JPS61501629A - 放射性標識化リポタンパク及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 放射性標識化リポタンパク及びその製造法発明の分野 本発明は、時に体外からの撮像に適した、放射性同位元素で標識した生物学的に 活性なりボタンバクに関し、更に詳しくはテクネチウム同位体で標識したりボタ ンバク並びにその製法゛に関するものである。

光１１と引数 過去において、リポタンパクの代謝は放射性同位元素＋ｔＪで標識したりボタン バクを静脈内に注入し、次いで血液中および／または尿中の放射能の経時変化を 測定することにより、生体内でモニタされていた。この同位体はγ−線放出体で あるので、放射像は代謝活性サイトおよびその度合をある程度描写している。リ ポタンパクの代謝は、これが静脈硬化症と密接に関係していることから特に興味 深いものである０例えば、米国特許出願第４２５．１８７号（１９８２年９月１ ８日出ＩＩＩ）に記載されているように、静脈硬化巣がＩＩＪで標識した低温リ ポタンパクを取込み、これら病巣は血流中にリポタンパクを導入した動物並びに ヒトにおいて体外的にＴ−線盪像によるモニタが可能である。しかしながら、こ れらの測定は＋２Ｊの貧弱な撮像特性のために幾分制限される。

テクネチウム−９９ｍなどの同位体は放射線医学においてしばしば利用されるも のである。というのは、これが短い半減期および高エネルギーγ−線を放射する ものであり、優れた体外像を与え、しかも生体内でのほんのわずかな放射線量の 吸収しかもたらされないためである。しかしながら、これらの同位体をリポタン パク（および一般的には生物学的分子）とカップリングすることは、そのカンプ リング分子の固有の構造もしくは生物的機能の損失をまねく恐れがある。リポタ ンパクば極めて不安定であり、ｐＨ７以下で急激に変性する。この事実により、 リポタンパクに放射性同位元素をカンプリングするために使用できる化学的方法 の範囲が制限される。更に、生物学的分子は活性サイト（他の生体化学物質また は構造成分との生物学的相互作用に対して応答性の該分子の部分）を有しており 、これら活性サイトに放射性同位元素が付着した場合、上記相互作用は化学的に あるいは立体的に妨害される。従って、同位体とカップリングした分子が変性し ない場合においてさえ、同様なかつカフプリングされていない対応分子と同程度 の生物学的活性を必ずしももたなくなる。このような同位体と結合した分子は目 的とする特定の生物反応の研究のためには不十分なものとなろう。

テクネチウム−９９ｍ　（９９＠Ｔｃ　）は外部撮像に特に適した同位体である 。テクネチウム化学の研究のためには、より安定な同位体９９Ｔｃを使用するこ とが好ましい場合がしばしばある。この事実はジョーンズ等（Ｊｏｎｅｓ　ａｔ 　ａｌ、ジャーナル　オン　ヌクレアーメデイスン（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｎ ｕｃｌｅａｒ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　）　、２１．２７９−２８１．１９８０）お よびデパンフィリス等（Ｄｅｐａｍｐｈｉｌｉｓ　ａｔａｌ、インオーガニック 　ケミストリー（Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　）、１９８３．２ ２．２２９２−２２９７）によって証明され、パーテクネテート（ＴｃＯａ−） を還元することにより安定なテクネチウム−ジチオレート錯体が得られることが 示された。この安定な錯体を形成するのに有効な還元剤はナトリウムジチオナイ トである。またその収率はｐＨ１１もしくはそれ以上で最大とはならず、いくつ かの安定なテクネチウム−ジチオレート錯体は生理的ｐＨ（５〜８）で形成され た。これらの研究においては、テクネチウムがタンパク並びにリポタンパクと共 に安定な錯体を形成するであろうことについて何の示唆も与えなかった。

ステイグマン（Ｓｔｅｉｇｍａｎ、ジャーナル　オン　ヌクレアーメディスン（ Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｎｕｃｌｅａｒ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）　、ｌ　９７５． １６．５７３〕により提出されたアブストラクトはバーテクネテートをアスコル ビン酸および塩化第２鉄で還元し、次いで一連のｐ）１９〜２の環境中での工程 により馬血清アルブミン（ＨＳ　Ａ）に付着させることにより得られるテクネチ ウム−Ｈ３Ａ錯体を開示している。このような低ｐｉではりボタンバクは変性さ れる。従って、テクネチウムとアルブミンとを錯化するステイグマンの方法は放 射性標識リポタンパクの形成に適用できない。

良好な撮像特性を有する多くの放射性同位元素がタンパクのアミノ基に共有結合 的に結合し得る２官能性キレート剤であるジエチレントリアミンペンタ酢酸（Ｄ ＴＰＡ）を錯化することが知られている。このＤＴＰＡはアルブミン〔クレジャ レフク＆ツッカ−（Ｋｒｅｊａｒｅｋ　ａｎｄ　Ｚｕｃｋｅｒ）、バイオケミカ ル＆バイオフィジカルリサーチ　コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ ｌ　ａｎｄ　ＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔ ｉｏｎｓ　）　、１９７７．７７．５８１−５８５゜ナトピッチ等（Ｈｎａｔｏ ｗｉｔｃｈ　ｅｔ　ａｌ、）、インターナショナル　ジャーナル　オン　アプラ イド　ラジエーシ９ン＆アイソトープス（Ｉｎｔｅｒｎａｔｊｏｎａｌ　Ｊｏｕ ｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｒａｄｉａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｌ５ｏｔｏｐ ｅｓ）、１９８２．３３．３２７−３３２）および免疫グロブリンＧ（ＴｇＧ） （ナトピッチ等（Ｈｎａｔｏｗｉｔｃｈ　ｅｔ　ａｌ、　）　、サイエンス（Ｓ ｃｉｅｎｃｅ）、１９８３．２２０．６１３−６１５）と結合し、この結合生成 物はインジウムと錯化する。ＤＴＰＡは他の金属、例えばＴｃ　、Ｐｂ　、Ｈｇ 　、ＧａおよびＭｎなどと錯化することが知られている。

