JPS6191200A - モノクロ−ナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ａ　産業上の利用分野 本発明はヒトαオープラスミンインヒビタ−（ａｌ　−
ｐｌａａｍｉｎ　１ｎｈｉｂｉｔｏｒ　；　ａ、　−ａ
ｎｔｉｐｌａｓｍｉｎ）に対するモノクローナル抗体、
特にヒトα、−グラスミンインヒビターの線維素溶解作
用阻害部位（ｒｓａａｔｌｖｅ　５ｉｔｅ　）を抗原と
してｇ識し、その結果ヒトα、−プラスミンインヒビタ
ーノ１ラスミンの線維製溶解作用に対する阻害活性を抑
制し、線溶促進させる働きを有するモノクローナル抗体
分子全体及びその部分に関するものでらる。

ｂ　従来技術 ヒトのα、−プラスミンインヒビタ−は、青水と諸井に
たって最初に単離・精製され、綜維素溶解酵素の１ラス
ミン（ｐｌａａｍｉｎ　）のエステラーゼ活性を瞬間的
に阻害する強力なグラスミンインヒビターであｊ９．１
１．７％の糖を含む分子量約６７．０００の１本鎖の糖
蛋白質であることが知られているＣ　Ｍｏｒｏｉ　＆　
Ａｏｋｉ；Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏ
ｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　＋２５１．５９５６
−５９６５（１９７６）　　参照〕。

一方ヒトのα、−グラスミンインヒビターには３種類の
活性部位があることが知られている。第１はフ゛ラスミ
ンの線維素溶解作用阻害部位（以下これを“リアクティ
ブサイト”ということがある）　（Ｂ、Ｗｌｍａｎ　＆
　Ｄ、Ｃｏ１１ｅｎ　　ｅ。

Ｔｈｅ　　Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ　　Ｂｉｏｌｏｇｉ
ｃａｌ　　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　　＋２５４．９２９１
−９２９７（１９７９）　　参照〕であり、第２はカル
ボキシル基末端側のプラスミン結合部位（Ｂ、Ｗｉｍａ
ｎ　＆　Ｄ、Ｃｏ１１ｅｎ　”、ＥｕｒｏｐｅａｎＪｏ
ｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｒｎｉｓｔｒｙ、　８
４　、５７３−５７８（１９７８）参照〕であシ、第３
はアミ７基末端のフィブリン結合部位である（　Ｙ、５
ａｋａｔａ。

ａｔ　ａｌ、＋　Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　Ｒｅ５ｅａｒ
ｃｈ、１６　Ｉ２７９−２８２（１９７９３参照〕。

ヒトαヨープラスミンインヒビタ−におけるこれら３種
類の活性部位のうち、リアクティブサイトを抗原として
選択的にＰＲするモノクローナル抗体蛋白全体及びその
部分を提供できれば、これを使用することによってヒト
αヨープラスミンインヒビタ−の線維素溶解阻害作用を
直接抑え、線溶を促進することができるので非常に興味
あることでちる。

Ｃ本発明の構成 本発明によれば、ヒトαヨープラスミンインヒビタ−に
対するモノクー−ナル抗体、殊にこのα２−プラスミン
インヒビタ−のりアクティブサイトを抗原として認識し
、このα、−１ラスミンインしビターの線維素溶解阻−
書作用を抑制する作用を有する高度に特異的モノクロー
ナル抗体（ｍｏｎｏｅｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅ
ａ　）全体及びその部分が提供される。

本発明のハイズリドーマ細胞は、ケーラーとミルシュタ
インの方法（Ｋ’６ｈ１台ｒ　ａｎｄＭｉｌａｔｅｉｎ
、Ｎａｔｕｒｅ　２５６　、４９５−４９７　（１９７
５））として知られた手法によって産生される。すなわ
ち、ヒトαイー１ラスミンインＬビターでマウスを免疫
した後、このマウスのｌｌｌ１！Ｓ細胞をマウスミ；、
ローマ細胞と融合させ、得られたハイプリドーマ細胞は
、マイク−タイターグレート（ｍ１ｅｒｏｔｌｔｅｒ　
ｐｌａｔｅｓ　）　Ｋ固定されたしトα、−プラスミン
インヒビタ−と反応する抗体に対し系統的に検査し選択
される。このよ５Ｋしてヒトαヨープラスミンインヒビ
タ−に対する抗体を合成し、分泌するハイグリドーマ細
胞を選別する。得られた・−イブリドーマ組胞を無血清
培地中で培養し、その培養上清中に分泌されたヒトαヨ
ープラスミンインヒビタ−に対する抗体は、フィブリン
プレート（ｆｉｂｒｉｎ　ｐｌａｔｅｓ　）上でヒトα
、−ブー’２スミンインヒビターの線＃！素溶解阻害作
用を抑える活性につい℃検査を行なう。その結果、ヒト
町−プラスミンインヒビターの線維素溶解阻止作用な％
Ｊ％的に抑える活性を有するモノクローナル抗体を産生
ずる７％イブリドーマ細胞が単離された。

