JPS63501172A - 特異的結合アッセイにおける成分の分離，混合および検出のための方法および装置 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 特異的結合アッセイにおける成分の分離、混合および検出のための方法および装 置 艮五分互 本発明は、−ｉに、自己収容アッセイ容器における特異的結合アッセイに関し、 さらに詳しくは、不均質結合アッセイにおいて固相に結合した標識付けされた成 分を結合しない標識付けされた成分から分離し、次いで結合した標識付けされた 成分を測定する方法に関する。本発明は、また、自己収容アッセイ容器（ここで アッセイ容器はアッセイ混合物、および、１または２以上の層中にあらかじめ分 配されたクッション（ｃｕｓｈｉｏｎ）を含有する）内で実施される均質または 不均質の結合アッセイを用いて、流体試料内の分析物の存在および／または量を 検出する方法に関する。

１景且歪 特異的結合アッセイは生医学的研究および臨床的診断の分野において広く応用さ れており、前記アッセイは生物学的流体中において普通に直面する種々の物質（ 分析物）の存在または量を決定するために用いられる。このような物質は蛋白質 、薬物、ホルモン、ビタミン、微生物などを包含する。さらに、特異的結合アッ セイは、他の分野、例えば、食物の処理および環境の品質管理において、微生物 および微生物の毒素の検出に、あるいは有機廃棄物の検出に利用することができ る。

特異的結合アッセイは、普通、均質アッセイおよび不均質標識付けされた成分が 発するシグナルは結合しない標識付けされた成分が発するシグナルと異なる。そ れゆえ、２つは物理的分離工程を必要としないで区別することができる。しかし ながら、均質アッセイにおいてさえ、試料と供に２以上のアッセイ反応成分を順 次に添加することを必要とする。古典的な特異的結合アッセイは、ルベンステイ ン（Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ）への米国特許第３，８１７．８３７号に記載されて いる、酵素多重（ｅｎｚｙｍｅ−ｍｕｌｔｉｐｌｉｅｄ）イムノアッセイ（ＥＭ ＩＴ）である。

均質特異的結合アッセイは迅速であり、そして手動的にあるいは自動化器具を用 いて実施することが容易である。しかしながら、これらの試験は、典型的には、 試料プラス抗体の順次的添加および混合、中間のインキュベーション、次いで酵 素−分析物接合体、次いで醇素基質へ色溶液の添加を必要とする。自動化は種々 の型の分析装置、例えば、個々の［例えば、デュポンのエイ力（ａｃａｏ　）　 ］　、遠心（ロシェ・コバス・バイオ（Ｒｏｃｈｅ　Ｃｏｂａｓ　Ｂｉｏ＠　） 　］　、および線状：＆［例えば、テクニコン（Ｔｅｃｈｎｉｃｏｎ）ＳＭＡＣ ＠　）を用いて達成された。しかしながら、均質アッセイは低分子量の化合物の 検出に限定され、干渉の傾向があり、そして一般に感度がほぼ１ナノモルの分析 物の検出に限定される。

不均質アッセイにおいては、大きい分析物および小さい分析物の両者を検出する ことができるが、結合した標識成分および結合しない標識成分が発するシグナル は同一であり、それゆえ２つを物理的に分離してそれらを区別しなくてはならな い。古典的な不均質特異的結合アッセイは、Ｙａｌｏｗが記載する［５ｃｉｅｎ ｃｅ、　２００：１２４５．１９７８　］競合ラジオイムノアッセイ　（ＲＩＡ ）である。Ｃｕａ　ｔｒｅｃａｓａｓが記載する（Ａｎｎ、　Ｒｅｖ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、、４３：１０９−２１４．１９７４コラジオリセプターアツセ イ、およびＷｉｄｅが記載する［Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　Ｍｅｔｈ ｏｄｓの１９９−２０６ページ、ＫｉｒｋｈａｍおよびＨｕｎｔｅｒ−、、Ｅ、 　＆　Ｓ、　Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ　ｓニブインバーブ、１９７０　］ササン ４ンンチラジオイムノアフセである。干渉は通常排除され、そして過剰の結合試 薬を時々使用できるので、不均質結合アッセイは均質アッセイよりもかなり感受 性がありかつ信頼性がある。

典型的な「二重抗体」競合ＲＩＡにおいて、試料中に存在する既知量の放射線標 識リガンドおよび試料中に存在するりガントが制限された量の抗体について競合 する。十分な時間を経過させて特異的結合を起こさせ、その後抗体および結合し たリガンドを抗−免疫グロブリンの添加により沈殿させ、反復した遠心により洗 浄して結合しない標識を除去し、そして結合した相中に存在する標識リガンドの 量を決定する。

サンドイッチアッセイを使用して、イムノアッセイにおける分析物、例えば、抗 原についてより大きい感度を達成することができる。このようなアッセイにおい ては、過剰のリガンドを使用して結合対の解離定数より下の濃度において結合を 強制する。典型的、なサンドインチイムノアッセイにおいては、２つの抗体の型 を必要とし、それらの各々は抗原に同時に結合することができる。一方の抗体は 固相に結合するが、他方は標識付けされる。競合ＲＩＡを用いるときのように、 結合した標識および結合しない標識を分離するために１または２以上の個々の洗 浄工程を必要とし、そして試薬の順次的添加が典型的である。

固相を単離しそして洗浄しな（ではならず、そして順次的試薬の添加が頻繁に要 求されるので、非均質アッセイは時間を浪費しかつ多い労働を必要とする。しか しながら、それらは低分子量および高分子量の化合物について等しく良好に機能 し、干渉の傾向が均質アッセイより少なく、そしてピコモ２　ルより低い抗原濃 度に対して感受性であることができる。非均質のイムノアッセイの自動化は達成 された［ＡＰＩＡ　Ｉ　ＩＯ、ベクトン・ディキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃ ｋｉｎｓｏｎ）、ＣｅｎｔＲＩＡ　＠、ユニオン・カーバイド（Ｕｎｉｏｎ　Ｃ ｒｂｉｄｅ）］が、これは液体の流れを注意して制御しかつ結合した分画または 結合しない分画を監視するために複雑なかつ高価の装置を必要とするが、あるい はそれは急速に水和した抗体の固相を通して流れる結合しない標識のみの検出を 与えた 非均質結合アッセイの洗浄工程の不便を排除す、るために、い（つかの試みがな された。例えば、Ｇｌｏｖｅｒら、英国特許（Ｇ　Ｂ）１，４１１．３８２号は 、結合した（下）層をシールドすることによって、結合した標識から部分的分離 後、結合しない放射線標識の量を測定する方法を記載している。しかしながら、 結合した標識成分ではなく結合しない標識成分を測定する場合、特異的結合アッ セイの感度および精度がきびしく制限されることが、この分野においてよく知ら れている。さらに、洗浄工程を欠く方法は緊密に結合する（特異的）標識および 弱く結合する（非特異的）標識の両者の検出が、非常に高い非特異的シグナルを 生ずるという欠点を有する。Ｃｈａｒｌｔｏｎら。

米国特許第４．１０６．９０７号、１９７８年８月１５日発行は、管の底から均 一の高さに上の延びる放射線シールドを有するテーパーをもつ反応管から成り、 上澄み（結合しない分画）からの放射線のみを検出できるようにした、放射能を 計数する他の容器を開示している。この方法は、上のグロウバーと同一の欠点を 有する。

Ｃｈａｎｔｏｔら、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　８４：２５６．１９７ ８は、放射線標識標識の膜の受容体への結合を測定するラジオリセプターアンセ イ法を記載している。この技術は、存在する放射線標識の合計量を計数し、試料 を遠心し、そして定められた量の上澄みから放射線を吸収する役目をする外部に 設置した銅スクリーンで再び計数することを含む。スクリーン自体は銅スリーブ から成り、この銅スリーブは底より上に正確に位置してスクリーンを保持する小 さいノブを有するカスタムメイドの試験管の外側に設置されている。この方法は 、二重の検出を必要とするという欠点を存し、そしてＧｌｏｖｅｒおよびＣｈａ ｒｌｔｏｎの方法について前述した高い非特異的結合に同様に悩まされる。さら に、管は標準的ガンマカウンターにおけるジャミング（Ｊａｎ＋ｍｉｎｇ）およ び破壊を受けやすい。前述の「スクリーニング」法におけるように、大きい直径 のスクリーンはかなりの量の放射線をスクリーニングした体積から散乱させ、ス クリーニングしない標識の測定を不正確にする。また、結合した標識は結合しな い標識の直接隣接しかつそれと接触するので、通常のかつ避けることができない 、スクリーンの位置または結合しない相および結合した相の体積の変動はシグナ ルを有意に変動させることがある。

Ｂｅｎｎｅｔら（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２５２：　２７５３．１９ ７７）は、結合標識を含有する固相の単一工程の単離および洗浄を有するラジオ リセプターアッセイを記載する。彼らは、延長した（３０分）の高速度の遠心を 使用して固相を２０％のスクロースのバリヤーに通させ、次いで直ちに液体窒素 中でアッセイ管を凍結し、そして固相および結合標識を含有する管の先端を切除 した。この方法は、前述よりも効果的な結合標識および非結合標識の分離を提供 する°が、いくつかの有意の欠点を有する。アッセイ混合物はシュークロースバ リヤーの上部でその場でインキュベーションすることができず、こうして反応成 分はバリヤー中に拡散するので、別のインキュベーション容器および分離容器を 必要とする。混合はアッセイ混合物を希釈し、こうしてアッセイ反応成分につい ての平衡を変化させるので、これらのスクロースバリヤー上へのアッセイ混合物 の装填において注意を払わなくてはならない。分離は比較的長い時間を要し、そ してアッセイ管は遠心直後に凍結しなくてはならない。なぜなら、結合した標識 は固相から解離し、そして分離管の上部から拡散し去るからである。最後に、分 離管の先端の切除は不要であり、時間を浪費し、再現的に実施することが困難で あり、使用者を液体窒素の火傷および凍結した管の破片およびその内容物の汚染 の危険にさらし、そして自動化することが非常に困難であろう。

米国特許第４．１２５．３７５号（１９７８年１１月１４日発行）において、Ｈ ｕｎ　ｔｅｒは、シュークロース溶液より高い密度の粒子を含有する前もって平 衡化したイムノアッセイ混合物より下に、シュークロース溶液を注意して注入す ることによって不均質イムノアッセイを実施する方法および自動化計器を記載し ている。

粒子を注入されたスクロースを通して沈降させて、結合しない標識の除去を達成 する。この方法はＢｅｎｎｅｔｔらの方法に固有の欠点のいくつかを潜在的に排 除するが、いくつかの有意な欠点を有する。これらの欠点は、次のものを含む： 　（１）それは結合した標識および遊離の標識の前にアッセイ混合物の別の予備 平衡化、および液体廃棄物の除去を必要とし、こうして自己収容的であることが できず、（２）この方法はほとんどの急速（遠心）分離に容易に適用することが できず、（３）それはＲｅｎｎｅｔｔらの方法におけるように人工的な潜在的お よび拡散に悩まされ、そして（４）それは便利な再現性ある手動法に適さない。

Ｌｉｎ５ｌｅｙ　ら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ 、　３５６．１９８５は、Ｓ、アウレウス（Ｓ、ａｕｒｅｕｓ）を使用する形質 転換性生長因子■型についてのラジオイムノアッセイを記載しており、ここで結 合標識を非結合標識から１０％のシュークロースのクッションを通す急速沈降に より分離し、次いで液体窒素中で凍結し、そして遠心管の先端を切除して沈降し た結合標識を測定する。この方法は、木質的にＢｅｎｎｅｔｔらが記載するラジ オリセプターアッセイのイムノアッセイの実施Ｅｆｉであり、前者の方法の固有 の欠点を有する。

前述の方法の各々はこの現技術状態にわずかの改良をもたらすが、アイソトープ および非アイソトープの両者について、均質技術の容易さおよび迅速さ、および 不均質技術に典型的な増大した感度を兼備し、望ましくない変動、遅延、労力、 および洗浄工程において起こる解離を伴わない特異的結合アンセイ法がこの分野 において要求されている。さらに、この方法は迅速分離を可能とし、標準的検出 器具による手動使用が便利であり、そして半自動化されたまたは完全に自動化さ れた計器に容易に適合することができるべきである。理想的には、この方法は自 己収容的であり、配管および可動部分が最小であり、そして完全にあらかじめ分 配された試薬と適合性であるべきである。本発明は、この要求を満足し、そして さらに、他の関連する利点を提供する。

主λ吋食Ｍ丞 簡潔には、本発明は、不均質結合アッセイ混合物内の結合標識を非結合標識から 分離するための、及び１または２以上の液体または固体の層においてアッセイ反 応成分およびクッションをあらかじめ分配させて不均質および均質の両者の結合 アッセイのための自己収容アッセイ容器を形成するための方法および関連する装 置、ならびに流体試料内の分析物の存在および／または量、を検出する方法、お よびそこの中でおよび一般に特異的結合アッセイ内で使用するために再使用可能 な検出容器を開示する。本発明の目的に対して、クッションなる用語は任意の１ つの実施態様においてすべの第１層および第２Ｎを包含すると定義される。

本発明の１つの面においては、アッセイ混合物内の結合標識を非結合標識から分 離する方法が開示される。このアッセイ混合物はアッセイ容器において層の形態 であることができ、この層は滴の形態であるか、あるいはアッセイ混合物の体積 およびアッセイ容器の形状寸法・に依存して薄いフィルムから数センチメートル まで変化する。アッセイ混合物は、−Ｃに、試薬混合物プラス分析物含有試料を 含む。試薬混合物は、さらに、１種または２種以上の結合成分を含み、そしてさ らに、１種または２種以上の標識を含むことができる。結合性成分は、通常、２ つの部分を含むんで成り、これらは固相およびそれに結合された特異的結合剤（ これは特異的結合活性を与える）である。

いったん試薬混合物および試料が一緒にされてアッセイ混合物を形成すると、イ ンキュベーション期間が通常必要である。インキュベーション期間は、例えば、 要求する感度、結合性成分の結合親和性および濃度のごとき因子に部分的に依存 して、１秒ないし数日の範囲であることができる。インキあるものに結合した分 析物および／又は標識を含み、そしてまた、非結合性成分を含み、非結合性成分 の１つは非結合標識である。他の非結合性成分は水、緩衝液、防腐剤、および蛋 白質を含むことができ、非結合性成分は典型的には大部分水溶液からなる。

簡単には、この方法は（ａ）第１層をアッセイ混合物と接触させ、結合性成分お よび非結合性成分の両者は第１層と不混和性でありかつ密度がそれと異なり、そ して（ｂ）アッセイ混合物を、第１Ｎと接触させながら、結合性成分および非結 合性成分を分離させるために十分な条件に暴露することからなる。典型的には、 結合性成分は第１層のそれより大きい密度を有し、そして非結合性成分の溶液は 結合性成分のそれまたは第１層のそれより低い密度を有する。

特定の実施態様においては、結合性成分および非結合性成分のいずれか一方又は 両者は第１層と同一の密度を有することができる。１つのこのような実施態様に おいては、結合性成分はアッセイ混合物を収容する容器の表面に固定化されてお り、そして結合性成分の密度はアッセイに無関係である。

このような他の１つの実施態様においては、結合性成分はアッセイ混合物中に懸 濁された磁気粒子の表面へ固定化されており、そして非結合性成分から磁力によ って分離される。この場合においては、結合性成分は密度が第１層と有意に異る 必要はないが、典型的にはアッセイ混合物は第１層のそれより低い密度を有する であろう。

追加の実施Ｂ様において、これは典型的には均質結合アッセイであり、アッセイ 混合物全体の密度は第１層の密度より大きいことができる。１つのこのような実 施態様は、試料の添加およびインキュベーションの間、固体の形態である第１層 を利用し、次いでこの第１層を液化してアッセイ混合物を酵素基質発色光を含有 する高密度の第２Ｎと混合させる。

クッションおよびアッセイ反応成分（すなわち、アッセイ反応成分は第１Ｎと接 触する試薬混合物を形成する試薬、なラヒニクッション中の任意の補助アッセイ 成分である）の予備分配を含む本発明の関連する実施態様においては、試薬混合 物を、前述のように、試料の添加および引続くアッセイ混合物のインキュベーシ ョンに実質的に先立って、第１層と接触させる。不均質結合アッセイおよび均質 結合アッセイの両者のため、これは反応成分を必要に応じて分配しなくてはなら ない場合のアッセイに比較して、より大きい便利さを使用者に提供する。さらに 、正確な自動化された装置を使用してアッセイの実施の間アッセイ反応成分を予 備分配させる場合、要求されるアッセイ反応成分の手動分配に比較して、より大 きい精度が期待される。

