JPS62285786A - ハイブリツドプロモ−タ−およびそれを利用した異種蛋白質の製造方法 - Google Patents
ハイブリツドプロモ−タ−およびそれを利用した異種蛋白質の製造方法Info
- Publication number
- JPS62285786A JPS62285786A JP61127153A JP12715386A JPS62285786A JP S62285786 A JPS62285786 A JP S62285786A JP 61127153 A JP61127153 A JP 61127153A JP 12715386 A JP12715386 A JP 12715386A JP S62285786 A JPS62285786 A JP S62285786A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- promoter
- yeast
- pho5
- region
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
- C12N2730/00011—Details
- C12N2730/10011—Hepadnaviridae
- C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
- C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Virology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
３、発明の詳細な説明
（産業上の利用分野〕
本発明はハイブリッドプロモーター及び該プロモーター
を利用した酵母による異種蛋白質の製造方法に関し、さ
らに詳しくはＳＶ４０ウィルス由来のエンハンサ−を酵
母プロモーターに組み込んだハイブリッドプロモーター
及び、これを利用して酵母において異種蛋白質を製造す
る方法に関する。
を利用した酵母による異種蛋白質の製造方法に関し、さ
らに詳しくはＳＶ４０ウィルス由来のエンハンサ−を酵
母プロモーターに組み込んだハイブリッドプロモーター
及び、これを利用して酵母において異種蛋白質を製造す
る方法に関する。
遺伝子工学の手法を用いて酵母に外来タンパク質を産生
させる試みが数多くなされている。これらの例では、目
的遺伝子の転写側？ＩＩＩ’ｐＭ域として酵母由来のＰ
ＨＯ５”、ＧＡＰ−ＤＨ２ゝ、ＰＧＫ”。
させる試みが数多くなされている。これらの例では、目
的遺伝子の転写側？ＩＩＩ’ｐＭ域として酵母由来のＰ
ＨＯ５”、ＧＡＰ−ＤＨ２ゝ、ＰＧＫ”。
ａ−１’；’ ａ ｃ ｔ ｏ ｒ”、などのプロモー
ター領域が用いられている。一般に酵母においてＲＮＡ
ポリメラーゼ■が作用するプロモーター領域は、翻訳開
始点から転写開始点およびＴＡＴＡボックスを含む領域
とこの領域の５′上流に存在し、シス（ｃｉｓ）に機能
して転写促進作用を示す？■域（Ｕ Ａ Ｓ ： ｕｐ
ｓｔｒｅａｍ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ５ｉｔｅ）の２
つの領域から成り立っている”、ＵＡＳは菌体間でトラ
ンス（ｔｒａｎｓ）に機能する因子の作用を受けて特異
的な遺伝子の転写を促進することが示されている６）。
ター領域が用いられている。一般に酵母においてＲＮＡ
ポリメラーゼ■が作用するプロモーター領域は、翻訳開
始点から転写開始点およびＴＡＴＡボックスを含む領域
とこの領域の５′上流に存在し、シス（ｃｉｓ）に機能
して転写促進作用を示す？■域（Ｕ Ａ Ｓ ： ｕｐ
ｓｔｒｅａｍ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ５ｉｔｅ）の２
つの領域から成り立っている”、ＵＡＳは菌体間でトラ
ンス（ｔｒａｎｓ）に機能する因子の作用を受けて特異
的な遺伝子の転写を促進することが示されている６）。
またＵＡＳは翻訳開始点から転写開始点およびＴＡＴＡ
ボックスを含む領域とは独立に機能するため、このＵＡ
Ｓを他の遺伝子のＵＡＳと置換して本来の制御系から解
除することが出来る７′。
ボックスを含む領域とは独立に機能するため、このＵＡ
Ｓを他の遺伝子のＵＡＳと置換して本来の制御系から解
除することが出来る７′。
動物細胞および動物ウィルス遺伝子の転写制御領域にも
シスに機能して転写促進作用を示す領域としてエンハン
サ−の存在が明らかにされているＳ）。
シスに機能して転写促進作用を示す領域としてエンハン
サ−の存在が明らかにされているＳ）。
ＳＶ４０ウィルスのエンハンサ−はアフリカミドリザル
腎細胞’ｌ、ＣＯ３細胞１０′、ならびにＨｅ１ａ細胞
１１）等で機能することが示されている。
腎細胞’ｌ、ＣＯ３細胞１０′、ならびにＨｅ１ａ細胞
１１）等で機能することが示されている。
このＳＶ４０エンハンサ−が酵母で機能するかどうかは
明らかでないが、酵母Ｔｙエレメント中にホモロジーの
ある領域が存在することが示されている１２＋ 。
明らかでないが、酵母Ｔｙエレメント中にホモロジーの
ある領域が存在することが示されている１２＋ 。
従来、酵母に外来タンパクを産生させる場合酵母由来の
プロモーター領域が用いられた。これは宿生酵母によっ
て何らかの制御あるいは組換えなどの望ましくない現象
が起こる危険性が考えられる。
プロモーター領域が用いられた。これは宿生酵母によっ
て何らかの制御あるいは組換えなどの望ましくない現象
が起こる危険性が考えられる。
参考文献（当業者の便宜のため原語で示した）１）に、
Ｍｕｒｒａｙ ｅｔ ａｌ、、 ＥＭＢＯＪ、、 ３（
３）、 ６４５−６５０゜＋８４ ２） Ｇ、Ａ、Ｂｉｔｔｅｒ＆ Ｋ、Ｍ、Ｅｇａｎ、
Ｇｅｎｅ、 ３２＋２６３−２７４． ’ ８４ ３） Ｃ，Ｙ、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ、、 Ｎｕｃｌ、
Ａｃ１ｄ Ｒｅｓ、、１２（２３）。
Ｍｕｒｒａｙ ｅｔ ａｌ、、 ＥＭＢＯＪ、、 ３（
３）、 ６４５−６５０゜＋８４ ２） Ｇ、Ａ、Ｂｉｔｔｅｒ＆ Ｋ、Ｍ、Ｅｇａｎ、
Ｇｅｎｅ、 ３２＋２６３−２７４． ’ ８４ ３） Ｃ，Ｙ、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ、、 Ｎｕｃｌ、
Ａｃ１ｄ Ｒｅｓ、、１２（２３）。
８９５１−８９７０． ’ ８４
４） Ａ、Ｊ、Ｂｒａｋｅ ｅＬ ａｌ、、 Ｐｒｏｃ
、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、。
、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、。
針、 ４６４２−４６４６． ’ ８４５） Ｌ、Ｇｕ
ａｒｅｎｔｅ、 Ｃｅ１ｌ、 ３６．７９９− 、
’８４６） Ｅ、Ｇｉｎｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ、、 Ｃ
ｅ１１． ａｏ、 ７６７−７７４＋ ’ ８５７ ）
Ｌ、Ｇｕａｒｅｎｔｅ ｅｔ ａｌ、＋ Ｐ
’ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、Ｓｃｉ、。
ａｒｅｎｔｅ、 Ｃｅ１ｌ、 ３６．７９９− 、
’８４６） Ｅ、Ｇｉｎｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ、、 Ｃ
ｅ１１． ａｏ、 ７６７−７７４＋ ’ ８５７ ）
Ｌ、Ｇｕａｒｅｎｔｅ ｅｔ ａｌ、＋ Ｐ
’ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、Ｓｃｉ、。
譲、７４１０− 、 ’８２
Ｌ、Ｇｕａｒｅｎｔｅ ｅｔ ａｌ、、 Ｃｅｌ＋、
３６＋ ５０３− 、 ’８４に、５ｔｒｕｈｌ、
Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、 ８１
＋７８６５− 、 ’８４ ８） Ｇ、Ｋｈｏｕｒｙ ＆ｔ Ｐ、Ｇｒｕｓｓ、
Ｃｅ１ｌ、 ３３．３１３−３１４゜＋８３ ９） Ｄ、Ｈ，Ｉ（ａｍｅｒ ＆ Ｐ、Ｌｅｄｅｒ、
Ｎａｔｕｒｅ、 ２８１ ＋ ３５１０） ｔｌｕｍｐ
ｈｒ＋ｅｓ ｅｔ ａｌ、＋ Ｃｅ１ｌ、 、ｑｏ、
１７３．’ ８２１１） Ｊ、Ｂａｎｅｒｊｉ ｅｔ
ａｌ、、 Ｃｅ１ｌ、 ２７． ２９９． ’ ８１１
２） Ｂ、Ｅｒｒｅｄｅ ｅｔ ａｌ、、
Ｐｒｏｃ、Ｎａむ１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、。
３６＋ ５０３− 、 ’８４に、５ｔｒｕｈｌ、
Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、 ８１
＋７８６５− 、 ’８４ ８） Ｇ、Ｋｈｏｕｒｙ ＆ｔ Ｐ、Ｇｒｕｓｓ、
