JPS6230728A - フイブリノ−ゲン阻止性モノクロ−ナル抗体 - Google Patents
フイブリノ−ゲン阻止性モノクロ−ナル抗体Info
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- JPS6230728A JPS6230728A JP61125964A JP12596486A JPS6230728A JP S6230728 A JPS6230728 A JP S6230728A JP 61125964 A JP61125964 A JP 61125964A JP 12596486 A JP12596486 A JP 12596486A JP S6230728 A JPS6230728 A JP S6230728A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（発明の背景）
血栓脈管性疾患における血栓の＠別学的位置および程度
を正確に決定することに固有な問題は、公知である。多
くの技術がこの目的のために発展してきている。放射性
標識されたフィブリノーゲンおよび種々のその他の放射
性薬剤を用いての血栓の映像化は、感度および／または
特異性が不十分でおると見出されている。放射性核種で
直接標識された血小板の使用も試みられているが、この
技術も標識化手順の複雑さゆえ広範な使用を獲得するも
のではなかった。ざらに、バックグラウンドに対する標
的の低い割合は、適切な結果を得るために遅延された映
像化おるいはバックグラウンド削減をしばしば必要とし
た。
を正確に決定することに固有な問題は、公知である。多
くの技術がこの目的のために発展してきている。放射性
標識されたフィブリノーゲンおよび種々のその他の放射
性薬剤を用いての血栓の映像化は、感度および／または
特異性が不十分でおると見出されている。放射性核種で
直接標識された血小板の使用も試みられているが、この
技術も標識化手順の複雑さゆえ広範な使用を獲得するも
のではなかった。ざらに、バックグラウンドに対する標
的の低い割合は、適切な結果を得るために遅延された映
像化おるいはバックグラウンド削減をしばしば必要とし
た。
タンパク質に関する放射性標識化技術は公知である。多
くの放射性標識が直接的に（例えばＮａ１２３、、Ｎａ
１２５■あるいはＮａ１３１■の場合）、あるいは間
接的に（タンパク質が例えばジエチレン１へリアジンへ
キサ酢！ （ＤＴＰＡ＞環状無水物に最初に接合され次
にこれに対して１１１インジウムがキレート化される。
くの放射性標識が直接的に（例えばＮａ１２３、、Ｎａ
１２５■あるいはＮａ１３１■の場合）、あるいは間
接的に（タンパク質が例えばジエチレン１へリアジンへ
キサ酢！ （ＤＴＰＡ＞環状無水物に最初に接合され次
にこれに対して１１１インジウムがキレート化される。
）用いられ得る。それゆえ、タンパク質が映像化に適し
た短庁命核種で敢剣線標識され得、そしてこの中間体が
次に、血小板が公知の操作技術によって局在化されるの
に十分な量で血栓に対し結合するような方法において、
血小板に対して結合するための単純な技術を提供するこ
とが望まれている。
た短庁命核種で敢剣線標識され得、そしてこの中間体が
次に、血小板が公知の操作技術によって局在化されるの
に十分な量で血栓に対し結合するような方法において、
血小板に対して結合するための単純な技術を提供するこ
とが望まれている。
コーラ−ら［Ｃｏ１１ｅｒ ｅｔ ａ、１． ］
（ジェイ、タリン、インベスト、 、 ７２． ３２５
（１９８３年） ［Ｊ、 Ｃｌ１ｎ、 Ｉｎｖｅｓ
ｔ、、 ７２． ３２５ （１９８３） ］）は血小板
へのフィブリノーゲンの結合を完全に阻止するモノクロ
ーナル抗体（１０Ｅ５）を発展させた。コーラ−の論文
の第３２７頁第１段において報告されるような最も効力
のある抗体を有する３つのクローンは、イヌ血小板と反
応することが見出されていない。これは、予め動物試験
をすることなく新薬のヒト試験を行なうことは通常許さ
れないことであるゆえに、適切な内容ではない。従って
上記取締まりの禁制ゆえにコーラ−により彼の論文中に
述べられた１０Ｅ５抗体の終局のヒト効用を測定するこ
とは不可能であろう。これゆえ１０Ｅ５モノクロ一ナル
抗体の特性を有するのみでなく、ヒト試験に先だち生体
内試験が行ない得るように試験動物血小板とも反応する
モノクローナル抗体を提供することが望まれる。
（ジェイ、タリン、インベスト、 、 ７２． ３２５
（１９８３年） ［Ｊ、 Ｃｌ１ｎ、 Ｉｎｖｅｓ
ｔ、、 ７２． ３２５ （１９８３） ］）は血小板
へのフィブリノーゲンの結合を完全に阻止するモノクロ
ーナル抗体（１０Ｅ５）を発展させた。コーラ−の論文
の第３２７頁第１段において報告されるような最も効力
のある抗体を有する３つのクローンは、イヌ血小板と反
応することが見出されていない。これは、予め動物試験
をすることなく新薬のヒト試験を行なうことは通常許さ
れないことであるゆえに、適切な内容ではない。従って
上記取締まりの禁制ゆえにコーラ−により彼の論文中に
述べられた１０Ｅ５抗体の終局のヒト効用を測定するこ
とは不可能であろう。これゆえ１０Ｅ５モノクロ一ナル
抗体の特性を有するのみでなく、ヒト試験に先だち生体
内試験が行ない得るように試験動物血小板とも反応する
モノクローナル抗体を提供することが望まれる。
（発明の構成）
ヒ１へ血小板がマウス中に注入された。マウス脾臓は除
去されそして、レビーら［Ｌｅｖｙ ｅｔ ａｌ、 ］
の技法（カル、トップ、ミクロパイオル、イムツル、８
１． １６４ （１９７８年） ［ＣＵｒｒ、丁０１
）、 ）ＩｉＣｒＯｂｉＯｌ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、８１
． １６４ （１９７８） ］ ）の修正によってマウ
ス骨髄腫と融合された。融合細胞はインキュベートされ
、そして次にざらにトＩＡＴ培地（非融合細胞は増殖し
ない。）においてインキュベートされた。細胞は次に限
界希釈されそして抗フィブリノーゲンレセプター活性に
関するふるいわけ法においてスクリーニングされた。正
常ヒト血小板とおよびイヌ血小板と反応し、血小板無力
症の血小板あるいはＧＰＩＩｂ／ＩＪＩａ複合体がＥＤ
ＴＡで解離される血小板と反応せず、そして非活性化ヒ
ト血小板とゆっくり反応しまたＡＤＰ活性化血小板とよ
り迅速に反応し、そしてＡＤＰにより誘発される血小板
とのフィブリノーゲンの相互作用を完全に阻止するもの
である、ＩｇＧ１クラスの、７Ｅ３と呼称される１つの
特定のクローンが選択された。（なお、マウスハイブリ
ドーマ７Ｅ３はＡＴＣＣに寄託され、受託番＠ＨＢ８８
３２を与えられた。）これらのモノクローナル抗体は次
にハロゲンあるいは金属の放射性核種で放射性標識され
た。このような標識化は、 ■おるいは１２３Ｉの
場合のように直接的で、また抗体がＤＴＰＡのようなキ
レート化剤で接合される１１１１ｎの場合のように間接
的でおり得る。
去されそして、レビーら［Ｌｅｖｙ ｅｔ ａｌ、 ］
の技法（カル、トップ、ミクロパイオル、イムツル、８
１． １６４ （１９７８年） ［ＣＵｒｒ、丁０１
）、 ）ＩｉＣｒＯｂｉＯｌ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、８１
． １６４ （１９７８） ］ ）の修正によってマウ
ス骨髄腫と融合された。融合細胞はインキュベートされ
、そして次にざらにトＩＡＴ培地（非融合細胞は増殖し
ない。）においてインキュベートされた。細胞は次に限
界希釈されそして抗フィブリノーゲンレセプター活性に
関するふるいわけ法においてスクリーニングされた。正
常ヒト血小板とおよびイヌ血小板と反応し、血小板無力
症の血小板あるいはＧＰＩＩｂ／ＩＪＩａ複合体がＥＤ
ＴＡで解離される血小板と反応せず、そして非活性化ヒ
ト血小板とゆっくり反応しまたＡＤＰ活性化血小板とよ
り迅速に反応し、そしてＡＤＰにより誘発される血小板
とのフィブリノーゲンの相互作用を完全に阻止するもの
である、ＩｇＧ１クラスの、７Ｅ３と呼称される１つの
特定のクローンが選択された。（なお、マウスハイブリ
ドーマ７Ｅ３はＡＴＣＣに寄託され、受託番＠ＨＢ８８
３２を与えられた。）これらのモノクローナル抗体は次
にハロゲンあるいは金属の放射性核種で放射性標識され
た。このような標識化は、 ■おるいは１２３Ｉの
場合のように直接的で、また抗体がＤＴＰＡのようなキ
レート化剤で接合される１１１１ｎの場合のように間接
的でおり得る。
このように標識された抗体は、自己由来の血小板と、全
てのフィブリノーゲン結合部位をブロックするには不十
分でおるが、該血小板において放射能の検知可能なレベ
ルをもたらすのに十分な濃度のレベルで反応させられた
。種適合性向液（すなわちイヌに対するイヌ血液、ヒト
に対するヒト血’ｅ＞のちのである血小板は次に目的被
験体に対して生理学的に適合する適当な懸濁媒体中へ懸
濁され、そして静脈内的に注入された。少なくとも１０
時間齢に到るまでの血栓が、ラジオシンヂグラフイーに
よって生体内血栓を検知可能とする方法において、該抗
体接合血小板と反応することが見い出された。標識され
た抗体はまた、生体内で血小板を標識するために直接血
