JPS6242998A - 新規な支持体、その製造及び中間体、オリゴヌクレオチドを合成するためのその使用、並びに支持体に結合した新規なヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、新規な支持体、これら支持体の製造、これに
より得られる新規な中間体、オリゴヌクレオチドを合成
するためのその使用、並びに得られた支持体に結合され
た新規なヌクレオシド及びオリゴヌクレオチドに関する
ものである。

オリゴヌクレオチドを同相で合成するため、多くの支持
体が文献中に既に記載されている。

これら支持体は、たとえば重合体により独特に構成され
、たとえばポリスチレン〔ヌクレイツク・アシド・リサ
ーチ（１９８０）、第８巻〕、珪藻上上で重合されたポ
リアクリルアミド、アクリロイルモルホリド、ポリジメ
チルアクリルアミド〔ヌクレイツク・アシド・リサーチ
、第９（７）巻、第１６９１頁（１９８１））があり、
これは珪藻土ポリアクリルアミドの式 ％式％ これらの支持体は、過度に膨潤しかつ成る種の試薬を保
持する傾向を有するため満足しえないことが判明してい
る。

既に記載されている他の支持体は、無機の性質を有する
。たとえば、支持体： Ｓ　ｉ　−（ＣＩ（２）、−０−ＣＨ２−Ｃ）ｆ−ＣＨ
，、ＱＣ−ＮＰＩ（引、）６ＮＨ。

Ｃ０ｃＨ３ 〔ジャーナル・アメリカン・ケミカル・ソサエティー、
第１０５巻、第６６１頁（１９８３））、又は３−アミ
ノプロピルトリエトキシシラン基により官能化されたシ
リカに基づく支持体を挙げることができ、オリゴヌクレ
オチドを製造するためのホスファイト及びホスホルアミ
ダイト合成におけるその使用がヨーロッパ特許第００３
５７１９号公報に最初に記載された。

しかしながら、この支持体は、ホスホトリエステル合成
に使用すると、特に最初のカップリングにつき低収率を
与える。

本発明の主題は、式（１） ％式％（１） 〔式中、■は官能化されたガラス又は■につき基ルコキ
シシラン基により官能化されたシリカ、珪藻土、ポリテ
トラフルオロエチレン、金属酸化物又はセルロースの微
細ベレットにより構成された物質であり、 ｍは１〜２０の範囲で変化しうる整数であり、Ｘｌ　は
１〜２０の範囲で変化しうる整数であり、又はＤ〜２０
の範囲で変化しうる整数であり、Ａは１〜２０個の炭素
原子を有する線状若しくは分枝アルキル鎖又は３〜１２
個の炭素原子を有する飽和環式基又はフェニル基又は５
若しくは６個の結合を有する複素環式基のいずれかを示
し、 ｙ、は０〜１０の範囲で変化し５る整数であり、かつｙ
′は０〜２０の範囲で変化しうる整数である〕 を有する支持体である。

式（１）において、Ａが線状アルキル鎖であればＡは基
−（α（２）ｎ−で示され、ここでｎは１〜２０の範囲
で変化しうる整数である。

人が分校アルキル鎖であれば、これは１個若しくはそれ
以上のメチル若しくはエチル基で直換された連鎖である
ことが好ましい。たとえば、この種の連鎖の１つとして
は次のものがある：メチルートメタンジイル；メチル−
１エタンジイル−１，２；メチル−１若しくは２プロパ
ンシイ７ｔ／−１゜３；メチル−１，２−プロパンジイ
ル−１，３；又はエチル−１エタンジイル−１２゜ 人が飽和環式基を示す場合、これはシクロプロパン、シ
クロブタン、シクロペンタン、シクロヘキサン、シクロ
ヘプタン、シクロオクタン、シクロノナン、シクロデカ
ン、シクロウンデカン若しくはシクロドデカン基である
ことが好ましい。

Ａが５個若しくは６個の結合を有する複索環式基を示す
場合、これはチアゾリル、ピリジニル、４．５〜ジヒド
ロチアゾリル、オキサシリル、イソキサゾリル、イミダ
ゾリル、ピリミジル若しくはチェニル基であることが好
ましい。

ガラス微小ベレットの場合「官能化された」という用語
は、問題とする基が末端アミノ基を含んで、スルホアミ
ド基を有するものを容易に固定化しうろことを意味する
。

特に本発明は、式： 〔上記式中、ｍ、ｘ、、ｘ、ｙ、、Ａ、ｙは上記の意味
を有する〕 に対応する式（１）を有する支持体に関するものである
。

さらに本発明は、特に式（１）において■が均一な粒子
寸法を有する支持体であるような支持体に関するもので
ある。

たとえば、直径が２０μｍかつ細孔が３０ＯＡである粒
子を有するＶＹＤＡＣシリカＡ（登録商標）などの市販
のシリカを使用することができる。

シリカＶＹＤＡＣＡ　（登録商標）に匹敵する他の任意
のシリカも使用することができる。さらに、クロマトグ
ラフィー用のシリカ、シリカＨＰ　Ｌ　Ｃ。

たとえばボロシルＢ（登録商標）の名称で市販されてい
るシリカも使用することができ、その粒子直径は６７〜
７５μｍである。

特に本発明は、式（１）においてのが均一な粒子寸法を
有しかつｍが１〜１０の範囲で変化しうる整数であり、
ｘｌが１〜１０の範囲で変化しうる整数であり、Ｘが０
〜１０の範囲で変化しうる整数であるような新規な支持
体、特に式（１）においてＡが基−ＣＨ２−若しくはフ
ェニル基であり、ｙ、が０〜５の範囲で変化しうる整数
であり、ｙが０〜１０の範囲で変化しうる整数であるよ
うな新規な支持体、並びに■が基 るものである。

特に本発明の主題は式： 〔■　はシリカＶＹＤＡＣＡ（登録商標）又は同等なシ
リカである〕 を有する支持体、並びに式： 〔ガラスＣ０Ｐ、Ｇ　／　Ｌ　ＣＡＡ　、すなわち調節
多孔質ガラス長鎖アルキルアミン（登録商標）の誘導体
〕 を有する支持体である。

さらに本発明は、式（ｎ） ＲＮ−（Ａ）ｙｌ−８ｏ２Ｃ１（［） 〔式中、Ｒはアミン基の一価若しくは二価の保護基であ
り、Ａ及びｙｌ　　は前記の意味を有する〕の試薬を第
６アミン塩基の存在下で式（ｎｒ）　：■−（ＣＨ２）
ｍ−ＮＦｆ２（■） 〔式中、■及びｍは上記の意味を有する〕の支持体と反
応させて式： ％式％ の中間体を得、その末端基−■■２を遊離させて式（Ｉ
）〔式中、■、ｍ、Ａ、ｙｌ　は上記の意味を有し、Ｘ
二〇かつｙ＝Ｑである〕の支持体を得、この支持体を必
要に応じ前記の同じ条件下で式（ＩＩ）の化合物で再び
処理して式： ％式％ を有する中間支持体を得、その末端基−ＮＩｌ（２を再
び遊離させて式（Ｉ）〔式中ｘ　＝　Ｏかつｙ−１であ
る〕の支持体を得、この工程を必要に応じ式：〔式中、
Ｒ，■、ｍ、人、ｙｌ　は上記の意味を有しかつｙは２
〜２０の範囲で変化しうる整数である〕 の中間支持体を介して所望に応じ式（Ｉ）〔式中Ｘ＝０
かつｙ−２０である〕が得られるまで継続するか、又は
式（■）： 〔式中、■、ｍ及びｘｌ　は上記の意味を有し、Ｘは１
〜２０の範囲で変化しうる整数である〕の支持体と反応
させて式： を有する中間支持体を得、その末端基−ＮＩ−ｆ２を遊
離させて式（■）〔式中■、ｍ、ｘ４、Ａ及びｙｌは上
記の意味を有しかつＸは１〜２０の範囲で変化しうる整
数であり、ｙ＝＝Ｑである〕の支持体を得、この支持体
を必要に応じ式（ＩＩ）の化合物で前記と同じ条件下に
再び処理して式： を有する中間体を得、その末端基ＮＨ２を遊離させて式
（１）〔式中Ｘは１〜２０の範囲で変化しうる整数であ
りかつｙ＝ｊである〕の支持体を得、この工程を必要に
応じ式： 〔式中、Ｒ，ＯＰ、ｍ、ｘ、、Ａ及びｙｌは上記の意味
を有しかつＸは１〜２０の範囲で変化しうる整数であり
、ｙは２〜２０の範囲で変化しうろ整数である〕 の中間体を介して所望に応じ式（１）〔式中ｙ−２０で
ある〕の支持体が得られるまで継続することを特徴とす
る、式（Ｉ）を有する支持体の製造方法に関するもので
ある。

