように、ＨＣ
−２０１４は抗原であるＨＣＣ−４ヒト肝癌細胞にのみ
反応した。
マタ、）（（、−２０１４は間接ロゼツト法においても
、表１に示すように、抗原であるＨＣＣ−４ヒト肝癌細
胞とのみロゼツトを形成し、他の腫瘍細胞に対しては反
応しなかった。
、表１に示すように、抗原であるＨＣＣ−４ヒト肝癌細
胞とのみロゼツトを形成し、他の腫瘍細胞に対しては反
応しなかった。
明細書の浄書（内容に変更なし）
表１ 間接ロゼツト法の結果
肺癌（Ｌｔｔｎ、ｑ Ｃａｒｃｉｎｏｒｎａ） Ａ
５４９ −結腸癌（Ｃｏｌｏｎ Ｇａｒｃｉｎａ
ｍａ） ８Ｍ３１４ −胃癌（Ｃｒａ、９ｔ、ｒ
ｚｃＣａｒｃｉｎｏｍａ） ＫＡＴＯＩＩ−〃
〃 八ｚ５２１ −
肝癌（Ｈｅｐａｔｔｒｒｎａ） ＨＧ ｃ−
４＋実施例３ オクタロニー法によるＭｏｋｈのクラス
。
５４９ −結腸癌（Ｃｏｌｏｎ Ｇａｒｃｉｎａ
ｍａ） ８Ｍ３１４ −胃癌（Ｃｒａ、９ｔ、ｒ
ｚｃＣａｒｃｉｎｏｍａ） ＫＡＴＯＩＩ−〃
〃 八ｚ５２１ −
肝癌（Ｈｅｐａｔｔｒｒｎａ） ＨＧ ｃ−
４＋実施例３ オクタロニー法によるＭｏｋｈのクラス
。
サブクラスの検討
実流側２で得られたＭｏ八すについてオクタロニー法（
ＯａｃｈｔａｔｏｒＬｙ法）により免疫プロズリンのク
ラス、サブクラスを決定した。即ち、１．５％アガロー
ス溶液（０，ｉ月％Ｎ ａ Ｎ ３を含む）をベトリ皿
（内径５２龍）に５．ｍｌ宛加え、約３０分間凝固する
まで待った。次に第５図に示すように凝固アガｒ−スに
穴をあけ、各穴１〜６に下記表２の各抗グロブリン抗体
を５μβづつ加え、中央の穴７には実施例２で精製され
たモノクローナル抗体を明細書の浄書（内容に変更なし
） ■５μｅ加えた。この状態で２４時間放置し、生じた阻
止線をもってモノクローナル抗体のクラスを決定した。
ＯａｃｈｔａｔｏｒＬｙ法）により免疫プロズリンのク
ラス、サブクラスを決定した。即ち、１．５％アガロー
ス溶液（０，ｉ月％Ｎ ａ Ｎ ３を含む）をベトリ皿
（内径５２龍）に５．ｍｌ宛加え、約３０分間凝固する
まで待った。次に第５図に示すように凝固アガｒ−スに
穴をあけ、各穴１〜６に下記表２の各抗グロブリン抗体
を５μβづつ加え、中央の穴７には実施例２で精製され
たモノクローナル抗体を明細書の浄書（内容に変更なし
） ■５μｅ加えた。この状態で２４時間放置し、生じた阻
止線をもってモノクローナル抗体のクラスを決定した。
表２ 使用した抗体
１ ａｎｔｉ −ｈｕｍａｎ Ｉ ｇＭ うさ
ぎ（ヘキスト社製）２ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ
ＩｇＧ うさぎ（〃）３ ａｎｔｉ −ｍｏｗ、
？ｅ ｊｑＧ うさぎ（力はル社製）４ ａｎｔ
ｉ −ｍｏｔｔｓｔ Ｉ ｇＭ ヤ ギ（ヘキス
ト社製）５ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ Ｉｇ（Ｃｒ
モＡ＋Ｍ）ヤギ（〃）６ ａｎｔｉ −ｈｕ、ｍａｎ
Ｉ ｙＡ うさぎ（〃）この結果、得られたモノ
クローナル抗体は３と７の間にのみ、阻止線が生じたこ
とより、マウスＴｇＧであることが中１明した。
ぎ（ヘキスト社製）２ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ
ＩｇＧ うさぎ（〃）３ ａｎｔｉ −ｍｏｗ、
？ｅ ｊｑＧ うさぎ（力はル社製）４ ａｎｔ
ｉ −ｍｏｔｔｓｔ Ｉ ｇＭ ヤ ギ（ヘキス
ト社製）５ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ Ｉｇ（Ｃｒ
モＡ＋Ｍ）ヤギ（〃）６ ａｎｔｉ −ｈｕ、ｍａｎ
Ｉ ｙＡ うさぎ（〃）この結果、得られたモノ
クローナル抗体は３と７の間にのみ、阻止線が生じたこ
とより、マウスＴｇＧであることが中１明した。
次に工ｇＧのサブクラスを検討するために、上記と同様
の実験を行なった。即ち、アガロース上に第６図の如く
穴をあけ】から４までに各サブクラスの抗体（表３）を
５μβ宛入れ、中央の５に得明細書の浄書（内容に変更
なし） られたモノクローナル抗体（Ｈｅ−２０１４）を１５μ
ｌ加え、２４時間室温で放置した。
の実験を行なった。即ち、アガロース上に第６図の如く
穴をあけ】から４までに各サブクラスの抗体（表３）を
５μβ宛入れ、中央の５に得明細書の浄書（内容に変更