流中に（静脈内的）注入されることができる。このアプ
ローチは、効力が生□体外で標識することによりイヌに
おいてより低い十分さではあったが、血栓を検知するこ
とは可能であった。イヌにおける生体内での開示される
成功のゆえに、この技術はヒト被験体においても同様に
使用可能である。
てのフィブリノーゲン結合部位をブロックするには不十
分でおるが、該血小板において放射能の検知可能なレベ
ルをもたらすのに十分な濃度のレベルで反応させられた
。種適合性向液（すなわちイヌに対するイヌ血液、ヒト
に対するヒト血’ｅ＞のちのである血小板は次に目的被
験体に対して生理学的に適合する適当な懸濁媒体中へ懸
濁され、そして静脈内的に注入された。少なくとも１０
時間齢に到るまでの血栓が、ラジオシンヂグラフイーに
よって生体内血栓を検知可能とする方法において、該抗
体接合血小板と反応することが見い出された。標識され
た抗体はまた、生体内で血小板を標識するために直接血
流中に（静脈内的）注入されることができる。このアプ
ローチは、効力が生□体外で標識することによりイヌに
おいてより低い十分さではあったが、血栓を検知するこ
とは可能であった。イヌにおける生体内での開示される
成功のゆえに、この技術はヒト被験体においても同様に
使用可能である。
クエンＭ塩加血小板濃厚血漿がコーラ−ら［Ｃ０１１ｅ
ｒ ｅｔ ａｌ、 コ （プロット、４７． ８４１
（１９７６年）［Ｂｆｏｏｄ、 ４７．８４１ （１
９７６）］ ）の方法にもとすいて調製され、適当な緩
衝液中に懸濁されそしてフロイント完全アジュバントと
混合された。約１Ｘ１０８〜５Ｘ１０Ｂの洗浄血小板の
注射物が、ＢＡＬＢ／Ｃマウス中へ腹腔内的に１週間間
隔で６回注射され、そして７回目のアジュバントなしの
同様の注射物が同様の時間間隔で静脈内的に与えられた
。
ｒ ｅｔ ａｌ、 コ （プロット、４７． ８４１
（１９７６年）［Ｂｆｏｏｄ、 ４７．８４１ （１
９７６）］ ）の方法にもとすいて調製され、適当な緩
衝液中に懸濁されそしてフロイント完全アジュバントと
混合された。約１Ｘ１０８〜５Ｘ１０Ｂの洗浄血小板の
注射物が、ＢＡＬＢ／Ｃマウス中へ腹腔内的に１週間間
隔で６回注射され、そして７回目のアジュバントなしの
同様の注射物が同様の時間間隔で静脈内的に与えられた
。
３日後にマウスは殺され、脾臓が除去され、細胞か分離
されそしてレビーら（上記）の方法にもとずいてＢＡＬ
Ｂ／Ｃマウス骨髄腫系と融合された・この方法において
３．９：１の比に脾細胞と骨髄種ｍ胞が、−緒にペレッ
ト化され、該ペレットはＲＰＭ１１６４０＠地中のポリ
エチレングリコール（３５％）に懸濁され、ここで細胞
は、直ちに低速度で遠心分離された。溶液は次にＲＰＭ
Ｉを用いてそれの以前の濃度の約２５％へ希釈され、＃
ｌ胞は再懸濁され、再遠心分離されそして上澄液が除去
された。上澄液は次に５％Ｃ０２９５％空気の雰囲気中
で、胎児ウシ血清を追加されたＲＰＭ１１６４０培地に
おいてインキュベ−１〜され、そしてその後の選択は、
ＨＡＴ培地を添加しそして微小力価ウェル（窪み）中へ
部分標本化（アリコツト化［ａｌｉｑｕｏｔｉｎｇｌ）
することによる通常の方法においてなされた。２週間後
に、増殖を示したウェルの上澄液は、抗フィブリノーゲ
ンレセプター活性に関してスクリーニングされた。この
方法によって得られたクローンは、種々の品質に関して
選択され、特に、７Ｅ３は成る品質に関して選択された
。
されそしてレビーら（上記）の方法にもとずいてＢＡＬ
Ｂ／Ｃマウス骨髄腫系と融合された・この方法において
３．９：１の比に脾細胞と骨髄種ｍ胞が、−緒にペレッ
ト化され、該ペレットはＲＰＭ１１６４０＠地中のポリ
エチレングリコール（３５％）に懸濁され、ここで細胞
は、直ちに低速度で遠心分離された。溶液は次にＲＰＭ
Ｉを用いてそれの以前の濃度の約２５％へ希釈され、＃
ｌ胞は再懸濁され、再遠心分離されそして上澄液が除去
された。上澄液は次に５％Ｃ０２９５％空気の雰囲気中
で、胎児ウシ血清を追加されたＲＰＭ１１６４０培地に
おいてインキュベ−１〜され、そしてその後の選択は、
ＨＡＴ培地を添加しそして微小力価ウェル（窪み）中へ
部分標本化（アリコツト化［ａｌｉｑｕｏｔｉｎｇｌ）
することによる通常の方法においてなされた。２週間後
に、増殖を示したウェルの上澄液は、抗フィブリノーゲ
ンレセプター活性に関してスクリーニングされた。この
方法によって得られたクローンは、種々の品質に関して
選択され、特に、７Ｅ３は成る品質に関して選択された
。
ＦＣ体はウェルあるいはフラスコ中にて上澄液から単離
された。あるいはまた、ハイブリドーマは、予めブロス
タン■［ｐｒｏｓｔａｎｅ■］処理された８ＡＬＢ／Ｃ
ラツト中へ腹腔内的に注射され、そして抗体は腹水から
単離された。抗体は、５０％飽和硫酸アンモニウムを用
いての沈澱により精製され、リン酸ナトリウム緩衝液中
に最初の容最の５〜１０％において再懸濁され、そして
同じ緩衝液に対して透析された。リン酸緩衝液で平衡化
されたタンパク質Ａ−セフ７７０−スＣＬ −４８［５
ｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−４Ｂ］におけるクロマトグラ
フィーが行なわれ、溶出は、０．１Ｍクエン酸緩衝液で
ｐＨを減少させながらリン酸緩衝液を用いて行なわれた
。７Ｅ３抗体は、ｐＨが約６．０に減少した後に溶出し
た。タンパク質溶出は、２８０ｎｍでの紫外線分光学に
よって観測された。
された。あるいはまた、ハイブリドーマは、予めブロス
タン■［ｐｒｏｓｔａｎｅ■］処理された８ＡＬＢ／Ｃ
ラツト中へ腹腔内的に注射され、そして抗体は腹水から
単離された。抗体は、５０％飽和硫酸アンモニウムを用
いての沈澱により精製され、リン酸ナトリウム緩衝液中
に最初の容最の５〜１０％において再懸濁され、そして
同じ緩衝液に対して透析された。リン酸緩衝液で平衡化
されたタンパク質Ａ−セフ７７０−スＣＬ −４８［５
ｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−４Ｂ］におけるクロマトグラ
フィーが行なわれ、溶出は、０．１Ｍクエン酸緩衝液で
ｐＨを減少させながらリン酸緩衝液を用いて行なわれた
。７Ｅ３抗体は、ｐＨが約６．０に減少した後に溶出し
た。タンパク質溶出は、２８０ｎｍでの紫外線分光学に
よって観測された。
抗ＩｇＧ１、抗ＩＱＧ２ａ、抗ＩｇＧ２６、抗ＩＣＪＧ
３、抗ＩＱＭおよび抗ＩＣＩＡ血清に対するオークタロ
ーニー免疫拡散検定は、ＩＱＧｌの独占的な存在を示し
た。
３、抗ＩＱＭおよび抗ＩＣＩＡ血清に対するオークタロ
ーニー免疫拡散検定は、ＩＱＧｌの独占的な存在を示し
た。
抗体それ自身は、例えば放射性ヨウ素（１２３Ｉ、１２
５Ｉまたは１３１ ｒ ＞のヨウ化プ゛トリウム等の放
射性標識、およびリン酸緩衝液ｐＨ７中で約５の抗体に
対するヨウ化物のモル比を得るために添加される非放射
性ヨウ化ナトリウムに直接的に結合され得る。ヨウ素化
タンパク質は、３０〜８０％の標識化収率および２０〜
３０μＣｉ／μＱの比活性を与えて、Ｐ６グル上におけ
るカラムクロマトグラフィーによって未結合の遊離ヨウ
化物から分離された。インジウム（１１１１ｎ）での標
識化においては、ＤＴＰＡがモノクローナル抗体と、非
常に十分な過剰、通常約５０〜１モル過剰において反応
させられ、そして未結合ＤＴＰＡは、へペス（ＨＥＰＥ
ｓ ） ／塩化ナトリウム緩衝液ｐＨ７に対する透析に
よって除去された。インジウム（１１１１ｎ）トリクロ
ライド３〜１０ｍＣ１が、酢酸緩衝液中でＤＰＴＡ−７
Ｅ３接合体１００〜３００μＱに対して添加され、３７
°Ｃで３０分間インキュベートされそして未結合インジ
ウムはゲルカラムを通しての溶出によっτ除去された。
５Ｉまたは１３１ ｒ ＞のヨウ化プ゛トリウム等の放
射性標識、およびリン酸緩衝液ｐＨ７中で約５の抗体に
対するヨウ化物のモル比を得るために添加される非放射
性ヨウ化ナトリウムに直接的に結合され得る。ヨウ素化
タンパク質は、３０〜８０％の標識化収率および２０〜
３０μＣｉ／μＱの比活性を与えて、Ｐ６グル上におけ
るカラムクロマトグラフィーによって未結合の遊離ヨウ
化物から分離された。インジウム（１１１１ｎ）での標
識化においては、ＤＴＰＡがモノクローナル抗体と、非
常に十分な過剰、通常約５０〜１モル過剰において反応
させられ、そして未結合ＤＴＰＡは、へペス（ＨＥＰＥ
ｓ ） ／塩化ナトリウム緩衝液ｐＨ７に対する透析に
よって除去された。インジウム（１１１１ｎ）トリクロ
ライド３〜１０ｍＣ１が、酢酸緩衝液中でＤＰＴＡ−７
Ｅ３接合体１００〜３００μＱに対して添加され、３７
°Ｃで３０分間インキュベートされそして未結合インジ
ウムはゲルカラムを通しての溶出によっτ除去された。
６０〜８０％の標識化収率および１０〜４０μＣ１／μ
Ｑの１ヒ活性が、抗体分子当たり０．２インジウム原子
よりも低い最終置換レベルで得られた。
Ｑの１ヒ活性が、抗体分子当たり０．２インジウム原子
よりも低い最終置換レベルで得られた。
このように製造された１２５■で標識された抗体は次に
、全面試料に結合させられた。仝血より調製された血小
板濃厚血漿が３．２％クエン酸ナトリウム中へ集められ
