KR20000029687A - 면역치료제로서유용한폴리펩티드및폴리펩티드의제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 파필로마바이러스 유래의 항원을 함유하는 융합 폴리펩티드 및 폴리펩티드 응집물, 및 예컨대 HPV 특이적인 면역 반응을 유도하는 면역원 및 백신 용도용 보조제를 함유하는 그 조성물과 용도에 관한 것이다. 이 폴리펩티드는 정제하여, 용액이나 분산액 형태일 때 멸균 여과기를 통과할 수 있는 응집물 및 무정형 응집물로 얻을 수 있다. 이와 같은 폴리펩티드의 예는 인간 파필로마바이러스 단백질 L2 및 E7의 융합 단백질이다.
Description
인간 파필로마바이러스(HPV)는 인간의 점막 표면과 피부에서 증식하며 여러 양성 병소와 악성 병소를 만드는 원인균이다. 이 바이러스는 상피 조직을 감염시키는 DNA 바이러스로부터 유전자적으로 분화된 군이며, 일정 범위의 다양한 인간 질병을 일으킬 수 있다. 지금까지 60 종류 이상의 HPV가 게놈 간의 교차 하이브리드화 정도에 따라 분리되었으며, 이들 중에서 몇몇 아군은 여러 종류의 질병을 일으키는 주요 원인균이다. 예컨대, 타입 1, 2 등의 HPV는 손과 발에 피부 우췌(사마귀)를 일으키는 원인균이고 HPV 5 및 8은 희귀 질병인 우췌상 표피이형성을 일으키는 원인균이다.
약 20 종류의 HPV는 생식기 점막에 감염되며, 감염시 일으키는 질병의 정도에 따라 2가지 아군으로 분류된다. 제1 군에는 생식기 우췌를 비롯하여 대부분의 양성 콘딜로마(우췌)와 관련이 있는 HPV-6 및 HPV-11과 같은 바이러스를 포함한다. 제2 군에는 경부의 편평우를 일으키는 원인균이고, 자궁 경관의 암종으로 진행되는 악성 변환에 관계하는 HPV 16, 18, 31, 33 및 45를 포함한다(zur Hausen, Cancer Res, 49(1989) pp 4677∼4681).
HPV와 관련있는 질병의 일반적인 특징은 직접적인 원인이 바이러스 감염인 상피 조직의 양성 증식(우췌)이다. 이 바이러스는 상피 중의 비각질성 기저 세포를 감염시키지만 이 세포 중에서 완전한 복제 사이클로 증식하지는 못한다. 대신 바이러스 유전자 발현은 감염된 세포의 증식을 유도하여 특징적인 우췌를 만드는 일군의 초기 단백질까지만 일어난다. 하지만, 우췌의 상층에 감염된 세포는 최후의 각질화 상태로 말기 분화하기 시작하며, 이와 같은 분화를 통해 바이러스는 완전한 복제 사이클을 충분히 진행시킬 수 있어 바이러스 단백질과 최종적으로 새로운 바이러스 입자를 생성하게 된다.
따라서, 이와 같은 병소는 증식성이지만 악성으로 변환될 위험이 적은 바, 우췌는 양성으로 유지되는 경우가 대부분이다. 하지만, 몇몇 경우에 HPV 서열을 보유하는 세포는 여러 해가 지나면 종양원성이 되기도 한다. 이와 같은 경우에 바이러스 게놈의 대부분은 소실될 가능성이 있으며, 보통 바이러스 E6과 E7 유전자를 포함하는 나머지 게놈 부는 숙주의 게놈으로 통합되는 것으로 나타난다. 하지만, 악성 종양으로 진행되는 현상은 주로 일정 HPV 종류, 즉 HPV 16, 18, 31, 33, 35, 45와, 경부 및 음경과 같은 특정 조직에만 관련이 있다.
면역계는 HPV 감염을 조절하는 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 면역억제 치료를 받는 환자들에서는 HPV 유도성 피부 우췌와 HPV 관련 질환의 발생 빈도가 증가하는 것으로 알려져 있으며, 이는 바이러스 감염이 대부분 면역 기작에 의해 조절됨을 시사한다. 또한, 면역계가 감염을 조절한다는 또다른 증거는 우췌가 자연 퇴행되는 고찰을 통해 얻어졌다. 생식기에 우췌가 있는 일부 개체들에서는 우췌가 갑자기 사라지는 것이 흔히 발견된다. 이와 같은 퇴행성 우췌가 조직학적으로 연구된 바 있는데, 이 병소에서 T 림프구의 유의적인 유입이 관찰되었다. 따라서, 퇴행은 면역계에 의해 매개되는 것으로 추정되고 있다.
HPV 감염에 효과적인 면역 반응은 HPV에 대한 항체를 혈청에 갖고 있는 환자가 이 질병을 계속 보유하는 바, 주로 세포 매개성 반응인 것으로 생각된다. 또한, 우췌의 자연적 퇴행은 흔히 감염 부위의 적색화, 림프구 침윤, 소양증 및 기타 다른 세포 매개성 면역 반응을 특징으로 나타내는 증상을 수반하는 것으로 알려져 있다. 또한, HPV 감염은 세포 면역성이 손상된 환자에게서 일반적으로 나타나며, 이 바이러스 질환이 지속되는 것을 통해 면역 감시가 불량함을 알 수 있다.
백신접종된 동물 모델을 사용하여 파필로마바이러스 관련 질환의 퇴행에 대하여 연구한 결과 이 질병을 퇴치하는데 면역 효과인자가 관련됨을 시사하였다. 예컨대, 소파필로마바이러스(BPV)에 대한 백신을 접종한 소는 중화 작용성이 없는 것으로 보고된 항체를 생성하지만, BPV L2 서열과 비HPV 서열(베타 갈락토시다제)을 함유하는 융합 단백질을 접종한 소는 예방 및 치료적 반응을 나타내는 것으로 밝혀졌다[WO93/00436, Cancer Research Campaign Technology Limited: Jarrett et al. and Jarrett et al. Virology, 184(1991) pp33-42].
백신 제조에 L1, L2와 같은 HPV 단백질의 용도에 대해서는 예컨대 WO93/02184(Univ of Queensland ＆ CLS Ltd: I Frazer et al: Papilloma virus vaccine)에 공지되어 있다. 기타 다른 HPV 단백질도 면역진단시의 용도에 관해 개시된 바 있다[예컨대, WO91/18294(Medscand AB: J Dillner et al: Synthetic peptides of various human papillomaviruses, for diagnostic immunoassay) 및 EP 0 375 555(Medgenix: G De Martynoff et al: Peptides, antibodies against them, and methods for detection and dosage of papilloma virus)].
EP 0 456 197(1991)(Behringwerke: C Bleul et al)은 HPV18 단백질 E1, E6 및 E7 유래의 일정 서열을 가진 혈청반응성 에피토프를 1개 이상 함유하는 펩티드에 대하여 개시하고 있다. EP 0 451 550(1991)(Behringwerke: M Mueller et al)은 HPV16 단백질 E4, E6, E7 또는 L1 유래의 일정 서열을 가진 혈청반응성 에피토프를 1개 이상 함유하는 펩티드에 대하여 개시하고 있다. 이 펩티드는 선별 시험용이며 백신용으로도 사용할 수 있음을 언급하고 있다.
WO 93/00436(Cancer Research Campaign Technology: WFH Jarrett et al)은 파필로마바이러스 종양의 예방 및 치료에 사용하기 위한 L2 단백질계의 파필로마바이러스 단백질 및 이의 단편에 대하여 개시하고 있으며, 또한 E7 단백질 제조물에 관해서도 언급하고 있다.
WO 92/16636(Immunology Ltd: MEG Boursnell et al)은 생 바이러스 벡터의 투여 후 항원의 생체내 발현을 유도하는, 재조합 백시니아 바이러스 벡터 중에 삽입된 융합 유전자로서 HPV16과 HPV18의 E6 및 E7의 유전자 서열을 개시하고 있다.
WO 92/05248(Bristol-Myers Squibb: EK Thomas et al)은 인간의 파필로마바이러스 감염 및 세포 형질전환을 억제 및 치료하는 물질과, E6 및/또는 E7 유전자 생성물의 일정 영역에 대부분 상응하는 펩티드나 또는 HPV 단백질 중 1 이상의 영역을 가진 키메라 펩티드를 암호하는 유전자를 함유하는 재조합 세포(바이러스 벡터 포함)에 대하여 제시하고 있다.
CP Crum 등은 문헌[Virology 178(1990) pp 238∼246]에서 HPV-16의 L1과 E4 부분 서열의 융합체를 발현시키는 방법과, 생성된 단백질과 프로인트 완전 보조제를 이용하여 래빗을 면역시켜서 진단 및 기타 시험용으로 사용되는 항혈청을 제조하는 방법을 제시한다.
본 발명은 HPV 폴리펩티드 제제 및 만성 HPV 감염의 예방 또는 치료에 사용되는 용도에 관한 것이다. 또한, 이종 세포, 특히 이.콜리(E.coli) 박테리아 세포 중에서 특정 단백질의 발현 농도를 증가시키기 위해 사용된 재조합 DNA 기법을 이용한 핵산 서열의 조작 방법과 단백질 정제 기법을 포함하는 상기 조합물의 제조 방법은 단백질 생산 분야에 일반적으로 사용될 수 있는 것으로 본 발명의 또 다른 양태를 구성한다.
도 1aa 내지 도 1ad는 본 발명의 양태에 따라 HPV L2E7 융합 단백질을 발현하는 벡터의 뉴클레오티드 서열을 도시한 것이다.
도 1a 및 도 1b는 도 1a 내지 도 1d에 기재된 서열에서 개시 코돈 전과 종결 코돈 후에 존재하는 벡터의 서열을 도시한 것이다.
도 2a 내지 도 2c는 이에 상응하는 아미노산 서열을 도시한 것이다.
도 3은 도 1aa 내지 도 1ad 및 도 2a 내지 도 2c에 기재한 L2E7 융합 단백질을 정제하는데 있어서 본 발명의 양태에 따라 사용된 단백질 정제 절차를 도시한 것이다.
본 출원인들은 특정 HPV 유전자, 구체적으로 HPV-6 바이러스 유래의 L1, L2 및 E7 유전자를 분리하였다. 이 유전자 서열을 본 명세서에 기재된 바와 같이 사용하여 원핵계와 진핵계에서 HPV-6 단백질을 고 효율로 발현하는 유전자 융합체를 작제하였다.
이와 같은 목적을 위하여, HPV-6, L2 및 E7과 같은 전술한 폴리펩티드를 이.콜리 중에서 단독 융합 단백질로서 발현할 수 있는 플라스미드 벡터를 작제하였다.
HPV-6으로 감염된 우췌 조직의 단독 임상 분리물로부터 제조한 바이러스 DNA 시료를 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)으로 처리하여 HPV-6 바이러스 유전자를 증폭시켰다. 분리된 유전자를 사용하여 이종 계 중에서 HPV-6 유래의 단백질을 발현시키기 위한 유전자 융합 카세트를 작제하였다.
제조 방법을 개선시키기 위한 유전자 작제물을 다양하게 변형시켰다. 특히 유용한 변형은 다음과 같다.
