JPS61280293A - ステロイド化合物のリン酸エステルの製造方法 - Google Patents
ステロイド化合物のリン酸エステルの製造方法Info
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- JPS61280293A JPS61280293A JP12148885A JP12148885A JPS61280293A JP S61280293 A JPS61280293 A JP S61280293A JP 12148885 A JP12148885 A JP 12148885A JP 12148885 A JP12148885 A JP 12148885A JP S61280293 A JPS61280293 A JP S61280293A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
皮栗上皇肘■立国
本発明はステロイド化合物のリン酸エステルの微生物学
的製造方法に関するものである。
的製造方法に関するものである。
更に詳細には、ステロイド化合物をリン酸エステル化す
る能力を有するモルティエレラ属に属する糸状菌を培養
する工程と、該モルティエレラ属に属する糸状菌をステ
ロイド化合物またはそのアルカリ金属塩に接触させる工
程と、該ステロイド化合物またはその塩から変換された
ステロイド化合物のリン酸エステルまたはそのアルカリ
金属塩を回収する工程とを含む微生物変換によ北ステロ
イド化合物のリン酸エステルまたはそのアルカリ金属塩
の製造方法に関するものである。
る能力を有するモルティエレラ属に属する糸状菌を培養
する工程と、該モルティエレラ属に属する糸状菌をステ
ロイド化合物またはそのアルカリ金属塩に接触させる工
程と、該ステロイド化合物またはその塩から変換された
ステロイド化合物のリン酸エステルまたはそのアルカリ
金属塩を回収する工程とを含む微生物変換によ北ステロ
イド化合物のリン酸エステルまたはそのアルカリ金属塩
の製造方法に関するものである。
従米抜吉
芳香族化合物の硫酸エステル化やグルクロン酸エステル
化についてはヒドロキシビフェニールのアスペルギルス
・トキシカリウス（とｙ山１■匹ｔｏｘｉｃａｒｉｕｓ
）による硫酸エステル化反応（Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ、、１５６，４９．１９８３）および１−ナフトール
や４−ヒドロキシビフェニールのカンニングハメラ・エ
レガンス（Ｃｕｎｎ江肢Ｕ姓り姐」ｌ匣）による硫酸お
よびグルクロン酸エステル化反応（Ａｐｐｌ。
化についてはヒドロキシビフェニールのアスペルギルス
・トキシカリウス（とｙ山１■匹ｔｏｘｉｃａｒｉｕｓ
）による硫酸エステル化反応（Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ、、１５６，４９．１９８３）および１−ナフトール
や４−ヒドロキシビフェニールのカンニングハメラ・エ
レガンス（Ｃｕｎｎ江肢Ｕ姓り姐」ｌ匣）による硫酸お
よびグルクロン酸エステル化反応（Ａｐｐｌ。
Ｅｎｖｉｒｏｎ、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏ！、、旦、 １０
７０．１９８２）が最近報告されているが、微生物によ
るステロイド化合物や多環炭化水素のリン酸エステル化
反応については全く知られていないのが現状である。
７０．１９８２）が最近報告されているが、微生物によ
るステロイド化合物や多環炭化水素のリン酸エステル化
反応については全く知られていないのが現状である。
また、ステロイド化合物は種々の生理活性を有すること
が明らかとなっており、すでにいくつかの医薬品に応用
され、かつその用途の拡大のための研究がなされている
。しかし、一般にステロイド化合物は水難溶性のため、
水易溶性ステロイド化合物は複雑な工程を経て化学合成
により製造されている。また、なかには合成困難なもの
もある。
が明らかとなっており、すでにいくつかの医薬品に応用
され、かつその用途の拡大のための研究がなされている
。しかし、一般にステロイド化合物は水難溶性のため、
水易溶性ステロイド化合物は複雑な工程を経て化学合成
により製造されている。また、なかには合成困難なもの
