JPS63502961A - 細菌感染芽胞の体外生成方法及び芽胞含有殺虫組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 細菌感染芽胞の体外生成方法及び芽胞含有殺虫組成物技術分野 本発明は、コガネムシ科幼虫に乳化病（＋ａｉｌｋｙ　ｄｉｓｅａｓｅ）を誘発 するバチルスの体外生成芽胞を備えた新規な殺虫組成物及びこの組成物を製造す る改良された方法に関する。

前景技術 日本カプト虫のようなコガネムシ科を制御する最も効率的な現行の方法は、これ らの幼虫に乳化病を誘発する宿主特異細菌を持つ幼虫を感染させる段階を備えて いる。乳化病は幼虫に致命的であるが、他の動物あるいは植物にとっては無害で ある。

公知の乳化屑綿ｍ＜バクテリア）は、変種ボピリ（ＰＯＰｉｌｌｉａｅ）、レン チモーバス（ｌｅｎｔｉ＠ｏｒｂｕｓ）、メロｏンチー（ｍｅｌｏｌｏｎｔｈａ ｅ）、ロバｘ　（ｒｈｏｐａｅａ）、Ｎ、Ｚ、Ｉ型、Ｎ、Ｚ、ｎ型等を含むＢ、 （バチルス）ボピリの種々の変種を含んでいるが、限定するものでない。

これら細菌の無性（ロッド）段階が殺虫剤製法の使用に不適当である。これらロ ッドは、敏感で、殺虫応用法に関連する状態あるいは殺虫応用法が広〈実施され た原野に生存しない。これと対照的に、これら細菌の芽胞は、不利な環境状態に 非常に抵抗力があり、液体、粉体、粒状体あるいは囮餌の応用後の野原において も長期間長生きし、影響力を持っている。

乳化病芽胞は、乳化病の高い死亡率、乳化病病原体の宿主特異性及び化学殺虫剤 の使用を通常伴う不利な環境衝撃の型の不存在が故に、殺虫組成物の使用に特に 好ましい。しかし、効率的な芽胞、特に大量で経済的に魅力ある量を得る種々の 困難さがこのような殺虫剤の広範囲の使用を防止している。

多くの研究者は、Ｂ、ボビリ及び他の乳化病細菌の殆どの芽胞形成を体外で得る ことに失敗している。ヂュトキ（ｄｕｔｋｙ）氏は、最初Ｂ、ボピリを体内で製 造する方法を提案した。この方法は、米国特許第２，２９３．８９０号に記載さ れ、生きた日本カプト虫の幼虫に、感染幼虫のリンパ液から採取した生きたＢ。

ボピリ芽胞を注入し、症状が悪化するまで待機し、この感染した幼虫を乾燥して 粉末にし、得られた物質を現場で応用する段階からなっている。

この体内（ビボの系）製法は極端に退屈で、高価で、仕事が集中することが明白 である。更に、幼虫の重量の百分率として得られる芽胞の量が少なく、コガネム シ科幼虫が３月〜５月及び８月〜ｌＯ月の数箇月間しか成長して得られないので 、限られた量のＢ、ボピリ生成物のみしか製造できない。

乳化病芽胞の代りの供給源用の確実な需要を満足するためには、研究が体外（ビ トロの系）製法に注目しなければならない。

不幸にして、乳化病細菌の制限された体外芽胞形成のみが報告されている。大多 数の無性細胞が人工の液体或は固体培地で製造できるが、芽胞形成の平均度が通 常１０〜３０％を越えず、感染芽胞が商業的に有用でないが相当悪化あるいは存 在しないことが報告されている。パーゲス氏（Ｈ，Ｄ、Ｂｕｒｇｅｓ）編集の「 疫病及び植物症のマイクロ制御」におけるＭ、Ｇ、クライン氏の「植物防疫用の Ｂ、ボピリの使用の利点ＪＩ９８ｉ年アカデミ−・プレス１８４〜１９２頁参照 。

セント・ジニリアン及びり、Ａ、ブラ・ジュニア氏の「比較病態生物学における 現行のトピックスＪ　Ｔ、Ｃ，チェン編集１９７３年０．２巻アカデミ−・プレ ス５７〜８７頁は、２０％の芽胞形成が酵母抽出物、１％のムエラー・ヒントン （Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉれｔｏｎ）培地の成分、トレハロース及び燐酸によって 公式化された固体培地においてＮＲＲＬ　Ｂ−２３０９Ｍの解体細胞の集団に発 生することを報告している。このムエラー・ヒントン培地は、非常に少量即ち０ ．１５％の澱粉を含んでいる。従って、セント・ジュリアン及びブラ培地が約０ ．００１５％のみの澱粉を含んでいる。

ローデス氏等の米国特許第３，３０８，０３８号は、（ａ）重ｉｌ／容積を単位 として、０．２％のショ糖、フラクトース或はトレハロースと、１．５〜２．０ ％の酵母抽出物と、ｐＨを７゜２〜７．５（０，３％）に調製するに十分なＫ　 ＊　ＨＰ　Ｏ、とを含む水溶培地において、１８〜２４時間振動しているフラス コ内或は０．１５〜０　、５　ｖｖ＋ｏで通気して無性細胞を培養し、（ｂ）こ の細胞を寒天、酵母抽出物、酢酸ソーダ及びＫ　＊　ＨＰ　Ｏ、を含むスラント （傾斜寒天）に移動して、まばらな解体を形成し、（ｃ）これら解体を芽胞形成 が発生するまで４２日間培養することによって、３〜５％の範囲で、Ｂ、ボピリ のＮＲＲＬ　Ｂ　２３０９副菌株の体外芽胞形成を誘導する方法を指向している 。

ボネフォイ氏の米国特許第３，０７１，５１９号は、Ｂ、ツーリンギエス（ｔｈ ｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）の原型を、アミノ化窒素と、少なくとも１種のサッカ ラーゼ、マルトース、デクストロース及びデキストリンと、痕跡要素として１種 以上のカルシウム、亜鉛、マンガン及びマグネシウムとを含むｐＨ５，５〜８． ５の液体媒体において、芽胞形成が発生するまで培養することを伴うＢ。

ツーリンギエスの芽胞を大量に製造する方法を指向している。

しかし、Ｂ、ツーリンギエスが乳化病細菌でなく、更に、乳化病バチルスより容 易に体外で成長することが検証された。

シュリニバサン氏の米国特許第３．５０３，８５１号は、Ｂ。

ボピリを酵母抽出物と、グルコース、グリセロール、食塩、硫酸アンモニウム、 ＫｔＨＰＯ，、ＭｎＳＯ４”　ＨｔＯｌＣａＣＱｔｓ　ＺｎＳ　０４”　７　Ｈ ＊Ｏ％ＣｕＳ　ｏ４ｅ　５　ＨｔＯ１ＦｅＳＯ＊”７ＨｔＯ及びクロロアセトア ミド、クロロホルム或はトリクロロエタンのようなりロロアリファチック成分の 少量を含む液体培地で培養して、Ｂ、ボピリ芽胞を体外で製造する方法を指向し ている。

得られた集団の比率は８０％であった。

第１に、クロロアリファチック成分の使用は次の２つの理由によって不適当であ る。（ａ）これら成分が揮発性で、空気に触れる培地に一定間隔で供給する必要 があり、これが製造原価に追加される。（ｂ）これら成分は、有害蒸気でプラン ト従業員が危篤になり、生産物に残った残余量が環境に拡散して、農作物を汚染 する。これら理由で、シュリニバサン氏の方法は、成業規模の生産に不適当であ り、取扱いが困難である。

第２に、シュリニパサン氏によって寄託された菌株はＢ、ポピリでない。これら 菌株は、シュリニバサン氏の特許で引用した農業ハンドブック（後掲）第５０表 ２６０〜２６１真に、誤認したものとして報告され、Ｂ、ボビリ（Ｂ、メガテリ ウム、Ｂ、セレウス、Ｂ、ポリミクサ等）でないと同定されている。

