KR100492017B1 - 인간 간엽줄기 세포를 이용한 항암치료방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 아데노바이러스 벡터를 이용하여 인간 간엽 줄기 세포를 유전적으로 변형하여 암억제 단백질인 p53을 과량 분비하게 하여 이를 항암치료에 사용하는 용도에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 아데노바이러스에 감염된 간엽 줄기 세포가 암억제 유전자 (tumor suppressor gene) 인 p53을 과량 분비한다는 사실에 착안해 이를 이용한 항암치료에 사용하는 용도에 관한 것으로, 본 발명의 p53 과량 분비 간엽 줄기 세포의 제조 방법은 종양 치료에 유용하게 사용 될 수 있다.

Description

인간 간엽줄기 세포를 이용한 항암치료방법 {Method for anticancer treatment using human mesenhymal stem cell}

줄기 세포를 이용한 의료 연구는 기존의 의학적 한계를 뛰어넘는 새로운 형태의 의학으로 21 세기 의학기술에서 중요한 위치를 차지하리라 본다. 줄기 세포란 분화(differentiation)되지 않은 세포로써, 증식(proliferation)되고 분화되어 어떤 특정 조직(tissue)이나 기관(organ)을 형성할 수 있는 능력을 가진 세포를 말한다. 줄기 세포를 크게 구별하면 성인 골수(adult bone marrow)에서 얻는 간엽 줄기 세포 (mesenchymal stem cell; MSC) 와 같은 성인 줄기세포 (adult stem cell)와 배자 (embryo) 와 태아 (fetus) 에서 얻는 배자, 태아줄기 세포 (embryonic & fetal stem cell)로 대별된다. 현재까지의 연구 결과에 따르면 성인 줄기 세포에서 연골 (cartilage), 지방 (fat), 근육 (muscle), 조혈(hemstopoietic) 그리고 신경 세포인 성상 세포(astrocyte)를 얻을 수 있다.

유전자 치료 (gene therapy) 는 유전병과 암 등 각종 유전자 이상으로 유발되는 질병 치료를 위해 치료 유전자를 체내에 주입하는 방법으로 각종 치료 유전자에 의해 각종 질환의 치료 효과를 기대 할 수 있다. 유전자 치료의 가장 중요한 요건은 목적 유전자의 목표 세포에의 성공적 전달에 있다.이를 위해 리포좀 (liposome) 등의 운반체를 사용하여 유전자를 주입하거나, 아데노바이러스나 레트로 바이러스 등에 유전자를 실어 세포에 전달하게 되는데 이 두 방법 모두 세포에의 전달 효율이 극히 떨어지며 환자에게 불필요한 면역 반응을 유도해 생명을 잃기도 한다. 따라서 암세포 등 목적 세포에 특이적으로 작용하면서 동시에 그 발현 효율이 높은 새로운 유전자 전달 체계가 필요하다.

p53 유전자는 암억제 유전자 (tumor suppressor gene) 로 대략 50~60 % 암환자의 p53 유전자가 변이 또는 결손되어 그 활성이 나타나지 않는다. 구체적으로 p53 단백질은 세포 내 DNA 손상 시 세포주기 G1 기에 멈추게 하여 DNA 손상 복구 과정을 통해 암세포 생성을 막는다. 또한 이미 성장한 암세포에는 세포 아폽토시스 (apoptosis)를 유발시켜 암세포를 사멸케 한다. 따라서 p53 유전자를 p53 변이가 있는 암세포에서 발현시키면 암세포의 사멸을 유도 할 수 있다.

현재 까지 연구 결과에 따르면 간엽 줄기 세포는 자가 면역 반응을 일으키지 않는 것으로 알려져 있다. 즉, 간엽 줄기 세포는 주조직 적합성 복합체(MHC) 를 갖음에도 불구하고, 면역학적으로 중성인 성질을 갖으므로 다른 사람에게서 이식받은 간엽 줄기 세포는 면역 거부 반응을 일으키지 않는다. 따라서 조직 적합 항원이 서로 다른 환자에게도 간엽 줄기 세포의 이식이 가능하다. 또한 간엽 줄기 세포는 면역체계에서 회피되는 세포이다. 즉, 동종이형 T 림파구와 간엽 줄기 세포를 공배양시 T세포에 의한 면역 반응이 일어나지 않음을 확인하였다.