Ｃｅ１ｌ、 ３３．３１３−３１４゜＋８３ ９） Ｄ、Ｈ，Ｉ（ａｍｅｒ ＆ Ｐ、Ｌｅｄｅｒ、
Ｎａｔｕｒｅ、 ２８１ ＋ ３５１０） ｔｌｕｍｐ
ｈｒ＋ｅｓ ｅｔ ａｌ、＋ Ｃｅ１ｌ、 、ｑｏ、
１７３．’ ８２１１） Ｊ、Ｂａｎｅｒｊｉ ｅｔ
ａｌ、、 Ｃｅ１ｌ、 ２７． ２９９． ’ ８１１
２） Ｂ、Ｅｒｒｅｄｅ ｅｔ ａｌ、、
Ｐｒｏｃ、Ｎａむ１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、。
８２、 ５４２３−５４２７． ’ ８５〔発明が解決
しようとする問題点〕 酵母のプロモーターを用いて、外来遺伝子産物を効率よ
く、かつ大量に産生ずる系を開発することを目的にまず
酵母以外のエンハンサ−を酵母プロモーターに組込んだ
ハイブリッドプロモーターを作成し、酵母において外来
遺伝子の発現を調べた結果１本来のプロモーターを用い
た場合と比較して外来タンパクの産生量が増大すること
を見出し２本発明を完成した。
しようとする問題点〕 酵母のプロモーターを用いて、外来遺伝子産物を効率よ
く、かつ大量に産生ずる系を開発することを目的にまず
酵母以外のエンハンサ−を酵母プロモーターに組込んだ
ハイブリッドプロモーターを作成し、酵母において外来
遺伝子の発現を調べた結果１本来のプロモーターを用い
た場合と比較して外来タンパクの産生量が増大すること
を見出し２本発明を完成した。
本発明は酵母プロモーターにおいて、好ましくは、その
転写促進作用を有するＵＡＳ領域とＳＶ４０ウィルスの
エンハンサ−領域とを置換して構築されたハイブリッド
プロモーター、およびそのハイブリッドプロモーター、
およびその下流に結合された異種蛍白質をコードするＤ
ＮＡ配列を用いて酵母を形質転換させることを特徴とす
る異種蛋白質の製造方法である。
転写促進作用を有するＵＡＳ領域とＳＶ４０ウィルスの
エンハンサ−領域とを置換して構築されたハイブリッド
プロモーター、およびそのハイブリッドプロモーター、
およびその下流に結合された異種蛍白質をコードするＤ
ＮＡ配列を用いて酵母を形質転換させることを特徴とす
る異種蛋白質の製造方法である。
酵母プロモーターからのＵ Ａ Ｓ ｉｉ域の除去は。
ユニークな認識部位をもつ制限酵素、あるいはＢａ１３
１などのエキソヌクレアーゼを用いてＴＡＴＡｂｏｘの
５′上流数１０ヘースのところからなされる。
１などのエキソヌクレアーゼを用いてＴＡＴＡｂｏｘの
５′上流数１０ヘースのところからなされる。
参考例１に記載のＰＨＯ５プロモーターは酵母抑制性酸
性ホスファターゼをコードする遺伝子（ＰＨＯ５）のプ
ロモーター領域であり、そのプロモーター活性は無機リ
ン酸が培地中に存在すると抑制され、無機リン酸の欠乏
とともに促進されることが知られている。従って、ＰＨ
Ｏ５プロモーターを利用する場合、無リン酸培地の使用
あるいはＰＨＯ５制御系に変異をもち、ＰＨＯ５プロモ
ーターが構成的に機能しうる宿生酵母を用いる必要があ
る。このＰＨＯ５プロモーターからのＵＡＳ領域の除去
はＴＡＴＡｂｏ ｘの５′上流約７０ｂにある制限酵素
ＢｓｔＥＩＩ認識部位から上流を除去することによって
行った。
性ホスファターゼをコードする遺伝子（ＰＨＯ５）のプ
ロモーター領域であり、そのプロモーター活性は無機リ
ン酸が培地中に存在すると抑制され、無機リン酸の欠乏
とともに促進されることが知られている。従って、ＰＨ
Ｏ５プロモーターを利用する場合、無リン酸培地の使用
あるいはＰＨＯ５制御系に変異をもち、ＰＨＯ５プロモ
ーターが構成的に機能しうる宿生酵母を用いる必要があ
る。このＰＨＯ５プロモーターからのＵＡＳ領域の除去
はＴＡＴＡｂｏ ｘの５′上流約７０ｂにある制限酵素
ＢｓｔＥＩＩ認識部位から上流を除去することによって
行った。
第１図に小型化ＰＨＯ５プロモーターの塩基配列を示し
た。
た。
また、実施例２にあるＧＡＰ−ＤＨプロモーターは酵母
解糖系を構成するグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒ
ドロゲナーゼ（ＧＡＰ−ＤＨ）をコードする遺伝子のプ
ロモーター領域であり、そのプロモーター活性は酵母菌
体間で構成的に機能する。このＧＡＰ−ＤＨプロモータ
ーからのＵＡＳ領域の除去はＴＡＴＡｂｏｘの５′上流
約２０ｂにある制限酵素Ｘｍｍ１ＬＴ２識部位から上流
を除去することにより行なった。第２図に小型化ＧＡＰ
−ＤＨプロモーターの塩基配列を示した。
解糖系を構成するグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒ
ドロゲナーゼ（ＧＡＰ−ＤＨ）をコードする遺伝子のプ
ロモーター領域であり、そのプロモーター活性は酵母菌
体間で構成的に機能する。このＧＡＰ−ＤＨプロモータ
ーからのＵＡＳ領域の除去はＴＡＴＡｂｏｘの５′上流
約２０ｂにある制限酵素Ｘｍｍ１ＬＴ２識部位から上流
を除去することにより行なった。第２図に小型化ＧＡＰ
−ＤＨプロモーターの塩基配列を示した。
ＳＶ４０ウィルスの転写制御領域は公知で、これを担持
したプラスミドも公知であり、商業的供給源（たとえば
、ファルマシア社等）から購入することが出来る。ＳＶ
４０エンハンサ−領域として、初期エンハンサ−である
７２ｂ繰返し構造を含む領域を用いることができ、これ
はＳＶ４０転写制御領域を担持したプラスミドより、適
当な公知の制限酵素で取り出すことが出来る。
したプラスミドも公知であり、商業的供給源（たとえば
、ファルマシア社等）から購入することが出来る。ＳＶ
４０エンハンサ−領域として、初期エンハンサ−である
７２ｂ繰返し構造を含む領域を用いることができ、これ
はＳＶ４０転写制御領域を担持したプラスミドより、適
当な公知の制限酵素で取り出すことが出来る。
第３図にＳＶ４０転写制御領域を模式的に示し。
合わせて制御酵素認識部位を示した。
このエンハンサ−領域を先述の酵母のＵＡＳを含む領域
を除去した小型化酵母プロモーターとをＤＮＡリガーゼ
処理によって結合しハイブリッドプロモーターが構築で
きる。
を除去した小型化酵母プロモーターとをＤＮＡリガーゼ
処理によって結合しハイブリッドプロモーターが構築で
きる。
このようにして構築されたハイブリッドプロモーターの
下流に目的のタンパクをコードする遺伝子を挿入し９組
換えプラスミドを得、酵母を形質転換し、さらに発現さ
せることにより目的のタンパクを効率よく産生ずること
が出来る。
下流に目的のタンパクをコードする遺伝子を挿入し９組
換えプラスミドを得、酵母を形質転換し、さらに発現さ
せることにより目的のタンパクを効率よく産生ずること
が出来る。
本発明の実施例において用いた酵母プロモーターのＰＨ
Ｏ５プロモーター、クーミネーターならびにＧＡＰ−Ｄ
Ｈプロモーター、ターミネータ−は、参考例１ならびに
参考例４に示した方法で単離される。
Ｏ５プロモーター、クーミネーターならびにＧＡＰ−Ｄ
Ｈプロモーター、ターミネータ−は、参考例１ならびに
参考例４に示した方法で単離される。
また１本発明の実施例ではハイブリッドプロモーターに
よる産生物にＢ型肝炎ウィルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）
およびＨＢＳＡｇのＮ末に５５個のアミノ酸からなるｐ
ｒｅＳ領域が付属したＰｒｅＳ−ＨＢｓＡｇを用いた。
よる産生物にＢ型肝炎ウィルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）
およびＨＢＳＡｇのＮ末に５５個のアミノ酸からなるｐ
ｒｅＳ領域が付属したＰｒｅＳ−ＨＢｓＡｇを用いた。
ＨＢウィルスが肝細胞へ侵入する機構は、 ＨＢＶ上
のポリアルブミンレセプター、ポリアルブミン、肝細胞
上のポリアルブミンレセプターを介していると仮定され
ている。ポリアルブミンレセプターは、ＨＢウィルスの
ＰｒｅＳｐｉ域に含まれており、そのためＰｒｅＳｌ域
を有するＨＢｓＡｇ（ＰｒｅＳ−ＨＢｓＡｇ）は、これ
を有さないＨＢｓＡｇより人に対する抗体産生能が高ま
ることが予想され、 ｉｎ ｖｉｔｒｏでは実際に高い
という報告がある（ Ｎｅｕｒａｔｈ、Ａ、Ｒ，ｅｔ
ａｌ、、 ５ｃｉｅｎｃｅ ２２４＋ ３９２−３９５
、１９８４）。
のポリアルブミンレセプター、ポリアルブミン、肝細胞
上のポリアルブミンレセプターを介していると仮定され
ている。ポリアルブミンレセプターは、ＨＢウィルスの
ＰｒｅＳｐｉ域に含まれており、そのためＰｒｅＳｌ域
を有するＨＢｓＡｇ（ＰｒｅＳ−ＨＢｓＡｇ）は、これ
を有さないＨＢｓＡｇより人に対する抗体産生能が高ま
ることが予想され、 ｉｎ ｖｉｔｒｏでは実際に高い
という報告がある（ Ｎｅｕｒａｔｈ、Ａ、Ｒ，ｅｔ
ａｌ、、 ５ｃｉｅｎｃｅ ２２４＋ ３９２−３９５
、１９８４）。
ＨＢｓＡｇｉｉ！伝子ならびにＰｒｅＳ−ＨＢｓＡｇ遺
伝子のＤＮＡ配列はいずれも公知であり、これらを担持
するプラスミドも公知である。本発明者らはＨＢｓＡｇ
遺伝子及びＰｒｅＳ−ＨＢｓＡｇ遺伝子は同じく旧ｏｇ