勿論、この文献は、Ｂ、ボビリと混同したＢ、セレウス及びＢポリミクサも報告 している。

スコール氏の米国特許第３，９５０，２２５号は、Ｂ、ポビリ及びＢ９レンチモ ブス用の２段階（発酵−芽胞形成）方法を指向している。無性の成長は酵母抽出 物、ＫｔＨＰＯいグルコース及びトリプトースを含む培地で達成された。結果の 細胞集団はガラス管砂糖精製器に移されて、芽胞形成培地として動物の雑用廃水 と共に培養された。この特許は、１００％の芽胞形成がこの方法によって得られ たが、この数量が計算された基礎が得られなかつたと論争している。この特許は 、培地の単位容積を基準として計数される芽胞について何も述べていなかった。

更に、この特許は、実施例のみに、６．５±０．５９の細胞集団が５Ｑの雑用廃 水に７５＋ａ１２の無性成長培地から移動させられたことを述べている。これは 商業尺度で不向きな容積の６６倍以上の増加を示している。最終的にスコール氏 の特許は、体外形成芽胞の感染データを含んでいない。

従って、多くの研究者がＢ、ボピリの芽胞形成金体外で誘導した刊行され、特許 された詳述プロトコルを持っていた。しかし、これらの手順のどれも大規模生産 に好適なり、ポピリ芽胞を効率的に製造する方法の基本要求を満たしていなかっ た。

これらの要求は、 多量の細胞集団が単位発酵容積毎に生産でき、高百分率の細胞が芽胞形成を起こ し、 成長及び芽胞形成が大規模処理に適した状態で発生し、結果の芽胞が発芽して、 感染的であることである。

現在、少量のレンチモーバス変種を含むＢ、ボピリ変種ボピリは、商業的に生産 された唯一の乳化病バチラスであるが、体内でしか生産できない。

乳化病芽胞を体外で生産するために、特に商業規模の尺度に適応できる効率方法 を形成した従来技術の失敗は、乳化病バチルス、特にＢ、ボビリ及びその変種の 特性及び形態学のある観点によって立証された。これらの観点は、文献の多くの 参照によって証明されるように当業者によって広く支持され、この分野に許容さ れた知識を構成する。

Ｂ、ボピリは、自由芽胞を解放するために自己分解しない膨張した芽胞嚢に形成 された強制の昆虫病原体として文献に汎用的に特徴付けられている。ミルナ氏（ Ｒ，Ｊ、Ｍｉｌｎｅｒ）の後掲４６頁参照。この細菌はカタラーゼ陰性で、栄養 を含むスープ内で成長できない。この細菌は、成長のために、極端に培養しにく い要求を持っていることが考慮される。

Ｂ、ボピリ芽胞についての文献の許容観点は、バチルスが体外の固体培地で成長 し、極めて希な場合体内で成長した時に、希な例を除いて、Ｂ、ボピリ芽胞が殆 ど常に芽胞嚢に保持されることである。従って、芽胞嚢の出現は、標本の同定に 重要な標識として許容される。事実、熟達した研究者は、芽胞嚢を持たない培養 液で成長した芽胞は、Ｂ、ボピリでないと言っている。通常、農業ハンドブック ４２７号、Ｒ，Ｅ、ゴートン氏等の「農業調査サービス、米国農務省１９７３年 」及びパーゲス氏編集の「疫病及び植物症のマイクロ制御」におけるミルナー氏 の「昆虫病原体のＢ、ポビリ群の同定Ｊ１９Ｂ１年アカデミ−・プレス４５〜５ ９頁参照。従って、研究者が酢酸を含む培地の他の培地において裸の（芽胞嚢を 持たない）乳化病芽胞を観察したとしても、その観察物は乳化病芽胞として同定 されない。シャープ氏（Ｅ、Ｓ、５ｈａｒｐｅ）等の！９８４年Ａｐｐ１．Ｍｉ ｃｒｏｂｉｏ１．　ｌ　９　（４）６８１〜６８８頁は、Ｂ、ボピリ菌株ＮＲＲ Ｌ−８−２３０９Ｍの例えば固体培地上の解体を芽胞形成する偶発的自由芽胞の 観察を報告している。同じ研究者等は、芽胞形成の体外速度の項目において、分 析において最も重要な、極端に乏しい感染度のギリギリの結果を得た。土壌が１ グラム当たり３０Ｘ１０″で培養される経口投与の感染度検査の結果が陰性であ った。これらの結果が研究者に次のことを積極的に述べさしている。

明白に、Ｂ、ボピリ・Ｂ−２３０９Ｍの体外芽胞が通常方法、昆虫の内臓を通し て日本カプト虫の幼虫に感染できない。前掲のシャープ氏の文献６８６頁参照。

前掲のミルナー氏は、芽胞及び尿道本体が芽胞表面構造の詳細を研究する目的の 超音波によって芽胞嚢から解放でき、これが液体培地から直接採取した未感染芽 胞を伴わないことを報告している。

この分野で広く認められた他の提案は、Ｂ、ボビリ或はどの乳化病芽胞が注入に よってコガネムシ科の幼虫に投与される生物検定が芽胞の感染用の高信頼性の検 査を形成することである。

この注入生物検定は、芽胞が土壌接種生物検定のような経口投与される生物検定 に要求されるそれより低い感染投与量が要求されることが発見された。経口生物 検定の所定量はかなり困難で、形成に時間が掛かり、感染検定が選択の感染性標 識として適用された。更に、注入で感染した判断された芽胞が経口投与時に未感 染としばしば報告された。反対のことは報告されていない。

前述の全観察は、当業者の内部に、注入で投与時にもし芽胞が未感染ならば、そ れらが経口投与時に感染しないであろうとの盲信的理屈を構築する役割をしてい た。

要約すると、本発明がなされる時点まで、技術の現状が乳化病バチルス、特にＢ 、ボピリの特性及び形態学において前述の言い訳を許容し、Ｂ、ボビリを体外で 大規模に効率的に成長させることが成功しなかった。

発　明　の　目　的 従って、本発明の１目的は、特に収率において従来達成された量より相当大きい 量の乳化病バチルスの体外芽胞形成を促進する方法を提供することである。

他の目的は、これら病原体の体外芽胞形成の効率を増加させることによって、大 量の乳化病バチルスの芽胞を得る方法を提供することである。

他の目的は、特に、これら芽胞が経口投与された時に、生存でき、成長する感染 性乳化病芽胞を大量に得る方法を提供することである。

他の目的は、体外で製造された乳化病芽胞を備えた野原、果樹園、庭及び鉢植植 物においてコガネムシ科の侵入及び他の感染し易い疫病を撃退するに使用される 殺虫組成物を提供することである。

本発明のこれら及び他の目的は、以下の記載、請求の範囲及び図面を参照して、 当業者にとって明白となろう。

図面の簡単な説明 第１図は体内及び体外の液体及び固体培地におけるＢ、ボビリの成長及び芽胞形 成を示す概略図、第２図は注入生物検定において、１回の注入に投与された芽胞 量の対数に対するＢ、ポピリ芽胞の感染度％の平方根を示すプロット図、第３図 は土壌接種生物検定において、芽胞濃度の対数に対する好ましい尺度のＢ、ポビ リ芽胞の感染度％を示すプロット図である。

発明の開示 本発明の一意図は、複数の乳化病バチルスの無性細胞を、酵母抽出物、水溶性砂 糖、次燐酸カリウム及び炭酸カルシウムを備えた殺菌、通気、ｐＨ調製された培 地において、成長段階の最後まで培養し、この培地に芽胞形成の補助剤と、して 硫酸マンガンを加え、この細胞を約８０％の芽胞形成が発生するまでの十分な時 間培養する段階を備えた、乳化病バチルスの芽胞形成を促進する方法を指向して いる。健康な無性成長を示す菌株用のこの方法で得られた収率は、発酵物におい て、少なくとも液体培地の約ｌＯ１の芽胞／峠のオーダであった。

