JPS63313054A - 電気泳動用グラジェントゲル膜の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、蛋白質特に尿中蛋白質などのように分子量分
布範囲の広い蛋白質を分離分析する為の電気泳動用グラ
ジェントゲル膜の製造方法に関する、特に電気泳動分離
用媒体液の調液に関するものである。

（従来の技術） 従来、平板型電気泳動法において、自己支持性のないア
クリルアミドの高分子濃度グラジェントゲルは、一枚の
支持体の上または二枚の支持体の間に濃度の異なるゲル
を電気泳動方向に層状に形成させ、膜状物として用いら
れて来た。

しかしながら支持体上にゲルを形成して用いる方法は、
支持体上にゲルを形成する時、泳動槽にセットする時、
ゲルの保存中、あるいは分析試料を添加するときなどに
誤まってゲルをこわしたり、試料以外のものをゲルの上
に落してゲルを損なったりすること等があり、操作上細
心の注意と熟練が必要であった。

一方二枚のガラス板などでモールドをつくり、この中で
ゲルを形成させて、そのモールドを垂直番こ保ったまま
電気泳動分析を行う垂直式電気泳動法においては、モー
ルドの厚さを均一にすることは困難であったり、ゲル形
成液がゲル化しないうちに狭いモールド中にゲル液を注
入しなければならないことなど操作上高度の熟練を要し
ていた。

また、ガラス板を用いるために、そのガラス板が破損し
やすいという欠点があった。

近年工業的に電気泳動用グラジェントゲル物質を製造す
る方法として、アクリルアミドモノマー及び架橋剤の混
合物の水溶液または水分離液を作り、光の照射を吸収し
、モノマーの重合を開始する遊離ラジカル発生物質を添
加した後、該溶液を所望のゲル生成物の形に形成し、形
成した溶液に光照射してモノマー溶液または、分散液を
重合させ架橋させる際、ゲルの多孔度を変えるためにモ
ノマー溶液に印加する光照射時間を調整する工程を含む
電気泳動グラジェントゲルの製法（特開昭６１−２８５
１２号公報参照） さらに又単量体、架橋剤および重合開始剤を含有し、濃
度の相互に異る二種類の水溶液を混合比率を漸次変化さ
せながら混合しつつ成形器に導入し、該成形器中で単量
体と架橋剤との重合を完了させ、電気原動力向に重合体
の濃度勾配を有する電気泳動用グラジェントゲルの製造
方法（特公昭６１−２２９０３号公報、特公昭６１−３
９６１７号公報参照）等が開示されている。

更に又、電気泳動分離用媒体液の調液方法としては連続
的に流量比をかえた濃・淡二種のモノマー液に一定量の
重合反応開始剤液を加える方法が用いられていた。

（発明が解決しようとする問題点） しかしながら、前記最初の製法は光照射の設備と生産性
の悪さによるコスト高と、ゲルの厚みが厚いための解像
性が悪い点、反応開始剤が製造終了後も光の存在下で重
合・架橋反応をおこし、安定性、再現性のあるグラジェ
ントゲルが得られない等の問題点を有し、次の製造方法
はやはりバッチ式製造方式であるため生産性が悪く、又
電気泳動分離用媒体液を成形器に分岐流入する際に均一
に分岐することが難しく、再現性のあるグラジェントゲ
ルが得られない等の問題点を有していた。

更に又モノマー液と重合反応開始剤液との混合方法とし
ては重合反応開始剤液がモノマー液が薄い時は過剰とな
りゲル膜そのものが不安定であるという欠点があった。

本発明の目的は上記問題点を解消し、生産性が高く、再
現性が高く、ゲル膜の安定性のよい蛋白質分析電気泳動
用グラジェントゲル膜の製造方法を提供することにある
。

（問題点を解決するための手段） 本発明の前記目的は、連続的に走行するウェブ上に電気
泳動分離用媒体液を連続的に塗布する電気泳動用グラジ
ェントゲル膜の製造方法において、該電気泳動分離用媒
体液が、連続的に流量比を変えた濃・淡二種のモノマー
液と、その混合モノマー液に対応して連続的に流量を変
えた重合反応開始剤液とその希釈液とをスタティックミ
クサーによって混合調液されながら、塗布ヘッドに供給
されることを特徴とする、変性剤として尿素を含まない
電気泳動用グラジェントゲル膜の製造方法によって達成
される。

