JPS62190191A - 加水分解可能なホスフアタ−ゼ用螢光基質ならびにそれを用いる分析組成物，要素および方法 - Google Patents

加水分解可能なホスフアタ−ゼ用螢光基質ならびにそれを用いる分析組成物，要素および方法

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JPS62190191A
JPS62190191A JP62018750A JP1875087A JPS62190191A JP S62190191 A JPS62190191 A JP S62190191A JP 62018750 A JP62018750 A JP 62018750A JP 1875087 A JP1875087 A JP 1875087A JP S62190191 A JPS62190191 A JP S62190191A
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  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は臨床化学及び酸又はアルカリホスファターゼの
測定に関する。更に詳しくは、本発明は加水分解可能な
ホスファターゼ用螢光基質に関する。本発明はまたホス
ファターゼ又は免疫学的に反応性の物質の測定のための
乾式及び湿式分析方法に関する。
〔従来の技術〕
生物学的流体、特にヒトの血清中の酸又はアルカリホス
ファターゼ並びにそのイソ酵素の定量分析は種々の物理
的病気の診断及び治療の面で非常に重要になって来てい
る。酸ホスファターゼとは多くのオルトリン酸モノエス
テルの加水分解に対して触媒作用をする最適活性がｐＨ
７，０未満である一群のホスファターゼをいう。この酸
素は最高濃度を有する前立腺をはじめ正する大抵の組織
に存在している。血清酸ホスファターゼレベルの上昇は
多くの病気の状態、特に前立腺癌を示す。
アルカリホスファターゼとはアルカリ性ｐｌ＋で最適活
性を示す一群の非特異性ホスファターゼをいう。アルカ
リホスファターゼの測定は骨及び肝臓の病気の検出に非
常に重要である。例えばアルカリホスファターゼ濃度の
上昇は、しばしば、ベージェット病、骨肉腫、骨軟化症
、閉塞性黄痕、肝炎などに伴なわれる。従って、ホスフ
ァターゼ深度の増大を早期かつ迅速に検出することによ
り前記病気の原因となる状態を早期に処置することがで
きる。その結果、酸又はアルカリホスフ・アターゼを定
量分析する種々の分析方法が多年に亘って開発されてい
る。
問題の酵素の基質を分解して検知可能な部分を放出する
多数の分析方法が開発されている。これらの方法は発色
及び螢光染料（又は色素）の両者を有している。螢光分
析は一般的には感度が大きいので好まれている。しかし
公知の螢光分析は多くの欠点を有している。例えばクマ
リン誘導体は糖ラジカル、アルコールラジカル又はホス
フェートラジカルに結合している。しかし、これらの染
料（又は色素）はヘモグロビンやビリルビンの分光的妨
害を受ける領域に吸収及び発光スペクトルを有する。
アルカリホスファターゼの好ましい基質はｐ−ニトロフ
ェニルホスフェートであり、これはｐＨ９，８〜１０．
５で加水分解して約４００ｎｍに最大吸収を有するｐ−
二トロフェノールを放出する。多くの血清成分もまたこ
のスペクトル領域において吸収する。
酸ホスファターゼの好ましい基質はチモールフタレンモ
ノホスフェートであり、これはｐＨ５，４における加水
分解で約５９５ｒｖに最大吸収を有するチモールフタレ
ンを放出する。しかし、分光光学的信号を測定する前に
ｐｌ（をあげてアルカリ値にするためにアルカリを添加
しなければならない。
最近、加水分解可能なアンベリフエロン（ｕｍｂｅｌｌ
ｆｅｒｏｎｅ）誘導体を用いる酸ホスファターゼの分析