또한, Snyder 등에 의하면 신경 줄기 세포에 자살 유전자인 사이토신 다아미나제 (CD)를 도입하고 이를 뇌종양 세포가 이식된 설치류에 주입하자 신경 줄기 세포가 뇌종양세포를 추적하여 대부분의 종양 세포를 괴사시켰음을 확인하였다. 본 발명에서는 간엽 줄기 세포도 신경 줄기세포와 같은 종양 특이적 부착능력이 있음을 확인하였다.

본 발명의 목적은 인간 간엽 줄기 세포에 아데노바이러스 벡터를 감염시켜 p53 발현량이 증가된 유전적으로 변형된 간엽 줄기 세포를 이용하여 이를 항암 유전자 치료에 응용하는데 있다. 또한 간엽 줄기 세포에는 종양 추적능력이 있음으로 이렇게 유전적으로 변형된 간엽 줄기 세포는 종양을 추적해 종양 세포에 부착되어 과량의 p53을 분비함으로써 종양세포 만을 특이적으로 괴사 시킬 것으로 생각된다.

본 발명은 p53을 과량 발현하는 인간 간엽 줄기 세포의 제조방법 및 이를 이용한 항암 치료 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세히 설명한다. 하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것으로, 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 세포주 배양

정상 사람 간엽 줄기 세포는 미국 바이오 휘테커 사 (Bio-whittaker, USA)에서 분양 받았으며, 간엽줄기 세포 성장 배지 (MSCGM)을 사용하여 37℃ 5% CO₂ 의 조건에서 배양하였다. 인간 정상 피부 섬유 아세포 세포인 IMR90과 부유 (suspension) 위암 세포주인 SNU-16 세포주는 10% 소태아혈청을 포함하는 배지 RPMI1640 에서 배양하여 사용하였다. 종양 세포주는 전립선암 세포주 Du-145, LN-CAP, 난소암 세포주 Ovca3 등을 이용하였다. 간엽 줄기 세포주를 제외한 모든 세포주는 한국 세포주 은행에서 구입하였다.

실시예 2 p53 과량 분비하는 인간 간엽 줄기 세포의 제조

아데노바이러스 Ad5.CMV-Null, Ad5.CMV-LacZ, Ad5.CMV-hp53 바이러스는 미국 퀀탐사 (Quantum-Appligene,USA) 에서 구입하였다. 간엽 줄기 세포의 아데노바이러스에 의한 유전자 전달 효율을 알아보기 위해 Ad5.CMV-LacZ을 10, 100 moi 감염시킨 후 X-gal 염색법을 시행하였다. 그 결과 moi 에 관계없이 거의 100% 세포가 감염됨을 확인한다 (도 1). p53을 과량 분비하는 간엽 줄기 세포의 제조를 위해 각각 바이러스를 10, 100 moi 씩 간엽 줄기 세포에 1시간 감염 후 새 배지로 바꿔주었다. 그 후 매 5일간 15일 동안 ELISA (Enzyme-Linked lmmuno-Sorbent Assay) 방법을 이용해 상층액에서 p53의 발현량을 조사하였다. 그 결과 p53 발현 아데노바이러스 Ad5.CMV-hp53 에 비해 Ad5.CMV-Null, Ad5.CMV-LacZ 감염 간엽 줄기 세포에서 약 4배의 p53이 발현됨을 확인 한다 (도 2). 이는 아데노바이러스 감염에 의한 간엽 줄기 세포의 방어책으로 p53 이 급격히 증가한 것으로 생각된다. Ad5.CMV-hp53에 의한 p53 증가량이 증가하지 않는 이유는 p53 발현량 증가에 의한 세포 자체의 항상성 (homeostasis)유지를 위한 것으로 생각된다. 또한 100 moi Ad5.CMV-hp53 처리한 간엽 줄기 세포의 거의 대부분이 사멸함을 확인해서 과량의 p53 분비를 위한 간엽줄기 세포의 제조에는 Ad5.CMV-hp53 이 적절치 않고, Ad5.CMV-Null, Ad5.CMV-LacZ 등 p53을 발현하지 않는 아데노바이러스를 100 moi 정도로 감염시켜 사용하는 것이 유리하다. 이러한 현상은 일시적이지 않고 15일 이후에도 계속 지속됨을 확인한다.

