JPS62294087A - タイロシン耐性を付与する新規遺伝子ｔｌｒＢ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３、発明の詳細な説明 発明の分野 本発明は、タイロシン（ｔｙｌｏｓｉｎ　）耐性を付与
する遺伝子（ｔｌｒＢと命名）、この遺伝子を含んでい
る組換えＤＮＡクローニング・ベクター、およびタイロ
シン耐性を付与するベクターを含んでいる形質転換体に
関する。ストレプトマイセス・７ラジエ（Ｓ　ｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓ　ｆｒａｄｉａｅ　）菌は、動物の成長
促進剤ならびに抗生物質として動物薬に使用されるタイ
ロシンを産生ずる。タイロシンは、１６員環の環状ラク
トンおよび３個の糖残基から成るマクロライド抗生物質
である。タイロシンの抗生物質活性は、他のマクロライ
ド類と同じく、タイロシンのリポソームへの結合を含む
機序による、蛋白質合成阻害に基づいている。

タイロシン耐性を付与するクローニング・ベクターはス
トレプトマイセス属およびその他の宿主細胞に有用であ
る。ストレプトマイセス属における組換えＤＮＡ技術の
開発利用は、好適なりローニング・ベクター上に存在す
る選択可能な遺伝標識を利用し得るかどうかに係わって
いる。現在のところ、ストレプトマイセス属に利用し得
る選択マーカーの数が少ないため、その開発は若干遅れ
ている。本発明はそのような目的に好適な選択マーカー
数を増加する意味で有用であり、特に重要である。

本発明方法のベクタ一群は小さくて使い道が広く、多数
のタイロシン感受性ストレプトマイセス細胞に導入して
選択され得るので、特に有用である。ストレプトマイセ
ス属は臨床的に重要な抗生物質の半数以上を提供してお
り、したがって商業的にも重要な菌群である。

発明の開示 本発明は、産業的に重要なこの菌群のための新規でかつ
有用なりローニング系およびベクターを提供し、もって
既知抗生物質の収量の増大、ならびに新規抗生物質およ
び抗生物質誘導体の生産のために、遺伝子をクローンす
ることを可能にするものである。

本発明はまた、形質転換されていない細胞群の中からス
トレプトマイセスの形質転換細胞を選び出すことを可能
にするベクターを提供する。本発明のベクター≦こさら
に非選択性のＤＮＡを付加した後、修飾ベクターをスト
レプトマイセスに導入し、形質転換細胞をタイロシン耐
性表現型によって選び出すことが可能である。形質転換
は比較的低い頻度で起こる現象であるから、そのような
機能試験は、多数の細胞群の中で何れの細胞が形質転換
を起こすＤＮＡを獲得したかを決定するのに実際上必要
なことである。

本明細書で開示した本発明の目的に従い、下記の如く用
語を定義する。

ＡｐＲ−アンピシリン耐性表現型、またはそれを付与す
る遺伝子。

ｍｅｌ−タイロシナーゼ遺伝子。

ファスミドーファージまたはプラスミドとして作用する
組換えＤＮＡベクター。

組換えＤＮＡクローニング・ベクター−自律的複製可能
または組込み可能な物質であって、ｌまたはそれ以上の
付加的なりＮＡ上セグメント付加することかできる、ま
たは既に付加されているＤ−ＮＡ分子を含んでいる物質
であり、プラスミドを含むがそれだけに限定されるもの
ではない。

制限断片（制限フラグメント）−１またはそれ以上の制
限酵素の作用によって生じる直線状ＤＮＡ分子。

感受性宿主細胞−ある特定の抗生物質に対する耐性を付
与するＤＮＡセグメントなしでは、その抗生物質の存在
下に生育できない宿主細胞。

ＴｃＲ−テトラサイクリン耐性表現型、またはテトラサ
イクリン耐性を付与する遺伝子。

ｔｌｒＡ−タイロシン耐性を付与するＡ型遺伝子。

ｔｌｒＢ−タイロシン耐性を付与するＢ型遺伝子。

形質転換体−形質転換された受容宿主細胞。

形質転換−受容宿主細胞に導入されたときその遺伝子型
を変化させ、受容細胞に変化を生じさせるＤＮＡを該細
胞に導入すること。

ｔｓｒＲ−チオストレプトン耐性表現型、またはそれを
付与する遺伝子。

ｔｙｌ−タイロシン生合成遺伝子。

下記の図面は一定の尺度で描かれている。ＳａｕｌｌＩ
ＡＩ　のような２．３の制限酵素の場合は、意味のある
切断部位だけを示した。

第１図はプラスミドｐＳＶＢ９の制限酵素切断部位およ
び機能地図、第２図はプラスミドｐＨＪＬ３１５の制限
酵素切断部位および機能地図、第３図はプラスミドｐＳ
ＶＢ２５の制限酵素切断部位および機能地図、第４図は
プラスミドｐＳＦＨ６２の制限酵素切断部位および機能
地図、第５図はプラスミドｐＳＫＣ１３の制限酵素切断
部位および機能地図、第６図はプラスミドｐＳＦＨ６０
の制限酵素切断部位および機能地図、第７図はプラスミ
ドｐＳＦＨ６１の制限酵素切断部位および機能地図、第
８図はプラスミドｐＳＶＢ３６の制限酵素切断部位およ
び機能地図、第９図はプラスミドｐＳＶＢ２の制限酵素
切断部位および機能地図、第１０図はプラスミドｐｌＪ
９０３の制限酵素切断部位および機能地図、第１１図は
プラスミドｐＳＶＢ４０の制限酵素切断部位および機能
地図、第１２図はプラスミドｐＳＶＢ４７の制限酵素部
位および機能地図である。

多くの微生物において、タイロシン耐性を付与するｔｌ
ｒＢ遺伝子は選択マーカーとして有用である。ｔｌｒＢ
遺伝子はｐＳＶＢ９プラスミドから、〜３．３５ｋｂの
Ｂｇｌ　ＩＩ　−Ｓａｃ　ｎ制限断片上に単離され得る
。プラスミド１）ＳＶＢ９は、ジ・アグリカルチュラル
・リサーチ・サービス（Ｔｈｅ　Ａｇｒ　１ｃｕｌ　ｔ
ｕｒａｌＲｅｓｅａｒｃｈ　５ｅｒｖｉｃｅ　）　、ノ
ーザーン骨レジオナル８リサーチ・センター（Ｎｏｒｔ
ｈｅｒｎ　Ｒｅｇｉｏｎａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＣｅｎ
ｔｅｒ　）、ペオリア（Ｐｅｏｒｉａ）　、イリノイズ
（１１１ｉｎｏｉｓ）　６１６０４に寄託され、ＮＲＲ
Ｌ１８０７３の番号のもとにその永久保存株の一つとし
て貯蔵されているストレプトマイセス・リビダンス〔ニ
ス（Ｓ、）−リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　
１ｉｖｉｄａｎｓ　）　）ＴＫ２３／ｐＳＶＢ９から単
離することかできる。

プラスミドｐＳＶＢ９の制限酵素切断部位および機能地
図を添付図面の第１図に示した。プラスミドｐＳＶＢ９
は、実質上実施例１の記載に従ってニス・リビダンスＴ
Ｋ２３／ｐＳＶＢ９から単離できる。

またｔｌｒＢ遺伝子は、ＮＲＲＬＢ−１８０４７の寄託
番号のもとにＮＲＲＬから入手することが可能なプラス
ミドであるプラスミドｐＨＪＬ３１５から単離すること
ができる。プラスミドｐＨＪＬ３１５の制限酵素切断部
位および機能地図を第２図に示した。

プラスミドｐＳＶＢ９およびｐＨＪＬ３１５はｔｌｒＢ
を介してタイロシン耐性を付与する他のベクターを組み
立てるのに有用な出発物質となる。例えば、タイロシン
耐性を付与するプラスミドｐＳＶＢ９の〜３．３５　ｋ
ｂ　Ｂｇｌ　Ｔｌ　−Ｓａｃ　ｎ制限断片を単離し、こ
れをプラスミドｐＩＪ　　７０２　（ＡＴＣＣ３９１５
５）の大きいＢｇｌ　ＩＩ　−５ａｃ　ｎ制限断片に挿
入するとプラスミドｐＳＶＢ２５が生成する。プラスミ
ドｐＳＶＢ２５は、ｔｌｒＢ遺伝子を含んでおり、後段
さらに詳述するように多数の微生物にタイロシン耐性を
付与する。プラスミドｐＳＶＢ２５の組立て手順を実施
例２に示す。プラスミドｐＳＶＢ２５の制限酵素切断部
位および機能地図を第３図に示した。

プラスミドｐＨＪＬ３１５はｔｌｒＢ遺伝子を含んでい
る本発明の多数のベクター頚の有用な出発物質である。

プラスミドｐＨＪＬ３１５を制御ａ酵素ＢｇｌＩ［で消
化して得られたｔｌｒＢ遺伝子を含んでいる〜５．Ｏｋ
ｂ　Ｂｇｌ　ｎ制限断片を、ＢａｍＨＩで消化したプラ
スミドｐＨＪＬ４０１へ挿入することによりプラスミド
ｐＳＦＨ６２および６３が得られる。

プラスミドｐＨＪＬ４０１はＥＰ−Ａ＝第２１３７７９
号に開示されており、ＮＲＲＬＢ−１８２１７Ｃ寄託日
：　１９８７年５月７日、イー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）
Ｋ１２ＪＭ　１０９に導入〕の番号のもとにＮＲＲＬか
ら入手することができる。プラスミドｐＳＦＨ６２とプ
ラスミドｐＳＦＨ６３とは〜５．ＯｋｂのＢｇｌｌＩ制
限断片の方向性だけが異なっている。プラスミドｐＳＦ
Ｈ６２の制限酵素切断部位および機能地図を第４図に示
した。同様な組立てを行ない、プラスミドｐＨＪＬ３１
５のｔｌｒＢを含んでいる５、０ｋｂＢｇｌｌＩ制限断
片に隣接した〜０．２　ｋｂ　Ｂｇｌ　Ｉｎ制限断片を
該〜５．０断片と一緒に、ＢａｍＨ丁で消化したプラス
ミドｐＨＪＬ４０１へ挿入（挿入鎖長合計〜５．２ｋｂ
）することによりプラスミドｐＳＫＣ１３が得られる。

プラスミドｐＳＫＣ１３の制限酵素切断部位および機能
地図を第５図に示した。プラスミドｐＳＦＨ６２、ｐＳ
ＦＨ６３およびｐＳＫＣ１３の組立て手順を実施例３に
示す。

プラスミドｐＳＫＣ１３を制限酵素ＫｐｎＩで消化し、
ｔｌｒＢを含んでいる〜３．８　ｋｂ　Ｋｐｎ　Ｉ制限
断片を単離し、これをＫｐｎ　Ｉで消化したプラスミド
ｐＵｃ１９（ＡＴＣＣ３７２５４’）へ挿入することに
よってプラスミドｐＳＦＨ６０およびｐＳＦＨ６０，１
を得る。この２つのプラスミドは〜３．８ｋｂのＫｐｎ
■断片の方向性だけが異なっている。ｐＳＦＨ６０の制
限酵素切断部位および機能地図を第６図に示した。プラ
スミドｐＳＦＨ６０のｔｌｒＢを含んでいる〜３．８　
ｋｂ　　ＥｃｏＲｌ−Ｈ１ｎｄｌｌＩ制限断片を単離し
、これをＥｃｏＲＩ　−ＨｌｎｄＩ［で消化したプラス
ミドｐＨＪＬ４０１へ挿入することによりプラスミドｐ
ＳＦＨ６１を得る。プラスミドｐＳＦＨ６１の制限酵素
切断部位および機能地図を第７図に示した。プラスミド
ｐＳＦＨ６０、ｐＳＦＨ６０，１およびｐＳＦＨ６１の
組立て手順を実施例４に示す。