なし） られたモノクローナル抗体（Ｈｅ−２０１４）を１５μ
ｌ加え、２４時間室温で放置した。
表３ 使用した抗体
１ ａｎｔｉ−ｍｏｕ、、？ｇ ＩｙＧｌ
うさぎ（マイルス社製）２ ａｎｔｉ −ｍｏｕ、、
？ｅ ＩｇＧ２ａ うさぎ（〃）３ σｎｔｉ−
ｍｏＬＬｓｅ ＩｇＧ２Ａ うさぎ（〃）４
ａｎｔｉ −ｍｏｔｂｓｔ ＩｇＧ３ うさぎ
（〃）これらの結果より、得られたモノクローナル抗体
（）（（３−２０１４）は２と５の間に阻止線が生じた
ことから工ｇＧ２αであることが判った。
うさぎ（マイルス社製）２ ａｎｔｉ −ｍｏｕ、、
？ｅ ＩｇＧ２ａ うさぎ（〃）３ σｎｔｉ−
ｍｏＬＬｓｅ ＩｇＧ２Ａ うさぎ（〃）４
ａｎｔｉ −ｍｏｔｂｓｔ ＩｇＧ３ うさぎ
（〃）これらの結果より、得られたモノクローナル抗体
（）（（３−２０１４）は２と５の間に阻止線が生じた
ことから工ｇＧ２αであることが判った。
さらに、ハイプリド−マが分泌する抗体の単一性は、Ｓ
ＤＳ ポリアクリルアミド９ゲル電気泳動法により確認
した。
ＤＳ ポリアクリルアミド９ゲル電気泳動法により確認
した。
実施例４ ｔｎ ｕｔｔｒｏにおけるＨｑ−２０１４
のＡＤＣＣ−外焦−−−−−−−−−−−−−−一本発
明のモノクローナル抗体が、エフェクター細胞の存在下
にヒト肝癌細胞を攻撃して死滅させうることをｉｎ ｖ
ｉｔｒｏで調べるため、ＨＣ−２０１４のヒト肝癌細胞
（ＨＣｃ−４）に対する細胞傷害性を、ヒト胃癌に対す
るモノクローナル抗体（ＹＫＯ２４）を対照として、Ａ
ＤＣＣ活性（Ａｎｔｉｂｏｄｙ −ｄ、ｅｐｅｎｄｅｎ
ｔＣｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉ
ｔｙ ）により検討した。
のＡＤＣＣ−外焦−−−−−−−−−−−−−−一本発
明のモノクローナル抗体が、エフェクター細胞の存在下
にヒト肝癌細胞を攻撃して死滅させうることをｉｎ ｖ
ｉｔｒｏで調べるため、ＨＣ−２０１４のヒト肝癌細胞
（ＨＣｃ−４）に対する細胞傷害性を、ヒト胃癌に対す
るモノクローナル抗体（ＹＫＯ２４）を対照として、Ａ
ＤＣＣ活性（Ａｎｔｉｂｏｄｙ −ｄ、ｅｐｅｎｄｅｎ
ｔＣｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉ
ｔｙ ）により検討した。
ＨＣｃ−４を９６穴マイクロプレートに１０５ｃｅｌｌ
ｓ／ｗｅｌｌの割合でまき、−晩培養した。これに、実
施例２で得たＨＣ−２０１４又は、ＹＫＯ２４を０゜０
．１ 、０．５ 、２．５ Ｗｒｙ／ｒｒｔｌｊとなる
様に加え、３０分間Ｃ○２インキュベータに放置した後
、ＰＢＳを用いて３回洗浄した。次にエフェクター細胞
としてＢ Ａ Ｌ Ｂ／ ｃ系マウスの牌臓細胞を１０
６ ｃｅｌｌｓ１ｗｅｌｌ宛加え、−晩培養した後ＰＢ
Ｓで３回洗浄し、各ｗｅｌｌのＨＧ Ｃ−４の生存の有
無を判定した。判定はトリパンブルーで染色後、生細胞
を算定することにより行なった。
ｓ／ｗｅｌｌの割合でまき、−晩培養した。これに、実
施例２で得たＨＣ−２０１４又は、ＹＫＯ２４を０゜０
．１ 、０．５ 、２．５ Ｗｒｙ／ｒｒｔｌｊとなる
様に加え、３０分間Ｃ○２インキュベータに放置した後
、ＰＢＳを用いて３回洗浄した。次にエフェクター細胞
としてＢ Ａ Ｌ Ｂ／ ｃ系マウスの牌臓細胞を１０
６ ｃｅｌｌｓ１ｗｅｌｌ宛加え、−晩培養した後ＰＢ
Ｓで３回洗浄し、各ｗｅｌｌのＨＧ Ｃ−４の生存の有
無を判定した。判定はトリパンブルーで染色後、生細胞
を算定することにより行なった。
結果を表４に示した。表中、生存率が１０％以下のもの
をＡＤＣＣ活性陽活性陽性上て示す。
をＡＤＣＣ活性陽活性陽性上て示す。
明細書の浄書（内容に変更なし）
表４
抗体の濃度 モノクローナル抗体２．５
− 十−−−０，５−十−− ０，１−十−−− ｏ −−−一 実施例５ 腹水癌モデルに対するＨＣ−２０１４の本発
明のモノクローナル抗体が、講υｉｖｏ においてもヒ
ト肝癌細胞傷害性であることを確認するため、ヌードマ
ウスによるモデル試験を行なった。
− 十−−−０，５−十−− ０，１−十−−− ｏ −−−一 実施例５ 腹水癌モデルに対するＨＣ−２０１４の本発
明のモノクローナル抗体が、講υｉｖｏ においてもヒ
ト肝癌細胞傷害性であることを確認するため、ヌードマ
ウスによるモデル試験を行なった。
