JPS63260935A - 多孔質ポリアミノ酸球状粒子の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、疎水性ポリアミノ酸を素材として、巨大分子
、特に糖、蛋白質および核酸等を分離精製するために、
液体クロマトグラフィーに用いる細孔径の大きい多孔質
ポリアミノ酸球状粒子を製造する方法に関する。

〔従来技術及び発明が解決しようとする問題点〕各種ク
ロマトグラフィー用充填剤としては、従来より種々の素
材からなる球状体が用いられて来ているが、改良すべき
問題点も多く残されており、特に巨大分子（例えば蛋白
質など分子量が１万以上の高分子量分子）をクロマトグ
ラフィー技術を使用して分離および分取を行う場合には
問題点が多い。巨大分子の分離のために有機物質および
無機物質が使用されているが、これらの物質は若干の欠
点があるため満足なものでない。

例えば、巨大分子の分離のための有機物質としては、セ
ファデックスと称されるデキストランを三次元的に架橋
した天然重合体およびポリアクリルアミドを三次元的に
架橋した合成高分子のような有機物質が多用されている
が、この充填剤はその物質と接触する媒質のｐＨおよび
イオン強度の変化によって容易に膨張、収縮を受ける。

又これらの充填剤は、圧力下の強度が弱く、煩雑な架稿
処理を行い強度を高く保つことが行われる。しかし・架
橋度を高くすると分画出来る高分子物質の範囲が小さく
なる欠点があり、巨大分子を分離することが困難となる
。

多数の無機物質も巨大分子の分離に使用されて来ている
が問題がある。例えば、シリカゲル系はアルカリ側では
使用に耐えないし、ヒドロキシアパタイトは結晶がもろ
くて微細粒子にまでこわれる傾向を有するし、硫酸バリ
ウムは蛋白質等に高度の吸着容量を与える等−長一短が
あり、巨大分子を分離精製する液体クロマトグラフィー
用充填剤としては満足なものではない、理想的には、巨
大分子を分離するための物質は圧力、温度および化学薬
品に対して安定であり、巨大分子に対してほとんど損傷
を与えなく分離しうるちのであることである。

近年、各種クロマトグラフィー充填剤球状粒子の素材と
して、従来より使用されているものとは全く別異の素材
である疎水性ポリアミノ酸の利用が提案され、その特巽
な性質が注目されているが、その分画能は必ずしも十分
ではな（、特に巨大分子の分画に未だ問題を残している
。

本発明の目的は巨大分子（分子量が１万以上の高分子量
）の分画が出来る細孔径の大きい多孔質球状粒子であり
ながら圧力に耐える強度を有し、耐溶媒性に優れ、充填
塔に通液したときに圧力損失が極く少ない新規なポリア
ミノ酸球状粒子の製造法を提供することにある。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明は疎水性ポリアミノ酸と多孔化用添加剤とを含有
させた有機溶媒溶液を水性媒体に添加し、撹拌しつつを
機溶媒を除去し、ついで多孔化用添加剤を抽出処理する
ことにより多孔質ポリアミノ酸を製造する方法において
、上記多孔化用添加剤は該ポリアミノ酸に非相溶性で咳
有Ｓ溶媒に相溶性で水性媒体に非溶解性であり、且つそ
れらの有機溶媒および水性媒体よりも沸点が高い液体ま
たは固体であり、有機溶媒の除去は不活性気体の流通下
に０℃よりも高（該有Ｍ１溶媒の沸点よりも低い温度で
、且つ有機溶剤の少なくとも５０％が除去されるまでは
実質的に一定速度で除去されるように蒸発させることに
より行うことを特徴とする、巨大分子の分画が可能な細
孔径の大きい多孔質ポリアミノ酸球状粒子の製造法であ
る。