もある。
即ち本発明の目的は水難溶性ステロイド化合物に対し、
ステロイド化合物の強力なリン酸エステル化能を有する
微生物によって水易溶−性ステロイド化合物を製造する
ことにある。
ステロイド化合物の強力なリン酸エステル化能を有する
微生物によって水易溶−性ステロイド化合物を製造する
ことにある。
−をゞするための手
本発明者らはステロイド化合物のリン酸化を指標に種々
の菌株について鋭意研究した結果、特開昭５９−１５９
７９５号記載の糸状菌モルティエレラ・ラマニャーナ・
ラマニャーナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｒａｍａｎｎ
ｉａｎａ ｖａｒ、 ｒａｍａｎｎｉａｎａ）Ｙ２−１
（微工研条寄第４４０号）がステロイド化合物に対す
る強力なリン酸エステル化活性を示すことを見い出した
。
の菌株について鋭意研究した結果、特開昭５９−１５９
７９５号記載の糸状菌モルティエレラ・ラマニャーナ・
ラマニャーナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｒａｍａｎｎ
ｉａｎａ ｖａｒ、 ｒａｍａｎｎｉａｎａ）Ｙ２−１
（微工研条寄第４４０号）がステロイド化合物に対す
る強力なリン酸エステル化活性を示すことを見い出した
。
具体的には、ステロイド化合物や胆汁酸の中でも脂溶性
の強いりトコール酸あるいはそのアミノ酸泡合体を基質
とし、リン酸エステル化能を有する菌株を、■ヤクルト
本社中央研究所保存菌株の中からスクリーニングし、該
糸状菌にその活性を見い出し、本発明を完成するに至っ
た。
の強いりトコール酸あるいはそのアミノ酸泡合体を基質
とし、リン酸エステル化能を有する菌株を、■ヤクルト
本社中央研究所保存菌株の中からスクリーニングし、該
糸状菌にその活性を見い出し、本発明を完成するに至っ
た。
即ち、本発明の構成はモルティエレラ属に属する糸状菌
を出発物質としてのステロイド化合物またはそのアルカ
リ金属塩に接触させて、ステロイド環に存在するα又は
β型水酸基をリン酸エステル化することにより、水易溶
性のステロイド化合物のリン酸エステルを製造するもの
である。
を出発物質としてのステロイド化合物またはそのアルカ
リ金属塩に接触させて、ステロイド環に存在するα又は
β型水酸基をリン酸エステル化することにより、水易溶
性のステロイド化合物のリン酸エステルを製造するもの
である。
さらに詳述すれば、ステロイド化合物をリン酸エステル
化する能力を有するモルティエレラ属に属する糸状菌の
菌株、典型的にはモルティエレラ・ラマニャーナ・ラマ
ニャーナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｒａｍａｎｎｉａ
ｎａ ｖａｒ、 ｎｎ島ｎ皿）Ｙ２−１株（以下、単に
Ｙ２−１株という）の菌体をステロイド化合物またはそ
のアルカリ金属塩に対して接触させることにより、微生
物変換の方法を用いて該ステロイド化合物のリン酸エス
テルまたはそのアルカリ金属塩を製造する方法であり、
具体的には下記の方法を包含する。
化する能力を有するモルティエレラ属に属する糸状菌の
菌株、典型的にはモルティエレラ・ラマニャーナ・ラマ
ニャーナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｒａｍａｎｎｉａ
ｎａ ｖａｒ、 ｎｎ島ｎ皿）Ｙ２−１株（以下、単に
Ｙ２−１株という）の菌体をステロイド化合物またはそ
のアルカリ金属塩に対して接触させることにより、微生
物変換の方法を用いて該ステロイド化合物のリン酸エス
テルまたはそのアルカリ金属塩を製造する方法であり、
具体的には下記の方法を包含する。
（１）ステロイド化合物またはそのアルカリ金属塩を含
有する培養培地にて、上記糸状菌を培養することにより
培地中に該ステロイド化合物のリン酸エステルまたはそ
のアルカリ金属塩を蓄積させて、これを回収する方法。
有する培養培地にて、上記糸状菌を培養することにより
培地中に該ステロイド化合物のリン酸エステルまたはそ
のアルカリ金属塩を蓄積させて、これを回収する方法。
（２）上記糸状菌が良好に生育する培養培地にて該糸状
菌を培養して得た菌体を、反応液中にてステロイド化合
物またはそのアルカリ金属塩に接触させることにより、