タレジャレソク＆ツノカーはＤＴＰＡとＨ５ＡとをＤＴＰＡのカルボキシ炭酸無 水物を用いて錯化した。この結合方法はまずｐｎ７〜８で反応させ、次いでｐＨ ５，５で酢酸バンフ１−で透析し、更にｐＨ３，５でカラムクロマトグラフィー によりＤＴＰＡ−Ｈ３Ａ生成物を単離する工程を含む。インジウムはｐＨ３−５ においてＤＴＰＡ　−Ｈ３Ａキレートに添加される。このタレジャレック＆ツッ カーにより使用されたｐＨもリポタンパクを変性させる。

ナトピッチは、ＤＴＰＡのカルボキシ炭酸無水物よりもある種のタンパクに対し て高い反応性を示すＤＴＰＡの環状無水物を使用し、その結果これらのタンパク をより柔和な反応条件下でより高効率でＤＴＰＡと結合できた。最適のカンプリ ングはｐｌ（７（これも依然としてリポタンパクについては使用できないｐＨで ある）で起こる。

このように、上記したタレジャレンクおよびナトピッチによるＤＴＰＡのカップ リング法はいずれも、後に放射性同位元素と錯化されるリポタンパクに対して直 接適用することはできない。反応条件におけるわずかな変化も得られる生成物に 影響することが知られている。例えば、反応条件の変更はＤＴＰＡのタンパクへ の結合効率を低下し、これはまたＤＴＰＡ結合タンパクと錯化し得る放射性標識 物質の量を減じる結果となる。得られる生成物は実用に際し不充分な特性放射能 しか存していない、また、生体分子に任意の同位体を付着させた場合と同様に、 得られる生成物は所定の生物学的活性をもたない。このような生物学的活性の変 化は、より大きな化合物、例えばＤＴＰＡが生体分子に結合した場合に一層起こ り易い。

３里坐舞！ そこで、本発明は体外撮像に適した、改良された放射性標識化リポタンパクを提 供することを目的とする。

本発明の他の目的は固有の生物学的活性を実質的に維持し、かつ生体内リポタン パク代謝のモニタのために使用できる改良された放射性標識化リポタンパクを提 供することにある。

更に別の本発明の目的は、比較的安価で容易に製造できる改良された放射性標識 化リポタンパクを提供することにある。

更に他の本発明の目的は、リポタンパクまたはりボタンバクの示す生物学的活性 を呈する他の分子を、体外撮像に適した同位体で放射性標識する方法を提供する ことにある。

他の目的は一部は明らかであり、一部は以下で明らかにされるであろう。

簡単にいえば、本発明は生物学的に活性なりボタンバクまたはりボタンバクの生 物学的機能の１またはそれ以上を有する他の分子を含み、これらはテクネチウム （Ｔｃ　）で放射性標識されている。更に詳しくは、本発明はテクネチウム同位 元素で放射性標識された生物学的に活性な低密度リポタンパクバＬＤＬ）および このような標識リポタンパクの製造法を含む。

テクネチウムを標識した低密度リポタンパク錯体（Ｔｃ−ＬＤＬ　）の好ましい 製造方法はＬＤＬとパーテクネテートＣＴｃ０．−　）とをｐＨ８〜９でナトリ ウムジチオナイトで同時に還元することからなる。ＬＤＬおよびＴ　ｃ　Ｏａ− を−緒に混合し、新たにナトリウムジチオナイトを添加し、混合物を室温にて３ ０分間攪拌する。

混合物はカンプリング処理中ずっとｐＨを８〜９に保つ、Ｔｃ−ＬＤＬは分子篩 クロマトグラフィーまたは濾過によって未反応テクネチウムおよびジチオナイト から分離される。

また、キレート化剤、即ちＤＴＰＡはＬＤＬと結合でき、結合したＤＴＰＡ−Ｌ ＤＬ生成物を次いで単離する。テクネチウム同位体は、ナトリウムジチオナイト の存在下で還元によってＤＴＰＡ　−ＬＤＬと実質的に錯化される。放射性標識 化Ｔｃ　−ＤＴＰＡ−ＬＤＬｔｆ体は分子篩クロマトグラフィーによって未錯化 テクネチウムから分離される。

皿皿生呈皇星星豊 第１Ａ図は、本発明の方法に従って処理した、Ｌ　Ｄ　Ｌ　５ＴｃＯａ−および ナトリウムジチオナイトの反応混合物のクロマトグラフィーによるカラム溶出プ ロファイルを示す図である。実線は放射能であり、点線はタンパクである。

第１Ｂ図は本発明の方法に従って処理した、Ｌ　Ｄ　Ｌ　、　ＴｃＯａ−および ナトリウムジチオナイトの反応混合物から得たクロマトグラフィーカラムの溶出 プロファイルを示すものであり、実線は放射能であり、点線はタンパクを示す。

第１Ｃ［ｆｆｌは本発明の方法に従って処理したが、ナトリウムジチオナイトを 含まない天然のＬＤＬとＴ　ｃ　Ｏａ−の混合物から得たクロマトグラフィーの カラム溶出プロファイルを示す、実線は放射能を、また点線はタンパクを表す。

