JPS6311848A - アデノシン３リン酸関連化合物の簡易測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産ｔ１−の矛１１ノ＞！Ｉ’ 本発明はる水産巣、食品産業、分析機器産業、分析試薬
産業の各分野で利用される。

え米立且遺 従来ＡＴＰ　（アデノシン３リン酸）関連化合物すなわ
ちＡＴＰ分解物の組成分析にはクロマトグラフ法や酵素
法が行われていたが、その操作には数十分ないし数時間
を要し、しかも高価な液体クロマトグラフ装置や紫外分
光光度計を要していたが、先に木発明者等はＡＴＰ分解
物の組成１分析を数分間程度で迅速にかつ簡便な溶存酸
素（ＤＯ）測定装置によって行い、魚、肉類の鮮度を判
定する方法を見出した（特開昭５９−２３２０９７およ
び特開昭６０−４？Ｈ５）。

特開昭５９−２３２０９７においてはキサンチンオキシ
ダーゼ（ＸＯ）　、ヌクレオシドホスフォリラーゼ（Ｎ
Ｐ）＋キサンチンオキシダーゼ（ＸＯ）　、アルカリホ
スファターゼ（ＡＰ）＋ヌクレオシドホスフォリラーゼ
（ＮＰ）＋キサンチンオキシダーゼ（ＸＯ）の各酵素の
作用の下に溶存酸素（ＤＯ）減少量を用いて、それぞれ
ヒポキサンチン　（Ｈ１１）、イノシン（ＨＸ　Ｒ）　
、およびイノシン酸（ＩＭＰ）の量を求めた。

特開昭６０−４７１３９５においては、高純度のアルカ
リホスファターゼ（Ａ　Ｐ）の代わりに粗アルカリホス
ファターゼ（粗ＡＰ）を用いることによって、粗ＡＰ＋
ＮＰ＋ＸＯの複合作用によって、前記出願の適用範囲を
拡げて、ＡＴＰ＋ＡＤＰ本Ａ　Ｉ’ｖｌ　Ｐ＋　Ｉ　Ｍ
Ｐ＋Ｈ！　Ｒ＋Ｈ！の測定を可能とした。

ネ１１が　・　しようと干るＩｊｔＩＩｎへＡＴＰは動
物のエネルギー代謝の鍵物質（Ｋｅｙｓｕｂｓｔａｎｃ
ｅ　）であることからＡＴＰ関連化合物の４１１定は玉
要である。前述したように、本発明者等は既に特定の酵
素の作用下にＤｏの減少によりＡＴＰ関連化合物を測定
したが、本発明では更に酵素の使用種類を拡張して１本
発明者等のこれまで開発した技術を更に発展せしめよう
とするもので、特にＡＭＰ、Ａｄ　Ｒの分別定量を可能
にし、本発明者等のａｌｌ定法の利用範囲を拡げること
を目的としている。

ＩＥＬｊｍ占　　Ｌ　るための一 本発明はＡＴＰ関連化合物を定量する際、酵素ヌクレオ
シドホスホリラーゼ（Ｎ　Ｐ）とキサンチンオキシダー
ゼ（ＸＯ）の複合作用の下に溶存酸素減少量又は過酸化
水素生成量の電気化学的信号によりａｌｌ定する方法に
おいて、被検液にＮＰとｘｏの複合作用をさせる前に、
（ｉ）酸ホスファターゼ（Ａｃ　Ｐ）もしくはヌクレオ
チダーゼ（ＮＴ）を作用させるか、（ｉｉ）アデノシン
デアミナーゼ（ＡＤＡ）を作用させるが、　（ｉｉｉ）
ヌクレオチダーゼ（ＮＴ）を作用させたのちに、ＡＤＡ
を作用させることによって、それぞれＩＭＰ、Ａｄ　Ｒ
，ＡＭＰを測定し、かくしてこれらの化合物の少くとも
１つを測定することよりなるＡＴＰ関連化合物の測定方
法を提供するものであって、又この方法を使用する際に
、被検液に前景って、粗アルカリホスファターゼ（１１
ＡＰ）を添加し予備反応させることによって、ＡＴＰ関
連化合物の混合液よりＡＴＰ＋ＡＤＰ＋ＡＭＰ＋Ａｄ　
Ｒ＋Ｉ　ＭＦ＋Ｈｚ　Ｒ＋Ｈｘ　　（以後、総ＡＴＰ関
連化合物と呼ぶ）、ＡＭＰ、Ａｄ　Ｒ，ＩＭＰ、ＨＸ　
Ｒ。

