JPS62120340A

JPS62120340A - 高度不飽和脂肪酸の分取方法

Info

Publication number: JPS62120340A
Application number: JP26050685A
Authority: JP
Inventors: Hidehiko Hibino; 日比野　英彦; Nobuo Fukuda; 信雄福田; Yasuhisa Noguchi; 野口　泰久
Original assignee: Nippon Oil and Fats Co Ltd
Current assignee: NOF Corp
Priority date: 1985-11-20
Filing date: 1985-11-20
Publication date: 1987-06-01

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は高度不飽和脂肪酸の分取方法、特に生体内にお
いて重要な生理活性を示すＡＡおよびＤＨＡを卵黄リン
脂質から分取する方法に関する。

〔従来の技術〕

高度不飽和脂肪酸（以下、ＰＵＦＡと記す）は細胞の生
体膜成分中のリン脂質画分中に存在し。

膜に対する刺激に応じて細胞外へ遊離され、種々の酵素
系により目的のオータコイドに変換されて生体の恒常性
維持を司る物質である。特にＡＡに関しては、プロスタ
グランジンやロイコトリエン等への代謝が認められ、Ａ
Ａカスケードの研究により非常に詳細な検討が行われて
いる。またＤＨＡに関しても、エイコサペンクエン酸同
様にω−３系のＰＵＦＡとして、血中コレステロールや
トリグリセリドを低下させることが知られ、最近この脂
肪酸に血小板凝集抑制作用が確かめられたり、心筋に多
く取り込まれることから、心臓の機能維持、特に心拍数
と関係があると期待されている。

天然のＰＵＦＡは工業的にはその生理活性を利用した医
薬、健康食品への展開が行われている。

しかしながら、いずれの用途においても、現在のところ
化学合成ができないため、天然の原料から分析的な手法
により、非常に特殊な原料、例えば哺乳動物の肝臓、腎
臓、心臓や魚類の肝臓などから分取しており、工業的に
応用するに至っていない。

〔発明が解決しようとする問題点〕

工業的に応用するに至らない原因は、に、　Ｋａｔｅｓ
（山川ら訳、脂質研究法、Ｐ６５．１９７５、東京化学
同人）が示すように、ＰＵＦＡを含有する動物組織、細
胞画分、血球および血漿からの脂質抽出が非常に微量な
規模でさえ繁雑な工程を要するからである。そして得ら
れた脂質から総崩肪酸を回収する操作も大量処理はさら
に繁雑であり、一方ＰＵＦＡから特定脂質のみを単離す
る操作も繁雑である。

またＰＵＦＡの調製法としては尿素付加分別法や超低温
結晶分別法が優れているが、これらの単一操作のみで特
定ＰＵＦＡを単離できず、この操作に供する試料調製も
必要である。このような処理を行えば、硝酸銀含浸吸着
クロマトグラフィや逆相分配クロマトグラフィにて特定
ＰＵＦＡを得ることができるが、安価で入手しやすい原
料から。

簡単な操作によってＰＵＦＡを含有する脂質を単離する
ことができないという問題点があった。

特にＡＡは血漿リボ蛋白質、血小板、赤血球膜、臓器の
生体膜のリン脂質に豊富であるが、リン脂質単離が繁雑
である。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明は上記問題点を解決するためのもので、安価で入
手しやすい原料から簡単な操作によってＡＡおよびＤＭ
Ａを単離することができる高度不飽和脂肪酸の分取方法
を提供することを目的としている。

