JPS61177996A - インタ−フエロン−γの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔技術分野〕 本発明は、インターフェロン−Ｔの遺伝子工学手法によ
る製造法に関する。

〔従来技術の説明〕

遺伝子工学手法は、有用な異種蛋白質の生産をはじめと
してその用途は広い。

現在、遺伝子工学手法における宿主としては、大腸菌、
枯草菌、酵母等が主として用いられる。

大腸菌は、その発現系等の遺伝子の解明が進んでいるこ
とから、最も容易に宿主として用いられる。

しかし、大腸菌を利用した場合、異種蛋白質は、菌体内
に産生されたまま残存するため、菌体内酵素による分解
等によって必ずしも効率的に異種蛋白質を回収できない
。一方、枯草菌を宿主として使用する場合、異種蛋白質
は、菌体外に分泌されることから、より効率的に生産さ
れた異種蛋白質を回収できる。しかし、枯草菌等では、
発現系に未知な部分が多く、必ずしも工業的生産に利用
するのは、未だ適当ではない。

〔発明が解決しようとする問題点〕

本発明の目的は、インターフェロン−Ｔを、グラム陰性
細菌を用いて、ペリプラズムに分泌させる系の確立にあ
る。さらに詳しくは、本発明の目的は、発現系遺伝子と
して、グラム陽性細菌、特に納豆菌由来のα−アミラー
ゼプロモーター部分を含む系、宿主として、グラム陰性
細菌を用い、インターフェロン−γをペリプラズムに分
泌させる遺伝子工学手法の提供にある。

〔問題点を解決するための手段及び作用の説明〕（ａ）
発現系遺伝子の調製 本発明において、発現系遺伝子としては、グラム陽性細
菌由来の系が用いられる。グラム陽性細菌としては、枯
草菌、納豆菌等のＢａｃｉｌｌｕｓ属の細菌が好適に用
いられる０発現系遺伝子とは、プロモーター、ＳＤ配列
、シグナル配列等を意味し、これらの遺伝子の由来が、
グラム陽性細菌由来である。好適な発現系遺伝子として
、α−アミラーゼプロモーター遺伝子系が例示される。

α−アミラーゼ遺伝子は、微工研条寄第５３９号（Ｆ［
！ＲＭＢＰ−５３９）として寄託されているＢａｃｉｌ
ｌｕｓｎａｔｔｏ　ＧＣ１６１から本発明の共同研究者
等が単離している（特願昭５９−１２８７４０　、用辺
他）。第１表にα−アミラーゼプロモーター及びシグナ
ル配列部分を含む塩基配列を示す。このプロモーター系
遺伝子を含むプラスミドは、微工研条寄第６４５号（Ｆ
ＥＲＭ　　ＢＰ−６４５）として寄託されているＢａｃ
ｉｌｌｕｓ　ｎａｔｔｏから由来するプラスミドｐＧＣ
２００からの誘導体であるｐＧｃ３０３として提供され
る（特願昭５９−１２８７４０）。ｐＧｃ３０３の制限
酵素地図は第１図に示す。

（ｂｌグラム陰性細菌用発現ベクターの調製（ａ）で調
製された発現系遺伝子は、ついで、大腸菌゛のようなグ
ラム陰性細菌由来のプラスミド、例　　　　　　。

えばｐＢＲ３２２に挿入し、グラム陽性細菌由来の発現
系遺伝子の働きによって、グラム陰性細菌において、イ
ンターフェロン−γの発現可能なプラスミドを調製する
。

（Ｃ）インターフェロン−γ遺伝子との連結〜）で得ら
れたグラム陰性細菌発現用ベクターのプロモーター、Ｓ
Ｄ配列、シグナル配列の下流に、インターフェロン−γ
をコードする遺伝子を既知の制限酵素とりガーゼによる
処理によって連結し、これを適当な宿主に導入する。

（ｄ）形質転換 宿主としては、グラム陰性細菌、とりわけ大腸菌が好ま
しい。宿主の形質転換は、例えば公知の方法（Ｃｏｈｅ
ｎ、　Ｓ、Ｎ、らＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、
　Ｓｃｉ。

ｔｌｓＡ　６９．２１１０　（１９７２）　）により行
う。

（ｅ）宿主の培養 ＋ｄ＋によって得られた形質転換株は、宿主の自体公知
の培地で培養する。培地としては、例えば、Ｐａ１ｖａ
　ら（Ｇｅｎｅ、　２２．２２９　（１９８３））の使
用した枯草菌用培地に準じたものが好適に例示される。

培養は、通常１５〜４３℃で３〜２４時間行い、必要に
より、通気や攪拌を加えることもできる。

（「）インターフェロン−Ｔの回収 培養後、公知の方法（例えば遠心分離）によって菌体を
集め、ペリプラズム中に分泌した蛋白質を回収する公知
の方法〔例えば、浸透圧ショック法（Ｎａｎｃｙ、　Ｇ
、Ｎ、　ａｎｄ　Ｌｅａｎ、　Ａ、Ｈ，Ｊ、　Ｂｉｏｌ
、　Ｃｈｅｗ。

２４１、３０５５　（１９６６））　）に準じて、ベリ
プラズミック画分を回収する。この両分からの１゛ンタ
ーフェロン−Ｔの回収は、自体公知の方法、例えばアフ
ィニティクロマトグラフィー、溶解度差に基づく分画に
よってなされる。

ｒｙｅｓ明のりｈ！！］ 本発明によって、グラム陽性細菌由来の発現系遺伝子を
用いて、グラム陰性細菌にインターフェロン−Ｔの生産
を達成することが可能となり、遺伝子工学手法における
技術的な多様性を達成した。

