JPS63501052A - ヒトアンギオゲニン（脈管形成因子）のためのｃｄｎａ及び遺伝子及び発現方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒトアンギオゲニン（脈管形成因子）のためのｃＤＮＡ及び遺伝子及び発現方法 発明の分野 不発明は組換えＤＮＡ技術によるタンパク質製造に関する。より詳しくは、本発 明は脈管形成活性を有するタンパク質をコード化するＤＮＡ配列及びそれらの配 列を発現する方法に関する 背景技術 脈管形成、血管網目の発達過程は固体腫瘍の増殖に必須であり、且つ正常の傷治 癒及び増殖過程の一成分である。それは又アテローム発生、関節炎及び糖尿病性 網膜症の病態生理学においても関係してきた。それは新たな毛細血管の特定の刺 戟に向けての方向付けられた増殖により特徴付けられる。この内ｆ３ＬＩｆａｉ 胞の移動により媒介される増殖は内皮細胞有糸分裂とは独立に進行することがあ る。

脈管形成の過程に対する原因となる分子メツセンジャーが長く探累されてきた。

グリーンブラット及びシュビック（Ｇｒｅｅｎｂｌａｔｔ　ａｎｄ　５ｈｕｂｌ ｋ　）は（Ｊ　、　Ｎａｔｌ　、　ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ、４１　：　１１１− １２４，１９６８）、腫瘍−銹発新血管形成は核酸性物質により媒介されている と結論した。引続き、各種の可溶性媒介物質が新面管形成の防発に係わってきた 。これらには、プロスタグランジン類〔アラニルバッハ（Ａｕｅｒｂａｃｈ　） 、Ｐｉｃ、ｋ　ａｎｄ　Ｌａｎｄ）’編「リンホカイン類（Ｌ）’ｍｐｈｏｋｉ ｎｅｓ　）　Ｊ、６９−８８、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　ｅ　Ｎｅｗ　Ｙ ｏｒｋ　ｉ　９８１　）、ヒトウロキナーゼ〔ペルマン等（Ｂｅｒｍａｎ　ｅｔ 　ａｌ、　）、Ｉｎｖｅｓｔ　Ｏｐｔｈａ１ｍ＋Ｖｉｓ、Ｓｃｉ、２２　：　１ ９１−１９９．１９８２）、銅〔ラジュ等（Ｒａｊｕ　ｅｔ　ａｌ、　）、Ｊ、 　Ｎａｔｌ　、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎａｔ、　６９　：１１８５−１１８８．１ ９８２）及び各種「脈管形成因子」が含まれる。

脈管形成因子は腫瘍細胞、創傷流体〔パンダ等（Ｅａｎｄａ　ｅｔ　ａｌ、　） 、Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、Ｕ　Ｓ　Ａ７９ニア７７３− ７７７７．１９８２年；　パンダ等（Ｂａｎｄａ　ｅｔ　ａｌ、　）米国特許４ ，５０３，０３８号明細書）及び網膜細胞〔ダモーレ（Ｄ’Ａｍｏｒｅ　）、Ｐ ｒｏｅ　、　Ｎａｔｌ　。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７８　：　３０６Ｂ−５０７２，１９８１年〕から 得られてきた。腫碍−由来の脈管形成因子は一般的に貧弱に％微行けられている にすぎない。フォークマン等（Ｆｏｌｋｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、　）　（Ｊ、Ｅｘ ｐ、Ｍｅｄ、　１５３　：２７５−２８８．１９７１年）はＷａｌｋｅｒ　２５ ６ラツト腹水腫瘍から腫瘍脈管形成因子を単離した。この因子は毛細管内皮細胞 に対して有糸分裂誘発性であり、ＲＮａ　ｓ　ｅにより不活性化された。チュア ン等（Ｔｕａｎ　ｅｔ　ａｌ・）（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１２　：　５１ ｓ９−５１６５．１９７３年）はＷａｌｋｅｒ　２５６　腫瘍の非ヒストンタン パク質に有糸分裂誘発性及び脈管形成活性を見出した。活性画分はタンパク質と 炭水化物の混合物であった。各種動物及びヒトａ瘍は脈管形成因子を産生ずるこ とが示された〔フィリップス及びクマール（Ｐｈｉｌｌｉｐｇ　ａｎｄ　Ｋｕｍ ａｒ　）、Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ　２　Ｓ　：　８２−８８．１９７９ 年〕が、しかしこれらの因子の化学的性質は決定されなかった。

Ｗａｌｋｅｒ　２５６腫瘍からの低分子量非タンパク質成分も又脈管形成及び有 糸分裂誘発性であることが示された〔ワイス等（Ｗｅｉｓｓ　ｅｔ　ａｌ、　） 、Ｂｒ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ　４０　：４９Ｍ−４９６，１９７９年〕。４０ ０〜８００ダルトンの分子量を有する脈管形成因子がフェンスロウ等（Ｆｅｎ５ ｅｌａｕ　ｅｔ　ａｌ、　）　（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５６：９６ ０．５−９６１１．１９８１年）により均質になるまで精製されたが、それは更 に特徴付けられたかった。ヒトの肺腫瘍細胞が高分子量担体及び低分子量の、お そら（は非−タンパク質、活性成分より々る脈管形成因子を分泌することが示さ れた〔クマール等（Ｋｕｍａｒ　ｅｔ　ａｌ　、　）Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｃａｎｃ ｅｒ　３２　：　４６１−４６４．１９８３年〕。

バレー等（Ｖａｌｌｅｅ　ｅｔ　ａｌ、　）　（Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｌａ、　４ １　：　１−１５．１９８５年）はＷａｌｋｅｒ　２５６　ｍ瘍からの三つの両 分に関連した脈管形成活性を見出した。トルバート等（Ｔｏｌｂｅｒｔ　ｅｔ　 ａｌ、　）　（米国特許４．２２９．５５１号明細８）はヒト腺癌細胞系統ＨＴ −２９からの脈管形成因子の産生を開示しているが、しかしこの物質は単に部分 的にｈ製されたに過ぎず、化学的に特徴付けられなかつた。脈管形成因子の産生 を荷う遺伝子の単離は少なくとも部分的にこれらの因子の純度及び特徴付けの欠 乏によりこれ迄報告されていない。

脈管形成因子の単離は高性能液体クロマドグ、７フイ〔パンダ等（Ｂａｎｄａ　 ａｔ　ａｌ、　）、前記〕；溶媒抽出〔前記フォークマン（Ｆｏｌｋｍａｎ　） 等〕；シリカゲル上クロマトグラフィ〔前記フェンスロウ（Ｆｅｎ５ｅｌａｕ　 ）等〕、ＤＥＡＥセルロース〔前記ワイス（Ｗｅｉｓａ）等〕或いは５ｅｐｈａ ｄｅ：ｃ　（前記チュアｙ　（Ｔｕａｎ　）０等〕及びアフイニテイクロマトグ ラフイ〔前記ワイス（Ｗｅｉｓｇ）等〕を用いてきた。

最近、バレー（Ｖａｌｌｅｅ　）等（米国特許出１５ｉ　５ｅｒｉａ１４７２４ ．０８　Ｂ、１９８５年４月１７日出願及び本出願と同時に出願したＵＳＳＮ　 、これらの両者は本発明において準用する）はヒト腺癌細胞系統からの脈管形成 タンパク質をｒＩ製した。このアンギオゲニンとして知られる精製タンパク質は 化学的に特徴付けられ、及びそのアミノ酸配列が決定された。

脈管形成因子は傷の泊地において重要な役割を果し〔レチュラ＠　（Ｒｅｔｔｕ ｒａ　ｅｔ　ａｌ、　）　ＦＡＳＥＢ　Ａｂｓｔｒａｃｔす４３０９、第６１回 Ａｎｎｕａｌ　Ｍｅｅｔｉｎｇ　、シカゴ１９７７年〕、又、悪性のスクリーニ ング試験の開発において応用を有するので〔り２ゲスバーン等（Ｋｌａｇｓｂｕ ｒｖ　ｅｔ　ａｌ　、　）、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒａｇ、　３６　：　１１０−１１ ４．１９７６年；及びプレム等（Ｂｒｅｍ　ｅｔ　ａｌ、　）、５ｃｉｅｎｃｅ 　１９５　：　８８０−８８１．１９７７年〕、脈管形成タンパク質をそれらの 治療及び診断における応用を可能にするのに十分な量を製造することは明らかに 有利である。遺伝子工学の技術はこれらのタンパク質の製造水準を増大するのに 理想的に適したものである。脈管形成タンパク質をコード化する遺伝子のクロー ニングがその様な大規模製造の必要な第一段階である。