ヌードマウスを１群６匹に分け、腹腔にＨＣＧ−４細胞
を２Ｘ１０７個接種し、接種口を０日目として１．３．
５日目に実施例２で得たＭＯＡｈＨｅ−２０１４を１．
５１Ｒ９又は３．０■腹腔内投与し、未投与群を対照と
して生存日数から延命率（ＩＬＳ％）を求めたと明細書
の浄書（内容に変更なし） ころ、２００％以上という高い値を示した。又、Ｈ（３
−２０１４投与直後及び投与中には、体重の減少並びに
毒性症状は認められなかった。なお、延命率（ＩＬＳ％
）は次の式で求めた。
を２Ｘ１０７個接種し、接種口を０日目として１．３．
５日目に実施例２で得たＭＯＡｈＨｅ−２０１４を１．
５１Ｒ９又は３．０■腹腔内投与し、未投与群を対照と
して生存日数から延命率（ＩＬＳ％）を求めたと明細書
の浄書（内容に変更なし） ころ、２００％以上という高い値を示した。又、Ｈ（３
−２０１４投与直後及び投与中には、体重の減少並びに
毒性症状は認められなかった。なお、延命率（ＩＬＳ％
）は次の式で求めた。
各群のマウスの生存日数を第２図に示した。
一方、ＨＣＣ−４のかわりに、８Ｍ３１４ （ヒト結腸
癌培養細胞系）を用いて同様に実験したところ、対照群
との間に差は認められなかった。結果を第３図に示した
。
癌培養細胞系）を用いて同様に実験したところ、対照群
との間に差は認められなかった。結果を第３図に示した
。
実施例６ 固型癌モデルに対するＨＣ−２０１４の抗腫
瘍効果 ヌードマウスを１群６匹に分け、背部皮下にＨ（３０−
４細胞を１ｘ１０７個接種しく０日目）、実をはかり、
Ｈｅ−２０１４未投与群を対照としてＴ／Ｃ％を次の式
で求めた。
瘍効果 ヌードマウスを１群６匹に分け、背部皮下にＨ（３０−
４細胞を１ｘ１０７個接種しく０日目）、実をはかり、
Ｈｅ−２０１４未投与群を対照としてＴ／Ｃ％を次の式
で求めた。
明細書の６１店（内容に変更なし）
結果を第１図に示した。図から明らかなとおり、対照群
の一匹が死亡した時点（８０日目）でＴ／（３％は１０
％以下であった。このことは、本発明のモノクローナル
抗体の投与により、背部の固型隔意味する。
の一匹が死亡した時点（８０日目）でＴ／（３％は１０
％以下であった。このことは、本発明のモノクローナル
抗体の投与により、背部の固型隔意味する。
（発明の効果）
本発明により得られるモノクローナル抗体は、免疫原で
あるヒト肝癌細胞とのみ特異的に結合し、ｉｎ ｖｉｔ
ｒｏにおいてＡＤＣＣ活性を、１ｒＬｖｉｖｏ におい
て顕著な抗腫瘍活性を示すことより、ＥＩＡ法、ＲＩＡ
法等による、試薬、診断薬として、さらに肝癌の治療薬
としての可能性が期待できる。
あるヒト肝癌細胞とのみ特異的に結合し、ｉｎ ｖｉｔ
ｒｏにおいてＡＤＣＣ活性を、１ｒＬｖｉｖｏ におい
て顕著な抗腫瘍活性を示すことより、ＥＩＡ法、ＲＩＡ
法等による、試薬、診断薬として、さらに肝癌の治療薬
としての可能性が期待できる。
第１図はＨＧ Ｃ−４固型癌モデルに対する本発明のモ
ノクローナル抗体の抗腫瘍効果を示すグラフであり、 第２図はＨＣＣ−４腹水癌モデルに対する本発明のモノ
クローナル抗体の抗腫瘍効果を示すグラフであり、 第３図は第２図におけるＨＣＣ−４細胞の代りに８Ｍ３
］４細胞を用いて行った試験の結果を示すグラフであり
、 第４図は本発明のモノクローナル抗体の特異性をＥＬＩ
ＳＡ法で検討した結果を示すグラフであり、第５図およ
び第６図は夫々、実施例２のモノクローナル抗体のクラ
ス及びサブクラスを同定するためのオクタロニー法を説
明する図である。 特許出願人 サントリー株式会社 （外５名） 第４図 抗イソドＪイｉ岸尺イ千デ牧 第６図
ノクローナル抗体の抗腫瘍効果を示すグラフであり、 第２図はＨＣＣ−４腹水癌モデルに対する本発明のモノ
クローナル抗体の抗腫瘍効果を示すグラフであり、 第３図は第２図におけるＨＣＣ−４細胞の代りに８Ｍ３
］４細胞を用いて行った試験の結果を示すグラフであり
、 第４図は本発明のモノクローナル抗体の特異性をＥＬＩ
ＳＡ法で検討した結果を示すグラフであり、第５図およ
び第６図は夫々、実施例２のモノクローナル抗体のクラ
ス及びサブクラスを同定するためのオクタロニー法を説
明する図である。 特許出願人 サントリー株式会社 （外５名） 第４図 抗イソドＪイｉ岸尺イ千デ牧 第６図
Claims (17)
- （１）ヒト肝癌細胞で感作された哺乳動物の抗体産生細