ｅｎ社より入手したＰｒｅＳ（第４．６図）から調製し
た。ＰｒｅＳ−ＨＢｓＡｇ遺伝子の制限酵素地図を第１
０図に示す。本発明で用いたＨＢｓＡｇのサブタイプは
ａｄｙｗ型である。
伝子のＤＮＡ配列はいずれも公知であり、これらを担持
するプラスミドも公知である。本発明者らはＨＢｓＡｇ
遺伝子及びＰｒｅＳ−ＨＢｓＡｇ遺伝子は同じく旧ｏｇ
ｅｎ社より入手したＰｒｅＳ（第４．６図）から調製し
た。ＰｒｅＳ−ＨＢｓＡｇ遺伝子の制限酵素地図を第１
０図に示す。本発明で用いたＨＢｓＡｇのサブタイプは
ａｄｙｗ型である。
本発明で用いられるベクターは、酵母の遺伝子と大腸菌
の遺伝子とを含みかつＳＶ４０エンハンサ−領域と小型
化酵母プロモーターからなるハイブリッドプロモーター
を担持したベクターである。
の遺伝子とを含みかつＳＶ４０エンハンサ−領域と小型
化酵母プロモーターからなるハイブリッドプロモーター
を担持したベクターである。
ベクターは、形質転換大腸菌及び形質転換酵母のマーカ
ーとなる遺伝子を担持しており１例えば。
ーとなる遺伝子を担持しており１例えば。
アンピシリン耐性遺伝子、２−イソプロピルマレート
デヒドロゲナーゼ遺伝子等を好適に担持する。
デヒドロゲナーゼ遺伝子等を好適に担持する。
形質転換される酵母としては、挿入されるプラスミドが
担持する選択マーカー遺伝子によって相補される変異を
もった変異株１例えばロイシン要求性変異株であるサツ
カロミセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ ｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ） Ａ Ｈ２２（ａ 、
ｈ±土４．互△且２．工旦ｎｌ）等が好適に用いられる
、 またトランスポゾン９０３などの薬剤耐性遺伝子を
マーカーに用いて野生株を宿生に用いることも可能であ
る。得られた形質転換株は、宿主に適した公知の培地で
培養する。培地としては、たとえば、ＹＮＢ液体培地〔
０，７°％Ｙｅａｓｔ ＮｉｔｒｏｇｅｎＢａｓｅ （
Ｄｉｆｃｏ社）、２％グルコース〕が好適に用いられる
。培養は１通常１５〜３２℃で、２０〜５０時間行い、
必要により通気や攪拌を行うこともできる。培養後、公
知の方法１例えば遠心分離法によって菌体を集め９例え
ば適当な緩衝液に懸濁させた後１例えば、超音波処理後
、遠心分離によって上澄みを回収する。この上澄み中に
目的とするＨＢｓＡｇおよびＰｒｅＳ−ＨＢｓＡｇが産
生されており１例えば、モノクローナル抗体を用いた固
定化カラムや疎水性基によるアフィニティクロマトによ
って目的物質の精製が行われ得る。
担持する選択マーカー遺伝子によって相補される変異を
もった変異株１例えばロイシン要求性変異株であるサツ
カロミセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ ｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ） Ａ Ｈ２２（ａ 、
ｈ±土４．互△且２．工旦ｎｌ）等が好適に用いられる
、 またトランスポゾン９０３などの薬剤耐性遺伝子を
マーカーに用いて野生株を宿生に用いることも可能であ
る。得られた形質転換株は、宿主に適した公知の培地で
培養する。培地としては、たとえば、ＹＮＢ液体培地〔
０，７°％Ｙｅａｓｔ ＮｉｔｒｏｇｅｎＢａｓｅ （
Ｄｉｆｃｏ社）、２％グルコース〕が好適に用いられる
。培養は１通常１５〜３２℃で、２０〜５０時間行い、
必要により通気や攪拌を行うこともできる。培養後、公
知の方法１例えば遠心分離法によって菌体を集め９例え
ば適当な緩衝液に懸濁させた後１例えば、超音波処理後
、遠心分離によって上澄みを回収する。この上澄み中に
目的とするＨＢｓＡｇおよびＰｒｅＳ−ＨＢｓＡｇが産
生されており１例えば、モノクローナル抗体を用いた固
定化カラムや疎水性基によるアフィニティクロマトによ
って目的物質の精製が行われ得る。
なお本発明において多くの技法１反応及び分析方法は当
業界においてよく知られている。特にことわらない限り
、全ての酵素は商業的供給源１例えば宝酒造；ニューイ
ングランド、バイオラプス（ＮＥＢ） （Ｎｅｗ Ｅｎ
ｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ （ＮＥＢ） ） 、 ？
サチューセッツ、米国；アマージャム（Ａｍｅｒｓｈａ
ｍ） ＋英国及びベセスダ リサーチ ラボラトリーズ
（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｌａ
ｔｏｒｉｅｓ （ＢＲＬ）） 、メリイランド１英国；
ベーリンガーマンハイム山之内から入手することができ
る。
業界においてよく知られている。特にことわらない限り
、全ての酵素は商業的供給源１例えば宝酒造；ニューイ
ングランド、バイオラプス（ＮＥＢ） （Ｎｅｗ Ｅｎ
ｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ （ＮＥＢ） ） 、 ？
サチューセッツ、米国；アマージャム（Ａｍｅｒｓｈａ
ｍ） ＋英国及びベセスダ リサーチ ラボラトリーズ
（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｌａ
ｔｏｒｉｅｓ （ＢＲＬ）） 、メリイランド１英国；
ベーリンガーマンハイム山之内から入手することができ
る。
酵素反応のための緩衝液及び反応条件は特に断わらない
限り各酵素の製造元の推奨にしたがって使用した。
限り各酵素の製造元の推奨にしたがって使用した。
ファージを用いた大腸菌の形質転換法、プラスミドを用
いた大腸菌の形質転換法、プラークへイブリダイゼーシ
ョン法、電気泳動法及びＤＮＡのゲルからの回収法は「
モレキュラークローニング」コールドスプリングハーバ
−ラボラトリ−（「恥−１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ Ｊ Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ （１９８２）に記載されている方
法により行った。
いた大腸菌の形質転換法、プラークへイブリダイゼーシ
ョン法、電気泳動法及びＤＮＡのゲルからの回収法は「
モレキュラークローニング」コールドスプリングハーバ
−ラボラトリ−（「恥−１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ Ｊ Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ （１９８２）に記載されている方
法により行った。
酵母の形質転換法は「メソッド・イン・イースト・ジエ
ネティクス」コールドスプリングハーバ−ラボラトリ−
（ｒＭｅＬｈｏｄ ｉｎ ｙｅａｓｔ Ｇａｎｅｔｉｃ
ｓＪ ）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ （１９８１）に記載されている方
法で行った。
ネティクス」コールドスプリングハーバ−ラボラトリ−
（ｒＭｅＬｈｏｄ ｉｎ ｙｅａｓｔ Ｇａｎｅｔｉｃ
ｓＪ ）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ （１９８１）に記載されている方
法で行った。
かくして得られたＳＶ４０エンハンサ−領域および小型
化酵母プロモーターからなるハイブリッドプロモーター
は、その下流に発現可能に接続された外来タンパク遺伝
子の効率的な産生を可能にし２本来の酵母プロモーター
を用いた場合に比べて産生量の増大をもたらした。さら
に小型化酵母プロモーターとして１本来抑制的に機能す
るＰＨＯ５プロモーターを用いたハイブリッドプロモー
ターの場合、ＰＨＯ５の転写促進作用をもつ領域が除去
されているために酵母菌体内で構成的に機能した。また
、プロモーター領域のうち、酵母に由来する領域が１／
３〜１１５に小型化できたため。
化酵母プロモーターからなるハイブリッドプロモーター
は、その下流に発現可能に接続された外来タンパク遺伝
子の効率的な産生を可能にし２本来の酵母プロモーター
を用いた場合に比べて産生量の増大をもたらした。さら
に小型化酵母プロモーターとして１本来抑制的に機能す
るＰＨＯ５プロモーターを用いたハイブリッドプロモー
ターの場合、ＰＨＯ５の転写促進作用をもつ領域が除去
されているために酵母菌体内で構成的に機能した。また
、プロモーター領域のうち、酵母に由来する領域が１／
３〜１１５に小型化できたため。
宿生酵母による染色体との組換え頻度が低下すると考え
られ、外来遺伝子の発現がより安定化することが期待で
きる。
られ、外来遺伝子の発現がより安定化することが期待で
きる。
以下に本発明の詳細な説明するために参考例実施例を記
載するが１本発明はこれらに限定されるものではない。
載するが１本発明はこれらに限定されるものではない。
