KR0161982B1

KR0161982B1 - 에토포시드 동족체

Info

Publication number: KR0161982B1
Application number: KR1019910700974A
Authority: KR
Inventors: 쿠오-슝 리; 제킹 왕; 영-치 쳉; 수-윙 리우; 야스히로 이마쿠라; 미쓰마사 하루나; 스코트 에이. 비어스; 리 에스. 써스톤; 후아-쥬안 다이; 충-슝 쳉; 제이. 필립 보웬; 도라 엠. 슈너; 야오 하우르 쿠오; 마사미 모리
Original assignee: 벤 제이. 터치; 더 유니버시티 오브 노스 캐롤라이나 앳 채플 힐
Priority date: 1989-02-23
Filing date: 1990-02-23
Publication date: 1998-12-01
Anticipated expiration: 2010-02-23
Also published as: KR920700657A; US5132322A

Abstract

에토포시드 동족체이고 항종양 활성을 나타내는 화합물을 개시한 것이다.

본 발명의 화합물은 다음 일반식(I)을 갖는다:

상기 식에서, R₁은

R₂는 H 또는 Br; R₃는 H 또는 Br; R₄는 H 또는 Br; R₅는 H 또는 Br; 및 R₆는 H 또는 -CH₃이다.

Description

에토포시드 동족체

본 발명은 항종양 작용을 지닌 에토포시드 동족체 화합물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 에토포시드 동족체 화합물을 안전하고도 유효한 양으로 투여함으로써 종양을 치료하는 방법에 관한 것이다.

포도필로톡신은 흰독말풀 식물로부터 추출한 천연 화합물이다. 근래에, 치료적으로 유용한, 2종의 포도필로톡신의 반합성 글리코시드인, 에토포시드(VP-16으로 공지됨)와 테니포시드(VM-26으로 공지됨)가 개발되었다.

이들 화합물은 폐의 소세포암, 고환종양, 호지킨병, 유두종 비루스 및 산재성 조직구 임파종을 포함한 여러 인간 신생물질에 대해 치료작용을 나타낸다.

이들 약물은 DNA가 분리되어 효소에 공유결합하고 있는, 효소-DNA 착체를 안정화 함으로써 DNA 토포이소머라제 II의 촉매 활성을 차단하는 것으로 생각된다[참조:Chen, G. L., Yang, L., Rowe T. C., Halligan, B. D., Tewey, K., and Liu, L., J. Biol. Chem., 259, 13560(1984); Ross, W., Rowe, T., Glisson, B., Yalowich, J., and Liu, L., Cancer Res., 44, 5857(1984); Rowe, T., Kuppfer, G., and Ross, W., Biochem. Pharmacol., 34, 2483(1985). 이들 문헌은 본원에서 상세히 인용 참조되었다]. 토포이소머라제는 DNA의 토폴로지 상태를 제어하는 효소이다. 타입 II 토포이소머라제는 DNA 내에서 일시적인 2중가닥 파단을 통해 DNA 가닥에 촉매작용을 미치게 한다. DNA의 결합수에 있어서 발생되는 변화는 이들 효소가 수퍼코일링(supercoiling) 및 수퍼코일링의 완화, 카테네이션(catenation) 및 탈카테네이션, 노팅(knotting) 및 언노팅과 같은 DNA의 상호변환을 중재하도록 한다[참조. Wang, J. C., Annu. Rev. Biochem., 54, 665(1985) and Maxwell, A., and Gellert, M., Adv. Protein Chem., 38, 69(1986)]. 이 문헌은 본원에 상세히 인용 참조되었다.

타입 II DNA 토포이소머라제 효소는 DNA 복제, 전사 및 염색체 분리를 포함한 다수의 생체 세포 대사과정에 포함되는 것으로 보인다. 따라서, 이들 효소는 에토포시드 및 테니포시드를 포함하여 광범위한 항암제 작용의 중요한 타켓이 된다. 세포의 사멸을 유도하는 중요한 관건이 되는 것은 상기한 바와 같이, DNA 토포이소머라제 II의 촉매적 활성을 차단시키는 이들 약물의 능력에 있다.

구조-활성에 대한 연구에서 포도필로톡신 동족체중 세포독성, DNA 파단 및 머린-유도된 토포이소머라제 II 억제 활성들 간에는 직접적인 상관관계가 있다는 것이 입증되었다[참조 Minocha, A., and Long, B., Biochem Res. Comm., 122, 165(1984), 이 문헌은 본원에서 상세히 인용 참조되었다]. 백혈구 임파구로부터 인간 타입 II 토포이소머라제를 분리 및 정제하여 에토포시드 및 관련 협동작용물중 구조-활성관계를 조사하기 위한 타켓으로서 이 효소를 사용하는 수단을 얻는다.