本発明の関連する面において、自己収容アッセイ容器において実施する均質また は不均質結合アッセイを用いて流体試料中の分析物の存在および／または量を検 出する方法が開示され、ここでアッセイ容器は１または２以上の層中に予備骨あ らかじめ配されたアッセイ反応成分を含有する。

流体試料内の分析物の存在または量を検出するための幾つかの実施態様において 、標識は分析物それ自体を構成することができる。例えば、血液中に存在するグ リコジル化ヘモグロビンの百分率を検出するアッセイは、典型的には、イオンを 使用してこの分析物の大部分またはすべてを分離し、次いで結合した分析物（グ リゴシル化へモブロビン）の吸収ならびに非結合性成分（非グリゴシルゴシル化 へモグロビまたは合計のヘモグロビン）の吸収を適当な比色計で測定することを 含む。この実施態様において、先行技術のカラムにおいて使用するのと同一の粒 子または関連する粒子を本発明のアッセイ混合物における結合性成分として使用 することができ、これは第１層と不混和性であろう。適当なインキュベーション 後、アッセイを結合性成分および非結合性成分を分離させるために十分な条件に 暴露し、そして結合した標識、（分析物）を検出する。試料を測定しない場合、 結合した標識および結合しなかった標識の両者を測定して、結合した分析物の百 分率を計算できるようにする。

本発明の追加の関連する面において、前述のようなアッセイ混合物内の結合標識 を非結合標識から分離するためのいくつかの装置が開示される。１つの実施態様 において、この装置は再密閉可能な基部端および閉じた末端を有するアッセイ容 器を含み、この容器は細長い室をその中に構成する。他の実施態様において、こ の装置は多ウェル（ｗｅｌｌ）プレートを含む。ほかの実施態様において、この 装置は細長いアッセイ容器または連結された細長いアッセイ容器のストリップを 含む。アッセイ容器は、多ウェルプレート中のウェルと実質的に同一の間隔を有 するように配置される。これらの装置は第１層を有し、この第１Ｎは室内でまた はウェルを横切って略横方向にしばしば延びて、その中にバリヤーを形成し、第 １層は結合性成分および非結合性成分の両者と不混和性でありかつ典型的にはそ れらと異なる密度を有する。

本発明の他の面において、流体試料内の分析物の存在または量を検出するための 他の方法が開示される。簡単に述べると、この方法は次の工程を含む：　（ａ） 流体試料を試薬混合物とともにインキュベーションしてアッセイ混合物を形成し 、このアッセイ混合物は１種または２種以上の結合性成分、標識、および非結合 性成分を含有し、標識の少なくともあるものおよび分析物の少な（ともあるもの は、結合性成分成分に、直接にあるいは間接的に結合しており、（ｂ）第１層を 前記アッセイ混合物と接触させ、結合性成分はそれに結合した標識および／また は分析物を有し、そして非結合性成分は第１層と不混和性でありかつそれと異な る密度を有し、（ｃ）アッセイ混合物を、第１層と接触させながら、それに結合 した標識および／または分析物を有する結合性成分と非結合性成分とを分離する ために十分な条件に暴露し、そして（ｄ）結合性成分に結合した標識を検出し、 そしてそれから分析物の存在または量を決定することを含む。

上に開示した特に好ましい実施態様は、得られるアッセイ混合物のインキュベー ションの前に、第１層を流体試料および試薬混合物と接触させることを含む。こ の実施態様内で、アッセイ混合物の形成およびインキュベーションをアッセイ容 ”器において実施し、この中で分離を実施する前述の方法の追加の好ましい実施 態様は、１または２以上の第２Ｎ′中に、補助アッセイ成分を含み１．この補助 ア７セイ成分は、インキュベーション後に、あるいは結合した標識を未結合標識 から分離した後に、アッセイ混合物に添加することが最良である。補助アッセイ 成分は、標識、例えば、酵素接合抗体、酵素基質発色発側、および酵素、例えば 、プロテアーゼ類を含む。第２Ｎ中に含有される他の物質、例えば、表２に記載 するものは、ある場合においては、第２層溶液の密度の調節を越えた追加の機能 を達成する場合、補助アッセイ成分であること考えることができる。

本発明の追加の面は、放射性標識を使用する特異的結合アッセイにおいて使用す るための再使用可能な検出容器を開示する。この検出容器は、−ｉに、開いた端 および閉じた端を有する細長い容器、およびこの細長い容器内に嵌合しかつその 中に位置して閉じた端に対してシールドされた部分およびシールドされない部分 を提供できる放射線シールドを含んでなる。大抵の場合において、効果的な均一 なシールドをよりよく提供する、実質的に円筒形の穴を有するシールドを使用す ることが好ましい。必須ではないが、円筒形の外部を有するシールドを提供する ことが便利なことがある。１つの実施態様において、この設計は、検出容器中に 挿入されているアッセイ容器の部分が、アッセイ容器の露出部分内の標識の検出 を可能とするために十分な距離でシールドから下方に突出できるようにする。他 の実施態様において、検出容器はシールドと容器の末端との間に位置する実質的 に円筒形の部材を有し、この円筒形の部材は容器内のシールドを支持しかつその 位置を維持することができる。なお他の実施態様において、円筒形部材は末端が 閉じていて、ディスクの形態の追加の薄い放射線シールドを支持する。このディ スクは、ある種の検出器具、例えば、ある種のウェル型ガンマカウンターを使用 するとき、より効果的なシールドを可能にする。

本発明の他の面は、以下の詳細な説明および添付図面を参照すると、明らかとな るであろう。

型皿■皿里展説所 第１Ａ図は、本発明のアッセイ容器および関連するクロージヤーの側面図である 。

第１Ｂ図は、本発明の別のアッセイ容器の側面図である。

第２図は、本発明の多ウェルプレートの側面断面図である。

第３図は、アッセイ容器が内部に配置された、本発明の再使用可能な検出容器の 側面図である。

日を　する最　の能 前述の様に、不均質特異的結合アッセイは均質アッセイよりも典型的に感度が高 い。しかしながら、実際には、この利点は典型的には要求されるアッセイ混合物 の労働を要しかつ時間を消費する取扱いによって相殺される。均質アッセイを用 いてさえ、い（つかの別々のアッセイ反応成分の順次的添加を必要とする。本発 明は、より便利な、労力が少ない、均質アッセイおよび不均質アッセイを包含す る、特異的結合アッセイを実施するための材料および方法に関する。このような 結合アッセイは、手動的に実施することができ、あるいは均質アッセイまたは不 均質アッセイを実施するために設計された自動化器具を用いて実施できる。不均 質アッセイにおいては、固相および結合された特異的結合剤からなり、そして典 型的には標識の少なくともあるものに結合して結合した標識および未結合標識の 両者を生成する結合性成分を使用する。

均質アッセイにおいては、典型的には溶液中に溶解した結合剤を使用する。

本発明によって提供される不均質アッセイについての重要な利点は、試薬混合物 またはアッセイ混合物（試料を包含する）を第１層と接触させて貯蔵またはイン キュベーションすることができ、ることであり、この第１層は、典型的には、゛ 未結合標識成分から結合した標識を分離するために使用する密な油様物質である 。第１層と接触させての試薬混合物の貯蔵は、アッセイ反応成分およびクッショ ンを予備包装できるので、有利である。これはアッセイのための調製およびその 実施における操作の数を減少し、そして便利さ、速度および精度を改良すること ができる。洗浄緩衝液の貯蔵、および廃液の収集および廃棄が排除されるので、 本発明は空間的要件を減少しかつ実験室の試験の安全性を増加する。さらに、水 を必要としないので、フィールドテストが促進される。

均質アッセイおよび不均質アッセイの両者に関連する本発明のよって提供される 他の重要な利点は、補助アッセイ成分をアッセイ混合物の層から分離された１ま たは２以上の層にあらかじめ分配して、分析物の存在および／またはレベルを決 定するための完全に自己収容的アッセイ容器をつることができることである。先 行技術において、このような補助アッセイ成分（例えば、均質アッセイのための 酵素基質発色発側、およびサンドインチイムノアッセイにおける標識抗体）は、 典型的には、インキュベーション工程後に、そしである場合においては、未結合 標識および／または分析物から結合した標識を分離した後に添加する。このよう な特徴は先行技術に比較して便利さを増加させるので、アッセイ反応成分のすべ てをあらかじめ分配する本発明において、有意な工業的利点が存在する。

他の面において、本発明は、分離の実施後、結合した標識を選択的に測定する方 法および装置に関する。ある実施態様において、結合した標識の測定は未結合標 識を検出器からシールドすることによって促進される。

Ａ、クッションの第１Ｎおよび第２層 本発明の方法は、一般に、結合性成分及び標識を含有する十分に水性のアッセイ 混合物、およびこのアッセイ混合物を接触する少なくとも１つの水不混和性層を 使用する。アッセイ混合物と接触する水不混和性層を、以後「第１層」と呼ぶ。

第１層は、結合アッセイが均質または不均質かに依存して２つの機能の少な（と も１つをはたす。不均質アッセイにおいては、第１層は、適当な条件下において 、少なくともある結合した標識および／または分析物を有する固相の結合性成分 がこの層と接触しそして／またはこの層を浸透し、こうして遊離している標識か ら分離されるような密度および性質を有する。主として第１Ｎによって起こされ る結合した標識と未結合標識のこの分離は、分離工程として知られている。均質 アッセイにおいて、第１Ｎは、適当な条件下に、アッセイ混合物がこの層を通過 して、補助アッセイ成分、例えば、酵素基質発色発側と接触または混合するよう な密度および性質を有する。この工程は補助試薬混合工程と呼ばれる。

クッションは、少なくとも分離および補助混合工程の間、液体の形態である。第 １層は、また、アッセイ混合物と十分にまたは完全に不混和性である。これらの ２つの特徴は、また、結合性成分と第１層との有効な接触を可能とし、同時にア ッセイ混合物の水性成分を排除する。多くの実施態様において、第１層および第 ２層は、また、アッセイ混合物と異なる密度（典型的にはこの密度はアッセイ混 合物のそれより大きい）を有するので、アッセイ混合物およびクッション層の相 対的位置は重力または遠心力のもとに維持することができる。

第１層によりアッセイ混合物から分離し、ｌまたは２以上の追加の層を使用する ことができ、これらの層は水溶液と混和性または不混和性であることができる。

これらの追加の層を、以後「第２層」と呼ぶ。各第２層は、使用される他の層と は異る密度を存し、そしてさらに、隣接する層とほとんどあるいは完全に不混和 性である。遠心力を用いない用途のため、すべての層は混合または逆転に対して 抵抗性であるが、あるいは短時間の放置後それらの相対位置に戻るべきである。

これは貯蔵温度において固体である少なくとも１つの層を選択することによって 、あるいは密度が大きく異りかつ不混和性であるＮ（例えば、フタル酸ブチルま たはフルオロカーボン油）を使用することによって達成することができる。１ま たは２以上の層の中あるいはアッセイ混合物の中に洗浄剤を包含させると、ある 場合において、混合された液状層の自発的分離が促進されるであろう。適当な洗 浄剤は非イオン性洗浄剤［例えば、ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）　Ｐ　４０ま たはトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）　Ｘ　−１００１およびイオン性洗浄剤（例えば 、タウロデオキシコレートまたはドデシルサルフェート）および洗浄剤の種々の 混合物を包含する。

第１層は種々の化合物のいずれにから構成することもでき、ただしそれはアッセ イ混合物の成分と実質的に不混和性であり、そして典型的にはアッセイ混合物の 固体または液体の成分と異なるの液体密度を有するであろう。第１Ｎがアッセイ 混合物の非結合性成分より大きい密度を有する場合、第１層の密度は通常はぼ１ ．０１以上である。遠心分離を含むような場合について、第１層の密度は典型的 には１．２０を越えず、そして最も好ましくは１．０３より太き（かつ１．１５ より小さい。さらに、不均質アッセイのためには、第１層の密度は、典型的には 、結合性成分の見掛は密度より小さいであろう。さらに、第１層は、インキュベ ーション後の少なくとも分離段階又は補助試験混合段階のために液体状であろう 。第２層もまた、少な（とも補助試薬の混合工程の間、および／または結合性成 分が第２層を浸透するかあるいは通過することを望むような期間の間、液体の形 態であろう。固体の第１層の液化は、典型的には、通常４〜５０℃の範囲におけ る溶融を包含する。

重力または遠心を利用して不均質結合アッセイにおいて分離を達成する用途にお いて、あるいは補助試薬の混合工程を均質結合アッセイにおいて望む場合、第１ 層およびすべての第２層の密度はアッセイ混合物の密度と異なるべきである。第 １層として使用するために適する水不混和性の密な油の代表的な列挙を表１に示 す、これらの物質は、また、第２層の成分として使用することができる。

里上立 水不混和性の密な油状物の代表例 １　アセト　酢酸ｘｎ　３６Ｂ６　１．０２５　−４５　１３０　３５２　７ｔ ）”ｌ！ＩチＩＬ　酸ＸｆＢ　３６Ｂ７　１．１５３　Ｎ、Ａ、　２０Ｂ　不溶 ３　アジピー４メｆｎ　７３Ｆ９７ｆ　１．０６３　８　１７４　Ｎ、Ａ。

４　アジピ＞政変Ｉｆｋ　３６Ｂ９　１．００９　−１８　２０２　ネオ容５　 安息香酸メチル　５８９９　１．０９４　−１５　１３６　不溶６　安息香酸エ チル−３６９７１，０５０−３４１５０はとんど不溶７　ベンゾイル　酢酸エチ ル　３６９８　１．１２２　Ｎ、Ａ、　１９２　不溶８　ベンゼンスル本ン酸エ チル　３６９６　１．２１９　Ｎ、Ａ、　１８６　ゎずが９　＜ンｆルスルネン 酉変Ｘｆル　３６９６　１．２１９　Ｎ、Ａ、　１８６　ゎずが１０　炭酸メチ ル　５９１２　１．０６５　０．５　９０．１　不溶１１　炭酸Ｘｆｋ　２２８ ８　１．０４２　３６　Ｎ、Ａ、はとんど不溶１２　桂皮酸ｘｆ＆　２２８８　 １．０４５　８　Ｎ、Ａ、不溶１３　桂皮酸ブｆｌ！　２２８８　１．０１２　 Ｎ、Ａ、　Ｎ、Ａ、　２００　−１４　クエン　酸トリエチル　３７１９　１． １３７　Ｎ、Ａ、　２７６　１４．５１５　クエン　酸プｆｌＬ　１５５１　１ ．０４５　−２０　３６０　ネオ容１６　フマル　酸ジエチル　アルトリフチ　 １．０５２　１−２　１７２．　Ｎ、Ａ。

１７　メチルフロｘ−ト　５９４３　１．１７９　Ｎ、Ａ、　１２６　わずか１ ８　グルタボン　酸ジエチル　シグマ　１．０５３　Ｎ、Ａ、　Ｎ、Ａ、　Ｎ、 Ａ。

１９　グルタＩＫｉジｕｒｓ　４３０５　１．０８７　Ｎ、Ａ、　１６０　Ｎ、 Ａ。

２０　ｆｎ’ｉｎ酸’；メｎ　７ｎＦ’ｌフｆ　１．０２２　Ｎ、Ａ、　１８８ 　Ｎ、Ａ。

２１　イタコン酸′／Ｉチル　アルトリフチ　１．１２４　３７−４０　１５８ 　Ｎ、Ａ。

２２　９ンｊ　政変５ｚｆ３　３７６１　１．０６４　−１０　１７２　不ｒｄ ２３　７Ｄン　酸ジメチル　５９６１　１．１５６　−６２　１３２　わずか２ ４　７Ｕン　酸ジエチル　３７６３　１．０５５　−５０　．１６０　５０２５ 　マロン　酸ジエチルメチル　シグマ　１．０１３　Ｎ、＾、　Ｎ、Ａ、　Ｎ、 Ａ。

２６　７０＞　ｇｉｊ５ジＺチＢ’ｃン５１Ｌ　７１））リッチ　１．０６４　 Ｎ、Ａ、　２５０　Ｎ、Ａ。

２７　オキ９ル酢酸エチ３　３７７６　１．１３１　Ｎ、Ａ、　１８８　ネオ容 ２８　蓚酸ジメチル　フルトリフチ　１．１４８　５０−５４　１１８　１７２ ９　蓚酸’；ｘチｎ　３１０９　１．０７９　−４１　１４６　ｊＨ容３０　７ ｚ二に酢酸ｘＨｂ　３７８０　１．０３３　Ｎ、Ａ、　１６４　Ｎ、Ａ。