本発明に用いられる疎水性ポリアミノ酸とは、ポリアラ
ニン、ポリロイシン、ポリイソロイシン、ポリノルマル
ロイシン等の本来的に疎水性のポリアミノ酸のみならず
、親水性ポリアミノ酸を疎水性化したもの（疎水性基を
導入した親水性アミノ酸ポリマー）も包含する。そのよ
うな変性ポリアミン酸としては、ポリグルタミン酸、ア
スパラギン酸等の酸性ポリアミノ酸を疎水性エステル化
したもの、例えば、それらのアミノ酸のアルキルエステ
ル、ベンジルエステル、シクロヘキサンメチルエステル
、テトラヒドロビランメタノールエステル等を挙げるこ
とができ、また、リジンのような塩基性アミノ酸を疎水
性カルボキシ化したもの、例えば、そのようなアミノ酸
のカルボベンゾキシ化物、カルボエトキシ化物を挙げる
ことができる。

本発明で用いる有Ｉａ溶媒は、疎水性ポリアミノ酸と多
孔化用添加剤の両者を溶解させ、且つ溶解液を水性媒体
中に加えたときに、疎水性ポリアミノ酸を形成するとと
もに、撹拌を続けると蒸発し得るものである。したがっ
ソ、この有機溶媒としては、疎水性ポリアミノ酸を良好
に溶解するとともに水に不溶であり、且つ沸点が水より
も低いものを採用する。好ましい有８１溶媒の例は、ク
ロロホルム、ジクロロメタン、ジクロロエタンおよびそ
れらに類似するハロゲン化炭化水素、ベンゼン並びにそ
れらの混合溶媒である。

疎水性ポリアミノ酸の濃度は疎水性ポリアミノ酸と有機
溶媒の合計に対して１．０〜１０重量％が好ましい。

本発明において多孔化用添加剤を用いるのは有機溶媒を
蒸発させる過程において、相分離を起こさせ多孔質とす
るためである。用いる多孔化用添加剤としては、ナフタ
ジンのごとき結晶性の物質を固体状態で加えることもで
きるが、一般にデカリン、ジオクチルフタレート、テト
ラリン、トルエン、キシレン、エチルベンゼン、ジエチ
ルベンゼン、アニソール、ドデカン酸メチル、ヘキサノ
ール、オククノール、ジブチルエーテルのような液体が
例示できる。

これらの中でも細孔径の大きい多孔質球状粒子を製造す
るには、ポリアミノ酸との相分離が比較的良好なデカリ
ン、ジオクチルフタレート、ドデカン酸メチル等を多孔
化用添加剤として用いると細孔径の大きい多孔質球状粒
子が得られる。また、球状粒子の多孔度および孔径の調
節には、上記多孔化用添加剤の添加量によっても行うこ
とが出来、ポリアミノ酸と多孔化用添加剤との比率によ
って空孔率が１０〜８０％である多孔質構造を有する多
孔質ポリアミノ酸球状粒子を得ることが出来る。多孔化
用添加剤が少ないと相分離が起こりにくく、また多すぎ
ると得られる多孔質球状粒子の強度がでなくなる。通常
用いられる範囲は疎水性ポリアミノ酸の０．１〜５重量
倍程度である。

疎水性ポリアミノ酸と多孔化用添加剤の有機溶媒溶液は
水性媒体に添加し、撹拌して球状粒子とする。ここで水
性媒体とは水を意味するが、水溶性ポリマーや界面活性
剤等を添加したものも含む。水性媒体の量は多い方が分
散性が良好で真珠状の球状粒子が得られるが、あまりに
多回に使用すると生産性が悪くなると同時に、後工程で
の水性媒体からの球状粒子の分離が大変となる。通常は
重Ｍ基準で疎水性ポリアミノ酸と多孔化用添加剤の有機
溶媒溶液の等量販上、１０倍量以下である。

得られるポリアミノ酸の球状粒子の粒径を制御する因子
は、主として有機溶媒−水性媒体系の粘度および撹拌速
度である。一般に有機溶媒中のポリアミノ酸濃度を低く
するほど、また、水性媒体系の粘度を高くするほど得ら
れる球状粒子の粒径は小さくなる。また、撹拌速度を大
きくすると、粒径の小さい球状粒子が得られる。粒子径
をｙ４節するためおよび多孔質の孔径を調節しやすくす
るために水性媒体中に粘度調節剤を加えるが、好適な粘
度調節剤の例は水溶性ポリマーであるポリビニルアルコ
ール、ゼラチン等であるが、特に鹸化度が７０〜９９モ
ル％である部分酢化ポリビニルアルコールが良溶解性で
ある上に多孔質の孔径も調節しやすく、細孔径の大きい
多孔質ポリアミノ酸球状粒子を容易に得ることが出来る
。