第２Ａ図は天然ＬＤＬとＴｃ　−ＬＤＬの免疫電気泳動プロファイルを表すもの である。

第２Ｂ図はＴｃ　−ＬＤＬの免疫電気泳動のオートラジオグラフである。

第１表は、４〜８　ｍ　Ｃｉのヒト””Ｔｃ　−Ｌ　Ｄ　Ｌを静脈内注入後１８ 時間経過後のウサギ内における９９“Ｔｃ　−ＬＤＬの生体分布を示すものであ る。

ましいｉ、の゛しい發己載 低密度リポタンパク（ＬＤＬ）の調製 ＬＤＬは正常なヒト血漿から、例えば密度平衡遠心分離法〔ハツチ＆リー（Ｈａ ｔｃｈ　ａｎｄ　Ｌｅｅｓ）　、アトパンスズ　イン　リビフドリサーチ（Ａｄ ｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｌｉｐｉｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）　％　１９６８．６．１ −６８〕を利用した逐次浮遊によって分離される。血漿の密度は、臭化カリウム 溶液を添加することにより１．０２５ｇ／ｍ１にｔｍ節し、１００．０００ｇで ２２時間超遠心分離する。上澄（密度１．０２５ｇ／■１未満のりボタンバクを 含む）は取出し、捨てる。

下部溶液の密度を次に１．０５０ｇ／■ｌに、更に臭化カリウム溶液を加えて調 節し、１００．ＯＱＯｇで２２時間２度目の超遠心分離する。第２の上澄（密度 １．０２５〜１．０５０ｇ／膳ｌの範囲の低密度リポタンパクを含む）を取出し 、ｐ）１８．６の０．１５　ＭＮａＣ１および１．ＯｍＭ　ＥＤＴＡ二ナトリウ ムを含む炭酸水素ナトリウムバンフ１−で２４時間透析するか、あるい・は透析 なしに使用する。

このＬＤＬは使用前に０．２２μのフィルタを通して濾過して混入している微生 物を除去する。

他の手続きを用いてＬＤＬを精製することもできる。これら手順はヘパリン−塩 化マンガン沈澱〔フレドリクソン等（Ｆｒｅｄｒｉ−ｃｋｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、 ）　、ニュー　イングランド　ジャーナル　カン　メディスン（Ｎｅｗ　Ｅｎｇ ｌａｎｄ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｆｅ　）　％　ｌ　９６７．２７ ６．３２−４４．９４−１０３．１４８−１５６．２１５−２２６．２７３−２ Ｅ１１］あるいはヘパリン−アガロース　アフィニティー　クロマトグラフィー 〔フィールディング＆フィールディング（Ｆｉｅｌｄｉｎｇ　ａｎｄ　Ｆｉｅｌ ｄｉｎｇ　）　、プロシーディングズ　カン　ナショナル　アカデミ−カン　サ イエンスＣＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　 ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅ）　ＵＳ　Ａ％　１　９　Ｂ　Ｏ、二り二し、３３２７− ３３７０）　、次いで不連続密度勾配法〔ハツチ＆リー（Ｈａｔｃｈ　＆　Ｌｅ ｅｓ　）　、？ドバンスズ　イン　リビ７ド　リサーチ（Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉ ｎ　Ｌｉｐｉｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　）　％　１９６８．６．１−６８）を利用 した超遠心分離を含む。

放射性標識法 ＬＤＬは直接テクネチウム（Ｔｃ　）で標識するか、あるいはジエチレンアミン ペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）などの強力なキレート化グループの共有結合的結合を介 して間接的に行うことができる。

上記ＤＴＰＡはインジウム−１１１などの放射性同位元素を含む各種金属を錯化 することが知られている。

１、ＬＤＬのテクネチウムによる直接標識テクネチウムは以下のような方法でリ ポタンパクに直接結合されるａ　５０　ｍ　Ｃｒの９９＋″Ｔｃ　（ＴｃＯａ− の形状の）を含む水性溶液０．５−ｔを、ｐｔｔａのＬＤＬを２〜６■含有する ０、２Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液０．５＋ｊ！に添加し、室温にて１０分間十分 に混合する。必要ならば０．２５Ｍ水酸化ナトリウムでｐＨを８〜９に上げ、混 合物を、新たに蒸留した水０．５＋ｗｊ！中に１０■（５７，５μモル）のナト リウムジチオナイトを溶解した溶液を加えて還元する。得られる混合物を室温に て３０分間ゆっくり攪拌する。

放射性標識されたＬＤＬ画分を、変性もしくは会合ＬＤＬ、未結合テクネチウム およびナトリウムジチオナイトから、分子篩クロマトグラフィーで分離する。重 炭酸塩−ＥＤＴＡパンファー（０，２Ｍの炭酸水素ナトリウム（ｐＨ８）および ０．００１Ｍのエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）を含む〕で平 衡にした寸法２Ｘ５（Ｊのセファデックス０５０Ｍカラムが分離に適したもので ある。このカラムをブルーデキストランおよびヨウ化カリウムで標準化して、空 隙容量およびカラ五体積を夫々決定する。

反応混合物をカラムに掛け、重炭酸塩−ＥＤＴＡバッファーを用いてカラム画分 を溶出する。ＬＤＬに特徴的な位置で溶出する巨大分子放射能にピークを分離し 、これを使用に供する。