本発明のモノクローナル抗体は、かかるノ１イブリドー
マ細胞が産生する産出物から得られる。かくして得られ
た七ツク「−ナル抗体ハ、ヒトα、−プラスミンイノヒ
ビターのりアクティブサイトに対して単一特異的 （ｍｏｎｏｓｐｅｃｉｆｉｅ　）に作用する０次に本発
明のモノクローナル抗体及びその製造方法について詳細
に説明する。

抗原に用いるしトα、−プラスミンインヒビタ−は前記
青水と諸井の方法によりヒト血漿中よυ単離精製された
。

雄Ｂａ１ｂ／ｃマウスを用いるが、他の系（５ｔｒａｉ
ｎｓ　）のマウスを使用することもできる。その際、免
疫計画及びヒトへ一プラスミンインＬビターの濃度は十
分な量の抗原刺激を受けたリンパ球が形成されるよう選
ばれるべきである。例えばマウスに少量の６−プラスミ
ンインヒビタ−で成る間隔で腹腔に数回免疫の後、さら
に数回静脈に投与した。最終免疫の数日後に融合の為に
肺臓細胞を取り出す。

Ｃｌｌ８Ｉｊｉ８１融合； 肺臓を無菌的に取り出し、それから単細胞懸濁液を調製
する。それらの肺臓細胞を適当なラインからのマウス骨
髄腫細胞と適当な融合促進剤の使用により細胞融合させ
る。膵臓細胞対骨髄腫細胞の好ましい比率は約２０：ｌ
〜約２：１の範囲である。約１０″個の膵臓細胞につい
て０．５〜１．５−の融合媒体の使用が適当である。

細胞融合に用いる骨髄腫細胞は多く知ら１ているが、本
発明ではＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕｌ細胞（以下Ｐ３−
Ｕｌと略記する）ＣＹｅｌｔｏｎｖＤＪ、ｓｔ　ａｌ、
＋ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏｐｌｃｓ　ｉｎＭｉｃｒｏｂｉ
ｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ＋８１　＋
　１（１９７８）参照〕を用いた。これ＆−８−７ザグ
アニン耐性の細胞ラインであυ、酵素ヒボキサンチン−
グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｈｙｐｏ
ｘａｎｔｈｉｎｅ　−ｇｕａｎｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈｏ
ｒｉｂｏｓｙｌ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）が欠失して
おシ、それゆえＫＨＡＴ　（ヒポキサンチン、７ミノプ
テリン、チミジン）培地中では生存しない。また、この
細胞ラインは、それ自体抗体を分泌しない、いわゆる非
分泌型である。

好ましい融合促進剤としては例えば平均分子量が１，０
００〜４　、０００　　のポリエチレングリフールを有
利に使用できるが、この分野で知られている他の融合促
進剤を使用することもできる。本発明の実施例では平均
分子１１１，５４０のポリエチレングリコールを用いた
。

Ｄ　融合した細胞の選択； 別の容器内（例えばマイク四タイタープレート）で未融
合の膵臓細胞、未融合の骨髄腫細胞および融合した細胞
の混合物を、未融合の骨髄腫細胞な支持しない選択培地
で希釈し、未融合の細胞を死滅させるのに十分な時間（
約１週間）培養する。培地は薬物抵抗性（例えば８−７
ザグ７ニン抵抗性）で未融合の骨髄腫細胞を支持しない
ものく例えば前記ＨＡＴ培地）が使用される。

この選択培地中では未融合の骨髄腫細胞は死滅する。こ
の未融合の膵臓細胞は非腫瘍性細胞なのである一定期間
後（約１週間後）死滅する。これらに対して融合した細
胞は骨髄腫の親細胞の腫瘍性と親膵臓細抱の性質をあわ
せ持つために選択培地中で生存できる。