このようにして疎水性ポリアミノ酸を含有する有機溶媒
から成る球状の液滴の水性媒体分散液が形成される。

次にこの球状液滴中の有機溶媒を蒸発により除去する。

蒸発は０℃よりも高く、使用する有機溶媒の沸点よりも
低い温度、好ましくは２０℃以上、溶媒の沸点より１０
℃低い温度以下で、撹拌下に液表面気相中に不活性な気
体、例えば空気、炭酸ガス、窒素等を流すことにより、
且つ有機溶剤の少なくともｍ１！にで５０％が除去され
るまでは実質的に一定速度で除去されるように行う、か
かる条件下で溶媒の蒸発を行うことにより多孔化用添加
剤とポリアミノ酸とを十分に相分離を起こさせ、球状粒
子中の有機溶媒の急激な蒸発をおさえ、目的とする多孔
質ポリアミノ酸球状粒子を得ることができる。蒸発温度
がＯ″ＣＣ以下水が凍結したり蒸発速度が極端に遅くな
る。有機溶媒の沸点以上では球状粒子の形態を保持でき
なくなったり、粒子同士の凝集が生ずる。なお沸点の異
なる混合溶媒を使用する場合の沸点はつぎの式で計算し
た温度とする。

ｂｐ＝Σｂｐ＋−Ｍ＋ ただし ｂｐ　　　混合溶媒の沸点 ｂｐＩ　溶媒ｉの沸点 Ｗｌ　　　溶媒ｉのモル分率 ここで重要なことは少なくとも有機溶剤の５０％以上、
好ましくは９０％以上が除去されるまでは蒸発速度を実
質的に一定に保つことである。即ち蒸発する有Ｊｍ溶媒
速度を一定に保つことにより、ポリアミノ酸中で細孔径
の大きい空孔率が１０〜８０％である多孔質構造を有す
る多孔質ポリアミノ酸球状粒子を製造することができる
。蒸発速度を一定に保つには、例えば流出する溶媒の量
を測定しつつ、あるいは容器の液面低下を観察しつつ不
活性気体の通気量を調節することにより容易に行うこと
ができる。なお実質的に一定とは通常の操作での制御範
囲内において一定であることを意味し、平均通気量の±
１０％程度の変動は許容するものである。

また液表面気相中に吹き込む不活性気体の流量が多いと
蒸発速度が速くなり、疎水性ポリアミノ酸止多孔賞を形
成させる多孔化用添加剤との相分離が十分に行われない
で有機溶媒が蒸発するために細孔径の大きい多孔質ポリ
アミノ酸球状粒子が得られない。逆に吹き込む流量があ
まりに少ないと有機溶媒がなかなか蒸発せずに疎水性ポ
リアミ　・ノ酸と多孔化用添加剤の相分離が進行しない
、好ましい流量は１〜１００時間、更に好ましくは５〜
５０時間で有機溶媒の蒸発が終了するような流量である
。

かくして得られた球状粒子を濾過し、水洗し、必要に応
じて熱水洗浄を行った後、ポリアミノ酸は溶解しないが
該多孔化用添加剤は容易に溶解する溶剤、たとえばメタ
ノール、エタノール等で該多孔化用添加剤を十分に抽出
処理することにより巨大分子の分画が可能な細孔径の大
きい多孔質ポリアミノ酸球状粒子を製造することができ
る。

〔発明の効果〕

本発明に従えば、本来的に疎水性のポリアミノ酸および
前述したように疎水性化した変性ポリアミノ酸を原料と
して細孔径が大きく、かつ機械的強度の強い硬質化した
多孔質ポリアミノ酸球状粒子が得られる。