本発明のプラスミド類はそれ以外のＤＮＡをさらに付加
することによってこれを修飾し、一層有用なベクターを
作成することができる。その−例を挙げれば、タイロシ
ン耐性を付与するストレプトマイセス・フラジエのｔｌ
ｒＢ遺伝子（ＥＰ−Ａ−第１７６３１９号に記載）をプ
ラスミドｐＳＶＢ２５に付加することによりプラスミド
ｐＳＶＢ３６およびｐＳＶＢ３７が得られる。プラスミ
ドｐＳＶＢ３６およびプラスミドｐＳＶＢ３７は、プラ
スミドＩ）ＳＶＢ２（寄託番号ＮＲＲＬ１５８８０のも
とにストレプトマイセス・リビダンスＴＫ２３に寄託さ
れている）のｔｌｒＢ遺伝子を含んでいる〜２．８６ｋ
ｂのＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩ制限断片をＢｄｇＩＩで消
化したプラスミドｐＳＶＢ２５へ挿入することによって
組立てられる。この２つのプラスミドは〜２．８６ｋｂ
　の制限断片の配向だけが異なっている。プラスミドｐ
ＳＶＢ３６の制限酵素切断部位および機能地図を第８図
に示した。プラスミドｐＳＶＢ３６およびｐＳＶＢ３７
の組立て手順を実施例５に示す。

またｔｌｒＢ遺伝子はストレプトマイセス属においてコ
ピー数の少ないベクターの組立てに使用されている。ｔ
ｌｒＢを含んでいるプラスミドｐＳＶＢ２５の〜３．３
５ｋｂのＳｓｔＩ−Ｂｇｌ　！Ｉ制限断片をＳｓｔＩ−
ＢａｍＨＩで消化したプラスミドｐＵｃ１９　へ挿入す
ることによりプラスミドｐＳＶＢ４０を得た。

次いでプラスミドｐＳＶＢ４０を制限酵素ＥｃｏＲＩお
よびＨｉｎｄ　ｍで消化し、ｔｌｒＢを含んでいる〜３
，８ｋｂのＥｃｏＲＩ　−Ｈｌｎｄ　ｍ制限断片を単離
し、精製して、これをＥｃｏＲＩ　−Ｈｌｎｄ　ｍで消
化したプラスミドｐＩＪ９０３に連結（ライゲーション
）してプラスミドｐＳＶＢ４７を得た。プラスミドｐｌ
Ｊ　９０３はりシェード（Ｌｙｄｉａｔｅ　）らによっ
て開示されており〔ジーン（Ｇ　ｅｎｅ　）、３５巻、
２２３〜２３５頁（１９８５年）〕、ザ・ジョン・イネ
ス・ストレプトマイセス・カルチャー・コレクション（
ｔｈｅＪｏｈｎ　Ｉｎｎｅｓ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｓ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　）、ジョ
ン・イネス・インスチチュート（Ｊ　ｏｈｎ　Ｉ　ｎｎ
ｅｓＩｎｓｔｉｔｕｔｅ　）　、コルニー・レーン（Ｃ
ｏ１ｎｅｙ　Ｌａｎｅ　）、ノル＋フイツチ（Ｎｏｒｗ
ｉｃｈ　）、イングランド（Ｅｎｇｌａｎｄ）ＮＲ４’
−７ＵＨから寄託番号３４１７のもとに入手できる。プ
ラスミドｐＩＪ９０３は、ストレプトマイセス属におい
て約１個のコピー数を有する。プラスミドＩ）ＳＶＢ４
７もこれと類似のコピー数を有する。プラスミドｐＳＶ
Ｂ４０およびｐＳＶＢ４７の制限酵素切断部位および機
能地図を、それぞれ第１１図および第１２図に示した。

プラスミドｐＳＶＢ４７の組立て手順を実施例７に示す
。

本発明の説明においてベクター組立てに使用した制限断
片は通常ライゲーションを容易にするため、修飾するこ
とが可能である。例えば特定のタイロシン耐性遺伝子を
含んでいる制限断片、またはベクター複製または組込み
機能を含んでいるＤＮＡへ分子リンカ−を提供すること
ができる。

このようにその後に行なうライゲーションに対して特異
的な部位を都合よく組み立てることか可能である。さら
にその特性を変えたり、ＤＮＡライゲーションのために
制限部位を設けるため、種々のタイロシン耐性遺伝子を
含んでいる制限フラグメント、複製超厚または特定ベク
ターの組込み配列にヌクレオチドを追加し、削除し、ま
たは置換することにより、その性質を変えることかでき
る。

当業者はヌクレオド化学および遺伝暗号を理解しており
、したがってどのヌクレオチドが交換可能であるか、ま
たどのＤＮＡの修飾が特定目的ｉζ望ましいものである
かを理解している。同時に、ベクター・コントロールに
支配されている臨界的な機能を破壊しない限り、タイロ
シン耐性遺伝子を含んでいるある制限断片がクローニン
グ・ベクターの特定位置に限定されないという事実は注
目に値する。当業者は、ベクター上のどの部位が特定の
タイロシン耐性遺伝子を含んでいる制限断片のライゲー
ションまたは組込みに有用であるかを理解し、容易にこ
れを決定することができる。

ストレプトマイセス・フラジエのタイロシン産生株から
ｔｌｒＢ遺伝子が単離された。即ち、ニス・フラジエの
ゲ／ミックＤＮＡを制限酵素５ａｕＩ［ＩＡｌ　で部分
消化し、得られたＤＮＡをＢｇｌ　ｎで消化したプラス
ミドｐＩＪ７０２へ挿入すること番こより、プラスミド
ｐＳＶＢ９を含む多数のｔｌｒＢ含有プラスミド類を得
た。同様の方法Ｉこより、これと同じニス・フラジエ株
のゲノミックＤ　Ｎ　Ａ　全制限酵素Ｍｂｏ　Ｉで部分
消化し、得られたＭｂｏＩ−消化ＤＮＡをプラスミドｐ
ＫＣ４６２Ａ（寄託番号ＮＲＲＬＢ−１５９７３のもと
にＮＲＲＬから入手可能なプラスミド〕のＢａｍＨＩ部
位ヘクローンした。ＥｃｏＲＩ制限断片上に挿入体を切
り出し、これをプラスミドｐＨＪＬ４０１ヘクローンす
ることによってプラスミドｐＨＪＬ３１５を得た。ｔｌ
ｒＢ遺伝子はニス・フラジエから単離したものであるか
ら、ｔｌｒＢ遺伝子はニス・フラジエ中で機能するが、
修飾されていない遺伝子も他の微生物において機能する
。

また実施例６に記載したように、ストレプトマイセス・
リビダンスをタイロシン耐性に形質転換するのに本発明
のベクターを使用した。このように、ｔｆｒＢ遺伝子は
多くのストレプトマイセス株をタイロシン耐性に転換す
るのに使用できる。しかしながらｔｌｒＢ遺伝子は、ス
トレプトマイセス・グリセオフスカス（Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ　）に高水準の
タイロシン耐性を付与することはできない。このように
ｔｌｒＢ遺伝子のプロモーターは、すべての宿主細胞に
おいて有効（こ機能するとは限らないのかもしれない。

しかし、プラスミドｐＳＶＢ９およびｐＨＪＬ３１５は
完全なｔｌｒＢ遺伝子、即ち、（１）蛋白質の暗号配列
（蛋白質をコードしている配列）の転写を指令するプロ
モーター、（２１ｍＲＮＡへ転写したとき、転写物の翻
訳を指令する配列、（３）蛋白質の暗号配列、（４）転
写ターミネータ−１から成る完全なｔｌｒＢ遺伝子を含
んでいる。それらの要素はそれぞれ独立的に有用であり
、組換えＤＮＡ技術の手技によって、さまさまな組換え
体遺伝子の作成に使用することができる。プラスミドｐ
ＳＶＢ９の〜３．３５ｋｂＢｇｌ　Ｋ　−Ｓｓｔ　Ｉ制
限断片のＤＮＡの配列決定によりｔｌｒＢ暗号配列の正
確な位置が明らかになるはずであり、したかつて、他の
プロモーターを、。

ｔｌｒＢの暗号配列と同じ読み取り相内に置くことか可
能となるつ好適なプロモーターを選択することにより、
任意の宿主細胞で、ｔｌｒＢ遺伝子産生物の発現を駆動
するベクターを組み立てることができる。ｔｌｒＢ逍伝
子のプロモーター類はそれ自体有用である。ｔｌｒＢＪ
伝子のプロモーターおよびその他の調節要素をタイロシ
ン以外の抗生物質の生合成遺伝子の暗号配列に連結し、
ストレプトマイセス・フラジエ菌内でハイブリッド抗生
物質を産生ずる働きを示し得るハイブリッド遺伝子を構
成することか可能である。したがって上述したプラスミ
ド上の遺伝子の個々の要素は本発明の重要な構成要素を
成す。

上記のベクターはプラスミドｐＩＪ７０２、ｐｌＪ９０
３、もしくはｐＨＪＬ４０１から誘導されたストレプト
マイセス・レプリコンを含んでいるが、さまざまな宿主
域で、同程度に有用なベクターの組立てに多数の既知ス
トレプトマイセス・レプリコン類か利用できる。第１表
はストレプトマイセス・レプリコンを得ることが可能な
ストレプトマイセス・プラスミド類を列挙した表である
か、すべてを網羅したものではない。当業者はレプリコ
ン機能が破壊されない限り、本発明のｔｌｒＢ遺伝子を
含んでいるベクターの組立てに、プラスミドの全てまた
は一部を利用できることを認めるであろう。第１表にプ
ラスミドを含有する宿主および寄託物の寄託番号を併記
した。

米ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル
・バクテリア（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏ
ｎ　ｏｆＩｎｄｕｓｔｒｉａｌ　　Ｂａｃｔｅｒｉａ　
）　（ＮＣＩ　Ｂ　）、　トリー・リサーチ１ステーシ
ヨン（Ｔｏｒｒｙ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　５ｔａｔｉｏｎ
）、ポスト・オフィス・ボックス（Ｐｏ５ｔ　Ｂｏｘ　
０ｆｆｉｃｅ）３１．１３５アベイ・ロード（Ａｂｂｅ
ｙ　Ｒｏａｄ　）　、アバディーン（Ａｂｅｒｄｅｅｎ
）　ＡＢ９８　ＤＧ　、スコツトランド（５ｃｏｔｌａ
ｎｄ　）　、ユナイテッド・キングダム（Ｕｎｉｔｅｄ
　Ｋｉｎｇｄｏｍ）　。

未来アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（
Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１
１ｅｃｔｉｏｎ）、ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉ　ｌｌｅ
　）、ＭＤ　２０８５２゜言うまでもなく、ｔｌｒＢ遺
伝子はプラスミド以外のベクターの組立てにも使用する
ことができる。

ファージφＣ３１は、本発明をさらに例証し得る、タイ
ロシン耐性を付与するインテグレイテイブ（組込み可能
な）・ベクターを組み立てる出発物質の優れた供給源と
なる、周知のストレプトマイセス・ファージである。φ
Ｃ３１の誘導体であるファスミドｐＫｃ３３１はインテ
グレイテイブ・ベクターを組み立てるのに特に好ましく
、イ〜・コリに１２　ＢＥ４４７／ｐＫｃ３３１（ＮＲ
ＲＬＢ−１５８２８）から入手することができる。φ３
１型ファージ類はインテグレイテイブ・ベクターであり
、修飾することによって容易にｔｌｒＢ遺伝子を挿入す
ることができるので、したがってタイロシン耐性をスト
レプトマイセス属に付与することかできる９本発明のベ
クター類は、ストレプトマイセス・レプリコンとタイロ
シン耐性を付与する制限断片とを含有している。プラス
ミドの増幅および操作はストレプトマイセス属よりイー
・コリ属の方が一層速やかで効率的であるから、イー・
コリ中でも複製が行なわれるＤＮＡ配列を付加すること
は好都合である。このようにイー・コリのプラスミド類
、例えばｐＢＲ３２２、ｐＡｃＹｃ１８４　、ｐＢＲ３
２５、ｐＢＲ３２８等のようなプラスミドから得られた
、機能的レプリコンを含有し、しかも抗生物質耐性を付
与し得る制限断片を付加することは極めて有利であり、
ここに例示したベクター類の一般的な有用性をさらに蕎
めるものである。

本方法に使用するベクター類はタイロシン感受性のスト
レプトマイセス属または近縁の宿主細胞にタイロシン耐
性を付与する。一般にタイロシン感受性ストレプトマイ
セス風では、タイロシン１０μｇ／ｍＬで毒性を示すが
、本発明のベクター類はタイロシン１０ｍｇ／ｍＬに近
い水準まで耐性を付与する。しかしながら選別の目的に
適した好ましいタイロシン濃度は、ストレプトマイセス
・リビダンスに関して約５００μｇ　／ｍ　Ｌである。

その外のタイロシン感受性微生物の選別に適した好まし
いタイロシン濃度は、従来技術で周知の方法によって容
易に決定され、ｔｌｒＢ遺伝子を発現させるのに使用し
たプロモーター、およびタイロシンに対する該微生物の
感受性によって決められる。