式（ｎ）を有する試薬において、アミン基Ｒの保護基は
たとえばカルボン酸から誘導されるアシル基、りとえば
エトキシ−カルボニル、ベンジルオキシ−カルボニル、
ｔ−ブチルオキシカルボニル（＝ＢＯＣ）、パラメチル
オギシーベンジルオキシカルボニル若しくはフルオレニ
ルメトキシカルボニル（＝ＦＭＯＣ）基であるか、又は
フタルイミド基、或いは窒素誘導体を、たとえば式二Ｎ
＝Ｎ−，，。

を有する誘導体を形成する基である。

たとえば置換若しくは未置換のアリール若しくはアラル
キル基、たとえばベンジル若しくはトリフェニルメチル
又はＯ−ニトロフェニルスルフェニル基などの他の基も
使用することができる。

本発明の方法を実施する好適条件は次の通りであるニ 一式（ＩＩＩ）若しくは（ＩＶ）を有する支持体を、Ｒ
がＦＭＯＣ型の保護基又は式： ％式％ を有する窒素基である式（ｎ）を有する試薬の作用にか
ける； 一式（ＩＩＩ）若しくは（ＩＶ）を有する支持体と試薬
（ＩＩ）との間の反応を塩素化溶剤、たとえば塩化メチ
レン若しくはクロロホルム、及び第３塩基、たとえばピ
リジン若しくはトリエチルアミンの存在下で行なう； 一中間支持体の末端アミン基を保護解除する条件は、使
用する保護基に応じて変化することができる。たとえば
、次の通りである； −ＲがＦＭＯＣ基である場合、たとえばピペリジンのよ
うな強塩基性アミンを使用し、或いは、たとえばピロリ
ジン若しくはジアルキルアミンのような他のアミンも使
用することができ；−フタルアミド基を使用する場合は
、ヒドラジン水和物を使用するのが好適であり； −たとえば、上記のような窒素基を使用する場合は、ヒ
ドロ亜硫酸ナトリウムを水酸化ナトリウムの存在下で使
用するのが好適である。

前記した他の基を使用する場合、末端アミン基を保護解
除する条件は当業者に公知である。

ＲがＦＭＯＣ保護基である式（ｎ）の試薬は、次の反応
式にしたがって製造される〔Ｊ、００Ｃ０第５７巻、第
２２頁（１９７２）］： 式（ＩＩ）を有する試薬を得るには、このように得られ
た生成物を塩化チオニルと反応させる。

Ｒがフタルイミド基を示す場合、操作はたとえばシンセ
シス、第７３９頁（１９７６）に記載された技術にした
がって行なわれる。

Ｒがたとえば前記したような窒素基を示す場合、操作は
たとえばタイルハイマー、第１７巻、第５５９頁、第２
２７頁に記載された技術にしたがって行なわれる。

一般的に、前記アミンに対する保護法は当業者に周知さ
れている。

本発明の方法に成る種の出発物質として使用する式（Ｉ
ＴＩ）を有する支持体は、ヨーロッパ特許第００３５７
１９号公報に示されたように製造される。

本発明の方法に他の出発物質として使用される式（ＩＶ
）を有する支持体は、ケミストリー・レタース、第１５
９７−１６００頁（１９８３）に記載された方法にした
がって製造される。

〔式中、■、ｍ、ｘ、、Ｘ、ｙｌ、Ｖ、Ａ及びＲは上記の童味を有する〕

を有する、新規な工業製品としての支持体に関するもの
である。

本発明の式（Ｉ）を有する支持体は、便利にオリゴヌク
レオチドの合成を行なうことができる。

したがって、本発明の主題は、ホスホルアミダイト、ホ
スファイト、ホスホジエステル又はホスホトリエステル
を用いる方法によりオリゴヌクレオチドを同相で合成す
る際に式（Ｉ）の支持体を使用することに関する。

特に、これらは高基準の第１ヌクレオシド及び安定な中
間体を得ることを可能にする。さらに、これはオリゴヌ
クレオチドを固相で合成するための最も一般的な方法（
ホスホルアミダイト、ホスファイト、ホスホジエステル
、ホスホトリエステルを用いる方法）において３１→５
＋及び５１→３′の両者で容易に使用することができ、
さらに全ての一般的なプリン型若しくはピリミジン型塩
基につき使用することができる。

さらに、オリゴヌクレオチドから支持体を分離する最終
的加水分解は容易に行なうことができ、かつ同時に燐酸
結合並びにプリン型若しくはピリミジン型塩基による保
護基の保護解除を行なうこともできる。

本発明は、特にホスホ）　ＩＪエステルを用いる方法又
はホスホルアミダイトを用いた方法により固相合成にお
いて式（Ｉ）を有する支持体を使用することに関する。

さらに、本発明の主題は、式（１）の支持体を含むオリ
ゴヌクレオチド合成の際に得られるデオキシリボヌクレ
オシド及びリボヌクレオシドにも関するものである。

したがって、本発明の主題は、式： 簡＝。

！１ 巳 ■　　２ （ここでＺは２〜２０個の炭素原子を有する炭化水素基
又はフェニル基である）を介在させて３１若しくは５′
位置のいずれかでリボヌクレオシド若しくはデオキシリ
ボヌクレオシドに結合され、支持体に対する３′若しく
は５′位置に結合していないヒドロキシル基はできれば
保護されており、さらにＡＩ　　は式（１）を有する支
持体がデオキシリボヌクレオシドに結合されていれば水
素原子であるか、又は式（Ｉ）を有する支持体がリボヌ
クレオシドに結合されていればＯＲ１であり、Ｒ１は水
素原子又はヒドロキシル基の通常の保護基のいずれかで
あり、Ｂ１はアミン基ができれば保護されているプリン
型若しくはピリミジン型塩基である〕 を有する支持体に基づく新規なデオキシリボヌクレオシ
ド若しくはりボヌクレオシドである。特に本発明の主題
は、式： （ここでＺは２〜２０個の炭素原子を有する炭化水素基
又はフェニル基である）を介在させて３′　　位置でデ
オキシリボヌクレオシドに結合され、５′　位置におけ
るヒドロキシ基はできれば通常の保護基Ｒ２によって保
護され、Ｂ１　はアミン基ができれば保護されているプ
リン型若しくはピリミジン型塩基である〕 を有する上記支持体に基づく新規なオリゴデオキシリボ
ヌクレオシドに関するものである。

さらに本発明は、式（１）を有する支持体の使用により
得られるヌクレオチドの合成に関するものである。

したがって、本発明の主題は、ヌクレオチドが式（１）
を有する支持体に対し３＋若しくは５′位置のいずれか
で結合され、次式： ０’　＝＝　Ｑ 図 Ｑ＝Ｑ に対応し、かつ式： 〔式中、Ｒ３は水素原子若しくは保護基のいずれかであ
る〕 のホスホジエステル若しくはトリエステル結合ニよって
他のＢ、・・・Ｂ（ｚ−１）塩基を有するヌクレオチド
に対し式： 〔式中、Ｂｚはオリゴデオキシ−若しくはオリゴリボヌ
クレオチドの最後の塩基である〕を有する最後のヌクレ
オシドまで結合され、５＋若しくは３１　　位置におけ
る最後のヌクレオシドのヒドロキシル基はできれば保護
されており、かつ異なるプリン型若しくはピリミジン型
塩基はそのアミン基ができれば保護されていることを特
徴とする支持体に基づく新規なオリゴデオキシリボヌク
レオチド若しくはオリゴリボヌクレオチドである。