更に、ある種の腫鶴生成物による汚染が受入れられない場合であるヒトの治療の 場合々どのように、これらのタンパク質を非−腫瘍細胞から得ることが望ましい 場合がある。本発明は従って組換えＤＮＡ技術を用いて非−腫瘍細胞において脈 管形成タンパク質の製造を提供するものである。

発明の開示 簡単に述べると、本発明は脈管形成活性を有するタンパク質をコード化するＤＮ Ａ配列を開示する。アンギオゲニンをコード化するＤＮＡ配列、即ちアンギオゲ ニンと実質的に同一々活性を有するタンパク質も又開示される。このＤＮＡ配列 はｃＤＮＡ或いはゲノムＤＮＡから得られ、或いはＤＮＡ合成技術により調製さ れる。

不発明は更に脈管形成活性を有するタンパク質をコード化するＤＮ’Ａ配列を含 んでなるベクターを開示する。

アンギオゲニンと実質的に同一な生物活性を有するタンパク質をコード化するＤ ＮＡ配列を含んでなるベクターも又開示される。これ等のベクターは更にそのＤ ＮＡ配列の上流に且つ操作可能に連結されたプロモータ配列を含んでなる。一般 的に、これらのベクターは選択的マーカーも又含み、且つ用いられる宿主細胞に 応じて制御配列、ポリアデニル化シグカレ、工／ハンサー及びＲＮＡスプライス 部位などの要素を含んでよい。

本発明の付加的側面は脈管形成活性を有するタンパク質を産生ずるようにトラン スフェクション、即チ形質転換された細胞を開示する。アンギオゲニンと実質的 に同一の生物学的活性を有するタンパク質を産生ずるようにトランスフェクショ ン即ち形質転換された細胞も又開示される。これらの細胞は脈管形成活性を有す るタンパク質をコード化するＤＮＡ配列を含んでなる発現ベクターを含有するよ うにトランスフェクション即ち形質転換される。

本発明の更にもう一つの側面は脈管形成活性を有するタンパク質の製造方法を開 示する。この方法は（ａ）宿主細胞中に脈管形成活性を有するタンパク質を＝− ド化するＤＮＡ配列を含んでなるベクターを導入し、（ｂ）この宿主細胞を適当 な培地中で増殖させ、及び（ｅ）このＤＮＡ配列によりコード化され及びこの宿 主細胞により産生されたタンパク質生成物を単離することを含んでなる。アンギ オゲニンと実質的に同一な生物学的活性を有するタンパク質の製造方法も又開示 される。これらの方法により製造されるタンパク質も又開示される。

本発明のその他の側面は詳細な説明及び図面を参照して明らかとなるであろう。

図面の簡単な説明 第１図はヒト腺癌ＨＴ−２９細胞から精製されたアンギオグニ／のアミノ酸配列 を図示する。

第２図はアンギオゲニンｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ及びゲノムクローンの配列決定のために 用いられる計画を図示するものである。頂部部分はｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを指し、及び 底部部分はゲノムＤＮＡを指す。実線の棒はコード化領域を示し、矢印は配列決 定された断片を示す。三つのＡｌｕ配列の位置及び方向は大きな斜線を付した矢 印により示される。

第５図はｐＨＡＧｌにおけるゲノムＤＮＡインサートの配列の一部を図示する。

ｐＨＡＧｌのｃＤＮＡインサートはヌクレオチド２５２において置換を有するゲ ノムＤＮＡのヌクレオチド１０６〜７３１に対応する。

第４図は覗孔動物細胞発現ベクターｐＨＡＧＦ−ＭＴ−ＤＨＦＲの造成を図示す る。

第５図及び阿６図は酵母発現ベクターｐＹＡＧＦの造成を図示する。

発明を提示する前に、以下に用いる残りかの用語を定義する。

生物学的活性とは生物学的関係において（即ち生物体において或いはｉｎ　ｖｉ ｔｒｏの複製において）分子により行われるある機能或いは機能の組である。ア ンギオゲニンについては、生物学的活性はその脈管形成活性により特徴付けられ る。

脈管形成活性は、組織における血管発達の化学的刺戟である。それは一般的に各 種細胞夕、イブにより産生される拡散性物質と相関する。脈管形成活性はヒョコ 胚漿尿膜アッセイ〔ナイトン等（Ｋｎｉｇｈｔｏｎ　ｓｔ　ａｌ　、　）、Ｂｒ 。

Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ　３５　：　３４７−５５６．１９７７年〕及び／又はウサ ギ角膜移植アッセイ〔ランガー及びフォークマン（Ｌａｎｇｅｒ　ａｎｄ　Ｆｏ ｌ）ａｎａｎ　）、Ｎａｔｕｒｅ　２６５　ｓ　７９７−８００．１９７６年〕 における陽性応答により特徴付けられる。

ＤＮＡ造成物はヒトの介入によりさもな（ば自然においては存在しないように組 合わされ及び配列されたＤＮＡのセグメントを含有するように変成されたＤＮＡ 分子或いはその様な分子のクローンである。

脈管形成タンパク質は腫瘍細胞及び網膜細胞を含む各種細胞タイプにより産生さ れる。最近迄、これらのタンパク質はそれらの化学的及び物理的特徴付けを可能 にするのに十分な純度で得らｎてい々かった。新規多段−精製方法の応用により 、以後アンギオゲニンと称する脈管形成タンパク質の具体例がヒ）Ｉｌ［細胞系 統の培養液媒体からａ製された。タンパク質配列の決定は対応するＤＮＡ配列の 単離及びこれらの配列の組換えＤＮＡ技術による発現を可能にした。

脈管形成タンパク質の単離はイオン交換クロマトグラフィによる調整細胞培地の 分別に引続く高性能液体クロマトグラフィに基づくものである。

腫瘍＃ｉＩ！胞が本発明による脈管形成タンパク質の好ましい源であるが、その 他のタイプの細胞、特に網膜細胞は脈管形成活性を重生することが知られている 。特に好ましいｒ１Ｂ胞系統はヒト腺癌細胞系統ＨＴ−２９Ｃフォグ及びトレン プ（Ｆｏｇｈ　ａｎｄ　Ｔｒｅｍｐｅ　）、Ｆｏｇｈ編ＨｕｍａｎＴｕｍｏｒ　 Ｃｅ１ｌｓ　ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　、　１１５−１６０、Ｐｌｅｍｕｎ、　＝ニー ヨーク１９７５年〕である。ＨＴ−２９単離体は受入番号ＨＴＢ５Ｂ及びＣＲＩ 、８９　Ｃ１５の下にアメリカンタイプ　カルチャー　コレクション（Ａｍｅｒ ｉｃａｎ　ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　）　Ｋ寄託されて いる。これらの細胞は公知の方法に従って、例えばダルベツコ−の変成イーグル 培地或いはその他の適当な培地内の単層培養として培養される。好ましい培地は ２ｍＭＬ−グルタミン及び５チ熱不活性化つシ胎児血清（ＤＭＥ１５）を補給さ れたダルベツコ−の変成イーグル培地である。この培地は定期的に変更され、及 び細胞は公知の操作に従って紬代培養される。

Ｂ胞培地から脈管形成タンパク質の単離な容易にするために、細胞をそれらが一 度集密的成長に達したならば、血清の力い維持培地に移すのが好ましい。好まし い維持培地は血清のない、がしかしＬ−グルタミンを５ｍＭの濃度で含有するＤ ＭＥ１５である。

細胞が培養され、維持された調整培地として知られる培地を次いで細胞から取出 し、及び好ましくは濾過して細胞残滓を除去し、次いで処理して高分子量タンパ ク質を除去する。好ましい処理方法は酸性化、例えば氷酢酸を５％（ｖ／ｖ）の 濃度に添加した後、遠心分離を行う方法である。又、濾過し酸性化された培地を 更にｆｆ製工程にかける前に濃縮することも望ましい。

ｐ過され、処理された培地を次いでカルボキシメチルセルロース（０Ｍセルロー ス）などのカチオン交換マトリックス上でクロマトグラフィにかける。この処理 された調整培地を凍結乾燥し、Ｑ、　Ｉ　Ｍ　ＩＪン酸ナナトリウム緩衝液ｐＨ ４６中戻してマトリックスにかけるのが好ましい。その様な条件下において、脈 管形成因子はマトリックスに結合し、ＩＭＮａＣｌを含有する同一緩衝液で溶出 される。