即ち本発明に従い製造した多孔質ポリアミン酸球状粒子
は、水溶性多糖類であるデキストランの分子量に換算し
て１０４〜１０６に相当する孔径を有し、また１０〜８
０％の空孔率を有するように調節されている。空孔率が
１０％以下では分画能で１０６以上の大孔径の多孔質体
が得られなく、また空孔率が８０％以上の多孔質体は液
体クロマトグラフィー用充填剤としての耐圧性が不十分
なものになってしまう。

また、球状粒子を製造する過程でβ−構造をもつポリア
ミノ酸球状粒子となるため、架橋処理を行わなくとも硬
質化になり、デキストランやポリアクリルアミドのよう
な三次元的架橋処理を行うことなく、細孔径の大きい多
孔質構造を有し、かつ硬直な多孔質ポリアミノ酸球状粒
子であるという特徴を有している。

この様な球状粒子は逆相クロマトグラフィーやアフィニ
ティークロマトグラフィー等に使用するのに適している
。また疎水性化した変性ポリアミノ酸であって、疎水性
の比較的小さいもの、すなわち、両親媒性のポリアミノ
酸（例えば、ポリメチルグルタミン酸エステル）の球状
粒子は、水系及び有機溶媒系の両方で使用できるゲルク
ロマトグラフィーのゲル粒子に使用され、高分子量領域
の分画に良好である。

また、従来からの既知の方法、例えばエステル交換反応
、アミツリシス反応、アシル化反応等により各種の疎水
性基を導入した多孔質ポリアミノ酸球状粒子は、高分子
量のタンパク質、核酸等の逆相分配クロマトグラフィー
充填剤として良好である。

さらに、既知の方法により疎水性化した変性ポリアミノ
酸を用いた多孔質球状粒子の疎水性基を脱離したり、親
水性基を導入したりした細孔径の大きい多孔質ポリアミ
ノ酸球状粒子は高分子量のタンパク質、核酸等のイオン
交換クロマトグラフィー充填剤およびアフィニティーク
ロマト用担体として良好である。

その他、本発明のポリアミノ酸球状粒子で、細孔径が大
きく、かつ両親媒性のものは透湿性ないしは通気性化粧
品パウダーとして良好である。さらに細孔径の大きい多
孔質ポリアミノ酸球状粒子であるために付着依存性の動
物細胞を撹拌によって浮遊される小さな球状（マイクロ
キャリヤー）の用途にも適している。

〔実施例〕

以下に実施例を示してさらに本発明を具体的に説明する
が、これらの実施例は本発明を限定するものと解される
べきではない。

実施例１ ポリーＴ−メチルーＬ−グルタミン酸エステル（以下Ｐ
ＭＬＧと略す）２．５ｇ、デカリン（多孔化用添加剤）
５．０ｇをジクロロエタン１００　ｍｌに溶解し、これ
を室温で定速撹拌中の２．５ｆｆｌｆｆｉ％部分酢化ポ
リビニルアルコール（以下ＰＶＡと略す）の水溶液４０
０ｍ１中に滴下した。４時間撹拌後、温度を４５℃に昇
温し、撹拌下に液表面気相中に窒素ガスを流しながら、
有機溶媒であるジクロロエタンの蒸発を一定に調節する
ことにより、４８時間かけ蒸発させ、デカリンを含んだ
ＰＭＬＧの球状粒子を得た。この球状粒子をメタノール
溶媒でのソックスレー抽出法により、洗浄してデカリン
を除いたのち、水に懸濁させてＪＩＳ規格適合のふるい
で粒子サイズ別に分別した。主生成物の粒径は、２０〜
３７μｍで９０％以上が１０〜７４μｍであった。

この２０〜３７１ｍの球状粒子の細孔径及び空孔率を推
定するために水系で通常のゲルクロマトグラフ操作を行
った。

すなわち、球状粒子を内径４．６ｍｍ　、長さ１５ｃｍ
のカラムに充填し、デキストラン（分子１９，０００〜
２．０００，０００）およびマルトースの同族体、重水
を標準試料とし、溶出時間と試料の分子量との関係をカ
ラム間げき容積まで外挿し、そのときの分子量を排除限
界分子量（最大孔径と見なすことが出来る）とした、ま
た、空孔率は、重水の溶出位置から算出した。この結果
、得られたＰＭＬＧの球状粒子は、デキストランの分子
量において４５０，０００に相当する最大孔径を有し、
また７０％の空孔率を存していた。

