KR20120006481A - 무혈관 조직의 복구를 촉진하기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents
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Abstract
손상된 무혈관 영역, 예를 들어 추간 원판의 복구를 필요로 하는 환자에서 손상된 무혈관 영역, 예를 들어 추간 원판의 복구를 위한 조성물 및 방법이 제공된다.
Description
본 발명은 손상된 무혈관 부위, 예를 들어 추간 원판의 복구를 촉진하기 위한 조성물 및 방법을 제공하고; 보다 특히, 본 발명은 이를 필요로 하는 환자에서 무혈관 부위 내에 또는 무혈관 부위에 인접한 최적화된 위치에 환경적으로 조건화된 자가유래 줄기 세포를 적용하는 것을 제공한다.
무혈관 이행 영역 및 복구가 어려운 다른 부위가 신체의 수많은 핵심 조직에 존재한다. 이들 영역은 조직, 예를 들어 원판으로의 혈액 공급이 제한되거나 부족한 곳 또는 조직에 대한 손상이 복구 절차를 방해하는 가혹한 환경을 초래한 곳에 존재한다. 예를 들어, 무혈관 조직이 손상된 경우, 상기 조직으로의 혈액 공급의 부족 또는 제한은 복구 과정에 대한 유의한 장애물이 된다. 이는 통상적 부하 문제가 복구 및 치유를 촉진하는 것을 어렵게 만드는 곳인 추간 원판, 무릎 및 엉덩이에서 특히 그러하다.
신체에서 한 특히 중요한 무혈관 이행 영역은 직접적 혈액 공급이 없는 추간 원판 내이다. 원판으로의 영양소는 전형적으로 시간 경과에 따라 원판 전반에 걸쳐 확산된 연골하골 내 작은 모세혈관상을 통해 도달한다. 또한, 원판은 종축 부하 활동, 예컨대 걷기, 뛰기 등 동안 침염, 다시 말해서 주변 조직으로부터 영양소의 흡수를 통해 영양소를 받는다.
추간 원판은 척추의 임의의 2개의 척추골을 서로 분리시키는 충격 완충 패드이다. 이들 원판은 본질적으로 척추에 3개의 기능을 제공하며, 첫째 원판은 곧게 선 자세 동안 신체의 종축 부하를 수용하는 충격 완충기로서 작용하고, 둘째 원판은 임의의 2개의 인접한 척추골을 함께 유지하는 인대로서 작용하고, 셋째 원판은 척추의 향상된 굽힘 및 회전을 위한 피벗 포인트로서 작용한다.
인간은 척추에 23개의 원판, 즉, 경부에 6개, 흉부에 12개 및 요부에 5개를 갖는다. 각각의 원판은 수핵, 섬유테 및 척추 종말판으로 구성된다. 수핵은 물이 풍부하고 젤라틴상이고, 원판의 중심부를 포함한다. 섬유테는 사실상 콜라겐으로 이루어진 섬유상이고, 물을 적게 (수핵과 비교하여) 포함하고, 수핵을 둘러싼다. 일련의 라멜라가 가압된 수핵을 함유하기 위해 섬유테에 배열된다. 또한, 척추 종말판은 각각의 원판을 인접한 척추체에 부착시키는 작용을 한다.
상기 논의된 바와 같이, 조직 복구 및 재생은 원판의 가혹한 환경적 측면 (무혈관, 높은 압력, 유해 pH 등) 및 복구 동안 원판 상에 놓인 어려운 기계적 요건 (두발 운동과 관련된 응력 및 긴장)으로 인해 손상된 원판에서 어려운 것으로 입증되었다. 줄기 세포 기술을 사용하는 통상적인 복구 방법은 전형적으로 담체 물질의 존재하에 수핵으로의 줄기 세포 (전형적으로 기존 비자가유래 세포주로부터 얻음)의 직접 이식에 초점을 맞추었다. 이들 방법이 동물 모델에서 일부 희망적인 결과를 제공하였으나, 이들 복구는 퇴행성 원판 질환 (DDD) 또는 다른 유사 상태를 갖는 인간에서 아직 입증되지 않았다. 이들 동물 모델에서 유망한 결과는 동물 연구에서 사용되는 원판 퇴행 모델의 급성 성질로 인한 것일 수 있다. 예를 들어, 이들 동물 모델에서 원판은 인간에서 긴 직립 퇴행성 원판보다 더 양호한 혈액 공급으로 새롭게 퇴행된다. 또한, 이들 모델에서 사용되는 동물은 일반적으로 두발로 걷는 인간과 비교하여 네발로 걸으며, 이 때문에 상이하게 원판에 부하한다. 마지막으로, 이들 DDD 모델에서 사용되는 동물은 DDD를 갖는 것으로 임상적으로 흔히 관찰되는 코호트보다 훨씬 더 젊은 환자와 연령 등가인 젊고 건강한 경향이 있다. 일반적으로 그러므로, 통상적인 방법은 줄기 세포 치료요법을 필요로 하는 인간 환자에서 발견되는 것과 잠재적으로 매우 상이한 손상된 원판 환경에서의 복구 및 재생에 기초한다.
원판에서 조직 복구 및 재생과 관련된 문제는 또한 엉덩이, 무릎 및 어깨 (회전 근개 포함)에서 유력하다. 이들 조직 중 각각에서, 가혹한 환경적 측면이 종종 손상 또는 노화시 확립되며, 무혈관 이행 영역 및 어려운 기계적 요건이 조합되어 낮은 줄기 세포 복구 성공의 시나리오를 확립한다.
본 발명은 상기 논의된 문제점들 중 하나 이상을 극복하는 것에 관한 것이다.
<실시양태의 요약>
본 발명은 하나 이상의 불량한 영양 영역 또는 적대적 환경, 즉, 무혈관 영역을 갖는 손상된 조직의 복구에서 사용하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 불량한 영양 영역 또는 적대적 환경은 전형적으로 혈관 혈액 공급이 제한되거나 부족한 조직, 즉, 본원에서 무혈관 이행 영역 또는 무혈관 영역이라고 불리는 곳에 위치된다. 이점에 비추어 영역 또는 환경은 추간 원판, 엉덩이 (관절순), 어깨 (회전 근개 포함) 및 다른 유사 부위를 포함한다. 본원의 실시양태는 무혈관 영역의 복구를 필요로 하는 환자로부터 줄기 세포, 예를 들어 중간엽 줄기 세포의 입수를 포함한다. 그 후, 입수된 세포는 환자의 무혈관 영역의 복구에서 사용되는 세포 능력의 최적화를 허용하는 환경에서 시험관내에서 조건화된다. 충분한 개수의 최적화된 조건화된 세포가 존재하는 경우, 세포는 복구를 필요로 하는 무혈관 영역의 표적 부위에 위치된다. 일부 실시양태에서, 혈소판 또는 혈소판 용해물 (전형적으로 자가유래) 및/또는 보조 치료가 부위로의 혈액 흐름/영양소 흐름을 향상시키기 위해 조건화된 세포와 조합하여 위치된다. 혈소판 및/또는 보조 치료의 타이밍은 전형적으로 조건화된 세포의 배치 직전, 동안 또는 직후이나, 다른 다수의 타이밍이 고려된다. 부위의 복구를 확실하게 하기 위해 절차가 반복될 수 있다 (오직 조건화된 세포 배치 또는 혈소판/혈소판 용해물/보조 치료(들)의 반복 포함).
한 실시양태에서, 손상된 추간 원판의 복구를 필요로 하는 환자에서 손상된 추간 원판의 복구에서 사용하기 위한 조성물 및 방법이 제공된다. 한 측면에서, 손상된 원판의 복구 및/또는 재생에서 사용되는 세포 능력을 최적화하는 조건 하에 줄기 세포의 입수 및 배양을 위한 방법이 제공된다. 또 다른 측면에서, 손상된 원판 조직의 성장 및 재생을 최적화하기 위해 손상된 원판의 표적화된 부위에 이들 조건화된 줄기 세포를 배치하기 위한 방법이 제공된다. 또 다른 측면에서, 손상된 원판으로 및 이를 통한 혈액 흐름을 향상시키기 위해 경막외 보조 치료를 사용하여 환자에게 치료와 조합하여 환자 내에 표적화된 부위에 조건화된 줄기 세포를 배치하기 위한 방법이 제공된다. 또한, 본 발명은 손상된 원판을 복구하고/거나 재생할 수 있는 세포의 선택을 향해 전념된 줄기 세포 배양을 위한 개선된 조성물을 제공한다. 개별적으로 및/또는 조합하여, 본 발명의 방법 및 조성물은 (다른 통상적인 기술과 비교하여) 원판 복구 및 재생의 분야에서 놀라운 예상 밖의 진보를 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 줄기 세포 (예를 들어, 중간엽 줄기 세포)는 원판 복구를 필요로 하는 환자로부터 수확되고, 불량한 영양 환경, 다르게는 적대적 환경 (예를 들어, pH가 건강한 세포 성장을 촉진하는 pH와 통상적으로 일치하는 범위가 아닌 환경), 저산소 환경 및/또는 손상된 원판 내에 상승된 이산화탄소 수준을 나타내는 환경을 견딜 수 있는 세포의 선택 및 증식에 기초한 조건 하에 배양된다. 그 후, 이들 조건화된 세포는 섬유상 후방 원판 테에 이식된다 (수핵에 이식을 전형적으로 요구하는 통상적인 방법과 비교하여). 일부 경우에, 그 후 환자는 후방 원판 테로의 혈액 흐름을 촉진하기 위해 경막외 보조제 (성장 인자, 시토카인, 인테그린, 카드헤린 등)로 치료된다. 실시양태의 각각의 측면은 손상된 원판 환경에서 생존하고 증식할 수 있는 줄기 세포를 증가시키고 선택할 뿐만 아니라, 원판 환경이 이식된 세포로 향상된 영양 및 산소를 제공하도록 촉진한다. 또한, 자가유래 혈소판 또는 혈소판 용해물 조성물이 손상된 원판 내 줄기 세포 생존성 및 증식을 촉진하기 위해 선택된 줄기 세포와 조합하여 또는 별개로 투여될 수 있다. 개별적으로 또는 조합하여, 본원의 접근법은 복구 과정 및 자가유래 줄기 세포 기재 원판 복구의 결과를 향상시킨다.
일부 경우에서, 원판 복구를 필요로 하는 환자로부터 수확된 줄기 세포는 1 내지 10% 산소 하에 및 보다 전형적으로 3 내지 7% 산소 하에 1일 내지 28일의 기간 동안 시험관내에서 배양된다. 이는 세포가 환자 내에 이식 전에 배양된 전체 시간에 대해 대략 1/3을 나타낼 수 있다. 생존한/생존가능한 세포, 즉, 저산소 조건 하에 성장할 수 있는 세포가 생존성에 대해 선택되고, 손상된 원판으로의 이식을 위해 충분한 세포를 입수하기 위해 이들 저산소 조건 하에 증식된다. 선택된 세포는 손상된 원판의 산소 결핍 환경 내에서 생존하고 증식하고 궁극적으로 복구할 수 있는 향상된 능력을 갖는다.
다른 경우에서, 원판 복구를 필요로 하는 환자로부터 수확된 줄기 세포는 상승된 이산화탄소 하에 및 보다 전형적으로 2 내지 10% 이산화탄소 하에 1일 내지 28일의 기간 동안 시험관내에서 배양된다. 이는 세포가 환자 내에 이식 전에 배양된 전체 시간에 대해 대략 1/3을 나타낼 수 있다. 생존한/생존가능한 세포, 즉, 상승된 이산화탄소 조건 하에 성장할 수 있는 세포가 생존성에 대해 선택되었고, 손상된 원판으로의 이식을 위해 충분한 세포를 입수하기 위해 이들 조건 하에 증식되었다. 선택된 세포는 손상된 원판의 환경의 더 높은 이산화탄소 조건 내에서 생존하고 증식하고 복구할 수 있는 향상된 능력을 갖는다. 이러한 동일한 접근법은 손상된 (손상 또는 노화를 통해) 엉덩이 및/또는 어깨 무혈관 부위를 복구/재생하는데 사용되는 줄기 세포를 선택하기 위해 사용될 수 있다.
다른 경우에서, 원판 복구를 필요로 하는 환자로부터 수확된 줄기 세포는 저산소 및 상승된 이산화탄소 조건 하에 시험관내에서 배양된다. 시험관내 배양 조건은 세포의 총 배양 시간의 전체에 대해 1/3 이하의 기간 동안 유지될 수 있다. 선택된 세포는 손상된 추간 원판에서 전형적으로 발견되는 더 낮은 산소 및 더 높은 이산화탄소 조건 내에서 생존하고 증식하고 복구할 수 있는 향상된 능력을 갖는다. 이러한 동일한 접근법은 손상된 (손상 또는 노화를 통해) 엉덩이 및/또는 어깨 무혈관 부위를 복구/재생하는데 사용되는 줄기 세포를 선택하기 위해 사용될 수 있다.
또 다른 경우에서, 원판 복구를 필요로 하는 환자로부터 수확된 줄기 세포는 생존성에 대해 선택하기 위해 영양소 불량한 조건 하에 배양되고, 이들 불량한 영양소 환경 하에 증식된다. 배양 조건은 당, 아미노산, 지질, 미네랄, 단백질 또는 줄기 세포 성장을 촉진하기 위한 다른 물질로 보충된 둘베코 변형 필수 배지 (DMEM) (또는 다른 유사 기초 배지)로부터 제조된 기초 세포 배양 배지의 사용을 포함한다. 성장 배지는 혈청, 예컨대 소 태아 혈청, 인간 전체 혈청, 혈소판 풍부 혈장, 혈소판 용해물 등을 함유할 수 있거나 함유하지 않을 수 있다. 그러나, 이들 제제는 구체적으로 인간 퇴행된 원판, 예컨대 저산소, 변경된 pH 또는 특정 제한된 영양소 이용가능성의 국소 환경을 모방하도록 설계된다. 이러한 동일한 접근법은 손상된 (손상 또는 노화를 통해) 엉덩이 (예를 들어 관절순에서) 및/또는 어깨 무혈관 부위를 복구/재생하는데 사용되는 줄기 세포를 선택하기 위해 사용될 수 있다.