が紹介されている　　（Ｋｏｌｌｅｒら、Ａｎａｌ、Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、　。
１４３、　１４６〜１５１頁、１９８４年）。
〔解決すべき問題点〕
しかしながら、前記文献に記載されている染料（又は色
素）は約５０Ｏｒ＋＋＋＋又はそれ以下の波長、即ち血
清成分であるビリルビンやヘモグロビンの吸収領域にお
いて吸収する。
〔問題点を解決するだめの手段〕
本発明に従えば、前記問題点は、式 ８式％ 〔式中、ＢＬＯＣＫはホスホノ、チオキソホスホノ（−
Ｐ（Ｓ）　−（ＯＨ）’　）又はその塩を表し、Ｘは一
〇−、−Ｓ−又は−ＮＲ−（ここでＲは水素又は置換若
しくは非置換アルキル基である）を表すがＢＬＯ（Ｊが
チオキソホスホノの場合にはＸは一〇−を表し、 Ｒｆは置換若しくは非置換フェナレノン若しくはベンズ
フェナレノン部分を表すが、−Ｘ−Ｒｆ−Ｌとして放出
された時に−Ｘ−Ｒｆ　−Ｌが少なくとも５８０ｎｍで
最大螢光発光を示し、５３０ｎｍより上で最大吸収を示
すものであり、そしてＬは水素又は特異結合性リガンド
を表す〕によって表される加水分解可能なホスファター
ゼ用基質を用いることによって克服される。
本発明の分析組成物は、上記加水分解可能なホスファタ
ーゼ用基質を含み、ｐＨ１２又はそれ以下に緩衝された
水溶液から成る。
更に、本発明は前記した加水分解可能なホスファターゼ
基質を含んで成る分析要素を提供する。
本発明は、更にまた、 Ａ、加水分解条件下にホスファターゼを含むと思われる
液体試料を前記した加水分解可能なホスファターゼ基質
と接触させ、そして Ｂ、ホスファターゼの存在の結果として加水分解により
前記化合物から放出された螢光部分を５３０ｎｍを超え
る波長で励起後少なくとも５８０ｎｍの波長で測定する 工程を含むホスファターゼの測定方法を提供する。
〔実施態様〕
本発明はホスファターゼを定性的又は定量的に測定する
のに使用することができる。本発明はまたホスファター
ゼの単一のイソ酵素の測定に使用することができ、或い
は全酸又はアルカリホスファターゼの活性を測定するの
にも使用することができる。本発明の基質はホスファタ
ーゼを含むと思われる任意の水性液体の分析測定に使用
することができる。本発明は生物学的流体、例えば尿、
血清、全血、背髄液などの分析に好適に使用することが
できる。本発明の基質は特異的結合分析、即ちホスファ
ターゼを標識として用いる酵素免疫分析又は以下におい
て更に詳細に説明するように、基質を標識として用いる
基質−標識免疫分析においても使用することができる。
測定は、酸又はアルカリホスファターゼによって開始さ
れ、基質の加水分解を引き起して螢光染料を放出する単
一の反応又は一連の反応を用いて実施することができる
。
本発明の加水分解可能な基質は式 ％式％ で表わされる。この式においてＢＬＯＣにはホスホノ基
、チオキソホスホノ基［−Ｐ（Ｓ）−（叶）２〕又はこ
れらの塩（例えばマグネシウム、ナトリウム、カリウム
、トリマ（ヒドロキシエチル）メチルアンモニウム及び
シクロヘキシルアンモニウム）ヲ表し、ｐＨ１２又はそ
れ以下での加水分解によって分子の残部から開裂され得
る。好ましくはＢＬＯＣＫはホスホノ基である。前記塩
類は水溶液中において遊離酸基質よりも一般に安定であ
る。
ＢＬＯＣＸがホスホノ又はその塩である場合には、Ｘは
オキシ、チオ又はイミノ　（−ＮＲ−）（式中、　ＪＲ
は水素又は置換もしくは非置換のアルキル、好。
ましくは炭素数１〜５のアルキル（例えばメチル、エチ
ル、プロピル、イソプロピル及びｔ−ブチル）である）
を表す。好ましくはＸはオキシ又はイミノ　（Ｒ＝水素
）である。
Ｒｔは置換又は非置換のフェナレノン又はベンズフェナ
レノン螢光化合物から３３’Ｆ　！された部分である。
ＢＬＯＣＫが加水分解により分子の残部がら開裂された
場合には、生成した加水分解部分（即ち−Ｘ−Ｒｆ−Ｌ
）は５３０ｎｍを超える波長で励起した場合に少なくと