ＨＸを溶存酸素減少量又は過酸化水素生成量の電気化学
的信号によりΔＩＩＩ定する方法を提供するものである
。

本発明はＡＴＰ関連化合物の測定において、下記フロー
シート（１）に示される酵素反応にもとづき、各成分を
順次酵素化学的に変化させ、最終的にキサンチンオキシ
ダーゼ（ＸＯ）によりヒボキサンチン（Ｈｚ）がキサン
チン（Ｘ）を経て、尿酸（ＵＡ）に酸化される過程で、
ＨＸ　１分子につき吸収される２分子の０２又は生成さ
れる２分子のＨ２Ｏ２の漬を電気化学的センサーでとら
えることを骨子とするものである。

フローシーｈ（１）中で粗ＡＰ（粗アルカリホスファタ
ーゼ）とあるのは、本発明者等が先の出願（特開昭Ｇｏ
−４７８９５）で述べた如＜、ＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰ
にも作用を及ぼすＡＰ酵素液で、この粗ＡＰはざらにＡ
ｄ　Ｒも分解することがわかっている。なおＡＰには高
純度のものもあるが、このものはＩＭＦをＨｘＲに変換
するのみで、ＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰには有効に作用し
ない。

本発明に用いるセンサーにはポーラログラフ式あるいは
ガルへ二電池式酸素センサー及びポーラログラフ式過酸
化水素センサー等公知のものが用いられる。これらのセ
ンサーの出力信号はＡｌｌ！ｌｌ分定モル濃度の２倍に
相当する電流であるため、酸素濃度又は過酸化水素濃度
既知の純水を基準として、測定成分の標準液なしで定量
することができる。さらに試料中に紫外線吸収性の物質
や色や薊りがあってもａｌｌｌ　疋に何等支障を生じな
い利点がある。

；（発明に用いる装置は、小型軽量で取扱いも容易なた
め、実験室以外の生産現場、農場、野外で使用すること
も可能である。

第１図は１本発明に用いる反応槽及び装置系統図である
。すなわち図中１は反応槽で、その容積は１〜２１程度
の小さいものが酵素、試薬の節約ト有利である。２は反
応槽の密栓でその中心に液注入用の例えば直径１ｍｍ程
度の細い穴３が備えられている。この細穴に入った液は
水封効果つまりクスターラーの攪拌子、６は温度制御用
ジャケットで外部の恒温水７を循環させるためのもので
ある０反応槽の形状は特に限定はないが、反応液の定常
的混合攪拌ができて反応温度の制御、試薬の注入に便利
で、しかも外界からの酸素が反応液に溶は込まない構造
＋あることが必須条件である。

センサー８は前記したもののうちの任意のものが用いら
れる。９は増幅器である。１０は市阪の任意のｍＶレコ
ーダでＩＯｍＶフルスケールで分’Ｅ位のスピードでの
記録可能なものが用いられる。１１は測定結果を自動も
ガ算する電算機であるが必ずしも必要ではない。