乙　リポタンパクへのテクネチウムの間接的結合ＤＴＰＡは、タレジャレンクお よびツソカーにより開示された方法に従ってリポタンパクと結合される。ＤＴＰ Ａのカルボキシ炭酸無水物の溶液の了りコート５．５μｆｆ１（０，７〜３．２ μモル）を２〜３　ａｌｔのＬＤＬ　（６■、１．２×１０づμモル）に添加し 、得られる混合物をゆっくり攪拌する。上記無水物対タンパクのモル比は３００ 程度である。反応中、０．２　Ｍ　ＮａＨＣＯｓでｐＨ８に保つ、この混合物を 室温にて１５分間攪拌し、４℃にて１８時間熟成する。

未反応のＤＴＰＡを重炭酸塩−ＥＤＴＡバッファーで透析して除（。

また、ＤＴＰＡの環状無水物はナトピッチ等の方法に従って調製し、以下の手順 でＤＴＰＡをリポタンパクと結合させるために使用する。

１０μｇの環状ＤＴＰＡ無水物を、室温で、１．Ｏｍｆの０．０５Ｍ＊ａ水素ナ トリウムバッファーに３■のＬＤＬを溶解した溶液に添加し、混合物を１０分間 攪拌する。得られるＤＴＰＡと結合したりボタンバクを、ｐＨ８の０．２Ｍ炭酸 水素ナトリウムバッファーで平衡化したセファデックスＧ２５クロマトグラフイ ーカラムを通過させることによって、未反応ＤＴＰＡから分離する。

次いで、テクネチウムを、天然ＬＤＬの直接標識する際の上記の手順に従ってＤ ＴＰＡ−ＬＤＬに結合させる。ＴｅＯ２−形状にあるテクネチウムをＤＴＰＡ− ＬＤＬに添加し、この混合物を１８〜９にてナトリウムジチオナイトで還元する 。次いで、カラムクロマトグラフィーによって、テクネチウム標ｍＤ　Ｔ　Ｐ　 Ａ　−ＬＤＬを非錯化テクネチウムおよびナトリウムジチオナイトから分離する 。

いくつかの場合においては、処理並びに実験を単純化するために、長い半減期を 有するテクネチウム同位体（”Ｔｃ　）を、短い半減期の””Ｔｃの代りに用い た０例えば、９９Ｔｃ同位体は標識条件を決定する際に、また天然ＬＤＬと放射 性標識ＬＤＬとの物理的、化学的特性を比較するために、並びに放射性標識ＬＤ Ｌの生物学的活性を証明する予備的生体内試験のために使用した。

”Ｔｃ同位体をＬＤＬと結合する場合、５０ｍＣ１雫”Ｔ　ｃの代りにｌμＣ４ ”Ｔｃを使用する以外は上記標識方法に従った。

Ｔｃ　−ＬＤＬおよびＴｃ　−ＤＴＰＡ−ＬＤＬ結合の証明：直接および間接放 射性標識性両者から得た反応混合物を分子篩クロマトグラフィーによって分析し て、実際に上記方法によりリポタンパクが放射性標識されているかどうか調べた 。天然ＬＤＬ、熱変性ＬＤＬおよび未反応テクネチウムを分子篩クロマトグラフ ィーカラム内に通過させて、このカラムを校正した。カラム画分を夫々タンパク および放射能に関してモニタした。熱変性ＬＤＬは空隙容量中に溶出された。天 然ＬＤＬはその分子サイズに特徴的な容量において溶出した。また未反応テクネ チウムはカラム容量中に即ち小分子ピークとして溶出した。

別の実験では、上記のような方法に従って、ナトリウムジチオナイトで還元する ことにより”ＴｃとＬＤＬとを結合させた。得られた混合物を校正後のクロマト グラフィーカラムによって分析した。添付第１Ａ図に、直接標識法、即ちＴｃ　 −ＬＤＬの形成に対する溶出プロファイルの結果を示した。プロファイルＩＯＡ はカラム溶出液の放射能測定を表し、プロファイル１２Ａは２８０ｎｍにおける 紫外吸収により決定した溶出液のタンパクアッセイを示す。プロファイルＩＯＡ は溶出された放射能の１／３〜〃が天然ＬＤＬの位置に対応する巨大分子ピーク にあることを示している。残りの放射能は小分子に特徴的な容量中に溶出された 。プロファイルＩＯＡおよび１２Ａによって示したように、空隙容量中には放射 能並びにタンパクはまったく観測されなかった。

第１Ｂ図は間接標識法、即ちＴｃ　−ＤＴＰＡ−ＬＤＬの形成に対する溶出プロ ファイルを示す、上記プロファイルＬＯＡおよび１２Ａに夫々対応するプロファ イルＩＯＢおよび１２Ｂは、Ｔｃ−ＬＤＬについて記録されたものと本質的に同 じＴｃ　−ＤＴＰＡ−ＬＤＬについての記録である。

これら実験のコントロールとして、”ＴｃＯ，−およびＬＤＬを、還元剤を全く 使用しない以外は上記方法に従って混合した。

第４Ｃ図はこの結果得られた該混合物に対する溶出プロファイルを示すものであ る。夫々放射能測定およびタンパクアッセイを表すプロファイルＩＯＣおよび１ ２Ｃは、天然ＬＤＬピークには放射能が検出されないことを示している。

従って、これらのクロマトグラフィーによる研究は、テクネチウムが単純にＬＤ Ｌと会合しているのではなく、上記結合法を使用した場合にはテクネチウム−リ ポタンパク錯体が天然ＬＤＬに直接付着するかあるいはＤＴＰＡ−ＬＤＬと間接 的に錯化されることにより形成されていることを示している。更に、ＬＤＬを変 性しない反応条件下では、リガンドＤＴＰＡの使用は天然ＬＤＬにつき得られる ものと比較して高いテクネチウム結合を形成しない。