実施例２ 実施例１と同様な方法で一定温度４５℃で撹拌下に液表
面気相中の窒素ガス流速を変化させ、有機溶媒であるジ
クロロエタンを蒸発時間として５時間、１０時間、２４
時間にてほぼ一定速度で蒸発させ、デカリンを含んだＰ
ＭＬＧの球状粒子を得、以下実施例１と同様な処理及び
評価方法にて細孔径（排除限界分子量）及び空孔率を求
めた。

評価結果は第１表の通りであった。

実施例３ 実施例１と同様な方法でＰＭＬＧ　２．５ｇに対して多
孔化用添加剤として、無添加、ジオクチルフタレート２
．５ｇ、５．０ｇ、７．５ｇまたはドデカン酸メチル５
．０ｇをジクロロエタン１００ｄに溶解し、実施例１と
同様な方法で製造、評価を行い、細孔径（排除限界分子
量）及び空孔率を求めた。

評価結果は第２表の通りであった。

実施例４ ＰＭＬＧ　２．５ｇ、多孔化用添加剤としてデカリン５
．０　ｇをジクロロエタン１００ｄに溶解し、これを室
温で定速撹拌下に添加する。部分酢化ポリビニルアルコ
ール水溶液中の部分酢化ポリビニルアルコールの濃度を
０６５重量％、１゜０重量％、２．５重景％と変化させ
た水性媒体４００ｄ中に滴下し、定速撹拌速度をＰＶＡ
水溶液濃度が下がるにしたがって高速で回転することに
より、粒子径が最終粒径で２０〜３７μ−になる様調節
し、約４時間撹拌し液滴を作り、以下実施例１と全く同
様な方法で球状粒子を得、球状粒子の細孔径（排除限界
分子量）及び空孔率を求めた。

評価結果は第３表の通りであった。

実施例５ 実施例１と全く同様な方法で有機溶媒であるジクロロエ
タンを蒸発させる際の分散溶液温度を４０℃１５０゛Ｃ
１６０゛Ｃと変化させ、撹拌下に液表面気相中に流す一
定流速の窒素流量を調節し、４８時間かけほぼ一定速度
で蒸発させ、デカリンを含んだＰＭＬＧの球状粒子を得
た。以下、実施例１と同様な方法で処理し、２０〜３７
μｍの球状粒子について同様な方法で細孔径（排除限界
分子量）及び空孔率を求めた。

評価結果は第３表の通りであった。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）疎水性ポリアミノ酸と多孔化用添加剤とを含有さ
   せた有機溶媒溶液を水性媒体に添加し、撹拌しつつ有機
   溶媒を除去し、ついで多孔化用添加剤を抽出処理するこ
   とにより多孔質ポリアミノ酸を製造する方法において、
   上記多孔化用添加剤は該ポリアミノ酸に非相溶性で該有
   機溶媒に相溶性で水性媒体に非溶解性であり、且つそれ
   らの有機溶媒および水性媒体よりも沸点が高い液体また
   は固体であり、有機溶媒の除去は不活性気体の流通下に
   ０℃よりも高く該有機溶媒の沸点よりも低い温度で、且
   つ有機溶剤の少なくとも５０％が除去されるまでは実質
   的に一定速度で除去されるように蒸発させることにより
   行うことを特徴とする、巨大分子の分画が可能な細孔径
   の大きい多孔質ポリアミノ酸球状粒子の製造法。
2. （２）多孔質ポリアミノ酸は水溶性多糖質の分子量に換
   算して１０＾４〜１０＾６に相当する孔径を有し、空孔
   率が１０〜８０％である多孔質構造を有する第（１）項
   記載の球状粒子の製造法。
3. （３）水性媒体は部分酢化ポリビニルアルコールを溶解
   している水である第（１）項記載の多孔質ポリアミノ酸
   球状粒子の製造法。