ｔｌｒＢ遺伝子はタイロシン耐性を付与するが、またそ
れ以外の抗生物質に対する耐性を付与することができる
。グラム陽性細菌〔スタフイロコツ（Ｓ　ｔｒｅｐｔｏ
ｍｙｃｅｓ　）、ストレプトコツ力ＸＡ（５ｔｒｅｐｔ
ｏ−ｃｏｃｃｕｓ　）　、およびバシラス属（ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ　）等〕におけるタイロシンおよびエリスロマ
イシンのようなマクロライド抗生物質に対し誘導可能な
耐性は、同時にリンコサミドおよびストレプトグラミン
Ｂ型抗生物質に対する共耐性（コレジスタンス）を生じ
る。この多剤耐性表現型をＭＬＳ耐性表現型と呼ぶ〔フ
ジサワ（Ｆｕｊｉｓａｗａ　）およびワイスブルム（Ｗ
ｅｉｓｂｌｕｍ）　、ジャーナル・オブ・バタテリオロ
ジー（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　）、１４６巻、６
２１〜６３１頁（１９８１年））、スタフィロコッカス
・アウレウス（Ｓ　ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕ
ｒｅｕｓ　）においては、ＭＬＳ耐性は、２３Ｓリボン
ームＲＮ　Ａ　（ｒＲＮＡ）　　のアデニン残基が特異
的にメチル化され、Ｎ６−シメチルアデニンが生成する
ことにより生ずる。その殆んどがＭ　Ｌ　Ｓ抗生物質を
産性する多数のストレプトマイセス種は、ＭＬＳ耐性表
現型を発現する。これらの種に由来するｒＲＮＡはＮ６
−モツメチルアデニンまたはＮ６−シメチルアデニン、
あるいはその両者を含有する。エリスロマイシン産生菌
であるストレプトマイセス・エリスレウス（Ｓ　ｔｒｅ
ｐｔｏｍｙｃｅｓｅｒｙｔｈｒｅｕｓ　）のＭＬＳ耐性
は、２３ＳｒＲＮＡの１個のアデニン残基のＮ６−ジメ
チル化によって起こる。

トンプソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ　）らは、２３ＳｒＲＮ
ＡにおいてＮ６−シメチルアデニンが生成される機序を
介シテ、ニス・リビダンスにエリスロマイシン耐性を付
与するニス・エリスレウス遺伝子をクローンした。ｔｌ
ｒＢ遺伝子は、ＭＬＳ耐性表現型を付与する遺伝子のよ
うであり、そう予測される。

ストレプトマイセス・リビダンスＴＫ２３は、ｔｌｒＢ
遺伝子を含んでいる形質転換細胞の選別に使用するタイ
ロシンの濃度（〜５００μｇ／ｍＬ）で感受性である。

しかしながらＴＫ２３株は内在性のＭＬＳ耐性付与能を
有するように思われる。

ＴＫ２３株は予備的な実験でタイロシンの低濃度（≦２
５μｇ／ｍＬ　）で感受性であったか、あらかじめタイ
ロシン１μｇ／ｍＬに接触させると１００μｇ／ｍＬの
濃度までタイロシン耐性を誘発した。

しかし内在性のＭＬＳ耐性機序では、クローンしたｔｌ
ｒＢ遺伝子を選別するのに使用する濃度でタイロシン耐
性を付与することは明らかに不可能である。

本発明の組換え体ＤＮＡクローニング・ベクターは広い
有用性を有しており、ストレプトマイセス属および関連
微生物において使用される好適なりローン・ビヒクルの
必要性を充足するのに役立つ。そのうえこのベクターの
タイロシン耐性付与能は、形質転換細胞を選別する機能
的な手段を提供する。これは形質転換操作において、ベ
クターＤＮＡを獲得した特定の細胞を決定し、選別する
ことが実際上必要なので重要である。

また、その存在を試験する機能的な試験法かないＤＮＡ
セグメントをさらに追加的にこのベクターへ挿入するこ
とができ、選別不可能なりＮＡを含んでいる形質転換細
胞をタイロシン耐性に対して選別することにより、これ
を単離することが可能である。プラスミドの機能および
複製に必要な領域内またはｔｌｒＢ遺伝子内を除き、抗
生物質修飾酵素を指定する遺伝子およびあらゆる型の調
節遺伝子を含め、ただしそれだけに限定されず、任意の
部位にそのような選別不可能なりＮＡ上セグメント挿入
することができる。

より詳細には、例えばプラスミドｐＳＶＢ９のようなプ
ラスミドのチオストレプトン耐性遺伝子中心Ｃ１ａＩ制
限部位へ、ある遺伝子を含んでいる選別不可能なりＮＡ
上セグメント挿入する。そのような挿入によってチオス
トレプトン耐性遺伝子は不活性化され、したがって組換
え体プラスミドの同定が容易に可能となる。まずタイロ
シン耐性によって選別し、次いでそれらのタイロシン耐
性形質転換細胞の中からチオストレプトンに耐性でない
細胞を選別する。このようにストレプトマイセス属およ
び関連細胞におけるタイロシン耐性を選別できることに
よって、興味ある特定の選別不可能なりＮＡを含んでい
る極めて数少ない細胞を効率よく選別することが可能と
なる。

また上記のタイロシン耐性に対する機能的試験は、コン
トロール要素として作用し個々の抗生物質耐性遺伝子の
発現を指令するＤＮＡセグメントの位置をつきとめるの
に使用される。プロモーター、アテニュエーター、リプ
レッサー、インデューサー、リボンーム結合部位等を含
む、ただしそれだけに限定されないそのようなセグメン
ト類はストレプトマイセス属および関連微生物のその外
の遺伝子の発現をコントロールするのに使用される。

また本発明のタイロシン耐性を付与するベクターは、連
結されたＤＮＡセグメントか、宿主細胞内に各世代にわ
たって確実に安定に保持されるようにするのに役立つ。

タイロシン耐性を付与するＤＮＡと共有結合的に連結し
、ストレプトマイセス底内で増殖されたそれらの遺伝子
またはＤＮＡ断片は、非形質転換細胞に毒性を示すタイ
ロシン濃度にその形質転換細胞を接触させることによっ
て保持される。したかつて該ベクターを失ない、その結
果、共有結合的に連結していたＤＮＡを失なった形質転
換細胞は培養内で発育できす、消失してしまう。このよ
うに本発明のベクターは対象となる任意のＤＮＡ配列を
安定化し、これを保持することかできる。

本発明のクローニング・ベクターおよび形質転換細胞は
、現在ストレプトマイセス属および関連微生物によって
産生されている種々の生産物の収量を向上させる遺伝子
クローニングを提供する。

そのような生産物を例示すれば、ストレプトマイシン、
タイロシン、セファロスポリン類、アクタプラニン、ナ
ラジン、モネンシン、トブラマイシン、エリスロマイシ
ン等が挙げられるが、それだけに限られるものではない
。また本発明は、以下に挙げる、例えばヒト・インシュ
リン、ヒト・プロインシュリン、グルカゴン、インター
フェロン等の商業的に重要な蛋白質、商業的に重要なプ
ロセスおよび化合物を導く代謝経路に介在する酵素機能
、または遺伝子発現を改善するコントロール要素等を暗
号化しているＤＮＡ配列をクローニングし、形質決定し
、そして再構築するのに有用な選択可能なベクターを提
供する。またこれら所望のＤＮＡ配列には、抗生物質誘
導体、例えばストレプトマイシン、セファロスポリン、
タイロシン、アクタプラニン、ナラジン、モネンシンお
よびエリスロマイシン誘導体等の含酸を触媒する酵素を
暗号化しているＤＮＡ、または抗生物質またはその他の
生産物のバイオ生産を媒介しこれを増大させる酵素を暗
号化しているＤＮＡ等が含まれるが、それだけに限られ
ない。そのようなりＮＡ上セグメント単離し、利用し得
る技術によって、ストレプトマイセス属および関連微生
物が産生ずる抗生物質の収量および有用性を増大するこ
とができる。

ストレプトマイセス属は、幾つかの異なった任意の培地
を使用する多くの方法によって培養できる。培養培地に
加えられる好ましい炭水化物供給源は、例えば糖蜜、グ
ルコース、デ牛ストリンおよびグリセリン等である。窒
素供給源は、例えば大豆粉末、アミノ酸混合物およびペ
プトン等である。また栄養無機塩供給源も加えられ、ナ
トリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、りん
酸、塩酸、硫酸等のイオンを生成することが可能な通常
使用される塩が添加される。また他の微生物の増殖と生
育に必要な必須微量元素も添加される。そのような微量
元素は、一般にその外の培地組成成分の添加に付随して
混入する不純物として供給される。

ストレプトマイセス属は、ｐＨ約５〜９の比較的広い範
囲にまたがる好気的条件下に、約１５°〜４０℃の温度
範囲で増殖する。プラスミドの安定性およびその保持の
ために、ｐＨ約７．２の培養培地で開始し、培養温度を
約３０℃に保つことが望ましい。

以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。

これらの実施例は単に発明を説明するためのものであっ
て、発明の範囲を限定するものではない。試薬または装
置の供給源は単に便宜的に示したものであり何ら発明を
制限するものではない。それぞれ適当な箇所で、発明の
説明と発明を構成する実際の方法とを一緒に記載する。

実施例１　プラスミドｐＳＶＢ９の単離Ａ、ストレプト
マイセス・リビダンスＴＫ２３／ｐＳＶＢ９の培養 ストレプトマイセス・リビダンスＴＫ２３／ｐ　５ＶＢ
９　（ＮＲＲＬ１８０７３）の胞子約１０８個を、チオ
ストレプトン１０μｇ／ｍＬを含有するＴＳＢ培地（ト
リプシカーゼ・大豆ブロス“）　１０　ｍＬに接種し、
培養が初期定常期に達するまで２９℃で増殖させた。次
いで培養をホモジナイズし、均質になった培養５ｍＬを
使用してこれをチオストレプトンを含有しているＴＳＢ
培地１００　ｍＬへ接種した。

ストレプトマイセス・リビダンスＴＫ２３／ｐＳＶＢ９
細胞が定常期に達するまで、１００　ｍＬの培養を２９
℃でインキュベートした。

’ＴＳＢ培地は３０　ｇ／Ｌの濃度で調製し、ベセスダ
・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ
５ｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　；　Ｂ　ＲＬ
　）社、８７１７、グローブモント・サークル（Ｇｒｏ
ｖｅｍｏｎｔ　Ｃ１ｒｃｌｅ　）、Ｐ、０．ボックス（
Ｐ、Ｏ，Ｂｏｘ）　５７７、ゲイサーズバーグ（Ｇａｉ
ｔｈｅｒｓ−ｂｕｒｇ　）、マリ−ランド（Ｍａｒｙｌ
ａｎｄ　）　、　２０７６０から入手した。

Ｂ、プラスミド単離 細胞を採集し、１０．３％スクロース溶液で１回洗浄し
た。次いで細胞を１０．３％スクロース溶液２４　ｍＬ
に浮遊し、これに５×リゾチーム溶液〔１２５ｍＭ　ト
リス−ＨＣｌ　（ｐＨ８）、１２５ｍＭ　Ｎａ２ＥＤＴ
ＡＣｐＨ８）、１０ｍｇ／ｍＬリゾチーム、１０．３％
スクロース１６ｍＬを添加した。溶液を混合し、３０℃
で３０〜６０分間インキュベートし、次いで０．３Ｍ　
ＮａＯＨおよび１％ｓＤｓからなる溶液１８ｍＬを予じ
め５０℃に加温してこれに添加し、混合して得られた混
合液を８０℃で１０分間インキュベートした。次いで混
合液を室温に冷却し、フェノール５００ｇ、ＣＨＣＬ３
５００ｇおよび８−ヒトロキシキノリン０．５ｇを水２
００　ｍＬに混合した溶液１２ｍＬを加え、細胞抽出物
とよく混合した。６０００〜８０００　ｒｐｍで１０分
間遠心することにより、層を分離した。得られた上層約
４５ｍＬを清浄なびんへ移した。