も５８０ｎｍの波長で最大螢光を示す。
有用なフェナレノン又はベンズフェナレノン螢光部分は
以下の弐で表わされる。
以下余白 これらの螢光部分が誘導される代表的化合物は以下の通
りである。
？０ Ｈ２ これらの螢光部分は、１個又はそれ以上の他の置換基を
、該置換基が螢光又は加水分解性に悪影響を及ぼさない
限り、融合環の１個又はそれ以上の位置に有することが
できる。そのような置換基としでは、置換または非置換
アルキル（好ましくは、例えばメチル、エチルまたはベ
ンジルの如き炭素原子１〜１２個のもの）、置換または
非置換ヒドロキシアルキル（好ましくは、例えばヒドロ
キシメチルまたは２−ヒドロキシエチルの如き炭素原子
１〜１２個のもの）、置換または非置換アルコキシカル
ボニル（好ましくは、例えばメトキシカルボニルまたは
エトキシカルボニルの如き炭素原子２〜１２個のもの）
、ハロ（例えばフルオロ、クロロ、またはブロモ）、シ
アノ、カルボキシ、アシル、置換または非置換了り−ル
スルホニル（好ましくは、例えばフェニルスルホニルま
たはトリルスルホニルの如き炭素原子６〜１０個のもの
）、置換または非置換アルキルスルホニル（好ましくは
、例えばメチルスルホニルまたはエチルスルホニルの如
き炭素原子１〜６個のもの）、および当業者に知られて
いる他の置換基が含まれる。
本発明の有用な加水分解可能な基質はフェナレノン−６
−ホスフェートマグネシウム塩、フェナレノン−６−チ
オキラホスフェートマグネシウム塩、ベンズフェナレノ
ン−６−リン酸及びフェナレノン−６−イミツホスフエ
ートマグネシウム塩である。
上に特定した螢光化合物ＩはＣｏｏｋｅらのＡｕ５ｔｒ
ａｌｉａｎＪ、Ｃｈｅｍ、　、　１１．２０３〜２３５
頁（１９５８年）に記載の方法で製造することができる
。螢光化合物■は５ｏｌｏｄａｒらの」九肛ｙ引」」巳
匹１弘遠状」−肘見Ｕエ　１６．（５）　、　１０６２
〜１０６４頁（１９８０）に記載の方法によって製造す
ることができる。
本発明の有用な加水分解可能な基質は（１）フェナレノ
ン又はベンズフェナレノン染料の調製及び（２）前記染
料とホスホリルクロリド又はチオホスホリルクロリドと
の反応による遮断された基質（又はブロック基質）の形
成の工程によって一般に調製する。遮断染料は次に適当
な金属試薬と反応して塩を形成することができる。
前記式中、Ｌは水素であるのが好ましい。しかし、Ｌは
、基質が、例えば米国特許第４，２７９．９９２号明細
書に記載されているような基質−標識螢光免疫分析に使
用しうるような特異結合リガンドであってもよい。この
ような分析においては、測定すべき被分析物は、特殊な
レセプターと複合体を形成するリガンドである。分析は
、螢光酵素基質である標識の使用に基づく。標識を酸又
はアルカリホスファターゼによって加水分解すると、検
知可能な螢光染料を生じる。本発明においては、螢光性
生成物（フェナレノン又はベンズフェナレノン）は５３
０ｎｍを超える波長で最大吸収を有し、そして５８０ｎ
ｍ又はそれ以上の波長で最大発光するという特長を有す
る。レセプターによる標識リガンドの結合は、酵素が基
質を加水分解するのを防止する。螢光生成物は抗体結合
標識によっては製造されないので、結合標識を非結合標
識から区別することができる。
コノ分析は、任意の特異結合リガンド、特にハプテン、
例えば薬剤、及び抗体、抗原、ホルモン又はポリペプチ
ドの測定に使用することができイ）。
基質を、“サンドインチ”分析として文献に公知の分析
に使用することもできる。
Ｌが特異結合リガンドである場合、これは共有結合基に
よってＲｆに結合される。リガンドをＲｆに共有結合す
るため、多数の方法があることは知られている。結合基
の特定の化学的特性は、リガンド及びＲｆ上のそれぞれ
利用される結合部位の性質に左右される。結合基の選択
は、特異結合反応に関与するりガントの能力の保有度及