また、インターフェロン−γをグラム陰性細菌にペリプ
ラズム中に分泌させ、このペリプラズムへ分泌される際
に、シグナルペプチドが切断され、Ｎ末端にメチオニン
が付かないｍａｔｕｒｅな蛋白質が得られることに成功
し、遺伝子工学手法による効率的なインターフェロン−
Ｔの製造方法を提供した。

〔実施例〕

以下に、ヒトインターフェロン−γ（以下、ＩＦＮ−γ
）を、グラム陽性細菌の発現系遺伝子として納豆菌由来
のα−アミラーゼプロモーター部分を含む系及び宿主と
して大腸菌を用いて製造する方法を示した。

（ａ１発現系遺伝子の調製 Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｎａｔｔｏ　　Ｇ　Ｃ１６１（微工
研条寄第５３９号（ＦＥＲＭ　ＢＰ−５３９）　）の−
夜培養液１１を遠心、洗浄して得た菌体に１０１の２０
％シｇ糖加５０ｍＭ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）
　、１００＋ｇのリゾチームを加えて、３７℃、１５分
間反応後、１％ザルコシルー１％ＥＤＴＡ溶液１０ｍ１
．プロナーゼＥ　（１００＋ｓｇ／ｍｌ）　ｌａｌを加
え、３７℃で１６時間放置した。この溶液をＴＢＳ溶液
（Ｔｒｉｓ　ＨＩＪ３０ｍＭ、　ＮａＣｊ！　５０＋＋
Ｍ、　ＥＤＴＡ　５＋ｗＭ、　ｐＨ８）にて３５ａ＋１
とし、塩化セシウム３５ｇ、エチジウムブロマイド（１
０ｍｇ／ｎｌ）　　ｌａｌを加え、６０．００Ｏｒｐｍ
　（ベックマン７０．Ｉ　Ｔｉローター）で１６時間遠
心した。

染色体ＤＮＡバンドを分取し、ＴＥＳ溶液にて透析後、
フェノール処理を２回して、染色体ＤＮＡを精製した。

得られた染色体ＤＮＡを制限酵素Ｐｖｕ　Ｕ、ＢｇｌＩ
Ｉ　、Ｈｐａｌ、　Ｂａ＋＋＋ｌｌ　Ｉ　、旧ｎｄｎ１
等で切断後、０．８％アガロースゲルから抽出し、各種
プラスミドｐｃｔ９４、ｐＥ１９４、ｐＵＢｌｌｏ及び
ｐｃ１９４の誘導体であるｐＧｃ２００　　（微工研条
寄第６４５号）に連結して、Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ　
（ｒｅｃ−、ａｍｙ−）に形質転換した。形質転換株は
、各プラスミドのＬ−寒天−１％溶性デンプン）に播取
して、３７℃、２日間培養後、ヨード溶液（０，１％ヨ
ウ素−１％Ｋｌ）を寒天平板に加え、ヨードの脱色にて
α−アミラーゼ活性をチェックした。使用した５種類の
制限酵素のうち、Ｈｉｎｄｌ［［で納豆菌染色体ＤＮＡ
を切断して、ｐＧｃ２ＱＱの旧ｎｄ０１部位に連結した
プラスミドにα−アミラーゼ活性を示す株を得た。挿入
した染色体ＤＮＡ断片は７Ｋｂであった。そこで、制限
酵素ＨｉｎｄｌｌＩ、Ｒｓａｌを用いてα−アミラーゼ
遺伝子を含む７ＫｂのＤＮＡを切断し、ｐＢＲ３２２の
ＥｃｏＲＩ−旧ｎｄｎＩ断片に挿入し、ｐＧＣ３０２を
得、次にこれをＳａｃ　ＩＩで切断した後、連結してｐ
ＧＣ：３０３（７，９Ｋｂ）を得たく第２図）。

形質転換は常法に従い、アンピシリンで選択し、上記と
同様にしてα−アミラーゼ活性をチェックしたところ、
α−アミラーゼが発現したことが確認され、全α−アミ
ラーゼ遺伝子を含んでいることが確認された。かくして
、α−アミラーゼプロモーター、シグナル配列、および
α−アミラーゼの構造遺伝子を含むプラスミドｐＧｃ３
０３を得た。

α−アミラーゼプロモーター部位及びシグナル配列を、
マクサム−ギルバートの方法（Ｍａｘａｍ、　Ａ。

ａｎｄ　Ｇ１１ｂｅｒｔ、　Ｗ、　１９７９．　Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ嬰、　４９９−
５６０）を用いてＤＮＡ配列を決定した（第１表）。

（以下余白） 山）大腸菌用分泌発現ベクターの調製 第３図および第４図に示した手順に従って、ｐＧＣ３０
３とｐＢＲ３２２から、大腸菌用分泌発現ベクターを調
製した。

工程ｌ：　制限酵素Ｂａｎ１ＩＩ、Ｂａｎ　ＩＩを用い
て、ｐＧｃ３０３を消化処理して、α−アミラーゼのプ
ロモーター、シグナル配列を含む比較的大きいＤＮＡ断
片を得た。消化処理は、以下の反応液組成によった。