カチオン交換マトリックスからの溶出液は更に逆相高性能液体クロマトグラフィ により分別される。この溶出液を凍結乾燥し、適当な溶媒例えば水中１１Ｌ１チ ドリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）などの溶媒中で戻し、及び第二の溶媒の勾配をカラ ムにかけることにより溶出される。１０８チＴＦＡを含有するインプロパツール ／アセトニトリル／水（５：５：４マ／マ／　ｖ　）の線形勾配が好ましい。

ＨＰＬＣカラムから溶出された物質を次いで透析して溶媒を除去し、凍結乾燥し 、又戻す。

戻されたＨＰＬＣカラム溶出液を次いで脈管形成活性のアッセイを行い、活性画 分を同定する。脈管形成活性に対する幾つかのアッセイは良く知られており、ヒ ヨコ胚漿尿膜アッセイ〔ナイトン等（Ｋｎｉｇｈｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ−）Ｂｒ、 　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ　３５　：　３４７−３５６．１９７７年〕及び角膜移植 アッセイ〔ランガー及びフォークマン（Ｌａｎｇｅｒ　ａｎｄ　Ｆｏｌｋｍａｎ 　）、Ｎａｔｕｒｅ　２６５　：　７９７−８００．１９７６年〕などが挙げら れる。

ＨＴ　−２９Ｍ胞が出発物質として用いられる場合には、二つの活性画分がＨＰ ＬＣカラムから得られる。一つの両分はＭｒ約１６０００の主たるタンパク質成 分とより少量のＭｒ約１４．０００１１１を含有する。第二の画分はアンギオゲ ニンと命名されたＭｒ約１４，０００の単一タンパク種を含有する。更に分析す ると、アンギオゲニンは９．５より大きい等電点及びアミノ酸配列分析により約 １４．１９３ダルトンの分子量を有することが判明した。

驚くべきことに、殆んどの前記脈管形成因子と対照的に、アンギオゲニンは通常 のアッセイにおいては有糸分裂誘発性ではなかった。アンギオゲニンのアミノ酸 配列は膵臓リボヌクレアーゼに３５チ相同であることが判明した。

脈管形成タンパク質が実質的に純粋な形態で得られた場合に、そのアミノ酸配列 は公知の方法、例えばエドマン分解〔エドマン及びベツグ（Ｅｄｍａｎ及びＢｅ ｇｇ　）、Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｌｏｃｈｅｍ、　１　：　８　Ｇ　−９１，１９ ６７年〕により決定された。全アミノ酸配列を決定する必要はない。

好ましくは、少なくとも５〜１０個のアミノ酸の配列が決定される。

このアミノ酸配列から、ＤＮＡプローブが設計される。

一般的には、このアミノ酸配列をコード化する全ての可能性あるＤＮＡ配列に対 応するプローブの族を設計する必要がある。その様なプローブはＤＮＡクローン をスクリーニングする際に偽の陽性シグナルを最少にするために少々くとも１４ 個のヌクレオチドの長さであるのが好ましい。適当なプローブは公知の方法によ り合成されるか〔総説としてイタクラ（Ｉｔａｋｕｒａ　）、Ｔｒｅｎｄｓ　ｌ ｎＢｉｏｃｈｅｍｌｃａｌ　５ｃｉｅｎｃ＠、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　Ｂｉｏｃｈｅ ｍｉｃａｌ　Ｐｒｅｓｓ　５１９８２年参照〕或いは商業上の供給者から購入さ れる。

ｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）及び／又はゲノムＤＮＡライブラリーを次いで調製し 、及び通常のハイブリダイゼーション技術を用いてプローブを用いてスクリーニ ングする。その様なライブラリーの調製技術は良く知られている〔例えば、ロー ン等（Ｌａｗｎ　ｅｔ　ａｌ、　）　Ｃｅ１ｌ　１５　：１１５７−１１７４． １９７８年；及びマイケルソン等（Ｍｉｃｈｅｌｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ　、　）　 Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ　、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ　、　ＵＳＡ８０：４７２−４ ７６．１９８３年参照〕。プローブにハイブリダイズするクローンを次いで選択 し、配列決定する。

或いは又、十分な量の純粋な脈管形成タンパク質が得られるならば、それを用い て抗体を調製し、午の抗体を次いで用いて発現ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａライブラリーをス クリーニングしてよい〔ヤング及びデービス（Ｙｏｕｎｇ　ａｎｄ　Ｄａｖｉｇ 　）、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃ１．　ＵＳＡ　８０　：　１１９ ４−１１９８．１９８３年〕。

全長のｃ　Ｄ　Ｎ　Ａクローンが得らｎるならば、それを脈管形成タンパク質を 製造するのに使用するために直接に発現ベクターに挿入してよい。全長のｅＤＮ Ａクローンが欠ける場合には、残りのコード化配列は幾つかの方法により得られ 、及び全長のコード化配列が次いで造成される。ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａクローンは追加 のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために或いはゲノムＤＮＡライブ ラリーをスクリーニングするためのプローブとして使用されてよい。タンパク質 のアミノ酸配列が知られているならば、欠けている物質を合成し、そのｃＤＮＡ 及び／又はゲノムＤＮＡ断片に連結して完全表コード化配列が造成される。幾つ かの状況下においては、コード化配列は適当な操作及び本発明により製造される 脈管形成タンパク質の分泌を容易にするために更にリーダーペプチドをコード化 するのが好ましい。リーダーペプチドは脈管形成ペプチド自身のそれであっても 或いは特別の宿主細胞１ｃおいて機能する異種リーダーペプチドであってよい。

脈管形成タンパク質をコード化する全長のＤＮＡ配列が得られた場合には、それ は次いで適当な発現ベクター中に挿入される。本発明を実施するのに使用される 発現ベクターは更に脈管形成タンパク質をコード化する。

ＤＮＡ配列に操作可能に連結されたプロモータを含んでなる。ある場合において は発現ベクターは更に選択される宿主細胞に応じて複製の原点並びに発現レベル を制御及び／又は高める配列を含んでなるのが好ましい。適当な発現ベクターは プラスミド類或いはウィルス類から得られ、或いは両者の要素を含んでよい。

本発明を実施するのに用いられる好ましい原核宿主は細菌エツジエリシア・コリ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｌａ　ｃｏｌｉ　）の菌株であるが、しかし、バチルス（Ｂ ａｃｉｌｌｕｓ　）その他の属も又有用である。これらの宿主を形質転換し、そ れらにクローン化された外来遺伝子を発現するための技術は良く知られている〔 例えばマニアテイス等（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔａｌ、）、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ 　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ）’　Ｍｏｎｕａｌ　。

Ｃｏ１ｄ　ＳＰｒｉｎｇ　Ｈｏｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　１９８２年 参照〕。

細菌宿主中で外米遺伝子を発現するために用いられるベクターは一般的に抗生物 質耐性のための遺伝子などの選択可能なマーカー及び宿主細胞内で機能するプロ モータを含有する。適当なプロモータとしては、ｔｒｐＣニコルス及びヤングス キ−（Ｎ１ｅｈｏｌｓ　ａｎｄ　Ｙａｎｏｆ８ｋＦ　）　Ｍｅｔｈ　。

ｉｎ　Ｅｎｚ７ｔｎＯＩＯｇ７１０１　：　１５５．１９８３年）　ｌａｃ〔カ サダバｙ等（Ｃａ５ａｄａｂａｎ　ｅｔ　ａＬ　）、Ｊ、Ｂａｃｔ。

１４３：９７１−９８０．１９８０年〕及びファージ入プロモータ系などが挙げ られる。細菌を形質転換するために必要なプラスミド類としては、ｐＢＲ３２２ （ポリバー等（Ｂｏｌｌｖａｒｅｔａｌ、　）Ｇｅｎｅ２　：　９５−１１３． １９７７年〕、ｐＵＣプラスミド類〔メツシング（Ｍｅｓｓｌｎｇ　）、Ｍｅｔ ｈ、　１ｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ７１０１　：　２０−７７１．１９８５年；及 びビエイラ及びメツシング（Ｖｉｅｉｒａ　ａｎｄ　Ｍｅｓｓｉｎｇ　）、Ｇｅ ｎｅ　１９　：　２５９−２６８．１９８２年〕、ｐＣＱＶ２（クイーン（Ｑｕ ｅｅｎ　）、Ｊ。