4-데메틸-에피포도필로톡신 에틸 에테르에서와 같이, 4-알콕시 그룹으로 에토포시드의 글리코시드잔기를 치환하는 경우, 고농도에서 본래의 DNA 포토이소머라제 II의 억제활성이 보존된다[참조. Thurston, L. S., Irie, H., Tani, S., Han, F. S., Liu, Z. C., Cheng, Y. C., and Lee, K. H., J. Med. Chem., 29, 1547(1986), 이 문헌은 본원에서 상세히 인용 참조되었다]. 그러나, 일련의 4-아실 협동작용물은 그들중 어떤 것이 비록 효능성 세포독성을 지니고 있을 지라도 활성이 덜 하다는 것을 나타내었다[참조 Thurston, L. S., Imakura, Y., Haruna, M., Li, D. H., Liu, Z. C., Liu, S. Y., Cheng, Y. C., and Lee, K. H., J. Med. Chem., 31, (1988), 이 문헌은 본원에서 상세히 인용 참조되었다].

본 발명은 항종양 활성을 나타내는 신규한 화합물을 제공한다. 이들 화합물은 에토포시드 동족체이다. 더욱 상술하면, 본 발명의 바람직한 화합물은 글리코시드 잔기가 2-히드록시에틸아미노아미노 쇄, 2-메톡시에틸아미노 쇄, 4-플루오로아닐리닐 쇄, 염소 원자 또는 브롬원자와 같은, 각종 치환체로 치환된 에토포시드 동족체이다. 본 발명의 화합물은 타입 II 인간 토포이소머라제를 억제하고 세포 단백질-결합 DNA의 절단을 유발하는 것으로 나타났으며, 따라서 종양의 치료에 유용할 수 있다. 본 화합물은 유두종 비루스의 치료에도 유용할 수 있다.

본 발명에 따라 다음 일반식의 화합물을 제공한다:

상기식에서, R₁은

R₂는 H, 또는 Br; R₃는 H, 또는 Br; R₄는 H, 또는 Br; R₅는 H, 또는 Br; 및 R₆는 H, 또는 -CH₃이다.

본 발명은 또한 상술한 바와 같이 본 화합물을 안전하고도 유효한 양으로 투여함으로써 인간과 하등 동물에 있어서의 종양을 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 속하는 화합물중 바람직한 그룹은 에토포시드와 동등하거나 그 이상으로 인간 타입 II DNA 토포이소머라제에 대해 억제 활성을 나타낸다.

상기식에서, R₁은

특히 바람직한 화합물은

본 발명의 다른 목적 및 이점은 다음에 기술한 상세한 설명으로부터 명확하게 나타나거나, 본 발명의 실시를 통해 알 수 있을 것이다.

본 발명의 원리를 설명하기위해 본 발명의 바람직한 실시태양을 다음 실시예와 함께 하기에 상세히 기술한다.

상술한, 바와같이, 본 발명은 다음 일반식의 화합물에 관한 것이다:

상기식에서, R₁은

상기한 바와같이, 본 발명에 속하는 화합물중 바람직한 그룹은 에토포시드와 동등하거나 그 이상으로 인간 타입 II DNA 토포이소머라제에 대해 억제활성을 나타내며, 다음 일반식을 갖는다:

상기식에서, R₁은

본 발명에 속하는 화합물중 다른 바람직한 그룹은 화합물이 다음 구조식을 갖는 4'-데메틸-4β-치환 아닐리닐 4-데스옥시포도필로톡신을 포함할 수 있다:

상기에서, Ar은 하기일반식에서와 같은 아릴아민이다.

여기에서,

본 발명의 바람직한 화합물은 일반적으로 다음 구조식을 가진 화합물로서 기술할 수도 있다:

상기식에서, R은 헤테로원자를 함유할 수 있거나, 또는 이와달리 방향족 링의 3 또는 4 위치에 전자 공여 치환체를 함유할 수 있는 플랫 방향족 그룹이다. 구체적으로, 치환체들은 산소함유 그룹이거나 또는 방향족 그룹은 피리딘일 수 있다.

본 발명의 화합물은 글리코시드 잔기가 치환된 에토포시드 동족체이다. 인간 DNA 토포이소머라제 II의 효능성 억제 활성을 나타내는 화합물은 글리코시드잔기가 C-4β 위치에서 2-히드록시에틸아미노 쇄, 2-메톡시에틸아미노 쇄, 도는 치환된 아릴아민으로 치환된 것에서 유래한다.