び吸光及び発光特性に左右される。一般に、結合基は単
結合又は二重結合、又は連鎖中に１〜ｌＯ個の炭素原子
若しくはヘテロ原子を含む連鎖を含む。
有用な結合基の特定の例及び−Ｒｆ−Ｌの製造方法は、
米国特許第４，２７９，９９２号明細書に記載されてい
る。
水溶性に応じて、本発明の基質を直接緩衝液又は緩衝液
及び水と混和しうる有機溶剤の組み合わせ中に溶解させ
るか、又は基質、緩衝剤、水と混和しうる有機溶剤及び
界面活性剤を含む分散液を製造することができる。
酸又はアルカリホスファターゼの測定に使用する場合、
分析組成物は１種以上の適切な緩衝剤でｐＨ１２以下に
緩衝する。一般に、アルカリホスファターゼを分析する
場合には、ｐＨは８〜１１の範囲、好ましくはｐＨ１０
に保持する。酸、ホスファターゼを分析する場合には、
ｐＨは６〜７の範囲、好ましくはｐＨ６に保持する。有
用な緩衝剤は、当業者によって容易に決定され、燐酸塩
、硼酸塩、炭酸塩及びＧｏｏｄらによってＢｉｏｃｈｅ
ｍ、、５巻４６７頁（１９６６）及びＡｎａｌ、Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ、、１０４巻３００頁（１９８０）に報告され
ているような有機緩衝剤を包含する。
本発明の実施に有用な界面活性剤は、化合物の加水分解
を抑制しない任意の界面活性剤を包含する。一般に、有
用な界面活性剤は、ノニオン界面活性剤、例えばアルキ
ルアリールポリエトキシアルコール（例えばＲｏｈｍ　
＆　ｔｌａａｓから市販のＴＲＩＴＯＮＸ−１００及び
Ｘ　−３０５）、ｐ−アルキルアリールオキシポリグリ
シドール（例えば０１ｉｎ　Ｃｏｒｐ、から市販の５ｔ
ｌＲＦＡＣＴＡＮＴ　ｌ０Ｇ）　、）　イーン８０　（
ＩＣＴ　Ａｍｅｒｉｃａｓ。
Ｉｎｃ、から市販）及びその他の当業者に公知のもので
ある。
水と混和しうる有用な有）ａ溶剤は、アルコール（例え
ばメタノール、エタノール、プロパツールなど）Ｎ、Ｎ
−ジメチルホル１、アミド、ジメチルスルホキシド、ア
セトニトリル及びヘキサメチレンホスホルアミドなどを
包含する。特定の溶剤は、通常の実験によって容易に決
定することができる。
基質の溶液は、下記の一般的方法で製造することができ
る。基質をその分子量に依存する濃度で−ｇには溶剤１
−あたり１〜１００■、好ましくは５〜８０■で水と混
和しうる溶剤に熔解する。次いで、生じる溶液を適当を
界面活性剤と、一般には溶剤ＩＷ１１あたり界面活性剤
０．１〜２４■、好ましくは０．５〜１０■の量で混和
する。この製造は、一般に室温で実施する。
これらの溶液は、所望のｐＨ（１２又はそれ以下）を維
持するのに有効な量で緩衝剤を含む。分散液中の緩衝剤
の深度は、広く変動することができるが、一般には０．
０１〜０．５モル濃度である。代表的緩衝剤は、前記の
ものである。
本発明は、溶液又は乾式分析に適用しうる。溶液分析に
おいては、基質を含む溶液（又は水性分散液）を製造し
、測定すべき酸もしくはアルカリホスファターゼ又はり
ガントを含む液体試験試料と混合によって接触させるこ
とができる。一般に、基質は適当な容器（例えば試験管
、ペトリ皿、キュヘット又は試験具）中で試験試料と混
合する。
生じる溶液（又は分散液）を穏和に混合し、４０℃以下
の温度、一般には２０〜４０℃の温度で比較的短時間保
温する。次いで、生じる螢光染料を５８０ｎｍより大き
い波長で適当な検出装置を用いて測定することによって
試験試料を評価する。
試験試料を含む多孔性吸収性物質、例えば紙ストリップ
を基質の分散液と接触させることによって溶液分析を実
施することもできる。試験試料中の被分析物は、多孔性
物質から分散液中に移動し、測定に必要な分析反応を開
始することができる。
溶液分析において、存在する基質の量は少なくとも０．
０１ミリモル、好ましくは１０〜１００　ミリモルの量
で存在する。他の試薬は、当業者によって容易に決定さ