、そして約２０〜約１５０ＣＰ Ｍ 、／′Ｄｇの比活
性の抗体の予め決めらめた」が血小板０．２彪に対して
添加された。部分標本（り７す］ ：ｔ ｌ−［ａｌｉ
ｑｕｏｔ Ｊ）が、０．５分〜２０分間の予め決められ
た時間インキュベートされ、シリコンオイルあるいは３
０％スクロース上に層とされ、未結合の抗体から血小板
を分離するために１２、ＯＯＯＸｇで２分間遠心分離さ
れ、そして試料の放射能が測定された。結合は２時間の
接触時間の後も増加しないことが見出された。イヌ血液
、正常ヒト血液からのものであり得る血小板およびグラ
ンラマン血小板無力症の患者からの血小板が試験された
。後者に対しては結合かないことが示された。血小板が
ＡＤＰで処理された場合、７Ｅ３抗体結合の速度は、緩
衝液処理血小板とのものよりも極めて迅速なものである
。この試験はクエン酸ナトリウムで抗凝固化された血小
板濃厚血漿を用いて行なわれた。
、全面試料に結合させられた。仝血より調製された血小
板濃厚血漿が３．２％クエン酸ナトリウム中へ集められ
、そして約２０〜約１５０ＣＰ Ｍ 、／′Ｄｇの比活
性の抗体の予め決めらめた」が血小板０．２彪に対して
添加された。部分標本（り７す］ ：ｔ ｌ−［ａｌｉ
ｑｕｏｔ Ｊ）が、０．５分〜２０分間の予め決められ
た時間インキュベートされ、シリコンオイルあるいは３
０％スクロース上に層とされ、未結合の抗体から血小板
を分離するために１２、ＯＯＯＸｇで２分間遠心分離さ
れ、そして試料の放射能が測定された。結合は２時間の
接触時間の後も増加しないことが見出された。イヌ血液
、正常ヒト血液からのものであり得る血小板およびグラ
ンラマン血小板無力症の患者からの血小板が試験された
。後者に対しては結合かないことが示された。血小板が
ＡＤＰで処理された場合、７Ｅ３抗体結合の速度は、緩
衝液処理血小板とのものよりも極めて迅速なものである
。この試験はクエン酸ナトリウムで抗凝固化された血小
板濃厚血漿を用いて行なわれた。
放射標識免疫電気泳動分析が可溶化血小板タンパク質に
おいて、異種抗血小板抗体および放射性標識化７Ｅ３抗
体の組合せを用いて行なわれた。
おいて、異種抗血小板抗体および放射性標識化７Ｅ３抗
体の組合せを用いて行なわれた。
血小板は１％トリトンＸ −１００［Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ
−１００］中で可溶化され、そして１．５％寒天ゲル上
で電気泳動された。ウェル（窪み、［ｗｅｌｌ］）は、
正常血小板、グランラマン血小板無力症の患者からの血
小板あるいはＧＰＩ Ｉｂ／Ｉ Ｉ Ｉａ複合体を分割
するために１０ｍＭ ＥＤＴＡで処理された正常可溶
化血小板を含み、そして正常血清を含んでいた。弧（ア
ーク）は、ウサギ抗血小板血清および１２５Ｉ標識化７
Ｅ３抗体との一晩のインキュベーションによって発展さ
せられた。正常血小板においては７Ｅ３Ｆｃ体はタンパ
ク質弧に結合したが、この弧は血小板無力症の血小板お
よびＥＤＴＡで処理された血小板においては見られなか
った。
−１００］中で可溶化され、そして１．５％寒天ゲル上
で電気泳動された。ウェル（窪み、［ｗｅｌｌ］）は、
正常血小板、グランラマン血小板無力症の患者からの血
小板あるいはＧＰＩ Ｉｂ／Ｉ Ｉ Ｉａ複合体を分割
するために１０ｍＭ ＥＤＴＡで処理された正常可溶
化血小板を含み、そして正常血清を含んでいた。弧（ア
ーク）は、ウサギ抗血小板血清および１２５Ｉ標識化７
Ｅ３抗体との一晩のインキュベーションによって発展さ
せられた。正常血小板においては７Ｅ３Ｆｃ体はタンパ
ク質弧に結合したが、この弧は血小板無力症の血小板お
よびＥＤＴＡで処理された血小板においては見られなか
った。
血小板が過剰の７Ｅ３モノクロ一ナル抗体でインキュベ
ートされる場合、これらはフィブリノーゲンとの相互作
用を示さなかった。
ートされる場合、これらはフィブリノーゲンとの相互作
用を示さなかった。
映像化実験において、実験的血栓が試験材料の注入の１
〜４８時間前に成る動脈および静脈中への銅コイルの移
動カテーテル配置［ｔｒａｎｓｃａｔｈｅｔｅｒ ｐｌ
ａｃｅｍｅｎｔ ］によって誘発された。試験材料は、
問題の種族、好ましくは犬の、抗凝固化血液を約３ｍｃ
ｉの１２３１−７Ｅ３抗体あるいは１１１■ｎ−ＤＴＰ
Ａ−７Ｅ３抗体と予めインキュへ−１−することにより
調製された。映像は、広視野ガンマ線カメラを用いて得
られ、そして血栓対バックグラウンドおよび血栓対血液
貯留比が算定された。
〜４８時間前に成る動脈および静脈中への銅コイルの移
動カテーテル配置［ｔｒａｎｓｃａｔｈｅｔｅｒ ｐｌ
ａｃｅｍｅｎｔ ］によって誘発された。試験材料は、
問題の種族、好ましくは犬の、抗凝固化血液を約３ｍｃ
ｉの１２３１−７Ｅ３抗体あるいは１１１■ｎ−ＤＴＰ
Ａ−７Ｅ３抗体と予めインキュへ−１−することにより
調製された。映像は、広視野ガンマ線カメラを用いて得
られ、そして血栓対バックグラウンドおよび血栓対血液
貯留比が算定された。
注入の１分後以内で、注入された放射能の２５〜３０％
が、おそらくは肝臓および肝臓によって、血液から取り
除かれたことを留意すべきで必る。
が、おそらくは肝臓および肝臓によって、血液から取り
除かれたことを留意すべきで必る。
この除去は３０分で合計５０％に増加したが、その後は
３〜４時間の間かなり一定に維持され、注入の２４時間
後に７８％に増加した。静脈のおよび動脈の血栓は、注
入の１〜５時間後程の早期に視認化されることができた
。この技術により１〜１０時間前の血栓が視認化される
ことができることが見出された。４８時時間面栓（８１
］検によって示される）は同じバッグラウンド放射能を
示しそして映像にされることができなかった。
３〜４時間の間かなり一定に維持され、注入の２４時間
後に７８％に増加した。静脈のおよび動脈の血栓は、注
入の１〜５時間後程の早期に視認化されることができた
。この技術により１〜１０時間前の血栓が視認化される
ことができることが見出された。４８時時間面栓（８１
］検によって示される）は同じバッグラウンド放射能を
示しそして映像にされることができなかった。
ＢＡＬＢ／Ｃマウス（ジャクソンラボラトリーズ、メイ
ン州バーハーバ−［Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、）Ｉｅ、 ］ ）は
３Ｘ１０Ｂ洗浄向小板（０，１５Ｍ ＮａＣ１、’ｌ
ｏｍＭトリス／Ｃ１，１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７，
４［ＴＳ−Ｅａで２度洗浄されたクエン酸塩加ＰＲＰ
（血小板濃厚血漿）〕がＴＳ−Ｅ中に最初の容量の１／
１０〜１／２０に再懸濁されそして１：１の割合で完全
フロイントアジ１バンドと混合されたものの０゜２ｍｌ
注射物を、週１回の割合で６回腹腔内的に注射された。
ン州バーハーバ−［Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、）Ｉｅ、 ］ ）は
３Ｘ１０Ｂ洗浄向小板（０，１５Ｍ ＮａＣ１、’ｌ
ｏｍＭトリス／Ｃ１，１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７，
４［ＴＳ−Ｅａで２度洗浄されたクエン酸塩加ＰＲＰ
（血小板濃厚血漿）〕がＴＳ−Ｅ中に最初の容量の１／
１０〜１／２０に再懸濁されそして１：１の割合で完全
フロイントアジ１バンドと混合されたものの０゜２ｍｌ
注射物を、週１回の割合で６回腹腔内的に注射された。
第７週日の注射物は尾静脈内へ静脈内的に与えられ、そ
してこの注射物は、Ｔ−３（ＥＤＴＡ成分を除いた丁５
−Ｅ）中に再懸濁された５Ｘ１０８洗浄血小板を含む０
．３ｄからなるものであった。該７つの血小板懸濁液の
それぞれが、異なる供血者から得られた。最後の注射の
３日後に、マウスは頚部脱臼によって殺されそして肝臓
が除去された。ＲＰＭ１１６４０中への脾細胞の懸濁液
が取り出した肝臓をかぎ裂くことによって調製された。
してこの注射物は、Ｔ−３（ＥＤＴＡ成分を除いた丁５
−Ｅ）中に再懸濁された５Ｘ１０８洗浄血小板を含む０
．３ｄからなるものであった。該７つの血小板懸濁液の
それぞれが、異なる供血者から得られた。最後の注射の
３日後に、マウスは頚部脱臼によって殺されそして肝臓
が除去された。ＲＰＭ１１６４０中への脾細胞の懸濁液
が取り出した肝臓をかぎ裂くことによって調製された。
赤血球が塩化アンモニウムで溶解された後に、脾細胞は
、定型的に用いられる培養培地（１０％胎児ウシ血清、
ペニシリン１０００Ｕおよび１ｄ当りストレプトマイシ
ン１００μＱを付加されたＲＰＭ１１６４０）中へ入れ
られ維持された際に、融合の１週間前まで１０％ＤＭＳ
○、９０％胎児ウシ血清中で冷凍されつづけていた非分
泌性ＢＡＬ８／Ｃマウス骨髄腫細胞系（Ｘ６３−Ａｇ８
．６５３＞と融合された。融合は、レビーら（上記）の
方法の修正によって行なわれた。
、定型的に用いられる培養培地（１０％胎児ウシ血清、
ペニシリン１０００Ｕおよび１ｄ当りストレプトマイシ
ン１００μＱを付加されたＲＰＭ１１６４０）中へ入れ
られ維持された際に、融合の１週間前まで１０％ＤＭＳ
○、９０％胎児ウシ血清中で冷凍されつづけていた非分