次に３　Ｍ　Ｎａ０Ａｃ　４．５　ｍ　Ｌおよびインプ
ロパ／−ル５０ｍＬを上清に加え、Ｍ液をよく混合し。

室温で３０分間放置した。次いで溶液を遠心しく８００
０ｒｐｍ、３０分間）、得られた上清を棄てた。

ペレットを、ＣｓＣＬ８ｇを含有しているＴＥ緩衝ｇ　
［１０ｍ　Ｍ　）リス−ＨＣＩ−（ｐＨ８）および１ｍ
ＭＥＤＴＡ３７．５ｍＬに再浮遊した。この溶液に臭化
エチジウム１０ｍｇ／ｍＬ溶液約０．５ｍＬを加え、次
いでこれを４００００　ｒｐｍ、　２０℃で４８時間遠
心した。プラスミド・バンドが含まれている分画をＴＥ
Ｅ衝液およびＣｓ　Ｃ’Ｉで飽和したインプロパツール
で３〜５回抽出し、臭化エチジウムを除去した。抽出後
、試料をＴＥＥ衝液４容量で希釈し、これにエタノール
２Σ容量を追加した。得られた溶液を混合し、−２０℃
で一夜インキユベートした。

一２０℃で一夜インキユベートして得られた沈殿を遠心
（１１００００ｒｐ、３０分間）によって採集し、乾燥
し、これを２回再沈殿した。沈殿は、ペレットをＴＥＥ
衝液に浮遊し、Ｎａ０Ａｃを０．３Ｍまで加え、さらに
２．５容量のエタ／−ルを追加して、これを−７０℃で
１０〜１５分間冷却し、次いで上記のように溶液を遠心
して実施した。この手ｊ頃によって、プラスミドｐＳＶ
Ｂ９　ＤＮＡ約１００μｇが得られ、これを１Ｍｇ／μ
Ｌの濃度でＴＥ緩緩衝流浮遊し４℃で貯蔵した。

実施例２　プラスミドｐＳＶＢ２５の組立てストレプト
マイセス・リビダンス７ｐｌＪ　７０２（ＡＴＣＣ３９
１５５）を培養し、実質上、実施例１の教示に従ってプ
ラスミドｐＩＪ７０２を単離した。

チオストレプトン選別（１０μｇ／ｍＬ）を用いてプラ
スミドｐＩＪ７０２の保持を確かめた。得られた〜１０
０μｇのプラスミドｐＩＪ　７０２　ＤＮＡをＴＥｌｍ
Ｌに浮遊して４℃で貯蔵した。

プラスミドｐＩＪ　７０２　ＤＮＡ約５００ｎｇ（５μ
Ｌ）を、１０　Ｘ　Ｓａｃ　Ｉ緩衝液［６０ｍＭ）リス
−ＨＣ１，（ｐＨ７，４）　、６０ｍＭ　ＭｇＣ，１，
２、６０ｍＭ２−メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍＬ
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））２μＬ　、　Ｈ２Ｏ１
２μＬおよび制限酵素５ａｃＩ（制限酵素Ｓｓｔ　Ｉの
インシゾマ−）１．５μＬ〔〜１５単位（単位の定義は
特に記載しない限りニュー・イングランド・バイオラブ
ズ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）、３２
トザー−ロード（Ｔｏｚｅｒ　Ｒｏａｄ　）、ビバリー
（Ｂｅｖｅｒｌｙ　）　、ＭＡ　０１９１５−９９９０
の定義によった）〕に添加した。得られた反応液を３７
℃で１時間インキュベートし、反応混合成約３μＬを取
ってこれをアガロース・ゲル電気泳動に掛け、消化が完
結していることを測定した。Ｓａｃ　Ｉ消化プラスミド
ｐｌＪ　７０２　ＤＮＡの溶液に、１０ＸＢｇｌＩＩ緩
衝液〔１，０Ｍ　ＮａＣ１，，１００ｍＭ）　　リ　ス
　−　ＨＣＬ　　（ｐＨ７，４）　　、１００ｍＭＭｇ
Ｃ１２，１００ｍＭ　２−メルカプトエタノール、１　
ｍｇ／ｍＬ　Ｂ　Ｓ　Ａ　）約４μＬ、Ｈ２Ｏ１６μＬ
および制限酵素ＢｇｌＩＩ２μＬ　（〜１６単位）を加
え、得られた反応液を３７℃で１時間インキュベートし
た。反応混合成約６μＬを取って消化が完結しているこ
とを確認した。次いで反応混合液の酢酸ナトリウム（Ｎ
ａ′０Ａｃ）濃度を３．０Ｍに調節し、エタノ°−ル２
容量を加え、反応混合液を一７０℃に冷却し、沈殿した
ＤＮＡを遠心によりペレット化することによりＳａｃ　
Ｉ　−Ｂｇｌ　ＩＩ消化ＤＮＡを採集した。Ｂｇｌ　［
−３ａｃ　Ｉ　　消化プラスミドｐｌＪ７０２ＤＮＡの
ペレットを５０ｍＭトリス−ＨＣＬ　（、ｐＨ８，０）
１００μＬに再浮遊した。ウシの腸アルカリ性ホスファ
ターゼ（ベーリンガー・マンハイム）の５０ｍＭ　）リ
ス−Ｈ（１（ｐＨ８）希釈液（１：１００）約１μＬを
ＤＮＡ溶液に加え、得られた反応液を３７℃で３０分間
インキュベートした。反応混合液を７０℃で１時間イン
キュベートすることにより反応を停止した。

プラスミドｐＳＶＢ９　ＤＮＡ約６２５　ｎｇをＴＥ緩
衝液２５μＬに浮遊した液を１０　Ｘ　Ｓａｃ　Ｉ緩衝
液６　ｕＬ　、　Ｈ２Ｏ２６ｕＬおよび制限酵素Ｓａｃ
　Ｉ２μＬ（〜２０単位）に加え、得られた反応液を３
７℃で１時間インキュベートした９次いでＩＭＮ　ａ　
Ｃ１，３μＬおよび制限酵素Ｃ１ａ　Ｉ　２　ｕＬを反
応混合液に加え、３７℃でさらに１時間インキュベート
した。Ｃ１ａ　Ｉ消化は、プラスミドｐＳＶＢ　２５を
組み立てるライゲーション中に好ましくないライゲーシ
ョン生産物が産生される頻度を少なくする。反応混合液
の約８μＬをアガロースゲル電気泳動に掛けて消化か完
結したことを確認したあと、残りのＣ１ａ　Ｉ　−５ａ
ｃ　Ｉ消化ＤＮＡの溶液にＩＭＮ　ａ　Ｃ１，１ｔｔ　
Ｌおよび制限酵素Ｂｇｌ　ＩＩ　１　ｕＬ　（〜８単位
）を添加した。反応混合液をさらに１時間、３７℃でイ
ンキュベートした。反応混合成約８μＬを取りＢｇｌｎ
消化の完結を確認した。

Ｂｇｌ　Ｉ［−Ｓａｃ　Ｉで消化しアルカリ性ホスファ
ターゼで処理したプラスミドｐＩＪ　７０２　ＤＮＡ約
７７μＬを、Ｂｇｌ　Ｉ［−５ａｃ　Ｉ　−Ｃ１ａ　Ｉ
　　消化プラスミドｐＳＶＢ９　ＤＮＡ３２μＬ、３Ｍ
酢酸ナトリウム（ＮａＯＡｃ）　　１１　ｕＬおよび無
水エタ／−／ｌ／３００μＬに加えた。溶液を混合し、
−７０℃で３０分間冷却し、これを遠心してＤＮＡをペ
レットとした。このＤＮＡを、１×リガーゼ緩衝液（５
０ｍＭトリス−ＨＣｌ、　（ｐＨ７，８）、１０　ｍＭ
　ＭｇＣ１，２，２０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ
）、１．０　ｍＭＡＴＰ、５０　μｇ／ｍＬ　ＢＳＡ　
］　１２　ｕＬに再浮遊した。Ｔ４　リガーゼ約１μＬ
（〜１単位；ベーリンガー・マンハイム）をこのＤＮＡ
溶液に添加し、得られた反応液を１５℃で一夜（〜１６
時間）インキュベートした。ライゲーションしたＤＮＡ
は所望のプラスミドｐＳＶＢ２５ＤＮＡを構成している
。プラスミドｐＳＶＢ２５の制限酵素切断部位および機
能地図を第３図に示した。ライゲーションしたＤ　Ｎ　
Ａを実施例６に示したようにストレプトマイセス・リビ
ダンスＴＫ２３の形質転換に使用したつニス・リビダン
スＴＫ２３／ｐＩＪ　７０２の形質転換細胞は、形質転
換プレート上に生じるコロニーの色によってニス・リビ
ダンスＴＫ２３／ｐＳＶＢ２５と識別された。プラスミ
ドｐｌＪ７０２は無傷のタイロシン遺伝子を保有してお
り、したがってニス・リビダンスＴＫ２３／ｐｌＪ７０
２形質転換細胞はタイロシン含有プレート上で黒色とな
る。タイロシナーゼ遺伝子はプラスミドｐＳＶＢ２５の
組立ての間に不活性化され、したがってニス・リビダン
スＴＫ２３／ｐＳＶＢ２５の形質転換細胞はタイロシン
含有プレート上で黒色を示さない。

実施例３　プラスミドｐＳＦＨ６２、ｐＳＦＨ６３、お
よびｐＳＫＣ１３の組立て マニアテイス（Ｍａｎｉａｔｉｓ　）　　ラ［モレキュ
ラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ）　、１９８２年、コールド・スプリング・ハーバ
−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ
ｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）　）を参照にした下記の
方法により、イー・コ１ＪＫ１２ＨＢ１０１／ｐＨＪＬ
　３１５からプラスミドＤＮＡを入手し、これを使用し
てプラスミドｐＳＦＨ６２、ｐＳＦＨ６３およびｐＳＫ
Ｃ１３を組み立てた。これと同一の手順で、ただしそれ
より小規模で、また超遠心段階をフェノール、次いでク
ロロホルムによる抽出におき換えることにより、本発明
の種々のイー・コリ形質転換細胞の同定に用いるプラス
ミドＤＮＡを調製した。

定常期のイー・コリに１２　　ＪＭ１０９／ｐＨＪＬ３
１５細胞約５００　ｍＬを４℃、４０００Ｘｇで１０分
間遠心して細胞を回収し、上清は棄てる。細胞ペレット
を水冷したＳＴＥ緩衝液Ｃ０，Ｉ　Ｍ　ＮａＣ１，，１
０ｍＭ　トリス−ＨＣ１，（ｐＨ７，８）　、１ｍＭＥ
ＤＴＡ）１００　ｍＬで洗浄する。細胞ペレットを洗浄
したあと、ペレットを、リゾチーム５ｍｇ／ｍＬを含有
している溶液１（５０ｍＭグルコース、２５　ｍＭトリ
ス−ＨＣｌ、（ｐＨ８，０）　、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ）
１０ｍＬに再浮遊し、１０分間室温に放置した。

次いでリゾチーム処理した細胞に溶１２（０，２ＮＮａ
ＯＨおよび１Ｍ％ＳＤＳ）２０ｍＬを加え、その溶液を
倒置法により静かに混合する。混合液を氷上で１０分間
インキュベートする。

氷冷したら５Ｍ酢酸カリウム１５　ｍＬ（ｐＨ４，８）
を酵素分解細胞混合液に追加し、この溶液を倒置法によ
り混合する。溶液を氷上で１０分間インキュベートする
。ここに使用する５Ｍ酢酸カリウム溶液は、氷酢酸１１
．５ｍＬを水２８．５ｍＬおよび５Ｍ酢酸カリウム６０
．ｍＬに加えることによって調製する。得られた溶液は
カリウムに関して３Ｍ。

酢酸に関して５Ｍとなる。

酵素分解した細胞をベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ　）　
５Ｗ２７・ローター（またはその等個物）で、４℃で１
０分間２０，０００　ｒｐｍで遠心する。細胞ＤＮＡお
よび残層は試験管の底にペレットを作る。上清約３６ｍ
Ｌを回収し、イソプロパツール０．６容ｆＡヲ加え、混
合し、得られた溶液を室温で１５分間放置する。室温で
３０分間、１２．ＯＯＯＸｇで遠心することにより、プ
ラスミドＤＮＡを採集する。上清を棄て、ＤＮＡペレッ
トを７０％エタノールで室温で洗浄する。エタノール洗
浄液をデカントしテ除き、ペレットを真空デシケータ−
中で乾燥する。次いでペレットをＴＥ緩緩衝液８ｍ区再
浮遊する。