好ましくは、勿論成長培地が成長刺激剤として水溶性澱粉を備えている。好まし くは、吸着樹脂が追加の芽胞形成補助剤として使用される。

本発明の他の意図は、活性成分として、体外培養で製造された芽胞嚢なしの乳化 病芽胞の殺虫量を備えた殺虫組成物を指向している。

好ましくは、芽胞嚢なしの芽胞が少なくとも２種の菌株からの芽胞混合物である 。

最も好ましくは、本発明の組成物が芽胞嚢なしの芽胞と、組成物の経口感染にお いて少なくともかなり参加する芽胞嚢なしの芽胞を持つ芽胞嚢付きの乳化病芽胞 の混合物を備えている。

しかし、体内芽胞の百分率は全芽胞量の０．０１％を越える必要がなく、体内芽 胞を単に含む市販品の芽胞量の０．０７％以下を示している。

発明を実施するための最良の形態 本発明は特別の好ましい実施例を参照して以下に詳述される。

未感染（裸）の乳化病芽胞の体外での好ましい製造方法は、まずＢ、ボビリ及び その感染性の成長及び芽胞形成パターンの記載によって以下に記載される。

しかし、本発明は、Ｂ、ボピリに限定されず、コガネムシ科の幼虫に乳化病を誘 発する全組織体及びこれら組織体から感染した他の昆虫にも適用できる。また、 本発明の組成物は後述された方法によって製造される裸の芽胞に制限されない。

汚染をなくすためには、乳化病細菌の各培養段階で厳格な衛生基準を観察するこ とが重要である。同じ理由で、無性細胞を頻繁に移し代え、生体及び感染検査と 同様に顕微鏡観察及び生化学試験が頻繁に実施されることが重要である。

菌株は、無性細胞の頻繁な遷移あるいは生存芽胞の無菌貯蔵によって維持しても よい。従って、菌株の維持のためには、成長及び芽胞形成条件が無菌でなければ ならず、製造のために収穫及び凍結乾燥条件が無菌でなくとも少なくとも清潔で なければならない。

本発明によれば、乳化病バチルスの維持培養がまず確立される。ＮＲＲＬ　菌株 Ｂ−２３０９、Ｂ−２３０９Ｓ、Ｂ−２３０９Ｍ及びそれらの感染性誘導体のよ うな、乳化病バチルスのどの通常芽胞形成感染菌株も本発明に使用できるが、Ｎ ＲＩ’ｔＬＢ−２３０９Ｔ、Ｂ−２５２４、Ｂ−３１９５、Ｂ−３３９１、Ｂ− ４１５４及びそれらの感染性誘導体が好ましい。Ｂ。

ボピリの次の菌株が特に好ましい。ＡＴＣＣ−５３２５６（ＲＬＩ−１１８２− Ｗ）、ＡＴＣＣ−５３２５７（ＲＬＩ−８０１５−１４Ｇ）、ＡＴＣＣ−５３２ ５８（ＲＬＩ−Ｄ−６３）及びＡＴＣＣ−５３２５９（ＮＲＲＬ−Ｂ−２３０９ −マイクロ−１）。最も好ましいのはＡＴＣＣ−５３２５６（ＲＬＩ−１１８２ −Ｗ）である。

本発明の体外方法から得られた全芽胞は、必須的に芽胞形成の終了時点で収穫さ れる芽胞嚢なしである。芽胞は芽胞嚢内にあるが、芽胞が成熟した時に培養で自 己分解する。

本発明に従って製造された芽胞がコガネムシ科の幼虫に注入された時には、殆ど 許容レベル以下の感染度を持っている。更に、より高い芽胞の投与量／注入が第 ２図及び第１表に示すように、高い感染度とならない。全く対照的に、投与応答 は、迅速に最大値に到達し、その後減少する。これと対照的に、本発明の芽胞は 経口投与時に全く感染し、より高い投与量が第３図及び第２表に示すように高い 感染度となる。

従来技術が乳化病芽胞としてではなく、芽胞嚢を持たない芽胞を考慮しがちであ り、これら芽胞が注入によって十分に感染しないので、殺虫組成物の形成、ある いは原野、庭、果樹園、牧場、芝地及び鉢植植物を蝕むコガネムシを撃退するた めに使用がこの分野の許容限界を越えている。

維持培養は、公知であるように土壌培地で確立される。無菌の固体Ｊ培地は、（ 媒体容積当たりの成分重量を基本として）ミシガン州デトロイトのＤｉｒｃｏ社 から市販され約１％のトリプトンと、約０．５％＋７）酵母抽出物（Ｄｉｒｃｏ ）と、約０．３％ｃＤ　Ｋ　ｔ　ＨＰＯ４と、約０．２％のデクトロースと、約 ｌ〜２％の寒天（Ｄｉｒｃｏ）とを蒸留水に含むように変形され、１．５％の酵 母と、０゜２％のトレハロースあるいはグルコースと、０．６％のＫｔＨＰ０４ と、１．５％の寒天とを含む変形液体Ｊ培地が特に好ましい。

トレハロースあるいは他の水溶性砂糖がデクトロースと置換でき、トレハロース が好ましい。培地成分は、好ましくは炉によって殺菌され、砂糖が別の炉で好ま しく殺菌されて、他の無菌培地成分に無菌状態で追加される。

無性の維持培養の岬化が２５〜３０℃で実施され、２８℃が好ましい。新鮮な培 地への１週間毎あるいは２週間毎の頻繁な細胞の移動は菌株維持を確保するに好 ましく、細菌によって発生される削除すべき芽胞形成抑制物質の集積を防止する 手助けをする。長期間の菌株維持は、無性の細胞の凍結乾燥、あるいは芽胞の無 菌貯蔵によって達成される。

液体（埋没）培養は、芽胞形成誘導に先立って、完全無性成長を達成するために 好ましく使用される。好ましい液体培地は、約０．１〜０．２％の栄養水溶性砂 糖（好ましくは０．１％のトレハロース、他の砂糖、特にグルコースが芽胞形成 に記録的な抑制効果を持っている）と、約０．５〜１．５％好ましくは１％の酵 母抽出物（少なくも１部分の酵母抽出物が加水分解カゼインと置換される）と、 約０．１〜０．６％好ましくは０．３％のに８）（ＰＯ，と、約０．０〜０．３ ％好ましくは０．２％の炭酸カルシウムと、蒸留水とを含んでいる。好ましくは 、勿論、液体成長培地が約Ｏ１１〜２．０％好ましくは１％の水溶性澱粉を含ん でいる。これら成分は、好ましく濾過殺菌されて、予め別の高圧消毒器で殺菌さ れた炭酸カルシウムに添加される。これの代わりに、高圧消毒器は、全体の殺菌 技術として使用できるが、水溶性砂糖は別に殺菌すべきである。

成長培地の開始ｐＨは、６．８〜８．１に調整すべきで、好ましくは７．６±０ ．２である。公知の追加必須要素の塩、及びマンガン、銅、鉄及び亜鉛の化合物 が追加できるが、ナトリウムは、ある菌株の無性成長を抑制すると知られている ので、避けるべきである。しかし、培地は、追加の物質を持たないで既に記載し た成分から構成されるのが好ましくい。この培地の使用は、無性成長のみを促進 し、また、従来技術で達成されたそれより大きな芽胞形成値及び結果の芽胞の高 感染度との達成を補助する。水溶性澱粉は、原理的に芽胞形成阻止生成体用の吸 着剤あるいは複合剤、即ち栄養素と言うより成長刺激体として信じられる。