３１　ｙｅｎ　酸９ｆｉＨＬ　３２４４　１．１９４　０　１９４　２３２３２ 　フタル　酸ジエチル　３７８３　・１．２３２　Ｎ、Ａ、　２２２　不溶３３ 　７＋４９９ブｏビＢ　７＆Ｆリフｆ　１．０７８　Ｎ、Ａ、’　２５０　Ｎ、 Ａ。

３４　フタ路　酸ジプチル　１５７５　１．０４３　−３５　２７８　２５００ ３５　サリチル酸メタル　５９９０　１．１８４　−８．６　１５２　１５００ ３６　サリチル酸エチル　３７９３　１．１３１　１　１６６　わずか３７　ジ メチルジフェニルポリシロキサシ　シグマ　１．０５　Ｎ、Ａ、　Ｎ、Ａ、　不 ７８３８　シリコーン油　シグマ　１．０５０　Ｎ、Ａ、　Ｎ、Ａ、　不溶３９ 　コハク　酸ジメチル　５９９３　１．１１７　１９．５　１４６　１２０４０ 　コハク　酸ジエチルメチル　アルトリフチ　１．０７６　Ｎ、Ａ、　１６０　 Ｎ、Ａ。

４１　コハク　酸ジエチル　３７９９　１．０４０　−２１　１７４　不溶４２ 　Ｌ−酒石兵変ジメチル　７）１トリフチ　１．２３８　４８，５０　１７８　 Ｎ、Ａ。

４３　Ｌ−酒石酸ジエチル　３８０３　１．２０４　１７　２０６　わずか４４ 　Ｌ−酒石酸ジプチル　７）レドリフチ　１．０９０　２１−２２２６２　ｊ讐 、Ａ。

４５　フロリナ−）ＦＣ−４０（３ｔ１）　３Ｍ　１．８５０　Ｎ、Ａ、　Ｎ、 Ａ、　不溶４６　フＵリナー）ＦＣ−７０（３Ｍ）　３Ｍ　、　１．９３０　Ｎ 、Ａ、　Ｎ、Ａ、　不？容４７　フロリナートＦＣ−７７（３Ｍ）　３Ｍ　１． ７８０　Ｎ、Ａ、　Ｎ、Ａ、　不を容４８　ジフェニルメタン　３３３９　１． 、．００１　２６　１６８　Ｎ、Ａ。

第１Ｎがアッセイ混合物の液状成分より密度が高い実施態様のためには、第１層 の物質は水より大きい密度＜　＞　１．００）を有するであろう。しかしながら 、反応混合物の全体が第１層を透過して第２Ｎ中の１種または２種以上の補助ア ッセイ成分と混合する、補助試薬の混合工程を必要とするある均質結合アッセイ のためには、水の密度より低いがあるいはそれに等しい密度をもつ油は、もしこ れがインキュベーションの間固体の形態に維持されることができ、引続いて液化 され得る場合、使用することができる。このような実施態様において、反応混合 物は密な水溶液を形成する１種または２種以上の物質を含有することができる。

このような物質の代表的列挙を表２に示す。

密な油様物質は典型的には生物有機酸の合成エステル（通常、メチル、エチル、 プロピルまたはブチルエステル）であり、そして通常実質的な酸幸、窒素、また はイオウを含有するか、あるいはそれらはフルオロカーボン油またはシリコーン に基く油である。はとんどの密な油様物質は互いに混和性であり、そして単独で あるいは種々の混合物の形態で第１Ｎまたは第２層において使用することができ る。しかしながら、ある実施態様においては、互いに混和性でなくかつ密度が異 なる隣接する水不混和性層つくることが可能でありかつ望ましい（例えば、炭化 水素に基づく物質または混合物＋フルオロカー水ンに基づく物質または混合物） 。このような実施態他の熟練者にとって、表１に列挙した物質以外の、所望の性 質を有する関連する水不混和性物質は容易に明らかであろう。

このような性質は水および水溶液中の部分的または完全な不混和性および不都合 な匂または毒性の欠如を包含する。第１層の物質のほかの所望の性質は、試薬混 合物またはアッセイする能力である。さらに、第１Ｎは分離工程（不均質アッセ イにおいて）および補助試薬の混合工程（均質アッセイにおいて）の間液体の形 態でな（ではならない。

本発明の方法において固体として有用な水不混和性の密な油について、液化は典 型的には４〜５０℃の範囲内で起こる。

ある場合において、溶融可能な水不混和性の密な油の液化温度は、物質の混合物 よりも高い温度で個々に溶ｉする２種以上の物質を配合することによって調節す ることができる。また、当業者にとって明らかなように、ある場合において液化 は溶融以外の手段により、例えば、固体のポリマーの解重合によって達成するこ とができる。

はぼ１．０４〜１．ｌＯの範囲の密度を有する第１層の物質またはそれらの混合 物、例えば、フタル酸ジプロピル、フタル酸ジブチル、桂皮酸メチル、桂皮酸エ チル、桂皮酸ブチル、クエン酸ブチル、フマル酸ジエチル、マレイン酸ジエチル 、シュウ酸ジエチル、コハク酸ジエチルおよび酒石酸ジブチルは、遠心性用途の ために特に好ましい。洗剤をアッセイ混合物中に第１層と一緒に使用する場合、 好ましい第１Ｎはフクル酸ブチル、桂皮酸エチル、サリチル酸エチル、シリコー ン油（表１、＃３８）、ジメチルジフェニルポリイソシクロヘキサンを包含する 。なぜなら、これらのような物質は洗剤を含有する反応混合物と共に望ましくな い乳濁液を形成しないからである。洗剤を使用ない場合、好ましい第１層の物質 はコハク酸ジエチル、アジピン酸メチル、コハク酸ジメチル、サリチル酸エチル 、マロン酸ジメチル、およびマロン酸ジエチ物と混合したとき、２以上の透明な 相に容易に分離するからルを包含する。なぜなら、それらは洗剤を欠・く水性反 応混合である。結合性成分がアッセイ容器の表面に結合さる実施態様においては フルオロカーボン油の第１層がと（に好ましい。

なぜなら、これらの油は低い粘度および高い密度をもち、これらの性質はこのよ うな実施態様において結合性成分からの水の完全な置換を促進するからである。

フルオロカーボン油は、また、ポリスチレンのアッセイ容器をこのような油と一 緒に使用できるので、このような用途のために魅力的である。

アッセイ容器が透明なプラスチック、例えば、ポリスチレンであることを望む他 の実施態様について、好ましい第１層の物質は桂皮酸メチルまたはイクコン酸メ チル（３６℃以下で貯蔵される）、シリコーン油［表１、＃３８、「高い温度の 」の融点の浴油、シグマ・ケミカル・カンパニー（ＳｉｇｍａＣｈｍｉｃａｌ　 Ｃｏ、）、米国ミゾリー州セントルイス、またはアルトリフチ・ケミカル・カン パニ（Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）、米度範囲のある部分内で 固体の形態であることを望む実施態様について、桂皮酸メチル、桂皮酸エチル、 イタコン酸ジメチル、シュウ酸ジメチル、コハク酸ジメチル、酒石酸ジメチル、 酒石酸ジエチル、酒石酸ジプチル、およびジフェニルメタンが好ましい。遠心分 離および０〜５０℃の範囲で固体の第１層の両者を利用する実施態様について、 好ましい第１Ｎの物質は桂皮酸メチルおよびイタコン酸ジメチルである。

標識によって放射されまたは生成されるシグナルの性質、または要求される洗浄 の効果に依存して、１または２以上の第２層を含めることが望ましいことがある 。第２Ｎは表１からの適当な水不混和性物質を使用して形成することができるが 、第２層は、また、水溶性であることができる。水溶性の第２層を形成するため に、あるいは均質アッセイのような用途のためにアッセイ混合物の密度を増加す ・るために、典型的には物質を水中に溶解してその密度を増加させる。この目的 に適当な物質の代表的列挙を表２に示す。これらの物質は前述のような第２層ま たはアッセイ混合物の成分として使用するためにことによく適する。しかしなが ら、ある場合において、水及び水不混和性物質の両者中で可溶性である物質（例 えば、ホルムアミドまたはジメチルスルホキシド）を第１層内に使用することが できる。他の実施態様において、ホルムアミドはＤ　Ｎ　Ａハイブリダイゼーシ ョンアッセイ混合物および／またはこのようなアッセイのための第１層中に含め て、ポリヌクレオチド鎖のハイブリダイゼーションを促進することができる。

物脣賭臀優膳ノア、　）マー、鳥ノふふＪ、？マｌ由田す２争９俵　嘉ν亭玉！ 代表的な宙な水混和性液体 塩化セシウム　１．１７４　２０％ 硫酸セシウム　１．１９０　２０％ ジエチレングリコール　１．１１８　１００％ジメチルスルホキシド　１．１０ ０　１００％　ＭＰ−１８℃エチレングリコール　１．１１４　１００％７　イ Ｄ　−／Ｌ／　（ｒ：ＩＣ０Ｌリ　１　、０６８　２０　％ホルムアミド　１． １３０　１００％　Ｍ　Ｐ　＝　２．６℃グリセロール　１．０４５　２０％ 臭化リチウム　１．１６０　２０％　０．６部の水中に可溶塩化リチウム　１． １１３　２０％　１．３部の水中に可溶ｇ酸リチウム　Ｎ　Ａ　２．６部の水中 に可溶メトリザミド（ＭＥＴＲＩＺＡＭＩＤＥ）　１．１１０　２０％　１５℃ における密度パーコール（ＰＥＲＣＯＬＬ）　１．３００　１００％　勾配を自 発形成する酢酸カリウム　１．１００　２０％ 臭化カリウム　１．１５８　２０％ クエン酸カリウム　１．１４０　２０％ヨウ化カリウム　ＮＡ 酒石酸カリウム　１．１３９　２０％ プロピレングリコール　１．０３６　１００％　水、ＣＨＣＪ　３と混合臭化ナ トリウム　１．１７２　２０％ ソルビトール　１．０７９　２０％　８３％に可溶ヨウ化ナトリウム　ＮＡ シュークロース　１．０７９　２０％ ）り負餠光憬樟１ムノｆソで１ここわに１更用Ｊる１この、蒋系基質を含有する 水性層２Ｎはアッセイ混合物と同一または同様な密度を有することができ、る。

このような実施態様においては、第１層は典型的には発色前のインキュベーショ ンの間において固体であろう。例えば、第１Ｎがアッセイ混合物および第２層の 両者より密度が低い場合、第１層は溶融のときアッセイ容器の上部に浮くであろ う。これはアッセイ混合物および基質含有箱２Ｎをアッセイ容器の底に沈めさせ るであろう。この実施態様においては、第１Ｎの物質は、密度がより大きい不混 和性第２層上に分散させた後固化できる場合、水より密度は低いことができる。

いくつかの磁性粒子をアッセイ容器内に含める場合、第１Ｎの液化後、電磁石を 使用してアッセイ混合物および第２Ｎを効果的に混合することができる。

さらに、補助アッセイ成分を第１Ｎまたは第２層中に含めて、シグナルの生成ま たは検出を促進することが望ましいことがある。第１層または第２層のための添 加剤の例は、シンーオキサシリル］ベンゼン（ＰＯＰＯＰ）であり、これらは標 識をシンチレーションカウンターでこのような蛍光体を使用して検出できる場合 、第１層または第２層中に含めることができる。第２層への添加剤は、また、酵 素、酵素前駆体、または酵素基質を包含することができ、ここで標識はそれぞれ 酵素識をアッセイ混合物に添加する実施態様（例えば、ある種のサンドインチ結 合アッセイ）において、第２層は標識（例えば、標識付けされた抗体）を含有す ることができる。

第２層を、また、チャオドロープ剤（ｃｈａｏｔｒｏｐｉｃ　ａｇ’ｅｎｔ）、 例えば、塩類、尿素、塩化グアジニウム、非イオン性洗剤、イオン性洗剤などを 含有するように配合して、非特異的結合を減少することができる。いずれの場合 においても、これらの添加剤は、結合性成分がこのような層を通して動（間、特 異的に結合した標識をその結合性成分から有意に解離させるために十分であって はならない。第１層および第２Ｎの両者は、また、連続的または不連続の勾配と して配合することができる。例えば、シュークロース層は、はぼ５重量％からほ ぼ４０重量％に増加する濃度の勾配として配合することができる。あるいは、交 互する層を配合することができ、ここで各連続層はその隣接層と実質的に不混和 性でありかつ異なる密度を有することができる。例えば、このような勾配は交互 する炭化水素層およびフルオロカーボン層から、あるいは交互する水性層および 非水性層から構成できるであろう。このような勾配は、好ましくは層の偶発的混 合（例えば、取扱いの間）に対して抵抗性であり、最も好ましくは偶発的に混合 した場合再生するように、自律形成性である。

前述のように、本発明の目的のため、用語「クッション」は単独であるいは組み 合わせで使用されるすべての第１層または第２層を包含すると定義される。異な る実施態様におけるクッションの体積は、可変であり、そして多数の因子、例え ば、とくに使用される標識、検出の方法、アッセイの要求される感度、およびア ッセイ混合物の体積に依存するであ′ろう。クッションの体積および配合の両者 は、実験的に決定することができる。しかしながら、大抵のアイソトープを用い る用途について、未結合標識標識から発生する放射能をシールドすることが必要 な場合、２．５容量のクッション対１容量の試料の比が適切であろう。

多層のクッションの実施態様について、そして非特異的結合が適切に低い場合、 第１層の体積は用いる条件下で１または２以上の第２Ｎからアッセイ混合物を完 全に隔離するために十分であればよい。典型的には、競合アッセイについて、は ぼ３〜４％の非特異的結合が許容されうるが、１〜２％であるのが非常によい。

過剰の標識を使用できるサンドイッチアッセイについて、非特異的結合は０．２ ％以下であることが要求されるであろう。非特異的結合は、標識および結合性成 分の物理的性質によって決定され、そして変化するであろう。

例えば、９６ウエルのプレートを使用するとき、１容量の第１層対１容量の試料 の比が通常適切であろう。第１Ｎが試料の負荷の間固体の形態である場合、ある いはアッセイ混合物がすべての第１層および第２層と不混和性である場合、より 少ない量の第１Ｎを使用することができるであろう。

アッセイ容器の形状寸法および向き、アッセイ混合物、およびクッションは特定 の用途よって支配されるであろう。遠心分離または重量分離を含む典型的な使用 において、多くの型の試験管または多ウェルプレートの１つを使用することがで きる。大抵の使用において、試料、結合性成分、および第２成分は便利に添加さ れ、混合され、そしてあらかじめ分配された第１層と接触してインキュベーショ ンされる。ある場合において、結合性成分および／または第２成分は、クッショ ンと一緒に、密閉したアッセイ容器７公離容器内であらかじめ分配することがで きる。このような場合において、より少数の成分（１種度に少ない、試料）を混 合およびインキュベーションの前に使用さが添加することが必要である。

追加の機会は磁気分離を使用して得られ、ここで１または２以上の層をアッセイ 混合物に対して横方向に向けることができ、あるいは反応混合物の密度が１また は２以上の層のそれより大きい場合、反応混合物より上に向けることができる。

結合性成分をアッセイ容器の表面へ結合せしめる場合、アッセイ混合物はアッセ イ容器の底において結合性成分と接触させて予備平衡化することができる。未結 合標識からの結合した標識の分離を達成するために、第１層の物質をアッセイ容 器に注ぐかあるいはピペットで入れて、密度が低い第２成分（未結合標識を含む ）を第１Ｎの上部に置換する。ある場合において、第２層を第１層の添加と同時 にあるいはそれに引続いて添加することができる。

Ｂ、結合性成分において使用する固相 結合性成分は通常２つの部分からなる：固相、および特異的結合活性を付与する それに結合された特異的結合剤である。

用である。一般に、それらは３つの型である：あらかじめ形成された粒子、容器 の表面、および特異的に結合性の成分に取付けることができかつ結合アッセイの 間に不溶性とされることのできる可溶性ポリマーである。これらの固相の型の各 々について、特異的の結合活性は固有の性質であってもよく、あるいは後刻「特 異的結合剤」と呼ぶ固相に特異的結合性質を付与する物質の共有結合または非共 有結合によって発生させることができる。

