JPS63298049A - 電気泳動用グラジェントゲル膜の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ＤＮＡもしくは、・ＤＮＡ部分分解物の塩基
配列を決定する為の電気泳動用グラジェントゲル膜の製
造方法に関する、特に電気泳動分離用媒体液の調液に関
するものである。

〔従来の技術〕

従来、平板型電気泳動法において、自己支持性のないア
クリルアミドの高分子濃度グラジェントゲルは、一枚の
支持体の上または二枚の支持体の間に濃度の異なるゲル
を電気泳動方向に層状に形成させ、膜状物として用いら
れて来た。

しかしながら支持体上にゲルを形成して用いる方法は、
支持体上にゲルを形成する時、泳動槽にセットする時、
ゲルの保存中、あるいは分析試料を添加するときなどに
誤まってゲルをこわしたり、試料以外のものをゲルの上
に落してゲルを損なったりすること等があり、操作上細
心の注意と熟練が必要であった。

一方二枚のガラス板などでモールドをつくり、この中で
ゲルを形成させて、そのモールドを垂直に保ったま一電
気泳動分析を行う垂直式電気泳動法においては、モール
ドの厚さを均一にすることは困難であったり、ゲル形成
液がゲル化しないうちに狭いモールド中にゲル液を注入
しなければならないことなど操作上高度の熟練を要して
いた。

特にＤＮＡの塩基配列決定操作においては、−枚のゲル
で出来るだけ多くのＤＮＡの断片を分析できるように長
いゲルを作ることが望ましいが、そのようなゲルはその
製造および取扱いが難しかった。また、ガラス板を用い
るために、そのガラス板が破損しやすいという欠点があ
った。

近年工業的に電気泳動用グラジェントゲル物質を製造す
る方法として、アクリルアミドモノマー及び架橋剤の混
合物の水溶液または水分散液を作り、光の照射を吸収し
、七ツマ−の重合を開始する遊離ラジカル発生物質を添
加した後、該溶液を所望のゲル生成物の形に形成し、形
成した溶液に光照射してモノマー溶液または、分散液を
重合させ架橋させる際、ゲルの多孔度を変えるためにモ
ノマー溶液に印加する光照射時間を調整する工程を含む
電気泳動グラジェントゲルの製法、（特開昭６１−２８
５１２号公報参照） さらに又単量体、架橋剤および重合開始剤を含有し、濃
度の相互に異る二種類の水溶液を混合比率を漸次変化さ
せながら混合しつつ成形器に導入し、該成形器中で単量
体と架橋剤との重合を完了させ、電気泳動方向に重合体
の濃度勾配を有する電気泳動用グラジェントゲルの製造
方法。（特公昭６１−２２９０３号公報、特公昭６１−
３９６１７号公報参照）等が開示されている。

更に又、電気泳動分離用媒体液を連続的に流量比をかえ
た濃・淡二種の七ツマー液に一定量の重合反応開始剤液
を加えて調液し、その液をウェブ上に塗布する方法が用
いられていた。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかしながら、前記最初の製法は光照射の設備と生産性
の悪さによるコスト高と、ゲルの厚みが厚いための解像
性が悪い点１反応開始剤が製造終了後も光の存在下で重
合・架橋反応をおこし、安定性、再現性のあるグラジェ
ントゲルが得られない等の問題点を有し、次の製造方法
はやりバッチ式製造方法であるため生産性が悪く、又電
気泳動分離用媒体液を成形器に分岐流入する際に均一に
分岐することが難しく、再現性のあるグラジェントゲル
が得られない等の問題点を有していた。更に又、連続的
に流量比を変えた濃・淡二種のアクリルアミドモノマー
液に一定量の重合反応開始剤液を混合装置により混合す
る方法では・媒体液中に異物が発生する不安定な状態に
なる問題点を有していた。

本発明の目的は上記問題点を解消し、生産性が高く、再
現性が高く、安定性のよい電気泳動用グラジェントゲル
膜の製造方法を提供することにある。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者は前記問題点について鋭意検討した結果、媒体
液中の異物は混合・攪拌装置の温度により発生する成分
の析出物或いはゲル状物質であることが判明した。