細菌の接種物は、好ましくは無菌状態の埋没培養培地のサンプル内の維持培養か ら調製される。この接種物は、細胞濃度がｌＸｌ０’〜１．５Ｘ１０”になった 時、好ましくはロッドが対数的に成長してｌＸｌ０’ロッド／ＭＱになった時に 使用状態になる。これは通常夜中（１０〜２４時間）かけて実施されるが、成長 率が菌株から菌株に変化する。接種物は、通気あるいは機械的混合下で３２℃で 培養される。

埋没培養は発酵器内で初期化される。好ましくは発酵器有効容積の３〜１２％の 最適量の接種物が培養培地に加えられる。

この結果、培養物は、集団対数成長の停止で証明される成長段階が完了するまで 、約１２〜２４時間培養される。好ましい培養状態は、２００〜２５０ｒｐ…の 連続機械混合下での３２±１℃及び約６．２以上好ましくは最適成長用の７．２ ±０．２のｐＩ（下での０．２〜０　、５　ｖｖ＋ａの無菌空気の通気である。

細胞収率を最大にするに重要なｐＨの制御は、塩酸あるいはソーダ以外のアルカ リの追加で達成される。最適ｐＨは菌株から菌株に変化するが、通常前述の範囲 に含まれている。゛好ましくない泡が通常高速混合速度あるいは高送風量で発生 する。泡は、必要ならば、（シリコンを基剤とした抗−泡沫剤である）イリノイ 州スコーギーのＨＯＤＡＧ化学会社のＩ（ＯＤＡＧ　ＦＤ−６２のような最適な 泡沫抑制剤、あるいは他の合成杭−泡沫剤あるいは無性油を添加し、あるいは機 械手段によって制御できる。

泡沫抑制剤は、もし使用されたならば、無菌の乳化あるいは溶液の形態であるべ きである。５容積％の■０ＤＡＧ　ＦＤ−６２の乳化物３ｘＱ／Ｑが好ましく、 発酵し始めてから泡が発生し始める前、通常発酵の開始点から４〜６時間以内に 導入されることが好ましくい。

成長段階中の培養期間の時間は無性細胞の分裂率に依存し、通常少なくとも１２ 〜２４時間である。芽胞形成の好ましい細胞濃度は０．５〜１．５ｘｌＯ＠細胞 ／ｌｅである。特に大規模で実施された細胞濃度は僅かに低いが、通常１〜２Ｘ １０′。細胞／Ｘ１２である幼虫のリンパ液の細胞濃度と好ましく匹敵する。

その後、硫酸マンガンが芽胞形成を誘導促進する芽胞形成補助剤として添加され る。更に、吸着樹脂は、特に菌株が無性段階中に活発に成長しない時に添加され る。これら両温加物が芽胞形成を促進して、発達し始める感染性芽胞となること が発見された。Ｍｎ５Ｏ，が好ましいが、当たり前の、鉄、亜鉛、コバルト或は ニッケルの無機塩、或はこれら金属と結合した例えば酢酸或はプロピオン酸の脂 肪族カルボキシル酸塩のような有機酸塩の他の微量の物質もその場で添加されて もよい。他のイオン交換或は吸着樹脂、即ち陽イオン交換樹脂アンパライトＩＲ −１２０（Ｒｏｈｍ　＆　Ｂａａｓ製）或はＤｏｖｅｘ　５０　ＷＸ４（ダウケ ミカル社製）、陰イオン交換樹脂アンパライトＩＲＡ−４１０或はＩＲ−４５（ 両方ともＲｏｈｍ＆　Ｈａａｓ製）或は非イオン交換樹脂Ｄｔａｉｏｎ　ＨＰ− １０（三菱化学株式会社製）が個別或は合同して使用してもよい。非イオン交換 樹脂アンパライトＸＡＤ−７（Ｒｏｈｍ　＆　Ｈａａｓ製）が最も好ましい。

Ｍｎ５Ｏ，が発酵容積の約１〜１５９／Ｑで添加され、３９／Ｑでの添加が好ま しい。高濃度は高芽胞形成とならないが、低濃度がある菌株においてかなり低い 芽胞形成となる。最適な樹脂濃度は、上記範囲の上限で幾つかの菌株がより高い 芽胞形成を示す菌株に依存する。活発に成長した菌株に上記樹脂が不必要である 。

芽胞形成の好ましい条件は、ｐＨが約６．８±０．１（ｐＨは８．１±０．１ま で耐えられるが不必要である）が好ましい点以外は、通常無性成長のそれと同じ である。ｐＨは、制御が重要で、必要に応じて塩酸或はナトリウム以外のアルカ リを添加して達成できる。

本発明によれば、８０％から９５％以上の芽胞形成率が達成される。所定の芽胞 形成率は、成長段階の終わりでの無性細胞の密度を基本としている。

もし要望されたならば、樹脂は芽胞を収集する前に濾過で除去してもよい。

芽胞は、タルク（ＭｇＳ　ｉｏ　４）或は含水ケイ酸アルミニウムを添加して、 遠心分離によって収集してもよい。４００メツシユのタルクの約θ〜１０ｙ／２ 好ましくは５９／Ｑは芽胞を培養培地から分離する手助けに使用される。分離は 高速遠心分離器で実施されるのがよい。主なベレット成分がタルク、もし必要で 予め除去されなかったならば樹脂、芽胞及びＣａ　ＣＯｓである。このベレット は、０．１％のトレハロース（１０９／　＋１１１２）を含む蒸留水に再度好ま しく懸濁され、その後凍結乾燥される。これで得られる量及び次のパラメータは 商業規模の生産に関連する。

この第１次発酵産物の乾燥重量収率は芽胞形成培地の約７゜７〜１２．５９／Ｃ である。

第１次発酵産物は、吸湿性でなく、遠心分離による未使用及び消費培地の除去が これの達成を手助けする。これの代りに、芽胞は、タルク、ＣａＣＯ５等を添加 しないで濾過で濃縮され、消費培地を洗い落とすために数回蒸留水で洗浄し、そ の後凍結成は噴霧乾燥してもよい。もし、タルク及びＣａ　ＣＯｓが使用されな いならば、第１次発酵産物のダラム当たりの芽胞数がより大きくなる。

本発明による商業規模の実施例のタルクで遠心分離された凍結乾燥第１次発酵産 物の好ましい組成が次に示している。

成熟芽胞　約１５〜２１％ ＣａＣ０５（４００メッシ：Ｌ）　約１０〜１４％樹脂　約２０〜０％ タルク　約４７〜６５％ トレハロース　約０．９〜１．４％ 好ましい芽胞密度は、タルク及び樹脂を含む凍結乾燥産物の約０．９〜１．５ｘ ｌＯ口芽胞／グラムである。

既に述べたように、訂述の液体培地において体外で生成された全乳化病芽胞は必 須的に収集時に芽胞嚢を持っていない。これらの芽胞は特に経口投与時に感染す るので、乳化病芽胞である。従って、本発明を考慮して、Ｂ、ボビリによって実 施例化された乳化病バチルスの成長及び芽胞形成パターンが第１図に示されてい る。

第１図は、この組織体が成長した環境に依存したＢ、ボビリの種々の成長及び芽 胞形成パターンを示している。体内パターンＡＢＣＤＡがバラ点で示され、固体 培地における体外パターンＡＢＣＤＡ及びＡＢＣＥＡが各々実線及び点線で示さ れ、最適を記すために、芽胞形成が固体培地において達成することが困難である 偶発的観察も示している。

最終的に、液体培地における体外パターンＡＢＣＥＡが連鎖しない丸の点在物で 示されている。

この循環図において、細菌のロッドは、点Ａで芽胞発酵からの結果であり、無性 成長サイクルを実行する。反対の環境状態に強いられた時にはロッドが死亡する か芽胞形成する。芽胞形成りの開始は、固体及び液体培地の両者において、体内 及び体外の芽胞嚢の発達によってマークされる。段々と、内生胞子及びバラスボ ア（芽胞対）本体か明らかとなる。体内及び固体培地においては、芽胞がＤで、 バラスボア本体を含むＢ、ボビリ型の芽胞或は歪んだバラスボア本体を含まない Ｂ２レンチモーバス型の芽胞に成熟する。液体培地においては、芽胞嚢が芽胞成 熟期Ｅで偶発的に融解して、歪んだバラスボア本体が希に観測される。時として 、この型の成長過程も固体培地において観測される。