あらかじめ形成された粒子の固相は、安定化された微生物の懸濁液、例えば、免 疫グロブリン結合分子である「プロティンＡ」を自然に生産するスタフィロコッ カス・アウレウス（旦鉦鉦旦並匹■　ａｕｒｅｕｓ）菌株を包含する。あるいは 、固相は微生物以外の鉱物（ヒドロキシアパタイト、ガラス、または金属）の粒 子の懸濁液、不溶性ポリマーのビーズ（例えば、デキストラン［セファデックス （Ｓｅｐｈａｄｅｘ）　Ｇ　−１０またはＧ−２５１、アガロース、またはポリ スチレン）であることができる。これらの微生物以外の粒子のあるものは、自然 に有用な活性を示す（例えば、ヒドロキシアパタイト）。しかしながら、大抵の 他のものは適当な物質により、この分野においてよく知られた手順を使用して被 覆しなくはならない。

上に記載したこれらの固相は、また、固有の磁性または常磁性をもつように調製 することができ、あるいはそれらを示すことができ、これらの性質は結合した標 識の未結合標識からの分離あるいは混合のために利用できる。非磁性、非遠心の 子、例えば、プラスチック被覆した金属ビーズ（典型的には直径３〜６ｔａ）を 包含する。これらは、この分野においてよく知られているように、金属ビーズを 溶液、例えば、アセトンまたはクロロホルム中に溶解したポリスチレン中に浸漬 し、次いでビーズを取り出し、溶媒を蒸発させ、次いでビーズを１種または２種 以上の特異的結合剤、例えば、抗体とともにインキュベーションすることによっ て容易に製造することができる。

ある粒子は分析物と非生物学的機構で特異的に結合する。

１つのこのような実施態様において、グリコジル化ヘモグロビンは、バイオラド （ＢｉｏＲａｄ）、米国カリフォルニア州すッチモンドからのイオン交換樹脂に 結合し、そしてピアース・ケミカル・カンバー’−（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉ ｃａｌ　Ｃｏ、）　、米国イリノイ州ロックフォードからのもののようなホウ酸 をそれらの表面上に有する粒子に特異的に結合する。このような粒子は血液中の この分析物の百分率をカラムクロマトグラフィーによって決定するために使用さ れ、そしてこれらの粒子および関連する粒子は本発明の方法における結合性成分 の役目をするために適する。

結合性成分は、また、アッセイ容器を予備被覆することによって製造することが できる。最も安定な予備被覆アッセイ容器は、結合活性に寄与する分子を相互に および／またはアッセイ容器の表面に化学的に架橋することによって製造される であろう。このような被覆されたアッセイ容器（マウス、ウサギ、ヤギに対する 抗１ｇＧ）は、例えば、マイクロメデインク・システムス・インコーホレーテッ ド（ＭｉｃｒｏｍｅｄｉｃＳｙｓｔｅｍｓ、　Ｉｎｃ、）、（米国ペンジルベニ ア州ホージャム）から商業的に入手可能である。

あるいは、固相はアッセイ混合物のインキュベーションの間またはそれに引続い て、有用な結合剤に結合した可溶性サブユニットを重合または凝集させることに よって製造することができる。すべての反応成分が溶液中に存在するとき、反応 の平衡はより急速に達成されるので、このようなアプローチは予備形成した不溶 性結合性成分を使用する方法よりも短いインキュベーション時間を提供する。

イムノアッセイにおいて、結合性成分は典型的には、特異的結合剤、例えば、抗 体、抗原、プロティンＡ、またはビオチンを、固相に吸着されたあるいはそれに 化学的に結合した形態で含有するであろう。容量が高い固相はスタフィロコッカ ス・アウレウス（Ｓ、ａｕｒｅｕｓ）を抗体（非常に強く結合する、ことにウサ ギまたは霊長類のＩｇＧ）で予備被覆することによってつくることができる。使 用すべき特異的抗体がウサギまたは霊長類からのものでない場合、ウサギまたは 霊長類抗−免疫グロブリン抗体を予備吸着させて種特異的高い容量の結合性成分 をつくることができるＣＦｒｏｈｍａｎら、Ｊ、　Ｌａｂ。

Ｃｌ１ｎ、　Ｍｅｄ、、　９３６１４−６２１．１９７９およびＢｅｎｎｅｔお よびＯ’Ｋｅｅｆｅ。

Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅａｐ、、１９８０、ここに引用によって加える］。安 定を化学的に安定化して（例えば、グルタルアルデヒドまたはカーポジイミドで ）結合剤の分子を互いにおよび／または結合性成分の粒子表面に架橋結合するす ることができる。これらの変性された「生物学的」固相は、免疫グロブリン分子 からの干渉、例えば、血清試料中において高いレベルで起こる干渉を経験しない という利点を有する。

遠心の用途のために好ましい粒子の固相は、適当な密度および粒子サイズを有し て、標準的な実験室および臨床的遠心機内で急速回転沈降し、しかもアッセイ容 器への分配の間懸濁したままであるものである。また、使用されるべき標識の非 特異性結合が低くかつ高い再現性をもって製造できる結合容量の特性が好ましい 。スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ、ａｕｒｅｕｓ）の商用調製物［ベーゾ ング・ダイアグノスチクス（Ｂｅｈｒｉｎｇ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）　、カ リフォルニア州すンジエゴおよびイムレ・コーポレーション（Ｉｍｒｅ　Ｃｏｒ ｐ、）、ワシントン州シアトル］は、これらの望ましい性質を示す。化学的に安 定化された抗−免疫グロブリン被覆スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ、ａｕ ｒｅｕｓ）の懸濁液はベーゾング・ダイアグノスチクス（Ｂｅｈｒｉｎｇ　Ｄｉ ａｇｎｏｓｔｉｃｓ）から商業的に入手可能である。

遠心分離を用いる実施態様のための他の望ましい固相は、セファデックスＣｌ０ １Ｇ１５、およびＧ２５［ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）であり、これら は過塩素酸塩で酸化されて、蛋白質および他の分子上のアミノ基との化学的結合 に適するアルデヒドを形成することができる。大きい分子はこれらの粒子のマト リックスから排除されるため、はとんどの標識の非特異的結合は非常に低く、そ して適当な化学剤（例えば、塩よって、さらに、最小とすることができる。

Ｃ，アッセイ法 簡潔のため、本発明の特異的結合アッセイを抗原および抗体によって説明する。

しかしながら、当業者にとって明らかなように、任意の実質的に特異的な結合の 対を本発明において使用することができ、これれらは次のものを包含するが、こ れらに限定されない：すなわち相補的核酸配列の結合；レクチン類と炭水化物と の結合；ホルモンと受容体との結合；ビタミンと輸送蛋白質との結合：および免 疫グロブリンと非免疫グロブリンである抗体結合性蛋白質との結合等である。

本発明のアッセイは、この分野においてよく知られている種々の標識付は物質の いずれを使用することもできる。これらは次のものを包含するが、これらに限定 されないニラジオアイソトープ（例えば、３２−Ｐ、３−Ｈ１１２４−１，３５ −Ｓ、ｌ４−Ｃ）；酵素（例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、ウレアー ゼ、ベータガラクトシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、グルコースオキシダ ーゼ、エンテロペプチダーゼ）；蛍光団（例えば、フルオレセイ、ローダミン、 ダンシル、フィコビリタンパク質、ナイルブル−（Ｎｉｌｅ　ｂｌｕｅ）、テキ サスレッド（Ｔｅｘａｓ　ｒｅｄ）　、ウンベリフェロン）；発光体または発光 体源物質；遷移金属キレート；酵素基質、コファクター、または阻害剤；粒子（ 例えば、磁性、色素、高い屈折率）；および酵素。これらは一部分次の刊行物に よって例示されている：米国特許第４．１８１．６３６号；米国特許第４．４０ １．７６５号；米国特許第３．６４６．３４６号；米国特許第４．２０１．７６ ３号；米国特許第３，９９２．６３１号：米国特許第４．１６０，０１６号；米 国特許出願第４８６０１６号［欧州特許出願（Ｅ　Ｐ　）０１２３２６５Ａ１号 ］、これらのすべてを引用によってここに加える。

特異的結合アッセイを実施できる種々の機能的の立体的配置は、この分野におい てよく知られており、そして、例えば、Ｍａｇｇｉｏ　Ｃ’ｆＡ者）　＊　Ｅｎ ｚｙｍｅ　Ｉｍｍｕｎｏ　ａｓｓａｙ＋　ＣＲＣプレス、米国フロリダ州ポカレ イトン、１９８０　（ここに引用によって加える）に広く記載されている。本発 明の方法を用いるいくつかの実施例を下に記載する。これらの方法を使用して広 範な種類の分析物の存在および／または量を検出することができる。

代表的分析物は、欧州特許（Ｅ　Ｐ　’）　１２Ｂ、２６５号に列挙されている 。

簡単に述べると、競合イムノアッセイにおいては、抗原（分析物）を含有すると 疑われる試料および既知量の標識付けされた抗原（トレーサー）を限定された量 の分析物特異的抗体について競合させる。不均質競合イムノアッセイにおいては 、固相上に固定化されて結合性成分を構成する抗−免疫グロブリン抗体またはス タフィロコッカス（Ｓｔａ　ｈ　１ｏｃｏｃｃａｓ）プロティンＡを、同時にあ るいは引続く工程において添加する。特異的結合が起こる間のインキュベーショ ン後、結合性成分を１または２以上の層のクッションに通過させ、これにより結 合した標識を未結合標識から分離する。均質競合酵素標識アッセイにおいては、 アッセイ混合物をクッションに通過させて、第２Ｎ中の酵素基質発色光剤と混合 させる。

結合性成分（不均質アッセイにおいて）またはアッセイ混合物（均質アッセイに おいて）は重力のためにクッションを通過することができるか、あるいはアッセ イ容器を遠心力゛に暴露することができる。結合性成分が磁化可能であるか、あ るいは磁性である場合、アッセイ容器を磁場に暴露して結合性成分をクッション を通して動かすか、あるいは混合のために動かすことができる。次いで、結合し た標識の存在または量を標識に対する適当な手段により決定し、そして試料中最 初に存在する分析物の存在または量を、１系列の既知の標識との比較によって、 関係づける。例えば、ガンマカウンターまたはシンチレーションカラターはラジ オアイソトープの検出に通し、分光光度計は光を吸収する物質または溶液の検出 に適する。

反応混合物を構成するすべての試薬（結合性成分および標識を包含する）を予備 混合し、そして試料の添加によってアッセイを開始する。この場合において、反 応は典型的には実質的にまたは完全に平衡化させた後、結合性成分またはアッセ イ混合物を第１層に通過させる。このような実施態様においては、インキュベー ション期間の正確なタイミングは不必要である。あるいは、試料および標識を予 備混合し、そして試薬混合物に同時に添加し、そして固定した間隔の間インキュ ベーションして非平衡混合物を形成し、次いで結合性成分（不均質アッセイのた めに）または混合物全体を第１層に通過させることができる。

競合結合アッセイの別なものとして、不均質サンドインチアッセイを実施するこ とができる。サンドインチイムノアッセイのため、分析物を過剰で存在できる２ 種類の抗体とともにインキュベーションし、一方の抗体は固定化されているか、 あるいは固定化することができ（結合性成分である）、そして他方の抗体は標識 に接合されている。抗体は分析物上の２つの異なる非競合的決定因子（エピトー プ）に対して向けることができるか、あるいは分析物上に多数の反復する決定因 子が存在する場合、それらは同一の決定因子に向けることができる。

サンドインチイムノアッセイは、分析物および抗体を添加する順序に依存して、 同時的、先進的または逆方向的配置［米国特許第４，３７６．１１０号（ここに 引用によって加える）、に記載されているようなコで実施することができる。次 いで、分析物を介して固相に結合する標識付けされた抗体は、前述のように、ク ッションを通過させることによって未結合標識から分離し、そして結合した標識 の量をその標識にとって適当な手段により決定する。

あるサンドイッチアッセイは結合性成分の添加、引続く結合した標識および未結 合標識の分離、及びこれに続く標識（標識付けされた抗体）の添加を必要とする 。本発明において、結合性成分への標識の添加は第２層中で起こさせることがで きるであろう。これは、このようなアッセイ法における手動工程を排除し、便利 さを加え、そして誤差の機会を減少するという利点を有する。最も末端の第２層 へ移動に先立つ特異的第２層への結合性成分の選択的移動は、適当な順序に力を 加えること、および適当な密度をもつ第１層および第２層の選択によって達成す ることができる。例えば、低速および高速の遠心分離を利用して、結合性成分を まず中間の第２層に通し、次いでより末端の高密度の層に通過させることができ るであろう。あるいは、第１分離工程の間に維持した温度より高い溶融温度をも つ水不混和性第２Ｎを使用できるであろう。温度はこの固体の第２Ｎの融点より 高くしてアッセイを完結することができるであろう。

サンドインチイムノアッセイのための結合性成分は、非標識付は抗体を固相に、 例えば、カーポジイミド化学またはシッフの埋木の化学を介して、共有結合させ ることによって調製することができる。あるいは、抗体はプロティンＡ、抗−免 疫グロブリンを介して、あるいは「粘着性」固相、例えば、ポリスチレンの表面 への非特異的吸着を介して非共有結合的に固相へ取付けることができる。固相は 、前述のように、この分野において知られた種々の物質から選択することができ る。サンドイッチアッセイは、両者の抗体を過剰で存在させることができ、それ ゆえアッセイの感度は抗体の親和定数によって厳格に限定されないという利点を 提供する。

本発明の１つの面において、非競合的サンドインチ結合アッセイを使用して試料 中の抗体を選択することができ、こうしてそれは臨床的血清学において、および ハイブリドーマの培養物のスクリーニングにおいて有用である。例えば、抗−マ ウスＩｇＧまたは抗原を前述のように固相上に被覆することができる。ハイプリ ドーマのスクリーニングにおいて使用する標準的手順に比較して、操作の実質的 な減少が、本発明を用いて達成することができる。追加の利点は、抗体が固相に 結合する場合、１ナノモル以下の標識付けされた抗原への結合を検出することに よって高い親和性の抗体の迅速な選択が可能であるという利点である。

Ｄ、インキュベーションおよび分離のためのアッセイ容器クッション（第１層お よび任意の第２層）を収容する容器を、ここで「アッセイ容器」と呼ぶ。アッセ イ容器の異なる大きさおよび形状を使用する多数の幾何学的配置が本発明の範囲 内で可能である。第１Ａ図を参照すると、はとんどの用　途において、ここで第 １層１２からなるクッションがアッセイ容器１０内に収容され、このアッセイ容 器１０はその末端または底端１３で閉じられている。

アッセイ容器は、細長い室１６を構成する実質的に円筒形の本体１４を有する。

第１層１２は室内を略横方向に延びてその中にバリヤーを形成し、このバリヤー は室の体積の典型的にはほぼ１／３〜７／８、好ましくは、１５／２４〜３／４ を充たす。第１層の最適な体積は、一部分アッセイ容器の形状寸法、標識の性質 、検出法および、存在する場合装置、および存在する場合シールドによって決定 されるであろう。

第一層および第２層の両者を使用する場合、典型的には第２Ｎの体積は第１層の 体積に等しいか、あるいはそれより大きい。２Ｎより多い層を使用する場合、末 端の層が典型的には最大である。当業者にとって明らかなように、使用する第１ 層対第２Ｎの比は使用する特定の層の物質、使用する標識および結合性成分の性 質によって影響を受けるであろう。例えば、酵素を標識として使用しかつ酵素基 質が第２層への添加剤である場合、第１層対第２層の比を小さく　（典型的には １：１０程度に小さり）シて感度を最大にすることができる。

これと対照的に、標識が蛍光物質でありかつ第２層を利用して検出のための最適 な溶媒の環境をつくる場合、この比は太きく（５：１程度に大きく）することが できる。

適当なアッセイ容器は、試験管またはウェル、あるいは多ウェルプレート中のウ ェルの群を包含する。アッセイ容器は上部または基端１７において再密閉可能で あって、使用者および環境を試料またはアッセイ試薬中の生物災害または化学的 災害から保護できることが好ましい。また、貫通可能な隔膜１８をもつアッセイ 容器を提供することが好ましい。簡単な金属箔またはポリエチレンフィルムはこ の目的に十分であるが、弾性シール、例えば、ゴム（例えば、シリコーン、ネオ プレン、またはＥＰＤＭ）から作られた隔膜または熱溶融性成形可能なゴム様プ ラスチックから作られた隔膜が好ましい。