수확된 줄기 세포를 증식하기 위해 pH, 소비된 배지의 사용, 표적 부위가 손상된 원판에 있는 경우 수핵 세포와의 공동-배양 (이에 의해 배양된 세포의 전달을 위해 궁극적 표적 부위에 근접하여 존재하는 환경적 인자를 제공함) 등을 포함하는 다른 선택 조건이 사용될 수 있다. 또한, 일부 경우에서 무혈관 부위 복구에서 사용하기 위한 줄기 세포를 확인하고 증식시키기 위해 본원에 기재된 선택 조건 중 2개 이상이 사용될 수 있다는 것을 주목한다. 그래서, 예를 들어, 불량한 영양 배지 및 저산소 조건이 제1 환자에서 사용되는 줄기 세포를 선택하기 위해 사용될 수 있으나, pH 및 이산화탄소 조건이 제2 환자에서 선택하기 위해 사용될 수 있다. 이는 임의의 주어진 환자에서 국소 미세환경의 실제 측정에 기초할 수 있다.
또 다른 경우에서, 손상된 부위를 갖는 동일한 환자로부터 혈소판이 입수되고 (수확되고), 트롬빈 및 염화칼슘 (CaCl2)으로 처리된다. 처리된 혈소판은 손상된 부위로 이식하기 위해 배양되고 선택된 줄기 세포와 조합된다. 혈소판의 처리가 손상된 부위로의 이식전 1 내지 7일 및 보다 특히 5 내지 7일에 이를 수 있다는 것을 주목한다. 또한, 혈소판은 선택된 줄기 세포의 이식 직전, 동안 또는 후에 이식될 수 있다. 이러한 예비조건화된 혈소판은 손상된 부위 내에 줄기 세포 생존 및 증식의 촉진에 유용한 무혈관 영역 환경으로 표적화된 성장 인자를 방출할 수 있다. 별법으로 또는 조합하여, 성장 인자, 시토카인, 인테그린 등이 선택된 줄기 세포와 함께 손상된 부위로 직접적으로 투여될 수 있다. 한 실시양태에서, 이들 성장 인자는 예를 들어, 손상된 원판의 외부 주변, 예컨대 경막외 공간에 위치된 곳에 투여된다.
본 발명의 이들 및 다양한 다른 특징 및 장점은 하기 상세한 설명을 읽고 첨부된 청구항을 검토하여 명백할 것이다.
도 1은 본원에 기재된 실시양태를 사용한 후방 원판 테의 혈관 및 이행 혈관 영역으로의 줄기 세포의 바늘 배치의 중첩된 경로를 갖는 종축 요부 도면이다.
도 2는 본원에 제공된 기술에 따라 단층 배양에서 성장된 MSC를 나타낸다.
도 3은 L5-S1 원판의 후방 원판 테로의 MSC 및 혈소판 유래 VEGF 상등액의 주사 위치의 예시적인 형광투시 영상이다 (대상체 ML). 후방 원판 테 내 조영제의 농도를 주목한다 (청색으로 향상된 조영제 흐름).
도 4는 줄기 세포 이식 후 수행된 혈소판 유래 VEGF 상등액 주사로 달성된 예시적 경막외 흐름을 나타낸다.
도 5는 절차 1개월 미만 전에 찍은 ML 단시간반전회복 (Short Tau Inversion Recovery; STIR) 영상을 제공한다. 이러한 시상 슬라이스는 내포된 L5-S1 원판 정출의 최대 정도를 나타내기 때문에 선택된다. 1:01 p.m.의 하루 중 영상화 시간으로 ET=6, TR=4816.7, TE=48.1. 이러한 영상은 L5-S1에서 0.7 cm 원판 정출을 나타낸다. 중심 원판에서 측정된 L5-S1 원판 높이는 0.5 cm이며, L4-L5 높이는 0.7 cm이다.
도 6은 동일한 STIR 파라미터를 사용하여 ML 절차후 1개월 매칭 시상 슬라이스를 제공한다. ET=6, TR=4816.7, TE=48.1. 하루 중 영상화 시간은 11:01 a.m.이었다. 이러한 영상은 L5-S1에서 0.3 cm 원판 정출을 나타낸다. L5-S1에서 원판 높이 0.5 cm 및 L4-L5에서 0.7 cm를 주목한다.
도 7은 동일한 STIR 파라미터를 사용하여 ML 절차후 5개월 매칭 시상 슬라이스를 제공한다. ET=6, TR=4816.7, TE=48.3. 하루 중 영상화 시간은 10:23 a.m.이었다. 이러한 영상은 L5-S1에서 0.3 cm 원판 정출을 나타낸다. L5-S1에서 원판 높이 0.5 cm 및 L4-L5에서 0.7 cm를 주목한다.
도 8은 내포된 L4-L5 원판 정출의 최대 정도를 통한 MJM 절차전 시상 슬라이스를 제공한다. 영상을 12:15 pm에 찍었다. ET=6, TR=4816.7, TE=48.1. L4-L5 원판 정출이 6 mm에서 측정된다. 이러한 슬라이스 상의 원판의 중간 부분에서 측정된 원판 높이는 다음과 같았다: L4-L5=8 mm, L5-S1=7 mm, S1-S2=5 mm.
도 9는 동일한 영상화 파라미터로 MJM 절차후 2개월 매칭 시상 STIR 슬라이스를 제공한다. ET=6, TR=4816.7, TE=48.1. 영상을 12:35 pm에서 찍었다. L4-L5 원판 정출이 3 mm에서 측정된다. 절차전과 동일한 측정된 원판 높이: L4-L5=8 mm, L5-S1=7 mm, S1-S2=5 mm.
도 10은 MJM 절차후 4.5개월을 제공한다. 이는 동일한 영상화 파라미터로 매칭 시상 STIR 슬라이스이다. ET=6, TR=4833.3, TE=48.2. 영상을 12:27 pm에 찍었다. L4-L5 원판 정출은 3 mm에서 측정된다. 절차전과 동일한 측정된 원판 높이: L4-L5=8 mm, L5-S1=7 mm, S1-S2=5 mm.
도 11은 L5-S1 원판 돌출의 최대 정도를 통한 HO 절차전 시상 STIR 슬라이스를 제공한다. ET=6, TR=4816.7, TE=48.3. 하루 중 영상 시간은 11:26 a.m.이었다. L5-S1 원판 돌출이 9 mm에서 측정된다. 원판 높이 측정: L4-L5=6 mm, L5-S1=8 mm.
도 12는 HO 절차후 6주 시상 매칭 STIR 슬라이스를 제공한다. 영상화 파라미터는 ET=6, TR=4816.7, TE=48.3에서 일정하게 유지되었다. 하루 중 영상 시간은 11:25 a.m.이었다. L5-S1 원판 돌출이 8 mm에서 측정된다. 원판 높이 측정: L4-L5=6 mm, L5-S1=8 mm.
도 13은 HO 절차후 3.5개월 매칭 시상 STIR 슬라이스를 제공한다. 영상화 파라미터는 ET=6, TR=4816.7, TE=48.3에서 일정하게 유지되었다. 하루 중 영상 시간은 1:10 p.m.이었다. L5-S1 원판 돌출이 9 mm에서 측정된다. 원판 높이 측정: L4-L5=6 mm, L5-S1=8 mm.
도 14는 HO에서 조영제 흐름 (청색에서 향상됨)이 후방 원판 테인 의도된 표적보다 더 전형적인 뉴클레오그램임을 나타낸다.
<상세한 설명>
본 발명은 하나 이상의 불량한 영양 영역 또는 적대적 환경, 즉, 무혈관 영역을 갖는 손상된 조직의 복구에서 사용하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 불량한 영양 영역 또는 적대적 환경은 전형적으로 혈관 혈액 공급이 제한되거나 부족한 조직, 즉, 본원에서 무혈관 이행 영역이라고 불리는 곳에 위치된다. 이점에 비추어 영역 또는 환경은 추간 원판, 엉덩이, 어깨 (회전 근개 포함) 및 다른 유사 부위를 포함한다. 본원의 실시양태는 무혈관 영역의 복구를 필요로 하는 환자로부터 줄기 세포, 예를 들어 중간엽 줄기 세포의 입수를 포함한다. 그 후, 입수된 세포는 환자의 무혈관 영역의 복구에서 사용되는 세포 능력의 최적화를 허용하는 환경에서 시험관내에서 조건화된다. 충분한 개수의 최적화된 조건화된 세포가 존재하는 경우, 세포는 복구를 필요로 하는 무혈관 영역의 표적 부위에 위치된다. 일부 실시양태에서, 보조 치료가 부위로의 혈액 흐름/영양소 흐름을 향상시키기 위해 조건화된 세포와 조합하여 위치된다. 보조 치료의 타이밍은 전형적으로 조건화된 세포의 배치 직전, 동안 또는 직후이나, 다른 다수의 타이밍이 고려된다. 부위의 복구를 확실하게 하기 위해 절차가 반복될 수 있다 (오직 조건화된 세포 배치 또는 보조 치료의 반복 포함).
본원에서 줄기 세포 선택을 위한 무혈관 영역 조건은 일반적으로 1 내지 10% 산소, 2 내지 10% 이산화탄소, 변경된 pH, 변경된 영양 및 이들의 조합을 포함한다. 선택된 세포는 보조제, 예를 들어, 성장 인자, 시토카인, 인테그린, 카드헤린 등 및/또는 처리된 자가유래 혈소판과 조합하여 복구 부위에 위치될 수 있다.
<정의>
하기 정의는 본원에서 빈번하게 사용되는 특정 용어의 이해를 촉진하기 위해 제공되고, 본 개시의 범위를 제한하려는 것이 아니다.
본원에서 사용되는 "줄기 세포(들)"는 자가재생 및 효력의 특성을 보유하는 세포를 지칭한다. 중간엽 줄기 세포에 관하여, 이들 세포는 다능성이고, 골모세포, 연골세포, 근세포, 지방세포 및 다른 유사 세포로 분화하는 능력을 갖는다.
본원에서 사용되는 원판 팽출은 원판의 섬유테로의 수핵의 돌출을 지칭한다.
본원에서 사용되는 원판 탈출증은 섬유테의 경계 아래로의 수핵의 정출을 지칭한다.
본원에서 사용되는 내포된 원판 탈출증은 후종 인대에 의해 여전히 국한된 섬유테의 경계 아래로의 수핵의 정출을 지칭한다.
본원에서 사용되는 "환자"는 하나 이상의 손상되거나 노화된 무혈관 부위, 예를 들어 손상된 추간 원판을 갖는 포유동물, 및 보다 전형적으로 인간을 지칭한다. 손상된 원판에 관하여, 손상은 탈출된 원판, 팽출성 원판, 골절된 원판, 원판 돌출, 원판 정출, 원판 박리 및 다른 유사 원판 병을 포함할 수 있다.
"혈소판 및 혈소판 용해물"은 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 혈소판의 용해를 통해 방출된 혈소판에 함유된 천연 성장 인자의 조합을 포함한다. 이는 화학적 수단 (즉 CaCl2), 삼투압 수단 (증류 H2O의 사용)을 통해 또는 동결/해동 절차를 통해 달성될 수 있다. 본 발명의 혈소판 용해물은 또한 전혈로부터 유래될 수 있고, 미국 특허 제5,198,357호에 기재된 바와 같이 제조될 수 있으며, 이 특허는 본원에 참고로 포함된다.
"복구" 또는 "재생"은 상호교환적으로 사용되고, 표적 무혈관 영역 또는 무혈관 영역에 인접한 영역 내 손상된 구역의 부분 또는 완전 대체를 지칭한다. 예를 들어, 추간 원판의 복구는 원판 내 조직의 부분 또는 완전 복구 또는 대체를 포함한다. 복구 또는 재생은 또한 정상적으로 노화하는 환자에서 무혈관 영역의 복구 또는 재생, 즉, 노화에 의해 유도된 영역에 대한 손상의 복구를 지칭할 수 있다.
본원에서 사용되는 "환경"은 시험관내에서 또는 생체내에서 세포에 영향을 주거나 효과를 나타내는 조건의 전체 세트를 지칭한다.
본원에서 사용되는 "저산소 또는 저산소성"은 환경에서 10% 이하의 산소를 갖는 시험관내 또는 생체내 조건을 지칭한다.
"보조제" 또는 보조 치료는 성장 인자, 시토카인, 인테그린, 예를 들어, VEGF-A, PIGF, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, FGF, Ang1, Ang2, MCP-1 엔도글린, TGF-β, CCL2, VE-카드헤린 등을 포함한다.
본 발명에 따른 실시양태는 손상된 무혈관 영역, 예를 들어, 추간 원판의 복구 및 재생에 유용한 방법 및 조성물을 포함한다. 본원의 실시양태는 불량한 영양 및 저산소 조건 하에 자가유래 줄기 세포의 수확 및 증식이 무혈관 영역의 복구를 위한 더 능력있는 세포를 제공한다는 예상 밖의 발견을 근거로 한다. 추가로, 자가유래 혈소판과 조건화된 세포의 이식, 뿐만 아니라 손상된 부위로의 혈액 흐름의 촉진은 극적으로 향상된 복구를 제공한다. 이식은 또한 하나 이상의 보조 치료(들) (혈소판 함유 또는 비함유)를 포함할 수 있다. 마지막으로, 본원의 실시양태는 복구 및/또는 재생을 추가로 촉진하기 위해 손상된 부위 내 최적화된 부위에 이들 조건화된 세포 및 부수 물질을 투여하는 것을 포함한다.