本発明の前記目的は、連続的に走行するウェブ上に電気
泳動分離用媒体液を塗布する電気泳動用グラジェントゲ
ル膜の製造方法において、該電気泳動分離用媒体液が、
連続的に流量比を変えた濃・淡二種の七ツマー液と重合
反応開始剤液とを攪１牢装置で混合調液する際の温度を
媒体液中の成分が析出する温度より高く、ゲル状物質が
発生する温度より低い温度以内に保って行うことを特徴
とする電気泳動用グラジェントゲル膜の製造方法により
達成される。

本発明において走行するウェブとは、平面性のよいシー
ト状のもので非導電性かつ実質的に水不透過性であれば
、どのような材質のものでもよく、ポリエチレンテレフ
タレート、ビスフェノールＡのポリカーボネートのよう
なポリエステル、ポリメチルメタクリレート、ポリエチ
レン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルなどのビニル系重
合体、ナイロンなどのポリアミドなど、およびそれらの
共重合体（例、塩化ビニリデン・塩化ビニルコポリマー
）が好ましく用いられる。

本発明における電気泳動分離用媒体液とは、電気泳動分
離用媒体膜を作れるものであれば何でもよく、その代表
的なものとしては、アクリルアミドゲル、アガロースゲ
ル、澱粉ゲル、寒天ゲル。

セルロースアセテート多孔質膜、ｉｌ！紙等の原料液と
なる液をいう。

本発明における電気泳動分離用媒体液の堂布方法として
はスライドビードコート、エクストルージョンコート、
ホッパーコート、カーテンコート等の塗布ヘッドが用い
られる。塗布する媒体膜の厚みは分離の目的に応じて選
ばれるが通常５０μｍから約１．０ｍｍ、好ましくは約
２００μｍから約０．５ｍ多孔質膜や濾紙の場合には約
７０μｍから約１鶴の範囲とされる。

本発明における電気泳動用グラジェントゲル膜とは、一
つの製品単位長の中に濃度勾配をもったものをいう。

本発明における攪拌装置としては如何なる様式のもので
もよいが、スタティックミクサーの使用が最も適してい
る。

スタティックミクサーとは、流体がミクサーの中に通さ
れる時、流体自身の運動により攪拌作用を行うものをい
い、管状のものとしてはスパイラルチューブ、左右交互
らせん状、又は邪魔板入りプロペラ状等がある。

本発明の実施態様を図を用いて説明する。

第１図は本発明の電気泳動用グラジェントゲル膜の製造
方法の１実施例の工程図である。

電気永動用媒体液１２１ま、低濃度上ツマー液１゜と高
濃度モノマー液２、更に重合反応開始剤液３をスタティ
ックミクサー７内で攪拌・混合することによって［夜さ
れる。

第３図ｆａ）は本発明の濃・淡二種の七ツマー液の流量
比の関係の説明図である。連続的に流量比をかえるとい
うことは、例えば当初高濃度モノマー液２はＱ　ｍ　ｌ
　／ｗｉｎ　、低濃度モノマー液１は１９ｍｊ２／ｍｉ
ｎの流量比で初まるが、電気泳動用グラジェントゲル膜
の製品単位長をｌとすると、図上、高濃度モノマー液２
は実線で、低濃度モノマー液１は点線で示すように流量
を変え、合計の流量は１９　ｍ　ｌ　／ｗｉｎというこ
とで一定であるが、濃度は連続的に変化することになる
。製品単位長ｌの終りは高濃度モノマー液２は１９ｍｊ
！／ｗｉｎ、低濃度モノマー液１はＱｍｌ／ｗｉｎとな
り濃度の濃い膜成分になっている次の製品単位長は高濃
度から低濃度にもって行く。この様な流量比の変更を繰
返し行うために、第１図において流量勾配送液ポンプ４
，５がパーソナルコンピューター１１の指令によりコン
ピュータリンケージアダプタを経由してコントローラ９
ａによって制御しスタティックミクサー８に送液される
。