鈍い末端をもつ器具、例えば、鈍い針または使い捨てピペットの先端によって貫 通可能な再密閉可能な隔膜は、製作が容易であり使用が容易であり、しかも安全 であるため、さらにいっそう好ましい。薄い領域を有するように前成形され°Ｃ いるかあるいはスリットで完全又は部分的にあらかじめカットして、液状アッセ イ反応成分の添加の間通気できるように容器は製造のとき本質的に永久的に密閉 し、キャップの取扱いを排除し、しかもアッセイ反応成分および／または試料の 安全かつ便利な添加を可能とする。

ラジオアイソトープの応用のためには、アッセイ容器は、強度および溶媒抵抗性 をもつために、ポリエチレンまたは、より好ましくは、ポリプロピレンから構成 することができる。

アイソトープ以外の方法は、典型的には、最高の透明度を有するアッセイ容器か ら利益を得ることができ、このアッセイ容器はガラス、ポリスチレン、ポリカー ボネート、ニトロセルロース、および光学銘柄のポリプロピレン［ベクトン・デ ィクソン・ラブウェアー（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｓｏｎ　Ｌａｂｗａｒｅ）、 米国カリフォルニア州オクスフォード］から作ることができる。本発明の驚くべ き特徴は、アイソトープ以外のアッセイに望ましい透明プラスチック、例えば、 ポリスチレンから構成された試験管は、このようなプラスチックが有機溶媒およ び炭化水素油により損・傷しやすいこととが知られているにもかかわらずいくつ かの第１層物質とともに使用することができることである。ゴム治よび他の隔膜 材料はプラスチックまたはガラス管に容易に接着することができる。１つの実施 態様においては、予備カットしたスリットを含有する弾性隔膜を有する緊密な嵌 合性・の成形されたキャップを使用する。他の実施態様においては１、予備カッ トしたスリットをもつゴムのディスクを、ポリマー工業においてよく知られた方 法により、管の上部に永久的、に締結する。例えば、シリコーン接着剤は、ガラ スおよびプラスチックを含金する多くの種類の管にシリコーンゴムを効果的に結 合するであろう。適当な化学的プライマー塗布を用いると、ポリプロピレン管を 種々のゴム、例えば、ＥＰＤＭポリマーのブレンドに接着することができる。シ アノアクリート接着剤七よ、プライマーを塗布しなくてさえ、ＥＰＤＭゴムをオ リプロピレンに結合するであろう。

アイソトープアッセイに殊に適する１つの好ましい実施態様において、アッセイ 容器はポリプロピレンにより構成された、例えば、サルステッド（Ｓａｒｓ　ｔ ｅｄ　ｔ）　にュージャージイ州プリン七トン）、ウェスト・コースト・サイア ンティフィック（Ｗｅｓｔ　Ｃｏａｓｔ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（カリフォル ニア州エメリビレ）から、そして多数の他の製造会社および販売会社から商業的 に入手可能な、０．４ｍｌのマイクロ遠心管（適当な寸法５×４５ｍ璽）である 。

第１Ａ図に示されているように、アッセイ容器の使用の間、特異的結合性成分２ ６を含むアッセイ混合物２４を第１Ｎ１２と接触させて配置する。アッセイ混合 物の非結合性成分からの結合性成分の分離と実質的に同時に、結合性成分は第１ 層の入りかつ典型的には末端１３へ入り続けるであろう。

ここで第１Ｂ図を参照すると、アッセイ容器１０の別の大きい（２ｍｌ）実施態 様が示されている。他の同様な実施態様は外部の寸法が、例えば、８×５５．１ ０Ｘ５５．１０×７５．１２Ｘ５５、および１２×７５ｍｍの、試験管を使用す る。

この実施態様の範囲内で、アッセイ容器によって構成される室１６は１または２ 以上の前形成されたビーズを受容するために十分な大きさをもち、これらのビー ズは第１層１２の上ビーズに結合させて結合性成分２６を形成する。第１Ｂ図に 示すように、クッションは第１層１２および第２層２８からなる。第１層１２は アッセイ混合物２４と接触する唯一の層であろう。第１層のインキュベーション および液体の形態への第１層の転化後、結合した標識をもつ結合性成分は第１層 を通過し、第２Ｎに入り、そしてアッセイ容器の末端１２へ沈降する。第１Ａ図 に示すキャンプ２０の代替物として、このアッセイ容器は適当なキャンプ（図示 せず）とかみ合うことのできるねじ込み部分３０を有することができる。

液体の第１層を使用し、そして典型的には第２Ｎを欠く、第１Ｂ図に示すものに 関係する実施態様において、結合性成分２６を最初にアッセイ容器の末端に位置 させ、次いでアッセイ混合物の他の成分とともにインキュベーションする。最後 に、第１Ｎの物質をアッセイ容器中に注ぐか、あるいは他の方法でその中に分配 し、アッセイ容器の底に洗浄された結合性成分および結合した標識を残し、アッ セイ混合物の他の成分（遊離の標識を含む）は第１Ｎの上部に移す。この実施態 様はまた、アッセイ容器の末端の内部表面が被覆されて結合性成分を形成してい る場合に有効である。

ここで第２図を参照すると、第１Ｂ図に類似し多ウェルプレート内にウェル３２ を使用する他の好ましい実施態様が示されている。ある用途のために好ましい他 の実施態様は、標準的９６ウエルのプレートの列の中に嵌合する１または１．４ は貫通可能な隔膜で密閉することができ、典型的にはアイソトープ以外の標識を 使用し、そして遠心力、重力、または磁力による達成される分離のために適する 。ウェル３２は、一般に、開いた空間３６を構成する本体３４からなる。ウェル は１または２以上のビーズ、およびあらかじめ分配された第１層、およびある場 合１または２以上のあらかじめ分配された第２層を受容するために十分な大きさ を有する。第２図に示す実施態様において、ビーズを第１Ｎ１２の上表面上に最 初に位置させる。ビーズはそれに結合された特異的結合剤を有し、こうして結合 性成分２６を形成する。第１Ｎより下に第２層２８が位置する。第１層のインキ ュベーションおよび液体の形態への転化後、結合した標識をもつ結合性成分は第 １層を通過し、第２層へ入り、そしてウェルの底へ沈降する。

第１層からウェルの底までの距離が短いため、この実施態様は磁力を用いる分離 のためにことに適する。

シグナルの発生は遊離した標識を含有する第２成分から分離した層中でのみ起こ るので、第２図に示す実施態様においてシールドは不必要である。好ましい実施 Ｂ様は酵素標識、第１Ｎ、および第２Ｎを利用し、第１Ｎはインキュベーション の間固体の形態でありそして分離の間に液体の形態に転化され、そして第２層は 標識の存在下に検出可能なシグナルを生成する酵素基質を含む。

標識が蛍光であり、そして検出器がウェルの底を通して「見」る他の好ましい実 施態様において、クッションの底領域中の側面の励起を使用して遊離標識の励起 を防止することができる。あるいは、このような場合において、クエンチング剤 （ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ　ａｇｅｎｔ）　（例えば、蛍光が標識である場合、ロー ダミンのような共鳴エネルギー伝達受容体）を結合アッセイに添加することがで きる。蛍光クエンチング化合物の使用は均質結合アッセイについて記載されてい る［ｔｌｌｌｍａｎおよびＳｃｈｗａｒｚｂｅｒｇ　ｓ米国特許第３．９９６． ３４５号、ここに引用によって加える］。クッションにより結合性成分から除去 されるであろうから、このようなりエンチャーは未結合標識の蛍光をクエンチン グするが、結合した標識のそれをクエンチングせず、不均質結合アッセイにおい て有用であろう。粒状固相の水性区画がクッション中の通過によって除去されな いある場合において、アッセイ混合物中にこのようなりエンチャーを含めること は非特異的シグナルを減少するためにとくに有用であろう。

Ｅ、シールド 標識により放射または生成されるシグナルの性質およびクッションの高さに依存 して、結合性成分から放射されるシグナルのみが検出されるように、第２成分（ 遊離標識を含む）を含有する容器の部分を物理的にシールドすることが望ましい こと、あるいは望まいくないことがある。第３図を参照すると、アッセイ容器が 内部に配置されている再使用可能な検出容器が示されている。検出容器３８は、 一般に、内部の室４２を構成する本体４０からなる。例えば、標識がガンマ放射 性アイソトープである場合、検出容器３８の上部（およびある場合最末端）は、 金属または金属化シールド４４を有することができ、このシールド４４は好まし くは鉛または鉛添加プラスチック、または銅から構成される。標識が蛍光団また は発光体である場合、検出容器の上部は光不透過性材料から構成されたシールド を有することができる。明らかなように、ある用途において、異なるアッセイ容 器および異なるシールドが好ましいであろう。

シールドが望ましい場合、シールド４４′は検出容器の本体と一体的であること ができるか、あるいは検出容器の本体によって閉じられた別のシールドであるこ とができ、その中にアッセイ容器ｌＯが滑動可能に嵌合する。後者の配置は、一 般に、その耐久性およびシールドのためのよりすぐれた形状寸法のために好まし い。最良のシールドの性能のために、シールドの穴は典型的には円筒形でありか つアッセイ容器の便利な挿入および取出しのために要求される最小の大きさをも つ。

第３図を参照すると、アッセイ容器１０は放射線遮断材°料から構成されたシー ルド中に滑動可能に嵌合する。シールドは両端が開いており、そしてシールド中 にアッセイ容器を容易にすべりこませることができるために十分に大きい内径を 有する。１つのとくに便利な配置は、アッセイ容器が試験管であり、そしてこの 試験管がシールドの上部とかみ合いかつそれをシールド内に支持するリップを有 するものである。はぼ０．４ｍｌの体積を有するマイクロ遠心管は、多数の入手 源から商業的に入手可能であり、そしてほぼ１／８インチの内径のシールドに容 易に滑動可能に出入させることができるであろう。同様な外径を有するが、０． ４ｍｌの管より長い管は、ある用途において有利であろう。

この実施態様において、アッセイ容器は直径が小さいので、シールドも小さい直 径であることができ、それゆえ、上澄みまたはクッションから検出される散乱し た放射は比較的少ない。したがって、結合したラジオアイソトープ標識の検出は 、先行技術の装置および方法と異なり、未結合標識の不注意の同時的検出によっ て木質的に妨害されない。

シールドの組成は標識により放射されまたは生成するシグナルの性質に依存して 変化するであろうが、その設計および材料は、アッセイ混合物の結合した（固体 ）の成分および結合しない（上澄み）の成分の分離後、結合しない分画中の標識 の少なくとも９０％、より典型的には９９％より大きい、最適には９９．７５％ より大きい検出を遮断するために十分なものである。

例えば、標識がガンマ放射性アイソトープ、例えば、１２５−ヨウ素である場合 、シールドは鉛、鉛添加プラスチック、銅、または他の適当な材料から構成でき るであろう。検出のため、環状結晶をもつガンマカウンターからなる器具［マイ クロメゾインク・システムス（Ｍｉｃｒｏｄｅｍｉｃ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ペン シルバニア州ホージャム、ＬＫＢインスツルメンツ（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ） 、マリイランド州ガイサーバーグ、およびベックマン・インスツルメンツ（Ｂｅ ｃｋｍａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）　、カリフォルニア州プレア、Ｋ　さ１ ／８インチのスリーブ（外径３／８インチ、内径１／４インチ）］は、強度（製 作の操作および使用時の少なくとも３０００Ｘｇまでの遠心に耐える）および放 射線の遮断のきわめて優れた組み合わせを提供する。しかしながら、Ｍａｃｋｅ ｎｚｉｅ、　［Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　％　６７：２０１− ２０３．１９８４、（ここに引用によって加える）］は、鉛の非常に薄い（Ｉｔ ｓ）シートは１２５−ヨウ素の線量の９９．９９９９６４％を遮断することを計 算した。こうして、’９９．０％の遮断を達成するためには、１インチの厚さの わずかに３６００万分の１の鉛箔を理論的に必要とするだけである。

高い一体性の鉛箔（０，００６インチおよび０．０１２インチの厚さ）は商業的 に入手可能であり［ニュークリアー・アソシエーツ（Ｎｕｃｌｅａｒ　Ａｓ５ｏ ｃｉａｔｅｓ）、ニューヨーク州カールプレイスコそして１Ｘ８インチの厚さの スリーブより非常に小さい重量で本質的に完全な放射線シールドを提供する。１ Ｘ８インチの厚さのスリーブが望まいくないほどに重い用途において、鉛箔を使 用してシールドを形成できる。成形した鉛または鉛箔から製造した鉛被覆または 鉛含有複合プラスチックまたは布はくは、また、効果的な軽量シールド材料であ る。このような箔および薄いフィルムのために、強度はプラスチック支持スリー ブによって提供される。鉛基外の金属、例えば、黄銅を包含する他の材料を１２ ５−ヨウ素によって放射されるものを包含する放射線のだめのシールドとして使 用できる。

標識がベータ放射性アイソトープ、例えば、チタンまたは３２−リンである場合 、シールドは不透明プラスチックから構成することができる。標識が蛍光団また は発光体である場合、シールドは黒色プラスチックであることができる。、しか しながら、はとんどの用途において、標識、例えば、蛍光団および低エネルギー のベータ放射性ラジオアイソトープはシールドを必要としないであろう。

必要な場合、シールドはアッセイ容器の上のほぼ７５％およびアッセイ容器の上 のほぼ９０％よりな（マスクするように設計される。一般の目的のシールドは、 典型的には、シールドされない部分４６における検出可能な標識を有意に減少し ないで、できるだけ長いであろう。環状の結晶を有するガンマカウンターおよび アッセイ容器、例えば、第１Ａ図に示すものについて、外径３／８インチ、内径 １／８インチ、長さぼぼ１３Ｘ８インチの鉛のスリーブが好ましい。このような アッセイ容器は、典型的には、はぼ２５０μｌのクッション液体および１０μｍ 以下の結合性成分を含有する。しかしながら、ある検出器具および異なるクッシ ョン高さについて、シールドの長さおよびクッションの体積および／または結合 性成分の体積の変更が望ましいであろう。

検出器がアッセイ管の底付近の′中央に位置する場合、下のシールドは望ましく ない放射を遮断するであろうから、アッセイ混合物の一部または全部を横方向に シールドすることは不必要であることがある。この形態のシールドは効果的には スカートであり、そしてシールドが働いておりかつアッセイ容器がその最終位置 に存在する間でさえ、アッセイ混合物を直接観察できる（例えば、クッションの 上部への試薬の添加の間に）という追加の利点を有する。

アッセイ容器をそれ自体内に収容することに加えて、−シールドは、第３図に示 すように、検出容器の本体の内側に嵌合すべきである。検出容器を底で閉じ、そ して同様によく上部で密閉することができ、あるいは密閉しないことができる。

典型的には、検出容器の本体は試験管であり、その内径はシールドの外径より十 分に大きくして、半永久的アセンブリーの目的でその中に緊密にすべり込ませる ことができるようにする。第３図に示すように、シールドはシム４８を有するこ とができ、シム４８は、好ましくは、接着性紙ラベル、ニカワ、または適当な弾 性材料から構成して、検出容器内のシールドの位置を維持する。

ポリプロピレン、ポリエチレン、またはガラスから構成され、典型的にはほぼ１ ２Ｘ７５または１２Ｘ５５ｉｎの外側寸法を有する試験管が、検出容器の本体と して使用するために適当である。このような管は種々の製造元から商業的に入手 可能であり、そしてガンマカウンターおよび／またはシンチレーションカラタン −の中に容易の嵌合するということにおいて有利である。０．４ｍｌのアッセイ 容器が検出容器の内壁上に結合する拘束キャップを有する場合、簡単な工具［例 えば、スタンレイ・ツール・カンパニー（Ｓｔａｎｌｅｙ　Ｔｏｏｌ　Ｃｏｍｐ ａｎｙ）からの６１−００８型］を使用してアッセイ容器の挿入および取出しを 行なうことができる。あるいは、短い（１２Ｘ５５ｃｍ）検出容器をこのような アッセイ容器と一緒に使用できる。なぜなら、拘束キャンプを有するアッセイ容 器は工具を使用しないで容易に挿入しかつ取出すことができるからである。

−ｉに、プラスチック管（ことにポリプロピレン）は、破壊の危険がな（かつ典 型的にはより大きい遠心力に耐えることができるので、検出容器の本体として使 用するためにガラス管より好ましい。一般に、また、検出容器は再使用可能であ ることが好ましい。

前述の外径３／８インチの鉛の円筒を使用して作ったシールド内でアッセイ容器 を直接遠心する好ましい実施態様においては、検出容器は円筒部材５０によって 支持されたシールドを内部に収容するであろう。このような円筒部材５０は好ま しくはプラスチック、例えば、ポリスチレンから構成され、そしてアッセイ容器 を一定高さに支持するために、シールドから末端のレベルにおいて閉じることが できる。

