KR20130119948A - 온코스타틴 ｍ (ｏｓｍ)에 대한 항원 결합 단백질 - Google Patents

온코스타틴 ｍ (ｏｓｍ)에 대한 항원 결합 단백질 Download PDF

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Abstract

본 발명은 온코스타틴 M(OSM), 특히 인간 OSM(hOSM)에 특이적으로 결합하고, gp130 수용체에 대한 OSM의 결합을 억제하지만, 부위 II 잔기와 직접적으로 상호작용하지 않는 항원 결합 단백질 및 이의 단편에 관한 것이다. 본 발명은 또한 항체를 인간화시키는 방법에 관한 것이다. 약학적 조성물, 스크리닝 및 의학 치료 방법이 추가로 개시된다.

Description

온코스타틴 Ｍ (ＯＳＭ)에 대한 항원 결합 단백질{ANTIGEN BINDING PROTEINS TO ONCOSTATIN M (OSM)}
발명의 분야
본 발명은 온코스타틴 M(OSM), 특히 인간 OSM(hOSM)에 특이적으로 결합하는 면역글로불린에 관한 것이다.
본 발명은 또한 상기 면역글로불린으로 질병 또는 장애를 치료하는 방법, 상기 면역글로불린을 포함하는 약학적 조성물 및 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 다른 구체예는 하기 기재로부터 명백해질 것이다.
발명의 배경
온코스타틴 M은 gp130 막횡단 신호전달 수용체를 공유하는, IL-6, 백혈병 억제 인자(LIF), 섬모 신경영양 인자(CNTF), 카디오트로핀-1(CT-1) 및 카디오트로핀-1 유사 사이토카인(Kishimoto T et al (1995) Blood 86: 1243-1254 참조)을 포함하는 사이토카인의 인터루킨 6(IL-6) 패밀리에 속하는 28 KDa의 당단백질이다(Taga T and Kishimoto T (1997) Annu. Rev. Immunol. 15: 797-819 참조). OSM은 본래 흑색종 세포주 A375의 성장을 억제하는 이의 능력에 의해 발견되었다(Malik N (1989) et al Mol Cell Biol 9: 2847-2853 참조). 이후, 더욱 많은 효과가 발견되었고, IL-6 패밀리의 다른 일원과 같이 다기능성 매개체인 것으로 밝혀졌다. OSM은 대식세포, 활성화된 T 세포(Zarling JM (1986) PNAS (USA) 83: 9739-9743 참조), 다형핵 호중구(Grenier A et al (1999) Blood 93:1413-1421 참조), 호산구(Tamura S et al (2002) Dev. Dyn. 225: 327-31 참조), 수지상 세포(Suda T et al (2002) Cytokine 17:335-340 참조)를 포함하는 다양한 세포 유형에서 생성된다. 이는 또한 췌장, 신장, 고환, 비장, 위 및 뇌(Znoyko I et al (2005) Anat Rec A Discov Mol Cell Evol Biol 283: 182-186 참조), 및 골수(Psenak O et al (2003) Acta Haematol 109: 68-75 참조)에서 발현된다. 이의 주요 생물학적 효과는 내피의 활성화(Brown TJ et al (1993) Blood 82: 33-7 참조), 급성기 반응의 활성화(Benigni F et al (1996) Blood 87: 1851-1854 참조), 세포 증식 또는 분화의 유도, 염증성 매개체 방출의 조절 및 조혈(Tanaka M et al (2003) 102: 3154-3162 참조), 뼈의 재-모델링(de Hooge ASK (2002) Am J Pathol 160: 1733-1743 참조), 및 혈관형성의 촉진(Vasse M et al (1999) Arterioscler Thromb Vase Biol 19:1835-1842 참조), 및 상처 치유를 포함한다.
OSM에 대한 수용체(OSM 수용체 β, "OSMRβ")는 상피 세포, 연골세포, 섬유모세포(Langdon C et al (2003) J Immunol 170: 548-555 참조), 신경 평활근, 림프절, 뼈, 심장, 소장, 폐 및 신장(Tamura S et al (2002) Mech Dev 115:127-131 참조) 및 내피세포를 포함하는 광범위한 세포에서 발현된다. 여러 정보의 증거는 내피세포가 OSM에 대한 주요 표적인 것을 암시한다. 이들 세포는 10 내지 20배 더 높은 수의 고친화성 및 저친화성 수용체 둘 모두를 발현하고, OSM을 이용한 자극 후에 현저하고 연장된 변화를 나타낸다(Modur V et al (1997) J Clin Invest 100: 158-168 참조). 또한, OSM은 내피세포 기원인 것으로 생각되는 카포시 육종 세포의 주요 자가분비 성장 인자이다(Murakami-Mori K et al (1995) J Clin Invest 96:1319-1327 참조).