芽胞成熟経路Ｃ−Ｅ−Ａは、本発明に先立ってＢ、ボビリと関連しないばかりか 、たとえ関連しても、経口投与時に感染する乳化病芽胞と関連しない。従って、 本発明の前には、芽胞嚢なしの芽胞が当業者によって考慮されなかった。この芽 胞嚢なしの芽胞が野原、庭、果樹園、牧場、芝地および鉢植（これらを現場とし て集約的に参照する）における応用のための殺虫成分の基礎を形成できる。

しかし、本発明の裸の芽胞の感染度が確認された。事実、本発明の裸の芽胞は、 注入投与より経口投与時において、ビボ（体内）生成の芽胞嚢付きの芽胞よりも 最も感染的であることが発見された。

特に第２図を参照すると、文献に報告された注入検定の結果は、体内生成（芽胞 嚢付きの）芽胞から得られたものと、体外芽胞の変種と比較された。検定で乳化 病と検査された日本カプト虫幼虫の百分率の平方根が対数芽胞１ｉ／注入に対し てプロットされた時には、文献が１０１のスレショルド値から約１０６の投与量 でＩＯ′θ％乳化病に乳化に増加すた直線応答であると、報告している。

ここで報告された研究において、黒丸でマークした陽性基準として導入された特 定の体内検査は、約ｌＯＳまでの芽胞／注入の投与のための、文献に報告された 感染度の範囲内であった。

しかし、より高い投与量で、追加の感染率が追加の芽胞投与量の関数として下に 傾斜し、時として感染率が全く減少した。これは、注入による感染率が下降後最 大のスレショルド投与量があることを示している。

本発明による体外生成芽胞が注入による感染率用に検査された時には、感染率が 同じ投与量で体内芽胞用に文献に報告されたものより変わらず低く、陽性基準検 査のそれより相当低かった。どの投与量でも、体内芽胞感染率が数倍高く、感染 率における高投与量の差異が減少する代わりに多様に増加した。更に、液体培養 からの芽胞（×印のＮＲＲＬ　Ｂ４１５４変種及び０印のＮＲＲＬ　Ｂ−３３９ １変種）は、匹敵投与量で他の変種の凍結乾燥芽胞より通常最も感染的である。

上記結果から、もし注入検定が感染率検査のみに導入されたならば、結果が期待 しないものを考慮したことが明白である。

これらの結果は、殆どの場合、菌注大のかなりの百分率を感染させるために、各 幼虫がｔｏ、ｏｏｏ〜１．０００，０００の芽胞で感染させなければならないこ とを示している。この低感染率がノイズレベルで容易にマスクされる。これらの 結果から、当該分野の技術者の一人は、本発明による体外芽胞が現場使用の殺虫 組成物として殆ど実用に供しないと結論するであろう。

従って、もし、本発明者は、所定投与量での注入検定が経口投与検定より高い感 染度を形成すると言う一般常識的観点を容認し続けているならば、とっくの昔に 殺虫組成物に体外芽胞を使用する努力を放棄しているであろう。

第３図及び第２表を参照して、土壌接種検定の結果を後述する。

これら結果は、体外芽胞が土壌の容器における、日本カプト虫の第３齢幼虫と共 に導入した土壌接種検定において、体外生成芽胞が同じ濃度で体内芽胞より低い 感染度を示すことを示している。しかし、注入検定と異なって、より高い芽胞濃 度では、感染度が増加し続けて、体内芽胞濃度の約６〜１８倍の濃度で、体内芽 胞感染度に到達する。

更に、体内で形成された芽胞の米国農務省標準物質（以下、体内標準物質と言う ）、ＡＴＣＣ−５３２５６及びＡＴＣＣ−５３２５９（形成物Ｚ）の混合物は、 体内物質の匹敵する比率を持つ体内標準物質と、ＡＴＣＣ−５３２５６及びＡＴ ＣＣ−５３２５９のいずれかの物質との混合物より最も感染度を持っていること が検証された。形成物Ｚは、第３図に示すように１、体内標準物質の６，４倍の 濃度で体内産物のそれに匹敵する感染度を持っている。この濃度には、０．００ ６％の体内標準物質と、３．９０６％のＡＴＣＣ−５３２５８と、４８．０４４ ％のＡＴＣＣ−５３２５６と、４８．０４４％のＡＴＣＣ−５３２５９とを含む 形成物が相当する。この形成物が特に好ましい。

この芽胞の内容は、形成物の３ｘｌＯ”芽胞／ボンドに最適に換算される。

本形成物の重要な特性は、非常に少量の体内・芽胞を含んでいることである。こ の体内・芽胞を高い比率で含むことも可能であるが、不必要で不経済である。従 って、原理的には、本発明の形成物のための唯一の要求が形成物の感染度に寄与 するように、大量の体外芽胞を含むことであるが、実際には、体外芽胞と合同し た時に、許容される感染度を持つ経済的形成物が得られるように、最少量の体内 で生成の芽胞を含むことが好ましい。

勿論、芽胞の感染度を菌株依存であるかぎり、上記範囲は推量の域を出ず、体内 あるいは体外で形成の芽胞の各菌株毎に正規化できないことが理解される。しか し、体内及び体外で形成の芽胞が合同して使用されるどの例においても、組成物 は、全体として組成物の感染度に（増加した）かなりの影響力を持つに十分な体 外芽胞を含んでいる。

勿論、本発明による最終の殺虫組成物は、キャリア或は希釈剤を含むことが好ま しい。粉末、粒状、錠剤あるいは誘引形態の土壌組成物が好ましい。土壌キャリ アは、含まれるが、タルク、炭酸カルシウム、含水ケイ酸アルミニウム、カオリ ン、トーモロコシの穂軸、ひる石及びこれらの混合物に限定されない。

粉末状の含水ケイ酸アルミニウム及び粒状のトーモロコシの穂軸が特に好ましい 。好ましくは、活性成分が以下の実施例の産物のように、第１次の発酵産物の形 態である時に、をキャリアあるいは充填剤が組成物の９８．５容積％〜９９．９ 容積％以上含まれている。

液体組成物は、通常、好ましくはｌ：９の無機曲及び水の混合物のような液体希 釈剤に分散した同量の活性成分を備えている。

勿論、液体噴霧組成物は、湿潤剤（例えば、ニューヨーク州ニューヨークのＧｌ ｙｃｏｌ化学会社からのメタノールを０．５〜１゜０％）と、乳化剤（例えば、 プラウエア州つィルミントンのＩＣｌアメリカスからのＴｖｅｅｎ　８０　ｐｏ ｌｙｓｏｒｂａｔｅを０．１−０．５％）と、分散剤（例えば、テネシー州チャ タヌーガのＧＡＦからのＢｌａｎｃｏｌを２〜４％或はニュージャージ州ニュー アークのＨｏｐｃ。

化学会社からのＬｏｍａｒを３％）とを含んでいる。活性成分は、乾燥重ｆｉ１ ボンド当たり７〜１２グラムの第１次発酵産物の等個物と、勿論、土壌成分の維 持性を改良する実体剤として（タルク、或は含水ケイ酸アルミニウム等の）追加 の充填物とを含む湿潤粉末の形態で使用される。