次に本発明に用いる酵素について説明する。

第１表に水沈で用いる酵素とその反応条件を示す。組ア
ルカリホスファターゼ（粗ＡＰ）、ｌ’ｄホスファター
ゼ（Ａｃ　Ｐ）、ヌクレオチダーゼ（Ｎ　Ｔ　）の３酵
素は試料液を別容器で予備反応させる。また酵素製剤に
おこりがちなカタラーゼの混入による０２発生現象は水
沈の実施上の大きな妨げとなるので、これを防ぐためリ
ン酸緩衝液にアジ化ナトリウム（ＮａＮ３）をｌＩＩＩ
Ｍ程添加することが望ましい。

／′ ７、／ ／′ ／−ｍ−−、−− なお、以下の実施例では第２表に示したＡＴＰ関如化合
物の純品を混合して、各種のＡＴＰＩ″Ａ連化合物の混
在する液を：Ａ製して用いた。

注二　よ　結晶水を考慮しないで純度を算出した。（こ
の試薬のロフトは Ｃｌ０Ｈ１ＩＮ４　Ｎ　ａ２０．ｌＰ　・７．５　Ｈｚ
　０の分子式を示した） １−記名試薬単独のＩＱ　ｍＭの水溶液を原液として調
製し１次に各原液を適宜混合し、更に０．１Ｍのリン酸
緩衝液で希釈して、各成分の所定の濃度を有する被検液
をｒＡ製した。

実施例 （ａ）イノシン酸（ＩＭＰ）の定量 以下酸素センサーを用いる場合について操作手順を述べ
るが、過酸化水素センサーの場合もこれに準する。

被検液： Ｌ通したようにして、ＩＭＦ、ＨＫ　Ｒ，Ｈｚの３成分
をそれぞれ０．２ｍＭの濃度で含有する被検液を調製し
た。

予備反応条件： 被検液中のＩＭＦを予めＨｚ　Ｒに変化するために、被
検液の一部に、酵素ＡｃＰもしくはＮＴを添加して予備
反応させた。この被検液を５２とする。その予備反応の
条件は第３表の通りである。

第３表予備反応条件 定１１１操作： ２０００μ容積の反応槽（第１図（１））に３７℃で空
気飽和させたＰ、Ｂ、緩衝液を充填し、密栓（２）をし
、その細穴（３）よりマイクロシリンジで、被検液Ｓ＋
　　（予備反応させない）　５０ＩＬｊを注入する。そ
してＤＯレコーダーの指示が安定しタラ、　Ｘ　ＯトＮ
　Ｐ　Ｉｆ）　ＩＡ合酵素液２５ｇｊ（ＭＯ＝２０μ、
ＮＰ＝５μ）を注入する。ただちに酵素反応が起こり、
第２図のようにＨｚ　＋Ｈｘ　Ｒの酸化に由来するＤＯ
減少ｄＴｏ＋）！ｘＲがレコーダー１−に記録される。

ＤＯ減少の停止トを確認したのち、Ｌ記の如く予備反応
させた混合液Ｓ２１００μ（この量は５１５０μに相当
する）を注入すると、今度はＨｚ　＋　ＨＸ　Ｒ＋　Ｉ
　Ｍｐｔ：由来するＤＯ減少ｄｉ（ｗｅ）ｌｘＲ＋ｌ１
ＩＰが記録される。