泌性ＢＡＬ８／Ｃマウス骨髄腫細胞系（Ｘ６３−Ａｇ８
．６５３＞と融合された。融合は、レビーら（上記）の
方法の修正によって行なわれた。
簡単には２．７Ｘ１０８の脾細胞と７Ｘ１０７の骨髄腫
細胞をあわせてペレット化し、該ペレットはＲＰＭＩ培
地中の３５％ポリエチレングリコール２戴に穏やかに懸
濁されそして細胞は直ちに２２°Ｃにて５００ＸＣ］で
６分間遠心分離された。溶液は次にＲＰＭｌ、１６４０
を用いて９％ポリエチレングリコールへと希釈され、Ｉ
ＩＩＩＩＪ２！は再懸濁され、そして直ちに２２°Ｃに
て２３０ＸＣ１で６分間遠心分離された。上澄流体は、
次に吸い出され、そして融合細胞はＲＰＭ１１６４ｏ＠
地中に懸濁され、そして２０％胎児ウシ血清および１０
％ １０９培地（ナショナル コレクション オブ タ
イプカルチャーズ［ＮａｔｉＯｎａｌ Ｃｏ１１ｅｃｔ
ｉｏｎ ｏｆ ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅｓ］ ）を付加
された。細胞はフラスコ中に入れられ、５％ＣＯ２，９
５％空気の雰囲気下において３７°Ｃで一晩インキユベ
ートされた。次の日、培地は、ヒポキサンチン（１０−
４Ｍ）、アミノプテリン（４ｘ１０−７Ｍ＞およびチミ
ジン（１゜６Ｘ１０−５＞を添加することによって首尾
よく雑種形成された細胞に関して選択的とされ、この後
、細胞は、９６０コの微小力価ウェル（コースタ−、デ
ータ パッケージング、マサチューセッツ州ケンブリッ
ジ［Ｃｏ５ｔｅｒ、 ［）ａｔａ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ
、 Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、 Ｈａ、］〉中に部分標本化
された。２週間後、５７５コのウェルが増殖を示し、そ
して５９コのウェルからの上澄流体が抗フィブリノーゲ
ンレセプター活性に関するふるいわけ法（下記参照のこ
と。
細胞をあわせてペレット化し、該ペレットはＲＰＭＩ培
地中の３５％ポリエチレングリコール２戴に穏やかに懸
濁されそして細胞は直ちに２２°Ｃにて５００ＸＣ］で
６分間遠心分離された。溶液は次にＲＰＭｌ、１６４０
を用いて９％ポリエチレングリコールへと希釈され、Ｉ
ＩＩＩＩＪ２！は再懸濁され、そして直ちに２２°Ｃに
て２３０ＸＣ１で６分間遠心分離された。上澄流体は、
次に吸い出され、そして融合細胞はＲＰＭ１１６４ｏ＠
地中に懸濁され、そして２０％胎児ウシ血清および１０
％ １０９培地（ナショナル コレクション オブ タ
イプカルチャーズ［ＮａｔｉＯｎａｌ Ｃｏ１１ｅｃｔ
ｉｏｎ ｏｆ ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅｓ］ ）を付加
された。細胞はフラスコ中に入れられ、５％ＣＯ２，９
５％空気の雰囲気下において３７°Ｃで一晩インキユベ
ートされた。次の日、培地は、ヒポキサンチン（１０−
４Ｍ）、アミノプテリン（４ｘ１０−７Ｍ＞およびチミ
ジン（１゜６Ｘ１０−５＞を添加することによって首尾
よく雑種形成された細胞に関して選択的とされ、この後
、細胞は、９６０コの微小力価ウェル（コースタ−、デ
ータ パッケージング、マサチューセッツ州ケンブリッ
ジ［Ｃｏ５ｔｅｒ、 ［）ａｔａ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ
、 Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、 Ｈａ、］〉中に部分標本化
された。２週間後、５７５コのウェルが増殖を示し、そ
して５９コのウェルからの上澄流体が抗フィブリノーゲ
ンレセプター活性に関するふるいわけ法（下記参照のこ
と。
）において陽性であった。＠養におけるざらに２週間の
後、陽性のクローンは２４−微小力価皿（コースタ−）
に移され、アミノプリテンをなくす以外は上記したもの
と同じ培地で使用された。
後、陽性のクローンは２４−微小力価皿（コースタ−）
に移され、アミノプリテンをなくす以外は上記したもの
と同じ培地で使用された。
クローンは拡張され、そして抗フィブリノーゲンレセプ
ター抗体を産生することを続けた細胞は、９０％胎児ウ
シ血清−１０％ＤＭＳＯ中に懸濁されそして液体窒素中
で冷凍された。このクローンは、限界希釈技術およびソ
フト寒天培地での増殖の双方によって、単クローン性を
保証するために副次クローニングされた。
ター抗体を産生することを続けた細胞は、９０％胎児ウ
シ血清−１０％ＤＭＳＯ中に懸濁されそして液体窒素中
で冷凍された。このクローンは、限界希釈技術およびソ
フト寒天培地での増殖の双方によって、単クローン性を
保証するために副次クローニングされた。
７Ｅ３抗体に富む腹水は、予めプリスタン処理されたＢ
ＡＢＬ／Ｃｖウスの、０．１５ＭＮａＣρ、１０ｍＭリ
ン酸ナトリウム、ｐＨ７，４（ＰＢＳ）中で２度洗浄さ
れた５Ｘ１０６ハイプリツド細胞での腹腔内的注射によ
って調製された。
ＡＢＬ／Ｃｖウスの、０．１５ＭＮａＣρ、１０ｍＭリ
ン酸ナトリウム、ｐＨ７，４（ＰＢＳ）中で２度洗浄さ
れた５Ｘ１０６ハイプリツド細胞での腹腔内的注射によ
って調製された。
実施例２
れるべき上澄培養培地（または腹水）３５μ９が、丸底
微小力価プレート（リンプロ ケミカル カンパニー、
コネチカット州ハムデン［ＬｉｎｂｒＯＣｈｅｍｉｃａ
ｌ Ｃｏ、、 Ｈａｍｄｅｎ、 Ｃｔ、 ］ ）のウ
ェル中にいっしょにされて２〜６０分間インキュベート
された。
微小力価プレート（リンプロ ケミカル カンパニー、
コネチカット州ハムデン［ＬｉｎｂｒＯＣｈｅｍｉｃａ
ｌ Ｃｏ、、 Ｈａｍｄｅｎ、 Ｃｔ、 ］ ）のウ
ェル中にいっしょにされて２〜６０分間インキュベート
された。
次にフィブリノーゲンを被覆したビーズの懸濁液５μｇ
が添加され、そしてプレートは２ Ｂ Ｏｒａｍで５分
間回転器（テカター■、アメリカン サイエンティフィ
ック プロダクツ、ニューシャーシー州エディソン［Ｔ
ｅｋａｔｏｒ Ｖ、 Ａｍｅｒｉｃａｎ ５ｃｉｅｎｔ
ｉｔｉｃ Ｐｒ０ｄＵＣｔＳ、 Ｅｄｉｓｏｎ、 Ｎ、
Ｊ、 ］ ）において混合された。ウェルは、拡大ミラ
ー器具（コーク マイクロティツタ−システム、ダイナ
チック ラボラトリーズ インニーポレーテッド、バー
ジニア州７レキサンドリ７ ［Ｃｏｏｋｅ Ｈｉｃｒｏ
ｔｉｔｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ。
が添加され、そしてプレートは２ Ｂ Ｏｒａｍで５分
間回転器（テカター■、アメリカン サイエンティフィ
ック プロダクツ、ニューシャーシー州エディソン［Ｔ
ｅｋａｔｏｒ Ｖ、 Ａｍｅｒｉｃａｎ ５ｃｉｅｎｔ
ｉｔｉｃ Ｐｒ０ｄＵＣｔＳ、 Ｅｄｉｓｏｎ、 Ｎ、
Ｊ、 ］ ）において混合された。ウェルは、拡大ミラ
ー器具（コーク マイクロティツタ−システム、ダイナ
チック ラボラトリーズ インニーポレーテッド、バー
ジニア州７レキサンドリ７ ［Ｃｏｏｋｅ Ｈｉｃｒｏ
ｔｉｔｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ。
Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、 Ｉ
ｎｃ、、 Ａｌｅｘａｎｄｒｉａ、 Ｖａ、コ）の
手助けのちとに底部より観察された。細胞を増殖するた
めに用いられなかった、培養培地を含有するウェルは、
ビーズの顕著な凝集（４＋と評価される）を示し、一方
、陽性クローンからの上澄培養培地おるいはマウス腹水
は凝集を阻止し、より低い読み（Ｏ〜３＋）となった。
ｎｃ、、 Ａｌｅｘａｎｄｒｉａ、 Ｖａ、コ）の
手助けのちとに底部より観察された。細胞を増殖するた
めに用いられなかった、培養培地を含有するウェルは、
ビーズの顕著な凝集（４＋と評価される）を示し、一方
、陽性クローンからの上澄培養培地おるいはマウス腹水
は凝集を阻止し、より低い読み（Ｏ〜３＋）となった。
実施例３
抗体精製
培養株上澄液は、４°Ｃて５０％飽和硫酸アンモニウム
で沈澱され、Ｏ，１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、Ｉ）
Ｈ８，０中にこれらの最初の容量の１７２０〜１／１０
に再懸濁された。同じ緩衝液に対する透析の後、試料は
リン酸緩衝液で平衡化されている（１ノン酸緩衝液およ
びクエン酸緩衝液、ｐｆ−Ｉ ３ 。
で沈澱され、Ｏ，１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、Ｉ）
Ｈ８，０中にこれらの最初の容量の１７２０〜１／１０
に再懸濁された。同じ緩衝液に対する透析の後、試料は
リン酸緩衝液で平衡化されている（１ノン酸緩衝液およ
びクエン酸緩衝液、ｐｆ−Ｉ ３ 。
○で洗ン争された１多）タンノマクＭＡ−セファロース
ＣＬ−４８の０．８Ｘ １５．９ｃｍカラムへ適用され
た。カラムは、リン酸緩衝液を用いて、溶離液の光学濃
度かベースラインにもどるまで溶離され、この後、段階
的な溶離が、エイら［Ｅｙ ｅｔ ａｔ、 ］（イイム
ノミミス１〜リー、１５． ４２９ （１９７８年）［
１ｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１５． ４２９ （
１９７８） ］ ）によって述べられるように、ｏ ｆ
−Ｉ ６ 、○、４，５．３，５、および３．０の０．
１Ｍクエン酸緩衝液を用いて行なわれた。７Ｅ３免疫グ
ロブリンは、ｐＨ６゜０ｔ″溶離した。タンパク質溶離
は２８０ｒ１ｍでの光学濃度によって監視され、そして
適当な分画がプールされそして０．０５％アジ酸ナトリ
ウムを含有するＴ−３に対して透析された。抗体濃度は
２８０ｎｍでの吸収によって評価され、△１％−１５と
推定された。
ＣＬ−４８の０．８Ｘ １５．９ｃｍカラムへ適用され
た。カラムは、リン酸緩衝液を用いて、溶離液の光学濃
度かベースラインにもどるまで溶離され、この後、段階
的な溶離が、エイら［Ｅｙ ｅｔ ａｔ、 ］（イイム
ノミミス１〜リー、１５． ４２９ （１９７８年）［
１ｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１５． ４２９ （
１９７８） ］ ）によって述べられるように、ｏ ｆ
−Ｉ ６ 、○、４，５．３，５、および３．０の０．
１Ｍクエン酸緩衝液を用いて行なわれた。７Ｅ３免疫グ
ロブリンは、ｐＨ６゜０ｔ″溶離した。タンパク質溶離
は２８０ｒ１ｍでの光学濃度によって監視され、そして
適当な分画がプールされそして０．０５％アジ酸ナトリ
ウムを含有するＴ−３に対して透析された。抗体濃度は
２８０ｎｍでの吸収によって評価され、△１％−１５と
推定された。
実施例４
放射線ヨウ素での抗体標識化
７Ｅ３抗体の１００μ０に対し、最初に放射性ヨウ化物
（Ｉ）そして次に冷却ヨウ化ナトリウムが、０．５の抗
体に対するヨウ化物のモル比を得るように添加された。
（Ｉ）そして次に冷却ヨウ化ナトリウムが、０．５の抗
体に対するヨウ化物のモル比を得るように添加された。
クロロアミン下の５μΩが次に添加され、そして反応は
、リン酸緩衝液（ｐＨ７，０＞中で２００μΩの全容量
において１〜３分間の間行なわれ、この後ヨウ素化タン
パク貿はＰ−６ゲル（バイオレット ラボラトリーズ
インニーボレーテッド、カリフォルニア州すッチモンド
［ＢｉｏＲｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、 Ｉｎｃ
、、 Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、 Ｃａ、 ］ ）あるいはＧ
−２５ゲル（）７ラマシア ファイン ケミカルズ、ニ
ューシャーシー州 ビス力タウエイ［Ｐｈａｒｌｌｌａ
Ｃｉａ Ｆｉｎｅ ＣｈｅｍｉＣａｌＳ、 Ｐｉｓｃａ
ｔａｗａｙ、 Ｎ、Ｊ、］ ）にあけるクロマトグラフ
ィーによってＴ解離ヨウ化物から分離された。標識化収
率は、２０〜３００μＣｉ／μＱの範囲の比活性で、３
０〜８０％でめった。標識化の後の抗体の完全さは、ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動およびフィブリノーゲン
被覆ビーズ検定の双方によって評価され、そして遊離ヨ
ウ化物からの結合ヨウ化物の分離の効率は、１０％トリ
クロロ酢酸のとの反応後の放射能の沈澱性によって判断
された。
、リン酸緩衝液（ｐＨ７，０＞中で２００μΩの全容量
において１〜３分間の間行なわれ、この後ヨウ素化タン
パク貿はＰ−６ゲル（バイオレット ラボラトリーズ
インニーボレーテッド、カリフォルニア州すッチモンド
［ＢｉｏＲｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、 Ｉｎｃ
、、 Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、 Ｃａ、 ］ ）あるいはＧ
−２５ゲル（）７ラマシア ファイン ケミカルズ、ニ
ューシャーシー州 ビス力タウエイ［Ｐｈａｒｌｌｌａ
Ｃｉａ Ｆｉｎｅ ＣｈｅｍｉＣａｌＳ、 Ｐｉｓｃａ
ｔａｗａｙ、 Ｎ、Ｊ、］ ）にあけるクロマトグラフ
ィーによってＴ解離ヨウ化物から分離された。標識化収
率は、２０〜３００μＣｉ／μＱの範囲の比活性で、３
０〜８０％でめった。標識化の後の抗体の完全さは、ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動およびフィブリノーゲン
被覆ビーズ検定の双方によって評価され、そして遊離ヨ
ウ化物からの結合ヨウ化物の分離の効率は、１０％トリ
クロロ酢酸のとの反応後の放射能の沈澱性によって判断
された。
上記の手順に従い、Ｎａ ＩｉるいはＮａ １３１
丁は、同様の生成品を得るためにＮａ Ｉの代わり
用いられ１胃る。
丁は、同様の生成品を得るためにＮａ Ｉの代わり
用いられ１胃る。
実施例５
インジウムでの抗体標識化
”１１ｎ（６）での標識化はＤＴＰＡ （ジエヂレント
リアミノペンタ酢酸）環状無水物法によって行なわれた
。７Ｅ３抗体に対する無水物の比は５０：１でありそし
て未接合ＤＴＰＡの除去は０゜０１Ｍペベスー０．１５
Ｍ塩化ナトリウム緩衝液。
リアミノペンタ酢酸）環状無水物法によって行なわれた
。７Ｅ３抗体に対する無水物の比は５０：１でありそし
て未接合ＤＴＰＡの除去は０゜０１Ｍペベスー０．１５
Ｍ塩化ナトリウム緩衝液。
ＤＨ７に対しての脱気的な透析によって達成された。標
識化は緩衝液１／ｎｌ中でＤＴＰＡ−７２３抗体接合体
１００〜３００μに対して１１１１ｎ−ＣΩ３ （研究
用板、メディーフイジイツクス、インニーボレーテッド
、カリフォルニア州すツチンモンド［）ｌｅｄｉ−Ｐｈ
ｙｓｉｃｓ、 Ｉｎｃ、、 Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、 Ｃａ
、 ］ ）３〜１ｏｍｃｉを添加し、そして３７°Ｃで
３０分間インキュベートすることによって行なわれた。
識化は緩衝液１／ｎｌ中でＤＴＰＡ−７２３抗体接合体
１００〜３００μに対して１１１１ｎ−ＣΩ３ （研究
用板、メディーフイジイツクス、インニーボレーテッド
、カリフォルニア州すツチンモンド［）ｌｅｄｉ−Ｐｈ
ｙｓｉｃｓ、 Ｉｎｃ、、 Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、 Ｃａ
、 ］ ）３〜１ｏｍｃｉを添加し、そして３７°Ｃで
３０分間インキュベートすることによって行なわれた。
未結合インジウムはＰ６あるいはＧ−２５の（０゜７Ｘ
１５Ｃｍ）カラムを通しての溶出によって除去された。
１５Ｃｍ）カラムを通しての溶出によって除去された。
生成物は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって特
性づけされ、そしてフィブリノーゲン被覆ビーズ凝集試
験によって検定された。標識化収率は、６０〜８０％の
範囲でありそして比活性は、抗体分子当り０．２インジ
ウム原子よりも少ない置換レベルで１０〜４０ｔｌＣｉ
／μｑであった。
性づけされ、そしてフィブリノーゲン被覆ビーズ凝集試
験によって検定された。標識化収率は、６０〜８０％の
範囲でありそして比活性は、抗体分子当り０．２インジ
ウム原子よりも少ない置換レベルで１０〜４０ｔｌＣｉ
／μｑであった。
実施例６
生体内評価
１２３Ｉ −７Ｅ ３抗体および１１’Ｉｎ−ＤＴＰＡ
−７Ｅ３抗体の評価は、雌性雑種成人（体重２０〜３０
ｋ（］）において行なわれた。ベンドパルビタール麻酔
が用いられそして実験を通してペパリンは用いられなか
った。はとんどの映像化実験は、八〇Ｄ−Ａ （６：
１ ）で抗凝固化された血液１５０ｄと１２３Ｉ −７
Ｅ ３抗体（３，０ｍＣｉ ）または１１’Ｉ ｎ−Ｄ
ＴＰＡ＝７Ｅ３抗体（３〜３．５ｍｃｉ）を２２°Ｃで
１時間予めインキュベートすることによって得られた標
識された血小板の注入の後に行なわれた。血液クリアラ
ンス（血液浄化率）研究は正常イヌにおいて１２３Ｉ−
７Ｅ３抗体のｏ、５ｍｃ；の投与量で行なわれた。ごく
わずかの映像化実験は、予めの接種なしに行なわれた。
−７Ｅ３抗体の評価は、雌性雑種成人（体重２０〜３０
ｋ（］）において行なわれた。ベンドパルビタール麻酔
が用いられそして実験を通してペパリンは用いられなか
った。はとんどの映像化実験は、八〇Ｄ−Ａ （６：
１ ）で抗凝固化された血液１５０ｄと１２３Ｉ −７
Ｅ ３抗体（３，０ｍＣｉ ）または１１’Ｉ ｎ−Ｄ
ＴＰＡ＝７Ｅ３抗体（３〜３．５ｍｃｉ）を２２°Ｃで
１時間予めインキュベートすることによって得られた標
識された血小板の注入の後に行なわれた。血液クリアラ
ンス（血液浄化率）研究は正常イヌにおいて１２３Ｉ−
７Ｅ３抗体のｏ、５ｍｃ；の投与量で行なわれた。ごく
わずかの映像化実験は、予めの接種なしに行なわれた。
はとんどの実験において、血液は遠心分離され（１８０
０ｘｇ、２２°Ｃで９分間）、未結合抗体を含む血漿が
除去され、そして細胞が食塩水と八〇Ｄ−Ａの６／１混
合物中に再懸濁された。上記の手順に従い、 Ｉｎ標
識された７Ｅ３抗体は１２５Ｉ −７Ｅ ３抗体に代わ
って用いられ得る。ごくわずかの映像化実験は、予めの
インキュベーションステップなしに行なわれ、ここにお
いて抗体は生体内的に血小板を標識するために静脈内的