ヒトの研究では、リポタンパクを放射性標識するための上記したテクネチウム− リポタンパク結合方法は無菌条件下で行わねばならない。これはカラムクロマト グラフィー手法が結合ＬＤＬを単離するために使用された場合には難しい。しか しながら、ｐＨ９にてジチオナイト還元により調製されるＴｃ　−ＬＤＬ　（第 １Ａ図）は、カラム空隙容量中に放射能もタンパクも存在しないことによって示 されるように、凝集ＬＤＬを形成しない。標識反応で形成される唯一の大分子量 種は放射性標識ＬＤＬである。従って、放射性標識ＬＤＬの単離のためには、大 分子量ＬＤＬを反応混合物中の小分子、還元テクネチウムおよびジチオナイトか ら分離することのみが必要とされる。従って、放射性標ＩＬＤＬは濾過および洗 浄によって反応成分から分離でき、この手順では無菌性が容易に維持される。

例えば、Ｔｃ−ＬＤＬおよびその反応混合物は、上記のように、予め無菌化処理 した寸法２Ｘ５ＧｌのセファデックスＧ５０Ｍゲル濾過カラムに通される。

ＴｃとＬＤＬおよびＤＴＰＡ−ＬＤＬとの結合におけるｐＨの効果： テクネチウムとＬＤＬおよびＤＴＰＡ−ＬＤＬとの結合におけるｐｉ環境の効果 は同様に分子篩クロマトグラフィーで見積られる。

ｐＨ１ｏ〜１１でテクネチウムを還元することにより、４５〜７０％の範囲の標 識効率が達成される。しかしながら、これらｐ）Ｉの下での結合操作では標ＩＬ ＤＬの収率が低下する。というのはこのようなｐＨでは天然り、ＤＬの変性およ びＬＤＬ凝集体の形成が促進され、これらはクロマトグラフィーにかけた際空隙 容量中に溶出される。この工程をｐＨ８〜９の環境で行った場合、４０％という 低い結合効率が結果される。しかしながら、溶出プロファイルは天然ＬＤＬと同 じであり、このことは変性並びに凝集が無視し得ることを示している。従って、 ｐＨを８〜９とすることがテクネチウムＩｔｉｌｌｉリポタンパクを得るために 好ましい、これはＬＤＬの最小の物理的変化を保ちつつ比較的高い標識効率を与 えるからである。

わずかにアルカリｐＨの下でテクネチウムを還元することにより、上記ジョーン ズ等によって報告されたようにテクネチウムとりボタンバクの結合と競合する反 応によってコロイド状Ｔ　ｃ　Ｏｔが作製されるが、このことば本明細書で記載 した標識法が不十分であることを示している。しかしながら、コロイド状テクネ チウムは我々の方法により得られる反応生成物中には検出されず、これはクロマ トグラフィーの空隙容量中に非タンパク結合高分子量放射性種がないことにより 、また超遠心分離における遠沈管底部に同様な種がないことにより証明される。

（第１Ａ図、第１Ｂ図および以下の記載参照）。

Ｔｃ　−ＬＤＬおよびＴｃ　−ＤＴＰＡ−ＬＤＬと天然ＬＤＬとの物理／化学的 比較並びにＴｃ　−ＬＤＬ結合の安定性：以下のようなテストを行って、本発明 の標識法により得られるテクネチウム−ＬＤＬの安定性を確認し、また放射性標 識生成物と天然ＬＤＬとの物理的および化学的性質の比較を行った０強力理的、 化学的性質の維持は、生体内での使用中におけるγ−線検出が天然リポタンパク 活性を正確に表示することを保証するために必要である。

■、直接およびＤＴＰＡによる２つの方法でのテクネチウムとＬＤＬとの結合安 定性は平衡密度超遠心により調べられた。適当な密度の下でＬＤＬは超遠心にお いて浮遊し、強＜ＬＤＬに結合したテクネチウムは結合したままであり、従って 上澄中に見出される。ゆるく結合したテクネチウムはＬＤＬと分離され、超遠心 分離後遠沈管内に均一に分布する。一方、コロイド状テクネチウムジオキシドは 管の底部に沈降する。巨大分子クロマトグラフィーピークから得られ、約０．１ μＣｉの放射能を有する約１．５■の９”Ｔｃ−ＬＤＬは１００，０００ｇで２ ２時間、密度１．０６３ｇ／ｓｊ＋の下で超遠心分離にかけた。この際の上澄は 全放射能の８４％（多数のサンプルについての平均）を含有する。　”Ｔｃ　− ＤＴＰＡ−ＬＤＬにつき実験を繰返すと、上澄液は超遠心後の全放射能の７９％ を含む、放射能の濃縮は管の底部には観測されなかった。上記コントロールも超 遠心によって分析した。ナトリウムジチオナイトなしに熟成したパーテクネテー トと天然ＬＤＬとの混合物を超遠心分離した場合、上澄液は全放射能のわずかに ５％を含むだけである。同様に、還元テクネチウム（ＬＤＬなしにテクネチウム とナトリウムジチオナイトを熟成）を超遠心分離した場合、上澄液中に放射能は 浮上しなかった。