１）　ＧＣ３０３（１，０ｐｇ／ｐＪ）　　　　　　１
００ｐａ１０ＸＢｃｌＩ用緩衝液１１１　　　　　　　
２０．ＪＲａｎ　ＩＩ　（８Ｕ／　Ｐｔ、東洋紡）　　
　　　２０μＲａｎ　Ｉ［ｒ　（５１Ｊ／ｐ−１１、東
洋紡）　　　　　　　２０ＰｔＨ，Ｏ−虹ｌ己 総計２００μ 反応は、３７℃で一夜行った。反応完了後、反応液全量
を１％アガロースゲルにアプライし・電気泳動を行った
。９６０ｂｐの断片をＤＥＡＥ　−ｐａｐｅｒに吸着後
回収し、エタノール沈澱のキャリアーとして、ｔＲＮＡ
６０／Ａｇを添加した。これをフェノール抽出後、エタ
ノール沈澱し、ＤＮＡを回収した。ＤＮＡの沈澱は、９
０−のＨ８０に溶解した。

工程２：　以下の反応液組成で、工程１で得られた断片
のＡｌｕ　Ｉによる部分消化を行った。

工程１で得られたＤＮＡ断片の溶液　　５０μｍ０ＸＡ
１ｕＩ緩衝液”　　　　　　　　　２０ｄＡｌｕｌ　　
（２Ｕ／ｐＨ、宝酒造）　　　　　　２０−Ｈ！Ｏ−一
一上上工ｄ 総計２００μ 反応は、３７℃で５分間処理の後、全量を５％ポリアク
リルアミドゲルにアプライし、電気泳動を行った。泳動
後、６２１ｂｐのＤＮＡ断片をｅｌｅｃ−ｔｒｏｅｌｕ
ｔｉｏｎによって回収した。回収後、エタノール沈澱の
キャリアーとして、ポリイノシン酸を２０イ添加し、フ
ェノール抽出の後、エタノール沈澱を行った。得られた
ＤＮＡの沈澱を３０μのＨ，０に溶解した。

工程３：　工程２で得たＤＮＡ断片のＡｌｕＩ末端にＢ
ａｗｌ　Ｉリンカ−を以下の反応液によって結合させた
。

工程２で得られたＡｌｕ　Ｉ部分断片　　　１０Ｐ４１
０　ｘ　ｌｉｇａｔｉｏｎ　’！ｍ衝液１　　　　　　
１μＢａｍＨＩリンカ−”　　　　　　　　　　　　１
０．ＪＴ４ＤＮＡ　Ｉｉｇａｓｅ （１７５Ｕ／、Ｊ、宝酒造）　　　　　　　　２１総計
２３ＰＩｔ 反応は、４℃で一夜処理後、フェノール抽出とエタノー
ル沈澱を行った。ＤＮＡの沈澱は、４２μのＨ，Ｏに溶
解した。

工程４：　工程３で得たＤＮＡ断片のＢａｍＨＩ消化を
以下の反応液組成で行った。

工程３で得たＤＮＡ　　　　　　　　　　４２μｍ　０
　ＸＢａｍＨＩ　緩衝液１　　　　　　　　５パＢａｍ
ＨＩ　　（１２Ｕ／４、宝酒造＞　　　　　　　３４総
計５０パ 反応は、３７℃で一夜行い、その後、反応液全量を５％
ポリアクリルアミドゲルにアプライし電気泳動を行った
。泳動後、５３３ｂｐの断片をｅｌｅｃ−ｔｒｏｅｌｕ
ｔｉｏｎｅよ−アｒｉｌｎ　ｄＶ　１．ナー　７．ノー
ル油虫の後、エタノール沈澱を行った。回収されたＤＮ
Ａの沈澱は、５０ＩのｄＨｔＯに溶解した。

工程５：　工程４で得られたＤＮＡ断片（両端がＢａｍ
ＨＩ末端）をクローニングするためのベクターとして、
ｐＢＲ３２２を以下の反応液組成のＢａｍＨＩで、３７
℃、−夜消化した後、ＢａｃｔｅｒｉａｌＡｌｋａｌｉ
ｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＢＡＰ）により５°−
末端のリン酸基を除去した。

ｐＢＲ３２２（１，ＯＰｇ／パ）　　　　　　２５μｍ
　０　Ｘ　ＢａＩＩＨＩ緩衝液（前出）　　　　　　　
５−Ｂａｓｅｒ　　（１０Ｕ／ｐｔ１宝酒造）３ＰｔＨ
，０１工ｄ 総計　５０μ 反応後、エタノール沈澱によりＤＮＡを回収した。ＤＮ
Ａは１８０ＰＪのＨｚＯに溶解した。

次に、ベクター（ｐＢＲ３２２）の５ｅｌｆ　ｌｉｇａ
−ｔｉｏ口を防ぐためＢＡＰにより、６５℃、４０分間
処理し、５゛−末端のリン酸基を除去した。その反応液
組成を以下に示す。

ＢａｍＨＩ消化ｐＢＲ３２２１８０，ＪＲＡＰ　　（０
，４５１１／μ、宝酒造）−一一一主ｄ総計２０２μ 反応後、３回フェノール抽出し、ＤＮＡをエタノール沈
澱により回収した。ＤＮＡの沈澱は、２５μのＨｔＯに
溶解した。