に注入され、陽性の結果がまたこの技術によっても得ら
れた。
０ｘｇ、２２°Ｃで９分間）、未結合抗体を含む血漿が
除去され、そして細胞が食塩水と八〇Ｄ−Ａの６／１混
合物中に再懸濁された。上記の手順に従い、 Ｉｎ標
識された７Ｅ３抗体は１２５Ｉ −７Ｅ ３抗体に代わ
って用いられ得る。ごくわずかの映像化実験は、予めの
インキュベーションステップなしに行なわれ、ここにお
いて抗体は生体内的に血小板を標識するために静脈内的
に注入され、陽性の結果がまたこの技術によっても得ら
れた。
生体内実験を仮装するために、放射標識された７Ｅ３抗
体のヒト血餅中への取込みの試験管内研究が行なわれた
。４０％クエン酸三ナトリウム０゜０１容量で抗凝固化
された全面の２つの１威試料か、 Ｉｎ−ＤＴＰＡ−
７Ｅ３抗体０．１μｃＩ／ｍ１と３７°Ｃで３０分間イ
ンキュベートされ、そしてその後一方の試料は遠心分離
されそして細胞分画と共に沈澱している放射能のパーセ
ンテージが測定された。二番目の部分標本は、ウシトロ
ンビン（１ＬＪ／７！、パーク−ディビス、ニューシャ
ーシー州モーリス プレインズ［Ｐａｒｋｅ−Ｄａｖ
ｉｓ、 Ｈｏｒｒｉｓ Ｐｌａｉｎｓ、 Ｎ、Ｊ、］を
含む管中に入れられていた抗凝固化されていない全血１
ｄに添加され、これは凝血するように３７℃で３０分間
放置され、そして血餅は０．１５Ｍ ＮａＣｎ中で２
回洗浄されガンマ線分光計中で計数された。
体のヒト血餅中への取込みの試験管内研究が行なわれた
。４０％クエン酸三ナトリウム０゜０１容量で抗凝固化
された全面の２つの１威試料か、 Ｉｎ−ＤＴＰＡ−
７Ｅ３抗体０．１μｃＩ／ｍ１と３７°Ｃで３０分間イ
ンキュベートされ、そしてその後一方の試料は遠心分離
されそして細胞分画と共に沈澱している放射能のパーセ
ンテージが測定された。二番目の部分標本は、ウシトロ
ンビン（１ＬＪ／７！、パーク−ディビス、ニューシャ
ーシー州モーリス プレインズ［Ｐａｒｋｅ−Ｄａｖ
ｉｓ、 Ｈｏｒｒｉｓ Ｐｌａｉｎｓ、 Ｎ、Ｊ、］を
含む管中に入れられていた抗凝固化されていない全血１
ｄに添加され、これは凝血するように３７℃で３０分間
放置され、そして血餅は０．１５Ｍ ＮａＣｎ中で２
回洗浄されガンマ線分光計中で計数された。
実験的な血栓は銅コイルの総頚動脈、肺動脈および大腿
動脈、ならびに右心室中への移動カテーテル配置によっ
て誘発された。血栓は１１１■ｎ−ＤＴＰＡ−７Ｅ３抗
体の注入の１．２，３，４゜８および４８時間前に誘発
された。映像（注入のＯ〜０．５時間後）は、ガンマ−
１１システム［Ｇａｍｍａ−１１ｓｙｓｔｅｍ ］
（ディジタル エクイップメント コーポレーション、
マサチューセッツ州つｔルサム［０１ｇ１ｔａｌ Ｅｑ
ｕｉｐｍｅｎｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、 Ｗａｌｔ
ｈａｍ、 Ｍａｌ ）でインターフェイスされた広視野
ガンマ線カメラで、６４Ｘ６４マトリツクスを用いて得
られた。血栓対バックグラウンド、血栓対血液貯留比が
算出された。血液クリアランス測定に関しては、試料は
注入後、１．２．３，４．５゜１０．１５，２０，３０
，４５．６０，９０，１２０および１８０分ならびに２
４時間で得られた。
動脈、ならびに右心室中への移動カテーテル配置によっ
て誘発された。血栓は１１１■ｎ−ＤＴＰＡ−７Ｅ３抗
体の注入の１．２，３，４゜８および４８時間前に誘発
された。映像（注入のＯ〜０．５時間後）は、ガンマ−
１１システム［Ｇａｍｍａ−１１ｓｙｓｔｅｍ ］
（ディジタル エクイップメント コーポレーション、
マサチューセッツ州つｔルサム［０１ｇ１ｔａｌ Ｅｑ
ｕｉｐｍｅｎｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、 Ｗａｌｔ
ｈａｍ、 Ｍａｌ ）でインターフェイスされた広視野
ガンマ線カメラで、６４Ｘ６４マトリツクスを用いて得
られた。血栓対バックグラウンド、血栓対血液貯留比が
算出された。血液クリアランス測定に関しては、試料は
注入後、１．２．３，４．５゜１０．１５，２０，３０
，４５．６０，９０，１２０および１８０分ならびに２
４時間で得られた。
Ｏ〜１，１〜２，２〜３および３〜４時間の期間の尿試
料が放射能に関して検定された。結果は全血官選（体重
の７％）当りの注入された放射能のパーセンテージある
いは総尿容量中に含まれた注入投与量のパーセンテージ
として種々に表わされた。実験の終了時に動物はベンド
パルビタールの１２〜２０ ｍｇ／ｋＯの注入により屠
殺された。
料が放射能に関して検定された。結果は全血官選（体重
の７％）当りの注入された放射能のパーセンテージある
いは総尿容量中に含まれた注入投与量のパーセンテージ
として種々に表わされた。実験の終了時に動物はベンド
パルビタールの１２〜２０ ｍｇ／ｋＯの注入により屠
殺された。
実施例７
結合は、４０％クエン酸ナトリウム０．０１容量中に集
められた全面から調製されたＰＲＰ （血小板濃厚血漿
３Ｘ１０”血漿／リットル）を用いて２２°Ｃで評価さ
れた。 ｌ−７Ｅ３抗体の微量（約０．２ｍＬｔｑ
／ｄの最終濃度）が０．２ｄＰＲＰに添加された。平衡
結合状態を定めるために、２＠の０．１ｄ部分標本が、
シリコン オイル（コンタ−ケミカル カンパニー、イ
ンコ−ボレーチット、マサチューセッツ州 ノースリー
プ−ｒン’；ｆ ［Ｃｏｎｔｏｕｒ Ｃｔ）ｅｍｉｃａ
ｌ Ｃｏ、、 Ｉｎｃ、、 ＮｏｒｔｈＲｅａｄｉｎｇ
、晶］、比重１．０４０＞ｃ％るいは３０％スクロース
上へ０．５〜４時間後に層とされた。
められた全面から調製されたＰＲＰ （血小板濃厚血漿
３Ｘ１０”血漿／リットル）を用いて２２°Ｃで評価さ
れた。 ｌ−７Ｅ３抗体の微量（約０．２ｍＬｔｑ
／ｄの最終濃度）が０．２ｄＰＲＰに添加された。平衡
結合状態を定めるために、２＠の０．１ｄ部分標本が、
シリコン オイル（コンタ−ケミカル カンパニー、イ
ンコ−ボレーチット、マサチューセッツ州 ノースリー
プ−ｒン’；ｆ ［Ｃｏｎｔｏｕｒ Ｃｔ）ｅｍｉｃａ
ｌ Ｃｏ、、 Ｉｎｃ、、 ＮｏｒｔｈＲｅａｄｉｎｇ
、晶］、比重１．０４０＞ｃ％るいは３０％スクロース
上へ０．５〜４時間後に層とされた。
これらは次に、微量遠心分離機（ベックマン インスツ
ルメンツ、インニーボレーテツド、カリフｙｔＪ’ｖニ
ア州イルビン［Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ
ｓ、 Ｉｎｃ、、 Ｉｒｖｉｎｅ Ｃａ］ ）において
１２，０ＯＯＸＣＩで２分間２２”Ｃで遠心分離され、
結合していない抗体から結合抗体を有する血小板を分離
した。血小板ペレッ１〜を含有するチップはイヌ爪切り
で切り取られ、そしてチップと上澄液の双方が計数され
た。
ルメンツ、インニーボレーテツド、カリフｙｔＪ’ｖニ
ア州イルビン［Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ
ｓ、 Ｉｎｃ、、 Ｉｒｖｉｎｅ Ｃａ］ ）において
１２，０ＯＯＸＣＩで２分間２２”Ｃで遠心分離され、
結合していない抗体から結合抗体を有する血小板を分離
した。血小板ペレッ１〜を含有するチップはイヌ爪切り
で切り取られ、そしてチップと上澄液の双方が計数され
た。
結合は、非活性化血小板において、２時間までに関して
増加された。
増加された。
実施例８
緩衝液−およびＡＤＰ−処理血小板
血小板）層厚血漿が４０％クエン酸ナトリウム０゜０１
容滑で抗凝固化された血液から調製されそしてゲル濾過
された。ゲル濾過された血小板（ＧＥＰ）（３，３０〜
３．６５Ｘ１０１１血小板／リツｌヘル）の部分標本（
０，２０ｆ＞が、緩衝液（０゜１５Ｍ Ｎａ（１，０
，０１Ｍへペス、ｐＨ７゜４）２２μＱとあるいはＡＤ
Ｐ （最終１ｇ度５μＭ）と２２°Ｃで３０秒間インキ
ュベートされそして次に以下に示す最終濃度を達するた
めの種々の濃度の１２５１−７重３抗体２０μΩとイン
キュベートされた。平衡が形成されるには短がすぎる時
間である５分間の後に、２重の０．１ｍ試料が３０％ス
クロース０．１ｍｌ上に層とされ、そして遊離抗体を血
小板に結合した抗体から分離するために遠心分離した。
容滑で抗凝固化された血液から調製されそしてゲル濾過
された。ゲル濾過された血小板（ＧＥＰ）（３，３０〜
３．６５Ｘ１０１１血小板／リツｌヘル）の部分標本（
０，２０ｆ＞が、緩衝液（０゜１５Ｍ Ｎａ（１，０
，０１Ｍへペス、ｐＨ７゜４）２２μＱとあるいはＡＤ
Ｐ （最終１ｇ度５μＭ）と２２°Ｃで３０秒間インキ
ュベートされそして次に以下に示す最終濃度を達するた
めの種々の濃度の１２５１−７重３抗体２０μΩとイン
キュベートされた。平衡が形成されるには短がすぎる時
間である５分間の後に、２重の０．１ｍ試料が３０％ス
クロース０．１ｍｌ上に層とされ、そして遊離抗体を血
小板に結合した抗体から分離するために遠心分離した。
第１表
１．０ ２１００（１８，６） ５６００（４４
，２）３．８ ５２００（１３，２） １４３０
０（３６，５）６．７ １０１００（１４，６）
２１３００（３０，９）１３．６ １７９００（
１２，８） ２５５００（１８，２）実施例９ 血小板をＡＤＰで予め刺激することの効果血小板濃厚血
漿（２，８４Ｘ１０”血小板／リットル）は４０％クエ