1. 이.콜리 세포 중에서 단백질의 발현이 향상(페리플라즘으로 발현을 유도하는 것이 아님)되도록 암호 단백질 서열의 N 말단에 리더 서열("pelB 리더")을 도입시킨다.
2. 금속 킬레이트화 크로마토그래피로 단백질을 정제할 수 있도록 암호 단백질 서열의 C 말단에 서열("His-Tag")을 도입시킨다.
3. 융합 유전자의 전사가 조기 종결되는 것과 연관이 있는 서열을 없애기 위하여 티미딘 잔기의 스트레치를 변이시킨다. 이 변이는 암호화된 단백질의 서열에 영향을 미치는 것이 아니라 유전자 작제물의 DNA 서열에만 영향을 미치는데, 그 이유는 이 변이가 코돈의 축퇴성 제3 위치만을 돌연변이시키기 때문이다.
시험관내에서 단백질의 오픈 리딩 프레임의 전사 및 해독을 통해 작제물을 분석하였다. HPV-6 L2E7 융합 단백질의 경우에는, HPV-6 L2E7 유전자 융합 작제물을 시험관내에서 발현시켰을 때 전길이 단백질(80 kD)과 절두 단백질 생성물(70 kD)이 관찰되었고, 이와 같은 패턴은 생체내에서도 재현되었다. 표적 단백질의 절두 형태는 HPV-6 L2 서열 중에 티미딘(T) 잔기의 긴 스트레치가 존재함을 통해 확인할 수 있었다. 또한, 6개의 티미딘 잔기를 함유하는 또 다른 T 풍부한 영역이 확인되었다. DNA 서열은 변화시키지만 HPV-6 L2 단백질의 아미노산 서열은 변화시키지 않는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 상기 영역을 돌연변이유발시켰다. 이와 같이 돌연변이된 HPV-6 L2E7 유전자 융합체를 박테리오파지 T7 프로모터로부터 클로닝된 서열의 발현을 유도하는 플라스미드 발현 벡터(pET 발현계, 노바겐 제품) 중으로 서브클로닝하였다. 이와 같이 얻어진 플라스미드 작제물 중에서 HPV-6 L2E7을 발현하는 것으로 선택된, pGW53은 업스트림 리더 서열, pelB와 HPV-6 L2E7 ORF 및 HPV-6 융합 단백질의 C 말단에 "인 프레임(in frame) 방식으로 결합된" 6개의 히스티딘 잔기(His Tag)를 암호하는 다운스트림 서열을 암호하였다.
도 1aa 내지 도 1ad 및 도 2a 내지 도 2c
도 1aa 내지 도 1ad 및 도 2a 내지 도 2c에 도시된 서열 데이터는 업스트림 리더 서열과 다운스트림 태그 서열을 비롯하여, 본 명세서 중에 기재된 기법으로 만들어진 L2E7 융합 단백질의 바람직한 일 예인 뉴클레오티드 서열과 암호화된 아미노산 서열을 기재한 것으로, 본 발명이 이것에 국한되는 것은 아니다. 필요한 경우에는 태그 서열(aa 591 내지 601) 뿐만 아니라 리더 서열도 제외시킬 수 있다. 도 1a 및 도 1b는 바람직한 T7 발현 벡터 중에서 도 1aa 내지 도 1ad에 도시된 개시 코돈 앞과 종결 코돈 다음에 존재하는 비암호 서열을 도시한 것이다.
도 2a 내지 도 2c는 L2와 E7로 이루어진 바람직한 융합 단백질의 서열을 도시한 것이다. 1827개의 염기쌍으로 이루어진 DNA 서열 중에서, 7번에서 1812번(종결 코돈 포함)까지의 위치가 L2E7 융합 단백질과 태그를 암호한다. 도 1aa 내지 도 1ad 및 도 2a 내지 도 2c에 기재된 L2 및 E7에 상응하는 서열 영역은 공지된 L2 및 E7 각각의 아미노산 서열과 비교하여 몇몇 차이가 있음을 발견할 수 있다. 이와 같은 차이는 다음과 같다[앞에 기재된 아미노산은 도 1aa 내지 도 1ad과 도 2a 내지 도 2c에 도시된 서열 번호를 가진 아미노산 잔기이고, 뒤의 아미노산은 공지 서열의 해당 위치에 존재하는 (상이한) 아미노산이다].
105 Gly은 공지 서열에서 Gln이고, 215 Ile은 Val, 230 Ile은 Val, 373 Glu은 Asp, 381 Lys은 Glu, 386 Asp는 Gly, 422 Ile은 Leu, 544 Tyr은 Phe이다.
또한, 폴리뉴클레오티드 서열에서는 몇개의 "침묵" 차이, 즉 해독된 아미노산 서열에는 차이를 유도하지 않는 차이도 발견되었다. 이와 같은 차이는 본 발명에 크게 중요하지 않은 것으로 생각된다. 본 명세서를 통해 거론된 바와 같은 이유로 만들어진 TTTTTT로부터 TTCTTC로의 2개의 침묵 돌연변이는 아미노산 위치 83 내지 84와 483 내지 484에 위치하였다.
공지 서열과 정확히 대응되게 발현되고 본 명세서에 개시된 조성물 중에 포함되는 융합 단백질은 도 1aa 내지 도 1ad 및 도 2a 내지 도 2c에 기재된 바람직한 L2E7 융합 단백질과 교차 반응성이 매우 높았고, 교차 반응성인 면역 반응도 거의 유사하게 유도하거나 고도의 수준으로 유도하였다.
또한, HPV의 다른 임상 분리물에서 얻어진 서열로부터 유도된 L2E7 융합 단백질도 기능적으로 유사할 것이다. 즉, 이와 같이 다른 임상 환경에서 분리된 분리물은 본 명세서에 기재된 서열과 차이가 있을 수 있으나, 이러한 차이는 본 발명을 실시하는데 있어서 중요하지 않을 것으로 판단된다. 필요하다면, 특정 임상 분리물에서 발견되는 임의의 차이는 예컨대 전술한 바와 같이 만들어진 해당 클로닝 벡터에 부위 지시성 돌연변이유발을 실시하면 쉽게 제거할 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같이 얻어진 유전자 작제물은 이.콜리 세포에서 이종 단백질을 고효율로 발현할 수 있도록 최적화된 발현계에 삽입하였다. 이 발현계는 이.콜리 세포를 유의적인 밀도로 증식시킨 뒤, 이 세포 중에서 T7 폴리머라제를 유도하는 처리를 통해 유전자 작제물을 고효율로 전사시키는 시스템이다.
이와 같이 발현된 단백질 생성물은 이.콜리 세포 중에 존재하는 봉입체 내에 축적되었다. 따라서, 이.콜리 세포를 수거하고 박테리아 단백질로부터 목적하는 단백질을 정제하여 가용성 단백질 추출물로 제조하였다. 이 단백질 추출물은 수용액 중에 용해성인 단백질 분자의 고분자 응집체를 포함한다.
이와 같이 얻어진 정제 단백질은 특히 생식기 우췌를 치료하기 위한 치료용 항원 생성물로서 사용할 수 있다.
다음 실시예와 제시된 서열 데이터는 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것이 아니라 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것이다.
본 발명은 이하에 구체적으로 기재되는 파필로마바이러스 유래의 항원을 가진 폴리펩티드 응집체와 융합 폴리펩티드, 이를 함유하는 조성물 및 파필로마바이러스 특이적 면역 반응을 유도하기 위한 면역원 및 백신으로서의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 다음에 기재되는 바와 같이 상기 폴리펩티드를 제조, 처리 및 정제하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 파필로마바이러스 단백질의 항원성 결정인자를 함유하며, 용액이나 현탁액 상태에서 멸균 여과기를 통해 통과할 수 있는 응집 형태 또는 무정형의 응집 형태인 폴리펩티드 및 폴리펩티드 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 예컨대 2종 이상의 다른 파필로마바이러스 단백질에서 각각 유래된 파필로마바이러스 유래의 항원을 결합시킨 융합 폴리펩티드를 제공하며, 일 예로서, 이 폴리펩티드는 (a) 파필로마바이러스 L2 단백질의 최소한 항원성 결정인자와 (b) E1, E2, E4, E5, E6 및 E7 파필로마바이러스 단백질과 (a)와 다른 종류의 파필로마바이러스 유래의 L2 파필로마바이러스 단백질 중에서 선택되는 단백질의 최소한 항원성 결정인자를 함유한다. 이와 같이 얻어진 융합 폴리펩티드는 E1, E2, E4, E5, E6 및 E7 파필로마바이러스 단백질에서 선택된 2종 이상의 파필로마바이러스 단백질 유래의 항원성 결정인자를 더 포함하는데, 이와 같은 경우는 예컨대 상기 단백질이 상이한 파필로마바이러스 종에서 유래된 것일 때이다.
본 발명의 특히 바람직한 폴리펩티드와 그 조성물은 예컨대 HPV 6, 11, 16, 18에서 유래하는 인간 파필로마바이러스 단백질의 항원성 결정인자를 포함하는 것이다. 기타 다른 종류의 HPV에서 유래되는 단백질과 인간을 제외한 동물의 파필로마바이러스에서 유래되는 단백질의 항원성 결정인자도 역시 제조하여 사용할 수 있다.
보다 구체적으로 설명하면, 본 발명은 예컨대 최소한 2종의 상이한 HPV 단백질에서 얻은 항원성 결정인자를 함유하는 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명을 통해 제시된 파필로마바이러스 단백질의 항원성 결정인자는 예컨대 해당 파필로마바이러스 단백질의 전 서열 또는 바람직한 경우에는 예컨대 해당 단백질의 전 서열 중 25% 이상, 예컨대 50% 이상 또는 75% 이상을 함유하는 서열 단편, 예컨대 N-말단 서열이나 C-말단 서열의 단편과 같은 준서열로 제공된다. 서열은 임상용 파필로마바이러스 분리물에서 얻거나 공지 서열 또는 이의 뮤테인일 수 있다.
항원성 결정인자가 상기 융합 폴리펩티드의 일부를 형성할 수 있는 것인, HPV 단백질은 예컨대 L1, L2, E1, E2, E4, E5, E6 및 E7 단백질 중에서 선택할 수 있다. 또한, 예컨대 (인간) 파필로마바이러스 유형 HPV 6, 11, 16 및 18의 단백질 뿐만 아니라 기타 다른 인간이나 동물의 파필로마바이러스종의 단백질도 사용할 수 있다. 따라서, 2종 이상의 파필로마바이러스 단백질의 항원성 결정인자는 예컨대 L2와 기타 다른 단백질 및/또는 E7과 기타 다른 단백질의 결정인자일 수 있다.
구체적인 예로서, 본 발명의 폴리펩티드는 2종 이상의 상이한 파필로마바이러스 단백질에서 각각 유래되는 항원성 결정인자와, 이와 동일하거나 또는 상이한 파필로마바이러스 유형에서 유래되는 단백질의 항원성 결정인자를 최소한 함유할 수 있다. 예컨대, 상기 단백질 중 최소한 1종은 L1 또는 L2에서 선택할 수 있고(또는), 상기 단백질 중 최소한 1종은 E1, E2, E4, E5, E6 및 E7 중에서 선택할 수 있다.