胞と腫瘍細胞との融合細胞から作られる、ヒト肝癌細胞
を特異的に認識するモノクローナル抗体。 - （２）ヒト肝癌細胞がライン化されたものである特許請
求の範囲第１項記載のモノクローナル抗体。 - （３）ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて
、ヒト肝癌細胞に対する細胞傷害性を有する特許請求の
範囲第１項又は第２項に記載のモノクローナル抗体。 - （４）オクタロニー法による検定により、ＩｇＧ＿２＿
ａサブクラスに属する特許請求の範囲第１項ないし第３
項のいずれかに記載のモノクローナル抗体。 - （５）腫瘍細胞がマウスミエローマである特許請求の範
囲第１項ないし第４項のいずれかに記載のモノクローナ
ル抗体。 - （６）ヒト肝癌細胞がＨＣ Ｃ−４である特許請求の範
囲第１項ないし第４項のいずれかに記載のモノクローナ
ル抗体。 - （７）哺乳動物がマウスである特許請求の範囲第１項な
いし第４項のいずれかに記載のモノクローナル抗体。 - （８）ＨＣ−２０１４と命名された特許請求の範囲第７
項記載のモノクローナル抗体。 - （９）ヒト肝癌細胞で感作された哺乳動物の抗体産生細
胞と、前記哺乳動物と同種又は異種の動物の腫瘍細胞と
の融合細胞からクローン化して得られる、ヒト肝癌細胞
を特異的に認識するモノクローナル抗体を産生するハイ
ブリドーマ。 - （１０）哺乳動物がマウスである特許請求の範囲第９項
記載のハイブリドーマ。 - （１１）ヒト肝癌細胞がＨＣ Ｃ−４培養細胞系である
特許請求の範囲第９項記載のハイブリドーマ。 - （１２）腫瘍細胞がミエローマである特許請求の範囲第
９項記載のハイブリドーマ。 - （１３）産生されるモノクローナル抗体がＩｇＧ＿２＿
ａサブクラスに属する免疫グロブリンである特許請求の
範囲第１２項記載のハイブリドーマ。 - （１４）ＨＹ−２０１４と命名された特許請求の範囲第
１３項記載のハイブリドーマ。 - （１５）ヒト肝癌細胞で感作された哺乳動物の抗体産生
細胞と、前記哺乳動物と同種又は異種の動物の腫瘍細胞
との融合細胞からクローン化された、ヒト肝癌細胞を特
異的に認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリ
ドーマを、培養容器中又は哺乳動物体内で増殖させ、モ
ノクローナル抗体を生成蓄積させ、これを採取すること
よりなる、ヒト肝癌細胞を特異的に認識するモノクロー
ナル抗体の製造法。 - （１６）ヒト肝癌細胞を特異的に認識するモノクローナ
ル抗体を有効成分として含む肝癌治療用組成物。 - （１７）ヒト肝癌細胞を特異的に認識するモノクローナ
ル抗体を含む肝癌診断用組成物。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59134556A JPS6115897A (ja) | 1984-06-29 | 1984-06-29 | ヒト肝癌細胞を特異的に認識するモノクロ−ナル抗体 |
| US06/749,564 US4820641A (en) | 1984-06-29 | 1985-06-27 | Monoclonal antibody capable of specifically distinguishing human hepato-carcinoma cells |
| DE8585108073T DE3580524D1 (de) | 1984-06-29 | 1985-06-28 | Monoklonaler antikoerper geeignet zur spezifischen unterscheidung von humanen hepatokarzinomzellen. |
| EP85108073A EP0166458B1 (en) | 1984-06-29 | 1985-06-28 | Monoclonal antibody capable of specifically distinguishing human hepato-carcinoma cells |