ン酸ナトリウム０．０１容吊で抗凝固化された血液から
調製された。０．２ｍｌの部分標本が緩衝液（０，１５
Ｍ ＮａＣΩ、０．０１Ｍヘペス、ｐＨ７，４）ある
いはＡＤＰ（最終濃度５μＭ）と２２°Ｃで指示された
時間インキュベートされ、そして次に１２５Ｉ −７６
３抗体（＠終濃度０．７μＱ／ｄ＞１μΩと２２℃で２
分間インキュベートされた。遊離抗体と血小板結合抗体
が、３０％スクロース０．１戒を通しての２車のＯ１ｄ
試料の遠心分離によって分離されそして血小板に結合し
た抗体の但が測定された。
，２）３．８ ５２００（１３，２） １４３０
０（３６，５）６．７ １０１００（１４，６）
２１３００（３０，９）１３．６ １７９００（
１２，８） ２５５００（１８，２）実施例９ 血小板をＡＤＰで予め刺激することの効果血小板濃厚血
漿（２，８４Ｘ１０”血小板／リットル）は４０％クエ
ン酸ナトリウム０．０１容吊で抗凝固化された血液から
調製された。０．２ｍｌの部分標本が緩衝液（０，１５
Ｍ ＮａＣΩ、０．０１Ｍヘペス、ｐＨ７，４）ある
いはＡＤＰ（最終濃度５μＭ）と２２°Ｃで指示された
時間インキュベートされ、そして次に１２５Ｉ −７６
３抗体（＠終濃度０．７μＱ／ｄ＞１μΩと２２℃で２
分間インキュベートされた。遊離抗体と血小板結合抗体
が、３０％スクロース０．１戒を通しての２車のＯ１ｄ
試料の遠心分離によって分離されそして血小板に結合し
た抗体の但が測定された。
（以下余白）
第２表
緩衝液 ＡＤＰ （５μＭ）
５秒 １９６０′ ５秒 ３５７０２０分 １７
２０ １５秒 ３７４０３０秒 ３５３０ １分 ３２９０ ３分 ３２１０ ６分 ３１２０ １０分 ２７９０ ２０分 ２３２０ “血小板当りの結合の１２５Ｉ −７Ｅ ３分子（二重
測定の平均） 実施例１０ ゲル濾過された血小板への１２５Ｉ−１０Ｅ５および１
２５■−７重３抗体の結合の速度にあけるＡＤＰ刺激の
効果 ＰＰＰは、４０％クエン酸ナトリウム０．０１容量中に
集められた血液から調製され、そして次にＨＢＭＴ緩衝
液中にゲル症過された。）ｑられた懸濁液（３，３１〜
３．６５ｘ１０”血小板／リットル）の部分標本（０，
２ｄ）は、０．１５ＭＮａＣＱ、Ｏ，Ｃ）１Ｍへペス、
ｌ１７．４緩衝液２２μΩ必るいは同様の緩衝液中に調
製された１００μＭ ＡＤＰ２２μΩと３０分間イン
キ１ベートされた。亜飽和濃度の１２５１−１０Ｅ５抗
体（２μΩ、最終濃度２．５μｑ／ｍＩ！＞あるいは１
２５■−７重３抗体（４μΩ、最終濃度１．０μΩ／ｄ
＞が次に添加され、そして指示された時間で２つの０．
１ｍ１部分標本がそれぞれの反応混合物から除かれ、３
０％スクロース０．Ｍ上に層とされそして１２０００Ｘ
Ωで３〜４分間遠心分離された。血小板ペレットを含有
するチップが切り取られ、そしてチップと上澄液の双方
の放射能が検定された。結合のパーセンテージに関する
２重の値の大部分は、５％未満程度それぞれ使方のもの
とは異なるものであり、最大の違いは１１％であった。
２０ １５秒 ３７４０３０秒 ３５３０ １分 ３２９０ ３分 ３２１０ ６分 ３１２０ １０分 ２７９０ ２０分 ２３２０ “血小板当りの結合の１２５Ｉ −７Ｅ ３分子（二重
測定の平均） 実施例１０ ゲル濾過された血小板への１２５Ｉ−１０Ｅ５および１
２５■−７重３抗体の結合の速度にあけるＡＤＰ刺激の
効果 ＰＰＰは、４０％クエン酸ナトリウム０．０１容量中に
集められた血液から調製され、そして次にＨＢＭＴ緩衝
液中にゲル症過された。）ｑられた懸濁液（３，３１〜
３．６５ｘ１０”血小板／リットル）の部分標本（０，
２ｄ）は、０．１５ＭＮａＣＱ、Ｏ，Ｃ）１Ｍへペス、
ｌ１７．４緩衝液２２μΩ必るいは同様の緩衝液中に調
製された１００μＭ ＡＤＰ２２μΩと３０分間イン
キ１ベートされた。亜飽和濃度の１２５１−１０Ｅ５抗
体（２μΩ、最終濃度２．５μｑ／ｍＩ！＞あるいは１
２５■−７重３抗体（４μΩ、最終濃度１．０μΩ／ｄ
＞が次に添加され、そして指示された時間で２つの０．
１ｍ１部分標本がそれぞれの反応混合物から除かれ、３
０％スクロース０．Ｍ上に層とされそして１２０００Ｘ
Ωで３〜４分間遠心分離された。血小板ペレットを含有
するチップが切り取られ、そしてチップと上澄液の双方
の放射能が検定された。結合のパーセンテージに関する
２重の値の大部分は、５％未満程度それぞれ使方のもの
とは異なるものであり、最大の違いは１１％であった。
比較を容易とするために、データは、それぞれの抗体に
関し、結合した添加放射能の最大部分のパーセンテージ
として表わされ、後者のもの（ＡＤＰ処理）は、７重３
抗体に関し７４゜１％および１０Ｅ５抗体に関し５０％
である。１血小板当りに結合した全７Ｅ３抗体および１
０Ｅ５抗体における相違は投入濃度および親和性におけ
る相違を反映するものである。１０Ｅ５抗体のデータは
２つの別々の実験からの平均であり、７重５抗体のデー
タはＡＤＰ処理されたＧＦＰへの７２３抗体結合の高め
られた速度を示す１１の別々の実験の１つからのもので
あった。 ｌ−１０Ｅ５抗体のより低い濃度（０，７
μＣｌ／ｄ＞を用いる他の実験において、ＡＤＰ活性化
はまた、結合の速度を変えることに失敗した。
関し、結合した添加放射能の最大部分のパーセンテージ
として表わされ、後者のもの（ＡＤＰ処理）は、７重３
抗体に関し７４゜１％および１０Ｅ５抗体に関し５０％
である。１血小板当りに結合した全７Ｅ３抗体および１
０Ｅ５抗体における相違は投入濃度および親和性におけ
る相違を反映するものである。１０Ｅ５抗体のデータは
２つの別々の実験からの平均であり、７重５抗体のデー
タはＡＤＰ処理されたＧＦＰへの７２３抗体結合の高め
られた速度を示す１１の別々の実験の１つからのもので
あった。 ｌ−１０Ｅ５抗体のより低い濃度（０，７
μＣｌ／ｄ＞を用いる他の実験において、ＡＤＰ活性化
はまた、結合の速度を変えることに失敗した。
特許出願人 ザ リサーチ ファウンデーションオブ
ステート ユニヴアシティ オブ ニューヨーク （ばか２る）
ステート ユニヴアシティ オブ ニューヨーク （ばか２る）
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１）マウス骨髄腫系からの細胞と、あらかじめヒト血
小板で免疫処置されたマウスからの脾細胞との融合によ
って形成されたハイブリドーマによって産生され、 ａ）正常ヒト血小板とおよびイヌ血小板と容易に反応し
、 ｂ）血小板無力症のヒト血小板またはＧＰＩＩｂ／ＩＩ
Ｉａ複合体がＥＤＴＡで解離されるヒト血小板と反応せ
ず、 ｃ）非活性化血小板とゆっくりと反応し、またＡＤＰ活
性化血小板とより迅速に反応し、そして ｄ）ＡＤＰによって誘発されるフィブリノーゲンの血小
板との相互作用を完全に阻止することを特徴とするＩｇ
Ｇ＿１クラスのモノクローナル抗体。 （２）Ｘ６３−Ａｇ８．６５３ＢＡＬＢ／Ｃマウス骨髄
腫細胞と、あらかじめヒト血小板で免疫処置されたＢＡ
ＬＢ／Ｃマウスからの脾細胞との融合によって形成され
たハイブリドーマから産生されるものである特許請求の
範囲第１項に記載のモノクローナル抗体。 （３）ａ）正常ヒト血小板とおよびイヌ血小板と反応し
、 ｂ）血小板無力症のヒト血小板またはＧＰＩＩｂ／ＩＩ
Ｉａ複合体がＥＤＴＡで解離されるヒト血小板と反応せ
ず、そして ｃ）非活性化血小板とゆっくりと反応し、またＡＤＰ活
性化血小板とより迅速に反応する、モノクローナル抗体
であって、 ｉ）マウスをヒト血小板で免疫処置し、 ｉｉ）該マウスより脾臓を除去し、そして脾細胞の懸濁
液を調製し、 ｉｉｉ）該脾細胞を融合プロモーターの存在下でマウス
骨髄腫細胞と融合させ、 ｉｖ）該融合細胞を別々のウェルにおいて非融合細胞を
支持しない培地中に希釈および培養し、 ｖ）ハイブリドーマを含むそれぞれのウェルをフィブリ
ノーゲンレセプターに対する抗体の存在に関して評価し
、 ｖｉ）上記ａ）、ｂ）およびｃ）の基準に合致する抗体
を産生するハイブリドーマを選択しそしてクローニング
し、 ｖｉｉ）該クローン上の上澄液から抗体を回収する、 ステップにより構成される方法により調製されることを
特徴とするモノクローナル抗体。 （４）ａ）正常ヒト血小板とおよびイヌ血小板と反応し
、 ｂ）血小板無力症のヒト血小板またはＧＰＩＩｂ／ＩＩ
Ｉａ複合体がＥＤＴＡで解離されるヒト血小板と反応せ
ず、そして ｃ）非活性化血小板とゆっくりと反応し、またＡＤＰ活
性化血小板とより迅速に反応する、モノクローナル抗体
であって、 ｉ）マウスをヒト血小板で免疫処置し、 ｉｉ）該マウスより脾臓を除去し、そして脾細胞の懸濁
液を調製し、 ｉｉｉ）該脾細胞を融合プロモーターの存在下でマウス
骨髄腫細胞と融合させ、 ｉｖ）該融合細胞を別々のウェルにおいて非融合細胞を
支持しない培地中に希釈および培養し、 ｖ）ハイブリドーマを含むそれぞれのウェルをフィブリ
ノーゲンレセプターに対する抗体の存在に関して評価し
、 ｖｉ）上記ａ）、ｂ）およびｃ）の基準に合致する抗体
を産生するハイブリドーマを選択しそしてクローニング
し、 ｖｉｉ）該クローンをマウス中へ腹腔内的に移し、そし
て ｖｉｉｉ）所望の抗体を含む悪性腹水または血清を収獲
するステップにより構成される方法により調製されるこ