特に本発明の主題は、式： ％式％ 〔式中、式（Ｔ）を有する支持体は３１　　位置にてＢ
　　　Ｂ　　・・・Ｂｚ　塩基を有するオリボデオキシ
リボヌクレオチドに結合され、かつＲ２は水素原子若し
くは保護基のいずれかであり、Ｒ５は水素原子若しくは
保護基のいずれかであり、プリン型若しくはピリミジン
型塩基はそのアミン基ができれば保護されている〕 を有する支持体に基づく新規なオリゴデオキシリボヌク
レオチドに関するものである。

上記支持体上のデオキシリポヌクレオシド、リボヌクレ
オシド、オリゴデオキシリボヌクレオチド又はオリゴリ
ボヌクレオチドにおいて、Ｚはフェニル基又は−（ＣＨ
２）ｎ基であることが好ましく、ここでｎは２〜２０の
範囲で変化しうる整数である。

本発明は特にＺが−（ＣＨ２）２基であるものに関する
。

上記リボヌクレオシド又はオリゴリボヌクレオチドにお
いて、Ｒ１はヒドロキシル基の通常の保護基、たとえば
ピラニル、シリル若しくはベンジル基である。

上記ヌクレオシド又はヌクレオチドにおいて、Ｂ１．Ｂ
２・・・Ｂｚ塩基はアデニン、グアニン（ビリン型塩基
）、シトシン、ウラシル若しくはチミン（ピリミジン型
塩基）を示す。

さらに、これらの塩基は置換プリン型若しくはピリミジ
ン型塩基、たとえば６−メチルアミノプリン若しくは６
−シメチルアミノプリン、１−メチルグアニン、５−メ
チル−シトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン又はジ
ヒドロウラシルとすることができる。

成る種の核酸に稀に見られる又は少量で存在する全ての
塩基も使用することができる。

これら塩基における窒素基の保護基は、たとえばベンゾ
イル若しくはインブチリル基である。

５１　位置におけるヒドロキシル基の保護基Ｒ２はたと
えばトリチル、モノメチルトリチル、ジメトキシトリチ
ル若しくはピキシル基である。

燐酸基のヒドロキシル基に対する保護基Ｒ３は、たとえ
ばメチル基、シアンエチル基又はオルト若しくはパラク
ロルフェニル基である。

ホスホトリエステルを用いる方法の場合、Ｒ３はオルト
若しくはパラクロルフェニル基であることが好ましい。

ホスホルアミダイトを用いる方法の場合、Ｒ３はメチル
基又はシアノエチル基のいずれかであることが好ましい
。

前記ポリヌクレオチドの合成方法は極めて一般的であり
、当業者に周知されている。その要約は、たとえばザ・
ケミカル・シンセシス・オプ・ＤＮＡ　。

アルドリヒミカ・アクタ、第１６巻、第３号（１９８３
）の論文に見ることができる。

以下、ホスホトリエステルを用いる方法及びホスホルア
ミダイトを用いる方法によるオリゴデオキシリボヌクレ
オチドの合成３１　　→５＋　　の種々異なる工程につ
き簡単に説明する。５１　　→３′　　における合成を
行なう場合、オリゴデオキシリボヌクレオチドの合成に
つき各工程が厳密に同一であるとは言えず、この場合に
は３＋　　位置におけるヒドロキシル基の保護基を適当
に選択せねばならない。

ｔ　活性化デオキシヌクレオチドの製造この酸は、遊離
状態で使用することができ、或いはペンタクロルフェニ
ル基〔イタクラ等、ヌクレイツク・アシッド・リサーチ
、第８巻、第２２頁、第５４７３頁（１９８０））又は
バラニトロフエニＡ４　ＣＭ、Ｈ，カルーザース、［遺
伝子断片の化学的及び酵素的合成Ｊ　、Ｉ（、Ｃｒ、　
　ガラセン及びＡ、ラング、フエアラーク・ヘミ−（１
９８２）、第７１頁〕により活性化することもできる。

ドの縮合 との縮合は、トリエチルアミンを触媒として使用しジメ
チルホルムアミド中の溶液として２０〜２４時間、或い
はジシクロへキシルカルボジイミドの存在下に１晩乃至
３日間、又はジメチルアミノビリジンの存在下でピリジ
ン中で行なわれる。

次のものが得られる： ５’ＯＨ基はルイス酸での処理、たとえば臭化亜鉛又は
ジー若しくはトリクロル−酢酸での処理によって保護解
除される。

モノマーヌクレオチド又はダイマーヌクレオチドをその
トリエチルアンモニウム塩として使用する。

ダイマーがシアノエチル誘導体として貯蔵される。トリ
エチルアンモニウム塩は、合成の直前に製造される。

支持体に固定された第１ヌクレオシドのヒドロキシル５
′　　における保護基が除去された後、第２段階におい
て活性化剤（たとえばメシチルスルホニル３−ニトロ−
１，２，４−）リアゾール、すなわちＭＳＮＴ又はメシ
チルスルホニルクロライド／Ｎ−メチルイミダゾールの
混合塩化物、或いはさらにＭＳＮＴ／Ｎ−メチルイミダ
ゾールの混合物）の存在下で作成されたこのダイマーを
ピリジン中で縮合させる。

Ｑ＝。

巴 ↑　閃 各カップリング前に、連鎖に結合した最後のヌクレオチ
ドの５′　位置における保護基を除去する。

合成図式は次の通りである： 二　　　　　　　　　　　　　　　　　［相］Ｑ＝Ｏ 巴 Ｒ４は、たとえばモルホリノ基のよりな二価の基である
か、又は２個の一価の基を示し、これらはたとえばイソ
プロピルのようなアルキル基である。

他の基は上記の定義を有する。

「アプライド・バイオシステムス・モデル３８／Ａ」と
して市販されている装置及び技術が使用される。

酸を式（Ｉ）を有する支持体上で反応させ、目的とする
合成に必要な第１塩基Ｂ、を有する第１ヌクレオシドと
縮合させて、５’−ＯＨ基を遊離させ、次いで選択した
モノマーをカップリング剤としてのテトラゾールの存在
下で固定する。得られた中間ホスファイトの直接的酸化
は、ホスホトリエステルを用いる方法の中間体と同様な
燐酸化合物をもたらす。連鎖の延長は、第２の方法にお
けると同じ手順で続行する。

４、　支持体及びオリゴヌクレオチド連鎖の保護解除及
び分離 保護解除したオリゴヌクレオチドを得るため、５１　　
位置における燐酸基、アミン基及びヒドロキシル基など
の種々異なる保護基に適用すべく変化自在な処理を使用
する。

燐酸保護基がオルト−若しくはパラ−クロルフェニル基
である場合、パラニトロベンズアルドキシムとＮ、Ｎ、
Ｎ’、Ｎ’−テトラメチルグアニジンとの混合物を、た
とえばジオキサンと水との混液（１−ｉ）中で使用する
。

この極めて緩和な試薬は、アリール燐酸結合を脂肪族燐
酸結合と対比して選択的に開裂させることができ、した
がって合成された連鎖を破壊することなく燐酸結合の保
護解除を達成することができる。この後、濃アンモニヤ
を６０℃にて５〜６時間反応させてアミドを鹸化させる
。

この場合、濃アンモニヤは、反応媒体を５０℃にて１８
〜２０時間緩和に加熱して使用しうろことも独特である
。アンモニヤによるこの独特な処理は、燐酸基がシアン
エチル基で保護されている場合も使用することができる
。

燐酸保護基がメチル基である場合、チオフェノールをヌ
クレオチドに対し室温で反応させ、次いで上記と同様ｊ
ｃ５０℃にて１８〜２０時間緩和に加熱することにより
濃アンモニヤでアミドの開裂を行なう。

これらの異なる処理は、オリゴヌクレオチドを保護解除
して得ることを可能にし、同様に支持体から分離するこ
ともできる。５′　　位置におけるヒドロキシルの４が
保護解除されずに残る。