줄기 세포
중간엽 줄기 세포 (MSC)는 재생 의학에서 치료제로서 매우 유망하다. 문헌 [Alhadlaq, A. and J.J. Mao, Mesenchymal stem cells: isolation and therapeutics. Stem Cells Dev, 2004. 13(4): p. 436-48]. [Barry, F.P., Mesenchymal stem cell therapy in joint disease. Novartis Found Symp, 2003. 249: p. 86-96; discussion 96-102, 170-4, 239-41]. [Bruder, S.P., D.J. Fink, and A.I. Caplan, Mesenchymal stem cells in bone development, bone repair, and skeletal regeneration therapy. J Cell Biochem, 1994. 56(3): p. 283-94]. [Cha, J. and V. Falanga, Stem cells in cutaneous wound healing. Clin Dermatol, 2007. 25(1): p. 73-8]. [Gangji, V., M. Toungouz, and J.P. Hauzeur, Stem cell therapy for osteonecrosis of the femoral head. Expert Opin Biol Ther, 2005. 5(4): p. 437-42]. 이들 성인 줄기 세포는 체내 많은 공급원으로부터 용이하게 단리될 수 있다. 문헌 [Alhadlaq, A. and J.J. Mao, Mesenchymal stem cells: isolation and therapeutics. Stem Cells Dev, 2004. 13(4): p. 436-48]. 또한, 근육, 골, 연골, 신경, 힘줄 및 다양한 내부 기관 세포로 분화하는 능력이 수많은 동물 연구에서 입증되었다. 요추 원판 퇴행 및 병리학이 유의한 장애 및 의료비의 주요 원인이다. 문헌 [Dagenais, S., J. Caro, and S. Haldeman, A systematic review of low back pain cost of illness studies in the United States and internationally. Spine J, 2008. 8(1): p. 8-20]. 수술적 치료, 예컨대 추간판절제술, 융합술 및 원판 대체술이 유의한 이환율에 대한 강한 잠재성으로 임상 실습에서 사용되어 왔다. 문헌 [de Kleuver, M., F.C. Oner, and W.C. Jacobs, Total disc replacement for chronic low back pain: background and a systematic review of the literature. Eur Spine J, 2003. 12(2): p. 108-16]. [Gotfryd, A. and O. Avanzi, A systematic review of randomized clinical trials using posterior discectomy to treat lumbar disc herniations. Int Orthop, 2008]. [Katonis, P., et al., Postoperative infections of the thoracic and lumbar spine: a review of 18 cases. Clin Orthop Relat Res, 2007. 454: p. 114-9]. 결과로서, 수술적 변경 또는 제거보다는 추간 원판 (IVD)을 복구하는 능력이 매력적인 치료 옵션이다. 사카이(Sakai) 등은 MSC가 모의된 원판 퇴행의 천자 모델을 사용하여 동물 연구에서 요추 원판을 복구할 수 있다는 것을 나타내었다. 문헌 [Sakai, D., et al., Regenerative effects of transplanting mesenchymal stem cells embedded in atelocollagen to the degenerated intervertebral disc. Biomaterials, 2006. 27(3): p. 335-345]. [Sakai, D., et al., Differentiation of mesenchymal stem cells transplanted to a rabbit degenerative disc model: potential and limitations for stem cell therapy in disc regeneration. Spine, 2005. 30(21): p. 2379-87]. [Sakai, D., et al., Transplantation of mesenchymal stem cells embedded in Atelocollagen gel to the intervertebral disc: a potential therapeutic model for disc degeneration. Biomaterials, 2003. 24(20): p. 3531-41]. 본 발명자들은 동물 IVD 모델과 인간 IVD 모델 간에 많은 생리학적 차이가 있다는 것을 인식하였다. 이는 인간에서 두발 역학과 비교하여 양, 돼지 및 뮤린 동물에서 네발로 생성되는 상이한 힘을 포함한다. 또한, 많은 동물 연구자들이 사용하는 퇴행성 원판 질환 (DDD)의 유명한 천자 모델은 급성으로 손상된 원판의 과학적 등가물을 생성한다. 인간 DDD는 종종 환자가 의학적 또는 수술적 치료를 추구하기 전에 수십년 동안 존재한다. 본원의 실시양태 (실시예 참조)는 VEGF 풍부화된 혈소판 유래 상등액을 갖는 인간 대상체의 후방 원판 테로 경피로 사용된 MSC가 유의한 원판 복구를 제공한다는 것을 나타낸다. 후방 원판 테에 세포를 위치시키는 결정은 수핵내 잘 한정된 무혈관 저밀도 영양소 환경과 비교하여 이러한 구역의 더 높은 혈관화에 부분적으로 기초하였다.
본 발명의 실시양태는 무혈관 부위 복구를 필요로 하는 환자로부터 줄기 세포의 수확을 포함한다. 본 발명에 따른 줄기 세포는 정의 부분에 상기 기재된 바와 같다. 일부 실시양태에서, 줄기 세포는 중간엽 줄기 세포, 즉, 다른 세포 유형 중에서도, 골모세포, 연골세포, 근세포, 지방세포 및 췌장도 세포로 분화할 수 있는 다능성 세포이다. 본 발명의 목적을 위해 많은 실시양태가 중간엽 줄기 세포와 관련되어 기재되어 있으나, 다른 줄기 세포 유형이 또한 사용될 수 있고, 본 발명의 범위 내에 포함된다는 것을 주목한다.
본 발명의 측면에 따른 줄기 세포 수확은 미국 특허 출원 일련 번호 제PCT/us08/68202호에 기재된 것을 포함하며, 이 출원은 그 전문이 참고로 포함된다. 또한, 미국 특허 제5,486,359호, 제6,387,367호 및 제5,197,985호에 기재된 바와 같은 방법 및 조성물은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
보다 상세하게, 중간엽 줄기 세포는 골수, 말초 혈액, 지방 조직 및 다른 유사 공급원에 위치된 다능성 줄기 세포이다. MSC는 수많은 세포 유형, 예를 들어 골모세포, 연골세포, 근세포, 지방세포 및 베타-췌장도 세포로 분화하는 능력을 갖는다.
본 발명의 공급원 MSC는 복원/대체 요법을 필요로 하는 환자 (또는 적합한 공여자)의 장골릉 (또는 다른 공급원 예컨대 IVD, 골막, 윤활액, 또는 척추체 또는 추궁근)으로부터 전형적으로 수확되며, 이러한 환자는 본원에서 "필요로 하는 환자 또는 이를 필요로 하는 환자"라고 지칭된다 (다른 공급원, 예컨대 지방 조직, 윤활 조직 및 결합 조직이 최근에 확인되었고 또한 본 발명의 범위 내에서 MSC 공급원으로 간주된다는 것을 주목한다). 한 실시양태에서, 대략 10 내지 100 cc의 골수가 미국 특허 출원 제60/761,441호 (Centeno)에 기재된 방법을 사용하여 또는 미국 특허 제5,486,359호 (Caplan et al.)에 기재된 바와 같이 플라스틱으로의 부착을 통해 수확되고 "단리된다". 이들 참고문헌은 각각 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 포함된다.
하기 보다 상세하게 기재된 바와 같이, 본 발명의 실시양태는 또한 어느 정도 수준 또는 양의 혈소판을 필요로 할 수 있다. 이와 같이, 본 발명은 혈소판 또는 혈소판 용해물 기술을 사용하기 위해 적절한 유핵 세포 개수 수율을 허용하는 표준 골수 채혈 방법에 변화를 도입한다. 또한, 이들 혈소판은 전혈로부터 수득될 수 있다. 공개된 연구의 막대한 대다수가 건강한 인간 또는 동물에서 다시 수행되기 때문에, 다양한 질환 상태를 갖는 인간으로 이러한 기술을 적용하는 것은 결코 시험되지 않았다. 각각의 측면에서 3개의 소량 2-3 cc 골수 분취액 (총 6개의 분취액)을 채혈하는 변경된 기술의 사용이 20% 혈소판 용해물에서 성공적으로 증식된 필요한 유핵 세포 수율을 생성하였다는 것을 주목한다.
본원에서 사용하기 위한 혈소판 및 혈소판 용해물은 두세(Doucet)의 방법 (문헌 [Doucet, Ernou et al., 2005 J. Cell Physiol 205(2): 288-36])을 사용하여 골수 수확물로부터 제조되며, 이 문헌은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다. 전형적인 용해물은 약 수천만개 또는 수천억개의 혈소판을 포함한다. 문헌 [Martineau et al., Biomaterials, 2004 25(18) p4489-503] (그 전문이 본원에 참고로 포함됨)에 표시된 바와 같이, 혈소판 용해물은 일관된 MSC 성장을 촉진하는데 필요한 성장 인자를 본질적으로 포함한다. 전형적인 실시양태에서, 혈소판 용해물 및 MSC는 자가유래이고, MSC의 효과적이고 일관된 증식에 유용한 양으로 존재한다 (하기 보다 상세히 기재됨). 특히, 성장 인자, 예컨대 TGF-베타의 수준이 MSC를 증식시키는데 흔히 사용되는 것보다 혈소판 용해물에 훨씬 더 낮으나, 혈소판 용해물에 함유된 낮은 수준의 성장 인자 모두가 함께 사용되는 경우 유의한 상승작용적 효과가 존재하는 것으로 여겨진다는 것을 주목해야 한다.
줄기 세포 선택 (선택압)
수확된 줄기 세포는 줄기 세포 (전형적으로 중간엽 줄기 세포) 및 궁극적으로 복구를 필요로 하는 부위, 예를 들어 복구를 필요로 하는 원판에서 발견되는 조건과 유사한 환경적 조건 하에 생존가능하고 증식하는 줄기 세포를 선택하기 위해 배양된다. 추간 원판 복구와 관련된 선택압이 하기 더욱 상세하게 논의되어 있으나, 유사한 조건이 존재하고 엉덩이, 어깨 등에 필요한 조건에 대해 확인가능하다.
문헌 [Urban et al., Nutrition of the intervertebral Disc. Spine, 2004. 29 (23): p2700-9] (그 전문이 본원에 참고로 포함됨)에서 논의된 바와 같이, 손상을 앓고 퇴행성인 추간 원판은 불량한 영양 환경 뿐만 아니라 산소 환경을 제공한다. 이러한 환경은 건강한 추간 원판의 환경과는 별개이다. 사실은, 손상된 원판에 이식된 중간엽 줄기 세포의 생존성을 결정하기 위해 수행된 연구는 불량한 세포 생존성 결과를 나타내며, 소수의 세포가 향상된 원판 복구에 필요한 세포의 필수 개수를 제공하기 위해 증식할 수 있다 (문헌 [Wuertz et al., Behavior of mesenchymal stem cells in the chemical microenvironment of the intervertebral disc. Spine, 2008. 33(17): p 1843-9], 그 전문이 본원에 참고로 포함됨).
보다 상세하게, 원판 복구 또는 복원을 필요로 하는 환자로부터 수확된 줄기 세포가 배양 조건 하에 위치된다. 한 실시양태에서, 배양 배지는 DMEM 또는 다른 유사 배지로부터 제조된 기초 세포 배양 배지이다. 배양 배지는 당, 아미노산, 지질, 미네랄, 단백질 또는 줄기 세포 증식을 촉진하기 위한 다른 유사 물질로 보충될 수 있다.
또한, 본원의 실시양태는 손상된 원판의 환경을 모의하는 다양한 대기 조건 하에 수확된 중간엽 줄기 세포를 배양하고 증식시키는 것을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 수확된 줄기 세포는 1 내지 15% 산소 하에 시험관내에서 배양된다. 일부 경우에 수확된 줄기 세포는 3 내지 10% 산소 하에 배양되고, 다른 경우에 수확된 줄기 세포는 3 내지 7% 산소 하에 배양된다. 이들 더 낮은 산소 조건은 전형적인 손상된 원판 환경에 존재하는 저산소 조건을 복제한다. 저산소 조건은 줄기 세포 증식 기간의 일부 또는 전체 동안 존재할 수 있으나, 전형적으로 세포가 시험관내에서 배양되는 시간의 1/3 이상 동안 존재한다. 세포가 배양될 때 선택이 수행되며, 생존하고 궁극적으로 증식할 수 있는 생존가능한 세포는 저산소 환경을 갖는 원판으로 이식되는 경우 장점을 갖는다.
다른 실시양태에서, 수확된 줄기 세포는 상승된 이산화탄소 조건, 전형적으로 2 내지 10% 이산화탄소 하에 시험관내에서 배양된다. 수확된 세포는 또한 조합된 상승된 이산화탄소 및 저산소 환경에서 배양될 수 있으며, 여기서 조건은 2 내지 10% 이산화탄소 및 3 내지 10% 산소를 포함한다. 상기와 같이, 세포가 배양될 때 선택이 수행되며, 생존하고 궁극적으로 증식할 수 있는 생존가능한 세포는 상승된 이산화탄소 환경 또는 저산소 환경과 조합된 상승된 이산화탄소 환경을 갖는 원판으로 이식시 장점을 갖는다.
다른 실시양태에서, 수확된 줄기 세포는 수확되고 배양된 수핵 세포 (NP 세포) 또는 섬유테 세포 (AF 세포)와 조합하여 배양되고 증식된다. 줄기 세포와의 공동-배양을 위한 수핵 (NP) 세포는 바늘 흡인 또는 다른 유사 기술을 통해 원판 복구를 필요로 하는 환자로부터 수확될 수 있다. 이들 NP 세포 또는 AF 세포는 자가유래 또는 비자가유래일 수 있다. 전형적인 실시양태에서, 대략 103 내지 109개 NP 또는 AF 세포가 수확된 줄기 세포와 공동-배양되고, NP 세포 및/또는 AF 세포 방출된 인자 및 노폐물에 반응하는 줄기 세포의 선택에 유용한 환경을 제공하도록 허용된다. 공동-배양 조건은 불량한 영양 환경, 저산소, 상승된 이산화탄소 및 본원에 기재된 다른 개시된 실시양태를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, NP 세포는 줄기 세포와 별개의 시험관내 플라스크 (또는 다른 유사 용기)에서 배양된다. 그 후, NP 세포 배양으로부터 소비된 배지는 줄기 세포 배양 동안 상기 배지 조건과 조합될 수 있거나, 또는 오직 이러한 조건 하에 생존성을 유지하고 궁극적으로 증식할 수 있는 줄기 세포를 증식시키고 선택하는데 사용될 수 있다.