| AT85108073T ATE58397T1 (de) | 1984-06-29 | 1985-06-28 | Monoklonaler antikoerper geeignet zur spezifischen unterscheidung von humanen hepatokarzinomzellen. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59134556A JPS6115897A (ja) | 1984-06-29 | 1984-06-29 | ヒト肝癌細胞を特異的に認識するモノクロ−ナル抗体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6115897A true JPS6115897A (ja) | 1986-01-23 |
| JPH0431674B2 JPH0431674B2 (ja) | 1992-05-27 |
Family
ID=15131083
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59134556A Granted JPS6115897A (ja) | 1984-06-29 | 1984-06-29 | ヒト肝癌細胞を特異的に認識するモノクロ−ナル抗体 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4820641A (ja) |
| EP (1) | EP0166458B1 (ja) |
| JP (1) | JPS6115897A (ja) |
| AT (1) | ATE58397T1 (ja) |
| DE (1) | DE3580524D1 (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6357596A (ja) * | 1986-08-29 | 1988-03-12 | Nisshin Flour Milling Co Ltd | モノクロ−ナル抗体、その製法およびそれからなる肝疾患診断剤 |
| JPS63290898A (ja) * | 1987-05-23 | 1988-11-28 | Hagiwara Yoshihide | ガン関連抗原特異的ヒト免疫グロブリン生産性ヒト／ヒトハイブリド−マ及びその生産する抗体 |
| JPH05207876A (ja) * | 1991-11-25 | 1993-08-20 | Hagiwara Yoshihide | ガン関連抗原特異的ヒト免疫グロブリン生産性ヒト／ヒトハイブリドーマ |
| JPH05268988A (ja) * | 1992-03-05 | 1993-10-19 | Hagiwara Yoshihide | ガン関連抗原特異的ヒト免疫グロブリン |
| JP2004529849A (ja) * | 2000-09-01 | 2004-09-30 | インターナショナル バイオイムン システムズ，インコーポレーテッド | 扁平上皮癌に対する特異的モノクローナル抗体の同定と開発 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5760000A (en) * | 1994-05-13 | 1998-06-02 | University Technologies International,Inc. | Inhibition of liver cancer by the use of GnRH and GnRH analogs |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4579827A (en) * | 1983-03-11 | 1986-04-01 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Monoclonal antibodies to human gastrointestinal cancers and hybridoma method of production of the monoclonal antibodies |
-
1984
- 1984-06-29 JP JP59134556A patent/JPS6115897A/ja active Granted
-
1985
- 1985-06-27 US US06/749,564 patent/US4820641A/en not_active Expired - Fee Related