はとんどの商業的に入手可能なガンマカウンターは前述の直径３７８インチの鉛 円筒を使用してすぐれたシールドを示すが、ウェル型結晶を有するあるもの（こ とに４より多い結晶を有する多くのガンマカウンター）はシールドの設計の変更 を必要とする。前述のように１端が閉じた支持体円筒は、適当なシールド材料、 例えば、鉛から作られたシールドディスク５２を含有できる。このディスクは部 材５０によって形成されたウェルの底に位置して、アッセイ容器の長軸を略平行 に移動する非結合標識の放射線からのガンマカウンターを遮断する。この設計の 驚くべき利点は、すべてのガンマカウンターを使用して改良されたシールドが得 られると同時に、アッセイ容器の末端に位置する結合した標識の検出可能性をほ んのわずかに減少させるだけであるということである。

前述の方法で構成すると、すなわち、ここの記載するようにクッションを予備充 填しかつ検出容器の本体内のシールド中に滑動可能に嵌合した内側アッセイ容器 では、シールドが円筒部材によって支持される場合、１つの液体添加（試料）工 程および結合した標識の検出前の１つの短時間の遠心工程の少ない工程で、特異 的結合アッセイを自己収容マイクロ管内で急速にかつ便利に実施することができ る。ある場合において、遠心工程は排除することができる。例えば、１つのこの ような場合は、高密度の粒子および溶融可能な第１層を使用して重力の分離を用 いる場合である。これらの結合アッセイ法は、このようなアッセイを実施する大 抵の実験室において現在入手可能な装置を使用できる。これらのアッセイは、現 在実施されている特異的結合アッセイ法と比較して、時間、熟練した労力、およ びラジオアイソトープの廃棄物の体積をかなり減少させて達成することができる 。匹敵する利点はアイソトープおよびアイソトート以外の両者の用途について経 験されるであろう。

Ｆ、クッションおよびシールドの組み合わせた使用驚くべきかつ価値ある特徴は 、水不混和性第１層および放射線シールドの組み合わせた使用において本質的で ある。抗体被覆管または大きい抗体被覆ビーズを使用する最も便利な現在入手可 能なアイソトープアンセイでさえ、熟練者により、あるいは複雑な液体取扱い装 置により、インキュベーションの前および後に処理しなくてはならない。このよ うな処理は、遊離の標識を除去するために、インキュベーション後の洗浄溶液の 添加、吸引またはデカンテーション、および通常これらの工程の反復を含む。こ れらの工程は不便であるばかりでなく、かつまた試料における生物災害およびラ ジオアイソトープアッセイの成分からの放射能の両者からのこぼれおよび汚染の 危険をもたらす。

注意して制御しないと、この洗浄はいくつかの理由で不利である。第１に、アッ セイの精度は洗浄工程の間に起こり、シグナルを潜在的に減少させる抗体−抗原 複合体の解離に悩まされることがある。これは、抗体および抗原の間の単一の結 合が形成されるモノエピトープアッセイ　（例えば、小さい抗原を使用する、あ るいはモノクローナル抗体を使用する多くのアッセイにおいて）においてはこと に有意である。　さらに、従来の不均質結合アッセイにおける洗浄液体の体積は アッセイ混合物の体積よりかなり大きくなくてはならず、そして洗浄体積が大き くなるほど、洗浄手順はより有効である。

この洗浄溶液を、典型的には吸着バンド上へのデカンテーションによって、除去 するとき、初期の混合物の体積に比較して放射性廃棄物の体積の有意な増加が生 ずる。

本発明の価値がありかつ驚くべき特徴は、前述の洗浄溶液を排除でき、そして試 薬をアッセイ容器内に完全に収容して保持できるということである。この特徴は 、従来の方法に比較して安全性を改良する。なぜなら、潜在的に危険な材料（例 えば、放射能および／または感染物質）が安全で便利な廃棄のために完全に収容 されているからである。アッセイ混合物の挿入に引続いて、特別の技能および注 意の必要性が排除される。他の驚くべき特徴は、水不混和性層を混合物の体積に 関して小さくすることができ、そして伝統的な不均質アッセイにおいて使用され た典型的な洗浄体積よりも非常に小さくすることができることである。結合性成 分がクッションを通過するとき、結合性成分は新しい媒質に連続的に直面し、こ うして小さい体積で効果的に洗浄される。

上記の配置は、また、先行技術よりの有意の改良を表わす。

なぜなら、アッセイと結合性成分との間の不混和性相の導入は、未結合標識の分 画からの結合した標識の分離の精度および完全さを劇的増加するからである。前 述のシールド特徴と組み合わされたこの不混和性相は、自己収容結合アッセイ、 例えば、ラジオイムノアッセイを効果的に実施できるようにさせる。このような アッセイにおける結合した標識および未結合標識の分離は事実上瞬間的であり、 かつ結合対のための相互作用の緊密性を特徴ずける場合の用途のための平衡結合 アッセイのデータを生成できる。

アッセイ容器およびシールドの形状寸法は、両者とも細長くかつ直径が比較的小 さく、測定する合計のシグナルへの散乱した放射の寄与を事実上排除し、それゆ えデータの数学的補正は実際に不必要である。アッセイ混合物およびその成分は 第１層中で不混和性であるので、混合物のインキュベーションの間希釈または解 離は起こらず、そしてシュークロースおよび関連する物質をバリヤーとして使用 する先行技術において観察されるような結合対の解離は起こらない。こうして混 合およびインキュベーションの工程を含むアッセイ全体を第１層と接触させて、 実施することができ、インキュベーションした混合物のクッション上への移送の 必要性が排除され、あるいは先行技術におけるような、インキュベーションした 混合物より下へのシュークロースのような物質の洗浄溶液の注入の必要性が排除 される。

本発明の他の特徴は、アッセイ容器または大きい高密度のビーズへ結合された結 合性成分の使用で明らかである。密度が第２成分より高いが、大きいビーズ（使 用する場合）より小さい水不混和性クッションを、必要に応じて、アッセイの終 りに添加し、未結合標識および他のアッセイ混合物の成分をアッセイ容器から除 去することを必要としないで、遊離した標識から結合した標識を分離することが できる。

水不混和性液体上でのアッセイ混合物のインキュベーションを用いる結合アッセ イの他の寄与は、混合物の体積の劇的な減少である。可視のベレットの操作は不 必要であり、そしてアッセイ混合物の成分は第１層の上部上にあらかじめ分配す ることができる。このようなあらかじめ分配されるアッセイ混合物の成分は液体 として貯蔵するか、あるいは濃縮および／または凍結乾燥により安定化し、次い で再水和または少量の（例えば１０μｍ）の試料の添加により使用のため希釈す ることができる。

こうして、アッセイを小型化し、廃棄物を劇的に減少し、そして安全性を有意に 増加すると同時に特異的結合アッセイの実施における労働を節約しかつ誤差の生 成を減少することができる。

Ｇ、シールドしないクッションの実施態様ことに酵素または蛍光標識を多ウェル プレートにおいて使用する、シールドしない用途のため、不混和性第１層および 水性第２Ｎの使用は、完全に水性のクッションを使用して有効であるためには小 さ過ぎる距離にわたって、遊離水性標識からの結合性成分の有効な分離（重力、 遠心力、または磁力による）を可能とする。このような応用において、冷却によ り容易に固化するか、あるいは０〜５０℃の範囲内の貯蔵および／またはインキ ュベーションの温度で固化しており、そしてこの温度範囲における分離工程のた め液化（典型的には溶融）することができる第１Ｎはことに有用である。第１Ｎ を加温により液化するとき、第１Ｎを通して沈む、非常に高密度の結合性成分の 固相粒子（例えば、ガラスまたは金属の球）を使用することができる。明らかな ように、本発明を使用する方法は比色および蛍光測定の臨床的アッセイのために 設計された現存する自動化臨床分析器と適合する。

次の実施例は例示のために提供され、本発明を限定するものではない。

遺Ｊ１匹 実施例において使用する略号は、次のものを包含する二ＰＢＳ　（リン酸塩緩衝 化塩溶液”）　、ＢＳＡ　（ウシ血清アルブミン）　、ＴＧＦ−α（形質転換増 殖因子アルファ’）　、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）　、ＤＴＴ　（ジチオ スレイトール）、およびＣＰＭ　（計数７分）。

実考貧ＩＬ ノ　−　土　アルフ　についてのハ刑ヒ　入−ジオイムノアソセイ すべてのアッセイは、アッセイ容器として、０．２５〜０．３ｍｌのクッション 物質を収容する０、４ｍｌのマイクロ遠心管を使用した。標識付けしたペプチド をクラアミンＴヨード化によって製造した（２００〜５００μＣｉ／μｇの比活 性の範囲）。特記しないかぎり、すべての固相はスタフィロコフカス・アウレウ ス（Ｓ、ａｕｒｅｕｓ）の懸濁液を使用して調製した。遠心はほぼ１０．０ＯＯ Ｘ　ｇにおいてマイクロ遠心機内で３０〜６０秒間であった。

ウサギの免疫感作に使用した合成ペプチドは、ラフ）　ｒＴＧＦ−αのＣ−末端 １７アミノ酸の蛋白質とグルタルアルデヒド参照標準としておよび標識（１２５ −ヨウ素標識付けした）として使用した。抗血清または正常ウサギ血清（非特異 的結合の決定のため）をホルマリン固定スタフィロコッカス・アウＬ／ウス（Ｓ 、ａｕｒｅｕｓ）の商用調製物［イムレ・コーポレーション（ｆｉｒｅ　Ｃｏｒ ｐ、）、ワシントン州シアトル］上に吸着させて、ＰＢＳ中固形分５％の抗体固 相懸濁液を形成した。１００μ１（２５０，ＯＯＯＣＰＭ）　（７）標識付けし たペプチド、１００μｌの１０％（０，６５モル）のジチオスレイトール、３０ μｌの１０■／ｍｌのＢＳＡ、５μｌの１０％のアジ化ナトリウム、５０μｍの １０ＸＰＢＳおよび２１５μｍの蒸留水を、５００μｍ０合計体積で、混合する ことによって、標識カクテルを調製した。

各アッセイ容器中に、３０μｍの標識カクテル、４０μｌの試料、および３０μ ｍの抗体懸濁液を負荷した。アッセイ混合物を混合し、そして４°Ｃで一夜イン キユベーションした後、アッセイ容器を遠心し、次いで放射線シールド（第３図 ）内に配置し、そしてガンマバイアル（Ｇａｍｍａｖｉａｌ）を使用するベック マンＬＳ−１００シンチレーションカウンターで計数した［コーホ−ライト・リ ミテッド（Ｋｏｃｈ−Ｌｉｇｈｔ　Ｌｔｄ、）　、英国サフォーク；計数効率は 約４０％であった］。

合成ペプチドの検量装置を使用して得られたデータを下に示す。生物活性合成ラ ットおよびヒトＴＧＦ−アルファは、はぼ０．６ｎＭのペプチドで５０％の競合 で、モル基準でペプチド断片に等しい競合曲線を与えた。

ＴＧＦ−αＲＩＡ：ぺブチド試薬、フタル酸フ゛チルのクッション試　料”　抗 　体　結合した標識 緩衝液　抗−ペプチド断片　４３％ ０．５ｎＭ　３０ １、ＯｎＭ　’　２４ ２．０ｎＭ　１６ １０ｎＭ　７ 緩衝液　正常ウサギ血清　３ 緩衝液　抗体不含懸濁液　０．１ ”アッセイにおける最終濃度 （Ｂ）トレーサーおよび参昭−，ｔとしてｍ−−血一およた　メチルおよびアッ セイ　応　八を　するＲＩＡ トランス−桂皮酸メチル（表１、項目１１、アルドリフヒ・ケミカル・カンパニ ー、ミゾリー州セントルイス）を、アッセイ容器中への分配の直前にマイクロ波 の炉内で短時間加熱することによって溶融した。クッションは室温で自発的に固 化した。固相を上の（Ａ）におけるようにして二倍濃度のアッセイ緩衝液（４％ のＮＰ−４０非イオン性洗浄剤を含む）中で調製した。この懸濁液は４℃で少な くとも１年間安定であった。０．２ｍｌのＩＯＸアッセイ緩衝液（非イオン性洗 浄剤を含まず）、０．６ｍｌの１０％のＮＰ−４０，０，５８ｍ１の蒸留水、お よび３０μｌの標識濃厚物（６００，ＯＯＯＣＰＭ）　（、生物活性合成ラット ＴＧＦ−アルファから調製した）（残基１−５０）を使用して、標識カクテル（ １，５ｍｌ）を調製した。

各アッセイ容器中に５０μｍの参照標準試料（生物活性、合成ラットＴＧＦ−α 、残基１−５０）、２５μｌの標識カクテルを負荷し、次いで２５μｌの固相懸 濁液を負荷した。示されるように、すべてのアッセイ反応成分はあらかじめ分配 し、そして試料の添加および混合によるアッセイの開始の前に、４℃で少な（と も３日間平衡化した。示された期間後、アッセイ容器を遠心し、そしてガンマカ ウンター（アポフト２００型）中で放射線シールド（第３図、ディスク５２を欠 く）を使用して計数した。

２種類の温度および混合の処理を４種類のインキュベージジン時間と組合わせた 。１つの処理はクッションの溶融温度直前の３２℃におけるインキュベーション 、および１５分の間隔の混合から成っていた。第２の処理はクッションの溶融温 度より上の４０℃におけるインキュベーション、およびインキュベーションの開 始時のみの混合（加温前）から成っていた。両者のアッセイは低い非特異的結合 、高い特異的結合、および高い参照標準との競合を、わずかに３０分のインキュ ベーション後でさえ、生じた。詳細な結果を下に示す：ＴＧＲ−αＲＩＡ　：生 物活性ペプチド＋桂皮酸メチルクッションインキユバ−９３フ インキュベーション＝１２０分間、温度＝３７℃、全ＣＰＭ　＝　７８’１２反 応成分　結合した標識　ｃ．ｖ．”　結合した最大％＊変動の係数（標準偏差／ 平均） （Ｃ）ヒト　パー゛Ｓおよびｍ一つサギ■　Ｇ　・　古　を−るＴＧＦ−αＲＩ Ａ このアッセイは上の（Ａ）に記載するフタル酸グチルのクッションを使用して実 施したが、ただし抗体被覆固相は固定したスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ ．ａｕｒｅｕｓ）　［パンソルビン（ＰｎｓｏｒｂｉｎＯ　）　、ベージング・ ダイアグノスチクス、カリフォルニア州うジョラコまたはグルタルアルデヒド架 橋抗ーウサギＩｇＧ被覆スクフィロコツカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ） 　［タチソルブ（ＴａｃｈｉｓｏｒｂＯ　）　、ベージング・ダイアグノスチク スコを使用して調製した。各場合における固体の濃度は、アッセイ混合物の体積 １００μｍにつき１２．５μｌの１０％ｗ／ｖ懸濁液に等しかった。すべての管 は二重反復実験として調製し、そして３７℃で２時間インキュベーションした。

５０μｍの希釈された正常ヒト血清試料を、あらかじめ分配したクッションを含 有する各管に添加し、次いで直ちに２５μｌの標識ペプチドおよび２５μｍの抗 体固相懸濁液を添加して反応を開始した。

結果が示すように、最高の濃度のヒト血清さえタチソルブアソセイに有意な効果 を有さないが、パンソルビンでは最高の希釈したヒト血清試料でさえ４１％の有 意の非特異的競合を生じ、これは多分固相上のプロティンＡへ結合したウサギ抗 体の置換のためであろう。タチソルプでは、非特異的結合はより低く、特異的結 合はより高く、そして１．　２５ｎＭの標準との競合はパンソルビンよりも大き かった。詳細な結果を下表３に示す。

芽−」し−表 パンソルビンとタチソルブの比較 象 喜 イ ！ イ 添加された合計ＣＰＭ　＝　８０８０ （Ｄ）６全な生　２　人　ホルモンをＵする　汗を工４　ＲＩＡｈＴＧＦ−α（ １−５０）の合成および免疫感作：ＤｅＲｙｎｃｋら、［Ｃｅ１ｌ、　３８：２ ８７−２９７．１９８５　］により決定されたヒトＴＧＦ−αの配列を使用して 、自動化器具（バイオサーチ）により低分子量の形態のホルモン（残基１−５０ ）を合成した。得られるペプチドを使用して、０．５ｍｇのペプチドを多重部位 において反復的に使用してウサギを免疫感作した。