ｄ　ＩＭＰ　　：　ｄＨ！◆Ｈ！Ｒ−ＩＭＰ　　　　’
　Ｈ！＋Ｈ！Ｒこの式で示されるように第２段と第１段
のり。

減少値の差がＩＭＦの濃度に対応するＤｏ減少幅に相当
する。勿論、酵素ｘＯとＮＰを混合液の形でなく、先ず
ｘｏを添加して、それに相当するＤＯ減少を記録した上
で、ＮＰを添加してその際のＤＯ減少を記録することも
できる。この場合はｄＩ（！＋Ｉ（ＩＲ＝　ｄ　）Ｉｔ
十ｄ　１（ｔＲとなる。このＩＭＦの定量の方法におい
ては、予備反応において用いられる酵素Ａｃ　Ｐ又はＮ
Ｔが、Ｓ２として反応槽に注入される際に、Ｓ１中のＩ
ＭＦ成分が化学変化しないことを利用している。即ちＡ
ｃ　Ｐの作用はＰ、Ｂ、　ｌ衝液の燐酸イオンによって
阻害されるために１反応槽内のＰ、Ｂ、緩衝液中にＳ２
を注入してもＳ１中のＩＭＦ成分は変化せず、又ＮＴを
用いた場合は、アルカリ性のＳ２液を注入しても、反応
槽のｐＨはＰ、Ｂ、緩挿ｌ液にもとづいて殆ど変化せず
、中性付近に保たれるために、ＮＴがＳ１中のＩＭＦ成
分に作用しないからである。

次に濃度の算出法を述べる。３７℃の空気飽和水を満た
した密栓をした反応槽に微量の塩化コバルトを添加した
０、５Ｍ　　Ｎａ２ＳＯ３溶液　１００４４を注入し、
ＤＯ飽和からＤｏゼロに至る減少曲線を得て、減少幅ｄ
ｏを測定する。この長さが３７℃における０２飽和１０
．２１４　ｇ　ｍａｔ／ａｊに対応するので１次の（２
）式によりＩＭＦの濃度が求められる。

但し　（２）式において Ｃ：定量成分の濃度（ｕ　ｌｌ１ｏ　ｌ／ｍ１）ｄ　：
定量成分についてのＤｏ減少幅（ｃｍ）ｄｏ：空気飽和
水についてのＤｏ減少幅（ＣＩＩ）Ｇｏ’２　　：空気
飽和水の酸素濃度（ｐｍｏｌ／ｍ１）３７℃では０．２
１４　（ｇｍｏｌ／ｍ１）２　：酸素当付数 Ｖ　二反応槽の容積（ＩＩＪ） ｖｓ：被検液（Ｓｌ）の容積（μ） かくシテ求められたＩＭＰ、Ｈｚ　Ｒ，Ｈｚ各成分の濃
度は定量的であり、最初の０．２０Ｍに近い値を示した
。

第６図（１）、（２）はそれぞれＡｃ　Ｐ、ＮＴを用い
てＩＭＦ濃度既知の標準液を用いて、ＩＭＦ濃度と酸素
消費量（この消費量は標準液を用いたときのＤｏ減少値
と前記ｄｏ値との関係より算出できる）をプロットした
検量線である０両図によってどちらの酵素を用いてもＩ
ＭＦ１モルに対して０□２モルが消費されることが定量
的に示され、ＩＭＰｃ度を０２消費による電気化学的信
号によって定量する本発明方法の意義がある。

なお、測定誤差を生じないためには１反応（測定）終了
時に残存する溶存酸素（ＤＯ）が、位相時の少くとも１
０〜２０％残存するようにすることが必要である。その
ためには、反応槽に注入する被検液の４を予め十分調整
する。

（ｂ）アデノシン（Ａｄ　Ｒ）の定着 反応槽に３７℃で十分に空気飽和したＰ、Ｂ　、を充填
し密栓後、Ｈ！　、Ｈｚ　Ｒ及びＡｄ　Ｒをそれぞれ０
．２ｍＭを含む被検液５０μを注入し、次に酵素ｘＯ＋
ＮＰ、２５ｇｊを注入する。第３図のように、初めのＤ
Ｏの減少がレコーダーに記録されるので、その反応の停
止トを確認してから、酵素ＡＤＡ５μをさらに注入する
と再びＤＯ減少（ｄＡｄＲ）が記録される。かくして求
められたＡｄ　Ｒ，Ｈ！　ＲｌＨｚの濃度はそれぞれ最
初の０．２ｍＭに近い値を示した。第７図は、Ａｄ　Ｒ
の標準液について上記方法で求めた酵素消費量の検量線
であり、ＡｄＲ１モルに対し２モルの０２が吸収される
ことが分る。