本発明は、特定の実施例によって以下に記載されるが、これらの実施例が本発明 を限定するものでない。

第１実施例：乳化病芽胞の体外製法 ＮＲＲＬ−Ｂ−２３０９菌抹Ｂ、ボビリの生きた種培養が寒天板で形成された。

この細胞ラインは、蒸留水に、１％のトリプトン（Ｄｉｒｃｏ）、０．５％の酵 母抽出物（Ｄｉｒｃｏ）、０．３％のＫ。

ＨＰＯ，，０，２％のトレハロース及び１．５％の寒天（Ｄｉｒｃｏ）を含むＪ 培地に維持された。トレハロースの添加前の培地は、１２０℃／１５ｐｓｉで１ ５〜２０分間高圧消毒された。Ｂ−２３０９培養から接種された注がれる板或は 傾斜板は、２５℃で培養される。これら細胞は少なくとも１週間毎に新しい培地 に移動させられる。

維持培養のために埋没培養が準備される。第１に、０．１％のトレハロース（コ ダック）、０．５％の酵母抽出物（Ｄｉｒｃｏ）、０゜３％のＫ　ｔ　ＨＰ　０ −１０．１　％ノＣａＣ０５（４００７’　ッシュ）及び蒸留水を含む液体培地 （ｐＨ７，６から開始）が準備される。

この培地は、１２０℃／　Ｉ　５　ｐｓｉで１５〜２０分間高圧消毒された。ト レハロースは、別の成分と分離して高圧消毒された。

ｐ）（は塩酸の追加のよって調整することが不必要である。

この液体培地を３００ｘＱ含む１１２容器の撹拌フラスコは、維持培養からの種 培養を無菌的に接種し、その後撹拌台に置いて３２±１”Ｃ１約２５　Ｏｒｐｍ 、　１４時間培養された。

顕微鏡による計数が約ｌＸｌ０”ロッド／ｊ１１２になった時に、３．３％の接 種物がｌＯＱの上記培地に加えられた。培養が３２℃で２５　Ｏｒｐｍで機械混 合しながら０．２の空気容積／培地容積／分（ｖｖｍ）で通風しながら実施され た。この培養の４時間後、１２０℃／　１５　ｐｓｉで１５〜２０分間高圧消毒 された３０ｘＱの５％ＨＯＤＡＧ　ＨＤ−６２泡抑制剤が無菌的に添加された。

ｐＨは、水酸化カリウム或は塩酸の追加によって調整され、開始時の７゜６から 対数成長段階の６．２５に調整された。

成長曲線は顕微鏡によって監視された。接種倹約１８時間で細胞数が１．２ｘｌ Ｏ”ロッド／ＩＩＱになった時には、ｐＨが水酸化カリウムの無菌追加によって ６．８に上昇させ、芽胞形成補助剤が追加された。

これら芽胞形成補助剤は、予め１２１℃／１５ｐｓｉで１５〜２０分間高圧消毒 され、次の比率で発酵物に無菌的に添加さ、れた。

１　、５０１１９／ＩＩＱのＭｎ５Ｏ＊水溶液が発酵物有効容積１１２につき１ ｘＱの割合で加えられた。

２、メタノールおよび蒸留水で徹底的に洗浄された吸着樹脂（アンパライトＸＤ Ａ−７）が高圧消毒前に発酵物有効容積ｌＱにつき３ｇの割合で加えられて、最 終量を３００ｘＱの水に３０９の樹脂を含むようにした。

芽胞形成段階の状態は、３２±１℃の温度、約２５０　ｒｐ＋＋の機械混合０　 、５　ｖｖｍの無菌空気を吹き掛け、０．５ｐｓｉＨの圧力であった。ｐＨは調 整されずに、補助剤の添加が続き、芽胞形成段階に至る所でゆっくりと赤くなり 、８．０の最終値になった。８゜２より高いｐＨが可能であるが、最大の芽胞形 成を伴わないので、不必要である。芽胞形成期間は、芽胞形成補助剤の添加から 約２０時間で完了した。９５％の芽胞形成が顕微鏡によって決定された。

濾過によって樹脂を除去した後、芽胞の収集は、消費培地の全水溶成分を除去し 、乾燥し易い第１次発酵生成物を得るために、連続通路、高速遠心分離器によっ て実施された。遠心分離に先立って、４００メツシユの含水ケイ酸アルミニウム が培養容積５９／Ｑの割合で添加された。この物質は、浮遊物から、未溶解炭酸 カルシウム及び樹脂と共にＢ−２３０９芽胞の分離を助長する。遠心分離は、Ｐ ｅｎｗａｌｔ社が製造した５ｈａｒｐｌｅｓ　ｔａｂｌｅｍｏｄｅｌ　ｃｅｎｔ ｒｉｆｕｇｅ　Ｍｏｄｅｌ　Ｎｏ、　Ｔｌ−Ｐで実施された。。

ベレット状のペースト、即ち芽胞、タルク、固体成分混合物が０．１％トレハロ ース及び蒸留水Ｃｌ０ｘＱ１９のペースト）再懸濁され、この懸濁液が凍結乾燥 された。ペーストは８１．４９の重量であり、芽胞混合物の乾燥収集物が４８． ８９であった。１０．６１２の培養／芽胞形成培地からの実際の芽胞収集物が１ ．２ＩＸＩＯ”芽胞であった。これは、成長段階の終了時点で細胞数を基礎とし た９５％の芽胞量に相当する。かく調整された第１次発酵生成物は、新鮮な芽胞 の成長度が古い芽胞のそれより相当低いので、年をとらし、現場での応用に好適 な組成物に混成される。

第２実施例：乳化病芽胞の体外製法 第１実施例の手順が使用されたが、樹脂が補助剤として添加されなかった。樹脂 の使用は、ＡＴＣＣ−５３２５８及びＡＴＣＣ−５３２５９のような菌株におい て、芽胞形成率を改良することが発見されたが、ＡＴＣＣ−５３２５６の芽胞形 成率に注目すべき効果が得られなかった。

第３実施例：注入生物検定 注入生物検定は、ここで参照する米国特許第２，２９３，８９０号に記載のデュ トキ氏等の手順に従って導入された。

以下の第１表において、注釈がない限り、１検査毎に４０個の幼虫には、冷凍液 体培養からの安定芽胞のサンプル、或は体内物質用リンパスライドから得られた サンプル、或は蒸留水に００３　ｘＱ／注入であり、各幼虫に１回の注入量が投 与された。

使用された、注入毎の投与量及びＢ、ボビリ菌株が以下の第１表に示されている 。

注入後、幼虫が１週間に２度監視されて、乳化病の兆候を観察した。乳化病の兆 候を示した幼虫が顕微鏡による観察によって生物検定し、同様に死亡した幼虫も 生物検定した。数週間後、生存していた幼虫が解剖されて、生物検定された。

これらの結果は以下の第１表に示されている。

第　１　表 体内芽胞　６．６２Ｘ　１０”　２２／　３９ａ　５６．４１（リンパ液　６． ６２Ｘ　１０’　３２／４０　８０．００スライド）　６．６２Ｘ　１０’　２ ６／４０　６５．００ｓ、６２ｘ　ｔＱｉ　１３／４０　３２．５０体外芽胞　 １．０２Ｘ　１０”　６／３９ｂ　１５．３０ＡＴＣＣ−５３２５６１，０２Ｘ 　ｔｏ’　５／４０　１２．５０＋、、０２Ｘ　１０’　４／４０　１０．００ １．０２Ｘ　１０”　１／４０　２．５０体外芽胞　１．３６Ｘ　１０＠ｌ／４ ０　２．５０ＡＴＣＣ−５３２５９１，３６Ｘ　１０’　４／４０　１０．００ １．３６Ｘ　１０’　３／３９ｂ　７．５０１．３６Ｘ　１０”　Ｏ／４０　０ ．００体外芽胞　９．ＩＱｘ　ｌｏ”　Ｏ／４０　０．００ＡＴＣＣ−５３２５ ８９，１０Ｘ　１０’　１／４０　２．５０９．１０Ｘ　１０◆　Ｏ／３９０． ００９．１０ｘ　ＩＱ３　２／４０　５．００９．１ＯＸ　１Ｇ”　３／４０　 ７．５０１．１ｌｌＸ　ＩＱ４　０／４０　０．００２．５１Ｘ　１０’　１／ ３９ｂ　２．５６６．２９Ｘ　ｔｏ’　２／２９ａ　７．０Ｑａ＝１匹紛失　ｂ ：１匹成虫　Ｃ：１匹さなぎ第４実施例：土壌接種生物検定 土壌接種生物検定は、次のようにデュトキ氏が開発した方法及びＰ、Ｂ、５ｃｈ ｖａｒｔｚ氏等の１９７０年Ｊ、［ｎｖｅｒｔ、Ｐａｔｈｏｌ、１５：　１２６ 〜１２８頁に記載された方法に従って形成された。芽胞の第１の濃度は、芽胞に 炭酸カルシウムと、芽胞形成したコヌカグサの根を含む土壌とを混合して用意さ れた。これら土壌サンプルは、２杯のテーブルスプーン量がプラスチック製の各 盆に置かれた。土壌は４０％米国薬局方溶液のホルムアルデヒドで湿潤されて、 水でｔ　：　１０００に希釈された。各盆には１匹の幼虫が追加された。