Ｍｏ１．　ＡｐＰｌ、　Ｇｅｎｅｔ、　２　：　１−１０．１９８３年〕及びそ れらの誘導体などが挙げらｎる。

酵母サツカロミセス・セレビジアエ（Ｓａｃｅｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉ ｓａｅ　）などの真核微生物も又宿主細胞として使用される。酵母を形質転換す るための技術はベッグス（Ｂｅｇｇｓ　）により説明されている（　Ｎａｔｕｒ ｅ　２７５　：１０４−１０８，１９７８年）。酵母内置使用する発現ベクター としてはＹＲｐ　７　（ストルール等（５ｔｒｕｈｌ　ａｔａｌ、）、Ｐｒｏｃ 、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、Ｕ　Ｓ　Ａ　７６　：１０３５−１０３ ９．１９７９年〕、ＹＥｐ１３（プローチ等（Ｂｒｏａｃｈ　ｅｔ　ａｌ、　） 、Ｇｅｎｅ　８　：　１２１−１３５．１９７９年〕、ｐＪＤＢ２４８及びＩ） ＪＤＢ２１９（前記ベッグス（Ｂｅｇｇｓ　）　］及びそれらの誘導体などが挙 けられる。その様なベクターは一般的にｔｒｐｌ変異を有する宿主株内における 選択を可能にする栄養マーカーＴＲＰ々どの選択可能なマーカーを含んでなる。

酵母発現ベクター内に用いるのに好ましいプロモータとしては、酵母糖分解遺伝 子からのプロそ一タ〔リッツマン等（Ｒｌｔｚｅｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、　）　Ｊ 、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２５５　：１２０７３−１２０８０．１９８０年；ア ルバー及びカワサキ（Ａｌｂｅｒ　ａｎｄ　Ｋａｗａｓａｋｉ　）、Ｊ、　Ｍｏ １．　ＡｐｐＬＧｅｎｅｔ、　１　：　４１９−４３４．１９８２年〕或いは７ ／Ｉ／コールデヒドロゲナーゼ遺伝子〔ヤング等（Ｙｏｕｎｇ　ｅｔａｌ、　） 　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｏｆ　Ｍｔｃｒｏｏｒｇａｎｌａ ｍｓ　ｆｏｒＣｂｅｍｉｅａｌｓ　ｓホランダー等（Ｈｏ１ｌａｅｎｄｅｒ　ｅ ｔ　ａｌ、　）　ｍ、ｐ、３Ｒ５、Ｐｌｅｎｕｍ　、　＝　ニー＊−り、１９８ ２年；及びアンマラー（Ａｍｍｅｒｅｒ　）、Ｍｅｔｈ、　ｉｎ　Ｅｎｚ）’ｍ ｏｌｏｇｙ　１０１　：１９２−２０１．１９８３年〕力どが挙げられる。酵母 形質転換体において産生された脈管形成タンパク質の精製を容易にし、及び適当 なジスｙフィト結合形成を得るために、シグナル配列、好ましくは分泌タンパク 質をコード化する酵母遺伝子からのものを脈管形成タンパク質のためのコード化 配列に連結してよい。特に好ましいシグナル配列はＭＦα１遺伝子のグレーグは 領域である〔カージャン及びヘルスコビツツ（Ｋｕｒｊａｎ　ａｎｄＨｅｒｓｋ ｏｗｉｔｚ　）、Ｃｅ１ｌ　３０　：　９３５−９４３．１９８２年〕。

より高等な真核細胞も又本発明を実施する際の宿主細胞として役立つ、培養され た哺乳動物細胞が好ましい。

哺乳動物細胞に用いるための発現ベクターは哺乳動物細胞に導入された外来遺伝 子の転写を方向付けることのできるプロモータを含んで々る。特に好ましいプロ モータはマウスメタロチオネイン−１（ＭＴ−１）プロモータである〔バルミタ ー等（Ｐａ１ｍ１ｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　）　５ｃｉｅｎｃｅ２２２：８０９− ８１４．１９８３年〕。この発現ベクター内には又挿入部位の下流に位置したポ リアデニル化シグナルが含有されている。このポリアデニル化シグナルはクロー ン化された脈管形成タンパク質遺伝子のそれであるか或いは異Ｓ遺伝子から誘導 されてよい。

クローン化された遺伝子配列は次いで例えばリン酸カルシウム−媒介トランスフ ェクション〔ウィグラー等（Ｗｉｇｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　）、Ｃｅ１ｌ　：　 ７２５．１９７８年：コラ口及びピアソン（Ｃｏｒａｒｏ　ａｎｄ　Ｐｅａｒｓ ｏｎ　）、Ｓｏｍａ　ｔ　ｉ　ｃＣｅｌｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　７　：　６０５ ．１９８１年；グラハム及びファン・デ／ｌ／　−ニブ（Ｇｒａｈａｍ　ａｎｄ 　Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ　）、Ｖｉｒｏｌｏｇ）’　５２　：　４５６．１９７ ３年〕により培養された哺乳動物細胞中に導入されろ。ＤＮＡ及びリン酸カルシ ウムより々る沈殿が形成され、この沈殿を細胞に適用する。細胞の幾つかはＤＮ Ａを吸収し、それを細胞内部に数日間維持する。これらの細胞の小部分（典型的 に１ｏ−’）がこのＤＮＡをゲノム中に一体化させる。これらの一体化物を同定 するために、選択可能な発現型（選択可能なマーカー）を与える遺伝子が一般的 に対象遺伝子と共に細胞中に導入される。好ましい選択可能なマーカーとしては 、ネオマイシン、ハイグロマイシン、及びメトトレキセートなどの薬品に耐性を 付与する遺伝子が挙げられる。選択可能なマーカーは対象遺伝子と同時に別々の プラスミド上の細胞中に導入されるか、或いはそれらは同一のプラスミド上に導 入されてよい。

一体化された遺伝子配列のコピー数はある種の選択可能なマーカー（例、メトト レキセートに耐性を付与するジハイドロホレートレダクターゼ）を用いることに より増幅して増大される。この選択可能なマーカーは対象遺伝子と共に細胞中に 導入され、及び薬物選択が適用される。薬物濃度を次いで各工程において耐性細 胞を選択しながら段階的に増大する。増大したコピー数のクローン化配列につい て選択することにより、発現レベルが実質的に増大される。

本発明により製造された脈管形成タンパク質は前記の如く宿主細胞或いは細胞培 地からカチオン交換クロマトグラフィ及び高性能液体クロマトグラフィにより精 製される。

その他の脈管形成タンパク質が上記方法により単離される。異った細胞系統は異 った物性を有する脈管形成タンパク質を産生ずることが期待される。加えて、遺 伝的多型性或いはタンパク質及びそれらの前駆体の細胞−媒介修飾により変化が 存在することがある。更に、ある脈管形成タンパク質のアミノ酸配列は変更され た生物学的活性を有するタンパク質を製造するために遺伝子技術により変成さｎ る。例えば、アンギオゲニンとりボヌクレアーゼの間の相同性に基き、位置２６ ．３９．５７．８１．９２及び１０７におけるｅｙ８残基、位置１３及び１４に おけるヒスチジン、及び位置４０におけるリジンは部位特異性突然変異誘発によ る他のアミノ酸による置換に好ましい部位である〔シラー等（Ｚｏｌｌｅｒ　ｅ ｔ　ａｌ　）　Ｍａｎｕａｌｆｏｒ　Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｔｅｃｈｎｌｑｕｅ　 ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｃｏｕｒｓｅ　。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、１９８３ 年〕Ｏ得られたＤＮＡ配列はアンギオゲニンと同一のアミノ酸配列を有するが、 しかし、より高い或いはより低いレベルの脈管形成活性を示すタンパク質をコー ド化するものである。生物学的活性の増大はより低い投与量レベルの使用を許容 することを可能にする。減少された脈管形成活性を有するか或いは全く脈管形成 活性を有さないが、しかしある税の構造的特徴を保持する分子は内皮その他の糺 胞上のレセプターをなお結合することが可能であり、及び、作用部位を閉基する ことにより天然タンパク質の作用に対する拮抗剤を形成し、その結果、脈管形成 −関連病態の治療への接近を与える。その様なタンパク質は本発明の範凹内のも のである。

不発明に従って製造された脈管形成タンパク質を用いて、それらを適当々担体と 組合わせることにより治療或いは診断組成物が製造される。これらの治り組成物 を用いて哺乳動物における血管ｒ目の発達が促進され、例えば心臓発作に引続（ 削性循環を誘発するか或いは例えば関節その他の位置における傷の治捷は促進す る。好ましくは、本発明による治療組成蝉は静脈内に投与するか或いは傷の部位 に直接局所適用により投与される。例えば、良くスポーツに関連したに或いは変 形性関節症において起こるようにひざ或いは肩の半月に傷が生ずる場合には、傷 の箇所における脈管形成タンパク質の注射が引裂かれた或いは外傷を受けた繊維 軟骨物質の治砥を促進する。