억제 활성은 또한 글리코시드 잔기가 C-4β 위치에서 염소, 브롬 또는 아미노 그룹으로 치환됨으로써 향상될 수도 있다. 4β-치환체의 입체 화학은 억제효능을 결정하는데 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다. 일반적으로, β-이성체는 상응하는 α-이성체 보다 더 큰 활성을 나타낸다. 효능에 영향을 주는 다른 요인은 C-4 위치에서 치환체 그룹의 길이와 그 그룹상에서의 치환이다. 이 길이 요인은 할라이드와 히드록시 치환 아릴아민에 따라 달라진다. 히드록시 치환된 아릴아민의 경우, 메타위치가 가장 높은 효능성을 나타내는 반면, 할로겐에서는 파라위치가 가장 높은 효능성을 나타낸다. 할로겐치환 아릴아민에 관련된 제2의 효능요인은 할로겐의 크기이다. 불소는 효능성이 가장 적은 반면, 요드는 가장 큰 효능성을 나타낸다. 이 밖에도, R₂, R₃, R₄및 R₅위치 하나 또는 그 이상의 위치에서의 브롬의 치환은 유의적인 억제 활성을 갖는 화합물을 생성시킨다. R₆는 수소를 메틸 그룹으로 치환함으로써 변환될 수 있다. 이들 변형은 억제활성의 변화를 초래할 수 있는데, 이때 억제활성은 이 기술분야에서 내재하는 통상의 지식을 통하여 선행기술에서 공지된 어세이에 의해 용이하게 측정할 수 있다.

본 발명의 화합물을 사용하여 인간 타입 II DNA 토포이소머라제에 대한 억제활성도, 단백질-결합 DNA 절단 형성에 미치는 영향 및 그들의 세포독성에 대해 시험하였다. 본 발명 화합물의 억제 활성은 DNA 가닥 파단을 유발하는 화합물의 능력과 상관관계가 있다. 그러나, 시험된 본 화합물의 실험관내 세포독성은 효소 억제활성과 DNA 가닥 파단 작용간에는 상관관계가 없다는 것을 나타낸다. 본 발명 화합물에 대해 시험한 결과는 표 1 및 3과 같다. 표 1 및 3에 기재된 화합물에 대해 사용한 어세이의 설명은 문헌［Thurston, L.S., Irie, H., Tani, S., Han, F. S., Liu, Z. C., Cheng, Y. C., and Lee, K. H., Antitumor Agents. 78. Inhibition of Human DAN Topoisomerase II by Podophyllotoxin and α-Peltatin Analogues, J. Med. Chem, 29, 1547(1986), 및 본원에서 인용된 문헌］에 기재되어 있다.

표 1 및 3은 본 발명 화합물과 에토포시드의 억제 활성, DNA 가닥 파단능 뿐만 아니라 세포독성을 설명한 것이다. 표 1 및 3에서 나타나 바와 같이,

의 DNA 가닥 파단능은 에토포시드의 파단능을 크게능가한다.

표 2는 본 발명의 여러화합물과 에토포시드의 상대 DNA 토포이소머라제 II 억제활성을 비교한 것이다. 표 2에서 나타나 바와 같이, 시험된 화합물은 에토포시드 보다 억제활성이 2 내지 8배나 월등하였다.

본 발명의 범위내에 속한 화합물의 제법을 하기 실시예에 기술하였다.

[4'-데메틸 에피포도필로톡신의 제조]

5g(12.1밀리몰)의 포도필로톡신을 75ml의 무수 CH₂Cl₂에 용해하고, 무수 브롬화수소를 상기 용액에 포화되도록 버블링한다. 반응 혼합물을 덮고 실온에서 48시간 동안 방치한다. 용매를 제거하여 얻어진 잔류물을 25ml의 물, 50ml의 아세톤 및 5g의 BaCO₃로 처리하고, 1시간동안 환류시킨다. 반응 혼합물을 클로로포름으로 추출하고 실리카 겔 컬럼상에서 크로마토그래피 한다. 생성물을 클로로포름-메탄올(30:1)로 용출하여 얻고 CH₂Cl₂/에틸에테르로 재결정하여 2.5g(52%)의 4'-데메틸에피포도필로톡신을 얻는다. 스펙트럼 데이타는 문헌［Kuhn, M., Keller-Julsen, C., and von Wartburg, A., Helv. Chim, Acta, 52, 944 (1969), 이 문헌은 본원에서 상세히 인용 참조되었다］에 기술된 것과 일치하였다.(참조 : 반응도식 1)

[실시예 2]

[4'-데메틸포도필로톡신의 제조]

4'-데메틸포도필로톡신을 실시예 1의 실리카 벨 컬럼을 사용하여 클로로포름-메탄올(30:1)로 추가로 용출하여 얻는다. 용출에 의해 얻어진 생성물을 아세톤으로부터 결정화하여 5%(0.5g)수율로 만든다. 스펙트럼 데이타는 본원에서 인용참조된 문헌［Kuhn, M., and von Wartburg, A., Helv. Chim. Acta, 52, 948 (1969)(이후 Kuhn and von Wartburg로 약기한다.)］에 기술된 것과 일치하였다.

[실시예 3]

[4'-데메틸-4β-아미노-데스옥시포도필로톡신의 제조]

(반응도식 II)

A. 4'-o-카보벤즈옥시에피포도필로톡신의 제조

200ml의 무수 디클로로메탈중 2g의 4'-데메틸에피포도필로톡신(5밀리몰)의 용액을 빙용중에서 냉각하고 2.5ml의 트리에틸아민(18밀리몰) 및 2.5ml의 카보벤즈옥시클로리드(17.5밀리몰)로 처리한다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간동안 교반한 후 100ml의 몰을 가한다. 유기층을 MgSO₄를 사용하여 건조, 농축하고 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제한다. 생성물은 클로로포름으로 용출하여 수득하고 클로로포름/에탄올로 재결정하여 2.4g(89%)을 얻는다. 스펙트럼 데이타는 쿤과 폰 바르트버그에 의해 기술된 값과 일치하였다.