かくしてハイグリドーマ細胞が検出された後、その培養
上清を採取し、ヒトαイープラスミンインヒビタ−に対
する抗体について酵素免疫定量法（Ｅｎｚｙｍｅ　Ｌｉ
ｎｋｅｄ　Ｉｍｍｕｎ。

５ｏｒｂｅｎｔ　Ａｓ５ａｙ　）　ＶＣよりスクリーニ
ングする。

ヒトαヨー１ラスミンインヒビターに対する抗体を産生
じているハイプリドーマ細胞を、無血清培地で培養して
得られた、抗体を含んだ培養上澄液を製経し、ヒトαイ
ープラスミンインヒビタ−と共に一定時間インキユペー
トした。さらＫこのヒトαオープラスミンインヒビタ−
混合液にプラスミンを那え、フィブリンプレート上にの
せ、フイフリン溶解面積を測定した。このよ５Ｋして、
ヒトα、−グラスミンインヒビターに対する活性を持つ
抗体を産生ずるハイフリドーマ細胞を選択する。

目的の抗体を産生ずるハイプリドーマ却１胞を適当な方
法（例えば限定希釈法）でクローン化すると、抗体は２
つの異なった方法で産生さ第１る。その第１の方法によ
ればハイプリドーマ細胞を一定時−１適当な層地で培養
することにより、その培養上清からそのハイプリドーマ
細胞の産生するモノクローナル抗体を得ろことができる
。机２の方法によれｄハイブリドーマ細胞は同質遺伝子
又は半同質遺伝子を持つマウスの腹腔に注射することが
できる。一定時間後の宿主動物の血液中及び腹水中より
、そのハイブリドーマ細胞の産生ずる七ツクｐ−ナル抗
体を得ることができる。

かくして得られたヒトαヨープラスミンインヒビタ−線
維素溶解阻止作用を抑制するモノクローナル抗体を蛋白
分解酵素であるパパインを用いて、Ｐｏｒｔｅｒ　ｆ）
方法（Ｒ，Ｒ，Ｐｏｒｔｅｒ＋　Ｂｌｏｃｈｅｍｌｃａ
ｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　、７ｉＪ１１９〜１２６（１９５
９）参照〕により切断し、添付図面の点線で囲まわた部
分（Ｆａｂ）の部分構造として単離した。

このモノクローナル抗体のＦａｂの部分構はフィブリン
プレート上でヒトα、−プラスミンインヒにターの１ｒ
３維素溶解阻害作用を抑える活性について調べられた。

その結果、上記のテノクロナール抗体のＦａｂの部分構
造のみでヒトαヨープラスミンインヒビタ−のｍ＃！素
溶解阻害作用を特異的に抑える活性を有する事が確かめ
られた。

本発明のＦａｂｇ造を少なくとも有するモノクロナール
抗体及び部分は、ヒトαヨープラスミンインヒビタ−の
リアクティブサイトに対して単一特異的に作用する。

以下実施例を掲げ本発明の詳細な説明する。

実施例１ （１）　　ヒトαヨープラスミンインヒビタ−の調製、
；前記、資本及び路弁の方法に従い、ヒト血漿２，３６
０ｄからヒトへ一プラスミンインヒビタ−７，７■を得
た。

（２）　　ヱヱニｘｏｓ札班 １ｍ　ｆ）　Ｂａ１ｂ／　ｅマウスをヒトα、−１ラス
ミンインヒビター１００μＩと完全なフロイントのアジ
ュバント（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ　ａｄ
ｊｕｖａｎｔ　）とのエマルジョン（ｓｍｕｌｓｉｏｎ
）で２１日間の間隔をおいて２同腹１ｉＫ免疫した。さ
らに７日後及び８８日後にヒトαヨープラスミンインヒ
ビタ−３０μｙを生理食塩水ととも匹靜脈に追加投与し
た。最終免疫の４日後に七〇肺臓細胞を細胞融合のため
に用いた。

（３）　　膵臓細胞の懸濁液の調製 膵臓を無菌的に取り出し、ステンレス製メツシュを通過
させることにより単細胞懸濁液が得られた。細胞をＬ−
グルタミン０．３９　ＩＩ／１．硫酸カナマイシン０．
２１　／　ｌ及びＮａＨＣｏ、２．ＯＪｉ’　／　ｌを
補充したＲＰＭＩ−１６４０培地（ＧＩＢＣＯ捜ンに移
した。増殖した細胞をＲＰＭＩ−１６４０で３回洗浄し
ＲＰＭＩ−１６４０培地に再懸濁させた。