好ましくは、合成の終りに行なわれる酸処理は、５′　
位置における保護基を遊離させることができる。酢酸又
はジー若しくはトリクロル酢酸が使用される。

次いで、このように得られたオリゴヌクレオチドを、合
成の際に蓄積された全不純分を除去するように処理する
必要がある。

次いで、所望のオリゴヌクレオチドを得るには、多くの
精製処理（電気泳動又はクロマトグラフィー）が必要で
ある。

配列決定の最終段階によってのみ、もし必要であれば所
定のオリゴヌクレオチドの構造を知ることができる。

本発明の式（Ｉ）を有する支持体はさらにペプチド合成
にも使用することができ、したがってこの使用も本発明
の主題である。

以下、限定はしないが実施例により本発明を説明する。

例１：次式を有する支持体の作成：一 工程Ａ：次の出発支持体の作成： 操作は、１０ｇのシリカＶＹＤＡＣＡ（登録商標）（粒
子寸法２０μｍ、細孔３００人）と１１５１の３−アミ
ノプロピルトリエトキシシランとから出発し、ヨーロッ
パ特許第００３５７１９号の実施例１に示されたように
行なった。

２　Ｘ　１０−’当量／ｇのＮ１（２タイター（ピクリ
ン酸法により測定）を有する求める支持体が得られた。

工程Ｂ：支持体の作成 ４６０ηのＮ、Ｎ−ジエチルエタンアミン−３−［−［
（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシカルボニル〕
アミノ〕プロパンスルホン酸（下記のように作成）を５
解の塩化チオニル中に部分溶解させ、２時間攪拌し、次
いで減圧下で濃縮した。

得られた乾燥抽出物へ、１ゴのピリジンと５１ｎｌの塩
化メチレンと５００１８９の工程Ａで作成された支持体
とを加えた。全体を暗所中で室温にて４８時間攪拌１．
、かつ分離した後に順次にジメチルホルムアミド、次い
で塩化メチレンによって洗浄しかつ減圧下で乾燥した。

５００１１１９の中間支持体が得られ、これは０．２８
　Ｘ　１０−’　ｅｑ　７ｇのＭちのタイターを有した
（ピクリン酸で測定）。

これをジメチルホルムアミド中の２０％ピペリジン２′
Ｉｉｌで溶解させ、３０分間攪拌し、分離し、順次にジ
メチルホルムアミドと塩化メチレンとで洗浄し、次いで
減圧下に乾燥させた。

４５０■の求める支持体が得られ、これは３×１０”−
’　ｅｑ／　ｆＪのＮＨ２のタイターを有した。

Ｎ、Ｎ−ジエチルエタンアミン−３−［−１ｍ（９Ｈ−
フルオレン−９−イル）メトキシカルボニル〕アミノ〕
プロパンスルホン酸の作成。

操作は、蒸留水１９ｍＪ中における２、４ｇのアミノプ
ロパンスルホン酸（二人塩）のナトリウム塩と４．５Ｉ
の９−フルオレニルメチルクロルホルメートとの混合物
から出発し、ジャーナル・オーガニック・ケミストリー
、第５７巻、第２２頁、（１９７２）に示されたように
行った。

溶媒を２．８ｄのトリエチルアミンでアルカリ性となし
、５時間攪拌し、塩酸によってｐＨを１となし、次いで
減圧下に濃縮した。

乾燥抽出物を塩化メチレンで溶解し、分離し、かつ固形
物質を塩化メチレンで洗浄し、この塩化メチレン溶液を
減圧下で濃縮乾固させて６．２ｙの求める生成物を得た
。

例２ｍ次式を有する支持体の作成： ５００■のＮ、Ｎ−ジエチルエタンアミン−６−［−［
（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシカルボニル〕
アミノ〕プロパンスルホン酸を５ｄの塩化メチレンと２
１１Ｌｔのピリジンと０．２　ｍｌの塩化チオニルとに
溶解させた。

この溶液を３時間攪拌し、次いで減圧下で濃縮しかつこ
の乾燥抽出物へ５　ｍｌの塩化メチレンと１ｄのピリジ
ンと例１の工程Ｂで得られた支持体４５０■とを加えた
。全体を暗所内で室温にて７２時間攪拌し、分離し、順
次に１００Ｘエタノール、次いで塩化メチレンで洗浄し
かつ減圧下で乾燥した。４４０ｍｙの中間支持体が得ら
れ、これは３　Ｘ　１０　”　ｅｑ／ｊｊのＮＩ（２の
タイターを有した。

これをジメチルホルムアミド中の２０Ｘピペリジン２プ
で溶解させ、３０分間攪拌し、分離しかつ順次にジメチ
ルホルムアミド、次いで塩化メチレンによって洗浄しか
つ減圧下で乾燥した。６８０ｄの求める支持体が得られ
、これは２．８Ｘ１０”−’当量／ｇのＮ１−Ｔ２タイ
ターを有した。

！Ｖ仝−：次式を有する支持体の作成 操作は、５００１ｎ９のＮ、Ｎ−ジエチルエタンアミン
−３−［−１：（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキ
シカルボニル〕アミノ〕プロパンスルホン酸及び２００
Ｉｎ９の例２で得られた支持体から出発して、例１と同
様に行なった。

２００■の中間支持体が得られ、これは［Ｌ３×１０−
’　ｅｑ／ｊｉのＮ）Ｉ２タイターを有し、次いで１９
０■の求める支持体が得られ、これはＺ３ＸＩＤ−’ｅ
ｑ／ｇのＮＨ２Ｉ２タイターした。

例４ｍ次式を有する支持体の作成： 出発支持体は次式を有する支持体： であり、これは３Ｘ１０　’当量／ｇのＮＩ（２タイタ
ーを有し、かつ例１の工程Ａで作成した次の支持体： から出発してケミストリー・レタース、第１５９７〜１
６００頁（１９８３）に記載された方法にしたがって作
成した。

２００Ｔｎ９の出発支持体を５４のクロロホルム、１Ｔ
Ｌｌのアセトニトリル及び３００■の７タルイミドーエ
タンスルホクロライド（製造法については下記する）と
混合した。０．２８ｄのトリエチルアミンを次いで攪拌
しながら滴加した。全体を２時間還流させ、次いで室温
にて１晩攪拌し、分離し、クロロホルムで洗浄し、次い
で減圧下に乾燥した。

ニンヒドリンによる試験が陽性であれば、このシリカを
前記の条件下で試験が陰性となるまで再び反応させる。

とのシリカを５　ｍｌのメタノール、１ゴの１００％ヒ
ドラジン水和物及び０１５１の水で溶解させた。攪拌し
、２時間還流させ、分離し、塩化メチレンとメタノール
との混液（１−１）で洗浄し、かつ減圧下で乾燥した後
、１８５Ｔｎ９の求める支持体が得られ、これは５　Ｘ
　１０−’当量／ＩのＮＩｒ２タイターを有した。

フタルイミドエタンスルホクロライドの作成。

これはフタルイミドエタンスルホン酸のカリウム塩２．
９ｇとオキシ塩化燐１０ｍ！、ｌ！’と五塩化燐２ｇと
から出発して、シンセシス、第７３９頁（１９７（Ｓ）
に示したように製造した。１９ｇの求める生成物が得ら
れた（　ｍ、ｐ、−１６２℃）。

例５ゴ次式を有する支持体の作成： 工程Ａ二次式を有する支持体の作成： し！ 例１の工程Ａと同様に作成した支持体３００■と、５０
０■の３−（（２−クロル−１−ナフタレニル）アゾ〕
ベンゼンスルホン酸クロライトド、３Ｔｌｌ！の塩化メ
チレンと、０．６ｖｔｌ！のアセトニトリルと、０．３
　ｍｌのトリエチルアミンとを２４時間攪拌した。分離
し、順次に塩化メチレン及び次いでメタノールで洗浄し
、かつ減圧下で室温にて乾燥した後、２５０ｍ９の中間
支持体が得られ、これは５Ｘ　１０”−’　ｅｑ／Ｊの
ＮＴ−１２タイターを有した。