かくして、上記結果はテクネチウム標識リポタンパク中にみられる放射能の大部 分がりボタンバクに強く結合していることを示している。

２、　テクネチウム−リポタンパク結合の安定性およびテクネチウム標識リポタ ンパクの物理的／化学的特性両者をペーパー電気泳動法で分析した。各種テクネ チウム標識ＬＤＬサンプル（以下に同定する）およびコントロールを平行して電 気泳動し、ストリップを脂質につき染色し、放射能につき走査した。天然ＬＤＬ 、”Ｔｃ−ＬＤＬ、ＤＴＰＡ−ＬＤＬおよび”Ｔｃ　−ＤＴＰＡ−ＬＤＬの電気 泳動は同じＬＤＬ移動度の単一バンドを示すことが証明された。”Ｔｃ　−ＬＤ Ｌおよび”Ｔｃ　−ＤＴＰＡ−ＬＤＬを含有する電気泳動ストリップを、ストリ ップカウンタで放射能につき走査したところ単一の放射能ピークがみられ、これ らピークは上記物質の脂質染色バンドに位置していた。染色によって検出される 熱変性ＬＤＬコントロールは原点にとどまっていた。還元テクネチウムのコント ロールも放射能のシャープな単一のピークで示されるように原点にとどまってい た。これらの結果は、ＬＤＬ移動度を有するリピノド染色バンド中に検出さ机た 放射能はＬｌ）Ｌに直接またはＤＴＰＡにより間接的に結合したテクネチウムを 表し、またＴｃ　−ＬＤＬおよびＴｃ　−ＤＴＰＡ−ＬＤＬの電気泳動特性が放 射性標識中にあるいはタンパクに結合した低分子比のＤＴＰ’Ａによって変えら れないことを示している。

３、Ｔｃ−ＬＤＬの物理／化学的特性を、夫々第２Ａ図および第２Ｂ図に示すよ うに、免疫電気泳動およびオートラジオグラフィーによって更に調べた。第２Ａ 図における沈降素アーク１４Ａおよび１６Ａは夫々天然ＬＤＬおよびＴｃ　−Ｌ ＤＬの免疫電気泳動プロフィールを示し、いずれもウサギの抗−ＬＤＬ抗血清と 接触させた後のものである。Ｔｃ　−ＬＤＬに対する沈降素アーク１６Ａの位置 並びに形状は天然ＬＤＬに対するアーク１４Ａのものと対応している。

第２Ｂ図は第２Ａ図に示した同一の免疫電気泳動スライドのオートラジオグラフ を示すものである。プロフィール１６Ｂは免疫電気泳動後Ｔｃ−ＬＤＬ中に存在 する放射能分析を表す、プロフィール１６Ｂは免疫沈降素アーク１６Ａと重った 、均一の放射能を有する単一のアークを示す。この免疫電気泳動およびオートラ ジオグラフィーの結果から、更に移動度、均一性および免疫学的同等性に関して Ｔｃ　−ＬＤＬと天然ＬＤＬとの間の類似性が明らかとなる。

４、　テクネチウム−ＬＤＬ結合の安定性およびタンパクと脂質量の標識物質の 分布はクロロホルム−メタノールによる抽出によって調べた。抽出の隙に、ＬＤ Ｌの脂質成分はクロロホルム相に可溶化し、ＬＤＬのタンパク成分は水性相に残 される。ＬＤＬにゆる（結合しているテクネチウムは水性相に可溶である。タン パクに結合した放射性標識はトリクロロ酢酸の添加によりタンパクを水性相から 沈澱させることで未結合放射性標識物から分離できる。

上記方法で調製された”Ｔｃ　−ＬＤＬはクロロホルム−メタノールの２　：　 １　（Ｖ／Ｖ）混合液と混合される。攪拌し、遠心分離した後、クロロホルム相 を取出し、放射能を測定した。残された水性相からのタンパクをトリクロロ酢酸 で沈澱させ、沈澱中の放射能を決定した。タンパク沈澱は全放射能の７８〜９０ ％を含み、一方クロロホルム抽出された脂質はわずかに２．４〜４．４％の放射 能を含むにすぎなかった。これらの結果から、更にテクネチウムが強＜　ＬＤＬ に結合していることがわかる。これらはまたテクネチウムがＬＤＬのタンパク成 分に結合することを示している。

Ｔｃ　−ＬＤＬのウサギ中での生体分布および挙動：更に、上記結果は、電気泳 動、免疫電気泳動並びに超遠心による標ｍＬＤＬおよび天然ＬＤＬ間の類伯性に よって示されたように、テクネチウム標識リポタンパクが最小の物理、化学的変 化しか受けないことを示している。従って、これらの放射性標識リポタンパクは 生体中でのりボタンバク代謝を正確に表示してくれる。

以下のようなテストを実施して、生体内でのテクネチウム標識リポタンパクの挙 動および分布を調べた。

２匹の二二一ジランドホワイトラビット（２〜３ｋｉｒ）の静脈内に、本発明の 方法で調製し、注入直前に０．２２μフイルターで濾過した”Ｔｃ　−ＬＤＬ　 （０，１５μＣｉ　、　１．７ｍｇヒトＬＤＬタンパク）を注射した。注射後、 ３６時間に亘り一定間隔で血液サンプルを採取した。各採取後、血漿を４０℃で 分離し、放射能測定用アリコートおよび密度１．０６３　ｇ／　ｗａｌにて超遠 心分離により”Ｔｃ　−ＬＤＬを単離するためのアリコートに分割した。