실시예 3 간엽 줄기 세포의 종양 특이적 부착성 확인

간엽 줄기 세포의 종양 특이적 부착성을 알아보기 위해 간엽 줄기 세포와 정상 인간 섬유 아세포 IMR-90 세포주에 부유 종양 세포주인 SNU-16 세포주를 투여해 보았다. 그 다음날 관찰해 본 결과 부유 종양 세포주가 강하게 부착됨에 비해 정상 섬유 아세포주 IMR-90엔 부착되지 않음을 확인한다 (도 3 참조). 따라서 간엽 줄기 세포엔 종양 특이적 부착 능력이 있음을 확인한다. 따라서 이러한 종양 세포 특이적 부착 능력을 갖는 간엽 줄기 세포를 종양 유전자 치료에 이용한다면 종양 세포만을 선택적으로 사멸 시킬 수 있을것이다.

실시예 4 아데노바이러스 감염시킨 간엽 줄기 세포에 의한 종양 세포 살상효과

아데노바이러스에 의해 감염된 간엽 줄기세포에서 분비되는 p53 유전자에 의한 세포 살상 효과를 알아보기 위해 아데노바이러스 간염 간엽 줄기 세포의 상층액을 각 종양 세포주에 투여한 후 6일 후 미국 프로메가사 제품인 CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity assay kit를 이용해 세포 살상도를 측정해 보았다. 그 결과 Ad5.CMV-Null 감염 간엽 줄기 세포의 상층액이 세포 살상 효과를 갖음을 알 수 있다 (도 4 참조). DU-145는 전립선암 세포주, LNCap-LN3는 전립선암 세포주, OVCAR-3은 난소암 세포주이다.

본 발명의 p53 과량 분비 간엽 줄기세포는 암세포를 추적해 부착해서 과량의 p53 분비함으로써 암세포를 사멸시키거나 성장을 억제시키는데 탁월한 효과를 나타낼 것으로 기대된다. 또한 상기 세포는 기존의 바이러스 유래 유전자 벡터의 부작용인 면역 반응이나 낮은 전달효율성, 제조 및 정제과정의 어려움 등을 일시에 해결이 가능하고, 항원 항체 반응을 일으키지 않아 암환자에게 직접 투여가 가능한 새로운 차원의 항암 유전자 요법으로 기대가 매우 크다.

도 1은 간엽 줄기 세포의 아데노바이러스에 의한 유전자 전달 효율을 알아보기 위해 Ad5.CMV-LacZ 을 100 moi 감염시킨 후 X-gal 염색법을 시행한 결과이다.

도 2는 ELISA(Enzyme-Linked lmmuno-Sorbent Assay) 방법을 이용해 각 아데노바이러스 벡터 감염 후 15일 후 p53의 발현량을 조사한 결과이다.

1:Ad5.CMV-Null 감염 간엽 줄기 세포 상층액의 p53 분비량

2.Ad5.CMV-hp53 감염 간엽 줄기 세포 상층액의 p53 분비량

3.목 (mock) 간엽 줄기 세포 상층액의 p53 분비량

도 3은 간엽 줄기 세포엔 종양 특이적 부착성이 있음을 확인한 그림이다.

도4는 아데노바이러스 감염 간엽 줄기 세포의 세포 상층액을 이용한 세포사멸 효과를 나타낸 그림이다.

Claims (3)

1. 인간 간엽줄기세포에 p53을 발현하지 않는 △E1/△E3 복제 결손 재조합 아데노바이러스 혈청형 5(replication-defective recombination Adenovirus serotype 5)로서, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터/인핸서의 제어를 받는 LacZ 유전자를 포함하는 Ad5.CMV-LacZ 또는 아무 유전자도 포함하지 않는 Ad5.CMV-Null를 감염시켜 제조되는 종양 추적 능력이 있으며 p53을 과량 분비하는 인간간엽줄기세포.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 암을 치료하는데 사용되는 것을 특징으로 하는 인간간엽줄기세포.