有効投与ｔは病態の重さ及び目標組織に応じて異る。更に、脈管形成タンパク質 はタンパク質を用いて抗体の存在を測定するか或いは免疫診断試薬として用いる ための抗体を産生ずることにより悪性の存在のスクリーニングにおける診断用途 を有する。このタンパク質を含有する診断組成物は抗原−抗体複合体の形成に適 した条件下において生物学的試料とインキュベートされる。複合体の形成（即ち 試料中における抗体の存在）が次いで検出される。その様なアッセイの技術は良 く知られており、例えば酵素結合免疫吸着剤アッセイ〔ホラ−等（Ｖｏｌｌｅｒ ｅｔａｌ、）、Ｔｈｅ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｌｉｎｋｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅ ｎｔ　Ａ！１８１Ｌ７５Ｄｙｎａｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ 、　１９７９年〕或いはウェスタンプロットアッセイ〔例えば、タウビン等（Ｔ ｏｗｂｉｎ　ｅｔ　ａｌ　、　）、Ｐｒｏｅ　、　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　＋　Ｓ ｃｉ　、　Ｕ　Ｓ　Ａ７６：４３５０．１９７９年〕などがある。同様に、ある 脈管形成タンパク質に対する抗体を含んでなる診断組成物を用いて生物学的試料 内におけるそのタンパク質の存在を測定することができる。これらの脈管形成タ ンパク質は又脈管形成に関連する障讐の治療に有用である脈管形成阻害剤を発達 させるために用いられてもよい。組換えＤＮＡはこれらの用途に必袂とされる量 でこれらのタンパク質を製造するための優れた方法を提供する。

実　験 材料及び方法 カリホスファターゼ、エンドヌクレアーゼＢａｌ　５１及びＤＮＡポリメラーゼ Ｉ（Ｅ、コリ）のフレノウ餅片はＢｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｉｅｓ或いはＮｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓから購入した 。逆転写酵素（烏骨髄朧ウィルス）は生化学Ｕ−Ｓ、　Ａ、　Ｉｎｃ、から得む れた。ジデオキシヌクレオチドトリホスフェート、デオキシヌクレオシドトリホ スフェート。ｐＢＲ５２２及びｐＵｃ１５はＰ−Ｉ。

Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｇから購入した。ジデオキシ配列決定のための万能プラ イマー（ヘプタデカマー）はＮｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＢｌｏｌａｂｓから購入し 、及び〔α−”Ｐ：１ｄＡＴＰ。

（７−”；Ｐ）ＡＴＰ及び（”Ｓ）ｄＡＴＰｔｔｓ）−１Ａｍｅｒ！Ｉｈａｍか ら得られた。

実施例１：　ｃＤＮＡの単離及びアンギオゲニンをコード化するゲノム配列 ヒトｃＤＮＡライブラリーはプラスミドｐＵｃ１３をクローニングベクター（前 記マニアティス等）を用いてヒト肝臓ポリ（Ａ）−ｍＲＮＡからＭＷした。この プラスミドは予めそのｐｓｔ　Ｉ部位に２いてＧで尾部を付されたものであった 〔マイケルーソン及びオーキン（Ｍｉｃｈｅｌｓｏｎ　＆　０ｒｋｉｎ　）　１ ９８２年〕。２６個の合成オリゴヌクレオチド類（ＣＣＣＴＧＡＧＧＣＴＴＡＧ Ｃ（Ａ／Ｇ）ＴＣ（Ａ／Ｇ）ＴＡ（Ａ／Ｇ）ＴＧ（Ｃ／Ｔ）ＴＧ）　の混合物は Ｐ　−Ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｒｎｉｃａｌｓから購入し、ハイブリダイゼーションプ ローブとして用いた。このヌクレオチド混合物はＧｉｎ−Ｈｌｇ−’！’）’ｒ −Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｌ７ｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇ１７をコード化するヌクレオチ ド配列と相補的である。この配列は大腸腺癌細胞系統ＨＴ　−２９から単離され たヒトアンこのヌクレオチド混合物をＴ４キナーゼ及び（”Ｐ）ＡＴＰで約３Ｘ 　１０”　ｃｐｍ／μｇの特異的活性に放射標識化し、ワラス輝（Ｗａｌｌａｃ ｅ　ｅｔ　ａｌ　−）の方法（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅ５ｒ、　９　： 　８７９−８９４．１９８１年）による肝臓ライブラリーからの３５０，０００ 個の形質転換体のスクリーニングに用いた。プローブと強くハイブリダイズした ７個の組換えプラスミドを単離し、セシウムクロライド勾配遠心分離により精製 した。陽性クローンの各々のＤＮＡインサートを各種制限酵素で消化し、ポリア クリルアミ、ドゲル電気泳動により分析した。それらの配列はマクサム及びギル バート（Ｍａｘａｍ　＆　Ｇ１１ｂｅｒｔ　）の化学分解法（Ｍｅｔｈ、　ｉｎ 　Ｅｎｚ７ｍｏｌｏｇ７６ｓ　：　４　ｔｐ　９−５６０　。

１９８０年）により決定した。各配列は２回以上決定され、８５チを越える配列 が両方の鎖について決定された。

最も大きいｃ　Ｄ　Ｎ　Ａインサートを含有するプラスミド（ｐＨＡＧｌ）を次 いで第２図の頂部に示される術策に従ってマクサム及びギルバートの方法（前記 ）に従って配列決定した。このｃＤＮＡインサートは６９７個のヌクレオチドを 含有し、及び５′末端に１２個のＧ、短い非コード化配列、２４個（或いは２２ 個）のアミノ酸のシグナルペプチドをコード化するリーダー配列、１２５個のア ミノ酸の成熟タンパク質をコード化する５６９個のヌクレオチド、停止コドン、 ３１非コ一ド化配列の１７５個のヌクレオチド、３６個のヌクレオチドのポリ（ Ａ）テール、及び３′末端上の２３個のＣを含むものであった。このｃ　Ｄ　Ｎ 　Ａインサートはヌクレオチド２５２（残渣２３においてＧ１７をコード化する ）置換を有する第３図に示したゲノムＤＮＡ配列のヌクレオチド１０６〜７３１ に対応する。プラスミドｐＨＡＧ１は受入れ番号４０１９２としてアメリカン・ タイプ・カルチャー。

コレクショｙ　（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｔｗｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔ ｉｏｎ　）に寄託されている。

約３Ｘ１０’個のλＣｂａｒｏｎ　４　Ａノくクテリオファージよりなるヒトゲ ノム２イブラリ−〔マニアテイス等（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、　）、Ｃ ｅ１ｌ　１５　：　６８７−７０２．１９７８年：ｌ’ニックトランスレーショ ンにより放射標識化されたクローンｐ　ＨＡ　Ｇ　１のｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ挿入でス クリーニングを行った〔リグビー等（Ｒｉｇｂｙ　ｅｔ　ａｌ−）、Ｊ。

Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　１１３　：　２５７−２５１．１９７７年〕。

ベントン及びデービス（Ｂｅｎｔｏｎ　＆　Ｄａｖｉｓ　）の方法（５ｃｉｅｎ ｃｅ　１９６　：　１８１−１８２．１９７７年）により同定さｎたλＨＡＧ　 １と称される一つの強くノ１イプリダイズするファージクローンをプラーク精製 し、この７アージＤＮＡをプレートリーシス法（マニアテイス等、１９８２年、 前記）により単離した。このゲノムインサートは各種制限酵素で消化して分析し た。このインサートをＰｖｕ　ＩＩで消化して生成したＤＮＡ断片は大きさが約 ５キロ塩基であり、ｅＤＮＡプローブに強くハイブリダイズした。この断片をプ ラスミドｐＢＲ５２２中にサブクローニングし、　Ａｍｅｒａｈａｍのクローニ ング及び配列決定マニュアルに説明されているよう’＆（”５）ｄＡＴＰαＳを 用いてジデオキシ法によりＤＮＡ配列決定に付した〔メツシング等（Ｍｅ＠＠ｉ ｎｇ　ｅｔ　ａｔ、　）　、　ＮｕｅｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、　９　：　 ５０９−５２１．１９８１年；ノランダー等（Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ 　、　）、Ｇｅｎｅ　２６　：　１０１−１（１６，１９８５年〕、このファー ジゲノムインサートなＫｐｎＩで消化することにより生成したプローブに強くハ イブリダイズした約５ｋｂｆ）ＤＮＡ断片をＭ１５ｍｐ１８ファージベクファー ジクローンニングし、合成オリゴヌクレオチドグローブをプライマーとして用い て’　ＤＮＡ配列決定に付した。ゲノムＤＮＡのエンドヌクレアーゼＢａｌ　３ １による系統的削除はボンツ等（Ｐｏｎｃｚｅｔ　ａｌ、　）　（Ｐｒｏｃ、Ｎ ａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ７９　：４２９８−４３０２．１９８２ 年）、グオ及びウー（Ｇｕｏ　＆Ｗｕ　）　（Ｍａｔｈ、　ｉｎ　Ｅｎｚ３’ｍ ｏｌｏｇｙ　１　ｏ　ｏ　＋　６０−同様にして行った。約９５％のゲノムＤＮ Ａ配列は２回以上決定され、５０チを越えるゲノム配列は両方の鎖について決定 された。この配列の一部はアンギオゲニンのコード化配列に対応した。ベクター λＩ（ＡＧ　１は受入番号４０１９３としてアメリカン・タイプ・カルチャー・ コレクションに寄託されている。