B. 4'-o-카보벤즈옥시-4-에피아지도포도필로톡신의 제조

3g(5.6밀리몰)의 4'-o-카보벤즈옥시-4-에피포도필로톡신(실시예 3의 생성물)을 100ml의 무수 메틸렌 클로리드에 녹인 용액을 빙욕중에서 냉각하고, 1.5ml(10.8밀리몰)의 트리에틸아민 및 1.2ml(15.5밀리몰)의 메탄술포닐 클로리드로 연속적으로 처리한다. 그후, 빙욕을 제거하고 반응 혼합물을 실온에서 1시간동안 교반한다. 이 혼합물을 진공하에 증발, 건조하고 40ml의 무수 DMF를 3g(46밀리몰)의 나트륨 아지드와 함께 가한다.

반응 혼합물을 실온에서 하루밤 교반하고 물(100ml) 및 에틸아세테이트사이로 분배한다. 유기층을 수세하고 MgSO₄를 사용하여 건조한 다음, 농축하여 불순한 잔류물을 얻는데, 이 잔류물은 TLC 및 NMR 분석에서 4α- 및 4β-아지도 이성체(약 1:3)의 혼합물임이 나타났다. 클로로포름/에탄올로 부터 결정화하여 다음 특성을 갖는 순수한 β-이성체 4'-o-카보벤즈옥시-4-에피아지도필로톡신(2.3g, 73%)를 수득한다:

C. 4'-데메틸-4β-아미노-4-데스옥시-포도필로톡신의 제조

500mg의 탄소상의 10% 팔라듐을 단계 a 및 b에 따라 얻은, 불순한 4'-데메틸-4-아지도포도필로톡신(2.3g, 4.1밀리몰) 및 200ml의 에틸아세테이트용액에 가하고, 이 혼합물을 수소 40Psi 하에 4시간동안 진탕시킨다. 반응 혼합물을 셀라이트상에서 여과하고 여액을 진공하에 증발시킨다. 잔류물을 실리카 겔 컬럼상에서 크로마토그래피하고 클로로포름/에틸아세테이트(2:1)로 일차 용출하여 비극성 생성물을 제거한다. 다시 클로로포름/메탄올(19:1)이동상으로 용출하여 목적 생성물 0.85g(52%)을 얻는다.

생성물은 메틸렌클로리드/에틸에테르로 결정화한다. 이의 특성은 다음과 같다:

[실시예 4]

[4'-데메틸-4α-아미노-4-데스옥시포도필로톡신의 제조]

4'-데메틸-4α-아미노-4-데스옥시포도필로톡신을 실시예 3에서 사용한 컬럼으로부터 추가로 클로로포름/메탄올(19:1) 이동상으로 용출하여 얻는다. 순수한 생성물(0.34g, 20%)은 메틸렌클로로리드/에틸에테르로 결정화한다. 이의 특성은 다음과 같다:

[실시예 5 내지 12]

[4-알킬아미노-4-데스옥시포도필로톡신의 제조]

(반응도식 III)

실시예 5 내지 12에 기술된 4-알킬아미노-4-데스옥시포도필로톡신은 다음 방법에 따라 제조한다. 50ml의 무수 메틸렌클로리드중의 포도필로톡신(5g, 12.1밀리몰)의 용액을 실온에 유지시키고 용액이 포화될 때까지 건조 브롬화수소가스를 용액을 통해 버블링한다. 플라스크에 마개를 하고 48시간 방치후, 건조질소를 용액을 통해 버블링시켜 과잉의 HBr을 제거한다. 2g의 무수 BaCO₃및 2ml의 적절한 아민을 가한다. 격렬한 가스의 발생이 관찰된다. 혼합물을 실온에서 5시간 방치후, 반응 혼합물을 여과, 수세, 건조하고 컬럼 크로마토그래피를 통해 정제한다. 수율은 5 내지 10%이다. 이들 실시예에서 얻어진 생성물은 다음과 같은 특성을 지닌다:

[실시예 5]

[4'-데메틸-4β-［2-히드록시에틸아미노］-4-데스옥시-포도필로톡신 무정형분말(CH₂Cl₂-에스테르로부터)]

[실시예 6]

[4'-데메틸-4α-［2-히드록시에틸아미노］-4-데스옥시포도필로톡신 결정(CH₂Cl₂-에스테르로부터)]

[실시예 7]

[4'-데메틸-4β-프로필아미노-4-데스옥시포도필로톡신 결정(CH₂Cl₂-에테르로부터)]

[실시예 8]