該ステロイド化合物のリン酸エステルまたはそのアルカ
リ金属塩を生成させてこれを回収する方法。
菌を培養して得た菌体を、反応液中にてステロイド化合
物またはそのアルカリ金属塩に接触させることにより、
該ステロイド化合物のリン酸エステルまたはそのアルカ
リ金属塩を生成させてこれを回収する方法。
次に上記各方法につき更に詳述する。上記（１）の方法
ではステロイド化合物またはそのアルカリ金属塩を培養
工程の適宜の時期に培養培地に一度に加えてもよく、あ
るいは段階的にまたは連続的に加えてもよい。また方法
はバッチ式、流加式または連続式で行い得る。
ではステロイド化合物またはそのアルカリ金属塩を培養
工程の適宜の時期に培養培地に一度に加えてもよく、あ
るいは段階的にまたは連続的に加えてもよい。また方法
はバッチ式、流加式または連続式で行い得る。
培養におけるステロイドの濃度はとくに制限されないが
好ましくは０．１〜１００ｇ／Ｊ！の範囲である。微生
物を接種する前に、適当な培地で増殖させたのちに変換
用培地に接種してもよい。追加の栄養素、または別の炭
素源、エネルギー源を所望により添加してもよい。好ま
しい炭素およびエネルギー源はグルコース、グリセロー
ル、廃糖蜜、酵母エキス、脂肪酸など、また好ましい窒
素源はアンモニウム塩、コーシスチーブリカー、大豆ミ
ール、綿実ミール、フィツシュミール、牛肉エキス、魚
肉エキスなどである。培養には適当な温度が採用され、
通常１０〜４５℃、好ましくは２５〜３０℃である。培
養ｐＨは通常４〜８で行われるが、好ましくはｐＨ７〜
７．５である。好適な培養時間は４８時間以上、最適に
は５日程度である。
好ましくは０．１〜１００ｇ／Ｊ！の範囲である。微生
物を接種する前に、適当な培地で増殖させたのちに変換
用培地に接種してもよい。追加の栄養素、または別の炭
素源、エネルギー源を所望により添加してもよい。好ま
しい炭素およびエネルギー源はグルコース、グリセロー
ル、廃糖蜜、酵母エキス、脂肪酸など、また好ましい窒
素源はアンモニウム塩、コーシスチーブリカー、大豆ミ
ール、綿実ミール、フィツシュミール、牛肉エキス、魚
肉エキスなどである。培養には適当な温度が採用され、
通常１０〜４５℃、好ましくは２５〜３０℃である。培
養ｐＨは通常４〜８で行われるが、好ましくはｐＨ７〜
７．５である。好適な培養時間は４８時間以上、最適に
は５日程度である。
目的化合物の収穫の好適な時期は菌体濃度、培地中の炭
素源濃度、溶存酸素濃度、排出ガス中の酸素や二酸化炭
素の１つ以上をモニターすることにより、あるいは培養
濾液の各種クロマトグラフィー分析などにより決定する
。
素源濃度、溶存酸素濃度、排出ガス中の酸素や二酸化炭
素の１つ以上をモニターすることにより、あるいは培養
濾液の各種クロマトグラフィー分析などにより決定する
。
次に上記（２）の方法では一旦培養培地から分離した菌
体の全部もしくは一部（胞子）をステロイド化合物また
はそのアルカリ金属塩を懸濁させた反応液中に投与して
もよい。また分離した菌体の全部もしくは一部をポリア
クリルアミドやカルシウムアルギネート等を用いて固定
化した後にステロイド化合物またはそのアルカリ金属塩
に接触させてもよい。更に反応液中にエネルギー源とし
ての有機物質、典型的にはブドウ糖、ガラクトース、そ
の他の炭水化物、カゼイン加水分解物、酵母エキス等を
低濃度に添加することにより反応効率がよくなる。
体の全部もしくは一部（胞子）をステロイド化合物また
はそのアルカリ金属塩を懸濁させた反応液中に投与して
もよい。また分離した菌体の全部もしくは一部をポリア
クリルアミドやカルシウムアルギネート等を用いて固定
化した後にステロイド化合物またはそのアルカリ金属塩
に接触させてもよい。更に反応液中にエネルギー源とし
ての有機物質、典型的にはブドウ糖、ガラクトース、そ
の他の炭水化物、カゼイン加水分解物、酵母エキス等を
低濃度に添加することにより反応効率がよくなる。
変換生成物はイオン交換樹脂に吸着させ、ついで溶出す
るか、または適当な水混和性有機溶媒にて抽出し、つい
で結晶化させるなどの種々の方法で回収される。
るか、または適当な水混和性有機溶媒にて抽出し、つい
で結晶化させるなどの種々の方法で回収される。
本発明に使用するモルテイエレラ属の糸状菌、典型的に
はＹ２−１株の生育形態および生理学的性質は特開昭５