本発明において走行するウェブとは、平面性のよいシー
ト状のもので非導電性かつ実質的に水不透過性であれば
、どのような材質のものでもよく、ポリエチレンテレフ
タレート、ビスフェノールＡのポリカルボネートのよう
なポリエステル、ポリメチルメタクリレート、ポリエチ
レン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルなどのビニル系重
合体、ナイロンなどのポリアミドなど、およびそれらの
共重合体（例、塩化ビニリデン、塩化ビニルコポリマー
）が好ましく用いられる。

本発明における電気泳動分離用媒体液とは、電気泳動分
離用媒体膜を作れるものであれば何でもよく、その代表
的なものとしては、アクリルアミドゲル、アガロースゲ
ル、澱粉ゲル、寒天ゲル、セルロースアセテート多孔質
膜、濾紙等の原料液となる液をいう。

本発明の電気泳動用媒体材料は、主として蛋白質または
複合蛋白質（たとえば、゛リポプロティン、糖プロティ
ンなど）の分析に有利に用いられるものであり、電気泳
動用媒体層には、変性剤として陰イオン性界面活性剤を
含有させることができる。

分析試料が蛋白質または複合蛋白質（例えばリボ蛋白質
、糖蛋白質など）の場合には陰イオン界面活性剤を含ま
せることは好ましいか、または必須であることが多い。

陰イオン界面活性剤をゲル媒体層に含有させないことが
あることは勿論であるたとえば陰イオン界面活性剤を含
有しないゲル媒体層は、ＤＮＡフラグメント分析に基づ
く遺伝病診断あるいは制限酵素分解を利用したＤＮＡ構
造解析などの目的に用いることができる。

陰イオン界面活性剤を電気泳動用媒体層に含有させるこ
とにより、蛋白質または複合蛋白質の効率的な分離およ
びそれらの分子量測定が可能となる。

陰イオン性界面活性剤の例としてはアルキル硫酸塩が挙
げることができ、特に炭素原子数１０以上の長鎖アルキ
ル基を有するアルキル硫酸塩が好ましく用いられる。塩
を形成する陽イオンとしては、ナトリウムイオン、カリ
ウムイオン、リチウムイオン等のアルカリ金属イオンが
一般的であり、これらのうちではナトリウムイオンが用
いやすい。

アルキル硫酸塩のうちではドデシル硫酸塩（ナトリウム
塩、カリウム塩、リチウム塩等）が好ましく、なかでも
ドデシル硫酸ナトリウム（Ｓ　Ｄ　Ｓ）が最も好ましい
。ＳＤＳを本発明のゲル媒体層に含有させることにより
蛋白質または複合蛋白質の効率的な分離およびそれらの
分子量測定が可能となる。

変性剤としての陰イオン界面活性剤の含有量はゲル形成
液に対して約０．０５Ｗ／Ｖ％から約２゜０Ｗ／Ｖ％、
好ましくは約０．１Ｗ／Ｖ％から約１．５Ｗ／Ｖ％の範
囲である。

本発明における電気泳動分離用媒体液の塗布ヘッドとし
てはスライドビードコート、エクストルージョンコート
、ホッパーコート、カーテンコート等の塗布ヘッドが用
いられる。塗布する媒体膜の厚みは分離の目的に応じて
選ばれるが通常５０μｍから約２．　０ｍｍ、好ましく
は約１００μｍから約１．　０１１、多孔質膜や濾紙の
場合には約７０μｍから約１．０ｆｌの範囲とされる。

本発明における電気泳動用グラジェントゲル膜とは、一
つの製品単位長の中に濃度勾配をもったものをいう。

本発明においてスタティックミクサーとは、流体がミク
サーの中に通される時、流体自身の運動により攪拌作用
を行うものをいい、管状のものとしてはスパイラルチュ
ーブ、左右交互らせん状、又は邪魔板入りプロペラ状等
がある。

本発明の実施態様を図を用いて説明する。

第１図は本発明の電気泳動用グラジェントゲル膜の製造
方法の調液部分の工程図である。

電気泳動分離用媒体液１４は、低濃度モノマー液１、と
高濃度モノマー液２、更に重合反応開始剤液３ａと重合
反応開始剤液の希釈液３ｂとをスタティックミクサー８
及び９内で攪拌・混合することによって調液される。