アンギオゲニンに対する遺伝子は又λＨＡＧ１をＰｖｕ■で消化するととＫより 生成した約５キロベースのＤＮＡ断片中にも見出された。このＤＮＡ断片はｐＢ Ｒ５２２中にサブクローニングされ、第２回の底部に示される術策を用いてジデ オキシ鎖停止方法によりＤＮＡ配列決定に付された。ヒトアンギオゲニンに対す る完全な遺伝子の配列（第６図）はこの遺伝子が約８００個のヌクレオチドを含 有し、遺伝子のコード化及びＳ１非コード化領域において介在配列がないことを 示した。しかしながら、５ｌ側面配置領域におけるイントロンの可能性は最も大 きいｃ　Ｄ　Ｎ　Ａさえこの領域に延在し力かったので排除することはできない 。

アンギオゲニンに対する遺伝子はその側面配置領域において、３個のＡｌｕ　繰 返し配列〔シュミット及びジエリネツク（Ｓｃｈｍｉｄ　＆　Ｊｅｌｉｎｅｋ　 ）、５ｃｉｅｎｃｅ　２１６　：１０６５−１０７０．１９８２年〕を含有する （第２図及び第３図）。第一番目のＡｌｕ　繰返しは遺伝子の隣接５′側面配散 領域に位置しているのに対し、第二番目は隣接３′側面配置領域に存在した。こ れらの二つのＡｌｕ繰返しは同一の反転配向にあった。第三番目のＡｌｕ　繰返 しは遺伝子の３ｌ側面配置領域において第二のＡｌｕ配列から約５００個のヌク レオチドの下流に位置し、３００個のヌクレオチド配列の３′末端上においてポ リ（Ａ）を有する典型的な配向状態にあった。更に、各Ａｌｕ　繰返しは一対の 短い直接繰返し配列が側面配置されていた。これらの３個のＡｌｕ　繰返しに対 するヌクレオチド配列はシュミット及びジュリネツク（前記）のコンセンサスＡ ｌｕ　配列に約８７チ相同であった。

仮のＴＡＴＡボックス〔ゴールドパーグ、Ｍ、Ｌ。

（Ｇｏｌｄ　−ｂｅｒｇ％Ｍ、　Ｌ　−）、博士論文、スタッフォード大学、１ ９７９年〕及び転写開始部位はそれぞれ−３２及び＋１のヌクレオチドにおいて 同定されたが、しかし、隣接部においては潜在的ＣＡＡＴボックスは見出されな かった。しかしながら、ＴＣＡＡＴの配列は提案されたＴＡＴＡボックスから約 １９０　ｂｐ上流であるヌクレオチド−２２５において同定された。３１末端に おけるポリアデニル化即ちメツセンジャーＲＮＡの操作に含まれる２個のＡＡＴ ＡＡＡ配列〔ブラウトフット及びプラウノリ−（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ　＆　Ｂｒ ｏｗｎｌｅｅ　）　Ｎａｔｕｒｅ　２６５　：　２１１−２１４．１９７６年〕 はヌクレオチド７０３及び７０７において同定された。ｍＲＮＡのポリアデニル 化は第二のＡＡＴＡＡＡ配列の末端から２０ヌクレオチド下流であるヌクレオチ ド７３１において生ずる。３１末端におけるｍ　ＲＮ　Ａのポリアデニル化或い は切断にも含まれる〔パーゲット（Ｂｅｒｇｅｔ　）　Ｎａｔｕｒｅ　３０９　 ：　１７９−１８２．１９８４年）ＣＡＣＴＧのコンセンサス配列はヌクレオチ ド７４７から出発して存在した。交互のプリン及びピーリミジンを有する３２個 のヌクレオチドの伸長はヌクレオチド１４１６から出発して見出された。この配 列は遺伝子における左手方向へリツクス構造即ちＺ−ＤＮＡに対する潜在的領域 を与える〔リッチ等（Ｒｌｃｈ　ｅｔ　ａｌ、　）Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈ ｅｍ、５　５　：　７　９　１　−　８　４　６、１９８４年〕。アンギオゲニ ンに対する遺伝子の側面配置領域並びに相補的領におけるコンピュータサーチは 開放読取りフレームを示さなかった。

ヒトアンギオゲニンのアミノ酸配列はヒトリボヌクレアーゼと約３５チ相同であ る。これらの二つのタンパク質の構造は第４図において比較され、そこで共通残 基は丸で囲んである。直接タンパク質配列分析により決定されたジスルフィド結 合の位置は更にリボヌクレアーゼとの相同性を強調する。

実施例２：トランスフェクションされた哺乳動物細胞におけるアンギオゲニンの 製造 トランスフェクションされた哺乳動物細胞において、アンギオゲニンを発現する ためにアンギオゲニンゲノムコード化配列（ＨＡＧＦ）、マウスメタロチオネイ ン−１（ＭＴ−１）プロモータ、及びＳＶ４０プｏ　モーＩ　Ｋ連結したＤＨＦ Ｒ選択可能マーカーを含んで力る発現ベクターｐＨＡＧＦ−ＭＴ−ＤＨＦＲを造 成した。

第４図に示す如＜、ＨＡＧＦインサートはＰｖｕｌ［断片としてλＨＡＧ１から 単離され、Ｓｍａ　■と線形化されたｐＢＲ５２２中に挿入された。得られたプ ラスミドを次いでＨＡＧＦ配列の５１未翻訳領域において切断するＢｇｌｌＩで 消化した。このＤＮＡを次いでＢａ１５１で消化して、転写開始部位からヌクレ オチド＋７における５１末端を有するＨＡＧＦ配列を生成した。このＤＮＡを次 いでＢａｍＨＩで消化した。得られた断片末端をＤＮＡポリメラーゼＩ　’（フ レノウ断片）を用いて平滑化し、ｐＢＲ５２２及びＨＡＧＦコード化配列よりな る断片なＣＬ７チアガロースゲル上の電気泳動により′Ｊｆ１４製した。このＤ ＮＡをゲルから抽出し、再円形化した。得られたｐＢＲ３２２−ＨＡＧＦと称さ れるプラスミドをＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、アンギオゲニン配列より なる一５ｋｂ断片な（Ｌ７チアガロースゲル上で電気泳動により精製した。

最終発現ベクターを次いで次の様にして造成した。マウスメタロチオネイン（Ｍ Ｔ−１）プロモータ、ヒト第■因子コード化配列、ＳＶ４０プロモータ、及び修 飾ＤＨＦＲ遺伝子〔レビｙソｙ等（Ｌｅｖｉｎ！！＋ｏｎ　ａｔ　ａｌ＠）　ｓ ヨーロッパ特許公開公報１１７．０６０号〕を含んでなるｐＭＴＦ■（クラチ及 びパルミタ−（Ｋｕｒａｃｈｉ　ａｎｄＰｏｌｍｉｔｅｒ　）、Ｔｈｒｏｍｂｏ ｓｉｓ　ａｎｄ　Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ　５４　：　２８２．１９８５年〕をＢ ａｍ　ＨＩ及びＥｃｏ　ＲＩで消化した（第４図）。ｐＵｃ１３配列及びＳＶ４ 　ｏ−ＤＨＦＲ発現単位を含んで々る断片をゲル精製した。この断片を次いでＢ ａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ　ＨＡＧＦ断片に連結した。得られたベクターをｐＨＡＧ Ｆ−ＭＴ−ＤＨＦＲと命名した（第４図）。