（４）　　骨髄肝細胞の調製 マウス骨髄肺細胞Ｐ３−Ｕｌは、Ｌ−グルタミン０．３
９ｆｌ／Ｉｔ、硫酸カナマイシン０．２Ｉ／　／　、　
ＮａＨＣＯｓ　２．０　、！７　／　ｌＩ及び１０％の
ウシ胎児血清で補充されたＲＰＭＩ−１６４０培地（１
０チＦＣ８−ＲＰＭＩ−１６４０と略記する）中で培養
した。骨髄腫細胞は細胞融合の時点に細胞分裂の対数期
にあった。

（５）細胞融合 ｎ臓細胞と骨髄腫細胞とを１０＝１の比率で無血ｉ’Ｆ
ｆＲＰＭＩ−１６４０培地中ＫＭ濁し、５分間約２００
１で遠心分離した。上澄液培地を除去した後、沈降物を
平均分子量１，５４０の５Ｑ％ポリエチレングリコール
溶液（ｐＩ（８，２）　１　ｍ／と共に２分間３７℃で
インキュベーションした。次いで無血清ＲＰＭＩ−１６
４０培地９　ａｔを加え、細胞を５分間注意深く再懸濁
した。次いでこの懸濁液な５分間約２００９で遠心分離
し、その後８×１０−細胞／ｌ！／の濃度が得られるよ
う忙１０％ＦＣ８−ＲＰＭＩ　−１６４０培地に再懸濁
し１次いで９６マイクロウエルプレート上に分配した（
シェル１個につき約１００ｐＪ）。この融合細胞は３７
℃において５　％　ＣＯ，を使用して培養した。

細胞融合の１日後にＨＡＴ培地をウェル１個につき１０
０＃加えた。以後２日間隔で半分量の培地な新たなＨＡ
Ｔ培地と交換して培養した。、８日後、ハイブリドーマ
細胞の培養上澄液中のヒトαヨープラスミンインヒビタ
−に対する抗体について酵素免疫定量法によりスクリー
ニングをおこなった。スクリーニングに用いられた抗原
はヒトαオープラスミンインヒビタ−１第２抗体はアル
カリフォスファターゼ（ａｌｋａｌｉ　ｐｈｏｓｈａｔ
ａｓｓ　）標識付のウサギ抗マウスであった。

Ｄｆｉ３４９個のウェルの全てが酵素免疫定量法によシ
陽性であり、α、−プラスミンインヒビタ−に対する抗
体を産生じているという結果が得られた。

細胞の増殖が活発になったと観察されたとき、）ＩＴ培
地を加えた。１日間隔で計４回ＨＴ培地を用いて培地交
換をおこない、その後は通常の１０％ＦＣ８−ＲＰＭＩ
−１６４０培地を用いて培養した。

実施例２ （ヒトαヨープラスミンインヒビタ−に対する抗体を産
生ずるハイズリドーマ細胞の選択）上記ヒトα、−グラ
スミンインヒビターに対する抗体を産生じているハイプ
リドーマ細胞中からヒトα２−プラスミンインヒビタ−
の線維素溶解阻害活性を抑える働きを持った抗体を産生
ずるハイプリドーマ細胞を次の方法でスクリーニングし
た。

各ウェルのハイプリドーマを１０％ＦＣ８−ＲＰＭＩ−
１６４°０培地中で培養し、細胞数を約２×１０７個と
した。この細胞を５分間約２００ｇで遠心分離し、培養
上澄液を除去した後、細胞を無血清ＲＰＭＩ−１６４０
培地１０−で洗浄した。

さらＶｃ５分間約２００１で遠心分離し、上澄液を除去
し、細胞を２−メルカプトエタノール５．０　ｄ　／　
７　、インシルニリン７．５ｄ／Ｉ１．トランスフェリ
ン５．０ｄｌ／ｌ、エタノールアミノ５．０Ｍｌ／ｌ、
ナトリウムセレナイト５．０１／ｌ　ｌ　Ｌ−グルタミ
ン０．３９１１／１．５１ｆ、、酸カナマイシン０．２
　、！ｉ’　／　ｌ　ｔ　Ｈｏｐｅｓ　２．３８　ｇ／
　ｌ及びＮａＨＣＯｓ、１．５　ＩＩ／　ｌで補充され
たＲＰＭＩ−１６４０：Ｄｕｌｂｅｃｅｏ’ｓ　ＭＥＭ
：Ｈａｍ’ｓ　Ｆ−１２（２：　１　：　１ンの混合無
血清培地（以下こわを−ＭＩＴＥＳ培地“と略記する）
１０１１！ＫＥ３濁し、３日間培養した。