一方重合反応開始剤液３は定流量送液ポンプ６によって
コントローラー９ｂに制御され一定量をスタティックミ
クサー７に送り込まれ、スタティックミクサー７内で攪
拌混合されて電気泳動用媒体液１２が出来る。電気泳動
用媒体液１２は塗布ヘッド８に供給され、ウェブ１４上
に塗布されることになる。

この際第２図に示すようにスタティックミクサーのエレ
メント２１を封じたハウジング２２の外套としてジャケ
ット２４を設けたスタティックミクサーのジャケット２
４内に冷却水を保冷水入口２５より保冷水出口２６に流
しスタティックミクサー内の温度を媒体液中の成分が析
出する温度より高く、ゲル状物質が発生する温度より低
い温度以内に保って混合・攪拌を行う。

第３図（ｂ）は第３図ｔａ＋の濃度比率によって作られ
る電気泳動用グラジェントゲル膜の平面図、第３図（Ｑ
ｌは第３図（ｂ）の側面図である。

第２図の製品単位長２間の間ｉｔは試料注入口の部分と
して打抜かれ、カバーシート等によって試料注入口にな
る部分に使われる。

〔作　　用〕

本発明は連続的に走行するウェブ上に電気泳動分離用媒
体液を塗布する電気泳動用グラジェントゲル膜の製造方
法において、該電気泳動分離用媒体液が、連続的に流量
比を変えた濃・淡二種のモノマー液と、重合反応開始剤
液とを攪拌・混合装置で混合調液する際の温度を媒体液
中の成分が析出する温度より高く、ゲル状物質が発生す
る温度より低い温度以内、例えばアクリルアミドゲルの
場合は１０〜１５℃に保つことにより、即ち、１０℃以
下の場合は媒体液中の成分の析出が発生し、又１５℃以
上の場合はスタティックミクサー内での重合によるゲル
状物の発生があるのである。

そうすることによって該電気泳動分離用媒体液は異物を
発生することなく塗布ヘッドに送られる為、再現性が高
く媒体液の安定性のよい濃淡勾配のはっきりした塗布膜
を安定して製造することが出来るようになる。

〔実　施　例〕

本発明の実施例について第１図、第２図、を用いながら
説明する。

電気泳動分離用媒体液 低濃度上ツマ−として□■ アガロース・・・・・・・・・６５ｇ 尿素　・・・・・・・４，２００ｇ アクリルアミド・・・・・・　５４９ｇ１．３．５−）
リアクリ ロイル−へキサヒドロ− ８−トリアジン・・・・・・　５．７ｇ脱イオン水　　
ｕｐ　ｔｏ　９，００抛ｌを作り高濃度モノマーとして
□■ アガロース・・・・・・・・・４０ｇ 尿素　・・・・・・・４，２００ｇ アクリルアミド・・・・・　１　、８３０ｇ１．３．５
−トリアクリ ロイル−へキサヒドロ− ３−）リアジン・・・・・・・１９ｇ 脱イオン水　　ｕｐ　ｔｏ　９．０００＋ｎｊ！を作り
緩衝液として□■ トリスヒドロキシメチル アミン　　　　・・・・・１２１．１４ｇはう酸　　　
　　・・　・・　・　６５．４ｇエチレンジアミンテト
ラ 酢酸２ナトリウム塩・・・・７．４５ｇ５ｇ脱イオン水
ｕｐ　ｔｏ　１．０００ｍｍ＋を作り緩衝液■・・・・
・・・・・・・・７５０１β２．９χポリビニルピロリ
ドン水溶液・８００ｍβ２５χテトラメチルエチレンジ
アミン液・・・・６．７ｍ　ｉｔ の混合液□■を 低濃度モノマー■９．０００ｍ　Ａ　、高濃度モノマー
■９．　ＯＯＯ＋＋＋　１の各々に加え、夫々を低濃度
モノマー液１．高濃度モノマー液２とする。

次に重合反応開始剤液３として ２Ｘｄｉ−２エチルへキシルスルホ サクシネート液・・・・・・・１００Ｉ１１０．３７５
χリボフラビンリン酸エ ステルナトリウム塩水溶液・・１５０＋＋＋　１３．７
５χテルオキソニ硫酸アン モニウム水溶液・・・・・・・１６０＋＋　ｌ　Ｉｃ作
り、夫々の３液をタンクに入れる。