ＣｓＣ１８ｇをＤＮＡ溶液に添加する。ＣｓＣｌ、−Ｄ
ＮＡ溶液各１０ｍＬ当たり、臭化エチジウム水溶液（１
０ｍｇ／ｍＬ　）約０．８ｍＬを添加する。溶液の最終
密度は約１．５５　ｇ／ｍＬであり、臭化エチジウムの
濃度は約６００μｇ　７ｍ　Ｌである。この溶液をベッ
クマン５０型の遠心用試験管へ移し、その上端までパラ
フィン油を充たして密封し２０℃で２４時間４５０００
ｒｐｍで遠心する。遠心後、普通光線で２本のＤＮＡの
バンドが見られる。試験管からキャップを除き、ゴ２１
の皮下用注射針を付けたシリンジを遠心用試験管の側方
から挿入して、低い方のバンドを回収する。

水を飽和した１−ブタノールで数回抽出することにより
、プラスミドＤＮ１８ｆｉから臭化エチジウムを除去し
、ＴＥＥ衝液に対する透析（こよってＣｓＣ１，を除去
する。緩衝化フェノール、次いでクロロホルムで抽出後
、ＤＮＡを沈殿させ、７０％エタ／−ルで洗浄し、乾煙
する。プラスミドｐＨＪＬ３１５ＤＮＡ約１ｍｇが得ら
れ、これをＴ　Ｅ　ｉ街液１０ｍＬに溶解した。

プラスミドｐＨＪＬ３１５約５μｇのＴＥ緩衝液５μＬ
溶液を、１０　Ｘ　Ｂｇｌ　ＩＩ緩衝液［１，ＯＭＮａ
（４１１００ｍＭ　）リス−ＨＣＬ　（ｐＨ７，４）、
１００ｍＭ　Ｍｇ　ＣＬ２．１００　ｍＭ　２−メルカ
プトエタノール、１　ｍｇ／ｍＬ　　ＢＳＡ）　２　μ
Ｌ　、　Ｈ２Ｏ１２μＬおよび制限酵素ＢｇｌＩ［１μ
Ｌ（〜１０単位）へ添加した。得られた反応液を３７℃
で２時間インキュベートした。

次いで所望の〜５．Ｏｋｂ　Ｂｇｌ　ＩＦ制限断片が他
の消化生産物から明らかに分離して（るまで、１％アガ
ロースゲル上でＢｇｌＩＩ消化プラスミドｐＨＪＬ３１
５　ＤＮＡを電気泳動した。電気泳動して得られたＤＮ
Ａを、臭化エチジウム希釈液（０，５μｇ／ｍＬ）中で
ゲルを染色し、染色したゲルに長波長紫外線を当てるこ
とによって観察した。所望の断片の所在が判明した後、
ゲルの断片先端に短いスリットを設け、このスリット部
分にシュライヒア−（５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　）および
シュエル（５ｃｈｕｅｌｌ　）　（キーン（Ｋｅｅｎｅ
　）、ＮＨ０３４３１）ＮＡ４５　ＤＥＡＥ膜の小片を
置いた。さらに電気泳動を行なうと、〜５．０ｋｂのＢ
ｇｌＩＩ制限断片は該ＤＥＡＥ膜に非共有結合的に結合
した。所望の断片がＤＥＡＥ膜に結合したあと、膜を取
りこれを低塩緩衝液（１００ｍＭＫＣＩ、　、０．１　
ｍＭ　ＥＤＴＡ、２０ｍＭ　トリス−ＨＣＬ（ｐＨ８）
〕で洗浄した。つぎに膜を小試験管に加え、高塩緩衝液
［ＩＭ　ＮａＣＬ、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ。

２０ｍＭ）リス−ＨＣ１，（ｐＨ８））で浸漬し、次い
で６５℃で１時間インキュベートしてＤＥＡＥ紙からＤ
ＮＡをはずした。６５℃でインキュベーション後、イン
キュベーション緩衝液を集め、膜を高塩緩衝液で洗浄し
た。所望のＤＮＡ断片を採集する前に、洗浄液をインキ
ュベーション緩衝液と一緒にプールした。

Ｎ　ａ　Ｃ１，の濃度が０．２５Ｍとなるように高塩Ｄ
ＮＡ溶液の容量を調節し、次いで冷熱水エタノール３容
量をこれに追加した。得られた溶液を混合し、−７０℃
に１０〜２０分間放置した。この溶液を冷却し、１５分
間１５０００ｒｐｍで遠心した。さらに残っている塩の
沈殿を除去した後、ＤＮＡペレットをエタノールで洗浄
し、乾燥後、ＴＥ緩衝液２０μＬに再浮遊すると、これ
は、所望のプラスミドｐＨＪＬ３１５の〜５ｋｂＢｇｌ
ＩＩ５ｋｂ素〜１．０μｇを構成していた；精製した断
片をＴＥ緩衝液２μＬに溶解し、−２０℃で貯蔵した。

プラスミドｐＨＪＬ４０１は、米国特許出願第Ｓ。

Ｎ、８４１９２０号（１９８６年３月２０日出願）に開
示すしているストレプトマイセス・クローニング・ベク
ターであって、その出願の一部を引用して説明する。プ
ラスミドｐＨＪＬ４０１の組立ての方策はＳ、Ｎ、８４
１９２０号の実施例１４に記載されている。プラスミド
ｐＨＪＬ４０１　ＤＮＡ約１μｇのＴＥ緩衝液１μＬ溶
液を、１０　Ｘ　ＢａｍＨＩ緩衝液Ｃ１，５Ｍ　ＮａＣ
１，，６０ｍＭ　）リス−ＨＣ１（ｐＨ７，９）、６０
ｍＭ　ＮａＣＬ２．１　ｍｇ／ｍＬ　ＢＳＡ）１μＬ、
制限酵素ＢａｍＨＩ　１　μＬ　（〜１０単位）および
Ｈ２Ｏ７μＬに添加した。得られた反応液を３７℃で約
２時間インキュベートした。次いで５０ｍＭトリス−Ｈ
ＣＬ（ｐＨ８）１００μＬをウシの腸アルカリ性ホスフ
ァターゼ〔ベーリンガー・マンハイム・バイオケミカル
ズ（Ｂｏｅｈｒ　ｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｈｅ　ｉｍＢｉｏ
ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）　、７９４１カストルウエイ・ド
クイブ（Ｃａｓｔｌｅｗａｙ　Ｄｒ、　）、Ｐ、０．ボ
ックス（Ｐ、Ｏ，Ｂｏｘ　）５０８１６、インジアナポ
リス（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ　）、ＩＮ。

４６２５０　）（１：１００希釈）１．１！Ｌとともに
ＢａｍＨ工消化プラスミドｐＨＪＬ４０１　　ＤＮＡ溶
液へ添加し、反応液をもう一度３７℃で３０分間インキ
ュベートした。

ＢａｍＨＩで消化し、ホスファターゼ処理したプラスミ
ドｐＨＪＬ４０１　　ＤＮＡ約３４μＬを、プラスミド
ｐＨＪＬ３１５の〜５．　Ｏｋｂ　Ｂｇｌ　ＩＩ制限断
片溶液１μＬへ添加した。ＤＮＡ混合物を、上記と同様
にＮａＣｌおよびエタノールで沈殿させ、そのペレット
を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガー・マンハイム）
６単位を含有している１×リガーゼ緩衝液［５０ｍＭ）
リス−ＨＣ１，（ｐＨ７，８）、１０　ｍＭ　　ＭｇＣ
１，２，５ｍＭジチオスレイトール、５％グリセリン、
０．１５ｍＭ　　ＡＴＰＩ　１０１１Ｌに再浮遊させた
。ライゲーション反応液を４℃で一夜（〜１６時間）イ
ンキュベートし、所望のプラスミドｐＳＦＨ６２および
ｐＳＦＨ６３を作成した。

プラスミドｐＳＦＨ６２の制限酵素切断部位および機能
地図を第４図に示す。プラスミドｐＳＦＨ６３は〜５．
Ｏｋｂ　Ｂｇｌ　ｍ制限断片の配向だけがプラスミドｐ
ＳＦＨ６２と異なっている。ライゲーションしたＤＮＡ
は、実質上下記に示す方法によって、イー・コＩＪ　Ｋ
　１２　Ｊ　Ｍ　１０９を形質転換するのに使用する。

形質転換受容能力を有するイー・コＩＪ　Ｋ　１２部Ｍ
１０９を作成するには、寄託番号Ａ　Ｔ　ＣＣ５３３Ｚ
３のもとにＡＴＣＣから入手したイー・コリに１２部Ｍ
Ｉ　０９の凍結乾燥品を再構成して単一のコロニーを単
離する。ＪＭ１０９から単離した１個の単一コロニーを
、１０ｍＭＭｇ５０４および１０ｍＭＭｇＣＬ２を含有
しているし一ブロス（ＩＬ当たり、バクトドリプトン１
０　ｇ、　ＮａＣ１，１０ｇおよびバクトイ−スト・エ
キストラクト５ｇを含有）５ｍＬに接種し、この培養を
一夜通気しながら３７℃でインキュベートする。−夜培
養物５０μＬを使用し、これを１０　ｍＭ　Ｍｇ　５０
４および１０　ｍＭ　ＭｇＣ］１２を含有しているし一
ブロス５ｍＬへ接種した。培養を通気しながら一夜３７
℃でインキュベートした。翌朝、この培養を１０ｍＭ　
ＭｇＳＯ４および１０ｍＭ　Ｍｇ　ＣｉＬ２を含有して
いるし一グロスで２００ｍＬに希釈した。約１×１０８
細胞／ｍＬの細胞密度を示す、５５０　ｎｍ　（Ａ３５
ｏ）の吸収が約０．５となるまで、希釈した培養を通気
しながら３７℃でインキュベートした。培養を氷水浴で
１０分間冷却し、次いで４℃で１０分間４０００Ｘｇで
遠心して細胞を採集した。細胞ペレットを１０ｍＭの冷
ＮａＣ：Ｌ　１００　ｍＬに再浮遊し、直ちに遠心によ
ってもう一度ペレット化した。細胞ペレットを３０　ｍ
Ｍ　ＣａＣ１，２１００ｍＬに再浮遊し、氷上で２０分
間インキュベートした。

遠心により細胞をもう一度採集し、これを３０ｍＭ　Ｃ
ａＣｌ２１０　ｍＬに再浮遊した。その一部をとり、細
胞０．５　ｍＬを、先にライゲーションして調製したＤ
ＮＡに添加した。このＤＮＡは３０ｍＭＣａＣ；Ｌ２に
浮遊させである。細胞−ＤＮＡ混合物を氷上で１時間イ
ンキュベートし、これを４２℃、９０秒間の加熱ショッ
クを与え、次いて氷上で約２分間冷却した。この細胞−
ＤＮＡ混合物を、１２５ｍＬのフラスコ中でＬ−ブロス
１０　ｍＬに希釈し、３７℃で１時間インキュベートし
た。

プラスミドｐＨＪＬ４０１上のＢａｍＨＩ部位は、それ
自体１ａｃＺ　α−断片を暗号化しているＤＮＡ配列の
１部をなしているポリリンカーに含まれている。イー・
コリ△Ｍ１５またはそれと類似型の突然変異体ＪＭ１０
９における１ａｃＺ　ｔｔ−断片の発現は、突然変異体
の機能的なβ−ガラクトシダーゼ酵素産生能を回復させ
る。このようにプラスミドｐＨＪＬ４０１はイー・コリ
△Ｍ１５突然変異体にβ−ガラクトシダーゼ活性を回復
することができる。しかしながらプラスミドｐＳＦＨ６
２の組立てで起こったように、プラスミドｐＨＪＬ４０
１にあるポＩＪ　ＩＪンカーの制限酵素切断部位へＤＮ
Ａを挿入することは１ａｃＺα−断片暗号配列を破壊す
ると同時にｐＨＪＬ４０１誘導体のΔＭ１５型突然変異
体に相補的な能力をも破壊する。β−ガラクトシダーゼ
は無色の化合物Ｘ−Ｇａ１（５−ブロモ−４−クロロ−
３−インドリル−β−Ｄ−がラクトビラ／シト）を加水
分解してインジゴ色をした生産物を生じるので、形質転
換細胞中で、出発プラスミドｐＨＪＬ４０１を含有して
いる細胞または修飾されたプラスミドｐＳＫＣ１３、ｐ
ＳＦＨ６２およびｐＳＦＨ６３を含有している細胞を識
別できる都合よいスクリーニング方法を提供する。即ち
、形質転換反応混合物の一部を、アンピシリン１１００
ｐ／ｍＬ　、　　Ｘ−Ｇａ１　４０　ｐｇ／ｍＬおよび
ＩＶＴＧ４０μｇ／ｍＬを含有しているし一アガール（
寒天ＩＬ当たりＬ−ブロス１５ｇを含有）平板上で培養
した。ＩＰＴＧはプラスミドｐＨＪＬ４０１上のＩａｃ
プロモーターを誘導する働きかある。平板を３７℃で一
夜インキユベートシた。イー・コＩＪ　Ｋ１２／ｐＳＦ
Ｈ６２のような挿入体を有するプラスミドを含んでいる
コロニーは白色である。数個のアンピシリン耐性株の白
色コロニーを選び出し、それらのプラスミドＤＮＡの制
限酵素分析によりｔｌｒＢを含んでいる〜５．Ｏｋｂ　
　ＢｇｌＩＩ制限断片の存在についてスクリーニングし
た。このような方法により、所望のイー・コリに１２Ｊ
Ｍ１０９／ｐＳＦＨ６２およびイー・コリに１２ＪＭ１
０９／ｐＳＦＨ６３形質転換体を同定し、単離した。