土壌が湿潤され、芽胞形成したコヌカグサが検査を通して必要に応じて交換され た。これらの結果は以下の第２表に示されている。

第　２　表 ２．Ｏｘ　１０”　２１／２６ａ　８０．７７０．５Ｘ　１０＠１９／３１ａ　 ６１．２９０．１Ｘ１０″’　１０／２８ａ、ｂ　３５．７１２、Ｏｘ　１０＠ ｔｙ／３１ａ　５４．８４体内スパイク　２．Ｏｘ　１０”　２３／　２５ａ　 ９２．００ＡＴＣＣ−５３２５８２，ＯＸ　１０目　１９／４０　４７．５０生 濃縮物　２．ＯＸ　１０”　８／　２７ａ　２９．６３２、ＯＸ　１０”　２／ 　１０ａ　２０．００ＡＴＣＣ−５３２５８２，ＯＸ　１０’”　２５／３２ａ 　８１．２５濃縮物　２．ＯＸ　１０′。１５／　３０ａ　５０．００２、ＯＸ 　１０”　２／３５ａ　５．７１形成物Ａ　２．ＯＸ　１．０”　１０／　２６ ａ　３８．４６２、ＯＸ　１０”　５／２３ａ　２１．７４２、ＯＸ　１０′０ １２／２９ａ　４１．３８２、ＯＸ　１０１′６／３２ａ　１８．７５形成物Ｂ 　２．ＯＸ　１０”　２７／　３４ａ　７９．４０２、ＯＸ　１０＠１３／３１ ａ　４１．９０形成物Ｃ２，ＯＸ　１０’°　２０／２７ａ　７４．０７２、Ｏ Ｘ　１０′１１２／２５ａ　４８．００形成物Ｄ　２．Ｏｘ　１０１０１９／　 ２８ａ　６７．８６２、ＯＸ　１０”　９／２３ａ　３９．１３＾ＴＣＣ−５３ ２５６２，ＯＸ　１０”　１０／３６ａ　２７．７８２、ＯＸ　１０”　２０／ ３７ａ　５４．０５２、ＯＸ　１０”　４／３５ａ　１１．４３２、ＯＸ　１０ ”　２／３９ａ　５．２８０．０　０／３１ａ　００．００ 〃　Ｘ　３　８．ＯＸ　１０”　１３／３４ａ　３ｇ、２４形成物　Ｙ　、　２ ．Ｏｘ　１０”　３／　２９ａ　１０．３４／／　Ｙｔ　４．０ｘｌＯ″’　５ ／２９ａ　１７．２４〃　Ｙ　ｓ　８．Ｏｘ　１０”　１４／３５ａ　４０．０ ０形成物　Ｚ　＋　２．ＯＸ　１０”　５／　２８ａ　１７．８６”　Ｚ　ｔ　 ４．ＯＸ　１０”　５／３９ａ　１２．８２”　Ｚ　ｓ　８．Ｏｘ　１０”　１ ５／３４ａ　４４．１２”　Ｚ、　１６．０Ｘ　１０”　２４／３９ａ　６１． ５４ａ：４０個からの残数、　ｂ：１匹の成虫、ｃ：２０個の残数米国農務省標 準は、ｌＸｌ０＠芽胞／グラムの濃度で接種用に使用された。

体内スパイクは、２．４Ｘ１０’芽胞／グラムを含む感染幼虫及び炭酸カルシウ ムの凍結乾燥混合物から得られた体内物質である。

ＡＴＣＣ−５３２５８生濃縮物は、０．８２５Ｘ　１０目芽胞／グラムを含む本 発明によって準備された凍結乾燥第１次発酵産物である。

ＡＴＣＣ−５３２５８＃縮物は、９９．９６重１１　％　ノＡＴＣＣ−５３２５ １１生濃縮物と、０．０４重量％の体内スパイクとの混合物である。

形成物Ａは％ｌＸ１０＠芽胞／グラムの計数になるように、ＡＴＣＣ−５３２５ ８濃縮物が含水ケイ酸アルニウムで希釈されている。

形成物Ｂは、９９．２重量％のＡＴＣＣ−５３２５８生濃縮物と、０．８重量％ の体内スパイクが含まれている以外は形成物Ａと同じであった。この形成物は、 順にｌＸｌ０”芽胞／グラムの計数になるように、含水ケイ酸アルニウムで希釈 されている。

形成物Ｃは、９９．６重量％のＡＴＣＣ−５３２５８生濃縮物と、０．４重量％ の体内スパイクが含まれている以外は形成物Ｂと同じであった。この形成物は、 順に１×ｌＯ″′芽胞／グラムの計数になるように、含水ケイ酸アルニウムで希 釈されている。

形成物りは、９９，８重量％の＾ＴＣＣ−５３２５８生濃縮物と、１×１０６芽 胞／グラムの計数になるように、含水ケイ酸アルニウムで希釈された０、２重量 ％の体内スパイクが含まれている以外は形成物Ｃと同じであった。

ＡＴＣＣ−５３２５６は、本発明によって製造された凍結乾燥第１次発酵産物で 、１．３４Ｘ１０”芽胞／グラムを含んでいた。

ＡＴＣＣ−５３２５９９は、本発明によって製造された凍結乾燥第１次発酵産物 で、１．５３ｘｌＯ”芽胞／グラムを含んでいた。

形成物Ｘ、Ｙ及びＺは、種々の量の米国農務省標準、ＡＴＣＣ−５３２５８生濃 縮物及び次の比率の＾ＴＣＣ−５３２５６及びＡＴＣＣ−５３２５９の両者ある いはいずれかを含んでいた。