れる量で存在することができる。
また、本発明方法を乾式分析要素と共に実施することが
できる。このような要素は、還元性基質若しくはそれを
含む溶液又は分散液の乾燥残渣を含む吸収性担体物質、
すなわち、自立性吸収性又は吸水性物質の薄いシート又
はストリップ、例えば口紙又はストリップであってよい
。このような要素は、試験ストリップ、診断要素、ディ
ツプスティック又は診断剤として公知である。
本明細書に記載する基質を乾式分析要素に使用する場合
、これを適当な吸収性担体物質中に吸収又は含浸によっ
て混入させるか、又は適当な吸収性担体物質上に塗布す
ることができる。また、基質を分析中に要素に混入する
ことができる。有用な担体物質は不溶性であり、水又は
生理学的液体、例えば尿又は血清と接触させたときに、
その構造上の一体性を維持するものである。有用な担体
物質は、紙、多孔性粒状構造体、セルロース、多孔性ポ
リマーフィルム、木材、ガラス繊維、織布及び不織布（
合成及び非合成）等から製造することができる。このよ
うな要素を作製するため有用な物質及び操作は、例えば
米国特許第３＋　０９２．４０５号、同第３．８０２．
８４２号、同第３，９１５，６４７号、同第３．９１７
．４５３号、同第３，９３６．３５７号、同第４．２４
８，８２９号、同第４．２５５，３８４号及び同第４．
２７０，９２０号明細書並びに英国特許第２，０５２，
０５７号明細書によって周知である。
乾式分析は、吸収性担体物質として少なくとも１個の多
孔性拡散帯域をその上に有する支持体を含む分析要素を
用いて特に有利に実施することができる。基質は、拡散
帯域又は異なる帯域（例えば試薬帯域、記録帯域又は親
水性帯域）に存在することができる。拡散帯域は任意の
適当な繊維質もしくは非繊維質物質又はこれらの一方又
は両方の混合物から調製することができる。
前記拡散帯域は、例えば米国特許第４．２９２．２７２
号明細書に記載されているように、繊維物質を適当なバ
インダー物質と混合するか或いは布帛に織ることによっ
て調製することができ、或いは米国特許第３，９９２．
１５８号、同第４，２５８，００１号及び同第４．４３
０，４３６号明細書及び特開昭５７　（１９８２）　−
１０１７６０号公報に記載されているようにポリマー組
成物（例えばプラッシュポリマー）又は粒状物質（結合
接着剤を含むか又は含まない）から製造することができ
る。拡散帯域は等方向に多孔性である、すなわち、孔度
が粒子、繊維、ポリマーストラン−ド等の間の連続空間
又は孔によって生じるように帯域のどの方向でも同一で
あるのが望ましい。
本発明の乾式分析要素は、吸収性担体物質を適当な非多
孔性支持体上に担持体上に担持するのが好ましい。この
ような支持体は、任意の適当な寸法安定性で、２００〜
９００ｎｍの波長の電磁線を透過する、好ましくは透明
な（輻射線透過性）フィルム又はシート物質である。特
定の要素のため選択される支持体は、意図する検出方法
と認容性であり、分析に使用する化学試薬及び液体試料
に対して不活性であるべきである。有用な支持体は、ポ
リスチレン、ポリエステル〔例えばポリ　（エチレンテ
レフタレート）〕、ポリカーボネート、セルロースエス
テル（例えばセルロースアセテート）及び他の文献に公
知のものを包含する。
本発明に係る要素は、１個より多くの帯域、例えば試薬
帯域、記録帯域又は下塗帯域を有していてよい。これら
の帯域は、一般に、相互に液体接触〔液体、試薬及び反
応生成物が隣接帯域の重なった領域の間を通過しうろこ
とを意味する〕している。帯域は、別々に塗布された、
重ねられた層であるのが好ましいが、一つの被覆層に２
以上の帯域が存在してもよい。前記の特許の他に、例え
ば米国特許第４．０４２，３３５号及び同第４．１４／
１，３０６号明細書及び米国再発行特許第３０，２６７
号明細書にも、適当な要素構造及び成分が記載されてい
る。
本発明の要素において、基質の量は、広く変動しうるが