培養土清液を回収し、これな２５培に濃縮した。この濃
縮液２５μｌＫヒトα２−プラスミンインヒビタ−０，
４μＩを加え、３７℃で３０分間インキ；、ベーション
した。次いでプラスミノーゲン０．０２５ユニツト及び
つｐキナーゼ０．０３１ユニツトを加え液ゑを４０μｌ
とした。このうちｌＯμｌをフィブリンプレートにのせ
た。フィブリンプレートは、３７℃、湿度９５チ以上の
条件下で１８時間靜重し溶解した面積を測定した。

その結果、Ｉ　Ｄ　１０　ノ飄イブリドーマ細胞の産生
−する抗体に加えたヒトαヨープラスミンインヒビタ−
の線維素溶解阻害活性を完全に抑える働きが見出された
。

実施例３ ハイプリドーマ細胞のクローニング； ヒトαヨープラスミンインヒビタ−に対する抗体の活性
試験において陽性の結果を示した・・イプリドーマ細胞
（ｌＤｌｏ）を次の方法でりｐ−ン化した。

ＩＤ１０細胞を９６ウエルマ１クロクイクーグレートの
１ウエルめたシ０．９細胞となるように希釈し、Ｂａ１
ｂ／ｅマウス胸練細胞をフィーダー細胞とし℃加えグレ
ートに分配し１０％ＦＣ８−ＲＰＭＩ−１６４０培地で
培養した。顕微鏡下で観察し、確実にシングルセルコロ
ニーであることを認めた。ハイグリトーマ細胞の培養上
澄液中しトα、−グラスミンインヒビターに対する抗体
につき酵素免疫定量法によりスクリーニングをおこなっ
た。

総数２６個のウェルが酵素免疫定量法により陽性で６Ｄ
ヒトα、−プラスミンインヒビタ−に対する七ツク２−
ナル抗体す注ヰしていた。

モノクローナル抗体の精製； 大量のヒトα、−プラスミンインヒヒターに対するモノ
クローナル抗体を産生させるために、約１０７個のハイ
プリドーマ細胞をプリスタンで前処理したＢａ１ｂ／ｃ
マウスに腹腔内注射した。

約１週間抜採取された腹水液よりＢｙらの方法（Ｐ、Ｌ
、ＥｙうＳ、Ｊ、Ｐｒｏｗｓｅ　ａｎｄ　Ｃ，Ｒ，Ｊｅ
ｎｋｉｎｔＩ　ｍｍｕ、ｎｏｃｂｅｍｉｓｔｒｙ、　１
５　、４２９−４３６（１９７８）診照〕ニ従いプロテ
ィンＡ−セファロース４Ｂ（ｐｒｏｈｅｉｎ　Ａ−８ｅ
ｐｈａｒｏｓｅ　４　Ｂ　）カラムを用（１て抗体を精
製した。腹水液２．５ｄよりヒトαヨープラスミンイン
ヒビタ−に対するモノクロナール抗体２０１１Ｆを得た
。

精製したモノクロナール抗体の特徴； 精製したモノクロナール抗体の特定のクラスを、クラス
特異性抗マウス抗血清な使用してオフタロニーゲル拡散
試験で決定した。その結果を１記表ＩＫ示した。ヒトα
ヨープラスミンインヒビタ−に対する抗体は、その多く
がＨ鎖ｒｌ。

Ｌ鎖にでおった。

表　　　１ 実施例４ 性の抑制 ヒトα１グラスミンインヒビター１μＪと各モノクロナ
ール抗体５μＩを０．０５　Ｍ　！ｊン酸緩衝生理食塩
水（以下ＰＢＳと略す）５０ｐ１に溶解させ、３７℃で
３０分間インキュベーションした。次いでプラスミノー
ゲン０．０２５ユニツト及びウロキナーゼ０．０３１ユ
ニツトを加え液量な６０μｌとした。このうちｌＯμｌ
をフィブリンプレートにのせた。フィブリンプレートは
３７℃、湿度９５チ以上の条件下で１８時間靜重し、溶
解した面積を測定した。その結果を下記表２に示した。