工程Ｂ：二次式有する支持体の作成： ２００■の前段の支持体を０．１Ｎ水酸化ナトリウム５
ゴ中で５０℃まで加熱し、かつ１ｇのヒドロ亜硫酸す）
　ＩＪウムを加えた。これを１２０℃まで３０分間加熱
し、次いで冷却し、得られた支持体を分離し、順次に水
とメタノールと次いで塩化メチレンとで洗浄した。これ
を減圧下で室温にて乾燥した後、８１ｍノの求める支持
体が得られ、これは７．２Ｘ１０−５当量／ｙのＭ−■
２タイターを有した。

工程Ａ：３−［：（２−ヒドロキシ−１−ナフタレニル
）アゾ〕ベンゼンスルホン酸にナトリウム塩） １４６９のメタスルファニル酸を２５ｍＪの２Ｎ塩酸中
で混合し、００／＋２℃まで冷却し、かつ１５時間かけ
て水８−中の亜硝酸ナトリウム１６５ｙの溶液を滴加し
た。これを１５分間攪拌した後、３．１７ｇのβ−ナフ
トールと２２ｍ１のＮ水酸化ナトリウムとｔ７，９の炭
酸ナトリウムとからなる室温で作成した溶液に注ぎ込ん
だ。これを１５分間攪拌した後、沈殿物を分離し、氷水
で洗浄しかつ減圧下で８０℃にて乾燥した。６．７ｇの
求める生成物が得られた。

工程Ｂ：３−（（２−クロル−１−ナフタレニル）アソ
〕ベンゼンスルホン酸クロライド 工程Ａで作成した５、７ｇの酸と２５１Ｒノのオキシ塩
化燐と５．２ｙの五塩化燐とを混合した。オキシ塩化燐
を減圧下での蒸留により除去し、残留物を５０ｍ１の塩
化メチレンで溶解させた。沖過しかつ減圧下で濃縮乾固
した後、残留物をアセトンから再結晶化させた。減圧下
に５０°Ｃで乾燥した後、３、２５　、ｐの求める生成
物が得られた。

ＩＲスペクトル 芳香族　：１６１８０−１ 共役系　：１５８２礪　〜１５［１３ＣＴＬＳｏ　　　
　：１３５０ｃｍ　　〜１１８０ｃｍ　　〜１１７０ｃ
ｒｒＬ例６：次式を有する支持体の作成： Ｉ 出発時点で４００■の例１の工程Ａと同様に作成した支
持体と７３４■の４−Ｃ（２−クロル−ナフタレニル）
アゾ〕ベンゼンスルホン酸クロライドとを使用して例５
の工程Ａと同様に操作することにより、６９０■の中間
支持体を得、これは５　Ｘ　１０−’当ｔｈｌ！：／ｇ
及び６　Ｘ　１０−６当量／ｇのＮＩ（２タイターを有
した。

工程Ｂ：次式を有する支持体の作成： ２００■の工程Ａで作成した支持体を１０ゴの０．１Ｎ
水酸化ナトリウム中で５０℃まで加熱し、かつ１ｇのヒ
ドロ亜硫酸ナトリウムを加えた。これを５０℃にて攪拌
下に２０分間保ち、次いで得られた支持体を分離し、順
次に水とメタノールと塩化メチレンとで洗浄し、次いで
減圧下に室温で乾燥した。１６０■の求める生成物が得
られ、これは８　Ｘ　１０”−５モル／ＩのＮＩ（２タ
イターを有した。

例６の開始時に使用した４−〔２−クロル−１＝ナフタ
レニル）アゾ／ベンゼンスルホン酸クロライドの作成。

工程Ａ：４−（（２−ヒドロキシ−１−ナフタレニル）
アソ〕ベンゼンスルホン酸にナトリウム塩）。

出発時にＮ塩酸５ｏｍｌ中の３．４８．９のスルファニ
ル酸を使用し、例５に示した手順の工程Ａと同様に操作
してＺｉｓ、ｐの求める生成物が得られ、これをそのま
ま次の工程に使用した。

工程Ｂ：４−（：（２−クロル−１−ナフタレニル）ア
ゾ〕ベンゼンスルホン酸クロライド。

工程Ａからの生成物７１５ｇと５２ｍ１のオキシ塩化燐
と８Ｉの五塩化燐とを使用し、例５に示した手順の工程
Ｂにおけると同様に操作して４．２５１の求める生成物
を得た。

芳香族　：１５８５ＣＴＬ 共役系　：１８０４印 ＳＯ２：１５８１儒　〜１１８１Ｃ！ｎ（ト：８３儒 例７：次式を有する支持体の作成： 例１の工程Ｂで得られた３−アミノプロピルスルホン酸
クロライドの９−フルオレニルメチルカルバメート１．
９と、４ｍｌのアセトニトリルと、アルキルアミン長鎖
を有するＣ、　Ｐ、Ｇ、ガラス２００　ｍ９と、２ｒＲ
１のトリエチルアミンとを１２時間攪拌した。

分離し、次いで順次にアセトニトリルと水とメタノール
と最後に塩化メチレンとで洗浄し、次いで減圧下で室温
にて乾燥した後、１９０■の粗生成物が得られた。残留
物を１罰のフェニルインシアネートを含有するピリジン
１Ｏｒｎｌ中に溶解させ、次〜・で分離しかつ先ず最初
に塩化メチレンとメタノールとの混液（１−１）、次い
で塩化メチレンのみで洗浄し、最後に減圧下で室温にて
乾燥し、１８０■の求める生成物を得た。

工程Ｂ：次式の支持体の作成 ト １８０■の上記支持体を１ｄのジメチルホルムアミド−
ピペリジン混液（９−１）で３回トリチル化した。分離
し、メタール及び次いで塩化メチレンで洗浄しかつ減圧
下で室温にて乾燥した後、１７０■の求める支持体が得
られ、これはｔａＸｌｏ−５当量／ｇのＮｌ−Ｉ２タイ
ターを有した。

ホスホトリエステル法によるオリゴヌクレオチドの合成 式（Ｉ）の支持体を、ミニカラム内の２枚のポリフルオ
ロエチレンのフィルタ間に配置した。これら２枚のフィ
ルタを２個の中空ピストンで固定位置に保った。この装
置の頂部を隔壁を設けたねじストッパで閉鎖し、これを
介してカップリング混合物を注射器により導入した。使
用した装置は、「遺伝子断片の化学的及び酵素的合成」
、ＨｏＣｒ。

ガラセン及びんラング、フエアラーク・ヘミ−１第８２
巻、第１４頁に記載されたものと同様である。

洗浄及び試薬の導入の全反復操作を自動化した。

合成の全体につき導入すべきヌクレオチドの数はプログ
ラミングすることができる。ヌクレオチド０導入のみが
注射器で行なうべき手動作動である。

式（Ｉ）を有する支持体の所定量を反応器中に入りて、
目的とする合成に必要な第１塩基Ｂ、を有する第１ヌク
レオシド（２５〜１５０■）と縮合させた。所望のパラ
メータ、特に順次に結合させるべきヌクレオチドの数を
適当にプログラミングし、次いで次の自動化サイクルを
開始した。

■程１： 工程２： 所望のヌクレオチドを得るのに必要な最初と同じ回数の
サイクルを行なった。

この合成サイクルに使用した溶媒は、極めて純粋かつ無
水とせねばならない。

脱トリチル化後に行なったトリチリウムイオンの量のＵ
Ｖ測定によって、各カップリングの収率を知ることがで
きた。

カッブリ混合物は使用直前に作成し、かつ次のものから
構成したニ ーモノマー若しくはダイマーヌクレオチドのトリエチル
アンモニウム塩１０当量（固体支持体上に存在する第１
ヌクレオシドの量に対し）、−無水ビリジン中のメシチ
ルスルホニル３−ニトロｉ、　２．４−トリアゾール（
すなわちＭＳＮＴ）３０当景（ダイマー約５０１ｎ９に
つき０．３　ｖｎｌ　）。