９−１５９７９５号に記載の通りである。
はＹ２−１株の生育形態および生理学的性質は特開昭５
９−１５９７９５号に記載の通りである。
本発明方法でリン酸エステル化される好ましい化合物の
例として下記のものがあげられるが、ここに記載する化
合物に限定されるものではなく、芳香族化合物や多環式
炭化水素化合物に該糸状菌を作用させて各々のリン酸エ
ステル化物を調製することも可能である。
例として下記のものがあげられるが、ここに記載する化
合物に限定されるものではなく、芳香族化合物や多環式
炭化水素化合物に該糸状菌を作用させて各々のリン酸エ
ステル化物を調製することも可能である。
コレステロール
コレスタン−３β−オール
１７α−メチル−テストステロン
５α−アントロスタン−３β、１７β−ジオールΔ５−
アンドロステン−３β、１７β−ジオールテストステロ
ン アンドロステロン テヒドロイソアンドロステロン へ４−アンドロステンー１１β−オール−３，１７−シ
オン デオキシコルチコステロン １７α−ヒドロキシ−プレグネノロン プレドニソロン アルドステロン コルチコステロン Δ５−プＩ／グネンー３β−オール−２０−オン１７α
−ヒドロキシ−プロゲステロン ヒドロコルチゾン コルチゾン １７α−エチニルエストラジオール エストロン エストリオール β−エストラジオール コール酸 ケノデオキシコール酸 ウルソデオキシコール酸 デオキシコール酸 リトコール酸 次に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが
、本発明はこれらに限定されない。
アンドロステン−３β、１７β−ジオールテストステロ
ン アンドロステロン テヒドロイソアンドロステロン へ４−アンドロステンー１１β−オール−３，１７−シ
オン デオキシコルチコステロン １７α−ヒドロキシ−プレグネノロン プレドニソロン アルドステロン コルチコステロン Δ５−プＩ／グネンー３β−オール−２０−オン１７α
−ヒドロキシ−プロゲステロン ヒドロコルチゾン コルチゾン １７α−エチニルエストラジオール エストロン エストリオール β−エストラジオール コール酸 ケノデオキシコール酸 ウルソデオキシコール酸 デオキシコール酸 リトコール酸 次に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが
、本発明はこれらに限定されない。
〈実施例１〉
水道水１ｅに対してグルコース５０ｇ１ポリペプトン５
ｇ、酵母エキス２ ｇ １ＫＨｚＰＯ＊ １ｇ 、 Ｋ
ＪＰＯ４，２ｇ 、 Ｍｇ５Ｏａ −７１２００，５
ｇ 、 ＣａＣｌｚｌｏｍｇ、ＦｅＳＯ４□ ７Ｈｚ０
１０ｍｇ 、塩酸チアミン１０■および変換基質として
のタウロリトコール酸１ｇを混合してなる６１の液体培
地を１０１１容量の発酵槽に投入し、予め同組成の培地
を用いて２７℃にて４８時間坂ロフラスコ中で振盪培養
したＹ２−１株をと記発酵槽内の液体培地に５％接種し
、培養温度２７°Ｃ，ｐ）１７〜７．５に調整しながら
攪拌速度３００ｒｐｍ、通気量０．５ ｖｖｍで５日間
、好気的に培養した。培養終了後、培養液を５℃に冷却
し、遠心して菌体および沈澱生成物とともに透明な上清
液を得る。この上清液を適当なポリマー非イオン性吸着
剤ポリスチレン−ジビニルベンゼンコポリ−ｒ −（ア
ンバーライトＸＡＤ−２が好ましい吸着剤である。）の
吸着床を通過させて、生成物を吸着させる。この吸着床
を脱イオン水で洗浄して不要の無機物を除き、ついでメ
タノールまたはエタノールで溶出し、生成物を回収する
。
ｇ、酵母エキス２ ｇ １ＫＨｚＰＯ＊ １ｇ 、 Ｋ
ＪＰＯ４，２ｇ 、 Ｍｇ５Ｏａ −７１２００，５
ｇ 、 ＣａＣｌｚｌｏｍｇ、ＦｅＳＯ４□ ７Ｈｚ０
１０ｍｇ 、塩酸チアミン１０■および変換基質として
のタウロリトコール酸１ｇを混合してなる６１の液体培
地を１０１１容量の発酵槽に投入し、予め同組成の培地
を用いて２７℃にて４８時間坂ロフラスコ中で振盪培養
したＹ２−１株をと記発酵槽内の液体培地に５％接種し
、培養温度２７°Ｃ，ｐ）１７〜７．５に調整しながら
攪拌速度３００ｒｐｍ、通気量０．５ ｖｖｍで５日間
、好気的に培養した。培養終了後、培養液を５℃に冷却
し、遠心して菌体および沈澱生成物とともに透明な上清
液を得る。この上清液を適当なポリマー非イオン性吸着