ラビットからのヒト”Ｔｃ　−ＬＤＬの血漿中クリアランスはビエキスボネンシ ャルであり、遅い成分は１８〜２２時間という半減期を存し、”’　Ｉ　−Ｌ　 Ｄ　Ｌについて得られた前の結果と同様である。注入後１〜１２時間で取出し、 超遠心分離した血液サンプルは、ＬＤＬを含有する浮遊百分中において、血漿放 射能の７０〜８０％を示すことがわかった。

同様に、１６匹の他のラビットの静脈にも””Ｔｃ　−Ｌ　Ｄ　Ｌ（４〜８ｍＣ １，１，５■タンパク）を注射した。注射後１６時間経過後、ラビットを麻酔に かけ、平行孔コリメータを備えた標準アンガーシンチレーションカメラ（テクニ ケア５５ｏ）を用いて前方、後方から撮像した。撮影時間は１ｏ分であり、この 間約ａｏｏ、ｏｏｏカウントが観測された。すべての動物において、副腎、肝臓 、腎臓、肺臓および腸管による放射能の蓄積が明らかとなった。注射後１８時間 経過した時点でラビットを殺し、器官を取出し、浄化し、秤量し、放射能をカウ ントした。雫９・Ｔｃ　−ＬＤＬの生体分布は第１表にｇ当たり、および器官当 たりの注入放射能の百分率として表した。各器官に対して可視化された像の強度 は、生体分布研究において測定された放射能に比例することがわかった。

以上の記載からｐＨ９にてナトリウムジチオナイトによってバーテクネテートお よびＬＤＬを同時に還元することにより、テクネチウム標識リポタンパクが容易 に得られることがわかる。更に、本発明の方法で標識した低密度リポタンパクは 実質的にその固有の構造並びに生物学的機能を維持している。かくして、これら は体外撮像用プローブとして適しており、リポタンパク代謝を解析するのに適し ている。

かくして、上記本発明の目的の中で上記記載により明らかになったものは有利に 達成される。また、上記構成を実施する際には本発明の範囲を逸脱することなし にある変更を行うことができる。

例えば、テクネチウムの代りに、ＤＴＰＡ−ＬＤＬと錯化することによって撮像 に適したものとなる他の同位体、例えばインジウム、鉛または水銀を使用するこ とができる。また、いくつかのりボタンバク代謝研究に対して、化学的に変えら れたりボタンバク分子または該分子の活性アミノ酸シーケンスを使用できる０例 えば、ＬＤＬは高−アフィニティー受容体を介しである種の器官に結合すること が知られており、該受容体はＬＤＬのリジンおよびアルギニン残基を含む。しか しながら、この高−アフィニティー受容体の先天的欠乏症のまたはまったく欠乏 している両親は早期かつひどい静脈硬化症を有していることが知られており、そ こで動脈中には高濃度でＬＤＬが存在する。か（して、動脈ＬＤＬ蓄積の機構は 高−アフィニティ一受容体とは異なる受容体およびＬＤＬ分子の異なった受容体 結合部を介して解釈されねばならない、ＬＤＬの還元メチル化は、このＬＤＬの 高−アフィニティー受容体結合を失わせることが示されている。従って、メチル 化Ｔｃ　−ＬＤＬは動脈の体外撮像用プローブとして使用するのに適している。

というのは、これが依然として動脈硬化巣に結合しており、また他の器官におけ る結合サイトに対する低いアフィニティーを存しているからである。かくして、 本発明のプローブは他の器官により殆ど取込まれることなく、かつより鮮明な背 景放射能で動脈像を与えることが確信される。

また、動脈壁に結合しているアミノ酸配列を含むオリゴペプチドの合成およびこ のペプチドのテクネチウムによる標識は安定な、動脈症お動脈硬化症検知用の完 全な合成撮像剤の製造を可能とする。

従って、上記記載に含まれる事項並びに添付図に示された事項は本発明を例示す るためのものであり、制限するものではないと理解すべきである。

また、以下の請求の範囲は、ここに記載した発明Φ上意概念的特徴かつ特異な特 徴のすべてを包含するものである。

第１表 ウサギ中での””Ｔｃ　−Ｌ　Ｄ　Ｌの生体分布ｇ当たりの注入　器官当たりの 注入 放射能の百分率　放射能の百分率 （”Ｓ、Ｅ、Ｍ−）　（±Ｓ、Ｅ、　Ｉｔ、）静脈血　０．０３±０．０１　− −− 肝臓　０．１９±０．０２　２１．１±１．３牌ＥＩ　０．２２　＋　０．０４ 　（Ｌ　４　＋　（Ｌ　１副腎（全体）”　０．８１”Ｑ、１９　（Ｌ２＋０． １（皮質）”　０．９２±Ｏ，Ｑ９　０．３＋０．１（髄質）”　０．５９±０ ．０６　０．１ｆＯ，１腎ｙｓ＜皮質＞　０．１１”０．０２　２．．９±０． ４（髄質）　０．０４”０．０１　０．９±０．２小腸　０．０１±０−００　 １．３±０．２”大腸　０．０５　＋０．０１　２．３　＋０．３”筋肉　（Ｌ ＯＱ２±０．０　１−６＋０．３”大静脈（１１部）　０．０２±０．００　− −−＊　全副腎線を秤量し、１２匹の動物についてカウントした。一方皮質およ び髄質を解剖により採取し、秤量し、別々に４匹の動物につきカウントした。