この混合物を無水アルゴン芥囲気下で注射器に移し、次
いで定期的間隔で３つのロットで加えた。

完全に保護解除されたオリゴヌクレオチドを得るために
は、次のことが必要であったニー極めて一般的でありか
つたとえば「遺伝子断片の化学的及び酵素的合成、Ｈｏ
Ｃｒ−ガラセン及びＡ。

ラング、フエアラーク・ヘミ−１第８２巻、第２〜４２
頁に記載されたような所定数の処理を行なうこと。

これらの処理は次の通りである： 処理は、ジオキサン−水混液（１−１）中のｔｌ、　３
．３−テトラメチルグアニジニウム０−ニトロベンズア
ルドキシムの［１３Ｍ溶液で行なった。

この方法は、ヌクレイツク・アンド・リサーチ、第９巻
、第１８号（１９８１）、第４６１１頁に記載された極
めて一般的な方法で行なった。

この極めて緩和な試薬は、アリール燐酸結合を脂肪族燐
酸基と比較して選択的に開裂することができ、かくして
合成された連鎖を破壊することなく燐酸結合の保護解除
を達成することができる。

（２）璧素塩基におけるアミン基の保護解除処理を飽和
（３７％）　ＮＨ４ＯＨで行ない、かつ窒素塩基の全ア
ミンがかくして遊離された。

処理１を抑制しかつＮＨ４０Ｈによる処理を延期させて
同じ反応を生ぜしめることもできる。

保護解除 処理はＣＨ３ＣＯ０Ｉ−（−水混液（４−１）で行なっ
た。

減圧下で濃縮乾固した後、残留物を水で溶解させかつエ
ーテルで抽出して、全試薬と開裂生成物とを除去した。

このようにして得られたｙ結合を有するオリゴヌクレオ
チドは多くの不純物を含有する（ｙ−２、Ｙ−４・・・
結合、並びに各種の分解生成物を有するヌクレオチド）
。

求める生成物を得るには、多くの連続した精製工程を必
要とするニ ーゲルにおけるクロマＩ・グラフィー、−’ＨＰＬＣ１ 一電気泳動、 一配列決定：この工程はモノマーヌクレオチドの配列を
明確かつ順序通りに示す。

これらの手順は極めて一般的である。

したがって、ここで詳細には説明しない。

例８：例１の支持体を使用して合成したオリゴ−デオキ
シリボヌクレオチド。

（１１５’−ジメトキシトリチル−２′−デオキシチミ
ジン−３’　−ハラニトロフェニルスフシネ−トノ作成
。

使用した方法はＭ、　Ｈ，カルーザース、［遺伝子断片
の化学的及び酵素的合成Ｊ　、Ｈ，Ｃｒ、ガラセン及び
尤ラング、フエアラーク・ヘミ−（１９８２）、第７１
頁に記載されており、その際１５５７．！ｉ’の５１−
ジメトキシトリチル−２′−デオキシチミジン−３１−
コハク酸と１０ｄの無水ジオキサンと０．５ｄの無水ピ
リジンと５６９ダのパラニトロフェノールと、５８５■
のジシクロへキシルカルボジイミドとを無水ジオキサン
２．５ｄ中の溶液として使用した。

１、１５０．９の求める生成物が得られた。

（２）例１の支持体と上記で作成した活性化チミジンス
クシネートとの間の縮合。

室温かつ暗所中にて、例１で作成されかつ２×１０−’
　ｅｑ／９のＮＨ２タイターを有する支持体７０■と、
上記で作成した活性化チミジンスクシネート１００■（
すなわち、約１１当景）と、１５０■のジシクロへキシ
ルカルボジイミドとを２．５１１１１のピリジン中で混
合した。分離し、塩化メチレンで洗浄しかつ減圧下で乾
燥した後、６０■の求める縮合支持体が得られ、これは
２　Ｘ　１０”−”　ｅｑ／ｊｉのジメトキシトリチル
のタイターを有した。

（３）例１の支持体から出発し、チミジンスクシネート
と縮合させ、かつ３種のダイマーを使用することにより
、オリゴ−デオキシリボヌクレオチド：ｓ’−ｄ　（Ｔ
ＴＡ　ＡＡ　ＣＴ　）が得られた。

使用したカップリング剤はＭＳＮＴである。

例９：例２からの支持体を使用して合成したオリゴ−デ
オキシリボヌクレオチド （１）例２の支持体と５′−ジメトキシトリチル−２′
−デオキシチミジン−３１−コハク酸との間の縮合。

室温かつ暗所中で、１７０■の例２からの支持体と、３
００■の５１−ジメトキシトリチル−２１−デオキシチ
ミジン−ジ−コハク酸と、４１５■のジシクロへキシル
カルボジイミドとを３ｄのピリジン中にて全部で７２時
間攪拌した。

分離し、順次にピリジンと塩化メチレン及びメタノール
の混合物と塩化メチレンとで洗浄しかつ減圧下で乾燥し
た後、１４０〜の求める縮合支持体が得られ、これは３
．８×１Ｏ−５ｅｑ／ｇのジメトキシトリチルのタイタ
ーを有した。

（２）上記で作成した縮合支持体から出発し、２種のダ
イマーをＭＳＮＴの存在下で使用することにより、オリ
ゴデオキシリボヌクレオチド５ｌ−ｄ（ＴＴＡＡＡ）が
得られた。

６種のダイマーを使用し、メシチレンスルホニルクロラ
イド／Ｎ−メチルイミダゾールの混合物の存在下で第２
の試験を行なった。ポリデオキシリボヌクレオチド５’
−ｄ　（ＴＴＡ　ＡＡ　　ＣＴ　）が得られた。

例１０：例３からの支持体を使用して合成されたオリゴ
デオキシリボヌクレオチド ｆｌ）　　例３の支持体と５１−ジメトキシトリチル−
２１−デオキシチミジン−３′−コハク酸との間の縮合
。

室温かつ暗所中で、１７４１ｎ９の例３で得られた支持
体と、２６０ｍ９０５′−ジメトキシトリチル−２′−
デオキシチミジン−３′−コハク酸と、２００■（Ｄ−
）シクロヘキシルカルボジイミドとを３１ｎｌのピリジ
ン中で７２時間攪拌した。分離し、順次にピリジンと塩
化メチレン及びメタノールとの混液と塩化メチレンとで
洗浄しかつ減圧下で乾燥した後、１６０ｍ９の求める縮
合支持体が得られ、これは５　Ｘ　１０−５ｅｑ／ｇの
ジメトキシトリチルのタイターを有した。

（２）上記で作成した縮合支持体から出発し、２種のダ
イマーをＭＳＮＴの存在下で使用して、オリゴデオキシ
リボヌクレオチド５’−ｄ　（ＴＴＡ　ＡＡ）が得られ
た。

メシチレンスルホニルクロライド／Ｎ−メチルイミダゾ
ール混合物の存在下で第２の試験を行なツタ。オリゴデ
オキシリボヌクレオチド５’−ｄ（ＴＴＡ　ＡＡ　ＣＴ
　）が得られた。

例１１：例４の支持体を使用して合成されたオリゴデオ
キシリボヌクレオチド （１）例４の支持体と５′−ジメトキシトリチル−２′
−デオキシグアノシン−３′−コハク酸との縮合。

例９及び１０の工程１におけると同様に操作を行ない、
求める縮合支持体が得られ、これはｔ１×１００９７ｇ
のジメトキシトリチルのタイターを有した。

（２）上記で作成した縮合支持体から出発し、モノマー
とダイマーとを使用してオリゴデオキシリボヌクレオチ
ド５’−ｄ　（Ｇ−ＡＣＴ　）が得られた。

カップリング剤は、メシチレンスルホニルクロライド／
Ｎ−メチルイミダゾール混合物である。

例〕−２：例５の支持体を使用して合成されたオリゴデ
オキシリボヌクレオチド （１）例５の支持体と活性化チミジンスクシネートとの
間の縮合。

例８の工程２におけると同様に操作を行ない、例８の工
程１で作成した５＋−ジメトキシトリチル−２′−チオ
キシチミジン−３′−バラニトロフェニルスクシネート
及び例５で作成した支持体を使用１−て所望の縮合支持
体が得られ、これはλ８×１０−５ｅｑ／ｊＪのジメト
キシトリチルのタイターを有した。