したがって実用的には、特にこのような検量線を作製せ
ず、（２）式を用いてＡｄ　Ｒを直ちに定量することが
できる。

（ｃ）ＡＭＰの定量 別容器にＧ、Ｂ、　１８０ＩＬｊ、　ＮＴ２０ｇｊ、　
Ｈ！　、　ＨｘＲ，ＡＭＰ、ＩＭＦ、Ａｄ　Ｒいずれも
０．２ｍＭを含む検液２００ＩＬｊをとり、３７℃で約
５分間予備反応させる０反応槽に３７℃で空気飽和した
Ｐ、Ｂ、を充填した後、密栓をし、上記の如く予備反応
させた混合液Ｓ、　　１００μ（この量は原検液５０ｇ
ｊに相当する）を注入し、次にＸＯ＋ＮＰ２５μを注入
すると、（ａ）で述べたように、Ｈｘ＋ＨｘＲ＋ＩＭＰ
に由来するＤＯ減少が得られる。レコーダーでＤＯ減少
の停止を確認してからＡＤＡ５μを注入すると、ＡＭＰ
＋Ａｄ　Ｒに由来するＤｏ減少ｄ　ＡＭＰやＡｄＲが得
られる（第４図（１））、これはＮＴがＩＭＰをＨＸＲ
にするだけでなく、ＡＭＰをＡｄ　Ｒにする特性をもっ
ためである。次に、新たに反応槽に３７°Ｃで空気飽和
したＰ、Ｂ、を充填した後、ｖ：栓をし、原検液５０μ
を注入して、（ｂ）で述べたと全く同様な操作を繰返し
てｄ　ＡｄＲを得る（第４図（２）　）　−ｄＡＭｐ　
＝　ｄＡＭｐ＋ＡａＲ−ｃｌａａＲによってＡＭＰの量
に相当するＤｏ減少’［ｄ　ＡＭＰを得るが、この際第
４図（１）、（２）に示す２本のり。

減少曲線を利用することができる。かくして得られたｄ
　ＡＭＰを（２）式に代入してＡＭＰ濃度を算出する。

かくして求められたＡＭＰおよびその他の成分の１＝度
はそれぞれ最初の０．２ｍＭに近い値奢示した。−［−
記の方法においてＸＯ＋ＮＰの混合液の代りにｘＯおよ
びＮＰをそれぞれ順次注入してＨＸおよびＨＸＲの含量
に相当するＤ　Ｏ減少幅を記録して行うこともできる。

第８図は標準液を用いて得たＡＭＰ濃度と酸素消費量と
の関係を示す検に線である。

（ｄ）ＡＴＰ関連化合物の混合液中のＨ！　％　ＨＸ　
ＲＸ、ｌ／ＩＭＦ、Ａｄ　Ｒ，ＡＭＰおよび総ＡＴＰ関
連化合物の定量法。

本発明者等が先に出願した特開昭８０−４７１３９５の
中で述べたＨＸ　、Ｈｚ　Ｒ，１ＡＴＰ関連化合物のＪ
１１定法に前記（ａ）（ｂ）　（ｃ）を組み合わせると
ＡＴＰ関連化合物の混合液よりＨＸ　、ＨＸ　ＲｌＩＭ
Ｆ、Ａｄ　ＲおよびＡＭＰの５次分を短時間で定量する
ことができる。

（ｄ−１） 別容器Ａに、Ｇ、Ｂ、　１８０ｇｊ、　ＮＴ２０ｔＬｊ
、第２表注に記した要領で調製したＨＸ　、ＨＸ　Ｒ，
ＩＭＰ、ＡｄＲ，ＡＭＰ、ＡＤＰ、ＡＴＰの０．２ｍＭ
を舎む被検液２００μを採り、３７°Ｃで約５分間予備
反応させておく（これを被検液Ｓ２とする）。又、別容
器ＢにＧ、８．１８Ｑμ、粗ＡＰ２Ｑμ、上記と同じ検
液２００μをとり、３７°Ｃで約５分間予備反応させて
おく（これを被検液Ｓ３とする）０反応槽に３７°Ｃで
空気飽和したＰ、Ｂ、を充填した後、密栓をし、第５図
（１）に従って検液Ｓ、５０μを注入し。