イムノア・・セイの　川： このアッセイは、参照標準、および精製した生物活性合成ラフトＴＧＦ−αから 調製した放射性ヨード化トレーサーを使用した［ベニスラ・ラボラオトリーズ（ Ｐｎｉｓｕｌａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ＋カリフォルニア州ベルモント］。

３００μｍの１０×緩衝液［０，５モルのヘペス（Ｈｅｐｅｓ）、２０ｍｇ／ｍ ｌのＢＳＡ、０．２％のアジ化ナトリウムコ、６００μｌの１０％のノニデッド （Ｎｏｎｉｄｅｔ）　Ｐ　−４０（シェル・オイル・カンパニー’）　、５８０ て、標識カクテルを調製した。抗体懸濁液を本質的に上の（Ａ）に記載するよう にして調製した。０．２５〜０．３ｍｌのフタル酸ブチルのクッションを収容す る各０．４ｍｌの管に、２５μｌの標識カクテル、５０μｌの試料、および２５ μｌの抗体懸濁液を添加した。示される場合、１０μｍの１モルのＤＴＴ（０， ５モルの重炭酸ナトリウム中に新しく溶解した）を各アッセイ混合物に添加した 。混合後、管を４℃で一夜インキユベーションし、次いで（Ａ）に記載するよう にして処理したが、ただし検出器具はガンマカウンター（アボット２００型）で あった。

このアッセイはラットおよびヒト合成ＴＧＦ−α（残基１−５０）を等しく、ペ プチドがＤＴＴによる還元により巻戻されたか否かについて検出した。さらに、 このアッセイはＡ３７５細胞でコンディショニングした細胞培地からの真正生物 学的ヒトＴＧＦ−αを検出した（マルクアートら、ＰＮＡＳ８０　：　４６８４ −４６８８．１９Ｂ’３）。詳細な結果を下に示す：、・′士人について−　さ れた、ム　ＴＧＦαからのｒ人を　いる、最　の七人に、″る％水生物学的ＴＧ Ｆ−α、培養液（Ａ　３７５細胞）から部分的に精製 実施１ｍ ２２、−゛ウサギ　庁グロブ１ンおよびクージョンをる、゛　Ｓ　のウサギ■　 Ｇを　且工玉太泣■、戸に　、を　六する０、４ｍｌの　にお番る１、１　°　 ・　心ｒＡ社人アフセイ （Ａ）跋１工　標識抗体は、１ｍｇ／＋ｎｌのウシ血清アルブミンを含有するリ ン酸塩緩衝化塩溶液中に１：３０００で希釈した、セイヨウワサビペルオキシダ ーゼに結合したアフィニティー親和精製されたウサギ抗−ヤギ免疫グロブリン［ ザイムド（Ｚｙｍｅｄ）　］であった。同相は、熱で殺したホルマリン固定スタ フィロコッカス・アウレウス（Ｓ、ａｕｒｅｕｓ）の１０％懸濁液（イムレ・コ ーポレーション、ワシントン州ジアドルア）であった。

２２ｇのソルビトールを５０ｍ１の蒸留水中に溶解し、次いで１００　ｍｇの発 色性基質（ＯＰＤ、ザイムド、カリフォルニア州すンフランシスコ）を１＋＋１ の水中に溶解し、そして０．１ｍｌのＯＰＤ原溶液および０．１ｍｌの３％の過 酸化水素を９．８ｍｌのソルビトールに添加することによって、ソレビトール基 質クッション溶液を調製した。

（Ｂ）ヱヱ立工二　次いでアッセイ容器（０，４ｍｌのポリエチレンのマイクロ 遠心管、ウェスト・コースト・サイエンＴティフィク、カリフォルニア州エメリ ビレ）に０．１ｍｌのソルビトール基質溶液を負荷゛し、次いで０．２ｍｌのフ タル酸ジブチルを上に重ねた。他の組のアッセイ容器に０．３ｍｌのソルビトー ル基質溶液を負荷した。

フタル酸ブチルのクッションの上部に、０．１％のアジ化ナトリウムを含有する リン酸塩緩衝液化塩溶液中１０％のパンソルビン０．０５ｍ１をピペットで添加 した。一方の管に０．００５ｍ１のウサギ血清を添加し、次いでアフィニティー 精製しかつセイヨウワサビペルオキシダーゼで標識付けしたウサギ抗−ヤギＩ　 ｇ　Ｇ　（ＲＡＧ−ＨＲＰ　、ザイムド、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含有するＰＢ Ｓ中で１：３００’Ｄに希釈した）　０．０５ｍ１を添加した。他方の管に０． ００５ｍ１の希釈緩衝液および０．０５ｍ１のＲＡＧ−）ＩＲＰを添加した。２ 分後、管を高速のマイクロ遠心器（フィッシャー２３５Ｂ型）内で１分間遠心し 、そしてシグナルの発生について検査した。

対照沈殿物はその上の表面上で直ちに「陰性」　（暗色−褐色または黒色）であ ったが、管と接触する側面は淡い琥珀色のままであった。試料で処理した沈殿物 は「陽性」　（淡い琥珀色）であった。試料（の層または分離した透明に見える 第１クッション層において色は発現せず、ここで基質は存在しなかった。驚くべ きことには、はんのわずかの色が下方の基質溶液中に発現したが、期待するよう に、試料の管はそれにもかかわらず対照の管・（琥珀色）に比較して可視的に陽 性（淡い黄色）であった。固相それ自体の表面上の基質の予期しない濃度は、劇 的な濃縮効果を提供し、陽性の試料と陰性の試料との間の差を増幅した。基質溶 液における差は注意深い視的検査で明らかであるが、沈殿物は見ただけでは容易 に識別された。試料を２５℃に保持する開成の３０分にわたってそれ以上の変化 は存在しなかったが、次の２時間にわたって、はとんどの黒色の対照試料は多少 淡く　（暗褐色）になり、淡い琥珀色の試料の沈殿物は多少より暗色（淡い褐色 またはオレンジ色）になった。明らかなそれ以上の変化は起こらず、そして２つ の沈殿物は室温（１８−２５℃）において１週間以上貯蔵した後、容易に識別さ れた。延長した貯蔵後、あたかも水性の下相から発色団が抽出されるように、フ タル酸ブチル層は琥珀色になった。対照管中の油層はより暗い琥珀色であり、試 料管からの油層と目によって区別することができた。

油層を介在させないでソルビトール基質のクッションを使用し、そして試料と基 質のクッションとの間に空気の空間を使用する類似の実験は、また、視的に識別 できる結果を与えた。遠心後、試料およびクッションの層の境界は見えながった 。着色したしまがアッセイ容器の壁を下る固体の通路を追跡したので、固相の洗 浄は有効ではなかった。しかしながら、対照容器のしま、および沈殿物は試料の 容器におけるそれらより明瞭により暗色な琥珀色であった。時間とともに、溶液 全体（試料およびクッション）は琥珀色となったが、１週後、対照容器は試料容 器よりも全体がなおより暗い琥珀色であった。

ス１副［皿−一 クーションの上聞に′±１・・した−芦するハ州ヒイムノア、セイ 試薬は実施例Ｉにおけるように調製したが、ただし試料は省略し、そして油は３ ６℃以下で固体である桂皮酸メチルであった。アッセイ容器を凍結し、そしてス ピード・バク（Ｓｐｅｅｄ　ＶｚｃＯ）　［サバント（Ｓａｖａｎｔ）　］中で 低速遠心下で凍結乾燥した。反応成分が乾燥したとき、管を室温で貯蔵した。

試料（０，０５ｍ１）を添加したとき、反応成分を再水和し、そして室温で２時 間後、管を３７〜４０℃に加温し、そして上の実施例Ｉにおけるように回転し、 そしてシグナルを測定した。

実立皿上呈 フタル酸ブチルのクッションを゛す心にと立見トロキシアパタイトへ′モ人した ３２−ＰえｆＤＮＡ久肱上 （Ａ）跋互上　３２ｐ標識二本鎖ＤＮＡを２つの７リコートに分割した。一方の 部分を２分間沸騰させ、次いで氷上に配置した。各アリコート（２０μｌ、１０ ミリモルのトリス緩衝液、ｐＨ８，２中）に、同一緩衝液中の１０％のヒドロシ キアバタイトの懸濁液の１００μｍを添加した。０．４ｍｌのマイクロ遠心管中 で０．３ｍｌの次の溶液の１つをピペットで加えることのよってクッション溶液 を調製した：　（１）４０ｇ／ｌのオムニ蛍光体（ｏｍｎｉｆｌｕｏｒ）を含有 するフタル酸ブチル、（２）１．２５　ｇ　／　１のオムニ蛍光体を含有するフ タル酸ブチル、（３）フタル酸ブチル単独。

（Ｂ）益豆ヱヱ皇工：　各クッションの上に、未加熱の標識付けしたＤＮＡおよ び固相を含有する懸濁液の１０μｌをピペットで加えた。この混合物をフィンシ ャーマイクロ遠心機（２３５Ｂ型）中で１分間回転した。管はベックマンＬＳ　 −１００Ｃ液体シンチレーションカウンターで計数した。

フタル酸ブチル（ＢＰ）ｌ）　８５　６７０２５ＢＰＨ＋１２．５　ｍｇ／Ｌオ ムニ蛍光体　２３０３５　７８８３５ＢＰＨ＋　４０．０　ｍｇ／Ｌオムニ蛍光 体　４７０９５　１０２７６５１４−Ｃチャンネルで計数する場合、３２−Ｐを クッション中の蛍光体の存在下または不存在下に検出した。１／８インチの厚さ の鉛シールドの存在下に１４−Ｃチャンネルで計数したとき、計数の１０％より 低い減少が得られ、このことによりＤＮＡの大部分はこれらの低塩条件下に固相 に結合したことが示された。これらの結果が示すように、ここで試験した場合、 蛍光体含有フタル酸ブチルの使用はシールドの必。

要件を排除した。なぜなら３２−Ｐチャンネルを使用するとき、クッションに入 らなかった遊離標識は検出されなかったからである。これらのデータが、また示 すように、３２−Ｐチャンネルより多少より高いシグナルを与えた１４チヤンネ ルにおいてさえ、クッション中の蛍光体の包含は蛍光体を欠くクッションに比較 して５０％より大きいシグナルを与えた。

しかしながら、このチャンネルでは、シールドは上澄み中の遊離標識をマスクす るために必要である。

３２−チャンネルを使用してさえ、クッションに入る上澄みからの放射により生 ずるバックグラウンドのシグナルはシールドの使用によって大きく減少できるか 、あるいは排除でき、そしてシールドは１４−Ｃチャンネルを使用するときより も有効である。これは、この系列の実験において固相にそれほど完全には結合し ない加熱したＤＮＡを使用して立証される。加熱したＤＮＡを、前述のように、 フタル酸ブチルのクッション上で処理した。

フタル酸ブチル（ＢＰ）Ｉ）　１１０．１７０　１０１３５５．１０８８５０Ｂ ＰＨ＋　シー　ル）’　７９８６０．８７１６０３２−Ｐチャンネルでは、蛍光 体含有クッションを伴う鉛シールドはシールドを使用しない同一クッションより もほとんど４０％だけ少ないシグナルを与え、これにより上澄みまたはクッショ ンの上部から有意のシグナルが発生することが示される。シグナルのほぼ２０％ の遮断が同一試料について１４−チャンネルを使用して得られた。

スＩビ」！ １：８１］「クージョン」の添■によ　−している−　を７、る−　・　の ５０μｍのＢＳＡ溶液（１ｍｇ／ｍｌ、　Ｐ　Ｂ　Ｓ中）またはｒＴＧＦ−ｆｌ ’ｃ−末端１７残基の断片（同−ＢＳＡ溶液中で１　：　１０００に前希釈した もの）をヤギ抗−ウサギＩｇＧ（マイクロメゾイック、ペンシベニア州ホージャ ム）を前被覆した８×５０ｍ１のポリプロピレン管に添加した。これらの管の各 々に、５０μｌの１２５−ヨウ素標識ペプチド断片（０，２ｔｎｇ／　ｍｌのＢ ＳＡを含むＰＢＳ中の１　ｎＭ）を添加した。室温で５分後、二重反復実験の管 に１ｍｌのフタル酸ジブチルまたはフルオロカーボン油、Ｆｅ１２　（両者共シ グマ・ケミカル・カンパニー、セントルイス）を添加した。

高密度の油が管の底から水性アッセイ混合物を除去した。

フタル酸ジブチルを有するものは、底付近で捕捉された水性アッセイ混合物の滴 を除去するために多少の攪拌を必要とし、そして水の薄いフィルムが油と管の内 部表面との間に持続するように見えた。Ｆｅ１２では、水は直ちに表面へ浮上し 、油相中での見掛けの保持はなかった。

すべての管を直ちにシンチレーションカウンター内で、１２Ｘ５０ｍのプラスチ ック管をガンマバイアル（コーホ−ライト）のためのホルダーとして使用し、上 澄みおよび油層の大部分を０．００６インチの鉛箔の１．２５インチの長さのシ リンダー（プラスチックのシリンダーで底から７７８インチ上で箱］、艮 抗体　フタル酸ブチル　１４６８０　６８．２　４９．４　３．６対照　４００ 　２．５ 両者の油は有意のシグナルを生成したが、それらは性能が異なった。フタル酸ブ チルは多少の操作を必要とし、そして高いバンクグラウンドを生じさせたが、短 いインキュベーションおよび比較的高い抗体の希釈（１：２０００の抗体希釈に おける平衡結合はほぼ３５〜４０％の特異的結合を生ずることが期待されるであ ろう）を考慮してきわめて高いシグナルを生じさせた。Ｆｅ１２は非常の低いバ ックグラウンド、および５分のインキュベーションの間に期待される値に近いシ グナルを生じさせた。両者の場合において、シグナル対ノイズ比は類似ＴＧＦの アッセイのため、２．５ｍｌの尿をＧ１５セフアデンクム緩衝液で平衡化したも の）に通して脱塩した。尿のペプチドを含有するボイドボリウム分画を凍結し、 そして１２０μｍの水＋１モルのジチオスレイトールおよび０．５モルの重炭酸 ナトリウムを含有する還元溶液１２μｌで再構成した。骨髄腫の試料に余分の１ ０μｌの還元溶液およびわずかに１１０μｌの水を加えた。ｈＥＧＦのアッセイ のため、尿を緩衝液で５倍に希釈した。

０．０５０μｌの各処理した尿の試料を、０．０２５　ｍｌの抗体懸濁液および ０．０２５　ｉｔの放射線ヨー素化トレーサー（全長ＴＧＦ−α、残基１−５０ 、またはｈＥＧＦ、残基１−５３．２５０−２７５μＣ１／μＧ、はぼ１０．０ ００ｃｐｍ）と０．２５ｍ１のフタル酸ジブチルを含有するインキュベーション ／分離容器内で混合した。４℃で一夜インキユベーションした後、容器を３０秒 間はぼ１０．０００Ｘ　ｇで遠心し、そして放射線シールド（第３図参照）中に 配置し、そしてＬＫＢラックガンマ（Ｒａｃｋｇａｍｍａ）カウンターで１分間 計数した。標準は０．２ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを含有する緩衝液中の 全長のＴＧＦ−αおよびｈＥＧＦから成り、そして尿の試料と同一の方法で処理 した。

胸　３０／３（０％）　１／３　（３３％）骨髄腫　１４　７／１４　（５０％ ’）　８／１４　（５７％）前立腺（進行性”）　７　３／７　（４３％）　５ ／７　（７１％）〃　（安定＞　８　１／８　（１２％”）　１／８　（１２％ ）〃　（未評価）　２　０／２　（０％）　Ｏ／２　（０％）直腸　１１／１　 （１００％＞　１／１　（１００％）多重層のクッションの使用 第１クッション層または第２クッション層として潜在的に使用する異なる物質を 、クッションの形成の間および引続く遠心の間の明確な境界を維持し、そしてス タフィロコッカス・アウレウス（Ｓ、ａｕｒｅｕｓ）粒子を短時間の回転で沈殿 させる能力について試験した。すべての潜在的クッションの物質を、マイクロ遠 心機［サバント（Ｓａｖａｎｔ）、１０．００Ｏｒｐｍ）中で全速で１分間遠心 する間、０．４ｍｌのポリプロピレンのマイクロ遠心管中の固定したスタフィロ コッカス・アウレウス（Ｓ、ａｕｒｅｕｓ）を沈殿させる能力について試験した 。これらの条件を使用して、沈殿はシュークロース溶液（１０〜４０％ｗ／ｖ、 ｄ＝１．０３７４−１．１７５８．２２℃）および次の列挙した水不混和性物質 について等しく良好に起こった：コハク酸ジエチル、桂皮酸エチル、フタル酸ジ 、ブチル、アジピン酸メチル、およびマレイン酸ジエチル。