参考例１．酵母ＰＨＯ５遺伝子およびＰ）（０５プロモ
ーターのクローニング サツカロマイセス・セレビシェ（ＳａｃｃｈａｒｏＩＩ
Ｉｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）より、クライヤー（Ｃ
ｒｙｅｒ）らの方法に従って酵母クロモソームの抽出を
行った〔ディー、アール、クライヤーら、メソッド・イ
ン・セル・バイオロジー（アカデミツク・プレス）（Ｄ
、Ｒ。
ーターのクローニング サツカロマイセス・セレビシェ（ＳａｃｃｈａｒｏＩＩ
Ｉｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）より、クライヤー（Ｃ
ｒｙｅｒ）らの方法に従って酵母クロモソームの抽出を
行った〔ディー、アール、クライヤーら、メソッド・イ
ン・セル・バイオロジー（アカデミツク・プレス）（Ｄ
、Ｒ。
Ｃｒｙｅｒ ｅｔ ａｌ、、 Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｃ
ｅ１ｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ａｃａｄｅ−ｍｉｃ Ｐｒ
ｅｓｓ））、 ｖｏｌ、 Ｘ Ｕ、 ３９．１９７５
）。
ｅ１ｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ａｃａｄｅ−ｍｉｃ Ｐｒ
ｅｓｓ））、 ｖｏｌ、 Ｘ Ｕ、 ３９．１９７５
）。
次にメイハック（Ｍｅｙｈａｃｋ）らの報告に基づきＰ
ＨＯ５遺伝子のクローニングを行った〔ビー、メイハ−
７りら（Ｂ、Ｍｅｙｈａｃｋ ｅｔ ａｌ、）、 ＥＭ
ＢＯＪ、、１．６７５゜１９８２）。即ち、得られた酵
母クロモソームを制限酵素旦土ｍＨ！消化し、０．８％
アガロースゲル電気泳動後、 ５．１ ｋｂ付近のＤＮ
Ａを回収した０回収したＤＮＡをｐＵｃ９のポリリンカ
ー配列内にあるＢａｍ８１部位に組み込み、 Ｅ、ｃｏ
ｌｉ １１８１０１を形質転換した。得られた形質転換
体について合成ポリヌクレオチドをプローブに用いてコ
ロニーハイブリダイゼーションを行なった。コロニーハ
イブリダイゼーション法はＭｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ （前述）に従って行なった。その結果、ポ
ジティブであったコロニーよりプラスミド（ｐＵｃＰｈ
ｏ）を調製し、呈上ｍＨＩ消化により挿入断片を回収し
。
ＨＯ５遺伝子のクローニングを行った〔ビー、メイハ−
７りら（Ｂ、Ｍｅｙｈａｃｋ ｅｔ ａｌ、）、 ＥＭ
ＢＯＪ、、１．６７５゜１９８２）。即ち、得られた酵
母クロモソームを制限酵素旦土ｍＨ！消化し、０．８％
アガロースゲル電気泳動後、 ５．１ ｋｂ付近のＤＮ
Ａを回収した０回収したＤＮＡをｐＵｃ９のポリリンカ
ー配列内にあるＢａｍ８１部位に組み込み、 Ｅ、ｃｏ
ｌｉ １１８１０１を形質転換した。得られた形質転換
体について合成ポリヌクレオチドをプローブに用いてコ
ロニーハイブリダイゼーションを行なった。コロニーハ
イブリダイゼーション法はＭｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ （前述）に従って行なった。その結果、ポ
ジティブであったコロニーよりプラスミド（ｐＵｃＰｈ
ｏ）を調製し、呈上ｍＨＩ消化により挿入断片を回収し
。
ｐＪＤＢ２０？旦ａｍＨ１部位に再クローニングした。
これを用いてサツカロマイセス・セレビシアＡＨ２２（
Ｓ、 Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＡＨ２２）を形質転換
し。
Ｓ、 Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＡＨ２２）を形質転換
し。
ＰＨＯ５活性（抑制性酸性フォスファターゼ活性）を東
江らの方法により確認した〔トーエ、エイら。
江らの方法により確認した〔トーエ、エイら。
ジャーナル・バクテリオロジー（Ｔｏｈ−ｅ、 Ａｅｔ
ａｌ、Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）１１３．７２７．
１９７３ ）−抑制性酸性フォスファターゼ活性が陽性
であったプラスミドｐ ＵＣＰ ｈ ｏを旦ａｍＨＩ−
且上」」消化後、１％アガロース電気泳動し、３．９ｋ
ｂ断片を回収した。
ａｌ、Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）１１３．７２７．
１９７３ ）−抑制性酸性フォスファターゼ活性が陽性
であったプラスミドｐ ＵＣＰ ｈ ｏを旦ａｍＨＩ−
且上」」消化後、１％アガロース電気泳動し、３．９ｋ
ｂ断片を回収した。
これをｐＢＲ３２２の旦土工Ｈ１一旦且ｏＲＶ部位に組
み込み、プラスミドｐＡ・Ｐ ５ （８ｋｂｐ ）を得
た。
み込み、プラスミドｐＡ・Ｐ ５ （８ｋｂｐ ）を得
た。
参考例２．ＰＨＯ５プロモーターを用いたＨＢｓＡｇ発
現プラスミドの作成（第４図） ｐＡＰ５を旦土工Ｈｒ−−ジ旦１１消化後、４％ポリア
クリルアミドゲル電気泳動（以下ＰＡＧＥと言う）Ｌ、
ＰＨＯ５のＡＴＧコドンを含むＰＨＯ５プロモ一ター断
片（０，６’２ｋｂ）を得た。これをｐＵＣ９のポリリ
ンカー配列内にある旦ａｍＨＩ−Σ土ヱ１部位に組み込
みｐＵＰ２６を得た。
現プラスミドの作成（第４図） ｐＡＰ５を旦土工Ｈｒ−−ジ旦１１消化後、４％ポリア
クリルアミドゲル電気泳動（以下ＰＡＧＥと言う）Ｌ、
ＰＨＯ５のＡＴＧコドンを含むＰＨＯ５プロモ一ター断
片（０，６’２ｋｂ）を得た。これをｐＵＣ９のポリリ
ンカー配列内にある旦ａｍＨＩ−Σ土ヱ１部位に組み込
みｐＵＰ２６を得た。
また、ｐＡＰ５を旦見且３ＡＩ消化後、ＤＮＡポリメラ
ーゼｌ （クリノー） （ベーリンガーマンハイム社製
）にて末端を修復したのち、Ｐｓｔｌ消化を行い４％Ｐ
ＡＧＥ （ポリアクリルアミドゲル電気泳動）によって
ＰＨＯ５ターミネータ−断片（０，３７ｋｂ）を得た。
ーゼｌ （クリノー） （ベーリンガーマンハイム社製
）にて末端を修復したのち、Ｐｓｔｌ消化を行い４％Ｐ
ＡＧＥ （ポリアクリルアミドゲル電気泳動）によって
ＰＨＯ５ターミネータ−断片（０，３７ｋｂ）を得た。
ｐ［ＪＰ２６を５ａｌｔ消化後ＤＮＡポリメラーゼＩ
（クリノー）による末端修復を行い、その後立１±１消
化したものに先のＰＨＯ５ターミネータ−断片を組み込
みｐＵＰ２６ｔを得た。ｐＵＰ２６ｔをＢａｍＨＩ−Ｈ
ｉユｄｌ［ｒ消化し、４％ＰＡＧＥによってＰＨＯ５プ
ロモーター・ターミネータ−を含む０．９９ｋｂ断片を
回収した。この０．９９ｋｂ断片をｐＪＤＢ２０７Ｂａ
ｍＨＩ一旦±旦ｄｕ＋１部位に組み込み、ｐｃＬ２０３
１を得た。
（クリノー）による末端修復を行い、その後立１±１消
化したものに先のＰＨＯ５ターミネータ−断片を組み込
みｐＵＰ２６ｔを得た。ｐＵＰ２６ｔをＢａｍＨＩ−Ｈ
ｉユｄｌ［ｒ消化し、４％ＰＡＧＥによってＰＨＯ５プ
ロモーター・ターミネータ−を含む０．９９ｋｂ断片を
回収した。この０．９９ｋｂ断片をｐＪＤＢ２０７Ｂａ
ｍＨＩ一旦±旦ｄｕ＋１部位に組み込み、ｐｃＬ２０３
１を得た。
Ｂｉｏｇｅｎ社より入手したＰｒｅＳ−ＨＢｓＡｇ遺伝
子を含むプラスミドｐＰｒｅＳを制限酵素ｘｂａｔ（宝
酒造）ならびにＢａｎＵ （ＮＥＢ社製）を用いて完全
消化し、１．５％アガロースゲル電気泳動によってＨＢ
ｓＡｇ遺伝子を含む１． ｌ ｋｂからなるＤＮＡ断片
を得た。ｐＧＬ２０３１を制限酵素ＡｈａＩ［［（宝酒
造製）によって部分消化したのち、０．８％アガロース
ゲル電気泳動し、１カ所で切断されたｐＧＬ２０３１を
回収した。このｐＧＬ２０３１断片に、先の１．１ ｋ
ｂからなるＨＢｓＡｇ遺伝子断片をＤＮＡポリメラーゼ
Ｉ （クリノー）を用いて末端修復をしたのち組込みｐ
ＧＬ２０６２を作成した。
子を含むプラスミドｐＰｒｅＳを制限酵素ｘｂａｔ（宝
酒造）ならびにＢａｎＵ （ＮＥＢ社製）を用いて完全
消化し、１．５％アガロースゲル電気泳動によってＨＢ
ｓＡｇ遺伝子を含む１． ｌ ｋｂからなるＤＮＡ断片
を得た。ｐＧＬ２０３１を制限酵素ＡｈａＩ［［（宝酒
造製）によって部分消化したのち、０．８％アガロース
ゲル電気泳動し、１カ所で切断されたｐＧＬ２０３１を
回収した。このｐＧＬ２０３１断片に、先の１．１ ｋ
ｂからなるＨＢｓＡｇ遺伝子断片をＤＮＡポリメラーゼ
Ｉ （クリノー）を用いて末端修復をしたのち組込みｐ
ＧＬ２０６２を作成した。
参考例３− ｐＧＰ３Ｈｒの作成
ｐＧＰ３Ｈｒは第５図に示す手順によって作成された。
ｐＧＬ２０６２をホ１１限酵素Ｈｉｎｄｆｌ［（宝酒造
製）で完全消化したのち、さらに制限酵素Ｓａβ！ （
宝酒造製）で完全消化し、１％アガロースゲル電気泳動
によってＰＨＯ５プロモーター、 ＨＢｓＡｇ遺伝子
ならびにＰＨＯ５ターミネータ−を含む２．４５ ｋｂ
の断片とベクタ一部分に相当する６゜３ｋｂ断片を得た