（２）上記縮合支持体から出発し、４種のダイマーを使
用してオリゴデオキシリボヌクレオチド５′−ｄ（ｃＡ
’ｒＴ’ｒＡｃＴ’ｒ　）を作成した。使用したカップ
リング剤はＭＳＮＴ／Ｎ−メチルイミダゾール混合物で
ある。

例１３：例乙の支持体を使用して合成されたオリゴデオ
キシリボヌクレオチド （１）例６の支持体と活性化チミジンスクシネートとの
間の縮合。

例８の工程２におゆると同様に操作を行ない、例８の工
程１で作成した５′−ジメトキシトリチル−２′−デオ
キシチミジン−３１−パラニトロフェニルスクシネート
及び例６で作成した支持体を使用した。所望の縮合支持
体が得られ、これは７×１００−５ｅｑ７のジメトキシ
トリチルのタイターを有した。

（２）上記縮合支持体及び６種のダイマーをＭ　Ｓ　Ｎ
Ｔ／Ｎ−メチルイミダゾール混合物の存在下で使用して
、オリゴデオキシリボヌクレオチド５’−ｄ（ＣＡＴＴ
ＴＡＴ　）が得られた。第２の試験を行ない、オリゴデ
オキシリボヌクレオチド５’−ｄ（ＴＣＴＴＣＴ　）が
得られた。

例１４：例７の支持体を使用して合成されたオリゴデオ
キシリボヌクレオチド （１１５’−ジメトキシトリチル−２’−Ｎ−ベンゾイ
ルチオキシシチジン−６１−パラニトロフェニルスクシ
ネートの作成 使用した方法はＭ、Ｈ，カルーザース、「遺伝子断片の
化学的及び酵素的合成Ｊ　、　Ｉ−ＬＣｒ、ガラセン及
びＡラング、フエアラーク・ヘミ−（１９８２）、第７
１頁に記載されており、４．１６．９の５′−ジメトキ
シトリチル−２１−デオキシ−Ｎ−ベンゾイルシチジン
−３′−コハク酸と、２５ｙｔｒｌの無水ジオキサンと
、（Ｌ８ｍＪのピリジンと１．１６９のパラニトロフェ
ノールと、ｔ８３．ｐのジシクロへキシルカルボジイミ
ドとを８．３３ｍのピリジン中で使用した。３．６２の
所望の生成物が得られた。

（２）例７の支持体と上記で活性化したシチジンスクシ
ネートとの間の縮合。

例８の工程２におけると同様に操作し、その際上記で活
性化したシチジンスクシネートと例７かもの支持体とを
使用した。所望の縮合支持体が得られ、これはｉ、５　
Ｘｌ　０−５ｅｑ／ｊｉのジメトキシトリチルのタイタ
ーを有した。

（３）上記縮合支持体から出発し、３種のダイマーとカ
ップリング剤としてのＭＳＮＴ／Ｎ−メチルイミダゾー
ル混合物とを使用して、オリゴデオキシリボヌクレオチ
ド５’−ｄ　（ＣＡＴＴＴＡＣ）を得た。

２種のダイマーを用いた第２の試験は、オリゴデオキシ
リボヌクレオチド５ｌ−ｄ（ＴＴＡＡＣ）を得ることが
できた。

例１５：ホスホルアミダイトを用いる方法により例１の
支持体を使用して合成されたオリゴデオキシリボヌクレ
オチド （１）例１の支持体と活性化シチジンスクシネートとの
間の縮合。

例８の工程２におげろと同様に操作し、例１で作成した
支持体と例１４で作成した活性化シチジンスクシネート
とを使用し、所望の縮合支持体が得られ、これはｔ　ａ
　ｘ　１ｏ−”　ｅｑ／ｇのジメトキシトリチルのタイ
ターを有した。

（２）上記に示した技術を［アプライド・バイオシステ
ムス」装置と共に使用して操作を行ない、上記工程１か
らの縮合支持体と１１棟のモノマーとを使用しかつ燐酸
基におけるヒドロキシル基の保護基としてメチル基を選
択することにより、オリゴデオキシリボヌクレオチドｓ
’−ｄ（σ１゛ＡＯ″ＣＡＧＡＴＡＣ）が得られた。同
じ条件であるが、燐酸基のヒドロキシル基の保護基とし
てシアンエチル基を使用することにより、第２の試験を
行なった。５種のモノマーを使用することにより、オリ
ゴデオキシリボヌクレオチド５１−　ｄ　（ＧＡＣＴＴ
Ｃ）が得られた。

丁　続　１ｌｌｉ　　＋ｌ：、１ｊｊ（方式）昭和６１
年　９Ｊ：Ｊ　　９１−１ ４．１．？′ＩＪコ丑官黒田明雄殿 明相Ｇイ′Ｉの表示　昭和６１年特　願第１４８！５５
２　号補正をする者 事件との関係　　　　　　　　　　　特許用１９ｆ１人
名　称ルセルーユクラフ