工程６：　工程４で得られたＤＮＡ断片と工程５で得ら
れたベクターを、４℃で一夜反応させ、１℃ｇａｔｉｏ
ｎした。その反応組成を以下に示す。

工程４のＤＮＡ断片　　　　　　　　　１０μＢａｍＨ
Ｉ消化、ＢＡＰ処理、ｐＢＲ３２２５ｐｇｌ　０　Ｘ　
ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ１′？４７ＪＴａＤＮ
Ａ　ｌｉｇａｓｅ （１７５Ｕ／ＰＪ、宝酒造＞　　　　　　　ｉｔ総計２
０Ｐｔ 反応後、反応液全量を用いて、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＲＲＩを
、Ｃｏｈｅｎ等の方法で形質転換した。その結果、６５
００個のコロニーが得られた。このうち、２００個につ
いて、アンピシリン（Ａｐ）とテトラサイクリン（Ｔｃ
）に対する感受性をチェックした。その結果、１４株が
Ａｐ耐性（Ａｐｒ）、Ｔｃ感受性（Ｔｃ”）であった。

その１４株について、アルカリ抽出法〔文献基：　　Ｈ
，Ｃ，Ｂｉｒｎｂｏｉｍ　　ａｎｄ　　Ｊ。

Ｄｏｌｙ、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａ
ｒｃｈユ、　１５１３　（１９７９））により、プラス
ミドを大量調製しくり、Ｂ、　Ｃｌｅｗｅｌｌａｎｄ　
Ｄ、Ｒ，）ｌｅｌｉｎｓｋｉ　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、
＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＤＮＡ譚、　１１５９　（１９
６９）に準じて）、これをｐＹＩ　５−１　とした。

工程７　：　　ｐＹＩ　５−１はＢａＩＩＩＩ　Ｉのサ
イトが２ケ所あるのでＩＦＮ−α２などの異種遺伝子を
挿入するのに不便である。そこで、片方（α−アミラー
ゼプロモーターの上流）のＢａ５ＨＩサイトを消失させ
るために、まずｐＹＩ　５−１をＡｖａ　Ｉで、３７℃
、−夜消化した。その反応液組成は以下の通りである。

ｐＹＩ　５−１　（１，４３ｐｇ／ｐＪ）　　　　　Ｌ
　４　ｐａｌ　（２０Ｎ）１０　ＸＡｖａｌ　ｂｕｆｆ
ｅｒ　”　　　　　　５７ａＪＡｖａｌ　　（８Ｕ／ｄ
、宝酒造）　　　３μＨｔＯ２８シ 総計５０μ 反応後、全量を１％アガロースゲルにアプライし、電気
泳動を行った。約３．５　ＫｂｐのＤＮＡ断片をＤＥＡ
Ｅ−ｐａｐｅｒに吸着させた後、回収した。エタノール
沈澱のキャリアーとして、ｔＲＮＡ２０ｐｇを添加した
。フェノール抽出の後、エタノール沈澱により、ＤＮＡ
を回収した。回収したＤＮＡは、５０μのＨｔ　Ｏに溶
解した。

工程８：　工程７で得られたＡｖａ　ｌ消化ｐｙｒ　５
−１を、４℃で一夜３６１ｆｌｉｇａｔｉｏｎさせて環
状化した。

その反応液組成を次に示す。

工程７で得られたＡｖａ　Ｅ消化ｐＹＩ　５−１　　　
２ｐ４１０　Ｘ　ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ（工
程６と同じ組成）　　　　　　　　１ｏｐｊＴ４ＤＮＡ
　ｌｉｇａｓｅ （１７５１１／、Ｊ、宝酒造）ＩＰ４ Ｈｔ　Ｏ−一一一影Ｌｄ 総計１００μ ｍ００μの反応液のうち、２５−を用いてＥ、ｃｏｌｔ
ＲＲＩを形質転換したところ１８個のアンピシリン耐性
（Ａｐつのコロニーが得られた。これらのコロニーにつ
いてアルカリ抽出法でプラスミドを抽出し、各種制限酵
素を用いてその構造を調べると、１４個のコロニーが第
３図に示したρＹｌ　６−１の構造のプラスミドを有し
ていた。このうち１株から　　。

プラスミドを大量調製し、これをｐｎ　６−１とした。

工程９：　制限酵素Ｈｐａ■を用いてｐ’ｌ　Ｉ　６−
１を消化処理して、α−アミラーゼのプロモーターとシ
グナル配列の一部を含むＤＮＡ断片を得た。消化処理は
以下の反応液組成によった。

１０ＸＨｐａＩＩ用緩衝液　”９　　　　　　３０，４
Ｈｐａｌｌ　（６ＩＪ／ｐｉｔ、東洋紡）　　　　　　
　４０．ＪＨｚｏ　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　４３℃総計３００μ 反応は３７℃で５時間行った０反応完了後、反応液全量
を５％ポリアクリルアミドゲルにアプライし、電気泳動
を行った。３４８ｂｐのＤＮＡ断片をｅｌｅｃｔｒｏｅ
ｌｕｔｉｏｎによって回収した０回収後、エタノール沈
澱のキャリアーとしてｔＲＮＡを４０μ添加し、フェノ
ール抽出の後、エタノール沈澱を行った。得られたＤＮ
Ａの沈澱を６０μのＨｔＯに溶解した。

工程１０：　　工程９で得たＤＮＡ断片の末端をＤＮＡ
　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　　Ｉを用いて以下の組成の反
応液によって平滑末端とした。

工程９で得たＨｐａ　！Ｉ断片　　　　　　　２４μｍ
０　Ｘ　Ｄ　Ｎ　Ａ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｉ緩衝液
　”’　　１５７ａＪｄＮＴＰ　　“ＩＩ　　　　　　
　　　　　　　　　　　　（ｉ、ＪＤ　Ｎ　Ａｐｏｌｙ
＋ｍｅｒａｓｅ　Ｉ　　、　ｌａｒｇｅ　　ｆｒａｇｓ
＋ｅｎｔ（６Ｕ／パ、東洋紡）　　　　　　　　４ｐｌ
ｔＨｚＯ１０１シ 総計１５０μ 中”　　　　ｄＡＴＰ、　　ｄＴＴＰ、　　ｄＧＴＰ。