。２．４５ｋｂ断片の両末端を４種のすべてのｄＮＴＰ
存在下でＤＮＡポリメラーゼ！（クリノー） （ベーリ
ンガーマンハイム社製）を用いて平滑末端に修復したの
ちｐｓａ１１リンカ−（宝酒造製）をＴ４リガーゼ（宝
酒造製）を用いて接続した。これを制限酵素ＢｓｔＥＩ
Ｉ（ＮＥＢ社製）で完全消化し、先と同様に両末端を修
復したのちｐＨ１ｎｄＩＩＩリンカ−（宝酒造製）をＴ
４リガーゼによって接続した。これをＨｉｎｄｌｌｌな
らびにＳａｌ■で完全消化し、０．８％アガロースゲル
電気泳動を行なった。結果としてＢｓ ｔＥ■認識部位
より上流領域が除去され小型化したＰＨＯ５プロモータ
ーの５′末端に新たにＨｉｎｄ■接着末端をもち、また
ＰＨＯ５ターミネータ−の３′下流に５ａｌＩ接着末端
をもつ１．７３ｋｂの断片が得られた。この１．７３ｋ
ｂ断片と先の６．３ Ｋｂベクター断片とをＴ４リガー
ゼによってライゲーションし、ｐＧＰ３Ｈｒを得た。
製）で完全消化したのち、さらに制限酵素Ｓａβ！ （
宝酒造製）で完全消化し、１％アガロースゲル電気泳動
によってＰＨＯ５プロモーター、 ＨＢｓＡｇ遺伝子
ならびにＰＨＯ５ターミネータ−を含む２．４５ ｋｂ
の断片とベクタ一部分に相当する６゜３ｋｂ断片を得た
。２．４５ｋｂ断片の両末端を４種のすべてのｄＮＴＰ
存在下でＤＮＡポリメラーゼ！（クリノー） （ベーリ
ンガーマンハイム社製）を用いて平滑末端に修復したの
ちｐｓａ１１リンカ−（宝酒造製）をＴ４リガーゼ（宝
酒造製）を用いて接続した。これを制限酵素ＢｓｔＥＩ
Ｉ（ＮＥＢ社製）で完全消化し、先と同様に両末端を修
復したのちｐＨ１ｎｄＩＩＩリンカ−（宝酒造製）をＴ
４リガーゼによって接続した。これをＨｉｎｄｌｌｌな
らびにＳａｌ■で完全消化し、０．８％アガロースゲル
電気泳動を行なった。結果としてＢｓ ｔＥ■認識部位
より上流領域が除去され小型化したＰＨＯ５プロモータ
ーの５′末端に新たにＨｉｎｄ■接着末端をもち、また
ＰＨＯ５ターミネータ−の３′下流に５ａｌＩ接着末端
をもつ１．７３ｋｂの断片が得られた。この１．７３ｋ
ｂ断片と先の６．３ Ｋｂベクター断片とをＴ４リガー
ゼによってライゲーションし、ｐＧＰ３Ｈｒを得た。
参考例４．酵母ＧＡＰ−ＤＨ遺伝子およびＧＡＰ−ＤＨ
プロモーターのクローニング 酵母染色体ＤＮＡより酵母Ｇ Ａ Ｐ −Ｄ ＩＩ遺伝
子配列を有するＤＮＡを次のようにして調製した。
プロモーターのクローニング 酵母染色体ＤＮＡより酵母Ｇ Ａ Ｐ −Ｄ ＩＩ遺伝
子配列を有するＤＮＡを次のようにして調製した。
酵母サツカロミセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏ−
ｍ ｃｅｓ Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） ＧＲＦ １８ｐ
ｈｏ８０（ｚ、 ｌｅｕ＋至紅ｓ、 ｍｅｔ、 助
飢虹）より、シー・アール・クライヤー（Ｃ０Ｒ０Ｃｒ
ｙｅｒ ）ら「メソド・イン・セル バイオロジーＪ
（ｒＭｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏ−１ｏｇ
ｙＪ ）第１８巻、第３節、３９頁、アカデミツクプレ
ス、ニューヨーク（１９７５）の方法に従って染色体Ｄ
ＮＡを調製した。 この染色体ＤＮＡを制限酵素Ｈｉｎ
ｄｌｌ［（宝酒造社製、以下同じ）を用いて完全消化し
、同じ＜ Ｈｉ ｎ ｄ Ｉ［＋を用いて完全消化した
ラムダファージｃｈａｒｏｎ２８（ｂ１００７． Ｋ１
１５４、 ＮｌＮ５）ＤＮＡと連結した。連結にはＴ４
ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製、以下同じ）を用い、推奨
されている方法に従って１６℃で１晩反応させることに
よって連結を行った。以下に述べるＤＮＡの連結にも同
じ方法を用いた。この連結したＤＮＡをインビトロパフ
ケージングキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いてパ
フケージング 後、大腸菌ＬＥ３９２株（Ｆ−、ｈｓｄ
Ｒ５１４（ｒｉ＋−ｍｍ−）。
ｍ ｃｅｓ Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） ＧＲＦ １８ｐ
ｈｏ８０（ｚ、 ｌｅｕ＋至紅ｓ、 ｍｅｔ、 助
飢虹）より、シー・アール・クライヤー（Ｃ０Ｒ０Ｃｒ
ｙｅｒ ）ら「メソド・イン・セル バイオロジーＪ
（ｒＭｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏ−１ｏｇ
ｙＪ ）第１８巻、第３節、３９頁、アカデミツクプレ
ス、ニューヨーク（１９７５）の方法に従って染色体Ｄ
ＮＡを調製した。 この染色体ＤＮＡを制限酵素Ｈｉｎ
ｄｌｌ［（宝酒造社製、以下同じ）を用いて完全消化し
、同じ＜ Ｈｉ ｎ ｄ Ｉ［＋を用いて完全消化した
ラムダファージｃｈａｒｏｎ２８（ｂ１００７． Ｋ１
１５４、 ＮｌＮ５）ＤＮＡと連結した。連結にはＴ４
ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製、以下同じ）を用い、推奨
されている方法に従って１６℃で１晩反応させることに
よって連結を行った。以下に述べるＤＮＡの連結にも同
じ方法を用いた。この連結したＤＮＡをインビトロパフ
ケージングキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いてパ
フケージング 後、大腸菌ＬＥ３９２株（Ｆ−、ｈｓｄ
Ｒ５１４（ｒｉ＋−ｍｍ−）。
土且且Ｅ４４．土且且Ｆ５８．互土且Ｙｌ。
ｌ１互に２，１１互Ｔ２２．工見より１．エエ１Ｒ５５
，！二）に感染させ４０，０００個のプラークを得た。
，！二）に感染させ４０，０００個のプラークを得た。
パンケージング方法はＡｍｅｒｓｈａｍ社の推奨する方
法に従って行い、大腸菌への感染はＭｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ（前述）に従って行った。
法に従って行い、大腸菌への感染はＭｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ（前述）に従って行った。
この４０，０００個のプラークをニトロセルロースフィ
ルターに固定後３２ｐを用いてラベルした合成りＮＡと
ハイブリダイズさせることによりスクリーニングを行っ
た（プラークハイブリダイゼーション法）。プラークハ
イブリダイゼーション法はＭｏ１ｅｃｕＬａｒ Ｃｌｏ
ｎｔｎｇ（前述）に従って行った。その結果強くハイブ
リダイズし、しかも制限酵素マツピングも一致する２つ
のファージを得た。
ルターに固定後３２ｐを用いてラベルした合成りＮＡと
ハイブリダイズさせることによりスクリーニングを行っ
た（プラークハイブリダイゼーション法）。プラークハ
イブリダイゼーション法はＭｏ１ｅｃｕＬａｒ Ｃｌｏ
ｎｔｎｇ（前述）に従って行った。その結果強くハイブ
リダイズし、しかも制限酵素マツピングも一致する２つ
のファージを得た。
このファージＤＮＡをＨｉｎｄＩ［Ｉで完全消化するこ
とにより、２．１ｋｂの酵母染色体由来のＤＮＡ断片を
調製した。
とにより、２．１ｋｂの酵母染色体由来のＤＮＡ断片を
調製した。
この２．ＩＫｂ ＨｉｎｄＩ［［ＤＮＡ断片を大腸菌
の代表的なプラスミドｐＢＲ３２２ＤＮＡをＨｉｎｄｌ
ｌｌを用いて連結し、大腸菌８８１０１株（旦二。
の代表的なプラスミドｐＢＲ３２２ＤＮＡをＨｉｎｄｌ
ｌｌを用いて連結し、大腸菌８８１０１株（旦二。
ｈｓｄｓ２０ （ｒｓ −、ｍｓ −）、ｒｅｃＡ１３
゜土Ｌニー１４，１工窯Ａ２．Ｎ見旦Ｙｌ、■エエＫ
２． Ｌｌ上Ｌ ２０ （Ｓｍ’ ）、 五１Ｌ−５゜
工±１−１．ユニ且Ｅ４４．スニ）を形質転換し。
゜土Ｌニー１４，１工窯Ａ２．Ｎ見旦Ｙｌ、■エエＫ
２． Ｌｌ上Ｌ ２０ （Ｓｍ’ ）、 五１Ｌ−５゜
工±１−１．ユニ且Ｅ４４．スニ）を形質転換し。
リクローニングを行った。大腸菌のプラスミドによる形
質転換法はＭｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（前述
）に従って行った。リクローニングによって得たプラス
ミドをｐＧＡＰ３０１第６図（Ａ）と命名した。
質転換法はＭｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（前述
）に従って行った。リクローニングによって得たプラス
ミドをｐＧＡＰ３０１第６図（Ａ）と命名した。
参考例５．ＰｒｅＳ−ＨＢｓＡｇ発現用ベクターの作成
酵母中でＰｒｅＳ−ＨＢｓＡｇを発現するためのＧＡＰ
−ＤＨプロモーターを用いるプラスミドベクターｐＧＧ
５０３を第６図（Ａ）、 （Ｂ）に示すようにして構
築した。以下１図に従って説明する。
−ＤＨプロモーターを用いるプラスミドベクターｐＧＧ
５０３を第６図（Ａ）、 （Ｂ）に示すようにして構