다른 실시양태에서, 수확된 줄기 세포는 손상된 추간 원판에서 발견되는 조건과 유사한 변형된 pH 조건 하에 배양되고 증식된다. 예를 들어, 시험관내 배양 배지 (본원에 기재된 바와 같음)는 6.6 내지 7.0, 및 보다 전형적으로 6.7 내지 6.9의 pH를 갖도록 변형될 수 있다. 변형된 pH는 원판 복구 및 재생에서 사용하기 위한 줄기 세포의 선택을 촉진하기 위해 본원에서 논의된 배양 조건 중 임의의 조건과 조합될 수 있다.
다른 실시양태에서, 수확된 줄기 세포는 손상된 추간 원판에서 발견되는 조건과 유사한 변형된 삼투압농도 조건 하에 배양되고 증식된다. 예를 들어, 시험관내 배양 배지 (본원에 기재된 바와 같음)는 350 내지 600 mOsm, 및 보다 전형적으로 450 내지 500 MOsm의 삼투압농도를 갖도록 변형될 수 있다. 변형된 삼투압농도는 원판 복구 및 재생에서 사용하기 위한 줄기 세포의 선택을 촉진하기 위해 본원에서 논의된 배양 조건 중 임의의 조건과 조합될 수 있다.
다른 실시양태에서, 하나 이상의 선택 조건 하에 줄기 세포의 생존성 및 증식은 1종 이상의 성장 인자의 포함에 의해 변형될 수 있다. 이들 경우에, 선택 조건 하에 세포는 TGF-베타 FGF, PDGF, IGF 및/또는 HIF-1 알파, 예를 들어 이들의 혼합물 및 다른 유사 인자의 존재하에 배양된다.
상기 줄기 세포 배양 기재 실시양태 중 각각에 대해, 조건(들)은 세포 표준 배양 환경에 서서히 혼입될 수 있다는 것을 주목한다. 예를 들어, 수확된 줄기 세포는 초기에 10% 산소 하에 1 또는 2 계대 동안 배양된 후, 9% 산소 조건으로 1 또는 2 계대 동안 이동되고, 표적 저산소 조건이 수득될 때까지 감소하는 수준의 산소 하에 배양될 수 있다. 이러한 절차 하에, 세포는 서서히 손상된 원판에 존재하는 환경에 순응하게 된다.
하기 치료 절차는 손상된 원판의 치료와 관련하여 기재되어 있으나, 다른 무혈관 영역의 치료가 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 고려된다.
손상된 추간 원판의 치료
상기 논의된 손상된 원판 변형인자 중 하나 이상에 의해 선택된 줄기 세포는 환자의 손상된 원판으로의 이식을 위해 충분한 개수의 세포가 존재할 때까지 증식하게 된다. 전형적인 실시양태에서, 손상된 원판으로의 이식을 위해 약 105 내지 109개 선택된 중간엽 줄기 세포가 필요하다.
환자의 신체로의 이식으로 의도되지 않은 물질, 즉, 배지 구성요소, 노폐물 등을 포함하지 않는 세포 집단을 수득하기 위해, 배양된 세포는 PBS 또는 다른 유사 완충액을 사용하여 세척된다. 세척된 줄기 세포는 NP 세포를 포함할 수 있으나, 줄기 세포가 NP 세포와 공동-배양되는 경우, NP 세포 집단은 세포 분류 기술 또는 친화도 크로마토그래피를 통해 제거될 수 있는 것으로 고려된다. 줄기 세포는 현재 이를 필요로 하는 환자로 바로 이식가능하다.
한 실시양태에서, 세척된 줄기 세포는 손상된 원판의 후방 테로 직접적으로 이식된다. 통상적인 방법은 수핵으로의 세포의 이식을 나타내기 때문에, 이는 줄기 세포의 이식을 위한 예상 밖의 위치이다. 세포는 당업계에 공지된 기술을 통해, 예를 들어 경피 x선 유도 또는 수술적 IVD 접근법을 통해 손상된 원판의 후방 테로 이식된다. 세포 이식의 1회 이상의 반복이 손상된 원판을 위한 복구 절차에서 사용될 수 있으나, 치료 사이에 14 내지 180일의 기간이 전형적이다.
또 다른 실시양태에서, 치료요법을 필요로 하는 환자로부터의 자가유래 혈소판은 대략 1 내지 7일 동안 트롬빈 및 CaCl2로 예비처리된다. 이러한 처리는 이들 혈소판이 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)를 우선적으로 발현하도록 예비조건화한다. 일부 실시양태에서, 수확된 혈소판은 대략 28.56 U/ml 트롬빈 및 대략 2.86 mg/ml CaCl2로 예비처리된다. 추가 실시양태에서, 이를 필요로 하는 환자로부터의 자가유래 혈소판은 트롬빈, 칼슘 또는 그의 염, 트롬복산 A2, 아데노신 트리포스페이트 및 아라키도네이트의 조합으로 예비처리된다. 상기와 같이, 예비처리는 이를 필요로 하는 환자로의 이식전 1 내지 7일에 수행될 수 있다. 그 후, 예비조건화된 자가유래 혈소판은 본 발명의 이전에 논의된 선택된 조건화된 줄기 세포의 이식 전에, 동안 또는 후에 이식된다. 혈소판은 일반적으로 이식된 줄기 세포와 동일한 위치에 이식된다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 수확되고 선택된 줄기 세포는 하나 이상의 보조제 또는 보조 치료, 예를 들어 성장 인자, 시토카인, 인테그린, 카드헤린, 또는 혈관형성, 맥관형성 또는 동맥형성을 촉진하는 것으로 공지된 분자 또는 약물, 예를 들어 VEGF-A, PIGF, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, TGF-β, Ang-1, Ang-2, IGF, HGF, FGF, Tie2, PDGF, CCL2, 알파-V 베타-5, 알파-5 베타-1, VE-카드헤린, PECAM-1, 플라스미노겐 활성화인자 및 질소 산화물 신타제와 함께 이식된다. 별법의 실시양태에서, 이를 필요로 하는 환자에서 이식에서 사용하기 위한 줄기 세포는 성장 인자, 예를 들어 TGF-β, FGF, PDGF, IGF, 또는 줄기 세포 및/또는 중간엽 줄기 세포 엄격함 또는 증식을 촉진하도록 의도된 다른 유사 성장 인자의 조합과 함께 공동-이식된다. 일부 실시양태에서 자가유래 혈소판 또는 혈소판 용해물은 상기 언급된 보조제와 조합하여 이식될 수 있다.
도 1은 중첩된 바늘 배치를 갖는 종축 요부 도면을 나타내는 본 발명의 한 실시양태의 유용성을 예시한다. 본원에 기재된 실시양태를 사용하여 조건화된 줄기 세포를 후방 원판 테의 혈관 및 이행 혈관 영역에 위치시켰다.
도 2는 본원에 제공된 기술에 따라 단층 배양에서 성장된 MSC를 나타낸다.
도 3은 L5-S1 원판의 후방 원판 테로의 MSC 및 혈소판 유래 VEGF 상등액의 주사 위치의 예시적인 형광투시 영상이다 (대상체 ML). 후방 원판 테 내 조영제의 농도를 주목한다 (청색으로 향상된 조영제 흐름).
도 4는 줄기 세포 이식 후 수행된 혈소판 유래 VEGF 상등액 주사로 달성된 예시적 경막외 흐름을 나타낸다.
도 5는 절차 1개월 미만 전에 찍은 ML 단시간반전회복 (Short Tau Inversion Recovery; STIR) 영상을 제공한다. 이러한 시상 슬라이스는 내포된 L5-S1 원판 정출의 최대 정도를 나타내기 때문에 선택된다. 1:01 p.m.의 하루 중 영상화 시간으로 ET=6, TR=4816.7, TE=48.1. 이러한 영상은 L5-S1에서 0.7 cm 원판 정출을 나타낸다. 중심 원판에서 측정된 L5-S1 원판 높이는 0.5 cm이며, L4-L5 높이는 0.7 cm이다.
도 6은 동일한 STIR 파라미터를 사용하여 ML 절차후 1개월 매칭 시상 슬라이스를 제공한다. ET=6, TR=4816.7, TE=48.1. 하루 중 영상화 시간은 11:01 a.m.이었다. 이러한 영상은 L5-S1에서 0.3 cm 원판 정출을 나타낸다. L5-S1에서 원판 높이 0.5 cm 및 L4-L5에서 0.7 cm를 주목한다.
도 7은 동일한 STIR 파라미터를 사용하여 ML 절차후 5개월 매칭 시상 슬라이스를 제공한다. ET=6, TR=4816.7, TE=48.3. 하루 중 영상화 시간은 10:23 a.m.이었다. 이러한 영상은 L5-S1에서 0.3 cm 원판 정출을 나타낸다. L5-S1에서 원판 높이 0.5 cm 및 L4-L5에서 0.7 cm를 주목한다.
도 8은 내포된 L4-L5 원판 정출의 최대 정도를 통한 MJM 절차전 시상 슬라이스를 제공한다. 영상을 12:15 pm에 찍었다. ET=6, TR=4816.7, TE=48.1. L4-L5 원판 정출이 6 mm에서 측정된다. 이러한 슬라이스 상의 원판의 중간 부분에서 측정된 원판 높이는 다음과 같았다: L4-L5=8 mm, L5-S1=7 mm, S1-S2=5 mm.
도 9는 동일한 영상화 파라미터로 MJM 절차후 2개월 매칭 시상 STIR 슬라이스를 제공한다. ET=6, TR=4816.7, TE=48.1. 영상을 12:35 pm에서 찍었다. L4-L5 원판 정출이 3 mm에서 측정된다. 절차전과 동일한 측정된 원판 높이: L4-L5=8 mm, L5-S1=7 mm, S1-S2=5 mm.
도 10은 MJM 절차후 4.5개월을 제공한다. 이는 동일한 영상화 파라미터로 매칭 시상 STIR 슬라이스이다. ET=6, TR=4833.3, TE=48.2. 영상을 12:27 pm에 찍었다. L4-L5 원판 정출은 3 mm에서 측정된다. 절차전과 동일한 측정된 원판 높이: L4-L5=8 mm, L5-S1=7 mm, S1-S2=5 mm.
도 11은 L5-S1 원판 돌출의 최대 정도를 통한 HO 절차전 시상 STIR 슬라이스를 제공한다. ET=6, TR=4816.7, TE=48.3. 하루 중 영상 시간은 11:26 a.m.이었다. L5-S1 원판 돌출이 9 mm에서 측정된다. 원판 높이 측정: L4-L5=6 mm, L5-S1=8 mm.
도 12는 HO 절차후 6주 시상 매칭 STIR 슬라이스를 제공한다. 영상화 파라미터는 ET=6, TR=4816.7, TE=48.3에서 일정하게 유지되었다. 하루 중 영상 시간은 11:25 a.m.이었다. L5-S1 원판 돌출이 8 mm에서 측정된다. 원판 높이 측정: L4-L5=6 mm, L5-S1=8 mm.
도 13은 HO 절차후 3.5개월 매칭 시상 STIR 슬라이스를 제공한다. 영상화 파라미터는 ET=6, TR=4816.7, TE=48.3에서 일정하게 유지되었다. 하루 중 영상 시간은 1:10 p.m.이었다. L5-S1 원판 돌출이 9 mm에서 측정된다. 원판 높이 측정: L4-L5=6 mm, L5-S1=8 mm.
도 14는 HO에서 조영제 흐름 (청색에서 향상됨)이 후방 원판 테인 의도된 표적보다 더 전형적인 뉴클레오그램임을 나타낸다.
<상세한 설명>
본 발명은 하나 이상의 불량한 영양 영역 또는 적대적 환경, 즉, 무혈관 영역을 갖는 손상된 조직의 복구에서 사용하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 불량한 영양 영역 또는 적대적 환경은 전형적으로 혈관 혈액 공급이 제한되거나 부족한 조직, 즉, 본원에서 무혈관 이행 영역이라고 불리는 곳에 위치된다. 이점에 비추어 영역 또는 환경은 추간 원판, 엉덩이, 어깨 (회전 근개 포함) 및 다른 유사 부위를 포함한다. 본원의 실시양태는 무혈관 영역의 복구를 필요로 하는 환자로부터 줄기 세포, 예를 들어 중간엽 줄기 세포의 입수를 포함한다. 그 후, 입수된 세포는 환자의 무혈관 영역의 복구에서 사용되는 세포 능력의 최적화를 허용하는 환경에서 시험관내에서 조건화된다. 충분한 개수의 최적화된 조건화된 세포가 존재하는 경우, 세포는 복구를 필요로 하는 무혈관 영역의 표적 부위에 위치된다. 일부 실시양태에서, 보조 치료가 부위로의 혈액 흐름/영양소 흐름을 향상시키기 위해 조건화된 세포와 조합하여 위치된다. 보조 치료의 타이밍은 전형적으로 조건화된 세포의 배치 직전, 동안 또는 직후이나, 다른 다수의 타이밍이 고려된다. 부위의 복구를 확실하게 하기 위해 절차가 반복될 수 있다 (오직 조건화된 세포 배치 또는 보조 치료의 반복 포함).
본원에서 줄기 세포 선택을 위한 무혈관 영역 조건은 일반적으로 1 내지 10% 산소, 2 내지 10% 이산화탄소, 변경된 pH, 변경된 영양 및 이들의 조합을 포함한다. 선택된 세포는 보조제, 예를 들어, 성장 인자, 시토카인, 인테그린, 카드헤린 등 및/또는 처리된 자가유래 혈소판과 조합하여 복구 부위에 위치될 수 있다.