[4'-데메틸-4β-［2-데스옥시포도필로톡신 결정(CH₂Cl₂-에테르로부터)]

[실시예 9]

[4'-데메틸-4β-알릴아미노-4-데스옥시포도필로톡신 무정형분말(CH₂Cl₂-에테르로부터)]

[실시예 10]

[4'-데메틸-4β-［2-히드록시프로필아미노］-4-데스옥시포도필로톡신 결정(CH₂Cl₂-에테르로부터)]

[실시예 11]

[4'-데메틸-4β-［1-메틸-2-히드록시에틸아미노］-4-데스옥시포도필로톡신 무정형분말(CH₂Cl₂-에테르로부터)]

[실시예 12]

[4'-데메틸-4β-［3-히드록시프로필아미노］-4-데스옥시포도필로톡신 결정(CH₂Cl₂-에테르로부터)]

[실시예 13]

[4'-데메틸-4β(2-아미노에톡시)-4-데스옥시포도필로톡신(반응도식 IV)의 제조]

4'-데메틸-4β-(2-아미노에톡시)-4-데스옥시포도필로톡신을 다음 방법에 따라 제조한다.

A. 4'-데메틸-4β-(2-브로모에톡시)-4-데스옥시포도필로톡신

포도필로톡신(500mg)을 무수 디클로로메탄(15ml)에 현탁시킨다. 건조 브롬화수소가스를 포화될 때까지 혼합물을 통해 버블링한다. 플라스크에 마개를 하고 실온에서 48시간 방치한다. 과잉의 브롬화 수소가스가 제거되도록 용액을 통해 질소가스를 버블링한 후, 탄산바륨(1.50g) 및 2-브로모에탄올(1ml)를 가하고 실온에서 10시간 교반한다. 혼합물을 디클로로메탄으로 희석하고 여과 및 증발 건조한다. 시럽상 잔류물을 클로로포름-아세톤(30:1 v/v)으로 용출하면서 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제한다. 더 정제하기 위해 생성물을 용출제로서 톨루엔-에틸아세테이트(5:1 v/v)를 사용하여 실리카 겔 컬럼상에서 크로마토그래피한다. 수득량(218mg), 융점 194-195℃.

B. 4'-데메틸-4β-(2-아지도에톡시)-4-데스옥시포도필로톡신

N,N-디메틸포름아미도(6ml)중의 4'-데메틸-4β-(2-브로모에틸)에피포도필로톡신(157mg) 및 나트륨 아지드(150mg)의 혼합물을 실온에서 10시간 교반한다. 반응 혼합물을 물에 붓고 교반하여 얻는 백색 침전물을 여과하여 수집하고 공기중에서 건조한다. 클로로포름-에테르로 재결정 하여 순수한 생성물(120mg)을 얻는다.

융점 215-217℃ IR(CHCl₃) cm^-1: 3538(OH), 2205 (N₃), 1770(락톤), 1615(방향족 C=C) 원소분석 C₂₃H₂₃N₃O₈계산치 : C, 58.84; H, 4.93; N, 8.95.

실측치 : C, 58.78; H, 4.98; N, 9.28.

C. 4'-데메틸-4β-(2-아미노에톡시)-4-데스옥시포도필로톡신 4'-데메틸-4β-(2-아지도에틸)에피포도필로톡신(108mg) 및 탄소중 10% 팔라듐(55mg) 및 에틸아세테이트(20ml)의 혼합물을 수소 대기하에 5시간 교반한다. 여과하여 촉매를 제거한 후, 여액을 감압하에 증발, 건조한다. 불순한 생성물을 클로로포름-메탄올(5:1 v/v)로 용출하면서 실리카 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 다음 특성을 지니는 순수한 물질(82mg)을 얻는다. 융점 143-145℃

원소분석 C₂₃H₂₅NO₈H₂O 계산치 : C, 48.72; H, 6.00; N, 2.98.

실측치 : C, 58.74; H, 5.98; N, 5.97.

[실시예 14]

[4-데메틸-4β-(2-히드록시에틸)-4-데스옥시포도필로톡신의 제조(반응도식 V)]

포도필로톡신(200mg)을 무수 디클로로메탄(15ml)에 현탁시킨다. 건조 브롬화수소가스를 포화될 때까지 혼합물을 통해 버블링한다. 플라스크에 마개를 하고 실온에서 48시간 방치한다. 과잉의 브로화 수소가스가 제거되도록 용액을 통해 질소가스를 버블링한 후, 무수 탄산바륨(500mg) 및 에틸렌글리콜(500mg)을 가하고 실온에서 10시간 교반한다. 혼합물을 디클로로메탄으로 희석하고 여과, 수세한 후, 유기층을 무수 MgSO₄상에서 건조한다. 용매를 제거하여 얻은 시럽을 클로로포름-아세톤(30:1 v/v)으로 용출하면서 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피하여 순수한 생성물(30mg)을 얻는다. 얻어진 생성물은 다음과 같은 특성을 지닌다:

[실시예 15]

[4'-데메틸-4β-클로로-4-데스옥시포도필로톡신의 제조(반응도식 VI)]

메틸술피드(0.3ml) 및 N-클로로숙신이미드(60mg, 0.4밀리몰)를 0℃에서 메틸렌클로리드(15ml)중 4'-데메틸포도필로톡신(100mg, 0.25밀리몰)의 용액에 가한다. 혼합물을 질소 대기하 0℃에서 5시간 교반한다. 진공하 증발에 의해 휘발성 시약을 제거한 후, 잔류물을 메틸렌 클로리드로 용출하면서 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 정제하여 순수한 생성물(82mg, 78.5%)을 얻는다. 생성물은 다음과 같은 특성을 지닌다:

IR(CHCl₃) cm^-1: 3540(OH), 1770(락톤)

[실시예 16, 17 및 18]

[4,5,8,2'-테트라브로모-4β-데스옥시포도필로톡신, 5,2',6'-트리브로모-4β-데스옥시포도필로톡신 및 5,8,2',6-테트라브로모-4β-데스옥시포도필로톡신의 제조(반응도식 VII)]

실시예 16, 17 및 18의 화합물을 다음 방법에 따라서 제조한다.

CH₃Cl₃(7ml)중 포도필로톡신(200mg, 0.54mMol)용액에 브로민(0.5ml, 9.70

mMol)을 첨가한다. 실온에서 2시간 교반한 후, 이 혼합물을 빙수내에 넣고, CHCl₃로 추출한 다음 5% 히드로아황산나트륨으로 세척하여 과량의 브로민을 제거한다. 유기층을 무수 황산 마그네슘상에서 건조하고 여과하고 진공내에서 농축하여 불순한 생성물을 수득한다. 이를 준비된 TLC(CHCl₃-아세톤 15:1)를 사용하여 정제시켜 실시예 16, 17 및 18의 화합물을 수득한다.

[실시예 16]

[실시예 17]

[실시예 18]

[실시예 19-41]

[4'-데메틸-4β-(아릴아미노)-4-데스옥시포도필로톡신(19-41)의 제조(반응도식 VIII)]

실시예 19-41에 명시된 4'-데메틸-4β-(아릴아미노)-4-데옥시포도필로톡신은 다음 방법에 따라서 제조한다:

250ml의 건조 디클로로메탄중 4'-데메틸-에피포도필로톡신의 용액을 0℃로 유지하고 건조 브롬화 수소 가스를 용액을 통해 버블링한다. 30분 후, 질소를 용액을 통해 버블링하여 과량의 브롬화 수소를 제거한다. 그리고나서, 이 용액을 진공내에서 증발시켜 벤젠과 함께 공비 증류하여 건조시킨다.

목적한 생성물(11.5g)을 수득한 후 어떠한 더이상의 정제가 없이 다음단계 반응에 사용한다.

스펙트럼 데이타는 문헌［M. Kuhn 및 A. von Wartbury저. Helv. Chim. Acta, 52, 944 (1969)］에 기술된 것과 일치한다.

7ml의 건조 1,2-디클로로에탄중에 4'-데메틸-4β-브로모-4-데옥시포도필로톡신(300mg, 0.65mMol), 탄산바륨(153mg, 0.78mMol) 및 적절한 아릴아민(0.78mMol)을 함유하는 용액을 실온에서 하루밤 교반한다. 이 반응 혼합물을 여과, 에틸 아세테이트로 희석, 수세, 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제한다.

이 실시예에서 수득한 생성물(19-41)은 하기에 나타낸 특성을 가진다.

[실시예 19]

[4'-데메틸-4β-아닐리닐-4-데스옥시포도필로톡신]

[실시예 20]

[4'-데메틸-4β-［4-시아노아닐리닐］-4-데스옥시포도필로톡신]

[실시예 21]

[4'-데메틸-4β-［3-시아노아닐리닐］-4-데스옥시포도필로톡신]

[실시예 22]

[4'-데메틸-4β-［4-에톡시카보닐아닐리닐］-4-데스옥시포도필로톡신]

[실시예 23]

[4'-데메틸-4β-［4-몰포리노아닐리닐］-4-데스옥시포도필로톡신]

[실시예 24]

[4'-데메틸-4β-［3,4-(메틸렌옥시)아닐리닐］-4-데스옥피포도필로톡신]

[실시예 25]

[4'-데메틸-4β-［3,4-디메톡시아닐리닐］-4-데스옥시포도필로톡신]

[실시에 26]

[4'-데메틸-4β-［3-플루오로아닐리닐］-4-데스옥시포도필로톡신]

[실시예 27]

[4'-데메틸-4β-［2-플루오로아닐리닐］-4-데스옥시포도필로톡신]

[실시예 28]

[4'-데메틸-4β-［4-플루오로아닐리닐］-4-데스옥시포도필로톡신]

[실시예 29]

[4'-데메틸-4β-［3,5-디플루오로아닐리닐］-4-데스옥시포도필로톡신]