剤ポリスチレン−ジビニルベンゼンコポリ−ｒ −（ア
ンバーライトＸＡＤ−２が好ましい吸着剤である。）の
吸着床を通過させて、生成物を吸着させる。この吸着床
を脱イオン水で洗浄して不要の無機物を除き、ついでメ
タノールまたはエタノールで溶出し、生成物を回収する
。
このものと上記遠心により得られた固体層を７０％熱水
メタノールまたはエタノールで抽出して得られる生成物
とを混合する。この混合抽出物を減圧下に濃縮してメタ
ノールまたはエタノールをほとんど除き、濃縮物を得た
。
メタノールまたはエタノールで抽出して得られる生成物
とを混合する。この混合抽出物を減圧下に濃縮してメタ
ノールまたはエタノールをほとんど除き、濃縮物を得た
。
これをセファデクスＬＨ２０３５０ｇを充填したカラム
に吸着させ、０．０１Ｍ ＮａＣ１を含むクロロホルム
：メタノール（１： １）から成る混合溶媒で脂溶性画
分を溶出したのち、メタノールにて水溶性画分を回収し
た。これを減圧下に濃縮乾固し、３．５ｇの固形物を得
た。
に吸着させ、０．０１Ｍ ＮａＣ１を含むクロロホルム
：メタノール（１： １）から成る混合溶媒で脂溶性画
分を溶出したのち、メタノールにて水溶性画分を回収し
た。これを減圧下に濃縮乾固し、３．５ｇの固形物を得
た。
次に上記固形物をＤＢＡＥセファデクスＡ−２５６０ｇ
を充填したカラムにて０〜１Ｍの食塩濃度勾配下に溶出
することによってタウロリトコール酸のリン酸エステル
画分を採取した。
を充填したカラムにて０〜１Ｍの食塩濃度勾配下に溶出
することによってタウロリトコール酸のリン酸エステル
画分を採取した。
この目的画分を前記ＸＡＤ２樹脂に吸着させて脱イオン
水にて洗浄、脱塩後メタノールにて溶出し、タウロリト
コール酸−３−リン酸のナトリウム塩の結晶２．１ｇを
得た。
水にて洗浄、脱塩後メタノールにて溶出し、タウロリト
コール酸−３−リン酸のナトリウム塩の結晶２．１ｇを
得た。
〈実施例２〉
実施例１の培地のタウロリトコール酸の濃度を０．１ｇ
／１２とした培地にて、ｐＨ７、通気量０．５ｖｖｍｓ
攪拌速度３００ｒｐｍでＹ２−１株を４８時間培養した
。この菌体をガーゼにて採取し、ｐＨ７のリン酸緩衝液
で洗浄した後、これをに２肝０４１ｇ１グルコース１０
ｇ１酵母エキス０６５ｇおよびタウロリトコール酸０．
２ｇ、蒸留水１１から成る反応液＜ｐＨ７，５）に菌体
濃度２０ ｇ ／ １２となるように懸濁させて、３０
℃にて６０時間変−反応を行わせた。以後は実施例１の
場合と同一の操作により反応液１１当り０．１ｇのタウ
ロリトコール酸−３−リン酸のナトリウム塩の結晶を得
た。
／１２とした培地にて、ｐＨ７、通気量０．５ｖｖｍｓ
攪拌速度３００ｒｐｍでＹ２−１株を４８時間培養した
。この菌体をガーゼにて採取し、ｐＨ７のリン酸緩衝液
で洗浄した後、これをに２肝０４１ｇ１グルコース１０
ｇ１酵母エキス０６５ｇおよびタウロリトコール酸０．
２ｇ、蒸留水１１から成る反応液＜ｐＨ７，５）に菌体
濃度２０ ｇ ／ １２となるように懸濁させて、３０
℃にて６０時間変−反応を行わせた。以後は実施例１の
場合と同一の操作により反応液１１当り０．１ｇのタウ
ロリトコール酸−３−リン酸のナトリウム塩の結晶を得
た。
なお、本願発明の実施例（１１、（２）にて回収された
結晶を以下に列記する分析法を用いて化学的同定を行っ
た。
結晶を以下に列記する分析法を用いて化学的同定を行っ
た。
（１）２次イオン化質量分析（Ｓ ＩＭＳ）モレキュラ
ーピーク（Ｍ＋＋）（＋）は６３０に認められることよ
り分子量は６２９である。
ーピーク（Ｍ＋＋）（＋）は６３０に認められることよ
り分子量は６２９である。
（２）赤外吸収スペクトル
ＫＢｒ法にて測定した結果を第２図に示す。
１２０Ｑｃｍ−’にｐ−ｏ−φのＣ−Ｏ伸縮振動、１０
２１０２Ｏ’にＰ、０の伸縮振動を示す吸収が認められ
る。
２１０２Ｏ’にＰ、０の伸縮振動を示す吸収が認められ
る。
（３）融点
２８０℃にて分解した。
（４１’ Ｈ−Ｎ Ｍ Ｒ
サンプル測定は重水中で行った。
■ ４．５８ｐｐｍ Ｈ−Ｃ−ＯＨ（ｍ） ３位４．
０６ｐｐｍ ＬＣ（ｔ）タウリン側鎖メチレン３．５６
ｐｐｍ ＨｚＣ（ｔ）タウリン側鎖メチレン１．４２ｐ
ｐｍ Ｈ：＋Ｃ（ｄ） ２１位］、、４１ｐｐｍ ８３
Ｃ（Ｓ） １９位１１−１６ｐｐ Ｈ３Ｃ（Ｓ） １８