プラスミドｐＳＦＨ６２およびｐＳＦＨ６３に用いた方
法と同様な方法で、プラスミドｐＳＫＣ１３を組み立て
た。しかしプラスミドｐＳＫＣ１３の組立てではｔｙｌ
Ｂを含んでいる〜５．Ｏｋｂ制限断片を単離するための
ＢｇｌＩ［消化を完全に進行させなかった。そのかわり
プラスミドｐＨＪＬ３１５の〜５．ＯｋｂＢｇｌｎ制限
断片に近接している〜０．２ｋｂＢｇｌＩＩ制限断片を
、〜５．Ｏｋｂ断片とともにＢａｒｒｆ（１消化プラス
ミドｐＨＪＬ４０１に挿入してプラスミドｐＳＫＣ１３
を得た。上記とほぼ同様の方法により、ライゲーション
したＤＮＡを使用してイー・コリに１２ＪＭ１０９を形
質転換し、イー・コＩＪＫ１２　　ＪＭ１０９／ｐＳＫ
Ｃ１３形質転換体をそのアンピシリン耐性表現型および
プラスミドＤＮＡの制限酵素切断分析によって同定した
。ｐ　ＳＫＣ１３の制限酵素切断部位および機能地図を
第５表に示した。

実施例４ニブラスミドｐＳＦＨ６０，ｐＳＦＨ６０，１
およびｐＳＦＨ６１の組立て Ａ、プラスミドｐＳＦＨ６０およびｐＳＦＨ６０，１の
組立て プラスミドｐＵｃ１９　（ＡＴＣＣ３７２５４）１μｇ
のＴＥ緩衝液１μＬ溶液を、１’ＯＸ　Ｋｐｎ　Ｉ緩衝
液［６０ｍＭ　　ＮａＣ１，、６０ｍＭ　　ト　リ　ス
　−　ＨＣｌ、（ｐＨ７，５）、６０　ｍＭ　Ｍｇ　Ｃ
１２，１０ｍＭ　ＤＴＴ、１ｍｇ／ｍＬ　Ｂ　Ｓ　Ａ　
）　２　ｐＬ　、制限酵素ＫｐｎＩ　１μＬ（〜１０単
位）およびＨ２Ｏ１６μＬへ添加した。

反応液を３７℃で２時間インキュベートし、反応混合液
を７０℃で１０分間インキュベートすることにより反応
を停止した。

プラスミドｐＳＫＣ１３約５μｇのＴＥ緩衝液５μＬ溶
液を１０ＸＫｐｎＩ緩衝液２μし、制限酵素Ｋｐｎ　Ｉ
　１単位およびＨ２Ｏ１２μＬに添加し、得られた反応
液を３７℃で約２時間インキュベートした。反応混合液
を７０℃で１０分間インキュベートすることにより反応
を停止した。次いで反応混合液を１％アガロースゲルに
載せ、ｔｌｒＢを含有している〜３．８ｋｂ制限断片が
他の消化生産物からよく分離するまで電気泳動を実施し
た。ｔｌｒＢを含有している〜３．８　ｋｂ　Ｋｐｎ　
Ｉ制限断片的１μｇをゲルから単離し、実施例３とほぼ
同様な方法によりこれを精製した。

ｔｌｒＢを含んでいる〜３．８　ｋｂ　Ｋｐｎ　Ｉ制限
断片約０．５μｇおよびＫｐｎＩ消化プラスミドｐＵｃ
１９ＤＮＡ〜０．１μｇをよく混合し、エタ／−ルおよ
びＮａＣ１，で沈殿させ、これを７４ＤＮＡリガーゼ（
イーリンガー・マンハイム）〜６単位を含有している１
×リガーゼ緩衝液１０μＬにもう一度浮遊させた１、４
℃で一夜（〜１６時間）インキュベートしてライゲーシ
ョン反応を実施した。ライゲーションしたＤＮＡはプラ
スミドｐＳＦＨ６０およびｐＳＦＨ６０，１を構成して
おり、この両者はミただ〜３．８ｋｂのＫｐｎ　Ｉ制限
断片の配向か互いに異なっているたけであった。プラス
ミドｐＳＦＨ６０の制限酵素切断部位および機能地図を
第６図に示した。

実施例３の方法にしたがい、ライゲーションしたＤＮＡ
をイー・”ＪＫ１２ＪＭ１０９（７）形質転換に使用し
た。プラスミドｐＨＪＬ４０１の場合と同様に、プラス
ミドｐＵｃ１９はｌａｃ　Ｚ　α−断片を暗号化してお
り、プラスミドｐＵｃ１９上の唯１つのＫｐｎＩ部位は
ｌａｃ　Ｚ　α−断片暗号化ＤＮＡ内に所在している。

したかって形質転換した細胞を、アンピシリン、Ｘ−Ｇ
ａ１およびＩＰＴＧを含有しているし一アガール上で培
養した。無色（「白色」）のアンピシリン耐性形質転換
体のプラスミドＤＮＡを制限酵素切断分析に付し、所望
のイー・コリＫｌ　２　ＪＭＩ　Ｏ９／ｐＳＦＨ６０お
よびイー・コリに１２　ＪＭ１０９／ｐＳＦＨ６０，１
形質転換体を同定した。実施例３に記載の方法にしたが
い、プラスミドｐＳＦＨ６１の組立てに使用するため、
イー・コリに１２　ＪＭＩ　Ｏ９／ｐＳＦＨ６０形質転
換体からプラスミドｐＳＦＨ６０のＤＮＡを作成しｆこ
。

Ｂ、プラスミドｐＳＦＨ６１の組立て プラスミドｐＳＦＨ６０ＤＮＡ約５μｇのＴＥ緩衝液５
μＬの溶液を、１０　Ｘ　Ｈｉｎｄ　ｍ緩衝液〔０，５
ＭＮａＣ１１、０，５Ｍ　）リス−ＨＣ１，（ｐＨ８）
、０．１Ｍ　ＭｇＣ：１．２．１ｍｇ／ｍＬＢＳＡ〕２
μシ、制限酵素Ｈｉｎｄｆｆｌ　１　ｐＬ　　（〜２０
単位）およびＨ２Ｏ１２μＬに加え、得られた反応液を
３７℃で２時間インキュベートした。次いでＨｉｎｄＩ
Ｉ［消化プラスミドｐＳＦＨ６０ＤＮＡをエタノールお
よびＮａＣ１で沈殿させ、これをＨ２Ｏ１７μＬにもう
一度浮遊させた。Ｈｉｎｄ　ｍ消化プラスミドｐＳＦＨ
６０ＤＮＡ溶液に、１０　Ｘ　ＥｃｏＲＩ緩衝液〔１Ｍ
トリス−ＭＣＩ。

（ｐｉ（７，５）、０．５Ｍ　ＮａＣ１，，５０ｍＭ　
ＭｇＣ１，２，１ｍｇ／ｍＬ　ＢＳＡ）約２μＬおよび
制限酵素ＥｃｏＲＩ　１μＬ（〜２０単位）を添加して
、得られた反応液を３７℃で２時間インキュベートした
。ＥｃｏＲｌ−Ｈｌｎｄ　ｍ　消化プラスミドｐＳＦＨ
６０ＤＮＡをアガロースゲル上に載せ、ｔｌｒＢを含ん
でいる〜３，８ｋｂ制限断片が他の消化生産物から分離
するまで電気泳動を行なった。〜３．８ｋｂ断片をゲル
から単離し、実施例３の方法にしたがってこれを精製し
た。約１μｇの断片を得た。

プラスミドｐＨＪＬ４０１約１μｇを、上記のように制
限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄｌｌｒで消化した。

反応混合物を７０℃でインキュベートして消化反応を停
止した。ＥｃｏＲＩ　−Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ消化プラスミ
ドｐＨＪＬ４０１　　ＤＮＡ約０．１ａｇをプラスミド
ｐＳＦＨ６０の〜３．８　ｋ　ｂ　　ＥｃｏＲＩ−Ｈｉ
ｎｄＭ制限断片約０．５μｇと混合し、次いでＤＮＡを
エタノールおよびＮ　ａ　Ｃ１−で沈殿させた。このＤ
ＮＡをもう一度、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（イーリンガー・
マンハイム）６単位を含有している１×リガーゼ緩衝液
１０μＬに浮遊させ、得られた反応液を４℃で一夜（〜
１６時間）インキュベートした。

ライゲーションしたＤＮＡは所望のプラスミドｐＳＦＨ
６１を構成しており、実質上、実施例３の方法にしたか
つて、これをイー・コＩＪ　Ｋ　１２　Ｊ　Ｈ１Ｏ９の
形質転換に使用した。Ｘ−Ｇａ１を加水分解しないアン
ピシリン耐性形質転換体を採集し、そのプラスミドＤＮ
Ａ　　を制限酵素切断分析に付し、所望のイー・コリに
１２　ＪＭ１０９／ｐＳＦＨ６１形質転換体を同定した
。プラスミドｐＳＦＨ６１の制限酵素切断部位および機
能地図を第７図に示した。

実施例５　プラスミドｐＳＶＢ３６およびｐ　５ＶＢ３
７の組立て ストレプトマイセス・リビダンスＴＫ２３／ｐＳＶＢ２
　（ＮＲＲＬ　　１５８８０）を培養し、実質上、実施
例１の方法にしたがってこれを処理して、プラスミドｐ
ＳＶＢ２　ＤＮＡを単離した。プラスミドｐＳＶＢ２の
制限酵素切断部位および機能地図を第９図に示した。プ
ラスミドｐＳＶＢ２　ＤＮＡ約５００μｇのＴＥ１１衝
１ｆｆ−５ｐＬ溶液を、Ｈ２Ｏ１２ｐＬ、１０ＸＣ］ａ
Ｉ緩衝液［０，５Ｍ　　ＮａＣ！、、６０ｍＭトリ、２
．−ＨＣｌ、（ｐＨ７，９）、６０　ｍ　Ｍ　Ｍｇ　Ｃ
１，２，１ｍｇ／ｍＬ　ＢＳＡ］　２　ｐＬおよび制限
酵素ＣＩａＩの２μＬ（〜１４単位）に添加し、得られ
た反応液を３７℃で１時間インキュベートした。ライゲ
ーション反応においてＣ１ａ　Ｉ消化はプラスミドｐ　
５ＶＢ３６　およびｐＳＶＢ３７の産生にとって不要な
ライゲーション生産物を減少した。

Ｃ１ａ　Ｉ消１ヒプラスミドｐＳＶＢ２　ＤＮＡの溶液
にＩ　Ｍ　ＮａＣ］　　約１μＬおよび制限酵素Ｂｇｌ
Ｉ１１μＬ（〜８８単）を添加し、反応液を３７℃でさ
らに１時間インキュベートした。反応混合成約５μＬを
取り、これをアガロースゲル電気泳動に掛けて消化の完
結を確認した。残りのＢｇｌＩ［−ＣＩａＩ　　で消化
したプラスミドｐＳＶＢ２　ＤＮＡ〜１７μＬに１０Ｘ
１０ＸＢａ緩衝液（１，５Ｍ　　ＮａＣ１，，６０ｍＭ
トリス−ＨＣｌ、（ｐＨ７，９）、６０　ｍ　Ｍ　Ｍ　
ｇ　Ｃ１，２，１ｍｇ／ｍＬ　Ｂ　Ｓ　Ａ　）約４　ｐ
Ｌ　、　Ｈ２Ｏ１９ｐＬおよび制限酵素ＢａｍＨＩ　１
２μＬ（〜４８単位）を添加し、反応混合液を３７℃で
１時間インキュベートした。