- 1985-06-28 DE DE8585108073T patent/DE3580524D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-06-28 AT AT85108073T patent/ATE58397T1/de active
- 1985-06-28 EP EP85108073A patent/EP0166458B1/en not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| HEPATOLOGY=1982 * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6357596A (ja) * | 1986-08-29 | 1988-03-12 | Nisshin Flour Milling Co Ltd | モノクロ−ナル抗体、その製法およびそれからなる肝疾患診断剤 |
| JPS63290898A (ja) * | 1987-05-23 | 1988-11-28 | Hagiwara Yoshihide | ガン関連抗原特異的ヒト免疫グロブリン生産性ヒト／ヒトハイブリド−マ及びその生産する抗体 |
| JPH05207876A (ja) * | 1991-11-25 | 1993-08-20 | Hagiwara Yoshihide | ガン関連抗原特異的ヒト免疫グロブリン生産性ヒト／ヒトハイブリドーマ |
| JPH05268988A (ja) * | 1992-03-05 | 1993-10-19 | Hagiwara Yoshihide | ガン関連抗原特異的ヒト免疫グロブリン |
| JP2004529849A (ja) * | 2000-09-01 | 2004-09-30 | インターナショナル バイオイムン システムズ，インコーポレーテッド | 扁平上皮癌に対する特異的モノクローナル抗体の同定と開発 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0166458A3 (en) | 1988-05-18 |
| EP0166458B1 (en) | 1990-11-14 |
| DE3580524D1 (de) | 1990-12-20 |
| JPH0431674B2 (ja) | 1992-05-27 |
| US4820641A (en) | 1989-04-11 |
| EP0166458A2 (en) | 1986-01-02 |
| ATE58397T1 (de) | 1990-11-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110294807B (zh) | 抗tim-3抗体 | |
| US4489710A (en) | Composition and method for transplantation therapy | |
| JP2017538441A (ja) | 抗ｔｉｍ−３抗体 | |
| US20130267688A1 (en) | Novel antibody structures derived from human germline sequences | |
| JP2019514355A (ja) | 抗人ｐｄ−１人源化単クローン抗体及び応用 | |
| JPS62187417A (ja) | 緑膿菌血清型に対する交さ反応性かつ交さ防御性単クロ−ン性抗体 | |
| JPH0634712B2 (ja) | 肝炎ｂウイルスに対する単クローン性抗体産生ハイブリツドマ細胞系 | |
| CN1418225B (zh) | 人低密度脂蛋白受体的单克隆抗体及其制备和用途 | |
| EP0057107A2 (en) | Method of manufacturing monoclonal antibodies and cells capable of manufacturing such antibodies | |
| JPS6115897A (ja) | ヒト肝癌細胞を特異的に認識するモノクロ−ナル抗体 | |
| MXPA06009759A (es) | Codocito para trastornos por linfocitos b. | |