ｄＣＴＰをそれぞれ２ｓ＋Ｍ含む水溶液反応は２０℃で
４５分間行った０反応完了後、５Ｍ酢酸アンモニウムを
１２０ｕＪ、冷エタノールを５４０．１添加し、エタノ
ール沈澱を行った。得られたＤＮＡの沈澱は２０．Ｊの
Ｈ２Ｏに溶解した。

工程１１：　　工程１０で得たＤＮＡ断片の両末端にＢ
ａｍＨＩ　リンカ−とＰｓｔｌリンカ−との混合物を以
下の組成の反応液によって結合させた。

工程１０で得られたＤＮＡ断片　　　　　１０μＩ　Ｑ
　Ｘｌｉｇａｔｉｏｎ緩衝液（前出’）　　　　　　　
２．ＪＢａ■Ｈ１リンカ− （０，２Ｒ／　ｌｄｌ、　日本セオ７社）””　　　１
０ＰｌｔＰａｔｌリンカ− （１，０ｎ／ｐａ、宝酒造）＊＋ｓ　　　　　　　３ｐ
ｌＴａＤＮＡ　ｌｉｇａｓｅ （１７５Ｕ／μ、宝酒造）　　　−一−ｌｄ総計２７Ｐ
Ｊ 傘Ｉｔ　　５”−ｄ（ＧＣＡＧＧＡＴＣＣＴＧＣ）−３
’という配列。

５゛−末端にリン酸基を付けてから使用した。

申”　　５’−ｄ（ρＧＣＴＧＣＡＧＣ）−３’　　と
いう配列。

予め５゛−末端にリン酸基が付いている。

反応は、４℃で一夜行った。反応完了後、フェノール抽
出とエタノール沈澱を行った。得られたＤＮＡの沈澱は
３７パのＨ，Ｏに溶解した。

工程１２：　　工程１１で得たＤＮＡ断片を以下の組成
の反応液によりＢａ＋＊旧と＾ｖａｌで消化した。

工程１１で得たＤＮＡ断片　　　　　　　３７．Ｊｌ　
０　ＸＢａｍＨＩ緩衝液（前出）　　　　　　　　５Ｐ
ｌｔＢａｍＨＩ　　（１２１Ｊ／ｐｌ、宝酒造）　　　
　　　　３ｄＡｖａｒ　　（８１Ｊ／ｐｌ、宝酒造＞　
　　　　　　　５４総計５０μ 反応は、３７℃で一夜行い、その後、反応液全量を５％
ポリアクリルアミドゲルにアプライし、電気泳動を行っ
た。泳動後、３００ｂｐ前後のＤＮＡ断片をｅｌｅｃｔ
ｒｏｅｌｕｔｉｏｎによって回収した。フェノール抽出
の後、エタノール沈澱を行った。この際、キャリアーと
してｔＲＮＡを４０ｑ添加した。回収されたＤＮＡの沈
澱は５０ＰＪのＨｔＯに溶解した。

工程１３：　　工程１２で得られたＤＮＡ断片（末端は
ＡｖａＴとＢａｍＨ）をクローニングするためのベクタ
ーとして、ｐＢＲ３２２を以下の組成の反応液にてＢａ
ｍＨＩ　とＡｖａ［で消化した。

ｐＢ　Ｒ３２２（１，０Ｆｔｒ／ｄ）　　　　　　　　
２５７Ｊ１０　ｘＢａａ＋ＨＩ緩衝液　　　　　　　　
　　５μＢａ５ａｌ　　（１２１Ｊ／ｐｇ、宝酒造）　
　　　　　３パ＾ｖａｌ　　（８Ｕ／７−Ｊ、宝酒造）
　　　　　　　　６ＩＪＦｒｔｏ　　　　　　　　　　
　　　　　　　１１己総計５０μ 反応は、３７℃で一夜行った。次にベクター（ｐＢＲ３
２２）の３６１ｆｌｉｇａｔｉｏｎを防ぐために、Ｂａ
ｃｔｅｒｉａｌ　Ａｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔ
ａｓｅ　（Ｂ　Ａ　Ｐ）にて５゛−末端のリン酸基を除
去した。即ち、上記反応液ニＢ　Ａ　Ｐ　（０，４５１
Ｊ／ｐＨ宝酒造）２μを添加し、６５℃で４０分間反応
を行った。反応完了後、反応液全量を１％アガロースゲ
ルにアプライし、電気泳動を行った。　３３００ｂｐの
ＤＮＡ断片をＤＥＡＥ　−ｐａｐｅｒに吸着後回収し、
エタノール沈澱のキャリアーとしてｔＲＮＡ４０ｑを添
加した。これをフェノール抽出後、エタノール沈澱し、
ＤＮＡを回収した。得られたＤＮＡの沈澱は、９０μの
Ｈｔ　Ｏに溶解した。