<정의>
하기 정의는 본원에서 빈번하게 사용되는 특정 용어의 이해를 촉진하기 위해 제공되고, 본 개시의 범위를 제한하려는 것이 아니다.
본원에서 사용되는 "줄기 세포(들)"는 자가재생 및 효력의 특성을 보유하는 세포를 지칭한다. 중간엽 줄기 세포에 관하여, 이들 세포는 다능성이고, 골모세포, 연골세포, 근세포, 지방세포 및 다른 유사 세포로 분화하는 능력을 갖는다.
본원에서 사용되는 원판 팽출은 원판의 섬유테로의 수핵의 돌출을 지칭한다.
본원에서 사용되는 원판 탈출증은 섬유테의 경계 아래로의 수핵의 정출을 지칭한다.
본원에서 사용되는 내포된 원판 탈출증은 후종 인대에 의해 여전히 국한된 섬유테의 경계 아래로의 수핵의 정출을 지칭한다.
본원에서 사용되는 "환자"는 하나 이상의 손상되거나 노화된 무혈관 부위, 예를 들어 손상된 추간 원판을 갖는 포유동물, 및 보다 전형적으로 인간을 지칭한다. 손상된 원판에 관하여, 손상은 탈출된 원판, 팽출성 원판, 골절된 원판, 원판 돌출, 원판 정출, 원판 박리 및 다른 유사 원판 병을 포함할 수 있다.
"혈소판 및 혈소판 용해물"은 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 혈소판의 용해를 통해 방출된 혈소판에 함유된 천연 성장 인자의 조합을 포함한다. 이는 화학적 수단 (즉 CaCl2), 삼투압 수단 (증류 H2O의 사용)을 통해 또는 동결/해동 절차를 통해 달성될 수 있다. 본 발명의 혈소판 용해물은 또한 전혈로부터 유래될 수 있고, 미국 특허 제5,198,357호에 기재된 바와 같이 제조될 수 있으며, 이 특허는 본원에 참고로 포함된다.
"복구" 또는 "재생"은 상호교환적으로 사용되고, 표적 무혈관 영역 또는 무혈관 영역에 인접한 영역 내 손상된 구역의 부분 또는 완전 대체를 지칭한다. 예를 들어, 추간 원판의 복구는 원판 내 조직의 부분 또는 완전 복구 또는 대체를 포함한다. 복구 또는 재생은 또한 정상적으로 노화하는 환자에서 무혈관 영역의 복구 또는 재생, 즉, 노화에 의해 유도된 영역에 대한 손상의 복구를 지칭할 수 있다.
본원에서 사용되는 "환경"은 시험관내에서 또는 생체내에서 세포에 영향을 주거나 효과를 나타내는 조건의 전체 세트를 지칭한다.
본원에서 사용되는 "저산소 또는 저산소성"은 환경에서 10% 이하의 산소를 갖는 시험관내 또는 생체내 조건을 지칭한다.
"보조제" 또는 보조 치료는 성장 인자, 시토카인, 인테그린, 예를 들어, VEGF-A, PIGF, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, FGF, Ang1, Ang2, MCP-1 엔도글린, TGF-β, CCL2, VE-카드헤린 등을 포함한다.
본 발명에 따른 실시양태는 손상된 무혈관 영역, 예를 들어, 추간 원판의 복구 및 재생에 유용한 방법 및 조성물을 포함한다. 본원의 실시양태는 불량한 영양 및 저산소 조건 하에 자가유래 줄기 세포의 수확 및 증식이 무혈관 영역의 복구를 위한 더 능력있는 세포를 제공한다는 예상 밖의 발견을 근거로 한다. 추가로, 자가유래 혈소판과 조건화된 세포의 이식, 뿐만 아니라 손상된 부위로의 혈액 흐름의 촉진은 극적으로 향상된 복구를 제공한다. 이식은 또한 하나 이상의 보조 치료(들) (혈소판 함유 또는 비함유)를 포함할 수 있다. 마지막으로, 본원의 실시양태는 복구 및/또는 재생을 추가로 촉진하기 위해 손상된 부위 내 최적화된 부위에 이들 조건화된 세포 및 부수 물질을 투여하는 것을 포함한다.
줄기 세포
중간엽 줄기 세포 (MSC)는 재생 의학에서 치료제로서 매우 유망하다. 문헌 [Alhadlaq, A. and J.J. Mao, Mesenchymal stem cells: isolation and therapeutics. Stem Cells Dev, 2004. 13(4): p. 436-48]. [Barry, F.P., Mesenchymal stem cell therapy in joint disease. Novartis Found Symp, 2003. 249: p. 86-96; discussion 96-102, 170-4, 239-41]. [Bruder, S.P., D.J. Fink, and A.I. Caplan, Mesenchymal stem cells in bone development, bone repair, and skeletal regeneration therapy. J Cell Biochem, 1994. 56(3): p. 283-94]. [Cha, J. and V. Falanga, Stem cells in cutaneous wound healing. Clin Dermatol, 2007. 25(1): p. 73-8]. [Gangji, V., M. Toungouz, and J.P. Hauzeur, Stem cell therapy for osteonecrosis of the femoral head. Expert Opin Biol Ther, 2005. 5(4): p. 437-42]. 이들 성인 줄기 세포는 체내 많은 공급원으로부터 용이하게 단리될 수 있다. 문헌 [Alhadlaq, A. and J.J. Mao, Mesenchymal stem cells: isolation and therapeutics. Stem Cells Dev, 2004. 13(4): p. 436-48]. 또한, 근육, 골, 연골, 신경, 힘줄 및 다양한 내부 기관 세포로 분화하는 능력이 수많은 동물 연구에서 입증되었다. 요추 원판 퇴행 및 병리학이 유의한 장애 및 의료비의 주요 원인이다. 문헌 [Dagenais, S., J. Caro, and S. Haldeman, A systematic review of low back pain cost of illness studies in the United States and internationally. Spine J, 2008. 8(1): p. 8-20]. 수술적 치료, 예컨대 추간판절제술, 융합술 및 원판 대체술이 유의한 이환율에 대한 강한 잠재성으로 임상 실습에서 사용되어 왔다. 문헌 [de Kleuver, M., F.C. Oner, and W.C. Jacobs, Total disc replacement for chronic low back pain: background and a systematic review of the literature. Eur Spine J, 2003. 12(2): p. 108-16]. [Gotfryd, A. and O. Avanzi, A systematic review of randomized clinical trials using posterior discectomy to treat lumbar disc herniations. Int Orthop, 2008]. [Katonis, P., et al., Postoperative infections of the thoracic and lumbar spine: a review of 18 cases. Clin Orthop Relat Res, 2007. 454: p. 114-9]. 결과로서, 수술적 변경 또는 제거보다는 추간 원판 (IVD)을 복구하는 능력이 매력적인 치료 옵션이다. 사카이(Sakai) 등은 MSC가 모의된 원판 퇴행의 천자 모델을 사용하여 동물 연구에서 요추 원판을 복구할 수 있다는 것을 나타내었다. 문헌 [Sakai, D., et al., Regenerative effects of transplanting mesenchymal stem cells embedded in atelocollagen to the degenerated intervertebral disc. Biomaterials, 2006. 27(3): p. 335-345]. [Sakai, D., et al., Differentiation of mesenchymal stem cells transplanted to a rabbit degenerative disc model: potential and limitations for stem cell therapy in disc regeneration. Spine, 2005. 30(21): p. 2379-87]. [Sakai, D., et al., Transplantation of mesenchymal stem cells embedded in Atelocollagen gel to the intervertebral disc: a potential therapeutic model for disc degeneration. Biomaterials, 2003. 24(20): p. 3531-41]. 본 발명자들은 동물 IVD 모델과 인간 IVD 모델 간에 많은 생리학적 차이가 있다는 것을 인식하였다. 이는 인간에서 두발 역학과 비교하여 양, 돼지 및 뮤린 동물에서 네발로 생성되는 상이한 힘을 포함한다. 또한, 많은 동물 연구자들이 사용하는 퇴행성 원판 질환 (DDD)의 유명한 천자 모델은 급성으로 손상된 원판의 과학적 등가물을 생성한다. 인간 DDD는 종종 환자가 의학적 또는 수술적 치료를 추구하기 전에 수십년 동안 존재한다. 본원의 실시양태 (실시예 참조)는 VEGF 풍부화된 혈소판 유래 상등액을 갖는 인간 대상체의 후방 원판 테로 경피로 사용된 MSC가 유의한 원판 복구를 제공한다는 것을 나타낸다. 후방 원판 테에 세포를 위치시키는 결정은 수핵내 잘 한정된 무혈관 저밀도 영양소 환경과 비교하여 이러한 구역의 더 높은 혈관화에 부분적으로 기초하였다.
본 발명의 실시양태는 무혈관 부위 복구를 필요로 하는 환자로부터 줄기 세포의 수확을 포함한다. 본 발명에 따른 줄기 세포는 정의 부분에 상기 기재된 바와 같다. 일부 실시양태에서, 줄기 세포는 중간엽 줄기 세포, 즉, 다른 세포 유형 중에서도, 골모세포, 연골세포, 근세포, 지방세포 및 췌장도 세포로 분화할 수 있는 다능성 세포이다. 본 발명의 목적을 위해 많은 실시양태가 중간엽 줄기 세포와 관련되어 기재되어 있으나, 다른 줄기 세포 유형이 또한 사용될 수 있고, 본 발명의 범위 내에 포함된다는 것을 주목한다.
본 발명의 측면에 따른 줄기 세포 수확은 미국 특허 출원 일련 번호 제PCT/us08/68202호에 기재된 것을 포함하며, 이 출원은 그 전문이 참고로 포함된다. 또한, 미국 특허 제5,486,359호, 제6,387,367호 및 제5,197,985호에 기재된 바와 같은 방법 및 조성물은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
보다 상세하게, 중간엽 줄기 세포는 골수, 말초 혈액, 지방 조직 및 다른 유사 공급원에 위치된 다능성 줄기 세포이다. MSC는 수많은 세포 유형, 예를 들어 골모세포, 연골세포, 근세포, 지방세포 및 베타-췌장도 세포로 분화하는 능력을 갖는다.
본 발명의 공급원 MSC는 복원/대체 요법을 필요로 하는 환자 (또는 적합한 공여자)의 장골릉 (또는 다른 공급원 예컨대 IVD, 골막, 윤활액, 또는 척추체 또는 추궁근)으로부터 전형적으로 수확되며, 이러한 환자는 본원에서 "필요로 하는 환자 또는 이를 필요로 하는 환자"라고 지칭된다 (다른 공급원, 예컨대 지방 조직, 윤활 조직 및 결합 조직이 최근에 확인되었고 또한 본 발명의 범위 내에서 MSC 공급원으로 간주된다는 것을 주목한다). 한 실시양태에서, 대략 10 내지 100 cc의 골수가 미국 특허 출원 제60/761,441호 (Centeno)에 기재된 방법을 사용하여 또는 미국 특허 제5,486,359호 (Caplan et al.)에 기재된 바와 같이 플라스틱으로의 부착을 통해 수확되고 "단리된다". 이들 참고문헌은 각각 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 포함된다.
하기 보다 상세하게 기재된 바와 같이, 본 발명의 실시양태는 또한 어느 정도 수준 또는 양의 혈소판을 필요로 할 수 있다. 이와 같이, 본 발명은 혈소판 또는 혈소판 용해물 기술을 사용하기 위해 적절한 유핵 세포 개수 수율을 허용하는 표준 골수 채혈 방법에 변화를 도입한다. 또한, 이들 혈소판은 전혈로부터 수득될 수 있다. 공개된 연구의 막대한 대다수가 건강한 인간 또는 동물에서 다시 수행되기 때문에, 다양한 질환 상태를 갖는 인간으로 이러한 기술을 적용하는 것은 결코 시험되지 않았다. 각각의 측면에서 3개의 소량 2-3 cc 골수 분취액 (총 6개의 분취액)을 채혈하는 변경된 기술의 사용이 20% 혈소판 용해물에서 성공적으로 증식된 필요한 유핵 세포 수율을 생성하였다는 것을 주목한다.
본원에서 사용하기 위한 혈소판 및 혈소판 용해물은 두세(Doucet)의 방법 (문헌 [Doucet, Ernou et al., 2005 J. Cell Physiol 205(2): 288-36])을 사용하여 골수 수확물로부터 제조되며, 이 문헌은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다. 전형적인 용해물은 약 수천만개 또는 수천억개의 혈소판을 포함한다. 문헌 [Martineau et al., Biomaterials, 2004 25(18) p4489-503] (그 전문이 본원에 참고로 포함됨)에 표시된 바와 같이, 혈소판 용해물은 일관된 MSC 성장을 촉진하는데 필요한 성장 인자를 본질적으로 포함한다. 전형적인 실시양태에서, 혈소판 용해물 및 MSC는 자가유래이고, MSC의 효과적이고 일관된 증식에 유용한 양으로 존재한다 (하기 보다 상세히 기재됨). 특히, 성장 인자, 예컨대 TGF-베타의 수준이 MSC를 증식시키는데 흔히 사용되는 것보다 혈소판 용해물에 훨씬 더 낮으나, 혈소판 용해물에 함유된 낮은 수준의 성장 인자 모두가 함께 사용되는 경우 유의한 상승작용적 효과가 존재하는 것으로 여겨진다는 것을 주목해야 한다.
줄기 세포 선택 (선택압)
수확된 줄기 세포는 줄기 세포 (전형적으로 중간엽 줄기 세포) 및 궁극적으로 복구를 필요로 하는 부위, 예를 들어 복구를 필요로 하는 원판에서 발견되는 조건과 유사한 환경적 조건 하에 생존가능하고 증식하는 줄기 세포를 선택하기 위해 배양된다. 추간 원판 복구와 관련된 선택압이 하기 더욱 상세하게 논의되어 있으나, 유사한 조건이 존재하고 엉덩이, 어깨 등에 필요한 조건에 대해 확인가능하다.