第２図（ａ）は本発明の濃・淡二種のモノマー液の流量
比の関係の説明図である。連続的に流量比をかえるとい
うことは、例えば当初高濃度モノマー液２はＱｍ６／ｍ
ｉｎ、低濃度モノマー液は３８ｍ１／ｍｉｎの流量比で
初まるが、電気泳動用グラジェントゲル膜の製品単位長
をｌとすると、図上、高濃度モノマー液２は実線で、低
濃度モノマー液１は点線で示すように流量を変え、合計
の流量は３３ｍ１／ｍｉｎということで一定であるが、
濃度は連続的に変化することになる。又その混合モノマ
ー液に対応して連続的に流量比を変えた重合反応開始剤
液とその希釈液とは第２図（ｂ）に示すように、第２図
（ａ）に対応して、重合反応開始剤液３ａと希釈液３ｂ
とを夫々点線と実線で示す様に流量を変化させることを
いう。従って合計流量は（１，０５＋０．５）　＝１．
５５ｍ１７ｍ１ｎで一定であるが、濃度は連続的に変化
することになる。製品単位長ｌの終りは高濃度モノマー
液２は３８ｍ１７ｍ１ｎｓ低濃度モノマー液１はＱｍｊ
！／ｍｉｎとなり濃度の濃い膜成分になっている。この
様な流量比の変更を繰返し行うために、第１図において
流量勾配送液ポンプ４，５がパーソナルコンピュータ１
３の指令によりコンピューターリンケージアダプタ１２
を経由してコントローラｌｌａによって制御しスタティ
ックミクサー８に送液される。

一方重合反応開始剤液３ａ及び希釈液３ｂは流量勾配送
液ポンプ６．７によってコントローラー１１ｂに制御さ
れ、スタティックミクサー９に送り込まれる。その後ス
タティックミクサー８内でモノマー液と一緒に攪拌混合
されて電気泳動分離用媒体液１４が出来る。電気泳動分
離用媒体液１４は塗布ヘッド１０に供給され、ウェブ１
５上に塗布されることになる。

第３図は第２図の濃度比率によって作られる電気泳動用
グラジェントゲル膜の平面図、第４図は第３図の側面図
である。

第２図、第３図の切断長４間の間隙ｔは試料注入口の部
分として打抜かれ、カバーシート等によって試料注入口
になる部分である。

（作　用） 本発明は連続的に走行するウェブ上に電気泳動分離用媒
体液を連続的に塗布する電気泳動用グラジェントゲル膜
の製造方法において、該電気泳動分離用媒体液が、連続
的に流量比を変えた濃・淡二種のモノマー液と、その混
合モノマー液濃度に対応して連続的に流量比を変えた重
合反応開始剤液その希釈液とをスタティックミクサーに
よって混合調液しながら、塗布ヘッドに供給することに
より、スタティックミクサーの攪拌力と自送力により前
後の溶液の混合がなく、塗布ヘッドに送られる為、従来
にない濃淡勾配のはっきりした塗布膜を安定して再現性
よく製造することが出来るようになった。しかも、従来
の様に混合したモノマー液と不平衡な重合反応開始剤液
量でなく、バランスのとれた液量になるのでゲル膜の安
定性が向上した。

（実施例） 本発明の実施例について第１図、第２図、第３図を用い
ながら説明する。

電気泳動分離用媒体液 低濃度モノマー液１として アクリルアミド　　　　−・−−−−一・・−５１３ｇ
Ｎ、　　Ｎ’−メチレンビス アクリルアミド−・・・−・・・・−２７ｇドデシル硫
酸ナトリウム−−−−一−−−−−・−・・−９ｇ（ｐ
Ｈ緩衝剤〕 １．５Ｍ−Ｔｒｉｓ　− 塩酸（ｐＨ８，９）−２２５０ｒｒｌ 脱イオン水　ｔＮ）　　ｔｏ　　９０００ｍｊ！を作る
。

高濃度モノマー液２として アクリルアミド　　　　−−−−−−−１７１０ｇＮ、
Ｎ’−メチレンビス アクリルアミドーーーー〜・−・−・・−９０ｇドデシ
ル硫酸ナトリウム・・・−・−・−・−９ｇ（ｐＨ緩衝
剤〕 １．５Ｍ−Ｔｒｉｓ− 塩酸（ｐＨ８，９）−２２５０ｍｌ 脱イオン水　ｕｐ　　ｔｏ　　９０００ｍｊ！を作る。