位■ ３位の１Ｈが基質タウロリトコール酸の３位の’
Ｈ（４，１０ｐｐｍ）より低磁場シフトしていることよ
りタウロリトコール酸の３α水酸基にリン酸基がエステ
ル結合していることがわかる。
０６ｐｐｍ ＬＣ（ｔ）タウリン側鎖メチレン３．５６
ｐｐｍ ＨｚＣ（ｔ）タウリン側鎖メチレン１．４２ｐ
ｐｍ Ｈ：＋Ｃ（ｄ） ２１位］、、４１ｐｐｍ ８３
Ｃ（Ｓ） １９位１１−１６ｐｐ Ｈ３Ｃ（Ｓ） １８
位■ ３位の１Ｈが基質タウロリトコール酸の３位の’
Ｈ（４，１０ｐｐｍ）より低磁場シフトしていることよ
りタウロリトコール酸の３α水酸基にリン酸基がエステ
ル結合していることがわかる。
（５） ホスファターゼによるリン酸エステルの遊離
実施例１で得られた結晶１■をｐＨ１０，４のグリシン
緩衝液５０ｍ１中に溶解し、１００ユニツトのアルカリ
ホスファターゼ（ＢｏｖｉｎｅＩｎｔｅｓｔｉｎａｌ
Ｍｕｃｏｓａ由来シグマ１ＶｋＬＰ−５５２１，）を添
加し、３７℃にて７時間脱リン酸化を行わせた。反応終
了後、反応液中に遊離したリンの量を比色定量法（デニ
ゲス法農芸化学実験書第１巻Ｐ１０３京都大学農学部農
芸化学教室曙）によって定量したところ４８．９μｇが
検出された。これはタウロリトコール酸のリン酸エステ
ルのナトリウム塩の中に含まれる理論的含有量４９．２
μｇとほぼ一致する。また、アルカリホスファターゼ処
理によって遊離したタウロリトコール酸を胆汁酸専用高
速液体クロマトグラフィー（日本分光製パイルパックお
よびエンザイムバックシステム）にて測定したところ、
１．６０μｍｏｌｅのタウロリトコール酸が検出された
。これは１■のタウロリトコール酸のリン酸エステルの
ナトリウム塩が理論的に含有するタウロリトコール酸の
含量１，５９μｍｏ１．ｅとほぼ一致する。以上質量分
析より分子量が６２９であること、赤外吸収スペクトル
よりリン酸基が認められることおよび基質がタウロリト
コール酸であることに基づいて、リン酸エステル化が起
こったと判断され、さらに’Ｈ−ＮＭＲスペクトルより
基質の水酸基にリン酸がエステル結合していることが確
認された。
緩衝液５０ｍ１中に溶解し、１００ユニツトのアルカリ
ホスファターゼ（ＢｏｖｉｎｅＩｎｔｅｓｔｉｎａｌ
Ｍｕｃｏｓａ由来シグマ１ＶｋＬＰ−５５２１，）を添
加し、３７℃にて７時間脱リン酸化を行わせた。反応終
了後、反応液中に遊離したリンの量を比色定量法（デニ
ゲス法農芸化学実験書第１巻Ｐ１０３京都大学農学部農
芸化学教室曙）によって定量したところ４８．９μｇが
検出された。これはタウロリトコール酸のリン酸エステ
ルのナトリウム塩の中に含まれる理論的含有量４９．２
μｇとほぼ一致する。また、アルカリホスファターゼ処
理によって遊離したタウロリトコール酸を胆汁酸専用高
速液体クロマトグラフィー（日本分光製パイルパックお
よびエンザイムバックシステム）にて測定したところ、
１．６０μｍｏｌｅのタウロリトコール酸が検出された
。これは１■のタウロリトコール酸のリン酸エステルの
ナトリウム塩が理論的に含有するタウロリトコール酸の
含量１，５９μｍｏ１．ｅとほぼ一致する。以上質量分
析より分子量が６２９であること、赤外吸収スペクトル
よりリン酸基が認められることおよび基質がタウロリト
コール酸であることに基づいて、リン酸エステル化が起
こったと判断され、さらに’Ｈ−ＮＭＲスペクトルより
基質の水酸基にリン酸がエステル結合していることが確
認された。
さらにホスファターゼ処理によってリン酸が遊離するこ
とから、この結晶はタウロリトコール酸−３−リン酸の
ナトリウム塩と同定された。
とから、この結晶はタウロリトコール酸−３−リン酸の
ナトリウム塩と同定された。
〈実施例３〉
水道水１１に対してグルコース５０ｇ、ポリペプトン５
ｇ 、酵母エキス２ｇ 、 ＫＩｈＰＯｔ ２ｇ −Ｋ
ｚＨＰＯａ ３ｇ ５Ｍｇ５Ｏ４−７Ｈｚ００．５ｇ、
Ｆｅ５Ｏａ ’７１ｈＯ１０ｍｇ 、 ＣａＣ１ｚ
１０ｍｇ、塩酸チアミン１０呵およびリン酸エステル
化の基質として表１に示した２６種類のステロイド化合
物をそれぞれ０．５ｇを混合して成る液体培地を５００
ｍ１の坂ロフラスコに１００ｍ１づつ分注し、１２１℃
１０分間滅菌し、室温にて冷却後、予めステロイドの入
っていない上記培地にて２日間２７℃で振盪培養したＹ
２−１株の培養液を５％接種した。各々の坂ロフラスコ