なお下記表の値は、プラスミノーゲン０．０２５ユニツ
トとウロキナーゼ０．０３１ユニツトとＫよる溶解面積
を１００％とした時の相対値である。

表　　２ 実施例５ １　ｔｍｓ　標識したヒトα、−７ラスミン１ンヒビタ
−＝０．０１μＭとα、−プラスミンインヒビクーンζ
対するモノクローナル抗体０．０５μＭを２％牛血清フ
ルプミンー０．０５　Ｍ　トリス緩衝液（ｐＨ７，４）
−０，１５ＭＮａＣＪを加えて、３７℃で３０分Ｉ！ｉ
ｉ１ンキュベーション後、４℃で一晩放［した。この抗
原−抗体反応混液に、２．５　ｎＩＭＣａＣｌｌ　＋　
？　陣１フィブリノーゲン画分、２ユニット／罰トロン
ビンを加え、全量で１ｏａｐｌとし３７℃で３℃分間イ
ンキュベーションした。凝固物（フィブリン塊）の形成
が認められた。３０分替ｔて２０（１ｍＭ　Ｅ　Ｄ　Ｔ
　Ａ　　な１００μｌ加え、カルシウムイオンを除いた
後、竹串でこの凝固物を巻き取った凝固物は５分間、３
回洗浄液〔２％Ｂ　Ｓ　Ａ　＋０．０５Ｍ　ト　リ　ス
　級＠　液　（ｐＨ７，４）　　　、　　０．１　５　
　ＭＮａＣＪ　　１２　ｒｎｒｖＩ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　
）で洗った。最後に誹１１物ン竹ａΔから試験管に回収
し、凝固物の放射活性（ｃｐｍ）を測定した。元の反応
混液中の放射活性忙対する凝固物の放射活偏り割合を表
３に示す。

なお表３中に通常の市販のマウスＩｇＧな比較抗体とし
て使用した結果を併せて示した。

この結果から各Ｌトα、−プラスミンイソヒビターに対
するモノクローナル抗体はヒトα、−グラスミンインし
ビターのフィブリン結合部位を認識していないモノクロ
ーナル抗体であることがわかる。

実施例６ 検索 本実施例はヒトαヨープラスミンインヒビタ′−による
プラスミンの不活性化に及ぼすα、−プラスミンインヒ
ビタ−に対するモノクローナル抗体の効果を調べたもの
である。

α、−プラスミンインヒビター０．６μｍとα、−グラ
スミンインヒビターに対するモノクローナル抗体６．６
μＳを２チ牛血清アルブミン溶液Ｃ１１，０５ＭトＩ）
Ｘ緩衝液（ｐＨ７，４）　＊　０．１５　ＭＮａＣｌ　
）６０μＪＫ溶解し、３７℃、３０分間インキュベーシ
ョンし、４℃で一晩放置した。

この反応混液とプラスミン溶液（０，４７μＭ）２０ｐ
ｌを混ぜ、０．０５　Ｍ　トリス緩衝液（ｐＨ７，４＞
＋０．１５　ＭＮａＣＩを加えて全量を５ｏｏｐｌとし
たものを各サンプルについて２本ずつ用意し、３７℃で
２分又は２０分間インキュベーションした。

次Ｋ　３．５ｍＭ合成基質Ｓ−２２５１（バラ−ニトリ
ル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−リジルーアニリドニ塩酸塩）水
溶液を２００ｐｌ加え、分光光度計（Ｂ＠ｃｋｍａｎ　
、　ＤＵ−８）　Ｋよって４５０ｎｍ　　の波長におけ
る単位時間白りの吸光度の変化を測定した。対照として
プラスミンのみを反応させた試料とモノクロナール抗体
を加えずにヒトα。

−グラスミンインヒビターとプラスミンを反応させた試
料についても同様に吸光度の変化を調べた。その結果を
下記表４に示した。

表　　４ 以上の実施例５及び６の結果から本発明のモノクローナ
ル抗体はヒトαヨープラスミンインヒビタ−のりアクテ
ィブサイトを特異的に認識し、グラスミン結合部位及び
アイプリン結合部位のいずれをも認識していないことが
わかった。