[실시예 30]

[4'-데메틸-4β-［3-피리딜아미노］-4-데스옥시포도피로톡신]

[실시예 31]

[4'-데메틸-4β-［2-피리딜아미노］-4-데스옥시포도필로톡신]

[실시예 32]

[4'-데메틸-4β-［3-퀴놀리닐아미노］-4-데스옥시포도필로톡신]

[실시예 33]

[4'-데메틸-4β-［3-히드록시아닐리닐］-4-데스옥시포도필로톡신]

[실시예 34]

[4-데메틸-4β-［2-히드록시아닐리닐］-4-데스옥시포도필로톡신]

[실시예 35]

[4'-데메틸-4β-［4-히드록시아닐리닐］-4-데스옥시포도필로톡신]

[실시예 36]

[4-데메틸-4β-［2-클로로아닐리닐］-4-데스옥시포도필로톡신]

[실시예 37]

[4-데메틸-4β-［3-클로로아닐리닐］-4-데스옥시포도필로톡신]

[실시예 38]

[4'-데메틸-4β-［4-클로로아닐리닐］-4-데스옥시포도필로톡신]

[실시예 39]

[4'-데메틸-4β-［3-브로모아닐리닐］-4-데스옥시포도필로톡신]

[실시예 40]

[4'-데메틸-4β-［4-브로모아닐리닐］-4-데스옥시포도필로톡신]

[실시예 41]

[4'-데메틸-4β-［4-요도아닐리닐］-4-데스옥시포도필로톡신]

[실시예 42-44]

(반응도식 IX)

포도필로톡신(500mg, 1.2mMol)을 건조 디클로로메탄(10ml)내에 용해시키고 0℃로 유지한다. 브롬화 수소가스를 이 용액내에 45분동안 도입한 후, 용매를 진공내에서 증발시키고, 무수 테트라히드로퓨란(15ml), 무수 탄산 바륨(474mg, 2.4mMol) 및 적절한 히드록시아닐린(142mg, 1.3mMol)을 첨가한다. 이 혼합물을 하룻밤 실온에서 방치한 다음, 여과 및 농축시킨다. 불순한 생성물은 컬럼 크로마토그래피(용리액으로서 디클로로메탄-아세톤-에틸 아세테이트 100:5:5인 실리카 겔 45g)을 사용하여 정제한다. 이 실시예에서 수득한 생성물(42-44)은 하기에 나타낸 특성을 가진다.

[실시예 42]

[4β-［2-히드록시아닐리닐］-4-데스옥시포도필로톡신]

[실시예 43]

[4β-［3-히드록시아닐리닐］-4-데스옥시포도필로톡신]

[실시예 44]

[4β-［4-히드록시아닐리닐］-4-데스옥시포도필로톡신]

[인간 DNA 토포이소머라제 II의 분리]

인간 DNA 토포이소머라제 II는 급성백혈병 환자의 말초 아세포로부터 분리한다. 분리공정은 문헌［Thurston, L., Imakura, Y., Haruna, M., Li, Z. C., Liu, S. Y., 및 Lee, K. H., J. Med. Chem., 31, COMPLETE (1888)］에 기술되어 있고 이 공정의 일부 조합은 문헌［Goto, T., Laiapia, P. 및 Wang, J., J. Biol. Chem., 259, 10422 (1984)］및 ［Halligan, B., Edwards, K., 및 Liu, L., J. Biol, Chem., 260, 2475 (1985)］에 기술되어 있으며, 이는 본원에 상세하게 인용 참조되었다.

[약물제조]

스톡용액으로서 약물을 20mM 농도로 Me₂SO에 용해시키고, 물과 함께 사용하기 전에 각 약물의 목적 농도로 희석시킨다.

[DNA 토포이소머라제 II 어세이]

P₄언놋팅 반응(P₄unknotting reaction)은 문헌［Hseih, J., J. Biol. Chem., 258, 8413 (1985)］에 기술된 공정의 변형이며, 이는 본원에 상세하게 인용 참조되었다.

이 반응 혼합물 20μL(50mM HEPES, pH 7.0, 50mM KCI, 100mM NaCl, 0.1mM EDTA, 10mM MgCl₂, 1.0mM, 50 μg/ml 소의 혈청 알부민, 0.4μg P₄놋트(knotted) DNA 및 효소함유)를 약물과 함께 또는 약물없이 배양한다.

이 반응 혼합물을 37℃에서 30분간 배양하고 5.0μl의 정지액(2% 도데실 황산나트륨, 20% 글리세롤, 0.05% 브로모페놀 블루)을 첨가하여 배양을 정지시킨다. 이 샘플을 1% 아가로스 겔에 넣고 전기영동 버퍼(90mM 트리스-보론산, pH 8.3 및 2.5mM EDTA 함유)로 55V에서 하룻밤 전기 영동한다. 완결후, 이 겔은 0.5μg/mL의 브롬화 에티듐으로 착색된다. 그리고나서, 장파장 UV 램프에 의해 유도된 형광으로 보여지는 DNA 밴드의 사진을 찍는다. 표 1 에 기록된 자료는 100μM 약물 농도를 반영한다.