を２７℃にて３日間毎分１２０ストロークスで振盪培養
した。培養終了後培養液を５Ｎ塩酸および５Ｎの水酸化
ナトリウムにてｐＨ６に８周整しその２０ｍ ｌを４０
ｍ ｌのｎ−フ゛名ノールでそれぞれ抽出し、減圧下に
濃縮乾固した。−次に各濃縮物の半量にｐＨ１０，４の
グリシン緩衝液１０ｍ１を注入し、超音波処理を行って
均一溶液としたのち中小腸粘膜由来のアルカリホスファ
ターゼ（シグマ阻Ｐ−５５２１） １２．５ユニツトを
投入し、３７℃にて７時間脱リン酸化反応を行わせた。
ｇ 、酵母エキス２ｇ 、 ＫＩｈＰＯｔ ２ｇ −Ｋ
ｚＨＰＯａ ３ｇ ５Ｍｇ５Ｏ４−７Ｈｚ００．５ｇ、
Ｆｅ５Ｏａ ’７１ｈＯ１０ｍｇ 、 ＣａＣ１ｚ
１０ｍｇ、塩酸チアミン１０呵およびリン酸エステル
化の基質として表１に示した２６種類のステロイド化合
物をそれぞれ０．５ｇを混合して成る液体培地を５００
ｍ１の坂ロフラスコに１００ｍ１づつ分注し、１２１℃
１０分間滅菌し、室温にて冷却後、予めステロイドの入
っていない上記培地にて２日間２７℃で振盪培養したＹ
２−１株の培養液を５％接種した。各々の坂ロフラスコ
を２７℃にて３日間毎分１２０ストロークスで振盪培養
した。培養終了後培養液を５Ｎ塩酸および５Ｎの水酸化
ナトリウムにてｐＨ６に８周整しその２０ｍ ｌを４０
ｍ ｌのｎ−フ゛名ノールでそれぞれ抽出し、減圧下に
濃縮乾固した。−次に各濃縮物の半量にｐＨ１０，４の
グリシン緩衝液１０ｍ１を注入し、超音波処理を行って
均一溶液としたのち中小腸粘膜由来のアルカリホスファ
ターゼ（シグマ阻Ｐ−５５２１） １２．５ユニツトを
投入し、３７℃にて７時間脱リン酸化反応を行わせた。
次にこの反応液を２０ｍ１のｎ−ブタノールで抽出し、
減圧下に濃縮乾固した。このようにして調整した培養液
のｎ−ブタノール抽出標品とそれぞれをアルカリホスフ
ァターゼ処理した標品についてその一定量をｎ−ブタノ
ール：酢酸：水（１０： ５ ： ３）の展開溶媒系に
てシリカゲル（メルクキーゼルゲルＧ−６０、Ｆ２５４
．０．２５１１）の薄層クロマトグラフィー分析を行い
、ホスファターゼ処理によって消失するスポットのを無
とその量をＴＬＣスキャナー（島津デュアルウェイブレ
シス、ＴＬＣスキャナ・−）にて定量した。
減圧下に濃縮乾固した。このようにして調整した培養液
のｎ−ブタノール抽出標品とそれぞれをアルカリホスフ
ァターゼ処理した標品についてその一定量をｎ−ブタノ
ール：酢酸：水（１０： ５ ： ３）の展開溶媒系に
てシリカゲル（メルクキーゼルゲルＧ−６０、Ｆ２５４
．０．２５１１）の薄層クロマトグラフィー分析を行い
、ホスファターゼ処理によって消失するスポットのを無
とその量をＴＬＣスキャナー（島津デュアルウェイブレ
シス、ＴＬＣスキャナ・−）にて定量した。
表１は各基質とｙ２−１株によるそのリン酸化効率を示
したものである。
したものである。
表Ｉ Ｙ２−１株による各ステロイドのリン酸エステ
ル化の効率 ステロイド リン エステルヒｔシ （％）コレ
ステロール ３０コレスタン−３
β−オール ４０１７α−メチル−テストス
テロン ５０５α−アントロスタン−３β、
６５１７β−ジオール △５−アンドロステンー３β、 ６０１７β−
ジオール テストステロン ５５アンドロス
テロン ２５テヒトロイソアンドロ
ステロン １５△４−アンドロステン−１１β−
１０ オール−３，１７−シオン デオキシコルチコステロン ５１７α−ヒ
ドロキシ−プレグネノロン ３０プレドニソロン
１５アルドステロン
５コルチコステロン ２
０△５−プレグネン−３β−オール−４５２０−オン １７α−ヒドロキシ−プロゲステロン １０ヒドロコ
ルチゾン １０コルチゾン
１５１７α−エチニルエストラ
ジオール ５エストロン
７５エストリオール １０β
−エストラジオール ８０コール酸
４５ケノデオキシコール酸
３５ウルソデオキシコール酸
４０デオキシコール酸 ４５リ
トコール ５０
ル化の効率 ステロイド リン エステルヒｔシ （％）コレ
ステロール ３０コレスタン−３
β−オール ４０１７α−メチル−テストス
テロン ５０５α−アントロスタン−３β、
６５１７β−ジオール △５−アンドロステンー３β、 ６０１７β−
ジオール テストステロン ５５アンドロス
テロン ２５テヒトロイソアンドロ