築した。以下１図に従って説明する。
ｐＧＡＰ３０１ＤＮＡをＴａｑＩ（ＮＥＢ社製）を用い
て完全消化し電気泳動によって分離することによりＧ、
ＡＰ−Ｄ）Ｉ遺伝子の翻訳開始点の塩基を＋１としたと
ころの−６７６から−２５までの６５２ｂｐのＧＡＰ−
ＤＨプロモーターの領域からＤＮＡ断片を調製した。
て完全消化し電気泳動によって分離することによりＧ、
ＡＰ−Ｄ）Ｉ遺伝子の翻訳開始点の塩基を＋１としたと
ころの−６７６から−２５までの６５２ｂｐのＧＡＰ−
ＤＨプロモーターの領域からＤＮＡ断片を調製した。
このＤＮＡ断片をＤＮＡポリメラーゼ！ （クリノー）
（Ｐｏｉ’ｌ） （ベーツ・ンガーマンハイム社
製）と４種のすべてのｄＮＴＰ （デオキシＮＴ Ｐ）
を用いて処理し、接着末端を平滑末端とした。このＤＮ
Ａ断片をｐＵＣ９をＳｍａｒ（宝酒造社製）を用いて完
全消化したものに図に示す方向でＴ４ＤＮＡリガーゼを
用いて連結した。このＤＮＡを大腸菌ＨＢＩＯＩに形質
転換した結果得られたプラスミドをｐＧＧ２と命名した
。
（Ｐｏｉ’ｌ） （ベーツ・ンガーマンハイム社
製）と４種のすべてのｄＮＴＰ （デオキシＮＴ Ｐ）
を用いて処理し、接着末端を平滑末端とした。このＤＮ
Ａ断片をｐＵＣ９をＳｍａｒ（宝酒造社製）を用いて完
全消化したものに図に示す方向でＴ４ＤＮＡリガーゼを
用いて連結した。このＤＮＡを大腸菌ＨＢＩＯＩに形質
転換した結果得られたプラスミドをｐＧＧ２と命名した
。
次にｐＧＡＰ３０１を５ａｉＮ（宝酒造社製）。
及びＨ４ｎｄｌ［［（宝酒造社製）を用いて完全消化し
、電気泳動で分離することによりＧＡＰ−ＤＨ遺伝子の
ターミネータ−配列を含む１４０ｂｐＤＮＡ断片を調製
した。又、ｐＧＧ２ＤＮＡを５ａＪｌ（宝酒造社製）及
び）（ｉｎｄｌ［Ｉを用いて消化し、電気泳動によって
３．４ＫｂｐＤＮＡ断片を調製した。この３．４Ｋｂｐ
ＤＮＡ断片と１４０ｂｐＤＮＡ断片とをＴ４ＤＮＡリガ
ーゼ（宝酒造社製）を用いて連結し、得られたプラスミ
ドをｐＧＧ３と命名した。
、電気泳動で分離することによりＧＡＰ−ＤＨ遺伝子の
ターミネータ−配列を含む１４０ｂｐＤＮＡ断片を調製
した。又、ｐＧＧ２ＤＮＡを５ａＪｌ（宝酒造社製）及
び）（ｉｎｄｌ［Ｉを用いて消化し、電気泳動によって
３．４ＫｂｐＤＮＡ断片を調製した。この３．４Ｋｂｐ
ＤＮＡ断片と１４０ｂｐＤＮＡ断片とをＴ４ＤＮＡリガ
ーゼ（宝酒造社製）を用いて連結し、得られたプラスミ
ドをｐＧＧ３と命名した。
ａｄｇｗ型のＰｒｅＳ−ＨＢｓＡｇ遺伝子はそのＤＮＡ
配列から４個の１訳開始コドン（ＡＴＧ）が存在する（
第１０図）。ポリアルブミンレセプター領域はＨＢｓＡ
ｇのＮ末に接続しておりＰｒｅＳ遺伝子の３番目のＡＴ
Ｇ （３ｒｄＡＴＧ’）からコードされている。従って
、ｐＰｒｅＳを制限酵素Ｍｓｔｌ［（ＮＥＢ社製）とＢ
ａｎ１Ｉ（ＮＥＢ社製）を用いて完全消化し、１％アガ
ロースゲル電気泳動によって３ｒｄＰｒｅＳ−ＨＢｓＡ
ｇ遺伝子を含む１．４ ＫｂからなるＤＮＡ断片を得た
。
配列から４個の１訳開始コドン（ＡＴＧ）が存在する（
第１０図）。ポリアルブミンレセプター領域はＨＢｓＡ
ｇのＮ末に接続しておりＰｒｅＳ遺伝子の３番目のＡＴ
Ｇ （３ｒｄＡＴＧ’）からコードされている。従って
、ｐＰｒｅＳを制限酵素Ｍｓｔｌ［（ＮＥＢ社製）とＢ
ａｎ１Ｉ（ＮＥＢ社製）を用いて完全消化し、１％アガ
ロースゲル電気泳動によって３ｒｄＰｒｅＳ−ＨＢｓＡ
ｇ遺伝子を含む１．４ ＫｂからなるＤＮＡ断片を得た
。
ｐＧＧ３ＤＮＡを５ａｆｆｌ（宝酒造社製）で完全消化
したＤＮＡ断片とＨＢｓＡｇを含む１．４Ｋｂ断片とを
７４ＤＮＡＩＪガーゼ（宝酒造社製）を用いて連結し得
られたプラスミドをｐＧＧ４０ （第６図（Ｂ））と命
名した。
したＤＮＡ断片とＨＢｓＡｇを含む１．４Ｋｂ断片とを
７４ＤＮＡＩＪガーゼ（宝酒造社製）を用いて連結し得
られたプラスミドをｐＧＧ４０ （第６図（Ｂ））と命
名した。
ＨＢｓＡｇ遺伝子を酵母内で発現させるためには、酵母
内で自己増殖するＤＮＡ上にＨＢｓＡｇが存在すること
が望ましいが、ｐＧＧ４０は酵母内で自己複製できない
。そこで大腸菌・酵母シャトルベクター１）ＪＤＢ２１
９ （ジエー・ディー・ベソグス、ネイチ＋ −（Ｊ、
Ｄ、 Ｂｅｇｇｓ＋ Ｎａｔｕｒｅ ）＋２７５、
Ｉ Ｏ４，１９７８） ＤＮＡを）（ｉｎｄｌ［ｒで完
全消化し、３．２ＫｂｐＤＮＡ断片を調製した。ｐｃＧ
４０をＨｉ ｎｄｌ［Ｉを用いて完全消化し、３．２Ｋ
ｂｐＤＮＡ断片とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、
ｐＧＧ５０３を作成した。
内で自己増殖するＤＮＡ上にＨＢｓＡｇが存在すること
が望ましいが、ｐＧＧ４０は酵母内で自己複製できない
。そこで大腸菌・酵母シャトルベクター１）ＪＤＢ２１
９ （ジエー・ディー・ベソグス、ネイチ＋ −（Ｊ、
Ｄ、 Ｂｅｇｇｓ＋ Ｎａｔｕｒｅ ）＋２７５、
Ｉ Ｏ４，１９７８） ＤＮＡを）（ｉｎｄｌ［ｒで完
全消化し、３．２ＫｂｐＤＮＡ断片を調製した。ｐｃＧ
４０をＨｉ ｎｄｌ［Ｉを用いて完全消化し、３．２Ｋ
ｂｐＤＮＡ断片とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、
ｐＧＧ５０３を作成した。
参考例６．ｐＧＧ７Ｂｒの作成（第７図）ｐＧＧ５０３
を制限酵素Ｘｍｎ Ｉ （ＮＥＢ社製）で完全消化し
たのち、ｐＢｇｌＵリンカ−（宝酒造製）をＴ４リガー
ゼを用いて接続した。これを）１ｉｎｄｌｌで完全消化
し、ＤＮＡポリメラーゼｌ（クリノー）によって、末端
を修復したのち、さらに制限酵素Ｂｇｇ［（宝酒造製）
で完全消化した。これも１％アガロースゲル電気泳動し
、結果としてＸｍｎＩ認識部位より上流領域が除去され
。
を制限酵素Ｘｍｎ Ｉ （ＮＥＢ社製）で完全消化し
たのち、ｐＢｇｌＵリンカ−（宝酒造製）をＴ４リガー
ゼを用いて接続した。これを）１ｉｎｄｌｌで完全消化
し、ＤＮＡポリメラーゼｌ（クリノー）によって、末端
を修復したのち、さらに制限酵素Ｂｇｇ［（宝酒造製）
で完全消化した。これも１％アガロースゲル電気泳動し
、結果としてＸｍｎＩ認識部位より上流領域が除去され
。
その５′末端に新たにＢｇｌｎ接着末端をもった小型化
ＣＡＰ−ＤＨプロモーターならびに３ｒｄＰｒｅＳ−Ｈ
ＢｓＡｇ遺伝子、ＧＡＰ−ＤＨターミネータ−からなる
１、９５ＫｂのＤＮＡ断片を得た。
ＣＡＰ−ＤＨプロモーターならびに３ｒｄＰｒｅＳ−Ｈ
ＢｓＡｇ遺伝子、ＧＡＰ−ＤＨターミネータ−からなる
１、９５ＫｂのＤＮＡ断片を得た。
ｐＪＤＢ２０７を）（ｉ ｎｄｌｌｒで完全消化し、Ｄ
ＮＡポリメラーゼ■ （クリノー）によって末端を修復
したのち、Ｔ４リガーゼを用いてＢｇ！！Ｕリンカ−を
接続した。これをＳａｊ！Ｉで完全消化し。
ＮＡポリメラーゼ■ （クリノー）によって末端を修復
したのち、Ｔ４リガーゼを用いてＢｇ！！Ｕリンカ−を
接続した。これをＳａｊ！Ｉで完全消化し。
ＤＮＡポリメラーゼＩ （クリノー）を用いて末端修復
したのちＢｇｆＩ［で完全消化した。これを０．８％ア
ガロースゲル電気泳動し、６．３Ｋｂからなるベクター
断片を得た。この６．３ Ｋｂベクター断片と先の１．
９５Ｋｂ断片とをＴ４リガーゼによってライゲーション
し、ｐＧＧ７３Ｂｒを得た。
したのちＢｇｆＩ［で完全消化した。これを０．８％ア
ガロースゲル電気泳動し、６．３Ｋｂからなるベクター
断片を得た。この６．３ Ｋｂベクター断片と先の１．
９５Ｋｂ断片とをＴ４リガーゼによってライゲーション
し、ｐＧＧ７３Ｂｒを得た。
実施例１゜
ファルマシア社より購入したプラスミドｐＬ。
を制限酵素）（ｉｎｄｌｌＩならびにＸｈｏｌ（宝酒造
製）で完全消化し、４％ＰＡＣ；Ｅによって３５４ｂｐ
の断片を得た。これをさらに制限酵素Ｎｅ。
製）で完全消化し、４％ＰＡＣ；Ｅによって３５４ｂｐ
の断片を得た。これをさらに制限酵素Ｎｅ。
■ （ベーリンガーマンハイム社製）で完全消化し。
ＳＶ４０初期エンハンサ−を含む２３９ｂｐ断片を得、
ＤＮＡポリメラーゼＩ （クリノー）で末端修復を行な
った。
ＤＮＡポリメラーゼＩ （クリノー）で末端修復を行な
った。
ｐＧＰ３Ｈｒを）（ｉ ｎｄｌｌｌで完全消化したのち
ＤＮＡポリメラーゼＩ （クリノー）によって末端修復
し、これとＳＶ４０初期エンハンサ−を含む２３９ｂｐ
断片とをＴ４リガーゼを用いてライゲーションした。そ
の結果ＳＶ４０初期エンハンサ−がＨＢｓＡｇ遺伝子の
転写方向に対して、ｅａｒｌｙ方向に挿入されたｐＧＰ
３ＨｒＳＶ、ならびに１ａｔｅ方向に挿入されたｐＧＰ
３ＨｒＳＶｔを得た（第８図）。
ＤＮＡポリメラーゼＩ （クリノー）によって末端修復
し、これとＳＶ４０初期エンハンサ−を含む２３９ｂｐ
断片とをＴ４リガーゼを用いてライゲーションした。そ
の結果ＳＶ４０初期エンハンサ−がＨＢｓＡｇ遺伝子の
転写方向に対して、ｅａｒｌｙ方向に挿入されたｐＧＰ
３ＨｒＳＶ、ならびに１ａｔｅ方向に挿入されたｐＧＰ