문헌 [Urban et al., Nutrition of the intervertebral Disc. Spine, 2004. 29 (23): p2700-9] (그 전문이 본원에 참고로 포함됨)에서 논의된 바와 같이, 손상을 앓고 퇴행성인 추간 원판은 불량한 영양 환경 뿐만 아니라 산소 환경을 제공한다. 이러한 환경은 건강한 추간 원판의 환경과는 별개이다. 사실은, 손상된 원판에 이식된 중간엽 줄기 세포의 생존성을 결정하기 위해 수행된 연구는 불량한 세포 생존성 결과를 나타내며, 소수의 세포가 향상된 원판 복구에 필요한 세포의 필수 개수를 제공하기 위해 증식할 수 있다 (문헌 [Wuertz et al., Behavior of mesenchymal stem cells in the chemical microenvironment of the intervertebral disc. Spine, 2008. 33(17): p 1843-9], 그 전문이 본원에 참고로 포함됨).
보다 상세하게, 원판 복구 또는 복원을 필요로 하는 환자로부터 수확된 줄기 세포가 배양 조건 하에 위치된다. 한 실시양태에서, 배양 배지는 DMEM 또는 다른 유사 배지로부터 제조된 기초 세포 배양 배지이다. 배양 배지는 당, 아미노산, 지질, 미네랄, 단백질 또는 줄기 세포 증식을 촉진하기 위한 다른 유사 물질로 보충될 수 있다.
또한, 본원의 실시양태는 손상된 원판의 환경을 모의하는 다양한 대기 조건 하에 수확된 중간엽 줄기 세포를 배양하고 증식시키는 것을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 수확된 줄기 세포는 1 내지 15% 산소 하에 시험관내에서 배양된다. 일부 경우에 수확된 줄기 세포는 3 내지 10% 산소 하에 배양되고, 다른 경우에 수확된 줄기 세포는 3 내지 7% 산소 하에 배양된다. 이들 더 낮은 산소 조건은 전형적인 손상된 원판 환경에 존재하는 저산소 조건을 복제한다. 저산소 조건은 줄기 세포 증식 기간의 일부 또는 전체 동안 존재할 수 있으나, 전형적으로 세포가 시험관내에서 배양되는 시간의 1/3 이상 동안 존재한다. 세포가 배양될 때 선택이 수행되며, 생존하고 궁극적으로 증식할 수 있는 생존가능한 세포는 저산소 환경을 갖는 원판으로 이식되는 경우 장점을 갖는다.
다른 실시양태에서, 수확된 줄기 세포는 상승된 이산화탄소 조건, 전형적으로 2 내지 10% 이산화탄소 하에 시험관내에서 배양된다. 수확된 세포는 또한 조합된 상승된 이산화탄소 및 저산소 환경에서 배양될 수 있으며, 여기서 조건은 2 내지 10% 이산화탄소 및 3 내지 10% 산소를 포함한다. 상기와 같이, 세포가 배양될 때 선택이 수행되며, 생존하고 궁극적으로 증식할 수 있는 생존가능한 세포는 상승된 이산화탄소 환경 또는 저산소 환경과 조합된 상승된 이산화탄소 환경을 갖는 원판으로 이식시 장점을 갖는다.
다른 실시양태에서, 수확된 줄기 세포는 수확되고 배양된 수핵 세포 (NP 세포) 또는 섬유테 세포 (AF 세포)와 조합하여 배양되고 증식된다. 줄기 세포와의 공동-배양을 위한 수핵 (NP) 세포는 바늘 흡인 또는 다른 유사 기술을 통해 원판 복구를 필요로 하는 환자로부터 수확될 수 있다. 이들 NP 세포 또는 AF 세포는 자가유래 또는 비자가유래일 수 있다. 전형적인 실시양태에서, 대략 103 내지 109개 NP 또는 AF 세포가 수확된 줄기 세포와 공동-배양되고, NP 세포 및/또는 AF 세포 방출된 인자 및 노폐물에 반응하는 줄기 세포의 선택에 유용한 환경을 제공하도록 허용된다. 공동-배양 조건은 불량한 영양 환경, 저산소, 상승된 이산화탄소 및 본원에 기재된 다른 개시된 실시양태를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, NP 세포는 줄기 세포와 별개의 시험관내 플라스크 (또는 다른 유사 용기)에서 배양된다. 그 후, NP 세포 배양으로부터 소비된 배지는 줄기 세포 배양 동안 상기 배지 조건과 조합될 수 있거나, 또는 오직 이러한 조건 하에 생존성을 유지하고 궁극적으로 증식할 수 있는 줄기 세포를 증식시키고 선택하는데 사용될 수 있다.
다른 실시양태에서, 수확된 줄기 세포는 손상된 추간 원판에서 발견되는 조건과 유사한 변형된 pH 조건 하에 배양되고 증식된다. 예를 들어, 시험관내 배양 배지 (본원에 기재된 바와 같음)는 6.6 내지 7.0, 및 보다 전형적으로 6.7 내지 6.9의 pH를 갖도록 변형될 수 있다. 변형된 pH는 원판 복구 및 재생에서 사용하기 위한 줄기 세포의 선택을 촉진하기 위해 본원에서 논의된 배양 조건 중 임의의 조건과 조합될 수 있다.
다른 실시양태에서, 수확된 줄기 세포는 손상된 추간 원판에서 발견되는 조건과 유사한 변형된 삼투압농도 조건 하에 배양되고 증식된다. 예를 들어, 시험관내 배양 배지 (본원에 기재된 바와 같음)는 350 내지 600 mOsm, 및 보다 전형적으로 450 내지 500 MOsm의 삼투압농도를 갖도록 변형될 수 있다. 변형된 삼투압농도는 원판 복구 및 재생에서 사용하기 위한 줄기 세포의 선택을 촉진하기 위해 본원에서 논의된 배양 조건 중 임의의 조건과 조합될 수 있다.
다른 실시양태에서, 하나 이상의 선택 조건 하에 줄기 세포의 생존성 및 증식은 1종 이상의 성장 인자의 포함에 의해 변형될 수 있다. 이들 경우에, 선택 조건 하에 세포는 TGF-베타 FGF, PDGF, IGF 및/또는 HIF-1 알파, 예를 들어 이들의 혼합물 및 다른 유사 인자의 존재하에 배양된다.
상기 줄기 세포 배양 기재 실시양태 중 각각에 대해, 조건(들)은 세포 표준 배양 환경에 서서히 혼입될 수 있다는 것을 주목한다. 예를 들어, 수확된 줄기 세포는 초기에 10% 산소 하에 1 또는 2 계대 동안 배양된 후, 9% 산소 조건으로 1 또는 2 계대 동안 이동되고, 표적 저산소 조건이 수득될 때까지 감소하는 수준의 산소 하에 배양될 수 있다. 이러한 절차 하에, 세포는 서서히 손상된 원판에 존재하는 환경에 순응하게 된다.
하기 치료 절차는 손상된 원판의 치료와 관련하여 기재되어 있으나, 다른 무혈관 영역의 치료가 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 고려된다.
손상된 추간 원판의 치료
상기 논의된 손상된 원판 변형인자 중 하나 이상에 의해 선택된 줄기 세포는 환자의 손상된 원판으로의 이식을 위해 충분한 개수의 세포가 존재할 때까지 증식하게 된다. 전형적인 실시양태에서, 손상된 원판으로의 이식을 위해 약 105 내지 109개 선택된 중간엽 줄기 세포가 필요하다.
환자의 신체로의 이식으로 의도되지 않은 물질, 즉, 배지 구성요소, 노폐물 등을 포함하지 않는 세포 집단을 수득하기 위해, 배양된 세포는 PBS 또는 다른 유사 완충액을 사용하여 세척된다. 세척된 줄기 세포는 NP 세포를 포함할 수 있으나, 줄기 세포가 NP 세포와 공동-배양되는 경우, NP 세포 집단은 세포 분류 기술 또는 친화도 크로마토그래피를 통해 제거될 수 있는 것으로 고려된다. 줄기 세포는 현재 이를 필요로 하는 환자로 바로 이식가능하다.
한 실시양태에서, 세척된 줄기 세포는 손상된 원판의 후방 테로 직접적으로 이식된다. 통상적인 방법은 수핵으로의 세포의 이식을 나타내기 때문에, 이는 줄기 세포의 이식을 위한 예상 밖의 위치이다. 세포는 당업계에 공지된 기술을 통해, 예를 들어 경피 x선 유도 또는 수술적 IVD 접근법을 통해 손상된 원판의 후방 테로 이식된다. 세포 이식의 1회 이상의 반복이 손상된 원판을 위한 복구 절차에서 사용될 수 있으나, 치료 사이에 14 내지 180일의 기간이 전형적이다.
또 다른 실시양태에서, 치료요법을 필요로 하는 환자로부터의 자가유래 혈소판은 대략 1 내지 7일 동안 트롬빈 및 CaCl2로 예비처리된다. 이러한 처리는 이들 혈소판이 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)를 우선적으로 발현하도록 예비조건화한다. 일부 실시양태에서, 수확된 혈소판은 대략 28.56 U/ml 트롬빈 및 대략 2.86 mg/ml CaCl2로 예비처리된다. 추가 실시양태에서, 이를 필요로 하는 환자로부터의 자가유래 혈소판은 트롬빈, 칼슘 또는 그의 염, 트롬복산 A2, 아데노신 트리포스페이트 및 아라키도네이트의 조합으로 예비처리된다. 상기와 같이, 예비처리는 이를 필요로 하는 환자로의 이식전 1 내지 7일에 수행될 수 있다. 그 후, 예비조건화된 자가유래 혈소판은 본 발명의 이전에 논의된 선택된 조건화된 줄기 세포의 이식 전에, 동안 또는 후에 이식된다. 혈소판은 일반적으로 이식된 줄기 세포와 동일한 위치에 이식된다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 수확되고 선택된 줄기 세포는 하나 이상의 보조제 또는 보조 치료, 예를 들어 성장 인자, 시토카인, 인테그린, 카드헤린, 또는 혈관형성, 맥관형성 또는 동맥형성을 촉진하는 것으로 공지된 분자 또는 약물, 예를 들어 VEGF-A, PIGF, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, TGF-β, Ang-1, Ang-2, IGF, HGF, FGF, Tie2, PDGF, CCL2, 알파-V 베타-5, 알파-5 베타-1, VE-카드헤린, PECAM-1, 플라스미노겐 활성화인자 및 질소 산화물 신타제와 함께 이식된다. 별법의 실시양태에서, 이를 필요로 하는 환자에서 이식에서 사용하기 위한 줄기 세포는 성장 인자, 예를 들어 TGF-β, FGF, PDGF, IGF, 또는 줄기 세포 및/또는 중간엽 줄기 세포 엄격함 또는 증식을 촉진하도록 의도된 다른 유사 성장 인자의 조합과 함께 공동-이식된다. 일부 실시양태에서 자가유래 혈소판 또는 혈소판 용해물은 상기 언급된 보조제와 조합하여 이식될 수 있다.
도 1은 중첩된 바늘 배치를 갖는 종축 요부 도면을 나타내는 본 발명의 한 실시양태의 유용성을 예시한다. 본원에 기재된 실시양태를 사용하여 조건화된 줄기 세포를 후방 원판 테의 혈관 및 이행 혈관 영역에 위치시켰다.
<실시예>
실시예 1: 경피로 이식된 자가유래 중간엽 줄기 세포
방법:
대상체:
IRB (척수 손상 재단 (Spinal Injury Foundation), 미국 콜로라도주 웨스트민스터) 승인된 MSC 이식 프로토콜에 참여하려는 의지에 기초하여 3명의 환자 대상체를 선택하였다. 각각의 대상체가 IRB 승인된 동의서에 서명하였다. 하기 포함/배제 기준에 기초하여 대상체를 선택하였다:
포함 기준:
1. 18세 내지 65세
2. 보존적 관리의 실패
3. 원판 돌출 또는 내포된 원판 정출 (인대하)을 갖는 요부 퇴행성 원판 질환
4. 치료될 원판 돌출/신경을 통증 생성기로서 확인한 선택적 신경근 차단 (주요 통증 호소의 >75% 경감) 또는 원판을 P2 통증 생성기로서 확인한 추간판조영술
5. T2 가중된 MRI 영상 상의 탈수와 함께 또는 탈수 없이 정상적 원판 높이의 75% 이상
6. 수술적 옵션을 추구하지 않는 의지
배제 기준:
1. 활성 염증성 또는 결합 조직 질환 (즉 루푸스, 섬유근육통, RA)
2. 잠재적으로 증상과 관련된 활성 비수정된 내분비 장애 (즉 갑상선기능저하증, 당뇨병)
3. 잠재적으로 증상과 관련된 활성 신경계 장애 (즉 말초 신경병증, 다발성 경화증)
4. 중증 심장 질환
5. 약물 사용을 필요로 하는 폐 질환
6. 자가유래 혈액 생성물의 수혈에 대한 다른 반응 또는 호흡곤란의 병력
절차전 데이터 수집:
1. 공지되지 않은 의학적 상태를 제외시키기 위해 MSC 이식의 3개월 내에 CBC 및 혈액 화학을 수득하였다.
2. 절차전 MRI
3. 절차전 성과 측정
중간엽 줄기 세포 (MSC)의 단리 및 증식:
골수 수확 절차전 1주 동안 환자가 코르티코스테로이드 또는 NSAID를 섭취하는 것을 제한하였다. 골수 수확 절차와 동시에, 헤파린화된 (아브락시스 파마슈티칼스(Abraxis Pharmaceuticals)) IV 정맥혈을 채혈하여 혈소판 용해물 (PL)을 위해 사용하였다. 적혈구 (RBC)로부터 혈소판 풍부 혈장 (PRP)을 분리하기 위해 200 g에서 원심분리를 통해 혈소판 용해물을 제조하였다. PRP 부피를 분취하고, -20℃에서 저장하여 PL을 제조하였다. 혈소판 용해물을 10 내지 20%로 세포 배양 배지에 보충하였다.