다른 구체예로서, 본 발명은 HPV L2 단백질의 항원성 결정인자와 HPV E7 단백질의 항원성 결정인자를 포함하며, 적합하게는, 예컨대 HPV 유래의 거의 전길이 L2 및/또는 E7 단백질이나 이의 항원성 단편 또는 뮤테인을 함유하는 폴리펩티드를 제공한다.
HPV의 L2 단백질과 E7 단백질을 함유하는 융합 단백질은 각 L2 단백질과 E7 단백질의 전 길이 중 50% 이상의 서열 단편, 예컨대 L2 와 E7의 거의 전 서열을 포함할 수 있으며, 선택적으로 L1 단백질의 서열을 더 포함할 수도 있다.
이 폴리펩티드는 기타 다른 HPV 단백질의 항원성 결정인자를 더 함유하거나 또는 기타 다른 HPV 단백질이나 단백질의 단편과 혼합되거나 응집될 수 있는데, 그 예로는 L1이나 파필로마바이러스 암호 단백질 중 L 단백질계와 E 단백질계의 다른 성분을 함유할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 L2와 E7의 융합체 또는 L2, E7 및 L1의 융합체로 이루어진 단독 단백질을 포함할 수 있다. 그 외에도, 본 발명의 폴리펩티드는 예방 또는 치료용으로서 유용한 L1 단백질과 조합된 L2-E7 융합체를 포함할 수 있다.
이 폴리펩티드는 융합 분자이거나, 또는 함께 결합되거나 응집된 폴리펩티드 각각으로부터 유도될 수도 있다. 폴리펩티드의 가용성 형태 또는 가용화된 형태 역시 본 발명의 범위에 속한다.
특정 구체예로서, 이 폴리펩티드는 공지의 방법, 예컨대 노출된 티로신 잔기나 리신 잔기의 입실론 아미노기 또는 아스파테이트 잔기와 글루타메이트 잔기의 카르복실기에 대한 공유 결합을 비롯한 표준 기법을 통해 화학 가교 결합으로 커플링시킬 수 있다. 하지만, 바람직한 구체예는 제1 파필로마바이러스 단백질의 전체 아미노산 서열 중 일부를 암호하는 제1 부분과 제2 파필로마바이러스 단백질의 아미노산 서열 중 일부 또는 전체 서열을 암호하는 제2 부분을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 재조합 숙주 세포에서 발현시켜 각각 얻는 융합 단백질이다.
구체적으로, 본 발명은 2종 이상의 상이한 파필로마바이러스 단백질 각각에서 유래되는 항원성 결정인자를 함유하며, 용액이나 분산액 상태일 때 멸균 여과기, 예컨대 소공의 크기가 0.16 내지 0.22 미크론, 예컨대 0.2 미크론인 여과기를 통해 통과할 수 있는 응집 형태인 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명은 예컨대 2 종 이상의 상이한 파필로마바이러스 단백질, 예컨대 L2 또는 L1과, 이외에 다른 L1, L2, E1, E2, E4, E6 및 E7 중 최소한 1가지에서 각각 유래되는 항원성 결정인자를 함유하며, 용액이나 분산액 상태일 때 멸균 여과기, 예컨대 소공 크기가 0.16 내지 0.22 미크론 범위, 예컨대 0.2 미크론인 여과기를 통해 통과할 수 있는 재응집 형태인 폴리펩티드를 제공한다.
적합한 제조물 형태는 예컨대 변성, 또는 환원 변성시킨 뒤, 예컨대 재조합 숙주 세포에서 봉입체 형태로 발현되는 융합 단백질 또는 기타 다른 파필로마바이러스 단백질, 예컨대 단독 파필로마바이러스 단백질인 폴리펩티드를 재응집시켜 얻을 수 있다. 이와 같은 형태는 예컨대 백신용으로서 비교적 쉽게 정제할 수 있어 바람직하다.
그 외에도, 폴리펩티드의 응집 제조물은 멸균하기 위하여 여과할 필요가 없이 무균 기법으로 제조, 정제할 수 있다는 장점이 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 응집 또는 재응집된 폴리펩티드는 예컨대 질량이 약 100,000 달톤, 예컨대 160,000 내지 10,000,000 달톤 범위일 수 있다. L2E7 이량체의 분자량은 약 130,000이다. 이 응집체의 직경은 전자현미경으로 조사해 본 결과, 약 4 내지 50 nm, 예컨대 10 내지 15 nm이었다.
하기 실시예를 통해 구체적으로 기재한 본 발명에 따른 폴리펩티드의 예로는 질량이 약 500,000 달톤이고 전자현미경 측정시 직경이 약 10 내지 15 nm 또는 15 내지 20 nm인 응집체를 함유하고, 응집체 당 약 7 내지 10개, 예컨대 약 8개의 L2E7 융합 폴리펩티드 사슬을 가진 재응집된 L2E7 융합 폴리펩티드를 포함한다. 보다 일반적으로는 응집체 입자 당 약 2 내지 200개, 예컨대 5 내지 50개 사슬을 함유할 수 있고, 응집체 제조물은 일정 범위의 입자 크기를 가진 입자를 조성물 중에 포함할 수 있다.
재응집은 예컨대 우레아(약 8M 우레아)와 티올 환원제(예컨대 약 10 mM 디티오쓰레이톨)(재응집 성성물 중에서는 약 0.1 mM 이하, 예컨대 약 0.04 mM 이하로 저하되는 것이 바람직함) 중에서 융합 폴리펩티드를 변성 및 환원시킨 제조물로부터 우레아와 티올 환원제(보통 예컨대 디티오쓰레이톨, 또는 기타 다른 허용되는 티올 환원제, 예컨대 글루타치온)를 서서히 또는 점차적으로 제거하여 형성시키는 것이 적합하다. 이와 같은 점차적인 제거는 예컨대 하기 상세히 기재되는 컬럼 크로마토그래피 절차를 통해 얻을 수 있다. 변성 및 환원된 융합 폴리펩티드 제조물은 예컨대 이.콜리 T7 시스템에서 상기 폴리펩티드를 발현시키면 생성되는 초기 불용성 봉입체를 우레아와 티올 환원제 중에 용해시키면 얻을 수 있다.
이와 같이 응집된 용해성 또는 분산성 생성물은 보통 무정형이고, L1 단백질이 없으며, 그 외에도 곤충 세포나 효모 세포 중에서 재조합 바큘로바이러스 같은 발현계 중의 HPV 유전자(L1 포함) 발현 결과로 생성되는 것으로 보고된, 파필로마바이러스 L1 단백질(및 때로는 기타 다른 파필로마바이러스 단백질도 포함)계의 바이러스 유사 입자와는 구별된다. 예컨대, 상기 바이러스 유사 입자는 가용화 변성 및 티올 환원에 이어 재응집시킨 형태로서 개시된 적은 없다.
전술한 폴리펩티드는 재조합 DNA 기법을 사용하여 적합하게 제조할 수 있다. 따라서, 본 발명은 전술한 폴리펩티드를 암호하는 핵산, 이 핵산 및 핵산의 일부를 포함하는 클로닝 벡터 및 발현 벡터, 이 핵산이 병입되어 단백질로서 발현될 수 있는 형질감염 및 형질도입된 숙주 세포를 제공한다. 일 예로서, 핵산은 예컨대 임상 표본인 생식기 우췌로부터 얻은 HPV-6 분리물에서 분리된, 예컨대 L2 및 E7 유전자를 함유하는 융합 유전자를 포함하는 것이 바람직하다.
전술한 폴리펩티드는 재조합 DNA 기법을 사용하여 원핵 숙주 또는 진핵 숙주 중에서 상기 핵산을 발현시켜 제조하는 것이 바람직하다.
구체적으로 설명하면, 적합한 오픈 리딩 프레임으로서 목적하는 폴리펩티드를 암호하는 핵산을 소정의 발현계에서 발현시키기에 적절한 임의의 부속 서열과 함께 적합한 벡터계에 병입시킨다. 이 벡터로 숙주 세포를 형질전환시킨다. 그 다음 하기 실시예에 기재된 바와 같이, 형질전환된 숙주 세포를 배양하고 이 배양물의 상청액이나 세포로부터 목적하는 폴리펩티드를 분리한다. 이와 같은 벡터 뿐만 아니라 형질전환된 숙주 세포도 본 발명의 다른 양태를 구성한다.
본 발명을 통해 제공되는 폴리펩티드의 발현에 대해서는 종래 HPV 유래의 유전자를 발현시키는 것으로 보고된 바 있는 효모 및 바큘로바이러스 발현계에서 조사하였다. 그 결과, 두 발현계에서 모두 전길이의 분자를 발현시킬 수 있었으나, 발현율은 때로 낮은 것으로 밝혀졌다. 따라서, 발현율을 높이기 위해 본 발명에서는 시험된 2가지 진핵계(효모 또는 바큘로바이러스) 보다는 원핵 숙주 발현계(구체적으로, 이.콜리 T7계)를 사용하는 것이 좋다.
본 발명을 통해 제공되는 면역원성 폴리펩티드 및 백신 조성물은 예컨대 파필로마바이러스 관련 질환의 예방 또는 치료용 백신으로서 HPV 특이적 면역 반응을 유도해 내는데 유용하다. 이 면역원, 예컨대 HPV 관련 질환의 예방 또는 치료에 유용한 면역 치료용 또는 면역 예방용 백신은 면역 반응, 예컨대 생식기 우췌(특히, 생성물과 감염이 HPV 유형 6 및/또는 11에 의한 경우) 또는 경부 상피내 신형성(특히, 생성물과 감염이 HPV 유형 16 및/또는 18에 의한 경우)을 비롯하여 만성 HPV 감염의 퇴행을 매개할 수 있는 세포 면역성과 관련된 반응을 형성시키는데 사용할 수 있다. 이와 같은 면역 반응은 예컨대 적당한 보조제를 사용하면 T 세포, 예컨대 CD4+ 세포를 표적으로 하여 형성시킬 수 있다.
따라서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 폴리펩티드를 유효량으로 환자에게 투여하는 것을 포함하여 HPV 감염이나 이와 관련된 병소를 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명을 통해 제공되는 구체예로는 본 명세서에 기재된 폴리펩티드를 주성분으로 하는 백신 제제를 포함하며, 이 백신 제제는 인간 생식기 우췌 및 경부 상피내 신형성의 예방 및 치료용으로서, 특이성에 따라 파필로마바이러스, 예컨대, HPV 유형 6 및 11의 파필로마바이러스, HPV 유형 16 및 18의 파필로마바이러스에 대한 면역 반응을 유도하는데 사용된다.
상이한 종류에 속하는 HPV가 서로 교차 반응하는 것으로 관찰되었으며, 이와 같이 관찰된 교차 반응성에 따라 생성되는 폴리펩티드와 백신은 각각의 기원인 파필로마바이러스 유형과 다른 유형의 파필로마바이러스에 대해 면역 반응을 유도하는데 유용하게 사용할 수 있다.
본 발명은 면역학적 보조제와 같은 담체를 함유하여 주입 투여하기에 적합한 전술한 폴리펩티드의 면역원성 조성물을 제공한다. 구체적인 바람직한 예로서, 보조제로는 다음에 보다 상세히 기재되는 수산화알루미늄 및/또는 모노포스포릴 지질 A를 포함한다.