レコーダーの指示が安定したら、Ｘ０２Ｑμを注入しＨ
Ｘの量に相当するＤＯ減少値ｄｉを読みとり、次にＮＰ
５ｇｊを注入しＨｘＲの量に相当するｄｌを読みとる０
次に、別容器Ａで予備反応させた液５２１００μ（この
量はＳ、　５０μの内容と同等である）を注入してＨｘ
　＋Ｈｘ　Ｒ＋ＩＭＦの量に相当するｄ３を記録する０
次にＡＤＡ５μを注入してＡＭＰ＋２Ａｄ　Ｒの量に相
当するｄ、を記録する（２ＡｄＲはＳｌ　とＳ２中の含
量の合計を示す）０次に別器Ｂで予備反応させた検液５
３１００μ（この量はＳ、　５０μや５２１００μに相
当する）を反応槽に注入して総ＡＴＰｒＡ連化合物に相
当するｄ５を記録する。旧述したように、別容器Ａおよ
びＢで予備反応をＰＨアルカリ側で行い、反応槽内の反
応を中性付近で行うことによって、最適ｐＨの差異によ
る各反応を使い分けることができる。

［−記の結果より直接ＡＭＰとＡｄ　Ｒを定量すること
がでさないために１次のような実験を続ける。上記の実
験と同じ条件であるが、注入する順序を４ｇ　、ＸＯ，
ＮＰ、ＡＤＡ、Ｓ２　、Ｓｌとして第５図（２）のよう
なりｏ減少曲線を得る。

この時、各減少幅は、　　ｄｌがＨＸの量に相当し、　
ｄｌがＨｚ　Ｒの量に、ｄ３′がＡｄ　Ｒの量に、ｄ４
′がＨＸ　＋ＨＸ　Ｒ＋ＩＭＦ＋Ａｄ　Ｒ＋ＡＭＰのか
に、　ｄ、が総ＡＴＰ関連化合物の量に相当する。よっ
て　ｄＨｘ＝ｄ＋　、ｄＨｘＲ＝　ｄｌ、ｄ　Ｉにｐ　
　＝　　　ｄ３　　　　（ｄｌ　　　＋　　ｄｌ　）　
　、　　　ｄ　　ＡｄＲ＝　　　ｄ：＋′　、ｄ　ＡＭ
Ｐ　＝　　＋Ｌ　−２ｄ３’　＝　ｄｎ’　　（ｄ３＋
　ｄ３’　）となる。これらの値を（２）式に代入して
各成分濃度が求められる。又ｄ５やａ、、　−ｄ、；の
偵を（２）式に代入して夫々総ＡＴＰ関連化合物および
ＡＤＰ＋ＡＴＰの濃度を求めることができる。かくして
求められた各成分の濃度は定量的で、最初の０．２ｍＭ
に近い値を示した。

（ｄ−２） Ｈｘ　　Ｏ，１ｍＭ ＨＸ　Ｒ，ＩＭＦ、Ａｄ　Ｒ，ＡＭＰ、Ａ　Ｄ　Ｐ　、
　Ａ　Ｔ　Ｐ　　０．２ｍＭ（総ＡＴＰ関連化合物　１
．３ｍＭ） を用いて（ｄ−１）と同様な測定を２回行った。求めら
れた各成分の濃度は下記の通りであるが、略定量的であ
った。