ステロン １５△４−アンドロステン−１１β−
１０ オール−３，１７−シオン デオキシコルチコステロン ５１７α−ヒ
ドロキシ−プレグネノロン ３０プレドニソロン
１５アルドステロン
５コルチコステロン ２
０△５−プレグネン−３β−オール−４５２０−オン １７α−ヒドロキシ−プロゲステロン １０ヒドロコ
ルチゾン １０コルチゾン
１５１７α−エチニルエストラ
ジオール ５エストロン
７５エストリオール １０β
−エストラジオール ８０コール酸
４５ケノデオキシコール酸
３５ウルソデオキシコール酸
４０デオキシコール酸 ４５リ
トコール ５０
第１図はこの発明に係る変換反応基質の基本構造式を示
す説明図であり、第２図は実施例１によって生産された
タウロリトコール酸−３−リン酸のナトリウム塩の赤外
吸収スペクトルである。
す説明図であり、第２図は実施例１によって生産された
タウロリトコール酸−３−リン酸のナトリウム塩の赤外
吸収スペクトルである。
Claims (4)
- （１）ステロイド化合物をリン酸エステル化する能力を
有するモルティエレラ属に属する糸状菌を培養する工程
と、 該モルティエレラ属に属する糸状菌をステロイド化合物
またはそのアルカリ金属塩に接触させる工程と、 該ステロイド化合物またはその塩から変換されたステロ
イド化合物のリン酸エステルまたはそのアルカリ金属塩
を回収する工程 とを含むことを特徴とする微生物変換によるステロイド
化合物のリン酸エステルまたはそのアルカリ金属塩の製
造方法。 - （２）ステロイド化合物をリン酸エステル化する能力を
有するモルティエレラ属に属する糸状菌をステロイド化
合物またはそのアルカリ金属塩に接触させる工程が、該
糸状菌を培養する工程のための培養培地中で実行される
工程である特許請求の範囲第１項記載の微生物変換によ
るステロイド化合物のリン酸エステルまたはそのアルカ
リ金属塩の製造方法。 - （３）ステロイド化合物をリン酸エステル化する能力を
有するモルティエレラ属に属する糸状菌を培養培地から
採取する工程と、該糸状菌が懸濁する反応液を準備する
工程とを更に含み、前記糸状菌をステロイド化合物また
はそのアルカリ金属塩に接触させる工程が、該反応液中
で実行される工程である特許請求の範囲第１項記載の微
生物変換によるステロイド化合物のリン酸エステルまた
はそのアルカリ金属塩の製造方法。 - （４）モルティエレラ属に属する糸状菌がモルティエレ
ラ・ラマニヤーナ・ラマニヤーナ（￥Ｍｏｒｔｉｅｒｅ
ｌｌａ￥￥ｒａｍａｎｎｉａｎａ￥￥ｖａｒ￥．￥ｒａ
ｍａｎｎｉａｎａ￥）Ｙ２−１株である特許請求の範囲
第１項ないし第３項記載の微生物変換によるステロイド
化合物のリン酸エステルまたはそのアルカリ金属塩の製
造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12148885A JPS61280293A (ja) | 1985-06-06 | 1985-06-06 | ステロイド化合物のリン酸エステルの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12148885A JPS61280293A (ja) | 1985-06-06 | 1985-06-06 | ステロイド化合物のリン酸エステルの製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61280293A true JPS61280293A (ja) | 1986-12-10 |
Family
ID=14812400
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12148885A Pending JPS61280293A (ja) | 1985-06-06 | 1985-06-06 | ステロイド化合物のリン酸エステルの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61280293A (ja) |
-
1985
- 1985-06-06 JP JP12148885A patent/JPS61280293A/ja active Pending
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