혈소판 유래 VEGF 풍부 상등액을 또한 마티노(Martineau)에 의해 기재된 방법에 기초하여 제조하였다 (문헌 [Martineau, I., E. Lacoste, and G. Gagnon, Effects of calcium and thrombin on growth factor release from platelet concentrates: kinetics and regulation of endothelial cell proliferation. Biomaterials, 2004. 25(18): p. 4489-502]). 상기와 동일한 PRP 단리 단계를 사용하여, PRP를 취하고, 분취액을 37℃ 및 5% CO2에서 6일 동안 28.56 U/mL의 인간 트롬빈 (존슨앤존슨(Johnson and Johnson)) 및 2.85 mg/mL의 염화칼슘 (CaCl2, 아메리칸 리전트(American Regent))으로 활성화시켰다. 활성화된 PRP 샘플을 3,000 rpm에서 6분 동안 원심분리하고, 상등액을 취하고, -80℃에서 저장하였다. 이후, 배양 증식된 MSC와 혼합되는 주사액 뿐만 아니라 경막외 주사를 통해 전달되는 보조제 주사를 위해 이를 사용하였다.
IV 전혈 채혈과 동시에, 환자를 그 후 수술실 (OR) 테이블 위에 엎드려 위치시키고, 수확되는 구역을 1% 리도카인으로 마취시키고, 멸균 일회용 투관침을 사용하여, 헤파린화된 주사기로 우측 PSIS 구역으로부터 골수 혈액 10 cc 및 좌측 PSIS 구역으로부터 10 cc를 채혈하였다. 환자가 골수 채혈 동안 국소 마취제에 의해 용이하게 제어되지 않은 통증을 보고한 경우, 미추 경막외에 마취제만을 첨가하였다.
전체 골수를 200 g에서 4 내지 6분 동안 원심분리하여, RBC로부터 유핵 세포를 분리하였다. 유핵 세포를 제거하고, 별개의 튜브에 위치시켰다. 샘플을 1000 g에서 6분 동안 펠렛으로 원심분리하였다. 유핵 세포를 포스페이트 완충 염수 (PBS, 깁코(GibCo))에서 1회 세척하고, 개수한 후, 10 내지 20% PL, 5 ug/mL 독시시클린 (베드포드 랩스(Bedford Labs)) 및 2 IU/mL 헤파린 (아브락시스 파마슈티칼스)을 갖는 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM, 깁코)에서 재현탁하였다. 유핵 세포를 조직 배양 플라스크에서 1x106개 세포/㎠로 시딩하였다. 배양물을 가습 환경에서 37℃/5% CO2/5% O2에서 인큐베이션하였다. 배양 배지를 48 내지 72시간 후 교환하여, 비부착 세포 집단의 대부분을 제거하였다. MSC 콜로니가 6 내지 12일에 발달하였으며, 그 후 동물 유래-비함유 트립신 유사 효소 (트립엘이 실렉트(TrypLE Select), 깁코)로 수확하여, 오직 콜로니-형성 MSC가 분리되었다. MSC를 증식시키기 위해, 이를 10 내지 20% PL, 5 ug/mL 독시시클린 및 2 IU/mL 헤파린을 갖는 알파-변형된 이글 배지 (AMEM, 깁코)에서 6 내지 12,000개 세포/㎠의 밀도로 플레이팅하고, 37℃/5% CO2/5% O2에서 거의 전면성장할 때까지 성장시켰다. 골수로부터 유래된 일차 세포를 계대 0으로서 지칭하고, MSC의 각각의 후속 계대배양을 1 추가 계대인 것으로 간주하였다. 이러한 단층 세포 배양 기술로 성장된 MSC 형태학의 예에 대해서는 도 2를 참조한다. MSC를 제2 내지 제5 계대로 계대배양한 후, 이를 수확하고, 세척하고, 주사를 위해 활성화된 PRP에서 현탁하였다.
경피 이식 절차
대상체를 x선 테이블 위에 엎드려 위치시키고, 멸균 장갑 및 도포와 베타딘 면봉을 사용하여 준비시켰다. 동측 사선 배향으로 AP 형광투시 영상 (지멘스(Siemens) Iso-C)을 수득하였다. 두부-미추 경사를 조정함으로써 주사되는 표적화된 수준의 상 종말판을 "종말 위에" 시각화하였다. 멸균 기술을 사용하여, 22 게이지 7 인치 퀸케 바늘을 양면 형광투시법 하에 치료되는 수준의 요부 후관절의 상관절돌기로 안내하고, 관절면을 지나서 후방 원판으로 전진시켰다. 측면도 하에 원판 접근을 수득하였으며, 근사를 위해 치료전 MRI 영상화를 사용하여 가능한 한 원판 돌출의 해부학적 위치에 근접하여 후방 테로 조영제 흐름 (PBS로 50% 희석된 옴니파크(Omnipaque) 300 mg/ml-NDC 0407-1413-51)을 최대화하도록 바늘을 위치시켰다 (도 3 참조). 그 후, 혈소판 유래 VEGF 상등액에서 배양 증식된 자가유래 MSC를 주사하고, 바늘을 빼내었다.
MSC 이식 후, 제1주 및 제2주에, 대상체는 표적 수준에서 VEGF 유래 상등액으로 수행된 추가 추간공 경막외를 위해 되돌아 왔다. 동일한 제제로 경막외 절차를 수행하였다. 양면 형광투시법 하에 조작되고 주사될 표적 수준의 유경하 오목부를 향해 지정된 25 게이지 3.5 인치 퀸스 바늘을 사용하여 경막외 접근을 수득하였다. 추궁근 위쪽 및 아래에 이르는 양호한 경막외 염료 흐름이 시각화되면, VEGF 유래 상등액 + 4% 리도카인을 주사하고, 바늘을 빼내었다 (도 4 참조). 수술후 치료 프로토콜은 4주 동안 1주마다 3회 집에서 또는 물리 치료에서 요추 견인으로 이루어졌다.
영상화 및 환자 추적 조사:
요추를 영상화하기 위해 GE 3.0 테슬라 익사이트(Tesla Excite) HD를 사용하였다. 영상화 순서는 시상 단시간반전회복 (STIR), 급속 경사 호출 에코 (Fast Gradient Recall Echo; FGRE) 시상 및 경사 호출 에코 급속 스핀 (Gradient Recall Echo Fast Spin; GRE-FS)을 포함하였다. 영상을 관찰하고, 이-필름 워크스테이션(E-Film Workstation) 버전 1.5.3 (멀지 헬스케어(Merge Healthcare))에서 측정하였다. 매칭 TR/TE 및 매칭 영상화 면으로 시상 단시간반전회복 (STIR) 및 경사 호출 에코 (GRE) 급속 스핀 영상을 사용하였다. 동일한 환자에서 일련의 영상의 해석 오차의 우도를 감소시키기 위해 이를 수행하였다. 일변 효과를 감소시키기 위해, 영상화 센터가 가능한 한 하루 중 동일한 시간에 근접하여 일련의 필름을 수행하도록 지시하였다.
추적 조사 설문지를 전화를 통해 개시하였고, 환자로부터 기능 및 증상에 관하여 수득하였다. 하부 요통에 관하여 변형된 VAS 점수를 수득하고, "기능적 평점 지수" (FRI)를 또한 수득하였다. 이러한 설문지는 환자 기능에 초점을 맞추었다 (문헌 [Feise, R.J. and J. Michael Menke, Functional rating index: a new valid and reliable instrument to measure the magnitude of clinical change in spinal conditions. Spine, 2001. 26(1): p. 78-86; discussion 87]). 수술후 검사를 위해 사무실 방문을 또한 사용하였다. 이를 하기 간격으로 개시하였다:
1. 절차후 6주에
2. 절차후 12주에
결과:
등록된 3명의 대상체의 의학적 병력 및 성과가 하기 기재되어 있다:
환자 1:
HO는 들어올리기 외상 및 그의 선택 운동에 대한 이차로서 여겨지는 하부 요통의 7년 병력을 갖는 대학 운동선수인 19세 백인 여성이었다. 그녀는 개입적 통증 관리 의사에 의한 평가 및 치료를 포함하여 발표 전에 4년 동안 집중 보존적 치료를 받았다. 요부 관절면을 관절내 주사에 대한 음성 반응으로 통증 생성기로서 배제하였다. MRI는 S1 신경근 둘 모두에 인접한 L5-S1 원판 돌출이 우측면에서 악화되었다는 것을 나타내었다. 추간판조영술은 L5-S1 원판에서 통증의 동향성 재생성과 함께 증상적 후방 테 파열을 나타내었다. 절차전 대상체는 임의의 신체 활동으로 우측 발의 S1 분포에서 저린감 및 자통과 함께 가변적 경중도의 일정한 통증을 언급하였으며, 이는 유의한 기능적 한계를 초래하였다.
대상체는 12주 전반에 걸쳐 75% 이하의 개선을 보고하였다. 절차후 6개월에, 대상체는 그녀의 보고된 변형된 VAS 통증 점수 및 기능적 평점 지수의 변화를 거의 나타내지 않았다. 치료후 MRI 영상화 결과에서 관찰된 변화의 상응하는 결핍이 있었다. 최대 돌출 크기의 1 mm 감소가 6주에 관찰되었으나, 이는 3.5개월에 절차전 크기로 되돌아 왔다. 모든 원판 높이 측정은 모든 영상화 세션에 걸쳐 동일하게 유지되었고, 찍은 모든 영상에 대한 하루 간격의 최대 시간은 1시간 45분이었다. HO에 대한 결과는 도 11, 12 및 13에 나타낸다.
환자 2:
MJM은 발표전 하부 요통의 15년 병력을 갖는 35세 백인 남성이었다. 그는 보존적 치료에 실패하였고 활동으로 인한 중증 통증 삽화의 빈도수 증가를 보고하였다. MRI는 L5-S1에 중등도 관절면 침입 및 중등도 유공 협소화와 함께 요추화된 S1-S2 분절, 광범위-기재 원판 팽출을 나타내었다. 또한, L4-L5에 좌측 후방 내포된 돌출보다 더 큰 우측 돌출이 있었다. 신체 검사는 활성 신경근병증를 나타내지 않았으나, 환자는 악화와 관련된 간헐적 신경근 증상을 보고하였다. 보존적 관리의 실패 후 수술이 추천되었으나, 거절되었다. L4-L5 원판은 이러한 치료의 초점이었으며, 탈수된 L5-S1 원판이 대조로서 남았다.
절차후 6개월에, 환자는 3으로부터 0으로 변형된 VAS가 개선되었으며, 통증의 빈도수가 80% 초과만큼 하락하였다 (표 1 참조). 이 환자에 대한 FRI 점수는 60% 초과만큼 증가되었고, 그는 50%의 전반적 증상 개선을 보고하였다. L4-L5 원판 팽출 시상 STIR 영상은 수술전 MR 영상에서 그의 최대 정도에서 6 mm인 것으로 측정되었다 (도 8 참조). 2개월 및 4.5개월 추적 조사 필름 (매칭 영상 순서 및 슬라이스-도 9 및 10 참조) 둘 모두에서, L4-L5 팽출이 3 mm로 감소된 것으로 발견되었으며, 원판 높이의 변화는 L4-S2 원판 중 어떠한 원판에서도 측정되지 않았다. 영상이 획득된 하루 중 시간은 20분 이하만큼 다양하였다.
환자 3:
ML은 군사 훈련과 관련된 외상성 하부 요부 손상을 갖는 24세 백인 여성이었다. 발표 당시, 그녀는 3년 동안 증상을 가졌다. 그녀의 호소는 전기 전격 통증 하향 다리 및 종종 양쪽 다리 모두, 오래 앉아있거나 서있을 때 하부 요통, 및 굽히거나 구부릴 때 통증으로 구성되었다. 그녀는 물리 치료로 구성된 보존적 관리에 실패하였다. 절차전 MRI는 감소된 원판 높이, 그러나 L5-S1 원판에서 어느 정도 보존된 T2 신호를 나타내었다 (도 5 참조). 이 원판은 또한 후종 인대에 의해 내포된 0.7 cm의 정출을 가졌다. 후방 테가 파열되었고, 수핵으로부터 후종 인대까지의 높은 강도 영역이 있었다. L4-L5 원판은 더 약한 T2 신호를 가졌고, 탈수되었으나, 원판 높이의 보존을 가졌다. 0.4 cm로 측정된 이러한 수준에 돌출이 있었으며, 높은 강도 영역이 원판의 하내측 부분에서 관찰되었다. 병력, 검사 및 MRI 소견에 기초하여, L5 및 S1 근에 간헐적 횡단 신경근 자극이 L4-L5 및 L5-S1 원판 수준에서 의심되었다. L4-L5 및 L5-S1 둘 모두에서 낮은 압력 동향성 통증 (P2)을 나타내는 추간판조영술을 수행하였으며, 둘 모두에서 후방 테가 파열되었다. 오직 L5-S1 원판만을 MSC 주사로 치료하고 L4-L5는 비치료된 대조로서 작용하도록 방치하는 것으로 결정하였다.
절차후 6개월에 (표 1 참조) ML은 통증 빈도수의 60% 초과의 감소와 함께 하부 요부 변형된 VAS (1 내지 10 스케일)의 대략 40%의 개선을 보고하였다. FRI에 의해 측정된 바와 같은 기능이 70% 초과만큼 개선되었다. 그녀 자신은 60%의 증상 개선을 보고하였다. 그녀의 절차후 요부 MRI 영상화는 L5-S1 원판 돌출의 크기가 절차전 0.7 cm로부터 절차후 1개월에 0.3 cm 및 절차후 5개월에 0.4 cm로 감소되었다는 것을 나타내었다 (도 6 및 7 참조). 또한, 후방 원판 테 내 HIZ 구역의 크기가 추적 조사 필름 둘 모두에서 감소되었다. 영상 인식의 시간은 1.5시간 이하만큼 상이하였다.