、一般に少なくとも０．０１　ｇ　／　ｇ、好ましくは
０．０５〜Ｌ　ｇ　／　ｒ＋？の被覆量で存在する。必
須ではないが、好ましい試薬は、一般に下記の被覆量で
存在する： 緩　衝　剤ニ一般に少なくとも０．１ｇ／ｍ、好ましく
は０．５〜２ｇ／ｍ、 界面活性剤ニ一般に少なくとも０．１ｇ／ｍ、好ましく
は０．２〜５ｇ／ｍ、 １以上の帯域が種々の他の所望であるが、必須ではない
成分、例えば当業者に公知の活性化剤、バインダー（一
般に親水性）及びカプラー溶剤並びに酸もしくはアルカ
リホスファターゼ又はリガンドの分析に必要な任意の試
薬を含んでいてよい。
本発明により、分析方法に応じて異なる種々の要素を製
造することができる。任意の所望の幅の長いテープ、シ
ート、スライド又はチップを含めて種々の形で要素を形
成することができる。
本発明の分析は、手操作で又は自動的にすることができ
る。一般に、乾式要素を使用する場合、要素を供給ロー
ル、チップ包装物又は他の供給源から採取し、試験すべ
き液体試料（例えば１〜２００μ２以下）と、試料が要
素中の試薬と混合するように接触させることによって被
分析物を測定する。このような接触は、任意の適当な方
法で、例えば要素を試料中に浸漬するか、又は好ましく
は適当な分配手段を用いて一滴以上の試料を手又は機械
で要素にスポット付けすることによって達成される。こ
の接触は要素内において液体試料と基質及び要素中の他
の試薬との反応を引き起す。
試料を施した後、要素をコンディショニング、例えばイ
ンキュベーション、加熱等、任意の試験結果を得るのを
促進又は容易にするのに望ましい処理に付す。
一般に、前記分析（溶液又は乾式）はホスファターゼに
よる基質の加水分解を促進する条件下で実施する。この
ような加水分解条件は、加水分解を補助するｐＨ及び温
度条件を包含する。一般に、ｐＨは測定すべきホスファ
ターゼにもよるが、１２未満である。温度は、限定的で
はないが、−ｉには５０℃以下である。
前記基質が還元されて少な（とも５８０ｎｍの波長で適
当な方法で検出しうる螢光部分を放出する場合に、酸又
はアルカリホスファターゼの検出が達成される。しかし
最大螢光の波長で測定を行う必要性は必ずしもない。測
定は、速度測定（ｒａｔｅｄｅｔｅｒ＋ｎ１ｎａｔｔｏ
ｎ）又は終点測定であってよい。
特異的結合リガンドの測定の場合には、放出された螢光
染料は試験試料中のりガントの量と相関する。
本明細書の開示において使用しているように、１．Ｕ、
は酵素活性の国際単位（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　
Ｌｌｎｉｔ）を表わし、１１．ｔｌ、は当該酵素の標準
ｐｌ＋及び温度条件下に１分当り１マイクロモル（μｍ
ｏｌ）の基質を転化せしめる触媒作用をするのに必要な
酵素活性の量である。
〔実施例〕
以下、実施例に従って本発明を更に詳しく説明するが、
本発明の技術的範囲をこれらの実施例に限定するもので
ないことはいうまでもない。
Ｃｏｏｋｅらの八ｕｓｔｒａ１．Ｊ、ｃｈｅｍ、　１１
＋２３０〜２３５頁（１９５８）に記載されている方法
に従って６−ヒドロキシフェナレノンを調製した。６−
ヒドロキシフェナレノン（１０ｇ）を乾燥ピリジン（１
５０ＩＲ１り中に分散せしめた。オキシ塩化リン（１０
ｄ）を添加して透明な黄緑色溶液を得、これを室温で２
〜３分間放置して反応を完結させた。次にこの液を冷水
３００＊１’中に注ぎ、水酸化ナトリウム溶液（５０％
）を加え、ｐＨを９までにした。ロータリーエバポレー
ターで殆んどのピリジンを除去し、生成暗橙色溶液を濃
塩酸で酸性とし、氷／メタノール浴中で急冷した。遊離
酸を濾過で集め、希塩酸及びアセトンで洗浄し、次いで
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液に再溶
解して基質の緩衝塩溶液を得た。