流量勾配送液ポンプ４．５で低濃度上ツマー液１、高濃
度上ツマー液２の流量和を１９ｍβ／ｍｉｎとし、それ
に重合反応開始剤液３の流量１．４６ｍｎ／ｗｉｎを定
量送液ポンプ６でスタティックミクサー７内に送液する
。

スタティックミクサー７内は第２図に示すようなジャケ
ット付保冷装置を用いスタティックミクサー内温度を１
３℃に保った。上記３液が自刃により混合攪拌し、電気
泳動分離用媒体液１２が出来上る。

塗布ヘッド８より電気泳動分離用媒体液１２がウェブ１
４上に塗布される。

その時の低濃度上ツマー液１と高濃度モノマー液２との
流量比は、第３図（ａｌに示したとおりであり、塗布さ
れたゲル膜の濃度は第３図（ｂ）、第３図（Ｃ）の状態
になる。

尚、電気泳動分離用媒体膜としての製品は、例えば特開
昭６０−２０３８４７号公報に開示しである様に、ウェ
ブ上にあらかじめ両端部にスペーサーを貼付ける工程、
塗布後硬化処理をする工程。

試量注入口としてコーム（ｌｉｔ）を打抜く工程、カバ
ーシートを貼付ける工程、製品長さに切断する工程３等
を経て初めて製品となる。

しかしこれらの工程は如何なる方法、手段を用いても本
発明とは関係がない。

〔発明の効果〕

本発明は連続的に走行するウェブ上に電気泳動分離用媒
体液を連続的に塗布する電気泳動用グラジェントゲル膜
の製造方法において、該電気泳動分離用媒体液が、連続
的に流量比を変えた濃・淡二種のモノマー液と重合反応
開始剤液とを攪拌・混合装置によって混合調液する際の
温度を媒体液中の成分が析出する温度より高く、ゲル状
物質が発生する温度より低い温度以内に保って行うこと
を特徴とする電気泳動用グラジェントゲル膜の製造方法
により従来よりも一層生産性が高く、再現性が高く、媒
体液の安定性のよい電気泳動用グラジェントゲル膜の製
造を行うことが出来た。４

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の電気泳動用グラジェントゲル膜の製造
方法の工程図、第２図は本発明に係わる攪拌・混合装置
内の温度を媒体液中の成分が析出したり、ゲル状物質が
発生したしない温度以内に保つ装置の一実施例である。 第３図は本発明の濃・淡二種の七ツマー液の流量比の関
係の説明図（ａ）。 （ａ）の濃度比率によって作られる本発明の電気泳動用
グラジェントゲル膜の平面図中）、断面図ＴＣ）である
。 １・・・低濃度モノマー液 ２・・・高濃度モノマー液 ３・・・重合反応開始剤液 ４．５・・・流量勾配送液ポンプ ６・・・定流量送液ポンプ ７・・・攪拌・混合装置（スタティックミクサ８・・・
塗布ヘッド ９ａ、９ｂ・・・コントローラー １０・・・コンピュータリンケージアダプタ１１・・・
パーソナルコンピューター １２・・・電気泳動用媒体液 １３・・・コーティングローラ １４・・・ウェブ ２１・・・エレメント　（スタティックミクサー）２２
・・・ハウジング ２３・・・フランジ ２４・・・ジャケット ２５・・・保冷水入口 ２６・・・保冷水出口 手続補正書 ９６２年７月２日

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 連続的に走行するウェブ上に電気泳動分離用媒体液を塗
   布する電気泳動用グラジェントゲル膜の製造方法におい
   て、該電気泳動分離用媒体液が、連続的に流量比を変え
   た濃・淡二種のモノマー液と重合反応開始剤液とを攪拌
   ・混合装置で混合調液する際の温度を媒体液中の成分が
   析出する温度より高く、ゲル状物質が発生する温度より
   低い温度以内に保って行うことを特徴とする、電気泳動
   用グラジェントゲル膜の製造方法。