芽胞生成百分率（重量％） 形成物Ｘ　農務省標準　ＡＴＣＣ−５３２５８ＡＴＣＣ−５３２５６ＡＴＣＣ− ５３２５９Ｘ　、　０，０３２　１９．９４４　７９．９７４　−Ｘｔ　Ｏ，０ １Ｂ　１１．１０９　８８．８７３　−Ｘ　、　０．ＯＱ９　５．８８２　９４ ．１０９　−形成物Ｙ Ｙ、　０．０３２　１９．９９４　−　７９．９７４Ｙ　ｔ　Ｏ，０１ｇ　１１ ．１０９　−　８８．８７３Ｙ　、　０．００９　５．８８２　−　９４．１０ ９形成物Ｚ Ｚ、　０．０３２　１９．９９４　３９．１１８７　３９．９８７ｚ　＊　Ｏ： ０１８　１１．１０ｇ　４４．４３７　４４．４３７Ｚ、　０．００８　５．８ Ｂ２　４７．０５５　４７．０５５Ｚ　４　０．００５　３．０３０　４８．４ ８２　４８．４８２にＸメｘ４本伺生へ 一一一一一、イネ外４二１ｇ（゛固イ本土音引邑（日子マ４Ｊし１ご）ｏｏｏｏ 　イ、杢、！ト４Ｌ万＼シ沫イ本を音力気。２イ、イ１．。　ノイ（ミ、外／４ 二１Ｎ−木イ本す音Ｕシ（ロマテノン（１Ｊ４家）オーーー、イオ（内４Ｌ号（ （峙＋ａ字ｌ）−イ４（へト４Ｌへ゛固体を音地 対欲力２枚与量／ｊ工入 涌 国原調査報告 エ１．　ＦｒＥＬＤＳ　５ＥＡＲＣＨＥＤ　（ＣＯＮＴＩＮＵＥＤ）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．活性成分として、種々の乳化病病原体芽胞及びそれらの混合物からなる群よ り選択された殺虫有効量の芽胞喪なしの芽胞と、キャリアまたは稀釈剤とを備え 、前記芽胞が体外芽胞で生成されることを特徴とする原野、果樹園、牧草地、芝 地、庭園に応用してこがねむし（Ｓｃａｒａｂｅｉｄａｅ）を制御するために使 用される殺虫剤組成物。 ２．前記芽胞がパチルスポピリ芽胞であることを特徴とする請求の範囲第１項記 載の組成物。 ３．前記キャリアがタルク、炭酸カルシウム、含水ケイ酸アルミニウム、カオリ ン、とうもろこしの穂軸、バーミュライト及びその混合物からなる群より選ばれ ることを特徴とする請求の範囲第１項記載の組成物。 ４．前記芽胞が前記病原体の同じ種の少なくとも２つの菌株の芽胞の混合物であ ることを特徴とする請求の範囲第１項記載の組成物。 ５．前記芽胞は、芽胞喪付きの体内生成芽胞を備え、前記芽胞喪なしの芽胞が少 なくとも前記組成物の経口感染度に殆ど寄与することを特徴とする請求の範囲第 １項記載の組成物。 ６．前記活性成分が単独で体内で生成した芽胞喪付きの芽胞である殺虫剤組成物 において、約６〜１８倍数の芽胞を含有していことを特徴とする請求の範囲第１ 項記載の組成物。 ７．前記組成物は、芽胞全数に基づいて、約０．０〜約０．０１％の芽胞喪付き の芽胞と、約１００〜９９．９９％の芽胞喪なしの芽胞とを備えたことを特徴と する請求の範囲第５項記載の組成物。 ８．前記量が少なくとも土壌培養生物検定法により測定される５０％の伝染度を 前足組成物に与えるのに充分であることを特徴とする請求の範囲第１項記載の組 成物。 ９．前記組成物に含まれる前記体内生成芽胞の量は、土壌培養生物検定法で測定 すると、芽胞喪付きの体内生成芽胞のみを含有した同じ効果の殺虫剤組成物に含 まれた該芽胞の量の多くて０．００７％であることを特徴とする請求の範囲第５ 項の組成物。 １０．前記病原体がバチルスポピリであり、前記芽胞は芽胞菌株ＡＴＣＣ−５３ ２５９及びＡＴＣＣ−５３２５６の混合物であることを特徴とする請求の範囲第 ４項記載の組成物。 １１．約０．００６％の芽胞喪付きの芽胞と、前記組成物の全芽胞含量に基づい た約３．９％の菌株ＡＴＣＣ−５３２５８とを備え、残りがＡＴＣＣ−５３２５ ９及びＡＴＣＣ−５３２５８の５０／５０の芽胞混合物であることを特徴とする 請求の範囲第１０項記載の組成物。 １２．約０．１〜約２．０％の可溶性澱粉、約０．１〜約０．２％のトレハロー ス、約０．５〜約１．５％の酵母抽出物、 約０．１〜約０．６％のＫ２ＨＰＯ４、約０．０〜約０．３％のＣａＣＯ３から なる液状培地を液状培培地中に好気性状態で、ｐＨを調節して前記バチルスの無 性細胞を培養する工程、前記無性成長殺階の終りで約５〜約２５０ｍｇ／ポンド のＭｎＳＯ４を芽胞形成補助剤として加える工程、及び芽胞形成が生起するまで 前記培養を培養に好適な環境を保つ工程からなることを特徴とする乳化病バチル ス芽胞を製造する方法。 １３．更に、アンパライトＩＲ−１２０、ダウエックス５０ＷＸ４、アンバライ トＩＲＡ−４１０、アンバライトＩＲ−４５及びダイヤイオンＨＰ−１０からな る群より選ばれた樹脂を芽胞形成補助剤として約１及び１５ｍｇ／ｌの間に並ぶ 量で吸収剤樹脂を加える工程から成ることを特徴とする請求の範囲第１２項記載 の方法。 １４．前記バチルスはバチルスポピリであり、前記液状培地が１．０％の可溶性 澱粉；０．１％のトレハロース；０．５％の酵母抽出物；０．３％のＫ２ＨＰＯ ４；０．２％のＣａＣＯ３（重量％）からなり、前記芽胞形成補助剤は５０ｍｇ ／ｌのＭｎＳＯ４からなることを特徴とする請求の範囲第１３項記載の方法。 １５．前記芽胞形成補助剤は３ｇ／ｌのアンバライトＸＡＤ−７吸収剤樹脂から なることを特徴とする請求の範囲第１４項記載の方法。 １６．培養中に少なくとも約８０％の細胞の量が存在するようにバチルスポピリ 芽胞を体外で生成するのに前記バチルスの種培養を行う工程、 前記バチルスの無菌状態で伝達する無性細胞による液状培養培地に対して前記培 養から接種物を形成する工程、約０．１〜２．０％の可溶性澱粉、約０．５〜１ ．５％の酵母抽出物、約０．１〜０．６％のＫ２ＨＰＯ４、約０．０〜０．３％ のＣａＣＯ２及び蒸留水からなる予殺菌培地中で約６．８〜約８．１のｐＨで前 記接種物を無菌状態で接種する工程、３２±１℃、０．５ｐｓｉｇ、約７．２〜 約７．４のｐＨ、機械的混合下で、約０．２〜０．５ｖｖｍの殺菌空気を供給し て、前記無性細胞の殺菌密度が約１×１０９ロッド／ｍｌに達するまで発酵器中 で培養培地を発酵する工程、最終濃度で約０．５〜２５０ｍｇ／ｌの蒸留水中の ＭｎＳＯ４溶液、乾燥重量を基にして１〜１５ｇ／４の量の吸収剤イオン交換樹 脂からなる少なくとも１つの補助剤を前記無性細胞の発酵培養に殺菌芽胞形成補 助剤として無菌状態に添加する工程、約３２±１℃、０．５ｐｓｉｇ、機械的混 合の下で、約０．５ｖｖｍの殺菌通気の存在において、芽胞形成を完結するのに 充分な時間で、ｐＨ６．８に等しいか又はそれ以上で、培養に好適な環境に保つ 工程を 備えたバチルスポピリの体外製造方法。 １７．前記樹脂は、アンバライトＩＲ−１２０、ダウエックス５０ＷＸ４、アン バライトＩＲＡ−４１０、アンバライトＩＲ−４５及びダイヤイオンＨＰ−１０ からなる群より選ばれることを特徴とする請求の範囲第１６項記載の方法。 １８．前記培地が、 １．０％の可溶性澱粉； ０．１％のトレハロース； ０．５％の酵母抽出物； ０．３％のＫ２ＨＰＯ４；及び ０．２％のＣａＣＯ３重量％からなり、前記芽胞形成アジュバントが少なくとも ５０ｍｇ／ｌのＭｎＳＯ４、３ｇ／ｌアムバーライトＸＡＤ−７吸収剤樹脂の１ つからなることを特徴とする請求の範囲第１６項第２項記載の方法。