ＮｏＩ　　Ｏ，１３０，１９０，１５０，１３０，２５
１，２９Ｎｏ２　０．１４　０．２０　０．２９　０．
１４　０．２８　　１．４１（単位ｍＭ） （ｄ−３） ）（！　、ＨＸ　Ｒ，ＩＭＰ、ＡＭＰ、ＡＤＰ、ＡＴＰ
　　各０．２ｍＭ （総Ａ　Ｔ　Ｐ　１５５連化合物（ただしＡｄ　Ｒを含
まず）　１．２ｍＭ） を含む被検液を用いて（ｄ−１）における第５図（１）
に従って４回Ａ１１ｌ定操作を行った。求められた各成
分の濃１１は下記の通りであるが、略定品−的であった
。

を含まず） Ｎｏｔ　　Ｏ，１７０，１７０，１２０，２２１，１５
Ｎｏ２　０．１４　０．１８　０．２７　０．２２　　
１．２７Ｎｏ３　０．１３　０．１８　０．２８　　Ｑ
、２２　　１．２８Ｎｏ４　０．１３　０．１７　０．
４８　０．２７　　１．２７（単位ｍＭ） （ｄ−４） Ｈｌｌｏ、１１！ＩＭ ＨＸＲ，ＩＭＦ　　各０．１５１１ＩＭＡＭＰ、ＡＤＰ
、　ＡＴＰ　各０．２　ｍＭ総ＡＴＰ関連化合物（ただ
しＡｄ　Ｒを含まず）１．０ｍＭ を含む被検液を用いて（ｄ−３）と同様に４回Δ１１ｊ
２操作を行った。求められた各成分の濃度は下記の通り
であるが、略定ｈｌ的であった。

総ＡＴＰ関連化合 を含まず） Ｎｏｔ　　Ｏ，１３０，１７０，０８−１，０８Ｎｏ２
　０．１２　０．１５　０．１４　０．１８　　０．９
９Ｎｏ３　０．１１　０．＋４　０．１８　０．２２　
　０．９８Ｎｏ４　０．１２　０．１７　０．０？　　
０．３９　　０．９８（単位ｍＭ） （ｄ−５） ＨＸ　　Ｏ，ＬｍＭ ＨＥ　Ｒ，Ａｄ　Ｒ８０，１５ａ＋Ｍ ＡＭＰ　’、ＡＤＰ、ＡＴＰ　　各０．２ａ＋Ｍ総ＡＴ
Ｐ関連化合物（ただしＩＭＦを含まず）１．０ｍＭ を含む被検液を用いて（ｄ−１）における第５図（２）
に従って４回測定操作を行った。求められた各成分の濃
度は下記の通りであるが、略定埴的であった。

■肝を含まず） Ｎｏｌ　　Ｏ，１３０，１６０，１？　　０．３２　　
１．１１３Ｎｏ２　０．１５　０．２０　０．１２　０
．３０　　１．１８Ｎｏ３　０．１４　０．１９　０．
１５　０．２８　　１．０５Ｎｏ４　０．＋３　０．１
９　０．１Ｂ　　０．２４　　１．１９（単位ｍＭ） 実施例（ａ）〜（ｄ）の１１１１１定において各酵素反
応は１分前後で終了するため、Ｄｏ減少曲線を得るのに
　（ａ）〜（ｃ）の場合で僅かに５分程度であり、（ｄ
）の場合でｌＯ分程度である。なお１本発明においては
酵素の特異性を利用して多くの複合作用を連続させるた
めに、各酵素剤に他の酵素の混入がないことが重要であ
る。