３ＨｒＳＶｔを得た（第８図）。
次にｐＧＬ２０６２，１）ＧＰ３Ｈｒ、ｐＧＰ３ＨｒＳ
Ｖ、およびｐ Ｇ Ｐ ３ Ｈｒ Ｓ Ｖ ｔを用いて
酵母サツカロマイセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏ
ｍ ｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） ＡＨ２２（ａ、
ｈ±ｓ４．Ｒｅ凹２゜工Ａ」」）を形質転換した。
Ｖ、およびｐ Ｇ Ｐ ３ Ｈｒ Ｓ Ｖ ｔを用いて
酵母サツカロマイセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏ
ｍ ｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） ＡＨ２２（ａ、
ｈ±ｓ４．Ｒｅ凹２゜工Ａ」」）を形質転換した。
また、ｐＧＬ２０６２を用いて、 Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅＧＲＦ１８ ｐｈｏ８０ （α、ｈｉｓ、
ｌｅｕ。
ｓｉａｅＧＲＦ１８ ｐｈｏ８０ （α、ｈｉｓ、
ｌｅｕ。
ｔｒｐ、ｍｅｔ、ｐｈｏ８０）を形質転換した。
得られた形質転換体をロイシンを含まない最小培地平板
（０，７％イーストナイト口ジェンベース（Ｙｅａｓｔ
Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａ５ｅ ）（Ｄｉｆｃｏ ）、
２％デキストロース、１．５％寒天）で純化した。
（０，７％イーストナイト口ジェンベース（Ｙｅａｓｔ
Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａ５ｅ ）（Ｄｉｆｃｏ ）、
２％デキストロース、１．５％寒天）で純化した。
純化した各株を上記最小培地（寒天は除く）で３０℃２
日間振盪培養したものを前培養として同最小培地８０ｍ
１に１％植菌し３０℃２日間培養した。遠心により集菌
し生理食塩水で１回洗浄後緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ−
ｌｌｃｌ ｐＨ７，５，１ｍＭ ＥＤＴＡ 、１ｍＭ
ＰＭＳＦ）に）調温した。この緩衝液をトミー精工社製
超音波発生装置ｕＲ−２００ｐを用いて水冷下、レベル
１０にて９分間処理した後０ ’ｃ、 １３，０ＯＯｘ
ｇ １０分間遠心し得られた上清のＨＢ ！９ Ａ
ｇ活性をアンチヘブセル＠ （ミドリ十字社製）を用い
て測定した。
日間振盪培養したものを前培養として同最小培地８０ｍ
１に１％植菌し３０℃２日間培養した。遠心により集菌
し生理食塩水で１回洗浄後緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ−
ｌｌｃｌ ｐＨ７，５，１ｍＭ ＥＤＴＡ 、１ｍＭ
ＰＭＳＦ）に）調温した。この緩衝液をトミー精工社製
超音波発生装置ｕＲ−２００ｐを用いて水冷下、レベル
１０にて９分間処理した後０ ’ｃ、 １３，０ＯＯｘ
ｇ １０分間遠心し得られた上清のＨＢ ！９ Ａ
ｇ活性をアンチヘブセル＠ （ミドリ十字社製）を用い
て測定した。
表１゜
ｐＧＰ３Ｈｒ ” ３ｐＧ
Ｐ３ＨｒＳＶ、 ” ＞１０
ｐＧＰ３ＨｒｓＶｔ ＞ｔ。
Ｐ３ＨｒＳＶ、 ” ＞１０
ｐＧＰ３ＨｒｓＶｔ ＞ｔ。
実施例２゜
実施例１と同様にｐＬＩをＨｉｎｄｌｌｒならびにＸｈ
ｏ ｒで完全消化し、４％ＰＡＧＥによって。
ｏ ｒで完全消化し、４％ＰＡＧＥによって。
ＳＶ４０初期エンハンサ−を含む３５４ｂｐの断片を得
た。これをＤＮＡポリメラーゼＩ （クリノー）で末端
修復を行なった。
た。これをＤＮＡポリメラーゼＩ （クリノー）で末端
修復を行なった。
ｐＧＧ７３ＢｒをＢｇｌＩｌで完全消化したのちＤＮＡ
ポリメラーゼＩ （クリノー）によって末端修復し、こ
れとＳＶ４０初期エンハンサ−を含む３５４ｂｐ断片と
をＴ４リガーゼを用いてライゲーションした。その結果
ＳＶ４０初期エンハンサ−が３ｒｄＰｒｅＳ−ＨＢｓＡ
ｇ遺伝子の転写方行に対してｅａｒｌｙ方向に挿入され
たｐＧＧ７３ＢｒＳＶ、ならびに１ａｔｅ方向に挿入さ
れたｐＧＧ７３ＢｒＳＶ、を得た（第９図）。
ポリメラーゼＩ （クリノー）によって末端修復し、こ
れとＳＶ４０初期エンハンサ−を含む３５４ｂｐ断片と
をＴ４リガーゼを用いてライゲーションした。その結果
ＳＶ４０初期エンハンサ−が３ｒｄＰｒｅＳ−ＨＢｓＡ
ｇ遺伝子の転写方行に対してｅａｒｌｙ方向に挿入され
たｐＧＧ７３ＢｒＳＶ、ならびに１ａｔｅ方向に挿入さ
れたｐＧＧ７３ＢｒＳＶ、を得た（第９図）。
次にｐＧＧ５０３．ｐＧＧ７３Ｂｒ、ｐＧＧ７３１３
ｒ Ｓ ＶｅおよびＰＧＧ７３ＢｒＳＶｔを用いて酵母
サン力ロマイセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ
ｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＡＨ２２（ａ、 ｈ±
ｓ４． ｌｅｕ ２゜土土立１）を形質転換した。得
られた形質転換体をロイシンを含まない最小培地平板（
０，７％イーストナイト口ジエンベース（Ｙｅａｓｔ
ＮｉＬｒｏｇｅｎ Ｂａ５ｅ）（Ｄｉｒｃｏ ） 、
２％デキストロース、１．５％寒天）で純化した。
ｒ Ｓ ＶｅおよびＰＧＧ７３ＢｒＳＶｔを用いて酵母
サン力ロマイセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ
ｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＡＨ２２（ａ、 ｈ±
ｓ４． ｌｅｕ ２゜土土立１）を形質転換した。得
られた形質転換体をロイシンを含まない最小培地平板（
０，７％イーストナイト口ジエンベース（Ｙｅａｓｔ
ＮｉＬｒｏｇｅｎ Ｂａ５ｅ）（Ｄｉｒｃｏ ） 、
２％デキストロース、１．５％寒天）で純化した。
純化した各株を上記最小培地（寒天は除く）で３０℃２
日間振盪培養したものを前培養として同最小培地８０ｍ
１に１％植菌し３０℃２日間培養した。遠心により集菌
し生理食塩水で１回洗浄後緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨｃｌｐＨ７，５，１ｍＭ ＥＤＴＡ 、１ｍＭ Ｐ
ＭＳＦ ）に懸濁した。この緩衝液をトミー精工社製超
音波発生装置ＵＲ−２００ｐを用いて水冷下、しヘル１
０にて９分間処理した後０°ｃ、 １３．ＯＯＯＸｇ１
０分間遠心し得られた上清のＨＢｓＡｇ活性をアンチヘ
プセル＠（ミドリ十字社製）を用いて測定した。又、ポ
リアルブミンレセプター活性をポリアルブミンを羊赤血
球に感作したＲＰＨＡ試薬を用いて測定した。
日間振盪培養したものを前培養として同最小培地８０ｍ
１に１％植菌し３０℃２日間培養した。遠心により集菌
し生理食塩水で１回洗浄後緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨｃｌｐＨ７，５，１ｍＭ ＥＤＴＡ 、１ｍＭ Ｐ
ＭＳＦ ）に懸濁した。この緩衝液をトミー精工社製超
音波発生装置ＵＲ−２００ｐを用いて水冷下、しヘル１
０にて９分間処理した後０°ｃ、 １３．ＯＯＯＸｇ１
０分間遠心し得られた上清のＨＢｓＡｇ活性をアンチヘ
プセル＠（ミドリ十字社製）を用いて測定した。又、ポ
リアルブミンレセプター活性をポリアルブミンを羊赤血
球に感作したＲＰＨＡ試薬を用いて測定した。
プラスミド ＨＢｓＡｇ活性 ポリアルブミンレ（２
’） セプター活性（２″） ｐＧＧ５０３ ７ ６ｐＧＧ
７３Ｂｒ ３ ２ｐＧＧ７３
ＢｒｓＶ、 ９ ８ｐＧＧ７３
Ｂｒｓν、９ ８
’） セプター活性（２″） ｐＧＧ５０３ ７ ６ｐＧＧ
７３Ｂｒ ３ ２ｐＧＧ７３
ＢｒｓＶ、 ９ ８ｐＧＧ７３
Ｂｒｓν、９ ８
第１図は、小型化ＰＨＯ５プロモーター、第２図は、小
型化ＧＡＰ−ＤＨプロモーター、第３図は、Ｉ）Ｌ＋に
担持されたＳＶ４０初朋転写制御領域模式図、および制
限酵素認識部位、第４図は。 参考例２のＰＨＯ５プロモーターを用いたＨＢｓＡｇ発
現プラスミドの作成、第５図は、参考例３のｐＧＰ３Ｈ
ｒの作成、第６図（Ａ）（Ｂ）は、参考例５のＰｒｅＳ
−ＨＢｓＡｇ発現用ベクターの作成、第７図は、参考例
６のｐｃＧ７３Ｂｒの作成、第８図は、実施例１のｐＧ
Ｐ３ＨｒＳＶ、又はｐＧＰ３ＨｒＳＶＬの作成、第９図
は、実施例２のｐＧＧ７３ＢｒＳＶ、又はｐＧＧ７３Ｂ
ｒＳＶ、の作成、第１Ｏ図は、ｐＰｒｅＳに担持された
ＰｒｅＳ−ＨＢｓＡｇ遺伝子の制限酵素地図を示す。 符号の説明 Ｂ ・・・・・・ ＧＡＰ−ＤＨプロモーター代理人
弁理士（８１０７）佐々木清隆 （ほか２名） 第 １ 図 ＧＴＣＡＣＣＴＴＡＣＴＴＧＧＣＡへＧＧＣＡＴＡＴＡ
ＣＣＣＡＴＴＴＧＧＴＡＴＡＡＧＣＧＣＴＧＡＴＧＴＴ
ＴＴＧＣＴＡＡＧＴＣＧＡＧＧＴＴＡＧＴＡＴＧＧＣづ ＡＧＣＡＡＡＴＴＣＧＡＧＡＴＴＡＣＣＡ手続補正書 １１８和６１斗°ｌＯ月１５日