プラスミドｐＨＡＧＦ−ＭＴ−ＤＨＦＲを次いで赤子のハムスター腎臓（ＢＨＫ ）細胞中に標準的り／酸カルシｆｙ　Ａ　−ｇ　介）ランスフエクション操作に より移した。

ベクターを含有する細胞を１７９／ｌ　ＮａＨＣＯ，，１０チ熱不活性化ウシ胎 児血清及び抗生物質を補給したグルコース及びグルタミンを含有するダルベツコ −の変成イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ　）中におりて５％ＣＯ，中で３７℃におい て増殖させた。プラスミドを含有する細胞を次いで培養培地内においてＭＴＸの 濃度を逐次増大させることによりメトトレキセー）（ＭＴＸ）耐性について選択 した。用いられたＭＴＸ濃度は１μＭ、１０μＭ、１００μＭ及び１ｍＭであっ た。１ｍＭＭＴＸの存在下において生残った細胞を次いで８０μＭ　Ｚ　ｎ　Ｓ 　０４．２μＭＣｄＳ０４、或いはこれらの二つの塩の混合物を培養培地に添加 することにより誘導した。

アンギオゲニンｍ　ＲＮ　Ａはダーナム及びパルミタ−（Ｄｕｒｎａｍ　ａｎｄ 　Ｐａ１ｍ１ｔｅｒ　）により説明されたのと実質的に同様にしてアッセイを行 った（　Ａｎａｌｙｔ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

１３１　＋　５８５−５９３．１９８５年）。約２．９ｋｂインサート中の全ア ンギオゲニン遺伝子を含有するＭ１３ｍ　ｐ　１８クローンからのセンス鎖ＤＮ Ａを用いて標準曲線を作成した。アンギオゲニンのアミノ酸３５〜４１に対する コード化配列に相補的なドデカオリゴヌクレオチドをその５′末端においてｓ！ Ｐで標識化し、溶液ハイブリダイゼーションにおけるプローブとして用いた。

メツセンジャーＲＮＡレベルはＣｄ＋十誘導を用いる＋＋ と２０倍を越えて上昇し、及びＺｎ　誘導に対しては１５倍を越えた。

アンギオゲニンの存在を測定するために、誘導され、し、及び上筺液を水に対し て透析して凍結乾燥した。凍結乾燥された物質を次いでα１Ｍす）　ＩＪウムリ ン酸緩衝液ｐＨ４６中に溶解し、及びそれに対して透析し、担体としてリゾチー ムを補給した。透析された試料をＣＭ−５２セルロースカラムにかけ、部分的に 精製されたアンギオゲニンをＩＭＮａＣｌを含有する同一緩衝液で溶出した。溶 出液をＣ１８逆相ＨＰＬＣカラムにかけ、上記と同様にして分別した。腫瘍−由 来アンギオゲニンのクロマトグラフィ及び電気泳動特性を有するタンパク質が得 られた。

得られたタンパク質について、刊行された操作を用いてＣＡＭ法により脈管形成 活性を測定した。

実施例３；酵母におけるアンギオゲニンの製造形質転換された８母内でアンギオ ゲニンを発現するベクターは第６図に図示される。それは、酵母ＡＤＨＩ［プロ モータ〔ヤング等（Ｙｏｕｎｇ　ｅｔ　ａｌ、　）　ＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇｌｎ ｅｅｒｌｎｇ　ｏｆ　Ｍｌｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ　ｆｏｒ　Ｃｈｅｍｉｃａ ｌｇ、Ｈｏｌｌａｅｎｅｌｅｒ等編ｐ、３３５、Ｐｌｅｎｕｍ、ニューヨーク、 １９８２年〕、ＭＦα１プレープロ配列の部分〔カージャン及びヘルスコビツツ （Ｋｕｒｊａｎ　ａｎｄ　Ｈｅｒｓｋｏｗｌｔｚ　）、Ｃ＠ｌｌ　５０　：　９ 　Ｓ　３−９４５．１９８２年〕、及びＨＡＧＦ配列よりなる発現単位を含有す る。

ＡＤＨＩ［遺伝子の一部は約１５３０ｂｐのｓｐｈ　Ｉ断片としてプラスミドｐ ＡＤＲ２から得られる〔バイヤー及びヤング（Ｂｅ１ｅｒ　ａｎｄ　Ｙｏｕｎｇ 　）、Ｎａｔｕｒｅ　５００　：　７２４−７２８．１９８２年〕。この断面を Ｍ１３ファージベクター中にサブクローニングし、配列ＧＴＡ　ＡＴＡ　ＣＡＣ ＡＧＡ　ＡＴＴ　ＣＡＴ　ＴＣＣＡＧＡ　ＡＡを有する突然変異誘発性プライマ ーを用いてシラー等（Ｚｏｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　）（Ｍａｎｕａｌ　ｆｏｒ 　Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｔｅｃｈｎｉｇｕｅｓ　ｉｎ　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣＩｏ ｎｉｎｇ　Ｃｏｕｒｓｅ　、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｉｅｓ　５１９８３年）により説明されるのと実質的に同様して突 然変異誘発を行った。突然変異誘発７アージの複製形態はｓｐｈ　ｌ及びＥｃｏ 　ＲＩで消化し、及び約１７６ｂｐの部分的ＡＤＨｎにプロモータ断片をｎ製し た。プロモータの上流部分を次いで約１７６ｂｐ断片、ＡＤＨＩ［（ｐＡＤＲ２ かう）の約１　ｋｂ　ＢａｍＨＩ　−Ｓｐｈ　Ｉ断片及びＢａｍ　ＨＩ　＋　Ｅ ｃｏ　ＲＩ切断ｐＵＣ１３を連結することにより修復した。得られたプラスミド をｐＵＣＡＤＨ２と命名した（第６図）。

男５図を参照すると、ＭＦα１遺伝子をＹＥｐ１３〔ナスミス及びクツチェル（ Ｎａｓｍｙｔｈ　ａｎｄ　Ｔａｔｃｈｅｌｌ　）Ｃｅｌｌ　１９　：　７５３− ７６４．１９８０年〕のＢａｍＨＩ部位にクローン化され、ｍａｔα２災然変異 の相補により同定された部分的Ｓａｕ　５　Ａ断片の酵母ゲノムライブラリーか ら得られた。一つのその様なりローンをｐＺＡ２と命名する。ＭＦα１配列を− ７１の位置においてＨｌｎｆＩで切断し、末端をＤＮＡポリメラーゼＩ（フレノ ウ断片）を用いて充填し、Ｅｃｏ　ＲＩリンカ−を添加する。

シグナル配列を次いでＥｃｏ　ＲＩ　−Ｈｉｎｄ　ｍ断片として単離し、ｐＵＣ １２中にサブクローニングしてプラスミドｐｔｙｃｐｐαＦを造成する。

Ｉ（ＡＧＦコード化配列配列ＨＡＧ１から１１１５ｂｐＡｅｃＪ断片として単離 する。この断片末端をＤＮＡポリメラーゼＩ（フレノウ断片）を用いて平滑化し 、Ｈｉｎｄ■リンカ−を末端に添加する。得られた断片をＨｉｎｄ　ＩＩＩ及び ＥｃｏＲＶで消化し、約６６６ｂｐ断片をゲル精製する。Ｓａｌ　Ｉリンカ−を ＥｅｏＲＶ末端に連結し、断片をＳａｌ　ｌにより切断し、約６７４ｂｐの断片 をゲル精製する。

このＨＡＧＦ配列を次いでＭＦα１シグナル配列の一部に連結する。プラスミド ｐＵＣＰＰαＦをＰａｔ　Ｉ及びＨｌｎｄｌｎで消化し、２５７ｂｐ断片を単離 する。この約６７４ｂｐ　ＨＡＧＦ断片及び２３７ｂｐＭＦα１断片をＰｓｔ　 Ｉ　＋Ｓａｌ　Ｉ切断ｐＵｃ１Ｍに連結する。得られた組換えプラスミドをＰ’ ｓｔ　Ｉ及びＳａｌ　Ｉで消化し、約９１１ｂｐＭＦα１−ＨＡＧＦ断片をゲル 精製し、Ｐｓｔ　Ｉ　＋　Ｓａｔ　Ｉ切断Ｍ１　ｘｍｐ　１０に挿入する（複製 形態）。ＭＦα１のＬｙｓ−Ａｒｇ操作部位とアンギオゲニンの第一アミノ酸の 間の正確カ連結は突然変異誘発性プライマーＴＧＧ　ＡＴＡ　ＡＡＡ’　ＧＡＣ ＡＧＧ　ＡＴＡ　ＡＣＴＣを用いて得られた組換えファージのｉｎ　ｖｉｔｒｏ の突然変異誘発により達成される。突然変異誘発ファージの複製形態はＰｓｔ　 Ｉ及びＳａｌ　Ｉで切断され約８８０ｂｐのＭＦα１−ＨＡＧＦ断片をゲル布製 する。