예컨대, 인간이나 인간을 제외한 동물에 대해 치료 또는 예방용 백신으로서 사용할 수 있는 전술한 바와 같은 면역원성 조성물은 "명반"[즉, 백신 보조제로서 통상 사용되는 수산화알루미늄, 보통 Alhydrogel(TM) 또는 Rehydrogel(TM)]과 이 위에 전술한 바와 같이 얻을 수 있는 폴리펩티드를 흡착시킨 흡착 복합체를 포함한다. 이와 같은 흡착 복합체는 명반과 폴리펩티드로 이루어진 2중 복합체이거나, 예컨대 하기 기재되는 MPL과 같은 성분을 더 함유하여, 예컨대 MPL, 명반 및 폴리펩티드의 3원 복합체를 만들 수도 있다.
본 발명에 따른 용해성 또는 응집성 폴리펩티드는 직접 백신으로 사용하거나 또는 약학적 허용성 부형제, 완충액, 보조제 또는 기타 다른 허용성 물질을 더 함유하는 약학적 조성물로서 투여할 수도 있다. 따라서, 본 발명은 전술한 폴리펩티드를 적합한 담체 또는 부형제와 함께 함유하는 약학적 조성물이나 백신을 제공한다.
폴리펩티드는 예컨대 L2E7의 용해성 단량체이거나 또는 폴리펩티드 응집물일 수 있다. 폴리펩티드, 예컨대 L2E7 융합 단백질은 치료 항원으로서 그 효과를 증가시키고 수용 환자 중에 바람직한 유형의 면역 반응을 자극하기 위하여 보조제 또는 면역자극 분자와 같은 기타 다른 부속 물질을 혼합하여 조제하는 것이 바람직하다. 유용한 보조제로는 수산화알루미늄("명반"), 예컨대 Alhydrogel(TM) 또는 Rehydrogel(TM) 형태; 예컨대 미국 특허 제4,912,094호(Ribi Immunochem Research: KR Myers and AT Truchot: 변형된 리포폴리사카라이드, 탈-3-O-아실 모노포스포릴 지질 A를 주성분으로 하는 보조제에 관하여 개시함) 또는 WO 94/21292(Smithkline Beecham: P Hauser et al : 3-O-탈아실화된 모노포스포릴 지질 A를 함유하는 백신 조성물)에 기재된 바와 같이 사용할 수 있는, 예컨대 미국 특허 4,912,094에 기재된 바와 같은 3D-MPL(3-탈아실화된 모노포스포릴 지질 A)을 포함하며, 이것에 국한되는 것은 아니다. 명반과 MPL을 모두 사용하는 경우에는, 먼저 단백질을 명반에 흡착시키고 그 다음 MPL을 첨가하는 것이 바람직하다. 또한, 트레할로스 디미콜레이트와 같은 트레할로스 디에스테르; 사포닌과 이들의 유도체, 예컨대 WO 88/09336(Cambridge Bioscience: CA Kensil et al: 사포닌 보조제) 및 WO 93/05789(Cambridge Biotech: CA Kensil et al: 사포닌-항원 접합체)에 기재된 바와 같은 Quil A 또는 QS-21; 예컨대 WO 90/03184(B Morein et al: Iscom matrix with immunomodulating activity, comprising lipid and optionally also adjuvants) 및 WO 92/21331(Kabi Pharmacia AB: B Morein et al: Pharmaceutical carriers comprising sterol and saponin)에 기재된 바와 같은 ISCOMS 또는 ISCOM 기질; 또는 뮤라밀 디펩티드 또는 콜레라 독소 B도 사용할 수 있다. 또한, 이와 관련하여 유용한 부속 분자 또는 면역자극 분자로는 인터루킨과 같은 시토킨, GM-CSF, IL-3, IL-2, IL-12 및 IL-7을 포함하며, 이것에 국한되는 것은 아니다. 이와 같은 보조제 및/또는 기타 다른 부속 물질은 각각 사용하거나 또는 필요한 경우에는 혼합하여 사용할 수도 있다.
본 발명을 통해 제공되는 백신과 같은 약학적 조성물은 예컨대 허용되는 광유나 또는 탄화수소유(예컨대 스쿠알렌 등), 또는 WO 91/00106과 WO 91/00107(SEPPIC: B Brancq et al: 주입가능한 다중상 유탁액 및 연속 오일상을 함유하는 유탁액 벡터에 대하여 기재하고 있음)에 기재된 바와 같은 생물분해성 광유 중에 유탁시킨 형태이거나; 또는 예컨대 생물분해성 미립자 또는 리포좀이나 비이온성 계면활성제 소포 중에 캡슐화한 캡슐 형태일 수 있으며, 이와 같은 기법은 각각 예컨대 WO 94/27718(DT O'Hagan et al: microparticles containing entrapped antigens and their use in immunization) 및 WO 93/19781(PCT/GB93/00716) (Proteus Molecular Design: J Alexander et al: Vaccines containing non-ionic surfactant vesicles with entrapped antigen)을 참조하라.
폴리펩티드는 치료용 또는 예방용으로 사용할 수 있다. 투여 경로와 절차로는 예컨대 표준 방법인 근육내, 경피, 피내, 정맥내, 경구 또는 직장을 통한 경로와 절차를 포함하며, 이것에 국한되는 것은 아니다.
폴리펩티드의 투여량은 제형과 치료 질환에 따라 선택한다. 일반적으로, 투여량은 단백질 1 내지 2000 ㎍, 바람직하게는 10 내지 300 ㎍, 예컨대 10 내지 250 ㎍이 보통이다. 최적량은 환자에 따라 쉽게 결정할 수 있다. 백신은 1회 이상의 투여량으로 일정 간격을 두고 투여할 수 있다(예컨대 실시예 13 참조). 이 섭생법의 최적 조건은 환자에 따라 쉽게 결정할 수 있다.
대안적으로, 상기 폴리펩티드를 암호하는 핵산은 적합한 재조합 바이러스 벡터에 삽입한 뒤 숙주, 예컨대 인간에게 도입시켜 핵산의 발현을 통해 동일계 중에서 폴리펩티드를 생성하도록 할 수 있다. 이와 같은 재조합 바이러스 벡터에 기본적으로 사용할 수 있는 적합한 바이러스의 예로는 예컨대 WO 92/05263(Immunology Ltd: SC Inglis et al) 및 WO 92/16636(Immunology Ltd: MEG Boursnell et al)에 기재된 바와 같은 바이러스를 포함한다.
본 명세서에 기재된 HPV 관련 폴리펩티드를 함유하는 백신은 다양한 HPV 특이적 면역 반응을 활성화시킬 수 있다. 이와 같은 면역 반응은 HPV6 및 HPV11 중화 항체를 비롯한 특정 항체와, HPV6 및 HPV11 특이적 림프증식성 반응, 지연형 과민 반응, 세포독성 T 세포 및 시토킨 생성을 비롯한 세포 매개 면역을 포함할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드를 발현시키기에 적합한 벡터를 제조하는 과정에서 본 출원인은 이종 세포, 특히 이.콜리 박테리아 세포 중에서 특정 폴리펩티드를 높은 발현율로 생성할 수 있는 기법을 마련하였다.
따라서, 또 다른 양태로서 본 발명은 목적하는 폴리펩티드를 암호하지만 전사나 해독을 조기 종결시키는 코돈이나 코돈 군을 축퇴 코돈으로 치환 변이시킨 핵산 서열을 박테리아 세포 중에서 발현시키는 것을 포함하는, 재조합 폴리펩티드의 제조 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 출원인은 이.콜리의 T7 발현계에서 [TTT]n(여기에서 n은 2 이상임)과 같은 1개 이상의 폴리 T 서열을 제거하면, 예컨대 이와 같은 서열을 동일한 아미노산을 암호하는 허용되는 대체 서열, 예컨대 [TTC]n서열로 치환시키면 전사 또는 해독의 조기 종결 빈도를 효과적으로 방지 또는 감소시켜 목적하는 폴리펩티드를 고수율로 얻을 수 있음을 발견하였다.
T7 계와 같은 박테리아 발현계에서 재조합 폴리펩티드는 세포 중의 불용성 응집물이나 '봉입체'(IB)로 발견된다. 따라서, 본 출원인은 상기 재조합 폴리펩티드를 회수하는 개선된 방법을 마련하였다.
즉, 또 다른 양태로서 본 발명은 불필요한 물질, 예컨대 분쇄된 세포 파편과 함께 봉입체를 함유하는 현탁액을 교차류 여과(cross-flow filtration) 방식으로 처리하고, 이와 같이 분리된 봉입체로부터 재조합 폴리펩티드를 회수하는 것을 포함하여, 원핵 숙주 세포 중의 봉입체로부터 재조합 폴리펩티드를 회수하는 방법을 제공한다. 이 기법은 세포 균질액 중에 존재하는 봉입체를 기타 다른 세포 파편으로부터 분리하고 이와 동시에 봉입체를 세척하는 복합 효과를 갖고 있어 유용한 정제도를 제공하는 방법이다.
이 방법의 바람직한 구체예로서, 분리된 봉입체는 이어서 동일계에서 용해시키고, 이 용액으로부터 폴리펩티드를 회수한다. 용해 시약의 예로는 우레아 및 우레아와 디티오쓰레이톨 또는 기타 다른 설프히드릴 환원제의 혼합물을 포함하며, 예컨대 약 8M 내지 10M 농도로 사용된다.
목적하는 발현된 폴리펩티드를 봉입체 형태 중에 함유하는, 숙주 세포 파쇄액인 미정제 현탁액은 동일한 여과 장치 중에서 2 단계로 교차류 여과를 실시하는 것이 특히 편리하며, 상기 2 단계 중 제1 단계에서는 목적하는 봉입체가 여과시 잔류하고 이 여과 잔류물 중에서 비용해 조건하에 세척되며, 제2 단계에서는 상기 봉입체가 용해 액체와 접촉한 뒤, 이 액체(예컨대 선택적으로 디티오쓰레이톨과 같은 설프히드릴 환원제를 함유하는 8M 내지 10M 우레아)와 함께 여과액으로 수집된다. 이후, 용해제의 제거와 재응집을 실시하는 것이 유용하다.
본 발명에 따른 단백질 제조물의 구체적인 예는 HPV-6계 L2E7 단백질을 함유하는 융합 단백질을 포함할 수 있다. 이 단백질은 이.콜리 세포 중에서 적절하게 발현시킨 뒤, 균질하게 정제하고, 그 다음 명반과 같은 보조제를 이용하여 조제한다. 이 제조물은 생식기 우췌의 치료에 유용하며, 투여 환자에게 비경구 주입으로 투여하기에 적합한 형태로 조제할 수 있다.
또한, 본 발명은 첨부되는 도면을 참조로 하여 다음 실시예를 통해 보다 상세히 설명될 것이다.
실시예 1: HPV-6 유전자의 증폭 및 클로닝
HPV-6의 표준 프라이머를 가지고 문헌[Snijders et al., 1990, Journal of General Virology, 71: pp 173-191]에 기재된 방법을 변형시킨 방법을 사용하여 PCR을 통해 감염 조직 중에 존재하는 HPV 유형의 바이러스 DNA를 추론하였다.