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. （１）式（ I ）： ■−（ＣＨ＿２）＿ｍ−［ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ＿２）＿
   ｘ＿＿１］＿ｘ−ＮＨ−［ＳＯ＿２−（Ａ）＿ｙ＿＿１
   −ＮＨ］＿ｙ−ＳＯ＿２−（Ａ）＿ｙ＿＿１−ＮＨ＿２
   〔式中、■はガラス又は■につき基▲数式、化学式、表
   等があります▼ を得るようアミノアルキルトリアルコキシシラン基によ
   り官能化されたシリカ、珪藻土、ポリテトラフルオロエ
   チレン、金属酸化物又はセルロースの微細ペレットによ
   り構成された物質であり、 ｍは１〜２０の範囲で変化しうる整数であり、ｘ１は１
   〜２０の範囲で変化しうる整数であり、ｘは０〜２０の
   範囲で変化しうる整数であり、Ａは１〜２０個の炭素原
   子を有する線状若しくは分枝アルキル鎖又は３〜１２個
   の炭素原子を有する飽和環式基又はフェニル基又は５若
   しくは６個の結合を有する複素環式基のいずれかを示し
   、 ｙ１は０〜１０の範囲で変化しうる整数であり、かつｙ
   は０〜２０の範囲で変化しうる整数である〕 を有する支持体。
2. （２）式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 又は式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、ｍ、ｘ１、ｘ、ｙ１、Ａ、ｙは特許請求の範囲
   第１項記載の意味を有する〕 に対応する特許請求の範囲第１項記載の式（ I ）を有
   する支持体。
3. （３）■が均一な粒子寸法を有する支持体である特許請
   求の範囲第１項記載の式（ I ）を有する支持体。
4. （４）ｍが１〜１０の範囲で変化しうる整数である特許
   請求の範囲第１項乃至第３項のいずれかに記載の式（
   I ）を有する支持体。
5. （５）ｘ１が１〜１０の範囲で変化しうる整数であり、
   かつｘが０〜１０の範囲で変化しうる整数である特許請
   求の範囲第１項乃至第４項のいずれかに記載の式（ I
   ）を有する支持体。
6. （６）Ａが−ＣＨ＿２−基若しくはフェニル基である特
   許請求の範囲第１項乃至第５項のいずれかに記載の式（
   I ）を有する支持体。
7. （７）ｙ１が０〜５の範囲で変化しうる整数であり、か
   つｙが０〜１０の範囲で変化しうる整数である特許請求
   の範囲第１項乃至第６項のいずれかに記載の式（ I ）
   を有する支持体。
8. （８）■が基▲数式、化学式、表等があります▼であり
   、かつｍ＝３で ある特許請求の範囲第１項乃至第７項のいずれかに記載
   の式（ I ）を有する支持体。
9. （９）式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ▲数式、化学式、表等があります▼ ▲数式、化学式、表等があります▼ ▲数式、化学式、表等があります▼ ▲数式、化学式、表等があります▼ ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、■はＶＹＤＡＣ　Ａ（登録商標）シリカ若しく
   は同等なシリカである〕 又は式： ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する特許請求の範囲第１項記載の支持体。
10. （１０）式（II）： Ｒ−Ｎ−（Ａ）＿ｙ＿１−ＳＯ＿２Ｃｌ（II）〔式中、
    Ｒはアミン基の一価若しくは二価の保護基であり、Ａ及
    びｙ＿１は前記の意味を有する〕の試薬を第３アミノ塩
    基の存在下で式（III）：■−（ＣＨ＿２）＿ｍ−ＮＨ
    ＿２（III） 〔式中、■及びｍは上記の意味を有する〕 の支持体と反応させて式： ■−（ＣＨ＿２）＿ｍ−ＮＨ−ＳＯ＿２−（Ａ）＿ｙ＿
    １−Ｎ−Ｒの中間支持体を得、その末端基−ＮＨ＿２を
    遊離させて式（ I ）〔式中■、ｍ、Ａ、ｙ＿１は上記
    の意味を有しかつｘ＝０及びｙ＝０である〕の支持体を
    得、この支持体を必要に応じ前記と同じ条件下で式（I
    I）の化合物で再び処理して式： ■−（ＣＨ＿２）＿ｍ−ＮＨ−ＳＯ＿２−（Ａ）＿ｙ＿
    １−ＮＨ−ＳＯ＿２−（Ａ）＿ｙ＿１−ＮＲを有する中
    間支持体を得、その末端基−ＮＨ＿２を再び遊離させて
    式（ I ）〔式中、ｘ＝０かつｙ＝１である〕の支持体
    を得、この工程を必要に応じ式：■−（ＣＨ＿２）＿ｍ
    −ＮＨ−［ＳＯ＿２−（Ａ）＿ｙ＿＿１］＿ｙ−ＳＯ＿
    ２（Ａ）＿ｙ＿＿１−ＮＲ〔式中、Ｒ、■、ｍ、Ａ、ｙ
    ＿１は上記の意味を有しかつｙは２〜２０の範囲で変化
    しうる整数である〕 の中間支持体を通過して所望に応じ式（ I ）〔式中、
    ｘ＝０かつｙ＝２０である〕の支持体が得られるまで継
    続するか、又は式（IV）： ■−（ＣＨ＿２）＿ｍ−［ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ＿２）＿
    ｘ＿＿１］＿ｘ−ＮＨ＿２（IV）〔式中、■、ｍ及びｘ
    １は上記の意味を有し、ｘは１〜２０の範囲で変化しう
    る整数である〕の支持体と反応させて式： ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する中間支持体を得、その末端基−ＮＨ＿２を遊離
    させて式（ I ）〔式中■、ｍ、ｘ＿１、Ａ及びｙ＿１
    は上記の意味を有しかつｘは１〜２０の範囲で変化しう
    る整数であり、ｙ＝０である〕の支持体を得、この支持
    体を必要に応じ式（II）の化合物で前記と同じ条件下に
    再び処理して式： ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する中間支持体を得、その末端基ＮＨ＿２を遊離さ
    せて式（ I ）〔式中、ｘは１〜２０の範囲で変化しう
    る整数でありかつｙ＝１である〕の支持体を得、この工
    程を必要に応じ式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、Ｒ、■、ｍ、ｘ＿１、Ａ及びｙ＿１は上記の意
    味を有し、かつｘは１〜２０の範囲で変化しうる整数で
    あり、ｙは２〜２０の範囲で変化しうる整数である〕 の中間支持体を通過して所望に応じ式（ I ）〔式中ｙ
    ＝２０である〕の支持体が得られるまで継続することを
    特徴とする特許請求の範囲第１項記載の式（ I ）を有
    する支持体の製造方法。
11. （１１）式： ▲数式、化学式、表等があります▼〔式中、■、ｍ、ｘ
    ＿１、ｘ、ｙ＿１、ｙ、Ａ及びＲは特許請求の範囲第１
    項記載の意味を有する〕を有する新規な工業製品として
    の支持体。
12. （１２）ホスホルアミダイト、ホスファイト、ホスホジ
    エステル又はホスホトリエステルを用いる方法によりオ
    リゴヌクレオチドを固相で合成するのに使用する特許請
    求の範囲第１項乃至第９項のいずれかに記載の式（ I
    ）を有する支持体。
13. （１３）ホスホトリエステル又はホスホルアミダイトを
    用いる方法によりオリゴヌクレオチドを固相で合成する
    のに使用する特許請求の範囲第１項乃至第９項のいずれ
    かに記載の式（ I ）を有する支持体。
14. （１４）式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 式（ I ） 〔式中、式（ I ）を有する支持体は基▲数式、化学式
    、表等があります▼（ここでｘは２〜２０個の炭素原子
    を有する炭化水素基又はフェニル基である）を介在させ
    て３′若しくは５′位置のいずれかでリボヌクレオシド
    若しくはデオキシリボヌクレオシドに結合され、支持体
    に対し３′若しくは５′位置に結合していないヒドロキ
    シル基はできれば保護されており、さらにＡは式（ I
    ）を有する支持体がデオキシリボヌクレオシドに結合さ
    れていれば水素原子であるか、又は式（ I ）を有する
    支持体がリボヌクレオシドに結合されていればＯＲ＿１
    であり、Ｒ＿１は水素原子又はヒドロキシル基の通常の
    保護基のいずれかであり、Ｂ＿１はアミン基ができれば
    保護されているプリン型若しくはピリミジン型塩基であ
    る〕 を有する支持体に基づく新規なデオキシリボヌクレオシ
    ド若しくはリボヌクレオシド。
15. （１５）式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 式（ I ） 〔式中、式（ I ）を有する支持体は基▲数式、化学式
    、表等があります▼（ここでＺは２〜２０個の炭素原子
    を有する炭化水素基又はフェニル基である）を介在させ
    て３′位置でデオキシリポヌクレオシドに結合され、５
    ′位置におけるヒドロキシ基はできれば通常の保護基Ｒ
    ＿２によつて保護され、Ｂ＿１はアミン基ができれば保
    護されているプリン型若しくはピリミジン型塩基である
    〕 を有する特許請求の範囲第１４項記載の支持体に基づく
    新規なオリゴデオキシリボヌクレオシド。
16. （１６）ヌクレオシドが式（ I ）を有する支持体に対
    し３′若しくは５′位置のいずれかで結合され、次式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 式（ I ） に対応しかつ式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、Ｒ＿３は水素原子若しくは保護基のいずれかで
    ある〕 のホスホジエステル若しくはトリエステル結合によつて
    、他のＢ＿１、…Ｂ（Ｚ−１）塩基を有するヌクレオチ
    ドに対し式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、Ｂｚはオリゴデオキシ−若しくはオリゴリボヌ
    クレオチドの最後の塩基である〕 を有する最後のヌクレオシドまで結合され、５′若しく
    は３′位置における最後のヌクレオシドのヒドロキシル
    基はできれば保護されておりかつ異なるプリン型若しく
    はピリミジン型塩基はそのアミン基ができれば保護され
    ていることを特徴とする支持体に基づく新規なオリゴデ
    オキシリボヌクレオチド若しくはオリゴリボヌクレオチ
    ド。
17. （１７）式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 式（ I ） 〔式中、式（ I ）を有する支持体は３′位置にてＢ＿
    １、Ｂ＿２…Ｂｚ塩基を有するオリゴデオキシリボヌク
    レオチドに結合され、かつＲ＿２は水素原子若しくは保
    護基のいずれかであり、Ｒ＿３は水素原子若しくは保護
    基のいずれかであり、プリン型若しくはピリミジン型塩
    基はそのアミン基ができれば保護されている〕 を有する特許請求の範囲第１６項記載の支持体に基づく
    新規なオリゴデオキシリボヌクレオチド。
18. （１８）Ｚが−（ＣＨ＿２）−（ＣＨ＿２）＿２−基で
    ある特許請求の範囲第１４項乃至第１７項のいずれかに
    記載の支持体に基づく新規なオリゴデオキシリボヌクレ
    オチド、オリゴリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレ
    オシド及びリボヌクレオシド。
19. （１９）ペプチドの合成に使用する特許請求の範囲第１
    項乃至第９項のいずれかに記載の式（ I ）を有する支
    持体。