工程１４：　　工程１２で得られたＤＮＡ断片と工程１
３で得られたベクターを、以下の組成の反応液にて１μ
ｇａｔｉｏｎ　Ｌｐた。

工程１２のＤＮＡ断片　　　　　　　　　１０μ工程１
３のベクターＤ　Ｎ　Ａ　　　　　　　　　５　Ｐｌｌ
　０　Ｘｌｉｇａｔｉｏｎ緩衝液（前出）　　　　　　
４μＴ４ＤＮＡ　ｌｉｇａｓｅ （１７５１１／μ、宝酒造）　　　　　　　　１．ＪＨ
，０，２０遥 総計４０μ 反応は、４℃で一夜行った０反応完了後、反応液全量を
用いてＥ、ｃｏｌｉＲＲ１をＣｏｈｅｎ等の方法で形質
転換した。その結果、３５００個のコロニーが得られた
。そのうち４８株についてアルカリ抽出法によりプラス
ミドを調製し、その構造を各種制限酵素を用いて調べた
。その結果、１株において、第４図に示したｐＹＩ　７
−１の構造のプラスミドを有していたので、これをｐＹ
ｌ　７−１として以後使用した。

得られたｐＹｌ７−１は、納豆曹α−アミラーゼ遺伝子
のシグナル配列（３１アミノ酸）の下流にＢａｍＨＩサ
イトを有し、更にその下流にＥｃｏＲＩ、Ｃ１ａｌ、　
Ｈｉｎｄｌ、ＥｃｏＲＶのサイトが１ケ所ずつあり、こ
れらのサイトを利用してＩＦＮ−ｒなどの異種遺伝子を
連結することができる。すなわち、ＩＦＮ−ｒなどの異
種蛋白質をコードする遺伝子の上流にＢａ５ＨＩサイト
があり、下流にＥｃｏＲＩ、Ｃ１ａｌ、Ｈｉｎｄｌｌ＋
、さらにＨｃｏＲＶなどのフラッシュエンドのサイトが
あるＤＮＡ断片を連結することができる。

（ｃｌｐＹＩ７−１とＩＦＮ−ｒ遺伝子の連結（ｐｌｒ
ａｍｙ５の作製） ｐＹＩ？−１を利用して、ＩＦＮ−γ遺伝子を分泌発現
させるためにｐＹｌ７−１のＢａＩｍ旧サイトとＥｃｏ
ＲＶサイトの間にＩＦＮ−γ遺伝子を含むＤＮＡ断片を
連結し、ｐｌｒａｍｙ５を得たその概略は第５図に示し
た。

工程１：　　ｐＹｌ７−１をＢａＩｍ旧とＥｃｏＲＶを
用いて、以下の組成の反応液にて消化した。

ｐＹ　！　？　−１（１，０ｐｇ／ｐｔＩｔ）　　　　
　　５０ｐＨ０Ｘ　Ｂａ＃ｌ旧緩衝液（前出）　　　　
　　　１５７４８ａｍＨＩ　（１２１Ｊ／ｐＨ、宝酒造
）１０ＰｔＥｃｏＲＶ　（５Ｕ／ｐＨ、宝酒造）　　　
　　　２０μＨｔｏ　　　　　　　　　　　　　　　　
　５５ノ総計１５０４ 反応は、３７℃で一夜行った０次にベクター（ｐＹｌ７
−１）の３６１ｆｌｉｇａｔｉｏｎを防ぐために、Ｂａ
ｃｔｅｒｉａｌ　Ａｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔ
ａｓｅ　（Ｂ　Ａ　Ｐ）にて５゛−末端のリン酸基を除
去した。即ち、上記反応液にＢ　Ａ　Ｐ　（０，４５Ｕ
／ｐｉ、宝酒造）２Ｐ４を添加し、６５℃で４０分間反
応を行った。反応完了後、反応液全量を１％アガロース
ゲルにアプライし、電気泳動を行った。泳動後、約３．
７　ＫｂｐのＤＮＡ断片をＤ　Ｅ　Ａ　Ｅ−ｐａｐｅｒ
に吸着後回収し、エタノール沈澱のキャリアーとしてｔ
ＲＮＡ４０ｑを添加した。これをフェノール抽出後、エ
タノール沈澱し、ＤＮＡを回収した。得られたＤＮＡの
沈澱は、５０−のＨｚ　Ｏに溶解した。

工程１　１ＦＮ−γ遺伝子を担持するプラスミドｐＹｓ
６１（昭和５９年１０月３１日付の特許層、出願人二株
式会社ミドリ十字）をＮｄｅｌと旧ｎｄ■を用いて、以
下の反応液組成にて消化した。

ｐＹｓ６１（１，２イ／μ）　　　　　　　　４２ｄ１
０　ＸＮｄｅＩ緩衝液　６４　　　　　　　１０μＮｄ
ｅｌ　（８１Ｊ／４、Ｎ　Ｅ　Ｂ　）　　　　　　　　
１０５−ＩＨｉｎｄｎ［（８Ｕ／Ｊ、宝酒造）　　　　
　　１０−Ｈｔ　Ｏ２影ｄ 総計１００μ 反応は３７℃で一夜行った。反応後、反応液全量を１％
アガロースゲルにアプライし、電気泳動を行った。約７
００ｂｐのＤＮＡ断片をＤＩ！ＡＥ　−ｐａｐｅｒに吸
着させた後、回収し、エタノール沈澱のキャリアーとし
てｔＲＮＡ４０ｑを添加した。これをフェノール抽出後
、エタノール沈澱し、ＤＮＡを回収した。得られたＤＮ
Ａは、５０ＰａのＨｔＯに溶解した。ここで得たＤＮＡ
断片は、ＩＦＮ−γ遺伝子のほぼ全部とｔｒｐのｔｅｒ
ｍｉｎａｔｏｒを含んでいるが、ＩＦＮ−ｒのＮ末端か
ら３つのアミノ酸をコードする部分を欠いている。この
欠損した３つのアミノ酸に対応するＤＮＡ塩基配列は、
後でＲａｍ旧リンカ−を付けた後、ｐＹＩ７−１と連結
したときに再生される。