유전자 분리가 용이한 이유로 치료 실체물의 개발을 위해 선택한 단독 임상 분리물(H26)로부터 바이러스 DNA 시료를 준비하고, 이로부터 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 실시하여 HPV-6 L1, L2 및 E7 유전자를 증폭시켰다. 임상 분리물의 종류는 중요한 것이 아니며, 통상적인 HPV-6 임상 분리물이라면 어떤 분리물이라도 동일하지는 않지만 실질적으로 등가물로서 간주할 수 있다. PCR 반응에 사용된 올리고뉴클레오티드 프라이머는 목적하는 유전자 서열에 대해 정확한 상동성을 나타내는 24개의 뉴클레오티드 뿐만 아니라 제한 효소 부위를 암호하거나 실질적인 유전자 융합물 사이의 리딩 프레임을 유지하거나 최종 발현 작제물 중에 종결 코돈을 도입시키기 위하여 첨가되는 부가 뉴클레오티드를 암호한다. 사용된 올리고뉴클레오티드의 예는 다음과 같다.
JPC08 CAGTGTCGACGGTCTTCGGTGCGCAGATGGGACA 서열 번호 1
(방향성 클로닝에 이용하기 위한 SalI 부위와 HPV 7 E7 유전자를 증폭시키기 위한 비암호성 가닥인 올리고뉴클레오티드 프라이머).
L1, L2 및 E7 유전자의 증폭 반응으로부터 얻어진 단독 PCR 생성물을 서열 분석 반응에서 주형 DNA로서 사용하여 3가지 유전자 각각에 대한 콘센서스 서열을 만들었다. 이 콘센서스 DNA 서열은 바이러스 DNA 추출물 중에 존재하는 유전자의 실제 DNA 서열을 정확히 반영할 것으로 추정되는데, 그 이유는 이 DNA 서열이 많은 개개의 주형 분자로부터 생성된 서열이기 때문이다.
PCR을 통해 HPV-6 바이러스 DNA로부터 약 1400 bp의 단독 생성물로서 HPV-6 L2 유전자를 증폭시켰다. 이 생성물을 아가로스로부터 정제하여 DNA 서열 분석의 주형으로 사용하고, 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 L2 증폭 유전자의 콘센서스 서열을 만들었다.
이와 같이 정제된 L2 생성물을 벡터 pGEM-T 중에 직접 서브클로닝하여 플라스미드 pGW12를 만들었다. 서브클로닝된 L2 유전자의 전체 DNA 서열은 콘센서스 서열 제조시 사용했던 것과 동일한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 pGW12 주형 DNA로부터 제조하였다. 클로닝된 L2 유전자의 DNA 서열은 콘센서스 서열과 동일한 것으로 나타났다. 또한, PCR을 통해 HPV-6 바이러스 DNA로부터 약 300 bp의 단독 생성물로서 HPV-6 E7 유전자를 증폭시켰다. 이 생성물을 아가로스로부터 정제하여 DNA 서열 분석의 주형으로 사용하고, 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 증폭 유전자의 콘센서스 서열을 만들었다.
이와 같이 정제된 E7 PCR 생성물을 벡터 pGEM-T 중에 직접 서브클로닝하여 플라스미드 pGW04를 만들었다. 서브클로닝된 E7 유전자의 전체 DNA 서열은 콘센서스 서열 제조시 사용했던 것과 동일한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 pGW04 주형 DNA로부터 제조하였다. 클로닝된 E7 유전자의 DNA 서열은 콘센서스 서열과 동일한 것으로 나타났다.
PCR을 통해 HPV-6 바이러스 DNA로부터 약 1500 bp의 단독 생성물로서 HPV-6 L1 유전자를 증폭시켰다. 이 생성물을 아가로스로부터 정제하여 DNA 서열 분석의 주형으로 사용하고, 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 증폭 유전자의 콘센서스 서열을 만들었다.
이와 같이 정제된 L1 PCR 생성물을 벡터 pGEM-T 중에 직접 서브클로닝하여 플라스미드 pGW-A를 만들었다. 서브클로닝된 L1 유전자의 전체 DNA 서열은 콘센서스 서열 제조시 사용했던 것과 동일한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 pGW-A 주형으로부터 제조하였다. 클로닝된 E7 유전자의 서열은 콘센서스 서열과 동일한 것으로 나타났다.
PCR 생성물을 실리카 매트릭스에 결합시켜 아가로스 겔로부터 정제한 뒤, pGEM-T 벡터 DNA에 결찰시켰다. 이 결찰 반응의 생성물을 사용하여 이.콜리 DH5a 세포를 형질전환시켰다. 재조합 클론을 분리하고 PCR을 기본으로 하는 방법으로 정확한 HPV-6 유전자 삽입물을 더 선별하였다.
이와 같이 클로닝된 HPV-6 L2 및 E7 유전자의 DNA 서열을 얻어서 초기 PCR 생성물로부터 직접 생성된 콘센서스 서열과 비교하였다. 콘센서스 서열과 일치하는 서열을 가진 클론을 사용하여 재조합 단백질 발현 카세트를 작제하였다.
실시예 2: EMBL 데이타베이스와 HPV-6 서열의 비교
콘센서스 서열을 HPV-11, HPV-16 및 HPV-18을 비롯하여 근연성이 큰 HPV 유형의 서열 뿐만 아니라 유럽 분자 생물학 실험실(EMBL) DNA 데이타베이스에서 얻은 HPV-6b의 공지 서열과 비교하여 증폭된 유전자가 HPV-6 유형의 바이러스로부터 유래되는 것인지를 확인하였다.
이 비교 실험에는 EditSeq, SeqMan, Megalign 및 Protean 프로그램을 사용하는 Lasergene Navigator 소프트웨어(DNAStar Inc.)로 실시하였다. 비교 대상은 상기 3가지 유전자의 DNA와 이로부터 추론되는 아미노산 서열을 사용하였다.
이와 같은 분석 결과, 증폭된 L2, L1 및 E7 유전자는 HPV-6 유형의 바이러스에서 유래된 것임을 확인하였다. 이와 같은 결과로부터 유전자 서열이 고도로 보존적이더라도 추론 서열에는 많은 변화가 나타날 수 있음을 알 수 있었다.
따라서, 본 발명에 사용하기에 적합한 작제물은 야생형 임상 HPV 분리물의 DNA로부터 만들 수 있다.
실시예 3: 발현 카세트 작제
L2 및 E7의 각 유전자를 다음과 같은 방식으로 조립하여 융합 분자를 만들었다. L2 유전자와 E7 유전자에 PCR 증폭을 통한 클로닝으로 새로운 N-말단 및 C-말단 제한 효소 부위를 만들었으며, 단 단백질 서열은 그대로 유지되도록 하였다. 그 다음 표준 재조합 DNA 기법을 사용하여 상기 유전자 서열들을 함께 두 서열의 오픈 리딩 프레임이 잘 유지되도록 클로닝 벡터 중에 결찰시켜 L2E7 융합 유전자를 만들었다. L2E7 융합 유전자는 다음과 같이 작제하였다.
먼저, HPV-6 L2 유전자를 BamHI 및 NcoI로 처리하여 BamHI 및 NcoI 부위가 인접된 1.1 kb의 PCR 단편으로 제조하였다. 이 PCR 단편을 pGEM-T 클로닝 벡터에 서브클로닝하였다. 필요한 삽입체를 함유하는 클론을 상기 2가지 효소로 분해하여 L2 유전자를 해리시키고, 아가로스 겔 분리한 다음 유리 밀크를 통해 추출시켜 정제하였다. 이와 유사한 방식을 통해 HPV-6 E7 유전자는 300 bp의 NcoI-SalI 단편으로 생성되었으며, 이를 pGEM-T에 서브클로닝하였다. 이와 같은 2가지 유전자 단편을 함께 결찰시켜 L2E7 융합 단백질을 암호하는 1.4 kb의 BamHI-SalI DNA 단편을 얻었다.
이와 같이 얻어진 BamHI-SalI DNA 단편을, 그 다음 카나마이신 내성이 있는 비발현성 클로닝 벡터인 pET16b의 유도체 중에 결찰시켰다. 생성된 작제물을 pGW48로 표시하였다. 그 다음, L2E7 유전자 융합체를 발현성 pET 벡터로 전이시키고, 이.콜리에서 단백질이 발현되는지 분석하였다.
이.콜리에서 융합 유전자가 발현되는지 분석한 다음, 전사의 조기 종결을 일으킬 것으로 생각되는 T 잔기의 스트레치를 제거하기 위하여 전술한 바와 같이 유전자 돌연변이를 실시하였다.
그 다음, L2E7 융합 유전자를 PCR로 변형시켜, 5' 말단에 인프레임 pelB 리더 서열을, 3' 말단에 인프레임 His Tag를 함유하는 발현 벡터에 유전자 카세트를 삽입할 수 있는 BamHI 및 NotI 말단을 만들었다. 이 PCR 단편을 pGEM-T 벡터를 통해 클로닝하고, 마지막에는 pET22b 유래의 pET 벡터로 전이시켰다. 이와 같은 최종 작제물을 pGW53으로 표시하였다.
조립 후, 융합 작제물을 pET 벡터로 알려진 일련의 원핵 발현 벡터로 전이시켰다. 공지의 pET 벡터는 강한 벡테리아파지 T7 전사 시그널과 해독 시그널을 갖고 있다. 그 다음, 숙주 세포 중에 T7 RNA 폴리머라제의 기질을 제공하여 유도성 lacUV5 프로모터의 조절하에 발현을 유도하였다. 그 후, 유도제인 IPTG를 첨가하면 세포의 성분이 표적 유전자 발현으로 변환된다. 따라서, 목적 생성물을 총 세포 단백질의 50% 이상으로 함유할 수 있다. 더욱이, 이 발현계는 유도성이기 때문에 유도 이전에는 표적 유전자 서열을 전사 침묵 상태로 유지할 수 있어, 숙주 세포에 대해 강력한 독성인 유전자 서열의 발현에도 이용할 수 있다.
따라서, 표적 유전자를 함유하는 pET 벡터로 형질전환시킨 세포를 급속하게 성장시킨 배양물에 IPTG를 첨가하면 폴리머라제 효소가 유도되고 이에 수반하여 클로닝된 유전자가 발현된다. 그 결과 단백질 생성물은 분비되거나, 전술한 HPV 유전자 생성물의 경우에는 봉입체로 유도된다.
클로닝 단계는 다음과 같은 올리고뉴클레오티드를 사용하는 PCR 돌연변이유발을 통해 유전자 단편의 각 말단에 Bgl II 제한 효소 부위를 도입시켜 실시하였다.
NRW170 GTCGACAGATCTGGCACATAGTAGGGCCCGA 서열 번호 2
(pET 벡터에 HPV 6 L2E7을 PCR 클로닝하기 위한 올리고뉴클레오티드. HPV 6 L2의 N-말단에 BgIII 부위가 도입됨. pET 리더 서열(pelB)에 융합시키기 위한 메티오닌 코돈이 필요치 않음.)