| AU636867B2 (en) | Rat monoclonal antibodies directed against human antigens and processes for preparation thereof | |
| JPH05170667A (ja) | バイスペシフィック抗体 | |
| Seida et al. | Hybridomas producing monoclonal antibodies against tetanus toxin replaces the polyclonal horse anti-tetanic serum | |
| TW202039582A (zh) | 抗ＥｐＣＡＭ抗體及其應用 | |
| US20250129155A1 (en) | Humanized antibody specific for cd47 and pharmaceutical composition for preventing or treating cd47-related diseases comprising the same | |
| JPS6261596A (ja) | 薬剤耐性癌に関するモノクロ−ナル抗体およびその製造 | |
| RU2003682C1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS MUSCULUS L. - продуцент моноклональных антител к @ -легким цеп м иммуноглобулинов человека | |
| RU1801117C (ru) | Способ получения монокло- нального антитела к моноклональному антителу к белку т4 лимфоцита человека, культивируемая клетка гибридомы jthfs-про- дуцентмоноклонального антитела к моноклональному антителу к белку т4 лимфоцита чело- века, культивируемая клетка гибридомы jti-if3-f5 - продуцент моноклонального антитела к моноклональному антителу к белку т4 лимфоцитачеловека, культивируемая клетка гибридомы jti-id7 - про- дуцент моноклонального антитела к моноклональному антителу к белку т4 лимфоцита человека, культивируемая клетка гибридомы jt2-n15 - продуцент моноклонального антитела к моноклональному антителу к белку т4 лимфоцитачеловека | |
| RU2010856C1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus musculus l., используемый для получения преципитирующих моноклональных антител к jgg человека | |
| JPH06504916A (ja) | 高親和性擬人化モノクローナル抗体 | |
| KR101388680B1 (ko) | 광견병 바이러스를 중화시킬 수 있는 결합 분자 | |
| RU2008350C1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus musculus l., используемый для получения моноклональных антител к jgg человека | |
| JP2599258B2 (ja) | ガン関連抗原特異的ヒト免疫グロブリン生産性ヒト／ヒトハイブリドーマ | |
| Ganguly et al. | Chapter-3 Production of Monoclonal Antibodies |