え乳立亘」 上記説明より明らかなように、本発明方法は従来のクロ
マトグラフ法や酵票法がＡＴＰ関連化合物の組成分析に
数時間を要していたのに対し、ｌａ分程度で迅速に行う
ことができるばかりでなく、本発明者等が先に発明した
Ｄｏ減少もしくはＨ２Ｏ２生成量を電気化学的信号によ
ってＡＴＰ関連化合物の組成分析する方法を更に改良し
たものである。すなわち特定の酵素を利用することによ
ってＡｄＲやＡＭＰも定量することができるようになっ
た。従って本発明の方法によってＡＴＰＩ３８連化合物
の組成を詳細に分析することができるので、魚介類や肉
類の鮮度測定に限らず、生化学、薬学、農学、医学、バ
イオテクノロジー等の広い領域に有用な分析技術である
０本発明に使用される酵素類の使用量も少なく極めて経
済的である。

記録されたＤｏ減少値やＨ２Ｏ２生成量を基にして、各
成分の濃度を手計算だけでなく、電算機連動による自動
演算も容易である。

従来技術に比べて、本発明の測定法は実験室ばかりでな
く、生産、流通の現場にも容易に実施され、食品産業の
振興、食品衛生の改善、消費者保護等の観点からも極め
て望ましいものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明方法を実施するのに適した装置の反応
槽の縦断面図および装置系統図である。 第２〜５図はそれぞれＩＭＦの定積；　Ａｄ　Ｒの定：
、：　、　Ａ　Ｍ　ｐの定；）　；　Ａ　Ｔ　Ｐ関連化
合物の混合液中のＨ！　、Ｈ！　ＲｌＩＭＰ、Ａｄ　Ｒ
およびＡ　Ｍ　Ｐおよび総ＡＴＰ関連化合物の定量；に
おけるり。 減少曲線を示す。 第６〜８図はそれぞれＩＭＦ、Ａｄ　Ｒ，ＡＭＰの検＋
、を線である。第６図（１）および第６図（２）は、そ
れぞれ予備反応にＡｃ　Ｐ、ＮＴを用いた場合である。 特許出願人　　オリエンタル酵母ｆ業株式会社オリエン
タル電気株式会社 代　　理　　人　　　若　　　林　　　　　　忠時間（
弁） 第２図 第４図 第５図 窩−←Ｅ参調 各艇−Ｆ！：砒−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、アデノシン３リン酸（ＡＴＰ）関連化合物にヌクレ
   オシドホスホリラーゼ（ＮＰ）とキサンチンオキシダー
   ゼ（ＸＯ）を複合的に作用させて、溶存酸素の減少量又
   は過酸化水素生成量の電気化学的信号により測定する方
   法において、被検液にＮＰとＸＯを複合的に作用をさせ
   る前に、（ｉ）酸ホスファターゼ（ＡｃＰ）もしくはヌ
   クレオチダーゼ（ＮＴ）を作用させるか、（ｉｉ）アデ
   ノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）を作用させるか、（ｉｉ
   ｉ）ヌクレオチダーゼ（ＮＴ）を作用させたのちに、Ａ
   ＤＡを作用させることによつて、それぞれイノシン酸（
   ＩＭＰ）、アデノシン（ＡｄＲ）、アデノシン１リン酸
   （ＡＭＰ）を測定し、かくしてこれらの化合物の少くと
   も１つを測定することよりなるアデノシン３リン酸関連
   化合物の測定方法。 ２、特許請求の範囲第１項の記載方法において、被検液
   を（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）のすべての操作に付す
   る前に、粗アルカリホスファターゼ（粗ＡＰ）を作用さ
   せることによって、アデノシン３リン酸（ＡＴＰ）＋ア
   デノシン２リン酸（ＡＤＰ）＋アデノシン１リン酸（Ａ
   ＭＰ）＋アデノシン（ＡｄＲ）＋イノシン酸（ＩＭＰ）
   ＋イノシン（ＨｘＲ）＋ヒポキサンチン（Ｈｘ）（ただ
   し、各成分のいずれかが欠けていても差支えな い）、ＡＭＰ、ＡｄＲ、ＩＭＰ、ＨｘＲおよびＨｘのそ
   れぞれを測定することよりなるアデノシン３リン酸関連
   化合物の測定方法。