とを特徴とするモノクローナル抗体。 （５）ハイブリドーマ７Ｅ３をマウス中に注入し、該マ
ウスの悪性腹水または血清から回収することでなる、 ａ）正常ヒト血小板とおよびイヌ血小板と反応し、 ｂ）血小板無力症のヒト血小板またはＧＰＩＩｂ／ＩＩ
Ｉａ複合体がＥＤＴＡで解離されるヒト血小板と反応せ
ず、そして ｃ）非活性化血小板とゆっくりと反応し、またＡＤＰ活
性化血小板とより迅速に反応する、モノクローナル抗体
を調製する方法。 （６）特許請求の範囲第５項に記載の方法により調製さ
れたモノクローナル抗体。 （７）ハイブリドーマ７Ｅ３をマウス中に注入し、該ハ
イブリドーマ上の上澄液から抗体を回収することでなる
、 ａ）正常ヒト血小板とおよびイヌ血小板と反応し、 ｂ）血小板無力症のヒト血小板またはＧＰＩＩｂ／ＩＩ
Ｉａ複合体がＥＤＴＡで解離されるヒト血小板と反応せ
ず、そして ｃ）非活性化血小板とゆっくりと反応し、またＡＤＰ活
性化血小板とより迅速に反応する、モノクローナル抗体
の調製方法。 （８）特許請求の範囲第７項に記載の方法により調製さ
れたモノクローナル抗体。 ａ）ヒト血小板とおよびイヌ血小板と容易に反応し、 ｂ）血小板無力症のヒト血小板またはＧＰＩＩｂ／ＩＩ
Ｉａ複合体がＥＤＴＡで分割されるヒト血小板と反応せ
ず、そして、 ｃ）非活性化血小板とゆっくりと反応し、またＡＤＰ活
性化血小板とより迅速に反応する、放射性標識化モノク
ローナル抗体の調製方法。 （１１）特許請求の範囲第１０項に記載の方法によって
調製された放射性標識化モノクローナル抗体。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US74220885A | 1985-06-07 | 1985-06-07 | |
| US742208 | 1985-06-07 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6230728A true JPS6230728A (ja) | 1987-02-09 |
Family
ID=24983904
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61125964A Pending JPS6230728A (ja) | 1985-06-07 | 1986-06-02 | フイブリノ−ゲン阻止性モノクロ−ナル抗体 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5336618A (ja) |
| EP (1) | EP0206532A3 (ja) |
| JP (1) | JPS6230728A (ja) |
| CA (1) | CA1297815C (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH04501503A (ja) * | 1988-05-18 | 1992-03-19 | セントカー・インコーポレーテツド | 血小板特異的キメラ免疫グロブリン |
| US5877006A (en) * | 1988-05-18 | 1999-03-02 | Centocor, Inc. | DNAs encoding chimeric immunoglobulin light or heavy chains and fragments thereof having variable regions derived from monoclonal antibody 7E3, and vectors and host cells comprising same |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5275812A (en) * | 1985-06-07 | 1994-01-04 | The General Hospital Corporation | Method of treatment for myocardial infarction |
| EP0447489A1 (en) * | 1988-12-01 | 1991-09-25 | Centocor, Inc. | Human platelet-specific antibodies |
| UA37249C2 (uk) * | 1993-11-05 | 2001-05-15 | Сентокор Інк. | Спосіб інгібування стенозу та/або рестенозу (варіанти), спосіб інгібування рестенозу після проведення операції на коронарній артерії у людини (варіанти), спосіб зниження ймовірності виникнення чи запобігання негострих ішемічних ускладнень при ангіопластиці у людини |
| EP1124856A1 (en) | 1998-10-23 | 2001-08-22 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Conformation-specific anti-von willebrand factor antibodies |
| US7317948B1 (en) * | 2002-02-12 | 2008-01-08 | Boston Scientific Scimed, Inc. | Neural stimulation system providing auto adjustment of stimulus output as a function of sensed impedance |
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| CN104768975A (zh) | 2012-08-31 | 2015-07-08 | 北卡罗来纳大学教堂山分校 | 用于增强或抑制胰岛素-样生长因子1(igf-1)的单克隆抗体 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4361509A (en) * | 1981-12-14 | 1982-11-30 | Scripps Clinic And Research Foundation | Ultrapurification of factor VIII using monoclonal antibodies |
-
1986
- 1986-05-15 CA CA000509242A patent/CA1297815C/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-05-23 EP EP86303953A patent/EP0206532A3/en not_active Withdrawn
- 1986-06-02 JP JP61125964A patent/JPS6230728A/ja active Pending
-
1988
- 1988-11-22 US US07/274,627 patent/US5336618A/en not_active Expired - Lifetime
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH04501503A (ja) * | 1988-05-18 | 1992-03-19 | セントカー・インコーポレーテツド | 血小板特異的キメラ免疫グロブリン |
| US5877006A (en) * | 1988-05-18 | 1999-03-02 | Centocor, Inc. | DNAs encoding chimeric immunoglobulin light or heavy chains and fragments thereof having variable regions derived from monoclonal antibody 7E3, and vectors and host cells comprising same |
| US5976532A (en) * | 1988-05-18 | 1999-11-02 | Centocor, Inc. | Method of antithrombotic therapy using anti-GPIIb/IIIa antibodies or fragments thereof, including c7E3 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA1297815C (en) | 1992-03-24 |
| US5336618A (en) | 1994-08-09 |
| EP0206532A3 (en) | 1987-04-01 |
| EP0206532A2 (en) | 1986-12-30 |
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