논의:
치료된 대상체 3명 중 2명이 치료된 원판 돌출의 크기의 감소를 나타내었고, 지속된 주관적 및 기능적 개선을 보고하였다. 단일 대상체가 증상의 일시적 감소 및 원판 돌출의 크기의 작은 일과성 변화, 이어서 처리전 기준선 측정으로의 회귀를 나타내었다. 흥미롭게는, 세포를 우선적으로 이 환자의 후방 원판 테로 위치시키는 것은 후방 테로의 조영제의 차선 흐름으로 기술적으로 곤란하였다. 본 발명자들은 이러한 차선 배치 및 지속된 반응의 대상체의 결핍 간에 가능한 상관관계에 의문을 가졌다. 코가(Koga) 등은 관절내 공간으로 비특이적으로 주사된 MSC가 연골 병변을 복구하는데 실패하였으나, 결함 상에 직접적으로 적용된 것은 표적 조직에 부착을 허용하여 복구할 수 있게 하였다는 것을 나타내었다. HO의 조영제 흐름 및 후속적 MSC 흐름 (도 14 참조)이 주로 수핵으로였다는 것을 주목한다. 다른 환자의 수핵으로 직접적으로 중간엽 줄기 세포를 위치시키는 것에 대한 본 발명자들 자신의 비공개된 임상 경험은 임의의 관찰가능한 MRI 변화를 개시하는데 실패하였다. 이들 관찰은 또한 줄기 세포 부착의 위치가 치료의 성공에 중대할 수 있다는 개념을 지지하였다. 특히, 후방 원판 테는 얼마간 혈관 관류를 유지하나, 무혈관 수핵은 잘 문서화된 차선 영양 환경을 가지며, 이는 이식된 MSC의 지속성의 결핍을 초래할 수 있다. 문헌 [Martin, M.D., C.M. Boxell, and D.G. Malone, Pathophysiology of lumbar disc degeneration: a review of the literature. Neurosurg Focus, 2002. 13(2): p. E1]. 또한, HO가 최소의 증식성 줄기 세포 수율을 가졌으며, 이는 다른 대상체보다 더 긴 배양 기간에 걸쳐 유의하게 더 적은 세포를 생성하였다 것을 주목한다 (표 2 참조).
MSC가 단층 배양에서 섬유모세포 형태학을 갖기 때문에 (도 2 참조), 관찰된 결과는 후방 원판 테로 우선적으로 위치된 MSC의 섬유모세포 분화로 인한 것일 수 있었다. 문헌 [Awad, H.A., et al., In vitro characterization of mesenchymal stem cell-seeded collagen scaffolds for tendon repair: effects of initial seeding density on contraction kinetics. J Biomed Mater Res, 2000. 51(2): p. 233-40]. [Delorme, B. and P. Charbord, Culture and characterization of human bone marrow. Mesenchymal stem cells. Methods Mol Med, 2007. 140: p. 67-81]. [Xiang, Y., et al., Ex vivo expansion and pluripotential differentiation of cryopreserved human bone marrow mesenchymal stem cells. J Zhejiang Univ Sci B, 2007. 8(2): p. 136-46].
별법으로, 치료 효과에 기여할 수 있는 다른 변수는 추적 조사 혈소판 상등액 경막외 주사였다. 마티노 등은 특정 칼슘 및 트롬빈 예비조건화를 사용하여 제조된 혈소판 상등액이 혈소판으로부터 VEGF 탈과립화의 최대 분출을 생성한다는 것을 나타내었다 (뿐만 아니라 다른 성장 인자의 숙주). 문헌 [Martineau, I., E. Lacoste, and G. Gagnon, Effects of calcium and thrombin on growth factor release from platelet concentrates: kinetics and regulation of endothelial cell proliferation. Biomaterials, 2004. 25(18): p. 4489-502]. VEGF는 혈관형성을 유발하는 것으로 공지되어 있고, 인간 퇴행성 추간 원판 (IVD)은 불량한 혈관 관류를 겪는 것으로 공지되어 있다. 문헌 [Maroudas, A., et al., Factors involved in the nutrition of the human lumbar intervertebral disc: cellularity and diffusion of glucose in vitro. J Anat, 1975. 120(Pt 1): p. 113-30]. [Wallace, A.L., et al., Humoral regulation of blood flow in the vertebral endplate. Spine, 1994. 19(12): p. 1324-8]. [Pandya, N.M., N.S. Dhalla, and D.D. Santani, Angiogenesis--a new target for future therapy. Vascul Pharmacol, 2006. 44(5): p. 265-74].
이들 환자에서 IVD 돌출의 감소에 대한 별법의 설명이 일변 효과으로 인한 것으로 생각될 수 있었다. 박(Park) 등은 MRI를 아침 및 저녁에 수행한 경우 L4-L5에 8명의 무증상 지원자에서 원판 팽출의 크기의 변화를 나타내었다. 문헌 [Park, C.O., Diurnal variation in lumbar MRI. Correlation between signal intensity, disc height, and disc bulge. Yonsei Med J, 1997. 38(1): p. 8-18]. 이러한 효과는 이들 대상체에서 발생할 수 있었으나, 환자들 중 2명은 크기가 변화하지 않은 비치료된 대조 원판을 가졌다. 또한, MRI 연구를 책임진 단일 영상화 센터가 초기 스캔과 하루 중 동일한 시간에 가능한 한 근접하여 추적 조사 스캔을 수행하도록 지시하였다. 결과로서, 임의의 환자에 대한 영상 간의 하루 중 최대 시간 분산은 2시간 미만이었다. 마지막으로, 치료된 원판 높이 및 대조 원판 높이를 측정하였고, 모든 대상체에 대해 서 유의한 변화가 주목되지 않았다. 일변 변화가 존재한 경우, 침염의 효과로 인해 원판 높이의 유의한 변동이 예상되었다. 원판 돌출 크기의 감소에 대한 별법의 설명은 바늘 외상에 의해 직접적으로 유도된 치유 효과일 수 있었다. 코렉키(Korecki) 등은 이러한 효과를 시험관내 동물 모델에서 연구하였고, 사실과는 반대로 바늘 천자가 원판에 대한 생물기계적 손상 및 그의 전반적 기능의 감소를 유발하였을 가능성이 있다는 것을 발견하였다. 문헌 [Korecki, C.L., J.J. Costi, and J.C. Iatridis, Needle puncture injury affects intervertebral disc mechanics and biology in an organ culture model. Spine, 2008. 33(3): p. 235-41]. 또한, 동물에서 DDD를 유도하기 위한 표준 모델이 천자 손상을 통한 것이라는 것을 주목해야 한다. 문헌 [Niinimaki, J., et al., Quantitative magnetic resonance imaging of experimentally injured porcine intervertebral disc. Acta Radiol, 2007. 48(6): p. 643-9].
결론:
본 실시예는 혈소판 상등액 경막외 보조와 경피로 이식된 자가유래 MSC가 내포된 요추 원판 돌출의 크기를 감소시킬 수 있다는 것을 나타낸다. 환자 중 1명이 치료요법에 대해 반응하지 않은 이유가 불명확하지만, 반응의 결핍은 비교적 낮은 MSC 수율, 뿐만 아니라 MSC의 차선 배치로 인한 것이었다는 것을 가정하는 것이 합리적이다.
본 실시예의 데이터는 본원에 기재된 절차가 당업계에 기재된 다른 절차보다 복구의 놀라운 개선을 제공하는 본 발명의 한 실시양태의 유용성을 나타낸다. 다른 무혈관 복구 부위, 예를 들어, 어깨, 엉덩이 등에 관한 데이터는 유사한 수준의 개선을 나타낼 것으로 예상되었다.
본 개시의 다양한 실시양태는 또한 각각의 종속항이 이전 종속항 뿐만 아니라 독립항 중 각각의 항의 제한을 혼입하는 다중 종속항인 것처럼 청구항에 인용된 다양한 요소의 교체를 포함할 수 있다. 이러한 교체는 명확히 본 개시의 범위 내에 포함된다.
본 발명은 수많은 실시양태와 관련하여 구체적으로 나타내고 기재되어 있으나, 본원에 개시된 다양한 실시양태에 대해 형태 및 세부사항의 변화가 본 발명의 취지 및 범위에서 벗어나지 않고 이루어질 수 있고, 본원에 개시된 다양한 실시양태가 청구항의 범위에 대한 제한으로서 작용하려는 것이 아니라는 것을 당업자는 이해할 것이다.
본 발명의 기재가 예시 빛 기재의 목적을 위해 제공되었으나, 이는 포괄적이거나 또는 개시된 형태로 본 발명을 제한하려는 것이 아니다. 본 발명의 범위는 오직 하기 청구항의 범위에 의해서만 제한된다. 많은 변형 및 변이가 당업자에게 명백할 것이다. 도면에 기재되고 표시된 실시양태는 본 발명의 원리, 실제 적용을 가장 잘 설명하고 당업자들이 고려되는 특정 용도에 적합한 바와 같이 다양한 변형으로 다양한 실시양태에 대해 본 발명을 이해할 수 있게 하기 위해 선택되고 기재되었다.
본 명세서는 특허, 특허 출원 및 공개에 대한 수많은 인용을 함유한다. 각각은 모든 목적을 위해 본원에 참고로 포함된다.
Claims (23)
- 퇴행성 추간 원판의 치료를 필요로 하는 환자로부터 줄기 세포를 수확하고;
손상된 추간 원판의 환경에 상응하는 선택압 하에 수확된 줄기 세포를 배양하고;
퇴행성 추간 원판의 후방 원판 테에 선택된 줄기 세포를 이식하는 것
을 포함하는, 퇴행성 추간 원판의 치료를 필요로 하는 환자에서 퇴행성 추간 원판의 치료 방법. - 제1항에 있어서, 선택압이 약 3% 내지 약 10% 산소에서 수확된 줄기 세포를 배양하는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제2항에 있어서, 선택압이 약 3% 내지 약 7% 산소에서 수확된 줄기 세포를 배양하는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 선택압이 약 2% 내지 약 10% 이산화탄소에서 수확된 줄기 세포를 배양하는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제2항에 있어서, 약 2% 내지 약 10% 이산화탄소에서 수확된 줄기 세포를 배양하는 것을 포함하는 선택압을 추가로 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서,
퇴행성 추간 원판의 치료를 필요로 하는 환자로부터 NP 세포를 수확하고;
선택압 하에 수확된 줄기 세포와 NP 세포를 공동-배양하는 것
을 추가로 포함하는 방법. - 제1항에 있어서, 줄기 세포가 중간엽 줄기 세포인 방법.
- 제1항에 있어서,
퇴행성 추간 원판의 치료를 필요로 하는 환자로부터 혈소판을 수확하고;
선택된 줄기 세포의 이식 전에, 동안 또는 후에 혈소판을 이식하는 것
을 추가로 포함하며, 여기서, 혈소판 및 줄기 세포 둘 모두의 이식이 후방 원판 테에서 수행되는 것인 방법. - 제8항에 있어서, 혈소판이 후방 원판 테에 이식전 1 내지 7일에 트롬빈 및 염화칼슘으로 처리되는 것인 방법.
- 제9항에 있어서, 트롬빈의 양이 28.56 U/ml이고, 염화칼슘의 양이 2.86 mg/ml인 방법.
- 제8항에 있어서, 혈소판이 트롬빈, 염화칼슘 또는 그의 염, 트롬복산 A2, 아데노신 트리포스페이트 및 아라키도네이트로 처리되는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 성장 인자, 시토카인, 인테그린, 카드헤린, 혈관형성을 촉진하는 분자 또는 약물, 맥관형성을 촉진하는 분자 또는 약물 및 동맥형성을 촉진하는 분자 또는 약물로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 화합물을 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
- 제12항에 있어서, 화합물이 VEGF-A, PIGF, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, TGF-β, Ang-1, Ang-2, IGF, HGF, FGF, Tie2, PDGF, CCL2, 알파-V 베타-5, 알파-5 베타-1, VE-카드헤린, PECAM-1, 플라스미노겐 활성화인자 또는 질소 산화물 신타제인 방법.
- 제1항에 있어서, 후방 원판 테에 선택된 줄기 세포의 이식 전에, 동안 또는 후에 1종 이상의 성장 인자를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
- 제14항에 있어서, 1종 이상의 성장 인자가 TGF-β, FGF, PDGF 및 IGF로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 수확된 줄기 세포의 배양이 D-MEM 베이스로부터 제조된 기초 배양 배지에서 수행되는 것인 방법.
- 줄기 세포, 혈소판, 1종 이상의 성장 인자 및 제약 담체 또는 희석제를 포함하는 제약 조성물.
- 제17항에 있어서, 줄기 세포가 중간엽 줄기 세포인 조성물.
- 제17항에 있어서, 줄기 세포가 저산소 조건 하에 생존성 및 증식을 위한 그의 능력에 대해 선택된 것인 조성물.
- 제17항에 있어서, 줄기 세포가 손상된 추간 원판과 비교가능한 배양 조건 하에 생존성 및 증식을 위한 그의 능력에 대해 선택된 것인 조성물.
- 무혈관 영역의 치료를 필요로 하는 환자로부터 줄기 세포를 수확하고;
손상되거나 노화된 무혈관 영역의 환경에 상응하는 선택압 하에 수확된 줄기 세포를 배양하고;
무혈관 영역에 선택된 줄기 세포를 이식하는 것
을 포함하는, 무혈관 영역의 치료를 필요로 하는 환자에서 무혈관 영역의 치료 방법. - 제21항에 있어서, 무혈관 영역이 환자의 어깨에 있는 것인 방법.
- 제21항에 있어서, 무혈관 영역이 환자의 엉덩이에 있는 것인 방법.
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