本発明は、卵黄リン脂質をＰＥとＰＣに分画し、得られ
たＰＥからＡＡおよびＤＨＡを単離することを特徴とす
る高度不飽和脂肪酸の分取方法である。

安価で入手しやすい卵黄油中には、リン脂質画分にＡＡ
やＤＨＡが多量に含有されている。卵黄油は中性脂質７
２重量％、リン脂質２８重量％がら成り立っているが、
中性脂質を除去したリン脂質画分中にはＡＡおよびＤＨ
Ａがそれぞれ６重量％前後含有されている。このリン脂
質画分中にはＰＥが２５重量％、ＰＣが７０重量％含ま
れているが、ＴＬＣで分画した各リン脂質の脂肪酸組成
を比較したところ、ＰＵＦＡ濃度はＰＣに比べてＰＥに
約４倍も偏在していることがわかった。こうしてＰＥ中
にはＡＡとＤＭＡが各１２重量％前後含有されているの
で、ＰＣとＰＥを分画することにより、これらのＰＵＦ
Ａ調製用の出発原料を２倍に濃縮することができる。

卵黄リン脂質からのＰＥの分画は、吸着分配クロマトグ
ラフィにより行うことができる０分画に使用する吸着分
配クロマトグラフィは分取用のものが好ましく、特に高
圧、高速、大量分取用の全自動分取液体クロマトグラフ
ィが好ましい。

吸着分配クロマトグラフィに使用するカラムは、一般に
吸着分配クロマトグラフィに使用されているものが使用
できるが、ケイ酸系または合成高分子系吸着分配クロマ
トグラフィ用担体を充填したカラムが使用できる。特に
好ましい担体の種類は球状シリカゲル、酢酸ビニル系ゲ
ル、ポリエチレングリコール系ゲル、アルミナゲルなど
、粒径は５〜１０μｍ、カラム径は４．６〜５５麓ｍ　
ＩＤ長さは７．５〜６０ｃ＋ｍである。

吸着分配クロマトグラフィに使用する溶離液は、一般に
吸着分配クロマトグラフィに使用されているものが使用
でき、特に好ましい溶離液はｎ−ヘキサン、ベンゼン、
クロロホルム、エタノール、水、アセトンなどであり、
圧力５〜１５０ｋｇ／ａＪ、流量３０〜１００ｔＱ／＋
ｍｉｎで分画を行う。

特に充填剤としてケイ酸を用いる吸着分配クロマトグラ
フィで分画を行うと、ケイ酸カラムにおけるＰＥの溶出
は最先頭であり、通常ＰＥ溶出位置に重複するホスファ
チジルセリンやホスファチジルイノシトールは卵黄中に
は非常に少ないため、ＰＥの分画が極めて容易である。

この操作を効率的にしかも安価に行うために、卵黄リン
脂質をベンゼン溶液としてケイ酸カラムに注入し、メタ
ノールのみでＰＥを回収する工程のすべてを全自動大量
分取液体クロマトグラフィで行うと、数十ｇ単位でＰＥ
が分画できる。

こうして分画されたＰＥは、テトラブチルアンモニウム
ヒドロキサイドメタノール溶液等を用いてアルコーリシ
スを行い、ＡＡおよびＤＭＡが濃縮されたＰＵＦＡメチ
ルエステル等の混合脂肪酸エステルを得る。この混合脂
肪酸エステルを尿素付細体処理することにより、飽和酸
であるバルミチン酸やステアリン酸などが除去される。

ここでモノエン酸より不飽和度の高い脂肪酸を尿素添加
量の調節によって除去し、ＡＡおよびＤＭＡのより高い
濃縮を行うと、回収された母液中のＡＡおよびＤＭＡの
濃度は著しく上昇するが１回収率は原料の混合脂肪酸エ
ステルに対して数重量％となり、好ましくない、一方飽
和酸を除去しただけの検体からは、ＡＡおよびＤＭＡが
８０重量％以上回収される。

混合脂肪酸エステルから脂肪酸同士を分画するには、硝
酸銀含浸吸着クロマトグラフィと逆相分配クロマトグラ
フィがよく使用されるが、前者は不飽和度の順に流出す
るため、ＰＵＦＡの流出時間が著しく長く、高速液体ク
ロマトグラフィのカラムへの均一な充填が困難である。