型化ＧＡＰ−ＤＨプロモーター、第３図は、Ｉ）Ｌ＋に
担持されたＳＶ４０初朋転写制御領域模式図、および制
限酵素認識部位、第４図は。 参考例２のＰＨＯ５プロモーターを用いたＨＢｓＡｇ発
現プラスミドの作成、第５図は、参考例３のｐＧＰ３Ｈ
ｒの作成、第６図（Ａ）（Ｂ）は、参考例５のＰｒｅＳ
−ＨＢｓＡｇ発現用ベクターの作成、第７図は、参考例
６のｐｃＧ７３Ｂｒの作成、第８図は、実施例１のｐＧ
Ｐ３ＨｒＳＶ、又はｐＧＰ３ＨｒＳＶＬの作成、第９図
は、実施例２のｐＧＧ７３ＢｒＳＶ、又はｐＧＧ７３Ｂ
ｒＳＶ、の作成、第１Ｏ図は、ｐＰｒｅＳに担持された
ＰｒｅＳ−ＨＢｓＡｇ遺伝子の制限酵素地図を示す。 符号の説明 Ｂ ・・・・・・ ＧＡＰ−ＤＨプロモーター代理人
弁理士（８１０７）佐々木清隆 （ほか２名） 第 １ 図 ＧＴＣＡＣＣＴＴＡＣＴＴＧＧＣＡへＧＧＣＡＴＡＴＡ
ＣＣＣＡＴＴＴＧＧＴＡＴＡＡＧＣＧＣＴＧＡＴＧＴＴ
ＴＴＧＣＴＡＡＧＴＣＧＡＧＧＴＴＡＧＴＡＴＧＧＣづ ＡＧＣＡＡＡＴＴＣＧＡＧＡＴＴＡＣＣＡ手続補正書 １１８和６１斗°ｌＯ月１５日
Claims (8)
- （１）ＳＶ４０ウィルス由来のエンハンサーを酵母プロ
モーターに組み込んだハイブリッドプロモーター。 - （２）酵母プロモーターが酵母グリセルアルデヒド−３
−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ−ＤＨ）プロ
モーター又は酵母抑制性酸性ホスファターゼ（ＰＨＯ５
）プロモーターである特許請求の範囲第（１）項記載の
ハイブリッドプロモーター。 - （３）ＧＡＰ−ＤＨプロモーター又はＰＨＯ５プロモー
ターが小型化されている特許請求の範囲第（２）項記載
のハイブリッドプロモーター。 - （４）少なくとも、ＳＶ４０ウィルス由来のエンハンサ
ーを酵母プロモーターに組み込んだハイブリッドプロモ
ーターおよびその下流に結合された異種蛋白質をコード
するＤＮＡ配列を用いて酵母を形質転換させることを特
徴とする異種蛋白質の製造方法。 - （５）酵母プロモーターが酵母グリセルアルデヒド−３
−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ−ＤＨ）プロ
モーター又は酵母抑制性酸性ホスファターゼ（ＰＨＯ５
）プロモーターである特許請求の範囲第（４）項記載の
異種蛋白質の製造方法。 - （６）ＧＡＰ−ＤＨプロモーター又はＰＨＯ５プロモー
ターが小型化されている特許請求の範囲第（５）項記載
の異種蛋白質の製造方法。 - （７）異種蛋白質がＢ型肝炎ウィルス表面抗原（ＨＢｓ
Ａｇ）又はＰｒｅＳ領域を含むＨＢｓＡｇ（ＰｒｅＳ−
ＨＢｓＡｇ）である特許請求の範囲第（４）項記載の異
種蛋白質の製造方法。 - （８）ＰｒｅＳ領域が、該領域の第３ＡＴＧ部位から始
まる少なくとも５５個のアミノ酸よりなる特許請求の範
囲第（７）項記載の異種蛋白質の製造方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61127153A JPS62285786A (ja) | 1986-06-03 | 1986-06-03 | ハイブリツドプロモ−タ−およびそれを利用した異種蛋白質の製造方法 |
| CA000538634A CA1310602C (en) | 1986-06-03 | 1987-06-02 | Yeast promoter and process for preparing heterologous protein |
| US07/057,143 US4945046A (en) | 1986-06-03 | 1987-06-03 | Yeast promoter and process for preparing heterologous protein |
| EP87108012A EP0248410A3 (en) | 1986-06-03 | 1987-06-03 | Improved yeast promoter and proces for preparing heterologous protein |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61127153A JPS62285786A (ja) | 1986-06-03 | 1986-06-03 | ハイブリツドプロモ−タ−およびそれを利用した異種蛋白質の製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62285786A true JPS62285786A (ja) | 1987-12-11 |
Family
ID=14952937
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61127153A Pending JPS62285786A (ja) | 1986-06-03 | 1986-06-03 | ハイブリツドプロモ−タ−およびそれを利用した異種蛋白質の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS62285786A (ja) |
-
1986
- 1986-06-03 JP JP61127153A patent/JPS62285786A/ja active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2634371B2 (ja) | 脊椎動物細胞内でｂ型肝炎表面抗原をコードするｄｎａを発現するベクター | |
| EP0100561B1 (en) | Yeast hybrid vectors and their use for the production of polypeptides | |
| HU204097B (en) | Process for producing cloning system relating to kluyveromyces species | |
| JPS61119192A (ja) | 高等真核生物細胞における非ｂＧＨポリペプチドの発現用の組換えＤＮＡ分子 | |
| PH27198A (en) | Expression and secretion of heterologous proteins by yarrowia lipolytica transformants | |
| JPH03143385A (ja) | 酵母細胞 | |
| JP2834111B2 (ja) | 微生物によるヒト副甲状腺ホルモンの生産 | |
| JPS61181398A (ja) | 形質転換酵母におけるグルカゴンの製造方法 | |
| JPH06509229A (ja) | シクロヘキシミド耐性タンパク質及びヌクレオチド配列 | |
| JP2973430B2 (ja) | 誘導可能な系を用いた酵母による蛋白質の製造方法、ベクター及びその形質転換株 | |
| CN101487015B (zh) | 利用酵母表达系统生产DSPAα1的方法 | |
| JPS58146281A (ja) | 酵母細胞の形質転換法 | |
| DD274053A5 (de) | Verfahren zur Produktion eines menschlichen, einkettigen Plasminogenaktivators | |
| JPH0576375A (ja) | 改良された酵母ベクター | |
| JPS6394969A (ja) | 外来遺伝子発現用に改良された酵母菌株 | |
| JPS62285786A (ja) | ハイブリツドプロモ−タ−およびそれを利用した異種蛋白質の製造方法 | |
| JPS61247384A (ja) | 酵母中でプラスミノ−ゲン活性化因子を発現する方法 | |
| US5164485A (en) | Modified hepatitis B virus surface antigen P31 and production thereof | |
| EP0174585A2 (en) | Promoters and the use thereof in the expression of unfused procaryotic or eucaryotic proteins in yeast | |
| JPS62253384A (ja) | 酵母における組換え蛋白の制御可能な発現 | |
| CN114957410A (zh) | 一种κ株2019-nCoV的表面蛋白受体结合区制备方法 | |
| JP2625379B2 (ja) | 酵母の高発現ベクタープラスミド用ｄｎａ断片 | |
| JP2694210B2 (ja) | 酵母発現ベクター | |
| CN114957398A (zh) | 一种α株2019-nCoV的表面蛋白受体结合区制备方法 | |
| JP3007115B2 (ja) | ムコールレンニン遺伝子シグナル配列 |