［註］Ｔｒｉｓ：）リス（ヒドロキシメチル）アミノメ
タン 次に重合反応開始剤液３ａとして ２．５％ベルオキソニ硫酸 アンモニウム水溶液−・−−−−−−−２１６ｍ　１２
２５％Ｎ、　Ｎ、　Ｎ’、　Ｎ’− テトラメチルエチレン ジアミン液　　　　−−−−−−−−−−２、２５ｍ　
Ｉｔｏ、３７５％リボフラビン リン酸エステルナトリ ラム塩水溶液　　　−・−・・・−・−・・−１５０ｒ
ｒｌ希釈液３ｂとして ２５％Ｎ、　Ｎ、　Ｎ’、　Ｎ”− テトラメチルエチレン ジアミン液　　　　−一一一・・−・−２，２５ｍ１０
．３７５％リボフラビン リン酸エステルナトリ ラム塩水溶液　　　・−・−−−−−−−−−−１５０
ｍ　Ｉｔ脱イオン水　　　　　　−・・・−−一−−−
・−２１６ｍｎの混合液を作り、夫々の４液をタンクに
入れる。

流量勾配送液ポンプ４．５で低濃度モノマー液１、高濃
度モノマー液２の流量和を３８ｍβ／ｍｉｎとし、それ
に流量勾配送液ポンプ６．７で重合反応開始剤液３ａ、
希釈液３ｂの流量和を１゜５５ｍ１／ｍｉｎとして、ス
タティックミクサー８．９内に送液する。

スタティックミクサー８，９内では上記４液が自刃によ
り混合攪拌し、スタティックミクサー８の出口で電気泳
動分離用媒体液１４が出来上る。

塗布ヘッド１０により電気泳動分離用媒体液１４がウェ
ブ１５上に塗布される。

その時の低濃度モノマー液１と高濃度モノマー液２及び
重合反応開始剤液３と希釈液４との流量比は、第２図（
ａ）、（ｂ）に示したとおりであり、塗布されたゲル膜
の濃度は第３図、第４図の状態になる。

尚、電気泳動分離用媒体膜としての製品は、例えば特開
昭６０−２０３８４７号公報に開示しである様に、ウェ
ブ上にあらかじめ両端部にスペーサーを貼付ける工程、
塗布後硬化処理をする工程、試料注入口としてコーム（
Ｆ８）を打抜く工程、カバーシートを貼付ける工程、製
品長さに切断する工程、等を経て初めて製品となる。

しかしこれらの工程は如何なる方法、手段を用いても本
発明とは関係がない。

（発明の効果） 本発明は連続的に走行するウェブ上に電気泳動分離用媒
体液を連続的に塗布する電気泳動用グラジェントゲル膜
の製造方法において、該電気泳動分離用媒体液が、連続
的に流量比を変えた濃・淡二種のモノマー液と、その混
合モノマー液の濃度に対応して連続的に流量比を変えた
重合反応開始剤液とその希釈液とをスタティックミクサ
ーによって混合調液されながら、塗布ヘッドに供給され
ることを特徴とする電気泳動用グラジェントゲル膜の製
造方法により従来よりも一層生産性が良（、製品の安定
性、再現性を向上することが出来た。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の電気泳動用グラジェントゲル膜の製造
方法の調液部分の工程図、第２図は本発明の濃・淡二種
のモノマー液（ａ）と、重合反応開始剤液と希釈液との
（ｂ）流量比の関係の説明図。第３図は第２図の濃度比
率によって作られる本発明の電気泳動用グラジェントゲ
ル膜の平面図、第４図は第２図の断面図である。 １・・・低濃度モノマー液 ２・・・高濃度モノマー液 ３ａ・・・重合反応開始剤液 ３ｂ・・・希釈液 ４．５・・・流量勾配送液ポンプ ６．７・・・流量勾配送液ポンプ ８．９・・・スタティックミクサー １０・・・塗布ヘッド １１ａ、ｌｌｂ・・・コントローラー １２・・・コンピュータリンケージアダプタ１３・・・
パーソナルコンピューター １４・・・電気泳動分離用媒体液 １５・・・ウエブ 手続ネ「１１正書 昭和６２年　９月１７０

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 連続的に走行するウェブ上に電気泳動分離用媒体液を連
   続的に塗布する電気泳動用グラジェントゲル膜の製造方
   法において、該電気泳動分離用媒体液を、連続的に流量
   比を変えた濃・淡二種のモノマー液と、その混合モノマ
   ー液に対応して連続的に流量比を変えた重合反応開始剤
   液とその希釈液とをスタティックミクサーによって混合
   調液しながら、塗布ヘッドに供給することを特徴とする
   、変性剤として尿素を含まない電気泳動用グラジェント
   ゲル膜の製造方法。