DNA 서열 분석은 다음과 같이 실시하였다. L2E7 융합 유전자를 N-말단 서열과 C-말단 서열이 각각 다른 pET11b, pET12b, pET16b 및 pET22b 벡터에 결찰시켰다. 그 다음 이 재조합 플라스미드를 사용하여 적당한 숙주 세포인 T7 폴리머라제의 유전자를 함유하는 HMS174를 형질전환시켰다. 기본 발현율을 억제하는 엄중도(stringency)가 상이한 기타 다른 숙주 세포도 이용가능하며 이 방법에 성공적으로 사용되었다.
실시예 4: 이.콜리에서의 L2E7 작제물 발현
형질전환 평판으로부터 개개의 박테리아 콜로니를 채취하여 2YT 배지 2 ㎖ 일정량에 접종하였다. 이 배양액을 2 시간 동안 증식시킨 뒤, 가온 배지 12 ㎖를 함유하는 배양물에 접종하였고, 이 때 접종물의 부피는 600 nm에서 광학 밀도를 측정하여 일정 수의 박테리아가 되도록 제공하였다. 배양물은 광학 밀도가 0.6이 될 때까지 증식시키고, 그 다음 배양물을 5.0 ㎖씩 2개로 분할하였다. 배양물 1개에는 IPTG를 추천 농도인 1.0 mM로 첨가하고, 두 배양물 모두 동일 조건하에서 3 시간 동안 배양하였다.
배양 시간 마지막에 박테리아를 얼음으로 옮기고 광학 밀도를 측정하였다. 박테리아 배양물을 15 ㎖ 팔콘 튜브 중에서 4,000 rpm으로 10 분 동안 원심분리하여 수거하였다. 상청액을 제거하고 박테리아를 TE 중에 최종 부피가 0.5 ㎖가 되도록 현탁시켰다.
SDS-PAGE 분석은 다음과 같이 실시하였다.
시료를 동량의 환원성 전기영동 시료 완충액에 첨가하고, 100 ℃에서 10 분 동안 가열하였다. 그 다음 시료 50 ㎕를 5 내지 15% 폴리아크릴아미드 겔에 장입하여 10 mA에서 12 시간 동안 전기영동하였다. 10% 아세트산, 10% 메탄올에 쿠마시 브릴리언트 블루를 용해한 용액 중에서 30 분 동안 염색하고, 그 다음 탈색시켜 단백질 밴드를 가시화하였다. 그 결과, 전길이의 L2E7 단백질에 상응하는 분자량 90 kD의 주 단백질 밴드가 검출되었고, 이외에도 전사 또는 해독의 조기 종결이나 단백분해성 붕괴 결과의 생성물에 해당하는 80 kD의 밴드가 1개 이상 검출되었다.
유전자 서열을 예컨대 실시예 6에 기재된 바와 같이 부위 지시성 돌연변이유발시켜 변형시킨 후에는 쿠마시 블루 염색을 통해서도 80 kD의 밴드가 더이상 관찰되지 않았는데, 이것은 전사 또는 전위의 조기 종결의 가설이 정확하다는 것을 시사한다.
겔에 존재하는 단백질의 양을 공지 표준물과 비교하여 박테리아 중에서의 발현 농도를 추정하였다. 이 농도는 10 내지 30 ㎎/L의 범위 내에서 일정한 것으로 나타났다.
발현된 단백질 생성물의 특성을 보다 상세히 규명하기 위하여, 겔을 웨스턴 전이시키고, 이.콜리 유래의 L2 융합 단백질을 양에게 면역접종하여 생성되는 항-L2 항혈청으로 탐침하였다. 그 결과, 전길이 서열보다 분자량이 적은 다수의 밴드가 가시화되었는데, 이 서열들 역시 모두 전사 또는 해독의 조기 종결이나 단백분해성 붕괴로 생성된 것으로 추정된다.
요약해보면, 초기 SDS-PAGE 분석에서는 전길이 L2E7 유전자 생성물로 추정되는 서열에 상응하는 크기의 쿠마시 염색 단백질 밴드의 존재를 확인할 수 있었다. 또한, L2E7의 단백분해성 단편이나 조기 종결 생성물에 해당할 수 있는 다른 다수의 밴드도 가시화하였다.
그 다음, 항-L2 또는 항-E7 항혈청을 사용하여 웨스턴 블롯팅으로 연구하였고, 그 결과 주 생성물이 L2E7임을 확인하였고, 소수의 밴드는 C-말단 영역이 결실된 것임을 시사하였다.
또한, 추가 특성 규명을 위해 단백질 서열 분석을 실시한 결과 2개의 주요 밴드는 절단되지 않은 pelB 리더 서열을 비롯하여 본래의 N-말단 서열을 함유한다는 것을 확인하였다.
실시예 5: 시험관내 전사 및 해독
생성물을 특성 규명하기 위하여, 일련의 커플링된 시험관내 전사 및 해독 실험을 통해 유전자를 분석하였다. 이 발현계는 도입된 T7 폴리머라제 효소를 이용하여 발현 벡터 중에 클로닝된 유전자로부터 mRNA 전사체를 생성하고, 그 다음 시험관내에서 해독하여 합성 단백질 생성물을 만들었다. 이 단백질 생성물에 방사능표지를 병입시키면 SDS-PAGE 분석을 통해 생성물의 합성을 모니터할 수 있다.
시험관내 전사와 해독을 통해서는 이.콜리 이종계에서 발견되는 단백질과 유사한 패턴으로 단백질이 합성되었다. L2E7 융합 단백질은 80 kD과 70 kD인 2개의 주밴드로 구성되는 반면, L1 생성물은 전길이 생성물로 추정되는 60 kD 밴드외에도 30 kD과 32 kD인 2개의 주밴드를 함유하였다.
DNA 서열을 분석한 결과, L1과 L2 서열에는 L1 분자와 L2E7 분자의 조기 종결 단편의 위치와 일치하는 것으로 보이는 7개 내지 9개의 T 잔기로 구성된 폴리-T 스트레치가 존재하는 것으로 밝혀졌다. 이와 같은 결과는 상기 T 영역이 전사 또는 해독의 조기 종결을 유도하고, 아마도 보다 일반적으로 전사의 조기 종결을 유도한다는 것을 시사한다. 이와 같은 사실은 T7 폴리머라제의 종결인자 서열에서 관찰되는 폴리-T 트랙에 의해 지지된다.
실시예 6: DNA 서열의 돌연변이유발
잠재적인 종결 생성물을 없애기 위하여 T-풍부한 영역의 2개의 스트레치를 변이시키기로 하였다. 코돈 TTT는 아미노산 페닐알라닌(Phe)을 암호하며, 이의 대체 코돈은 TTC이다. 따라서, 리딩 프레임과 천연의 단백질 서열은 유지시키면서 TTT 코돈을 변이시켜 서열 TTC를 만들기로 하였다. 이 실시예에서 이와 같은 변이를 선택한 이유는 생성물의 성질에 영향을 미치지 않아 면역치료 시약으로서 단백질 서열을 변화시키지 않기 때문이다. 하지만, 이와 같은 돌연변이는 전사 또는 해독의 조기 종결에 의한 생성물의 농도를 감소시켜 발현 단백질 생성물의 수율을 증가시킬 것이다.
하기 기재된 올리고뉴클레오티드 JCT61, JPC81을 사용하여 유전자 중첩 신장부를 PCR 기법으로 돌연변이시켜, 천연 DNA 서열의 해당 영역을 돌연변이 서열로 대체시켰다.
돌연변이유발에 사용된 올리고뉴클레오티드는 다음과 같다.
JCT61CCAACCCTCCGAAGAACACCCCCAAAC 서열 번호 3
[HPV 6 L2를 DNA 서열 위치 159 내지 162에서 돌연변이(TTTTTT에서 TTCTTC로) 유발시키기 위한 비암호 가닥의 올리고뉴클레오티드 프라이머].
JPC81GATCAAATATTAAAATGGGGAAGTTTGGGGGTGTTCTTCGGAGGG 서열 번호 4
(위치 159 내지 162에 있는 서열 TTTTTT를 서열 TTCTTC로 돌연변이유발시킨 HPV 6 L2에 사용되는 암호 가닥인 올리고뉴클레오티드 프라이머. 이 올리고뉴클레오티드는 Ssp1 부위 AATATT를 암호한다.)
또한, 다음과 같은 올리고뉴클레오티드를 사용하여 또 다른 부위를 부위 지시성 돌연변이유발로 변이시켰다.
JPC90CGTATTCCCTTATTCTTCTCAGATGTGGCGGC 서열 번호 5
(위치 1359 내지 1362에 있는 서열을 시험관내 돌연변이유발로 병입시킨 HPV 6 L2에 사용되는 암호 가닥인 올리고뉴클레오티드 프라이머).
최종 유전자 생성물을 삽입하여 pGW53이라고 하는 최종 발현 벡터를 만들었고, 이것을 시험관내 발현과 생체내 발현을 통해 분석하였다.
실시예 7: 변이된 서열의 발현
L2E7 작제물을 돌연변이시킨 후 그 효과는 시험관내 발현 및 생체내 발현에 이어 SDS-PAGE 및 필요한 경우에는 웨스턴 블롯 분석으로 모니터하였다.
먼저, 돌연변이된 L2E7 유전자와 L1 유전자의 시험관내 전사 및 해독 생성물을 분석하는 실험을 실시하였다.
돌연변이된 L2E7 및 L1 유전자의 생체내 발현은 전술한 바와 같이 조사하였다. 각각의 콜로니를 선별하여 광학 밀도가 0.6에 이를때까지 증식시키고, 이 때 배양물 중의 절반을 사용하여 IPTG로 발현을 유도하였다. 유도 반응 3 시간 후, 세포를 수거하고 일정량을 취해 SDS-PAGE로 분석하였다. 발현 카세트는 충분히 해독되는 것으로 밝혀졌다.
시험관내 실험과 생체내 실험을 통해, 폴리-T 영역의 돌연변이가 L2E7 및 L1의 조기 종결 단편의 수율을 감소시키고, 전길이 생성물의 수율을 증가시킨다는 것을 확인할 수 있었다. 즉, L2E7 발현의 경우에는 70 kD 생성물의 수율이 감소하고 L1 발현의 경우에는 30 내지 32 kD 단편이 없어졌다.
따라서, 폴리-T 영역을 돌연변이시키면 이와 같은 발현계에서 전길이 단백질의 발현율을 향상시킬 수 있음이 명백하다. 이와 같은 결과는 T7 폴리머라제를 기본으로 한 발현계에서 종래 제시된 바 없었으며, 기타 다른 발현 연구에도 널리 사용될 수 있을 것이다.