工程３：　工程２で得たＤＮＡ断片の末端をＤＮＡ　ｐ
ｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｉを用いて以下の反応液組成にて
平滑末端とした。

工程２で得られたＤＮＡ断片　　　　　２５Ｐｊ１０　
Ｘ　Ｄ　Ｎ　Ａ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　　Ｉ緩衝液（
前出）１５μ ｄＮＴＰ　（各２＋＋＋Ｈの溶液、前出）　　　　　６
−Ｄ　ＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｉ　、　ｌａｒｇ
ｅ　ｆｒａｇｍｅｎｔ（６１１／ｄ、東洋紡）　　　　
　　　　　４−Ｈｔｏ　　　　　　　　　　　　　　　
　１００ｄ総計１５０μ 反応は、２０℃で４５分間行った６反応完了後、５Ｍ酢
酸アンモニウムを１２０．ｊ、冷エタノールを５４０Ｐ
１添加し、エタノール沈澱を行った。得られたＤＮＡの
沈澱は２０μのＨ２Ｏに溶解した。

工程４：　工程３で得たＤＮＡ断片の両末端に、Ｂａ＋
ｍＨＩ　リンカ−を以下の反応液組成によって結合させ
た。

工程３で得られたＤＮＡ断片　　　　　１０Ｐ１１０　
Ｘ　ｌｉｇａｔｉｏｎ緩衝液（前出）　　　　　　２μ
Ｂａｗｌ　Ｔ　リンカ− （１，Ｏｐｇ　／　ｄ、宝酒造）′″”　　　　　　２
ＩＪＴａＤＮＡ　　ｌｉｇａｓｅ （１７５０／μ、宝酒造）　　　　　　　２ＰＪＨ，Ｏ
−−一一二しシ 総計２０パ 一１Ｓ５’−ｄ（ｐＣＧＧＡＴＣＣＧ）−３’　　とい
う配列。

あらかじめ５°−末端にリン酸基が付いている。

反応は、４℃で一夜行った。反応完了後、フェノール抽
出とエタノール沈澱を行った。得られたＤＮＡの沈澱は
３０ｄのＨｔ　Ｏに溶解した。

工程５：　工程４で得たＤＮＡ断片を以下の反応液組成
により、ＢａｍＨＩと旧ｎｃＩＩで消化した。

工程４で得たＤＮＡ断片　　　　　　　３０パ１０　Ｘ
　Ｂａ＃＋旧緩衝液（前出）５Ｐ４ＢａｍＨＩ　　（１
２１Ｊ／Ｐｌ−宝酒造）　　　　　　３ＰＩｔ旧ｎｃＩ
［（６Ｕ／ｐＨ、宝酒造）　　　　　　　６−ＨｌＯ−
一一一影ｄ 総計５０μ 反応は、３７℃で一夜行い、その後、反応液全量を５％
ポリアクリルアミドゲルにアプライし、電気泳動を行っ
た。泳動後、約７ｏｏｂｐの断片をｅｌｅｃｔｒｏｅｌ
ｌｉｏｎによって回収した。フェノール抽出の後、キャ
リアーとしてｔＲＮＡを３０／Ａｇ添加し、エタノール
沈澱を行った０回収されたＤＮＡの沈澱は２５μのＨ，
Ｏに溶解した。

工程６：　工程１で調製したベクターと工程５で調製し
たＩＦＮ−ｒ遺伝子を含むＤＮＡ断片を以下の反応液組
成でｌｉｇａｔｉｏｎ　した。

工程ｌで得たベクター断片　　　　　　　２μ工程５で
得たＤＮＡ断片　　　　　　　　５μｍ　０　Ｘ　ｌｉ
ｇａｔｉｏｎ緩衝液（前出）　　　　　　３−Ｔ４ＤＮ
Ａ　ｌｉｇａｓｅ （１７５１１／μ、宝酒造）　　　　　　　２μＨｔＯ
１８４ 総計３０Ｐｔ 反応は、４℃で一夜行った。

（ｄ）形質転換 前記工程６の反応後反応製全量を用いてＥ、ｃｏｌｉＨ
Ｂ　１０１を形質転換した。その結果、２４の形質転換
株（Ａｐ’）が得られた。これらの株についの制限酵素
を用いて構造を調べた結果、２２株が第５図に示したｐ
ｌγａ　ｍ　ｙ　５を有していた。これらの株の１つ（
ｐｌｒａｍｙ５を有するＥ、ｃｏｌｉＨＢ　１０１）に
ついて、ＩＦＮ−γの産生を検討した。

（ｅｌ　Ｉ　Ｆ　Ｎ　−ｒの産生 ｐＩｒａｍｙ５を保有するＥ、ｃｏｌｉ　ＨＢ　１０１
を、Ｐａ１ｖａら（Ｇｅｎｅ、　２２．２２９　（１９
８３））の方法に準じた培地（下記）　５００ａ＋１を
使って、２１マイヤー中で、３７℃にて振とう培養し、
経時的にＡｔｈＳ６の測定によって菌の生育状況を追跡
した。

酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ）　　　　　　　　Ｉ　Ｑ　ｇ
　／　ＩＢａｃｔｏｔｒｙｐｔｏｎｅ　（Ｄｉｒｃｏ）
　　　　　　　２０　ｇ　／　ＩＮａＣＪ　　　　　　
　　　　　　　　　１０ｇ／１（ＮＨ＊）　ｔｓＯａ　
　　　　　　　　　　　　　１　ｇ　／　１ｘｔｉｐｏ
ｔ　　　　　　　　　　　　　　　７　ｇ　／　ＪＫＨ
ｚＰＯａ　　　　　　　　　　　　　　　２　ｇ　／　
１アンピシリン　　　　　　　　　　２５＋＊ｇ／Ｊ（
ｆ）ＩＦＮ−１の回収 （ｅｌで得られた培養液を３時間毎に２０ｓ＋１サンプ
リングし、後記フローシートに従って各両分を分取した
。培養上清、菌体洗浄液■と■、ペリブラズミンク画分
、菌体抽出液について、ＩＦＮ−ｒの力価をＲＰＨＡ法
で測定した。培養開始１２時間後におけるＴＦＮ−ｒの
産生力価は、第２表の通りである。

第２表：ＩＦＮ−ｒの力価（■υ／ｌ培地）次いで、ベ
リプラズミンク画分と菌体抽出液について、６から２４
時間後まで３時間ごとに経時的にＩＦＮ−ｒ力価を測定
した結果は、第３表の通りである。第３表から明らかな
ように、菌の生育とともに産生量が増し、培養開始１５
時間で一定になっている。また、菌体内のＩＦＮ−７の
約５０％がペリプラズムに分泌されていた。

第３表：ＩＦＮ−ｒの力価（ＩＵ／Ｉｌ培地）（ｇ）ペ
リプラズミック画分に分泌されたＩＦＮ−ｒの性状の検
討 ｐＩｒａｍｙ５を保有するＥ、ｃｏｌｉＨＢ　ｌ　０１
を、Ｐａ１ｖａ　らの方法に準じた培地（前出）２０ｍ
ｌを使って、１０（１＋１マイヤー中で、３７℃にて振
とう培養した。培養開始９時間後（Ａｌｌ。−６，５０
）に、２００μＣｉの〔１Ｈ〕グルタミンあるいは〔３
Ｈ〕リジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を添加し、更に１５分
間振とう培養を続けた。培養後、マイヤー氷冷し、ラベ
リングを停止した。遠心分離によって集菌した後、後記
フローシートに従ってペリプラズミンク画分を調製した
。得られたベリプラズミンク画分を、抗１ＦＮ−γモノ
クローナル抗体セファロース（昭和５９年１０月３１日
付の特許願、出願人−株式会社ミトリ十字）２ａ＋１を
充填したカラムに通し、ＩＦＮ−ｒを吸着させた。その
後、０．１〜１．０ＭのＮａＣ１溶液でカラムを洗浄し
、不純物を除去した０次に、３．５ＭのＫＳＣＮ溶液を
カラムへ注入し、［ＦＮ−γを溶出した。透析によって
ＫＳＣＮを除去した後、限外濾過により約２００７．４
にまで濃縮した。次にこの精製ＩＦＮ−ｙ２Ｓμを用い
て５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。

ゲルの固定、増感処理、乾燥の後、オートラジオグラフ
ィーを行った。その結果、分子量１１０００付近にシン
グルバンドが認められた。

次に、精製ＩＦＮ−７１００，Ｊを４ｐｐｌｉｅｄ　Ｂ
ｌｏ−５ｙｓ　ｔｅｍｓ製４７０Ａ型Ｐｒｏｔｅｉｎ　
５ｅｑｕｅｎｃｅｒを用いてエドマン分解した。得られ
たＮ末端からの各フラクションについて液体シンチレー
シシンカウンターを用いて放射活性を測定した。その結
果を第６図に示した。これから明らかなように〔３Ｈ〕
グルタミンでラベルした場合は、１番目のサイクルに３
Ｈの取り込みが認められ、〔３Ｈ〕リジンでラベルした
場合は、６番目、１２番目、１３番目に３Ｈの取り込み
が認められた。このことは、ペリプラズミンク画分に分
泌されたＩＦＮ−γのＮ末端付近のアミノ酸配列が Ｇｌｎ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｌｙｓ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ
−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−（Ｘ：　ｕｎｋｎｏｗｎ　） であることを示唆する。これは表４に示したＧｉｎから
始まるｒａａ　ｔｕｒｅなＩＦＮ−γのアミノ酸配列に
一致する。即ち、ペリプラズムに分泌されたＩＦＮ−γ
はＮ末端にＭｅｔが付いていないｎａｔｉｖｅなＩＦＮ
−γと同じアミノ酸配列を持つことが確認された。

鵡 −駅

【図面の簡単な説明】

第１図・・ｐＧｃ３０３の制限酵素地図。 第２図・・納豆菌染色体ＤＮＡからのα−アミラーゼ遺
伝子のクローニング。 第３図及び第４図 ・・大腸菌用発現ベクターの作成工程を示す。数字は本
文中の工程番号を示 す。 第５図・・ｐＹＩ７−１とＩＦＮ−ｒ遺伝子との連結に
よるｐｌｒａｍｙ５の作成 工程を示す。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）発現系遺伝子として、納豆菌由来のα−アミラー
   ゼプロモーター部分を含む系、宿主として、グラム陰性
   細菌を用いることによって、インターフェロン−γをペ
   リプラズムに分泌させることを特徴とするインターフェ
   ロン−γの製造法。
2. （２）グラム陽性細菌が、バチラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
   ）属細菌である特許請求の範囲第（１）項記載の製造法
   。
3. （３）グラム陰性細菌が、大腸菌である特許請求の範囲
   第（１）項記載の製造法。