プラスミドｐＳＶＢ２５ＤＮＡ（実施例１記載の方法に
したがってストレプトマイセス・リビダンスＴＫ２３／
ｐＳＶＢ２５細胞から作成した）約５００　ｎｇのＴＥ
緩衝液５μＬ溶液を、Ｈ２Ｏ１１μＬ、ｌＯＸＢｇｌＩ
Ｉ緩衝液２μＬおよび制限酵素ＢｇｌＩＩ２μＬ（〜１
６単位）に添加して得られた反応液を３７℃で１時間イ
ンキュベートした。反応混合液の約５μＬをアガロース
ゲル電気泳動に掛けてＢｇｌＩＩ消化の完結を確認し、
残りのＢｇｌｌＩ消化プラスミドｐＳＶＢ２５ＤＮＡを
エタノールで沈殿させ、実施例１の方法にしたがってウ
シの腸アルカリ性ホスファターゼで処理した。

Ｃ１ａ　Ｉ　−Ｂｇｌ　ＩＩ　−ＢａｍＨＩ消化プラス
ミドル　５ＶＢ２　ＤＮＡ約２５μＬおよびＢｇｌ　Ｉ
Ｉ消化、アルカリ性ホスファターゼ処理プラスミドｐ　
ＳＶＢ　２５　ＤＮＡ約６７μＬを一緒に３　Ｍ　Ｎａ
０Ａｃ９．２　μＬおよび工タ／〜ル２５０μＬと混合
した。混合液を一７０℃で３０分間冷却後遠心し、ＤＮ
Ａをペレットとした。このペレットをＴ４　ＤＮＡリガ
ーゼ１単位を含有している１×リガーゼ緩衝液１０μＬ
にもう一度浮遊させ、得られた反応液を１５℃で一夜イ
ンキユベートした。ライゲーションしたＤＮＡは所望の
プラスミドｐＳＶＢ３６およびｐＳＶＢ３７を構成して
いた。プラスミドｐＳＶＢ３６の制限酵素切断部位およ
び機能地図を第８図に示した。実施例６の記載と同様に
して、ライゲーションしたＤＮＡの約５μＬをストレプ
トマイセス・リビダンスＴＫ２３の形質転換に使用した
。所望のニス・リビダンスＴＫ２３／ｐＳＶＢ３６およ
びニス・リビダンスＴＫ２３／ｐＳＶＢ３７の形質転換
体を、そのタイロシン耐性表現型およびそれらのプラス
ミドＤＮＡの制限酵素切断分析によって同定した。

実施例６　タイロシン耐性ストレプトマイセス・リビダ
ンスＴＫ２３形質転換体の組立てＡ、溶液の一覧表 以下に示した溶液は全実施例に適用されるものであり、
その詳細を説明する。

１、　　Ｐ培地（〜１００　ｍＬ　）　：成分　　　　
　　　　　　含有量 スクロース　　　　　　　　　　　　１０．３ｇＫ２Ｓ
Ｏ４０，０２５ｇ 微量元素溶液（１！３参照）　　　　　　０．２ｍＬＭ
ｇＣＬ２・６Ｈ２００，２０３ｇ 水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　８０ｍＬ
オートクレーブ滅菌後、下記の成分を追加する。

ＫＨ２ＰＯ４（０，５％）　　　　　　　　１ｍＬＣａ
Ｃ］、２　・２Ｈ２０（３，６８’！＝　）　　　　１
０　ｍＬ〔Ｎ−トリス−（ヒドロキシメ　　　１０ｍＬ
チル）−メチル−２−アミ／エ タンスルホン酸）　’ＴＥＳ’緩衝液 ０．２５Ｍ（ｐＨ７，２） ２、　　Ｌ培地（〜１００ｍＬ）： 成分　　　　　　　　　含有量 スクロース（１０，３％）　　　　　　　１００　ｍＬ
ＴＥＳ緩衝液（ｐＨ７，２）　　　　　　１０ｍＬ（０
，２Ｍ） Ｋ２ＳＯ４（０，５％　）　　　　　　　　　　ｌ　ｍ
Ｌ微量元素溶液（＝３参照）　　　　　　　０．２　ｍ
ＬＫＨ２ＰＯ４（０，５％　）　　　　　　　　　１　
ｍＬＭｇＣ’ｌ、２　（２，５Ｍ　）０．１　ｍＬＣａ
Ｃ’Ｌ２　（０，２５Ｍ　）　　　　　　　　　１　ｍ
Ｌリゾチーム　　　　　　　　　　　　　　１　ｍｇ／
ｍＬＬ培地は調製後、濾過滅菌する。

３　微量元素溶液（〜ＩＬ）： 成分　　　　　　　　　含有量 ＺｎＣｌ２　　　　　　　　　　　　　４０ｍｇＦｅＣ
１１，３・６Ｈ２０２００ｍｇ ＣｕＣ１２−２Ｈ２０１０ｍｇ ＭｎＣ，１，２−４Ｈ２０１０ｍｇ Ｎ３２Ｂ４０７　’　１０Ｈ２０１０ｍｇ（ＮＨ４）　
Ｍｏ　７０２４−４Ｈ２０１０ｍｇＨ２ｏ　　　　　　
　　　　　　　　　　　ＩＬ４、　Ｒ２再生培地（〜Ｉ
Ｌ）： 成分　　　　　　　　　　含有量 スクロース　　　　　　　　　　　　１０３ｇＫ２８０
４　　　　　　　　　　　　　　０．２５ｇ微量元素溶
液　　　　　　　　　　　　２ｍＬＭｇＣＬ２・６Ｈ２
０１０，１２ｇ グルコース　　　　　　　　　　　　　　１０ｇＬ−ア
スパラギア　・Ｉ　Ｒ２０２，Ｏｇカザミノ酸　　　　
　　　　　　　　　　０．１ｇ寒天　　　　　　　　　
　　　　　　２２ｇこれに水を加えて全量７００ｍＬと
する。

オートクレーブ滅菌後、下記の成分を追加する。

ＫＨ２ＰＯ４（０，０５ｇ／１００ｍＬ）　　　　１０
０ｍＬＣａＣ１ｌ、２（２，２２ｇ／１００ｍＬ）　　
　　　１００　ｍＬＴＥＳ緩衝液（５，７３ｇ／１００
ｍＬ）　　１００ｍＬ（ｐＨ７，２） ＮａＯＨ（５Ｎ）　　　　　　　　　　　　　　１ｍＬ
５、　　Ｔ培地（〜１４．５　ｍＬ）　：成分　　　　
　　　　　　含有量 スクロース（１０−３％　）　　　　　　　　　２．５
ｍＬ蒸留水　　　　　　　　　　　　　　　７．５ｍＬ
微量元素　　　　　　　　　　　　　２０μＬＫ２Ｓ０
４　（２，５％）　　　　　　　１００μＬＣａＣ１，
２（５Ｍ　）　　　　　　　　　２１７１１Ｌトリス−
７レイン酸（ｐＨ８）　　　５４３μＬ（ＩＭ） ポリエチレングリコール１０００　　　　３．６３ｇす
べての構成要素は使用前に滅菌した。液体要素は混合し
、次いで好適量の溶融ポリエチレングリコールへ添加し
た。最初の４成分を予め混合しくプレミックス）、室温
で少なくとも１ケ月貯蔵できる。

６、軟栄養寒天（ＳＮＡ、〜ＩＬ）： ディフコ・バクト栄養ブロス　　　　　８ｇ寒天　　　
　　　　　　　　　　　　　５ｇ７、Ｒ２ＹＥ培地は、
培地ＩＬ当たり２５％酵母エキスを２０　ｍＬ添加した
Ｒ２培地である。

８、＃母エキスー麦芽エキス（ＹＥＭＥ、〜ＩＬ）：成
分　　　　　　　　　含有量 酵母エキス　　　　　　　　　　　　　３ｇペプトン　
　　　　　　　　　　　　　５ｇ麦芽エキス　　　　　
　　　　　　　　３ｇグルコース　　　　　　　　　　
　　　１０ｇ９、ＹＥＭＥ＋　３４％スクロース液体完
全培地はスクロース４３４０ｇ／Ｌを含有するＹＥＭＥ
である。

１０、ＹＭＸ培地（〜ＩＬ）： 酵母エキス　　　　　　　　　　　　　　３ｇ麦芽エキ
ス　　　　　　　　　　　　　３ｇグルコース　　　　
　　　　　　　　　　　２ｇ寒天　　　　　　　　　　
　　　　２０μＬ、プロトプラストの作成および貯蔵 本実施例に記載する方法を用いて、ストレプトマイセス
・リビダンスＴＫ２３形質転換体を組み立てて分析した
。プラスミドｐＳＶＢ９　、ｐＳＶＢ２５．１）ＳＶＢ
３６、ｐＳＶＢ３７、ｐＳＦＨ６１、Ｉ）ＳＶＢ４７、
ｐＳＦＨ６２、ｐＳＦＨ６３およびｐＳＫＣ１３を、そ
れぞれ別々に独立して形質転換用ＤＮＡとして使用した
。

ストレプトマイセス・リビダンスＴＫ２３（ＮＲＲＬ　
１５８２６）を３０℃で４０〜４８時間ＹＥＭＥ＋　３
４　％　スクロース、５　ｍＭ　ＭｇＣ１Ｌ２および０
．５％グリシン中で増殖させた。遠心によって（８００
×ｇ、１０分間、ベンチトップ遠心機）菌糸体を回収し
、これを１０．３％スクロースで２回洗浄した。２５〜
５０ｍＬの培養から由来した菌糸体を３〜４ｍＬのし培
地に浮遊し、これを３２℃で１一時間インキュベートし
た。この間、凝集塊を分散させるためピペットで浮遊液
を上下に動かした。

Ｐ培地５ｍＬを追加し、次いで液を綿栓で濾過した。遠
心によりプロトプラストを回収しく８００Ｘｇ、１０分
間）、Ｐ培地５ｍＬで２回洗浄した。

次いでプロトプラストをＰ培地４ｍＬに浮遊し、血球計
算盤を使用してプロトプラスト数を顕微視的に計測した
。プロトプラストをすぐに使用しな１い場合は、浮遊層
を滅菌したねじ込みキャップ付きポリエチレン・チュー
ブにプロトプラスト数か９　　　１０　。

５×１０〜１０　　つつ含まれるよう（約１ｍＬ）に分
割することができる。チューブをアイスボックスに入れ
て浮遊液を徐々に凍結し、次いでこれを一７０℃に保管
した。必要な時までこの温度でプロトプラストを貯蔵し
た。凍結した浮遊液は、使用前、３７℃の水浴に漬けて
速やかに融解した。

Ｃ，プロトプラストの形質転換 遠心Ｉこより（８００ｘｇ、１０分間）プロトプラスト
約５×１０９をペレットとした。上滑をデカントして除
き、プロトプラストをチューブに残っている少量の液に
もう一度浮遊させた。ＴＥ緩衝液に浮遊した２０μＬよ
り多くない量のプラスミドをこれ１こ添加し、次いで直
ちにＴ培地０．５ｍＬを加えた。ピペットを１〜２回上
下して混合欣の内容物を混合した。この浮遊液をそのま
ま直接平板に培養するか、またはＰ培地０．５ｍＬに希
釈して培養した。何れの場合でも、Ｒ２ＹＥ培地１平板
当たり約０．１　ｍＬを接種した。

タイロシン５００μｇ／ｍＬを含有しているＲ２ＹＥ培
地へ再生したプロトプラストをレプリカ平板培養するこ
とにより、タイロシン耐性形質転換体を選別した。別法
としては、再生したプロトプラストにタイロシンを含有
している軟栄養ブロス寒天を重層することによってタイ
ロシン耐性形質転換体を選び出すことができる。再生平
板を３０℃で１６〜２２時間インキュベートした後、こ
の平板に、希釈後の最終濃度が５００μｇ／ｍＬとなる
ようにタイロシンを含有している軟普通ブロス寒天（Ｓ
ＮＡ：温度４５〜５０℃）を平板１枚当たり２．５ｍＬ
適用する。ＳＮＡ重層にタイロシンを７５０　μｇ／ｍ
Ｌ添加し、ｐｒＪ７０２誘導体を保有している形質転換
体のメラニン産生の有無を測定した。無傷のタイロシナ
ーゼ遺伝子を保有している形質転換体は、タイロシンの
存在下で増殖した後、黒色を呈する。