一方、後者は不飽和度の多い順に流出するため、ＤＭＡ
が先頭に流出し、次にＡＡが流出するパターンである点
が非常に有利であり、また上記カラムへの充填が容易で
あるため、大量分取システムの利用が可能である。特に
後者を用いた流出パターンに関しては、一般にＤＭＡお
よびＡＡの流出位置にカプリン酸およびラウリン酸の重
複が知られているが、原料となる混合脂肪酸エステルに
はこれらの飽和酸が存在しないため＋　ＤＨＡおよびＡ
Ａの単離が容易である。

分画に使用する逆相分配クロマトグラフィは分取用のも
のが好ましく、特に高圧、高速、大量分取用の全自動分
取液体クロマトグラフィが好ましい。

逆相分配クロマトグラフィに使用するカラムは、一般に
逆相分配クロマトグラフィに使用されているものが使用
できるが、化学結合型ケイ酸系または合成高分子系逆相
分配クロマトグラフィ用担体を充填したカラムが使用で
き、特に好ましい担体の種類はスチレン系ゲル、高保持
力ＯＤＳ化学結合型、無シラノールＯＤＳ化学結合型な
どであり、粒径は５〜１０μ瑣、カラム径は４．６〜５
５＋＊ｍ　ＩＤ、長さは７．５〜６０ｃｍである。

逆相分配クロマトグラフィに使用する溶離液は、一般に
逆相分配クロマトグラフィに使用されているものが使用
でき、特に好ましい溶離液はクロロホルム、イソプロピ
ルアルコール、エタノール。

アセトン、メタノール、リン酸、酢酸、水などであり、
圧力５〜１５０ｋｇ／ｃｄ、流量２０〜１００ｍＱ／　
ｗｉｎでＤＨＡおよびＡＡの単離を行う。

全自動大量分取液体クロマトグラフィに逆相分配クロマ
トカラムを装着し、メタノール系溶媒にてＤＨＡおよび
ＡＡを連続分取すると１ｇ単位で単離を行うことができ
る。

〔発明の効果〕

以上のとおり、本発明によれば、入手の容易な卵黄リン
脂質から、生理活性の高いＡＡおよびＤＨＡを簡単な分
離工程により、容易かつ高収率で得ることができ、医薬
品およびそれらの原料などとして効果的に用いることが
できる。

〔実施例〕

以下、実施例に基づいて本発明を具体的に説明する。実
施例中５％は重量％を示す。

市販卵黄レシチン２００ｇをベンゼン１０００ｍ　ｍに
溶解し、全自動分取型高速液体クロマトグラフィに装着
した分取カラム（カラム長さｘカラム径：６０ｃｍＸ５
５ｍｍ、断面積２３．７ａＪ、カラム体積１４２２ｃｄ
）に粒径１０μ層の球状シリカゲルを充填したものに５
１バッチ当り２０ｔａＱを自動注入した。溶離液はメタ
ノールを流速３０＋Ｑ／ｗｉｎで流し、カラム恒温槽は
４０℃で、ピーク検出は屈折率検出器を用いてモニター
したところ、第１図に示したクロマトグラムが得られた
ので、溶剤流出直後のＰＥ区分を分画区分Ａとしてフラ
クションコレクターを用いて分取した。分画したＰＥ区
分の純度はイヤトロスキャン法にて９５％以上である６
分画ＰＥの脂肪酸組成と原料の卵黄リン脂質全体の脂肪
酸組成をＣａｒｂｏｖａｘ　２ＯＮの５ＣＯＴカラムを
装着したガスダルマトグラフイを用いて定量したＡＡと
ＤＭＡの含量は下記の通りであった。