＊＊　注入量の割合は小腸および大腸に対しては１００ｇ当たりの量で示し、一 方筋肉に対しては身体の筋肉量に対して示してあり、体重の４５％であるとした 。

ｉ”ｆ）ａ、（六番に斐どなし） 手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示　ＰＣＴ／ＵＳ８５１００５００２、発明の名称　放射性標識化 リポタンパク及びその製造法 ３、補正をする者 事件との関係　出願人 氏　名　リース　ロバート　ニス ４、代理人 ５、補正命令の日付　昭和６１年５月１３日７、補正の内容　別紙のとおり 国際調査報告 １ｍ−一町内ミー１ｍＭＩＡｅｅｌｋａｍ＋＋Ｎｓ、ｐｅｒ／ＵＳ８５１００Ｓ ＯＯ

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. １．テクネチウムの放射性同位元素と、リボタンパクの呈する生物学的活性を示 す錯体とで構成される放射性標識プローブ。
2. ２．実質的に天然リボタンパクの構造並びに生物学的機能を有することを特徴と すろ請求の範囲第１項記載のプローブ。
3. ３．放射能検知器によつて体外的像を得るのに適した請求の範囲第１項記載のプ ローブ。
4. ４．上記錯体が密度１．０２５〜１．０５０ｇ／ｍｌの範囲のリボタンパクから 本質的になることを特徴とする請求の範囲第１項記載のプローブ。
5. ５．上記テクネチウムの放射性同位体が■Ｔｃである請求の範囲第３項記載のプ ローブ。
6. ６．上記錯体が本質的に密度１．０２５〜１．０５０８／ｍｌの範囲内のリボタ ンパクからなることを特徴とする請求の範囲第３項記載のプローブ。
7. ７．リボタンパクあるいはリボタンパクの１もしくはそれ以上の生物的機能を有 する他の分子をテクネチウムの同位体で標識する方法であつて、 Ａ．上記リボタンパクおよびテクネチウム同位体を、該リボタンパクを変性しな い７以上のｐＨ環境で、還元剤と接触させて、安定なテクネチウムーリボタンバ ク錯体を形成し、Ｂ．咳テクネチウムーリボタンバク錯体を、上記工程Ａで得ら れる物質から分離する 工程を含むことを特徴とする上記方法。
8. ８．上記還元剤がナトリウムジチオナイトである請求の範囲第７項記載の方法。
9. ９．上記還元剤対テクネチウム同位体のモル比が１０°より大きいことを特徴と する請求の範囲第７項記載の方法。
10. １０．上記ｐＨ環境が８〜９であることを特徴とする請求の範囲第７項記載の方 法。
11. １１．上記リボタンパクが密度１．０２５〜１．０５０ｇ／ｍｌを有するリボタ ンパクから本質的になることを特徴とする請求の範囲第７項記載の方法。
12. １２．上記テクネチウムーリボタンパク錯体が、分子篩クロマトグラフイーによ つて、上記工程Ａで得られる物質から分離されることを特徴とする請求の範囲第 ７項記載の方法。
13. １３．上記テクネチウムーリボタンバク錯体が、実質的にこれを保持する制御さ れたポアサイズのフイルタで濾過し、洗浄することにより、上記工程Ａで得られ る物質から分離されろことを特徴とする請求の範囲第１０項記載の方法。
14. １４．リボタンパクまたはリボタンパクの１またはそれ以上の生物学的機能を有 する他の分子をテクネチウムの同位体で標識する方法であつて、 Ａ．ＤＴＰＡ−リボタンパク対およびテクネチウム同位体を、ＤＴＰＡ−リボタ ンパク対を変性しない７以上のｐＨの下で還元剤と接触させて、安定なＤＴＰＡ −リボタンパク錯体を形成し、Ｂ．上記工程Ａで得られる物質からテクネチウム ーＤＴＰＡ−リボタンパク錯体を分離する、 工程を含むことを特徴とする上記方法。
15. １５．Ａ．リボタンパクまたはリボタンパクの１またはそれ以上の生物学的機能 を有する他の分子およびテクネチウム同位体を、咳リボタンパクを変性しない７ 以上のｐＨの下で還元剤と接触させて．安定なテクネチウムーリボタンパク錯体 を形成し、Ｂ．上記工程Ａで得られる物質からテクネチウムーリボタンバク錯体 を分離する、 ことによつて調製される放射性標識化プローブ。
16. １６．リボタンパクまたはリボタンパクの１またはそれ以上の代謝特性を有する 他の分子をテクネチウムの同位体で放射性標識する方法であつて、以下の各工程 ： Ａ．該リボタンパクを変性しないｐＨの下で無水ＤＴＰＡと該リボタンパクとを 混合してＤＴＰＡ−リボタンパク対を形成する工程、 Ｂ．生成ＤＴＰＡ−リボタンパク対を未反応ＤＴＰＡから分離する工程、 Ｃ．該ＤＴＰＡ−リボタンパク対をテクネチウム同位体と混合する工程、 Ｄ．上記工程Ｃの混合物を、リボタンパクが変性しない７以上のｐＨの下で還元 剤により還元して、安定なテクネチウム−ＤＴＰＡ−リボタンパク錯体を形成す ろ工程、およびＥ．生成するテクネチウムーＤＴＰＡ−リボタタンバク錯体を、 還元剤および還元されたテクネチウムから分分離する工程、を含むことを特徴と する上記方法。
17. １７．上記ＤＴＰＡ無水物が環状無水物である請求の範囲第１６項記載の方法。
18. １８．上記ＤＴＰＡ無水物が無水カルボキシ炭酸である請求の範囲第１７項記載 の方法。
19. １９．上記リボタンバクが本質的に密度１．０２５〜１．０５０ｇ／ｍｌのリボ タンパクからなることを特徴とする請求の範囲第１７項記載の方法。