実差に取」Ｌ−一 ”　＋’　＃／Ｌ／モア　（ＴＳＨ）　ニツｔｒＮテノｉ”’ＲＩＡＴＳＨを決 定するための商用１２５−ヨウ素ＲＩＡキットを、アメリカン・バイオクリニカ ル（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｂｉｏｃｌｉｎｃａｌ）　（オレゴン州ボートランド） から入手し、そして本発明の分離および検出の方法に適合させた。すべてのアッ セイ反応成分は製造業者の指示に従って使用したが、ただし反応成分の体積は４ 分の１に減少させ、そしてスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ、ａｕｒｅｕｓ ）　（２５μｍ／試験の１０％ｗ　／　ｖの懸濁液）を「第２抗体」沈殿溶液の 代わりに使用した。適合した試験は、０．２５ｍ　ｌのフクル酸ブチルのクッシ ョンを含有する０、４ｍｌのマイクロ遠心管を使用して実施した。

適合させた試験はわずかに２時間（３７°Ｃ）インキュベーションし、これに対 して標準試験は４時間（２５℃）インキュベーションしてさえ、適合させた試験 は有意に低い非特異的結合をし、合計の結合は同等であり、そして全体の感度は 大きかった。詳細な結果を下に示す： 温度　室　温　３７℃ アッセイ混合　０．５０ｍｆ　＋　１＋ｎ１０．１５ｍ１物容量　沈澱溶液 災施±土Ｘ ＲＩＡ　＼の　′４：′：庁およびシールリド六−（Ａ）放射線シールドの遮断 効果 放射線シールド（４２、第３図）を１２５−ヨウ素放射の遮存在下に試験した。

１２５−１含有溶液のアリコートを０．４ｍｌのアッセイ容器にピペットで入れ た。合計の遮断されない計数を、クッションを含まない管を使用して、シールド の不存在下に計数した。検出効率は、２つの型のシールド中でこれらの同じ管を 計数することによって決定した。遮断効率は、２種類のシールド（第３図、ディ スク５２の存在下および不存在下）を伴ってクッションを収容する管を計数する ことによって決定した。

（Ｂ）ＲＩＡについての精度 合計の結合したトレーサーの反復実験物をＴＧＦアッセイを使用して測定した（ 実施例ＩＡ）。各々１５本の管の４つの群を２つの異なるガンマカウンターで計 数した。

マイクロメゾイック４チヤンネルカウンク（３八日の８　）■　・２１２１　８ ５　４．Ｏ Ｉ［Ｌ　２１１４　８９　４．２ ＴＩ　２１９４　９６　４．０ ＦＩＧ、ｌＡ　ＦＭＧ。ＩＢ 手続補正書（方式） ％式％ ２、発明の名称 特異的結合アッセイにおける成分の分離、混合および検出のための方法および装 置 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 氏名　ハーグリーブス、ウィリアム、ルドルフ４、代理人 住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号５、補正命令の日付 ６、補正の対象 （１）明細書及び請求の範囲の翻訳文 （２）委任状 ７、補正の内容 （１）明細書及び請求の範囲の翻訳文の浄書（内容に変更なし） （２）別紙の通り ８、添付書類の目録 （１）明細書及び請求の範囲の翻訳文　各１通（２）委任状及びその翻訳文　各 １通 特許庁長官　黒　１）明　雄　殿 ＰＣＴ／ＵＳ８６１０１７２０ ２　発明の名称 特異的結合アッセイにおける成分の分離、混合および検出のための方法および装 置 ３　特許出願人 ４代理人 住　所　東京都港区虎ノ門−丁目８番１ｏ号静光虎ノ門ビル〒１０５　を話（５ ０４）　０７２１ ５　補正書の提出年月日 １９８７年３月！り日 ６　添付書類の目録 （１）　補正書の翻訳文　１通 請求の範囲 １、　アッセイ容器内に形成されたアッセイ混合物内の結合した標識を結合して いない標識から分離する方法であって、該アッセイ混合物は１種または２種以上 の結合性成分、該結合性成分の少なくともあるものに結合した標識、および結合 していない標識を含有する実質的に水性の溶液を含み、該結合性成分は見掛は密 度が該非結合性成分と異なり、該方法は、第１層をアッセイ容器内に形成された アッセイ混合物と接触させ、前記第１層は前記結合していない標識および前記結 合性成分の両者と非混和性でありかつ該結合性成分と異なる密度を有し、そして 前記アッセイ混合物を前記結合性成分および前記結合していない標識を分離させ るために十分な条件に暴露する、ことを含んでなることを特徴とする方法。

２、前記第１層が実質的に酸素、窒素またはイオウを含有する芳香族および非芳 香族の炭化水素化合物がら成る群より選択される水不混和性の密な油を含んでな り、ここで前記化合物は１〜４個のＲでエステル化されており、ここでＲはメチ ル、エチル、プロピルまたはブチルである請求の範囲１に記載の方法。

３、前記第１層がフルオロカーボンまたはシリコーン含を油である水不混和性油 を含んでなる請求の範囲１に記載の方法。

４、前記暴露工程後、前記結合性成分を第２層と接触させ、前記第２層は前記第 １層と実質的に不混和性でありがっそれと異なる密度を有する請求の範囲１に記 載の方法。

５、前記第２層が糖溶液、塩溶液、高密度の粒子のコロイド懸濁液および水混和 性有機溶媒から成る群より選択される請求の範囲４に記載の方法。

６、前記標識がラジオアイソトープ、酵素、酵素前駆体、着色された染料、顔料 、および蛍光化合物から成る群より選択される請求の範囲１に記載の方法。

７、前記標識が分析物である請求の範囲４に記載の方法。

８、アッセイ混合物内の結合した標識を結合していない標識から分離するアッセ イ容器であって、該アッセイ混合物は°１種または２種以上の結合性成分、該結 合性成分の少なくともあるものに結合した標識、および結合しない標識を含有す る実質的に水性の溶液を含み、該結合性成分は見掛は密度が該水性溶液と異なり 、該容器は、 透過可能なシールをもつ基部端および閉じた末端を有する容器であって細長い室 をその中に構成するもの、および前記室内を略横方向に延びてその中に選択的バ リヤーを形成する第１層であって前記結合性成分および前記非結合性成分の両者 と不混和性であるもの、 を含んでなるアッセイ容器。

する芳香族および非芳香族の炭化水素化合物から成る群より選択される水不混和 性の密な油を含んでなり、ここで該化合物は１〜４個のＲでエステル化されてお り、ここでＲはメチル、エチル、プロピルまたはブチルである請求の範囲８に記 載のアッセイ容器。

１０、前記第１Ｎがフルオロカーボンまたはシリコーン含有油である水不混和性 油を含んでなる請求の範囲８に記載のアッセイ容器。

１１、暴露工程後、前記結合性成分を第２層と接触させ、該第２層は前記第１層 と実質的に不混和性でありかつそれと異なる密度を有する、請求の範囲８に記載 のアッセイ容器。

１２、前記第２層が糖溶液、塩溶液、高密度の粒子のコロイド懸濁液および水混 和性有機溶媒から成る群より選択される請求の範囲１１に記載のアッセイ容器。

１３、前記標識がラジオアイソトープ、酵素、酵素前駆体、着色された染料、顔 料、および蛍光化合物から成る群より選択される請求の範囲１１に記載のアッセ イ容器。

１４、前記標識が分析物である請求の範囲１１に記載のアッセイ容器。

１５、流体試料内の分析物の存在または量を検出する方法であって、 該流体試料を反応混合物と一緒にしてアッセイ混合物を形成し、該アッセイ混合 物はアッセイ容器内に形成され、該アッセイ混合物は１種または２種以上の結合 性成分および標識を含有し、該標識の少なくともあるものおよび前記分析物の少 なくともあるものは該結合性成分に直接的にあるいは間接的に結合し、 前記アッセイ混合物を第１層と接触させ、前記結合性成分および結合していない 標識は該第１層と不混和性でありかつそれと異なる密度を有し、 前記アッセイ混合物を前記結合性成分および前記結合していない標識を分離させ るために十分な条件に暴露し、そして前記結合性成分に結合した標識を検出し、 そしてそれから前記分析物の存在または量を決定する、ことを含んでなる方法。

１６、分析物が形質転換増殖因子アルファまたはヒト表皮増殖因子である請求の 範囲１５に記載の方法。

１７、特異的結合アッセイのための再使用可能な検出容器であって、 開いた基部端および閉じた末端を有する細長い容器、および 該容器内に嵌合できる放射線吸収シールド（その中に位置した該シールドはシー ルドされた部分と前記閉じた末端に向うシールドされない部分とを提供する）、 を含んでなる再使用可能な検出容器。

１８、前記シールドと前記管の閉じた端との間に位置し、そして前記管内の前記 シールドとかみ合いかつその位置を維持する大きさを有する部材を含む請求の範 囲１７に記載の検出容器。

１９、基部端と閉じた末端を有するアッセイ容器を含み、該容器はその中に細長 い室構成し、そして前記シールドより滑動可能に受容されることができ、該アッ セイ容器は、さらに、該室内を略横方向に延びて選択的バリヤーを内部に形成す る請求の範囲１７に記載の検出容器。

２０、流体試料内の分析物の存在または量を検出する方法であって、 第１層を１種または２種以上の特異的結合剤および標識を含有する試薬混合物と 接触させ、該第１層は該試薬混合物および前記流体試料に対して実質的に不透過 性であり、分析物を含有する流体試料を前記試薬混合物中に導入してアッセイ混 合物を形成し、 前記アッセイ混合物をインキュベーションし、前記第１層の透過性を変更し、こ れにより前記アッセイ混合物を前記第１層に通過させ、 前記アッセイ混合物を、標識の存在下にシグナルを生成することのできる１種ま たは２種以上の補助成分と接触させ、そして 前記標識によって生成されたシグナルを検出し、シグナルの量が前記分析物の存 在または量により決定される、ことを含んでなる方法。

国際調査報告 Ａ、’ＪＮＥＸ　Ｔｏ　’ｒ１３−　ＩＮτＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ　５ＥＡＲＣ ＨＲＥＰＯＲＴ　ＯＮ

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. １．アッセイ混合物内の結合した標識を結合していない標識から分離する方法で あって、該アッセイ混合物は１種または２種以上の結合性成分、前記結合性成分 の少なくともあるものに結合した標識、および非結合性成分を含み、該非結合性 成分は遊離している標識を含み、該結合性成分は見掛け密度が該非結合性成分と 異なり、該方法は、第１層を前記アッセイ混合物と接触させ、前記結合性成分お よび前記非結合性成分は前記第１層と非混和性でありかつそれと異なる密度を有 し、そして 前記アッセイ混合物を、前記第１層と接触させながら、前記結合性成分および前 記非結合性成分を分離させるために十分な条件に暴露する、 ことを含んでなることを特徴とする方法。
2. ２．前記第１層が実質的に酸素、窒素またはイオウを含有する芳香族および非芳 香族の炭化水素化合物から成る群より選択される水不混和性の密な油を含んでな り、ここで前記化合物は１〜４個のＲでエステル化されており、ここでＲはメチ ル、エチル、プロピルまたはブチルである請求の範囲１に記載の方法。
3. ３．前記第１層がフルオロカーボンまたはシリコーン含有油である水不混和性油 を含んでなる請求の範囲１に記載の方法。
4. ４．前記暴露工程後、前記結合性成分を第２層と接触させ、前記第２層は前記第 １層と実質的に不混和性でありかつそれと異なる密度を有する請求の範囲１に記 載の方法。
5. ５．前記第２層が糖溶液、塩溶液、高密度の粒子のコロイド懸濁液および水混和 性有機溶媒から成る群より選択される請求の範囲４に記載の方法。
6. ６．前記標識がラジオアイソトープ、酵素、酵素前駆体、着色された染料、顔料 、および蛍光化合物から成る群より選択される請求の範囲１に記載の方法。
7. ７．前記標識が分析物である請求の範囲４に記載の方法。
8. ８．アッセイ混合物内の結合した標識を結合していない標識から分離するアッセ イ容器であって、該アッセイ混合物は１種または２種以上の結合性成分、該結合 性成分の少なくともあるものに結合した標識、および非結合性成分を含み、前記 非結合性成分は遊離している標識を含み、該結合性成分は見掛け密度が該非結合 性成分と異なり、該容器は、基部端および閉じた末端を有する容器であって細長 い室をその中に構成するもの、および 前記室内を略横方向に延びてその中に選択的バリヤーを形成する第１層であって 前記結合性成分および前記非結合性成分の両者と不混和性でありかつそれらと密 度を異にするもの、を含んでなることを特徴とするアッセイ容器。
9. ９．前記第１層が実質的に酸素、窒素またはイオウを含有する芳香族および非芳 香族の炭化水素化合物から成る群より選択される水不混和性の密な油を含んでな り、ここで該化合物は１〜４個のＲでエステル化されており、ここでＲはメチル 、エチル、プロピルまたはブチルである請求の範囲８に記載のアッセイ容器。
10. １０．前記第１層がフルオロカーボンまたはシリコーン含有油である水不混和性 油を含んでなる請求の範囲８に記載のアッセイ容器。
11. １１．暴露工程後、前記結合性成分を第２層と接触させ、該第２層は前記第１層 と実質的に不混和性でありかつそれと異なる密度を有する請求の範囲８に記載の アッセイ容器。
12. １２．前記第２層が糖溶液、塩溶液、高密度の粒子のコロイド懸濁液および水混 和性有機溶媒から成る群より選択される請求の範囲１１に記載のアッセイ容器。
13. １３．前記標識がラジオアイソトープ、酵素、酵素前駆体、着色された染料、顔 料、および蛍光化合物から成る群より選択される請求の範囲１１に記載のアッセ イ容器。
14. １４．前記標識が分析物である請求の範囲１１に記載のアッセイ容器。
15. １５．流体試料内の分析物の存在または量を検出する方法であって、 該流体試料を試薬混合物とともにインキュベーションしてアッセイ混合物を形成 し、該アッセイ混合物は１種または２種以上の結合性成分、標識、および非結合 性成分を含有し、該標識の少なくともあるものおよび該分析物の少なくともある ものは、前記結合性成分に直接的にあるいは間接的に結合し、 前記アッセイ混合物を第１層と接触させ、前記結合性成分および前記非結合性成 分は前記第１層と不混和性でありかつそれと異なる を有し、 前記アッセイ混合物を、前記第１層と接触させながら、前記結合性成分および前 記非結合性成分を分離させるために十分な条件に暴露し、そして 前記結合性成分に結合した標識を検出し、そしてそれから前記分析物の存在また は量を決定する、ことを含んでなる方法。
16. １６．分析物が形質転換増殖因子アルファまたはヒト表皮増殖因子である請求の 範囲１５に記載の方法。
17. １７．特異的結合アッセイのための再使用可能な検出容器であって、 開いた基部端および閉じた末端を有する細長い容器、および 該容器内に嵌合できる放射線吸収シールド（その中に位置した該シールドはシー ルドされた部分と前記閉じた末端に向うシールドされない部分とを提供する）、 を含んでなる再使用可能な検出容器。
18. １８．前記シールドと前記管の閉じた末端との間に位置し、そして前記管内の前 記シールドとかみ合いかつその位置を維持する大きさを有する部材を含む請求の 範囲１７に記載の検出容器。
19. １９．基部端と閉じた末端を有するアッセイ容器を含み、該容器はその中に細長 い室を構成し、そして前記シールドより滑動可能に受容されることができ、該ア ッセイ容器は、さらに、該室内を略横方向に延びて選択的バリヤーを内部に形成 する請求の範囲１７に記載の検出容器。
20. ２０．流体試料内の分析物の存在または量を検出する方法であって、 第１層を１種または２種以上の特異的結合剤および標識を含有する試薬混合物と 接触させ、該第１層は該試薬混合物および前記流体試料に対して実質的に不透過 性であり、分析物を含有する流体試料を前記試薬混合物中に導入してアッセイ混 合物を形成し、 前記アッセイ混合物をインキュベーションし、前記第１層の透過性を変更し、こ れにより前記アッセイ混合物を前記第１層に通過させ、 前記アッセイ混合物を、標識の存在下にシグナルを生成することのできる１種ま たは２種以上の補助成分と接触させ、そして 前記標識によって生成されたシグナルを検出し、シグナルの量が前記分析物の存 在または量により決定される、ことを含んでなる方法。