Ｄ、ストレプトマイセス・リビダンス形質転換体の分析 形質転換体を、タイロシンを添加したＲ２ＹＥ寒天（５
００μｇ／ｍＬ　）で培養することによって単一のフロ
ニーを得る。これらの単一コロニーをチオストレプトン
をも含有しているＴＳＢ培養（２０μｇ／ｍＬ　）の接
種に使用する。培養をホモジナイズし、回転振とう機で
一夜３０℃で増殖する。

分析用プラスミドの単離は実施例１に示した手順を小規
模に置きなおして実施する。実施例１に記載したＣ　ｓ
　Ｃ’１．勾配をエタ／−ル沈殿法に置き換える。遠心
によって菌糸体を採集し、１０．３％スクロースで２回
洗浄し、次いでこれを１０．３％スクロース１〜２ｍＬ
に浮遊する。細胞混合液４００μＬを小試験管へ移し、
５×リゾチーム溶液（実施例１）１００μＬを添加する
。浮遊液を３０℃で３０〜６０分間インキュベートし、
次いで１％ＳＤＳを含有している０、３　Ｍ　ＮａＯＨ
３００ｐＬをこれに添加して混合する。添加した液は細
胞混合液へ添加する前５０℃に予熱しておく。細胞混合
液を８０℃で１０分間放置し、室温に冷却し、次いでフ
ェノール：　ＣＨＣｌ、３　（５０：　５０　）　２０
０μＬでこれを抽出する。水層を清浄な試験管に移し、
Ｎａ０Ａｃを０．３Ｍ加え、次いで同容量のインプロパ
／−ルを追加する。室温でＤＮＡを５分間インキユイー
トシ、次いで遠心によりペレットとする。このペレット
をＴＥ緩衝液４００μＬに溶解し、これにＮａ０Ａｃを
加えて０．３Ｍとする。エタノール約２．５容量を加え
この混合液を一７０℃で３０分間インキュベートする。

遠心後、もう一度沈殿を取り、プラスミドＤＮＡをＴＥ
緩衝液５０μＬに浮遊する。反応生産物の制限酵素切断
および電気泳動分析により、プラスミドの構造を決定す
る。

実施例７　プラスミドｐＳＶＢ４７の組立てＡ、プラス
ミドｐＳＶＢ４０の組立て プラスミドｐＵＣ１９ＤＮＡ約１．２μｇのＴＥ緩衝液
４μＬ溶液を１０　Ｘ　Ｓａｃ　Ｉ緩衝［（：６０ｍＭ
トリス−ＨＣ１，（ｐＨ７，４）、６０ｍＭ　ＭｇＣ１
，２，６０ｍＭ２−メルカプトエタノール、１００　ｍ
ｇ／ｍＬ　ＢＳＡ　）　２　ｐＬ　、制限酵素５ａｃＩ
　１　ｐＬ　（〜１０単位）およびＨ２Ｏ１３μＬへ添
加した。得られた反応液を３７℃で１時間インキュベー
トした。

１０ＸＢｇｌＩＩ緩衝液約６μＬ１制限酵素ＢｇｌＩＩ
２μＬ（〜２０単位）およびＨ２Ｏ３２μＬを５ａｃＩ
消化プラスミドｐＵｃ１９ＤＮＡの溶液に添加し、３７
℃でさらに１時間反応を続けた。

プ５７．ミｔ’ｐＳＶＢ２５ＤＮＡ約１μｇｃ７）ＴＥ
緩衝液１０μＬ溶液を、１０　ｘ　Ｓａｃ　Ｉ緩衝液２
　ｐＬ　。

制限酵素５ａｃＩ　１　ｐＬ　（〜１０単位）およびＨ
２Ｏ７μＬへ添加し、得られた反応液を３７℃で１時間
インキュベートした。１０ＸＢｇｌＩ［緩衝液約６μＬ
、制限酵素Ｂｇｌ　ＩＩ　２μＬ（〜２０単位）および
Ｈ２Ｏ３２ｐＬをＳａｃ　Ｉ消化プラスミドルＳＶＢ２
５ＤＮＡの溶液に加え、得られた反応液を３７℃で１時
間インキュベートした。

５ａｃＩ　−Ｂｇｌ　ＩＩ　　消化プラスミドｐＵｃ１
９約１５０ｎｇ　（〜７．５　ｐＬ　）および５ａｃＩ
　−Ｂｇｌ　ＩＩ消化プラスミドｐＳＶＢ２５　３７５
ｎｇ（〜２２μＬ）を混合し、これをＮａＣ１，および
エタノールで沈殿させた。このＤＮＡを、Ｔ４　ＤＮＡ
リガーゼ３単位（イーリンガー・マンハイム）を含有し
ている１×ｒリガーゼ緩衝液５μＬに浮遊し、得られた
反応液を４℃で約１６時間インキュベートした。ライゲ
ーションしたＤ　Ｎ　Ａは所望のプラスミドｐＳＶＢ４
０を構成していた。制限酵素切断部位および機能地図を
第１１図に示した。実施例３の方法にしたがい、ライゲ
ーションしたＤＮＡをイー・コリに１２ＪＭ１０９の形
質転換に使用した。形質転換細胞を、ＩＰＴＧ　４０　
μｇ／ｍＬ％　Ｘ−Ｇａ１４０　μｇ／ｍＬおよびアン
ピシリン１００μｇ　／ｍ　Ｌを含有しているしアガー
ル平板で培養した。インジゴ色に発色しないコロニーを
制限酵素切断分析によりスクリーニングし、所望のイー
・コリに１２ＪＭ１０９／ｐＳＶＢ４０形質転換体を同
定した。イー・コＩＪ　Ｋ１２　ＪＭＩ　０９／ｐＳＶ
Ｂ４０形質転換体から得られたプラスミドＤＮＡを実施
例３に記載の方法にしたがいプラスミドｐＳＶＢ４７の
組立てに使用した。

Ｂ、プラスミドｐＳＶＢ４７の組立て プラスミドｐＩＪ９０３　ＤＮＡ約１．２μｇのＴＥ緩
衝液４μＬ溶液を１０　Ｘ　ＨｉｎｄｌＩ［緩衝液２μ
Ｌ１制限酵素ＨｉｎｄｌＩ１１μＬ（〜１０単位）およ
びＫ２０１３μＬへ添加した。得られた反応液を３７℃
で１時間インキュベートした。Ｉ　Ｃ□　Ｘ　ＥｃｏＲ
Ｉ緩衝液約６μし、制限酵素ＥｃｏＲ■　２μＬ（〜２
゜単位）およびＨ２Ｏ３２μＬをＨｉｎｄＩ［Ｉ消化プ
ラスミドｐＩＪ　９０３　ＤＮＡの溶液へ添加し、反応
液を３７℃でさらに１時間インキュベートした。

プラスミｌ’ｐＳＶＢ４０　ＤＮＡ約１μｇのＴＥ緩衝
液１０μＬ溶液を１０ＸＢｉｎｄｌＩ［緩衝液２μし、
制限酵素Ｈｉｎｄｌ［１ｐＬ　（〜１０単位）およびＨ
２゜７μＬへ添加し、得られた反応液を３７℃で１時間
インキュベートした。１０　Ｘ　ＥｃｏＲＩ　　緩衝成
約６　ｐＬ　、制限酵素ＥｃｏＲＩ２μＬ（〜２０単位
）およびＨ２Ｏ３２μＬをＨｉｎｄＩ［Ｉ　消化プラス
ミドＩ］５ＶＢ４０ＤＮＡの溶液に添加し、得られた反
応液を３７℃で１時間インキュベートした。

Ｈｉｎｄ　ｍ　−ＥｃｏＲＩ消化プラスミドｐＩＪ９０
３約１５０　ｎｇ　（〜７．５　ｐＬ）およびＨｉ　ｎ
ｄ　Ｉ［Ｉ　−ＥｃｏＲＩｐＳＶＢ４０　３７５ｎｇ（
〜２２μＬ）を混合し、ＮａＣ１，およびエタノールで
沈殿させた。このＤＮＡを’ｒ４　ＤＮＡ　！Ｊガーゼ
３単位（イーリンガー・マンハイム）を含有しているＩ
　Ｘ　ＩＪガーゼ緩衝液５μＬに再浮遊させた。ライゲ
ーションしたＤＮＡは所望のプラスミドｐＳＶＢ４７を
構成していた。

プラスミドｐＳＶＢ４７の制限酵素切断部位および機能
地図を第１２図に示した。ライゲーションしたＤＮＡを
実施例６の方法にしたがいストレプトマイセス・リビダ
ンスの形質転換に使用した。

【図面の簡単な説明】

第１図はプラスミドｐＳＶＢ９の制限酵素切断部位およ
び機能地図、第２図はプラスミドｐＨＪＬ３１５の制限
酵素切断部位および機能地図、第３図はプラスミドｐＳ
ＶＢ２５の制限酵素切断部位および機能地図、第４図は
プラスミドｐＳＦＨ６２の制限酵素切断部位および機能
地図、第５図はプラスミドｐＳＫＣ１３の制限酵素切断
部位および機能地図、第６図はプラスミドｐＳＦＨ６０
の制限酵素切断部位および機能地図、第７図はプラスミ
ドｐＳＦＨ６１の制限酵素切断部位および機能地図、第
８図はプラスミドｐＳＶＢ３６の制限酵素切断部位およ
び機能地図、第９図はプラスミドｐＳＶＢ２の制限酵素
切断部位および機能地図、第１０図はプラスミドｐＩＪ
　　９０３の制限酵素切断部位および機能地図、第１１
図はプラスミドｐＳＶＢ４０の制限酵素切断部位および
機能地図、第１２図はプラスミドｐＳＶＢ４７の制限酵
素切断部位および機能地図である。 特許出願人　　　イーライ・リリー・アンド・カンパニ
ー代理人　弁理士青白　葆（外１名） ＦＩＧ、１ ＦＩＧ、２ ＦＩＧ、３ ５ｔｌ ＦＩＧ、４ ＦＩＧ、５ ＦＩＧ、６ 日ａｒｎＨＩ ＦＩＧ、７ ＦＩＧ、８ ＦＩＧ、９ ＦＩＧ、ＩＯ ５ｔｌ ＦＩＧ、１Ｉ ＦＩＧ、Ｉ２ ｐｈ１

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ストレプトマイセス・フラジエのｔｌｒＢ遺伝子。 ２、ストレプトマイセス・フラジエのｔｌｒＢ遺伝子を
   含んでいる組立てられたＤＮＡ。 ３、プラスミドｐＳＶＢ９の〜３．３５ｋｂ　Ｓａｃ
   I −ＢｇｌII制限断片である第２項記載のＤＮＡ。 ４、ストレプトマイセス・フラジエのｔｌｒＢ遺伝子を
   含んでいる組換えＤＮＡクローニング・ベクター。 ５、プラスミドである第４項記載のベクター。 ６、プラスミドｐＳＶＢ９、ｐＳＶＢ２５、ｐＳＶＢ３
   ６、ｐＳＶＢ３７、ｐＳＶＢ４０、ｐＳＶＢ４７、ｐＳ
   ＫＣ１３、ｐＳＦＨ６０、ｐＳＦＨ６０．１またはｐＳ
   ＦＨ６１である第５項記載のベクター。 ７、ストレプトマイセス・フラジエのｔｌｒＢ遺伝子を
   含んでいる組換えクローニング・ベクターで形質転換さ
   れた宿主細胞。 ８、ストレプトマイセス属に属する第７項記載の宿主細
   胞。 ９、ストレプトマイセス・フラジエまたはストレプトマ
   イセス・リビダンスである第８項記載の宿主細胞。 １０、プラスミドｐＳＶＢ９、ｐＳＶＢ２５、ｐＳＶＢ
   ３６、ｐＳＶＢ３７、ｐＳＶＢ４７、ｐＳＦＨ６１、ｐ
   ＳＦＨ６２、ｐＳＦＨ６３またはｐＳＫＣ１３で形質転
   換されたストレプトマイセス・リビダンスである第９項
   記載の宿主細胞。 １１、エシエリキア・コリである第７項記載の宿主細胞
   。 １２、プラスミドｐＳＦＨ６０、ｐＳＦＨ６０．１、ｐ
   ＳＦＨ６１、ｐＳＦＨ６２、ｐＳＦＨ６３、ｐＳＶＢ４
   ０またはｐＳＫＣ１３で形質転換されたエシエリキア・
   コリＫ１２　ＪＭ１０９である第１１項記載の宿主細胞
   。