実施例７゜ ヒトα、−プラスミンインＬビターのリアクティブサイ
トを特異的ＶＣｕＲする上記実施例記載のモノクローナ
ル抗体ＩＤｌ０Ｃ１１１１１９を溶解液（２ｍＭｉ　Ｅ
ＤＴＡ　ｔ　　１２．５ｍＭ　　システィン、５０ｍＭ
トリス緩衝液（ｐＨ７，４）　＋　０．１５　Ｍ　Ｎａ
Ｃｌ〕３００μｌ！に溶解し、ｌ　ｙ９　／　ｍｌ濃度
のパパイン溶液１００μｌを加え、３７℃で１８時間反
応させた。

この反応液を液体クロマトグラフィーにかけ、Ｆａｂ成
分を分取した。これを５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動により、還元条件及び非還元条件下で分子量を
測定したところ、抗体のＨ鎖（Ｈｅａｖｙ　ｃｈａｉｎ
　）の７ミノ基末端よシ分子量約２３．０００の断片と
分子量約２３．０００のＬ鎖全体から成るＦｉｂ成分で
あることが確認された。

実施例８ ヒトα、−グラスミンインヒビター１μＩと、各モ／り
０−ナル抗体３１１１１を０．０５Ｍ　　ＰＢＳ５０μ
ｌ　に溶解させ３７℃で３０分間インキュベーションし
た。次いで１ラスミノーグン０．０２５ユニツト及びウ
ロキナーゼ０．０３１ユニツトを加え液量な６０μｌと
した。このうち１０μｌをフィブリンプレートにのせた
。フィブリンプレートは３７℃湿度９５％以上の条件で
１８時間靜重し、溶解した面積を測定した。その結果を
下記表５に示した。なお下記表の値は、プラスミノーゲ
ン０．０２５ユニツトとウロキナーゼ０．０３１ユニツ
トとによる溶解面積を１００％とした時の相対値である
。

表　　５ また、実施例６と同様の方法でこのモノクローナル抗体
のＦａｂ成分によるヒトαオープラスミンインヒビタ−
活性の抑制の検討をおこなった。

α、−プラスミンインヒビター０．６μｆＪ　（９ｐ　
ｍａｔ）とα、−プラスミンインヒビタ−に対するモノ
クローナル抗体４０ｐｍｏｌを２％牛血清アルブミン溶
液（０，０５Ｍ　）リス緩衝液（ｐＨ７，４）　＋０．
１５　ＭＮａＣｌ）　６０ｐｌＶＣ溶解し、３７℃。

３０分間インキュベーションし、４℃で一晩放置した。

この反応混液とフ”ラスミン溶液（０゜４７ＭＭ）２０
ｐｌを混ぜ、０．０５　Ｍ　）リス緩衝ＦＦ１．（ｐＨ
７，４）Ｑ、１５ＭＮ＾Ｃ４を加えて全量を５００μｌ
とした。

次Ｋ　３　、５　ｍＰ、ｆｆ　　合成＄、質Ｓ　−２２
５１水溶液を２００μｌ加え、分光光度計（日立１０ｏ
−ｓｏ　　）によって４０５ｎｍの波長における単位時
間当シの吸光度の変化をｄす定した。対照としてフーラ
スミンのみを反応させた試料とモノクローナル抗体を加
えずにヒトα、−グラスミンインヒビターとプラスミン
を反応させた試料についても同様に吸光度の変化を調べ
た。その結果を下記表６に示した。

表　　６ 以上実施例８の結果から、本発明のＦａｂを有するモノ
クローナル抗体はヒトαヨープラスミンインヒビタ−の
りアクディプサイトを特異的に認識し、ヒトαヨープラ
スミンインヒビタ−の線維素溶解阻止作用を抑制するこ
とがわかった。

【図面の簡単な説明】

添付図面は、本発明におけるモノクー−ナル抗体を、パ
パインを用いて分解したときの抗体のＦａｂの部分構造
を示す図である。図中Ｖは可変領域、Ｃは定常領域を示
す。 手続補正書 昭和６０年２　月２７日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヒトα＿２−プラスミンインヒビターに対するモノ
   クローナル抗体であつて、ヒトα＿２−プラスミンイン
   ヒビターにおけるプラスミンの線維溶解作用の阻止部位
   を特異的に認識し、ヒトα＿２−プラスミンインヒビタ
   ーの線維素溶解阻止作用を抑制するモノクローナル抗体
   。 ２、パパインによる切断し得る箇所を少くとも有し、そ
   のパパイン切断箇所よりアミノ基末端側を含む第１項記
   載のモノクローナル抗体。