第６図を参照すると、ＡＤＨＩＩ−ＭＦα１−ＨＡＧＦ発現単位が次いで組立て られる。プラスミドｐＵｃＡＤＨ２をＢａｍＨＩ及びＥｃｏ　ＲＩで切断し、約 １２００ｂｐのＡＤＨＩＩ断片がゲルＮ製される。プラスミドｐＵｃＰＰｔｘＦ をＥｃｏ　ＲＩ及びＨｌｎｄｌｌで切断し、約３４０ｂｐＭＦα１断片をゲル［ Ｊする。これらの二つの断片をＢａｍ　ＨＩ　＋　Ｈｌｎｄ　ｍ切断ｐＵｃｉ２ に連結してｐＵＣＡＤＨＰＰを造成する。このプラスミドをＢａｍＨＩ及びＰｓ ｔ　Ｉで消化し、約１３ｏｏｂｐＡＤＲＩｌ−ＭＦα１断片を精製する。この断 片及び約８８０ｂｐのＭＦα１−ＨＡＧＦ断片を次いで三重連結でＢａｍＨＩ＋ ５ａｌ（切断ｐＵＣ１２に連結する。得られたプラスミドをｐＵＣＡＭＡと命名 する。

この酵母発現ベクターｐＹＡＧＦはｐ　Ｕ　ＣＡＭＡからのＢａｍ　ＨＩ　−Ｈ ｉｎｄ　ｍ発現単位断片をＢａｒｒｉＨＩ　十Ｈ１ｎｄ　ｍ消化ＹＥｐ１５に連 結することにより造成した。

酵母細胞はｐＹＡＧＦにより形質転換され、常法により培養された。アンギオゲ ニンは実質的に上記と同様にして細胞抽出物或いは培養培地からｒＲ製した。

以上の説明から、本発明の特別の実施態様が例示を目的として説明されたが、各 稲修正が本発明の趣旨及び範囲から離れることなくなされることが了解されるで あろう。従って、本発明は請求の範囲以外には限定されるものではない。

ＦＩＧ、４ ＦＩＧ、　５ ＦＩＧ、　６ 手続補正書（方式） ％式％ 補正をする者 事件との関！８　特許出願人

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ｔ脈管形成活性を有するタンパク質をコード化するＤＮＡ配列。 ２．アンギオグニンと実質的に同一の生物学的活性を有するタンパク質をコード 化するＤＮＡ配列。 ３．該タンパク質が第１図に示されたアミノ酸配列を有する請求の範囲第２項記 載のＤＮＡ配列。 ４．該配列がｃＤＮＡである請求の範囲第２項記載のＤＮＡ配列。 ５．該配列がグノムＤＮＡの断片である請求の範囲第２項記載のＤＮＡ配列。 ６．該タンパク質がそのアミノ末端にシグナルペプチドを包含する請求の範囲第 ２項記載のＤＮＡ配列。 ７．ＴＡＴＡボツクス配列及び転写開始部位を包含する５′非−コード化領域を 含む請求の範囲第２項記載のＤＮＡ配列。 ８．ポリアデニル化シグナルを包含する３′非−コード化領域を含む請求の範囲 第２項記載のＤＮＡ配列。 ９．アンギオグニンと実質的に同一の生物学的活性を有するタンパク質をコード 化するヌクレオチド１８５からヌクレオチド５５３までの第３図に示されたＤＮ Ａ配列。 １０．アンギオゲニンと実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質をコー ド化するＤＮＡ配列において、該タンパク質が殆んど或いは全く脈管形成活性を 有しないことを特徴とするＤＮＡ配列。 １１．脈管形成活性を有するタンパク質をコード化するＤＮＡ配列を含んでなる ことを特徴とするベクター。 １２．アンギオゲニンと実質的に同一の生物学的活性を有するタンパク質をコー ド化するＤＮＡ配列を含んでなることを特徴とするベクター。 １３．該タンパク質が第１図に示されたアミノ酸配列を有する請求の範囲第１２ 項記載のベクター。 １４．該ベクターがプラスミド或いはその誘導体である請求の範囲第１２項記載 のベクター。 １５．該ベクターがウイルス或いはその誘導体である請求の範囲第１２項記載の ベクター。 １６．更に該ＤＮＡ配列の上流に且つそれに操作可能に連結されたブロモ−タ配 列を含んでなる請求の範囲第１２項記載のベクター。 １７．該ブロモ−タがメタロチオネイン遺伝子ブロモ−タである請求の範囲第１ ６項記載のベクター。 １８．アンギオグニンと実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質をコー ド化するＤＮＡ配列を含んで左るベクターであつて、該タンパク質が殆んど或い は全く脈管形成活性を有さないことを特徴とするベクター。 １９．脈管形成活性を有するタンパク質をコード化するＤＮＡ配列及び該ＤＮＡ 配列の上流に且つそれに操作可能に連結したブロモ−タ配列を含んでなるＤＮＡ 造成物を含有する細胞。 ２０．アンギオグニンと実質的に同一の生物学的活性を有するタンパク質をコー ド化するＤＮＡ配列及びそのＤＮＡ配列の上流に且つそれに操作可能にれれ連結 されたブロモ−タ配列を含んでなるＤＮＡ造成物を含有することを特徴とする細 胞。 ２１．該タンパク質が第１図に示されたアミノ酸配列を有する請求の範囲第２０ 項記載の細胞。 ２２．該ブロモ−タがメタロチオネイン遺伝子ブロモ−タである請求の範囲第２ ０項記載の細胞。 ２３．請求の範囲第２０項記載の細菌細胞。 ２４．請求の範囲第２０項記載の酵母細胞。 ２５．請求の範囲第２０項記載の哺乳動物細胞。 ２６．アンギオゲニンと実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質をコー ド化するＤＮＡ配列を含んでなるＤＮＡ造成物を含有する細胞であつて、該タン パク質が殆んど或いは全く脈管形成活性を有さないことを特徴とする細胞。 ２７．アンギオグニンと実質的に同一の生物学的活性を有するタンパク質を製造 する方法てあつて、細胞内に該タンパク質をコード化するＤＮＡ配列及び該ＤＮ Ａ配列の上流に且つそれに操作可能に連結されたブロタータ配列を含んでなるＤ ＮＡ造成物を挿入する工程、該細胞を適当な培地内で増殖する工程、及びそのタ ンパク質を細胞から分離する工程を含んでなることを特徴とする方法。 ２８．該タンパク質が第１図に示されたアミノ酸配列を有する請求の範囲第２７ 項記載の方法。 ２９．該ブロモ−タがメタロチオネイン遺伝子ブロモ−タである請求の範囲第２ 、７項記載の方法。 ３０．該細胞が細菌細胞である請求の範囲第２７項記載の方法。 ３１．該細胞が酵母細胞である請求の範囲第２７項記載の方法。 ３２．該細胞が哺乳動脈細胞である請求の範囲第２７項記載の方法。 ３３．請求の範囲第２７項に従つて製造されたタンパク質。 ３４．アンギオゲニンと実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク賃を製造 する方法であつて、該タンパク質が殆んど或いは全く脈管形成活性を有さない方 法において、細胞内に該タンパク質をコード化するＤＮＡ配列及び該ＤＮＡ配列 の上流に且つそれに操作可能に連結されたブロモ−タ配列を含んでなるＤＮＡ造 成物を挿入する工程、該細胞を適当な培地内で増殖する工程及びそのタンパク質 を細胞から分離する工程を含んでなることを特徴とする方法。 ３５．請求の範囲第３４項に従つて製造されたタンパク質。 ３６．請求の範囲第３３項記載のタンパク質及び薬学的に許容可能な担体を含ん でなることを特徴とする治療組成物。 ３７．請求の範囲第３３項記載のタンパク質を含んでなることを特徴とする診断 組成物。 ３８．請求の範囲第３５項記載のタンパク質及び薬学的に許容可能な担体を含ん でなることを特徴とする治療組成物。