실시예 8: 단백질 생산 및 정제 방법
본 명세서에 기재된 바와 같이 유도된 pGW53 플라스미드를 함유하는 이.콜리 HMS174 세포의 기탁된 마스터용 및 연구용 세포 수집물을 배지에 도말하고 -80℃에 보관하였다. 단백질 생산을 위해, 연구용 세포 수집물 앰플을 해동시키고 2YT 배지에서 발효기에 접종하기에 적당한 부피로 배양하였다. 발효 용량은 1.3 L 내지 50 L 정도이며, 용량을 더 증가시킬 수도 있다. 세포 밀도가 예비설정점(일반적으로 1 리터당 0.3 g)에 도달할 때까지 세포를 배양하였다. 이와 같은 조건에 도달하면 배양물에 IPTG를 첨가하여 발현을 유도하고, 약 2 시간 후에 세포를 수거하였다. 표준 발효 조건을 사용하여 때로 건조 세포 중량 g당 L2E7 24 내지 50 ㎎을 얻었다. 그 다음 세포 붕괴 및 단백질 정제를 첨부되는 도면의 도 3과 하기 기재되는 바와 같이 실시하였다.
세포 붕괴는 세포내 봉입체(IB)로서 보관된 불용성 L2E7을 해리시키기 위하여 실시하였다. 세포 붕괴는 세포를 5000 psi 압력하에 좁은 구멍을 통해 통과시켜 세포를 용해시키는 수압 프레스를 사용하여 실시하였다. 표준 방법을 통해 약 95%의 용해 효율을 얻을 수 있었고, 3회 통과 후에는 사실상 완전하게 붕괴되었다.
봉입체 형태로 불용성 L2E7을 함유하는 이.콜리 세포 용균물을 원심분리하였다. 봉입체와 세포 파편을 함유하는 침강된 펠렛은 트리톤 X-100 세정제를 함유하는 완충액에 재현탁하였다. 그 다음, 시판용 "Filtron"(TM) 장치에서 사용되는 표준 기법인 접선 방향으로의 교차류 여과를 이용하여 막을 통해 여과물을 유동시키기에 충분한 경막 압력하에 한외여과 막이나 여과막을 통해 한외여과하거나 여과해야 하는 액체류 또는 현탁액류를 통과시킨다. 본 실시예에서는 0.16 ㎛ 여과기를 사용하여 접선 방향으로의 교차류 여과를 실시하여 봉입체 현탁액을 농축하였다. 그 결과, 봉입체는 잔류물 중에 농축되었고 오염물은 여과액으로 제거되었다. 그 다음 농축물을 트리톤 X-100의 농도를 감소시키기 위하여 희석하고 다시 농축하였다. 그 다음 우레아와 DTT(디티오쓰레이톨)를 최종 농도가 각각 8 M 및 10 mM이 되도록 첨가하여 L2E7을 용해시켰다. 그 다음, 변성 환원된 L2E7 단백질을 0.16 μ여과기를 통해 통과시키고 여과액을 수집하였다.
변성, 환원 및 여과된 형태의 L2E7을 그 다음 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 먼저 8.0M의 우레아로 용해된 L2E7 단백질을 도 3에 기재된 조건을 사용하여 음이온 교환 크로마토그래피로 정제하였다. 보통 250 내지 350 ㎖의 컬럼에서 1 내지 2g의 생성물이 정제되었다. 우레아 용해된 L2E7을 음이온 교환 수지 상에 장입하고, 50 mM NaCl을 함유하는 우레아 DTT 트리스 완충액(pH 8.0)을 4 컬럼 부피로 사용하여 용출시켜 약하게 결합된 오염물을 제거하였다. 마지막으로, 350 mM 염을 함유하는 우레아 DTT 트리스 완충액(pH 8.0)을 최대 5 컬럼 부피로 사용하여 컬럼으로부터 L2E7 단백질을 용출시켰다. 이 단계에서의 용출 속도는 약 5 ㎖분/㎠이었다.
이 음이온 교환 크로마토그래피 피크 생성물을 양이온 교환기상에 장입하였다. 보통 컬럼 재료 약 250 ㎖ 상에서 생성물 1 내지 2 g이 정제되었다. 이 생성물을 2.5 ㎖·분/㎝의 속도로 수지 상에 장입하고, 그 다음 210 mM 염화나트륨을 함유하는 8.0 M 우레아 DTT 인산염(pH 6.2) 4 컬럼 부피로 세척한 다음, L2E7 피크 용출물을 500 mM 염화나트륨을 함유하는 세정 완충액 약 1.5 컬럼 부피로 세척하였다.
이와 같이 얻어진 양이온 교환기의 피크 생성물을 전개 완충액인 75 mM 염화나트륨을 함유하는 25 mM 트리스 pH 8.0를 사용하여 크기 배제 매트릭스(도 3에 기재됨) 상에 장입하였다. 보통 200 내지 400 ㎎의 L2E7을 함유하는 100 ㎖를 베드 높이가 100 ㎝인 매트릭스 6.5 L에 장입하였다(0.2 ㎖·분/㎠의 속도). 주생성물과 N 말단 절단된 부단편에 상응하는 피크는 대략 0.46 컬럼 부피의 용출 부피에서 분취된 피크이다.
이와 같은 공정 단계에서 얻은 크기 배제 크로마토그래피 피크를 약 0.25 내지 0.5 ㎎/㎖의 농도로 희석하였다. 이 생성물(1 내지 2 L)을 0.5 ㎖·분/㎠의 유속으로 소량의 음이온 교환 매트릭스(약 75 ㎖) 상에 장입하여 농축하였다. 이 생성물을 1.0 M의 염화나트륨을 함유하는 우레아 DTT 인산염 완충액(pH 8.0)을 사용하여 용출시켰다. 피크 부피는 1 내지 2 컬럼 부피이었다.
이와 같이 농축된 Q 음이온 카트리지 피크를, 5 mM DTT를 함유하는 48.9 mM 트리스(pH 8.0)인 최종 조제 완충액으로 완충액 교환시켰다. 컬럼 매트릭스는 부피가 약 2.5 리터인 세파로스 G25이다. 생성물 부피와 동일한 부피의 8M 우레아 함유 완충액 "슬러그(slug)"를 컬럼 상에 예비장입하였다. 그 다음 생성물을 약 100 내지 150 ㎖ 장입량으로 장입하였다. 이와 같이 조제 완충액으로 교환된 생성물의 피크는 보통 유속이 0.06 ㎖·분/㎠일 때 0.5 컬럼 부피에서 용출되었다. 그 다음, 최종 생성물은 -80 ℃에서 저장하였다.
이와 같은 방법으로 얻을 수 있는 생성물 L2E7 단백질 용액이나 분산액은 응집형(재응집형)이며, 그럼에도 불구하고 예컨대 게이지 범위가 0.16 내지 0.22 미크론, 예컨대 0.2 미크론인 멸균 여과기를 통해 통과할 수 있다.
실시예 9: 효모, 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)에서 HPV-6 유전자의 클로닝 및 발현
HPV-6 유전자를 고 농도로 발현할 수 있는 기타 다른 이종 발현계를 조사하기 위하여, L2E7 융합 작제물과 L1의 유전자를 일반적으로 입수용이한 사카로마이세스 세레비지에의 자가 복제성 발현 벡터 중으로 클로닝하였다. 이 벡터는 2 μ플라스미드의 구성 인자를 기본으로 한 것으로, 이종의 인프레임 유전자를 GAL7 프로모터의 작동을 통해 발현시킨다. 또한, 이 벡터는 효모 세포 중에서 카피수의 증가를 선별할 수 있는 LEU-2d 마커와 에스케리히아 콜리에서의 선별 용이성을 제공하는 카나마이신 내성 유전자를 함유한다. 발현에 사용된 사카로마이세스 숙주 균주는 S150-2B(유전자형: a, leu2-3, 112, Δhis3, trp1-289, ura3-52)이다.
HPV-6L2-E7 작제물을 사용하여 효모를 형질전환시키고 유일한 탄소원으로서 2% 글루코스를 함유하는 배지에서 증식시켜 GAL7 프로모터에 의한 전사를 억제시켰다. 유전자의 발현은 유일한 탄소원으로 배지 중에 2% 갈락토스를 첨가하여 유도하였다.
유리 비드 중에서 세포 막을 붕괴시켜 세포 추출물을 만들었다. 추출 완충액은 트리스를 주성분으로 하며, 다양한 프로테아제 억제제인, PMSF, 펩스타틴, 류펩틴, 안티페인 및 키모스타틴을 함유한다. 세포 추출물을 SDS PAGE시키고 분리된 단백질을, HPV-6 L2 및 HPV-6 E7을 양에게 투입하여 발생되는 폴리클로널 항혈청을 사용하여 웨스턴 블롯팅하였다.
이와 같은 방법으로 사카로마이세스 세레비지에에서 생성된 HPV-6 L2-E7 융합 단백질의 수율은 일부 구체예에서 배양물 1 리터 당 10 ㎍인 것으로 추정되었다.
실시예 10: 효모, 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)에서 HPV-6 유전자의 클로닝 및 발현
L2E7 융합 분자(상기 실시예 3 참조)는 BamHI-NotI DNA 단편으로 작제하여 피키아 발현 벡터 pPIC3K(필립스 페트롤륨으로부터 인가하에 입수함)와 같은 적합한 발현 벡터 중으로 클로닝하였다. 이 유전자는 알코올 옥시다제 프로모터 AOXI의 조절하에 있도록 배치하여 융합 단백질을 고농도로 발현시켰다. 발현 작제물을 선형화한 후, 이 DNA를 스페로플라스트 융합으로 효모 세포를 형질감염시켰다.
형질전환체는 성장 배지에 히스티딘을 필요로 하는 비형질감염된 세포와 달리 히스티딘 무첨가하에 최소 배지에서 성장할 수 있는 성질을 통해 선별하였다. 2번째 선별 단계로, L2E7 유전자가 정확한 위치에 통합되었는지를 선별하기 위하여 메탄올 기질에서의 느린 성장을 통해 선별하였다.
실시예 11: 바큘로바이러스 중에서 HPV-6 유전자의 클로닝 및 발현
바큘로바이러스 중에서 L2E7 융합 유전자가 발현되는지를 연구하기 위하여, HisTag 테일의 존재 또는 부재하에 각각 HPV-6 L2E7 융합 단백질을 암호하는 2가지 작제물을 제조하였다. 이 작제물들에는 리더 서열을 병입시키지 않았으며, 따라서 세포내 발현율을 조사하는 것이 바람직하다.
이 2가지 작제물을, 말단에 Bgl II 부위를 병입시키는 PCR 증폭을 통해 pGEM-T 벡터 중으로 클로닝하였다. 그 다음 L2E7 유전자를 BglII-BglII 단편으로 분리한 뒤, 전이 벡터 pBacPAK1(클론테크)의 BamHI 클로닝 부위 중으로 서브클로닝하였다. 그 다음, PCR 분석을 통해 삽입체의 배향을 조사하고, 정확하게 배향된 클론으로부터 DNA를 제조하였다.
표준 리포펙틴 매개 방법을 사용하여 L2E7 작제물을 함유하는 pBacPAK1 전이 벡터 유래의 DNA와 함께 Bsu36 1 절단된 PBacPAK1 바이러스 DNA(클론테크)로 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)(유형 Sf9) 세포를 형질감염시켰다. 그 다음, 플라스미드 DNA와 바이러스 DNA 간의 생체내 동종 재조합을 일으켜 바이러스 DNA를 회수하고, 이 방법으로 표적 유전자를 바이러스 게놈으로 전이시켰다.
동시 형질감염 상청액 중에 생성된 후손 바이러스로 새로운 세포를 감염시켜 증폭시켰다.