[단백질-DNA 복합체에 대한 K-SDS 침전 어세이]

공유 결합 토포이소머라제 II-DNA 복합체의 세포내형성을 칼륨 SDS 침전어세이를 이용하여 정량하고, 이 공정은 본원에서 상세하게 인용 참조한, 문헌［Rowe, T. C., Chen, G. L., Hsiang, Y. H., 및 Liu, L., Cancer Res., 46, 2021 (1986)］(이후, Rowe 등 저)에 기술된 방법으로부터 채택하고 있다. KB ATCC 세포는 0.05mLi/ml 14C-티미딘(특정 활성도 50.5mCi/mMol)으로 18시간동안 예비 표지한다. 최종농도의 5 x 10⁵세포/샘플은 37℃에서 1시간동안 10μM의 약물로 처리하고 문헌［Rowe 등 저］에 기술된 방법에 따라 진행하여 단백질 결합 DNA 수준을 측정한다.

이 분야의 숙련자들에게는 본 발명의 방법 및 생성물에 있어서 다양한 변형 및 변화를 할 수 있다는 것이 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 목적은 본 발명의 변형 및 변화를 포함하는 본 발명이 본 청구항의 범위 및 이들의 균등물내에서 취급될 수 있는 것을 제공한다.

시험 화합물의 여러 다른 농도를 사용하여 이들의 효능성을 측정한다. 표 1에 나타낸 에토포시드에 대한 상대적 효능성은 25 내지 400μM 범위내에서 에토포시드에 의해 동일 정도 억제할 수 있는 시험 화합물의 상대적 농도이다.

Claims

다음 일반식의 화합물:

상기 식에서, R₁은

여기에서, R₁은

R₂는 H 또는 Br; R₃는 H 또는 Br; R₄는 H 또는 Br; R₅는 H 또는 Br; 및 R₆는 H 또는 -CH₃이다.
다음 일반식의 화합물:

상기 식에서, R₁은
다음 일반식의 화합물:

상기 식에서, R₁은 -OCH₂CH₂NH₂또는 -NHCH₂CH₂OH이다.
다음 일반식의 화합물:

상기 식에서, R₁은 -NHCCH₃HCH₂OH, -NHCH₂CCH₃HOH 또는 NHR₃, 여기에서 R₃는
다음 일반식의 화합물:

상기 식에서, R₁은 -NCH₂CH₂OH이다.
다음 일반식의 화합물:

상기 식에서 R은 Cl이다.
다음 일반식의 화합물:

여기에서, R₁은 Cl; R₂는 H 또는 Br; R₃는 H 또는 Br; R₄는 H 또는 Br; R₅는 H 또는 Br; 및 R₆는 H 또는 -CH₃이다.
다음 일반식의 화합물:

상기 식에서, R은
다음 일반식의 항종양 활성을 가진 화합물로 이루어진 약제학적 조성물.

상기 식에서, R₁은

여기에서, R₀는

R₂는 H 또는 Br; R₃는 H 또는 Br; R₄는 H 또는 Br; R₅는 H 또는 Br; 및 R₆는 H 또는 -CH₃이다.
항종양 활성을 나타내는 제1항에 따른 화합물.
다음 일반식의 화합물:

상기 식에서, R₁은 치환 또는 비치환 아릴아민이다.
제11항에 있어서, R₁이인 화합물.
제12항에 있어서, R₁이 다음에서 선택되는 화합물:
다음 일반식의 화합물:

상기 식에서, R₁은및 R₂는 CH₃이다.
항종양 활성을 나타내는 제11항에 따른 화합물.
다음 일반식의 화합물로 이루어진 항종양성 약제학적 조성물.

상기 식에서, R₁은 다음에서 선택된다.
다음 일반식의 화합물:

상기 식에서, Ar은 다음 일반식에서와 같은 아릴아민이다.

여기에서, R₁은

R₃및 R₄는 OCH₂O 또는 OCH₂CH₂O이다.
다음 일반식의 화합물:

상기 식에서, R₁은 플랫 방향족 링계이고, 상기 링계는 헤테로 원자를 함유하거나, 링의 3 도는 4 위치에서 전자 공여 그룹으로 치환된다.
제18항에 있어서, 3 또는 4 위치의 전자 공여 치환체가 산소인 화합물.
제18항에 있어서, 플랫 방향족 링계가 피리딘인 화합물.
다음 일반식의 화합물:

상기 식에서, R₁은 β-Br, β-OH, α-OH, β-NH₂및 α-NH₂에서 선택되고, R₂, R₃, R₄,R₅는 각기 독립하여 H 또는 Br이고, 여기에서 R₂, R₃, R₄또는 R₅의 적어도 하나는 Br이고, R₆는 H 또는 CH₃이다.