卵黄レシチン；ＡＡ　　５．５％、ＤＨＡ５．９％分画
ＰＥ・；ＡＡｌｌ、５％、ＤＨＡ　Ｉ２．１％また分画
ＰＥの上記以外の脂肪酸組成は、０１６：０　３２．５
％、Ｃ１８：　０　１１．７％、　Ｃ１８：１　２９．
４％、Ｃ１８：２　１４．８％であった。１バツチのサ
イクルタイムは９０分で、原料溶液を９０分ごとに自動
充填し、５０サイクルで約７６時間を要して、卵黄レシ
チン２００ｇから分画Ｐ　Ｅ　４４．８　ｇを分取した
。

次に分画Ｐ　Ｅ　４４．８　ｇを５００朧Ωのベンゼン
に溶解し、攪拌しつつテトラブチルアンモニウムヒドロ
キサイド１０％メタノール溶液５０ｇを加えた。

沈殿が析出し始めてから３０分間攪拌を続け、その後３
０分静置した。脂肪酸メチルエステル含有ベンゼン溶液
を濃縮し、３０．２　ｇの脂肪酸メチルエステルを得た
。この混合脂肪酸メチルエステルをメタノールに溶解し
、尿素２４ｇを飽和させたメタノール溶液に加えた。１
時間攪拌し、析出した結晶を濾別した。濾液に尿素１６
．８ｇを加え、４５℃に加温して溶解させた１次いで徐
々に冷却して結晶を析出させ、結晶を濾別して濾液を得
た。濾液を濃縮し、７．１ｇのメチルエステルを得た。

このメチルエステルの脂肪酸組成はＣ１６：１　０．５
％。

Ｃ１８：　１　１０．１％、　Ｃ１ｇ：２　１４．２％
、ＡＡ３６．１１％。

ＤＨＡ３５．０％、その他３．４％であった。

尿素付加した脂肪酸メチルエステル７．１ｇを１４２ｔ
ａＱのメタノールに溶解し、前述の全自動分取型高速液
体クロマトグラフィにて処理した。使用した分取カラム
はカラム長Ｘカラム径、断面積およびカラム体積は前記
の通りであるが、充填剤は粒径１０μ腫の高保持力ＯＤ
Ｓ化学結合型である。１パッチ当り１０１を自動注入し
、溶離液は５％含水メタノールを流速２Ｃ）ＩＩＭ／＠
ｉｎで流し、カラム恒温槽は４０℃で、ピーク検出は紫
外部吸収スペクトル検出器（検出波長２２５ｎｍ）を用
いてモニターしたところ、第２図に示したクロマトグラ
ムが得られたので、溶剤流出直後の先頭成分と第２成分
を分画区分Ｂ、Ｃとして、フラクションコレクターを用
いて分取した０分画区分ＢのＤＭＡの純度は９６％、分
画区分ＣのＡＡの純度は９４％であることを前記ガスダ
ルマトグラフイにより確認した。

１バツチサイクルは１００分で、原料溶液を１００分ご
とに自動充填し、１５サイクルで約２５時間を要して、
尿素付加した脂肪酸メチルエステル７．１ｇから分画Ｄ
ＭＡ２．２ｇ、分画Ａ　Ａ　２．４　ｇを得た。

【図面の簡単な説明】

第１図および第２図はそれぞれ実施例において得られた
クロマトグラムである。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）卵黄リン脂質をホスファチジルエタノールアミン
（以下、ＰＥと記す）とホスファチジルコリン（以下、
ＰＣと記す）に分画し、得られたＰＥからアラキドン酸
（以下、ＡＡと記す）およびドコサヘキサエン酸（以下
、ＤＨＡと記す）を単離することを特徴とする高度不飽
和脂肪酸の分取方法。
（２）卵黄リン脂質からのＰＥの分画が吸着分配クロマ
トグラフィによるものである特許請求の範囲第１項記載
の高度不飽和脂肪酸の分取方法。
（３）ＡＡおよびＤＨＡの単離がＰＥをアルコーリシス
して逆相分配クロマトグラフィにより分画するものであ
る特許請求の範囲第１項または第２項記載の高度不飽和
脂肪酸の分取方法。