ＭＲ酸もそのマグネシウム塩に転化させた。即ち、先ず
遊離酸を酢酸ナトリウムの希釈溶液に熔解し、次に水（
５０ｍ）中の硫酸マグネシウム（１５ｇ）溶液を添加し
、得られた混合物を濾過して少量の暗色不純物を除去し
た。透明な濾液をフリーザー中で一夜冷やした。生成し
た橙色生成物を濾取し、少量の氷水で洗浄した。かくし
て核磁気共鳴スペクトルが構造的に一致するフェナレノ
ン−６−ホスフェートマグネシウム塩８ｇを得た。
例１で調製したマグネシウム塩基質を５４０ｎｍにおけ
るアルカリホスファターゼの動力学的パラメータ及び反
応速度を測定するのに使用した。この研究は、基￥ｔ（
濃度範囲０．１〜１０ミリモル濃度）、子ウシの腸アル
カリホスファターゼ（０，０１１，Ｕ、／−）、炭酸ナ
トリウム（１００ミリモル濃度、ｐＨｌｏ）、塩化マグ
ネシウム（１ミリモル濃度）、及び過塩素酸亜鉛（１ミ
リモル濃度）を用いて実施した。
得られたデータからダブルレシプロカルプロットを描い
た。このプロットから計算したミカエリス（Ｍｉｃｈａ
ｅｌｉｓ）定数Ｋｍは１．４ミリモル濃度であった。
反応速度（■いａｘ）の計算値は０．０２９吸光度（Ａ
）単位７分であった。これらの稙は同一の条件下で試験
した公知のアルカリホスファターゼ基質、ｐ−ニトロフ
ェニルホスフェート基質で得られた値Ｋｍ−１．２ミリ
モル濃度及びＶ、、、　＝　０．０３５Ａ／分と十分匹
敵するものである。これらのデータは本発明のフェナレ
ノンホスフェートがホスファターゼの傍れた基質である
ことを示している。
１３：アルカリホスファターゼの汐を先梶例１の基質（
１０−”＝モル濃度）、酢酸マグネシウム（１０−’モ
ル流度）及びトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
緩衝剤（０，１モル濃度、ｐＨ８，５）を用い調製した
。この溶液１１Ｒｐ、を２個の試験セルのそれぞれに入
れた。一方のセルにウシの肝臓アルカリホスファターゼ
（１００ｐ！！、１０−５モル濃度）を入れ、第二のセ
ルにはホスファターゼは入れなかった。
ホスファターゼ−加水分解された基質を含む試験セル中
の溶液の相対螢光を励起５３５ｎｍ及び発光５８０ｎｍ
で測定した。螢光の迅速な発生が認められた。加水分解
されていない基質を含む第二のセルにおいては、これら
の波長では最小限の螢光が認められたに過ぎなかった。
第二の試験セルの加水分解されていない基質の相対螢光
を励起４５１ｎ＋ｎ及び発光５３５ｎｍで測定した。
第一の試験セル中の加水分解された基質に対しては、こ
れらの波長では最小限の螢光が認められたに過ぎなかっ
た。
この例は本発明の基質がアルカリホスファターゼによっ
て加水分解されてシフトした螢光部分を生成し、その螢
光発光は５３５ｎｍで励起させた場合に５８０ｎｍで検
出することができ、従って該酵素の分析に使用すること
ができる。
〔発明の効果〕
本発明は基質を加水分解した場合に螢光染料を放出する
酸及びアルカリ系スファターゼ用の新規な基質を提供す
る。この放出染料は生物学的流体中において共通的に遭
遇する分光的妨害物質から刈れた波長で吸収発光すると
いう特長をもつ。更に、放出された染料の螢光励起及び
発光スペクトルはシフトして、基質自身の励起及び発光
スペクトルと異なったものとなる。
本発明の基質を用いる分析は迅速で感度が高く、生物学
的流体中の酸又はアルカリホスファターゼを測定するの
に好適に使用することができる。本発明の分析方法は、
更に、酸若しくはアルカリホスファターゼを標識として
用いた場合に、或いは前記した加水分解可能な化合物を
標識として用いた場合に、免疫学的に反応性の物質を測
定するのに使用することもできる。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、式 ＢＬＯＣＫ−Ｘ−Ｒ＾ｆ−Ｌ 〔式中、ＢＬＯＣＫはホスホノ、チオキソホスホノ又は