감염 세포의 일정 분획을 수거하고 게놈 DNA를 제조하였다. 상기 프라이머를 사용하여 PCR 증폭을 실시한 결과 세포 중에 재조합 바이러스가 존재하는 것으로 나타났다.
그 다음 1세대의 바이러스 스톡을 사용하여 세포를 높은 감염 다중도로 더 감염시키고, 시간 경과에 따른 단백질 생성 과정을 측정하여 유전자 발현의 특성을 규명하였다. 즉, 6 웰 접시에서 응집성 Sf9 세포를 높은 감염다중도로 감염시키고, 감염 후 24 시간, 48 시간 및 72 시간째 세포와 상청액을 수거하였다. 실험 결과는 SDS-PAGE 분석과 웨스턴 블롯팅으로 관찰하여 단백질의 합성을 측정하였다.
재조합 단백질은 SDS/PAGE 겔에서는 관찰되지 않았으나 웨스턴 블롯팅에서는 저농도로 검출되었다. 즉, 예상된 바와 같이 단백질이 리더 서열의 부재로 인하여 분비되지 않은 것이다. 이와 같이 증폭된 유전자를 완전하게 서열분석하였고, 플라스미드 벡터 중으로 서브클로닝하였다. 이 유전자 서열을 사용하여 원핵 발현계와 진핵 발현계에서 HPV-6 단백질을 고농도로 발현할 수 있는 유전자 융합체를 작제하였다.
실시예 12: 마우스 중에서 L2E7의 면역원성
L2E7 응집물의 면역원성을 마우스 중에서 조사하였다. 수산화알루미늄("명반") 상에 흡착된 L2E7 응집물을 B6CBA 마우스 중에 주입한 결과 L2E7 특이적인 면역성이 유도되는 것으로 발견되었다. 이와 같은 L2E7 특이적인 면역성은 면역글로불린 G(IgG)류와 면역글로불린 G1 서브클래스(IgG1)의 혈청 항체를 함유하였다. 시험관내 L2E7 특이적인 지연형 과민 반응과 림프증식성 반응 역시 관찰되었다.
명반 상에 흡착된 L2E7의 면역원성은 B6CBA 마우스에서 조사하였다. 마우스에게 180 ㎍의 L2E7/명반을 14일 간격으로 2회 경피 주입하여 투여하였다.
L2E7/명반을 2차 주입한 후 7일, 14일 및 56일째 혈청을 수집하였다. 혈청 중에 존재하는 항L2E7 항체의 농도는 L2E7 특이적인 효소 결합된 면역흡착 분석법으로 측정하였다. 혈청 중의 항L2E7 반응은 L2E7을 2차 주입한 후 14일째 최고치를 나타내었고(1/2 역가 log10 4.572), 56일 동안 지속되었다(1/2 역가 log10 4.127).
L2E7에 대한 생체내 지연형 과민 반응(DTH)은 전술한 바와 같이 면역화시킨 마우스 제2 군에서 측정하였다. L2E7/명반을 2차 주입한 지 7일 후 마우스에게 L2E7 1.8 ㎍을 오른쪽 귀를 통해 주입하고 동량의 완충액을 왼쪽 귀로 주입하였다. L2E7 특이적인 귀 두께의 증가는 귀를 통한 항원주입 후 24 시간, 48 시간 및 72 시간째 공학용 마이크로미터기로 측정하였다. L2E7/명반으로 면역화시킨 마우스는 생체내 DTH 반응을 나타내었다.
시험관내 림프증식 반응은 마우스 제3군에서 채취한 림프절 세포(보조 림프절 세포)를 탈수시키고, L2E7/명반 생성물(전술함)을 2차 주입한 후 7일째에 측정하였다. 단독 림프절 세포 현탁액을 만들고, 2 x 106생림프구/㎖를 1% 정상 마우스 혈청, 글루타민, 베타-머캅토에탄올 및 항생제가 보강된 배지(이스코브 변형 둘베코 배지)에서 도말하였다. L2E7을 배양물(91 ㎍/㎖)에 주입하고, 72 시간 배양 중 마지막 24 시간 동안 삼중수소표지된 티미딘을 병입시켜 세포 증식을 측정하였다. L2E7/명반으로 면역화된 마우스 유래의 림프절 세포는 L2E7(42000 cpm, 자극 지수 50)에 대한 반응으로 시험관내에서 증식하였다.
실시예 13: 인간에 대한 면역 반응
전술한 바와 같이 동등한 방식으로 제조된 L2E7의 수산화알루미늄 겔 복합물인 전술한 바와 같은 백신은 건강한 남성 지원자 중에서 적당한 용량 관련성 면역 반응을 유도하는 것으로 밝혀졌다. 백신접종된 36명의 지원자 모두의 세포는 생성물에 대한 면역 반응의 지표로서 L2E7 특이적인 시험관내 림프증식성 반응(CD4+ T 세포)을 나타내었다. 각 지원자들에게 본 발명의 생성물을 3 ㎍, 30 ㎍ 또는 300 ㎍의 용량으로 0일째 초기 투여량과 7일과 28일째 반복 투여량(급속법)을 근육내 주입하였다. (대안 방법으로, 0일, 28일 및 56일째 백신을 접종하는 저속법도 실시하였으나 효과는 떨어졌다). 림프증식성 반응은 최저 투여량인 3 ㎍을 비롯한 투여량 농도에서 7일째 관찰되었다. 또한, 지원자들로부터 채취한 32개의 평가 시료 중 29개에서 L2E7 특이적인 항체 반응이 관찰되었다(항체 시험에서 3명의 무응답자에게는 최저 투여량을 주입하였다). 또한, 항체 생성과 함께 IL-5의 시험관내 생성도 증가하는 것으로 관찰되었다. 최저량 보다 높은 투여량들은 최저량 보다 T 세포 증식을 보다 신속히 유도하였다. 최고의 투여량인 300 ㎍은 이보다 적은 투여량들보다 IFN 감마 생성을 더욱 자극하였다. 급속한 T 세포 증식과 이와 관련된 IFN 감마 생성의 관찰은 생성물의 생식기 우췌 치료용 백신으로서의 목적 용도에 대략 부합하였다.
인간 파필로마바이러스에 의한 것으로 간주되는 장기 지속형 인간 발바닥 우췌는 이 세포가 면역증식 반응을 나타내는 세포 중의 하나이기 때문에 생성물을 3 ㎍ 투여한 수용체에서 퇴화하는 것으로 관찰되었다. 퇴화는 7일째 관찰되었고 14일째 우췌가 사라졌다.
본 명세서를 통해 기재된 발명과 양태들은 본 명세서의 개시 내용을 통해 당업자라면 자명하고 용이하게 수행할 수 있는 많은 변형 양태와 수정 양태들로 실시될 수 있으며, 본 발명의 개시 내용에는 본 명세서에 기재된 특징들을 조정한 양태, 조합한 양태 및 준조합한 양태도 포함되는 것이다. 본 명세서를 통해 인용된 문헌들은 본 발명의 인용 문헌에 포함된 것이다.
Claims (15)
- 용액이나 분산액 상태일 때 멸균 여과기를 통해 통과할 수 있는 응집형이거나 무정형의 응집 형태인, 파필로마바이러스 단백질의 항원성 결정인자를 포함하는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 조성물.
- 제1항에 있어서, 2종 이상의 파필로마바이러스 단백질, 예컨대 L2와 다른 단백질이나 E7과 다른 단백질의 항원성 결정인자를 포함하는 것이 특징인, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 조성물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 파필로마바이러스 L2 단백질 중의 1개 이상의 항원성 결정인자와 파필로마바이러스 E1, E2, E4, E6 또는 E7 단백질 중의 1개 이상의 항원성 결정인자를 포함하는 것이 특징인, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 조성물.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, HPV의 L2 단백질과 E7 단백질의 항원성 결정인자, 예컨대 L2 단백질과 E7 단백질 각각의 전 서열 중의 50% 이상인 서열 단편, 예컨대 L2와 E7의 전 서열 대부분을 포함하고, 선택적으로 L1 단백질 서열을 더 포함하는 것이 특징인, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 조성물.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 항원성 결정인자가 HPV 유형 6, 11, 16, 18의 파필로마바이러스 단백질 유래이거나 인간을 제외한 동물의 파필로마바이러스 유래인 것이 특징인, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 조성물.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 변성, 환원 및 재응집된 제조물 형태인 것이 특징인, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 조성물.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 재조합 숙주 세포에서 봉입체 형태로 발현된 폴리펩티드를 변성 또는 환원 변성시킨 뒤 재응집시켜 얻을 수 있는 것이 특징인, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 조성물.
- 제7항에 있어서, 응집물 당 분자량이 약 100,000 내지 약 10,000,000 달톤 범위인 것이 특징인, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 조성물.
- 제7항에 있어서, 전자 현미경으로 측정한 직경이 약 4 내지 50 nm 범위, 예컨대 약 10 내지 15 nm인 응집물 입자를 포함하는 것이 특징인, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 조성물.
- 제7항에 있어서, 응집물 당 폴리펩티드 사슬이 2개 내지 200개, 예컨대 5개 내지 50개인 응집물 입자를 포함하는 것이 특징인, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 조성물.
- 제1항에 있어서, (a) 파필로마바이러스 L2 단백질의 최소한 항원성 결정인자 및 (b) E1, E2, E4, E5, E6, E7 파필로마바이러스 단백질 및 (a)에 기재된 파필로마바이러스와는 다른 유형의 L2 파필로마바이러스 단백질 중에서 선택되는 단백질의 최소한 항원성 결정인자를 포함하거나; 또는 E1, E2, E4, E5, E6 및 E7 파필로마바이러스 단백질들이 예컨대 여러 파필로마바이러스 유형에서 유래된 것인 경우에는 이 단백질들 중에서 선택되는 2종 이상의 파필로마바이러스 단백질 유래의 항원성 결정인자를 포함하는 융합 폴리펩티드를 함유하는 것이 특징인, 폴리펩티드 또는폴리펩티드 조성물.
- 제11항에 있어서, L2 단백질의 항원성 결정인자와 E1, E2, E4, E6 및 E7 단백질 중 1종 이상의 단백질에서 유래되는 항원성 결정인자를 함유하는 융합 폴리펩티드를 포함하는 것이 특징인, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 조성물.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 하나의 항에 기재된 폴리펩티드와 면역 보조제를 포함하는, 주입 투여용으로 적합한 면역원성 조성물.
- 제13항에 있어서, 보조제가 수산화알루미늄 및/또는 모노포스포릴 지질 A를 포함하는 것이 특징인, 면역원성 조성물.
- 파필로마바이러스 관련 질환의 예방이나 치료용 백신과 같은 면역원으로 제1항 내지 제12항 중 어느 하나의 항에 기재된 폴리펩티드 또는 제13항이나 제14항에 기재된 면역원성 조성물의 용도.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1019997000766A KR20000029687A (ko) | 1999-01-29 | 1996-07-29 | 면역치료제로서유용한폴리펩티드및폴리펩티드의제조방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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Family
ID=19635928
Family Applications (1)
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Country Status (1)
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-
1996
- 1996-07-29 KR KR1019997000766A patent/KR20000029687A/ko not_active Ceased
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