    その塩を表し、 Ｘは−Ｏ−、−Ｓ−又は−ＮＲ−（ここでＲは水素又は
    置換若しくは非置換アルキル基である）を表すがＢＬＯ
    ＣＫがチオキソホスホノの場合にはＸは−Ｏ−を表し、 Ｒ＾ｆは置換若しくは非置換フェナレノン若しくはベン
    ズフェナレノン部分を表すが、−Ｘ−Ｒ＾ｆ−Ｌとして
    放出された時に−Ｘ−Ｒ＾ｆ−Ｌが少なくとも５８０ｎ
    ｍで最大螢光発光を示し、５３０ｎｍより上で最大吸収
    を示すものであり、そして Ｌは水素又は特異結合性リガンドを表す〕 によって表される加水分解可能なホスファターゼ用基質
    。 ２、式 ＢＬＯＣＫ−Ｘ−Ｒ＾ｆ−Ｌ 〔式中、ＢＬＯＣＫはホスホノ、チオキソホスホノ又は
    その塩を表し、 Ｘは−Ｏ−、−Ｓ−又は−ＮＲ−（ここでＲは水素又は
    置換若しくは非置換アルキル基である）を表すがＢＬＯ
    ＣＫがチオキソホスホノの場合にはＸは−Ｏ−を表し、 Ｒ＾ｆは置換若しくは非置換フェナレノン若しくはベン
    ズフェナレノン部分を表すが、−Ｘ−Ｒ＾ｆ−Ｌとして
    放出された時に−Ｘ−Ｒ＾ｆ−Ｌが少なくとも５８０ｎ
    ｍで最大螢光発光を示し、５３０ｎｍより上で最大吸収
    を示すものであり、そして Ｌは水素又は特異結合性リガンドを表す〕 によって表される加水分解可能なホスファターゼ用基質
    を含むｐＨ１２又はそれ以下に緩衝された水溶液を含ん
    で成る分析組成物。 ３、式 ＢＬＯＣＫ−Ｘ−Ｒ＾ｆ−Ｌ 〔式中、ＢＬＯＣＫはホスホノ、チオキソホスホノ又は
    その塩を表し、 Ｘは−Ｏ−、−Ｓ−又は−ＮＲ−（ここでＲは水素又は
    置換若しくは非置換アルキル基である）を表すがＢＬＯ
    ＣＫがチオキソホスホノの場合にはＸは−Ｏ−を表し、 Ｒ＾ｆは置換若しくは非置換フェナレノン若しくはベン
    ズフェナレノン部分を表すが、−Ｘ−Ｒ＾ｆ−Ｌとして
    放出された時に−Ｘ−Ｒ＾ｆ−Ｌが少なくとも５８０ｎ
    ｍで最大螢光発光を示し、５３０ｎｍより上で最大吸収
    を示すものであり、そして Ｌは水素又は特異結合性リガンドを表す〕 によって表される加水分解可能なホスファターゼ用基質
    を含む分析要素。 ４、Ａ、加水分解条件下に、ホスファターゼを含むと思
    われる液体試料を構造式： ＢＬＯＣＫ−Ｘ−Ｒ＾ｆ−Ｌ 〔式中、ＢＬＯＣＫはホスホノ、チオキソホスホノ又は
    その塩を表し、 Ｘは−Ｏ−、−Ｓ−又は−ＮＲ−（ここでＲは水素又は
    置換若しくは非置換アルキル基である）を表すがＢＬＯ
    ＣＫがチオキソホスホノの場合にはＸは−Ｏ−を表し、 Ｒ＾ｆは置換若しくは非置換フェナレノン若しくはベン
    ズフェナレノン部分を表すが、−Ｘ−Ｒ＾ｆ−Ｌとして
    放出された時に−Ｘ−Ｒ＾ｆ−Ｌが少なくとも５８０ｎ
    ｍで最大螢光発光を示し、５３０ｎｍより上で最大吸収
    を示すものであり、そして Ｌは水素又は特異結合性リガンドを表す〕 によって表される加水分解可能なホスファターゼ用螢光
    基質と接触させ、そして Ｂ、ホスファターゼの存在の結果として加水分解により
    放出された螢光部分を５３０ｎｍを超える波長で励起後
    少なくとも５８０ｎｍの波長で測定する工程を含むホス
    ファターゼの測定方法。
JP62018750A 1986-01-31 1987-01-30 加水分解可能なホスフアタ−ゼ用螢光基質ならびにそれを用いる分析組成物，要素および方法 Pending JPS62190191A (ja)

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EP0232129A3 (en) 1989-08-30
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