다른 IL-6 패밀리 사이토카인과 같이, OSM은 막횡단 신호전달 당단백질 gp130에 결합한다. gp130 사이토카인의 주요 특징은 리간드에 따른 gp130과 하나 이상의 공동-수용체를 포함하는 올리고머 수용체 복합체의 형성이다(Heinrich PC et al (2003) Biochem J. 374: 1-20에서 개관됨). 결과로서, 이들 사이토카인은 형성된 수용체 복합체의 조성에 따라 시험관내 및 생체내에서 공유되는 생물학적 활성 및 독특한 생물학적 활성 둘 모두를 매개할 수 있다. 인간 OSM(hOSM)은 gp130, 및 2개의 공동-수용체인 LIFR 또는 온코스타틴 수용체(OSMR) 중 어느 하나와 복합체를 형성할 수 있는 점에서 다른 IL-6 사이토카인과 상이하다. 도 27은 hOSM과 gp130, LIFR 및 OSMR 사이의 상호작용을 예시한다. hOSM의 결정 구조는 설명되었으며, 2개의 잠재적 당화 부위를 갖는 4개의 α 나선형 다발을 포함하는 것으로 밝혀졌다. 2개의 별개의 리간드 결합 부위가 hOSM 분자에 대한 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 확인되었다(Deller MC et al (2000) Structural Fold Des. 8:863-874 참조). 부위 II(때때로, "부위 2")로 언급되는 첫번째 부위는 gp130과 상호작용하고, 분자의 반대 말단의 부위 III(때때로, "부위 3")로 언급되는 두번째 부위는 LIFR 또는 OSMR과 상호작용한다. 돌연변이유발 실험에서 LIFR 및 OSMR에 대한 결합 부위가 거의 동일하나, 단일 아미노산 돌연변이가 상기 둘 사이를 구별할 수 있는 것이 밝혀졌다.
OSM-gp130 상호작용을 조절하는 것이 RA 및 다른 질병 및 장애, 특히, 만성 염증성 질병 및 장애, 예를 들어, 골관절염, 특발성 폐 섬유증, 동통, 염증성 폐 질병, 심장혈관 질병 및 건선의 치료에서 이로울 수 있다는 가설을 뒷받침하는 증거가 증가하고 있다.
OSM은 인간 RA 환자의 SF에서 발견된다(Hui W et al (1997) 56: 184-7 참조). 상기 수준은 SF에서 호중구의 수, SF에서 TNF 알파(때때로, "TNF")의 수준, 및 연골 파괴의 마커와 관련이 있다(Manicourt DH et al (2000) Arthritis Rheum 43: 281-288). 또한, RA 환자로부터의 윤활 조직은 OSM을 생체외에서 자발적으로 분비한다(Okamoto H et al (1997) Arthritis and Rheumatism 40: 1096-1105 참조). OSM이 윤활 대식세포에 존재하고(Cawston TE et al (1998) Arthritis Rheum 41:1760-1771), 이전에 논의된 바와 같이, OSM 수용체 및 gp130이 내피세포, 윤활 섬유모세포, 연골세포 및 골모세포에서 발현되는 것이 또한 입증되었다. 정상 마우스의 관절에서의 뮤린 OSM(mOSM)의 아데노바이러스 발현은 중증 염증 및 미란관절염을 발생시킨다(Langdon C et al (2000) Am J Pathol 157:1187-1196 참조). 유사하게, 공격성 질병이 아데노바이러스 mOSM 전달 후에 TNF, IL-1, IL-6 및 iNOS가 결핍된 녹아웃(knockout) 마우스에서 관찰되며(de Hooge ASK et al (2003) Arthritis and Rheumatism 48:1750-1761 참조), 이는 OSM이 관절염 병변의 모든 구체예를 매개할 수 있는 것을 나타낸다. 아데노바이러스 발현되는 mOSM 벡터를 이용한 마우스 OSM 발현은 소아 특발성 관절염의 특징인 성장판을 손상시킨다(de Hooge ASK et al (2003) Arthritis and Rheumatism 48:1750-1761 참조). 콜라겐 유도성 관절염의 실험 모델에서, 마우스에 치료적으로 투여된 항-OSM 항체는 질병의 모든 추가 진행을 방지하였다.
항-OSM이 인간 질병을 연상케 하는 재발/완화 모델인 프리스탄 유도성 관절염을 갖는 마우스에 예방적으로 투여된 경우에 유사한 결과가 관찰되었다(Plater-Zyberk C et al (2001) Arthritis and Rheumatism 44: 참조).
골관절염은 관절에 영향을 주는 질환이다. 골관절염의 3개의 특징이 존재한다. 이는 뼈에 라이닝(lining)되어 있고, 관절이 마찰 없이 용이하게 이동하도록 하는 강하고 매끈한 표면인 연골을 손상시킨다. 이는 관절의 가장자리 주위에서 발달하는 뼈 성장을 발생시키고, 이는 관절 주위의 조직의 가벼운 염증(윤활막염)을 야기시킨다. OSM은 연골 파괴, 염증 및 뼈 전환(bone turnover)에서 중요한 역할을 하는 것으로 입증되었고, 이에 따라 상기 사이토카인의 차단이 질병 발병기전의 중요 양태에서 일정한 역할을 할 수 있다. OSM은 IL-1 또는 TNF와 상승작용적으로 작용하여, 프로테오글리칸(PG) 및 콜라겐의 손실을 포함하는 인간 코연골에서의 콜라겐분해를 유도하며, 콜라겐의 손실은 MMP-1 및 MMP-13의 유도와 서로 관련이 있다. IL-1을 갖는 OSM은 또한 인간 관절 연골로부터 PG 손실을 유도할 것이나, 콜라겐 손실에서의 증가는 유의하지 않았다(Morgan et al 2006). 관절 사이토카인 농도를 증가시키는 아데노바이러스 벡터를 이용한 다수의 연구에서 OSM 과발현이 염증, 판누스 형성, 연골 파괴 및 뼈 미란을 유도하는 것이 밝혀졌다(Langdon et al 2000). 전체적으로, 상기 문헌은 OSM이 특히 다른 사이토카인과 조합되는 경우 프로테오글리칸 및 콜라겐 파괴와 관련된 프로테아제를 유도하여, 연골 파괴 뼈 미란을 발생시키는 것을 암시한다.
상기 문헌으로부터의 정보는 OSM 분자가 건선과 관련된 염증 과정에서 일부 관련성을 가질 수 있는 것을 암시한다. 보이파티 등(Boifati et al)에 의한 연구(1998)에서 비-병변성 건선 피부 및 정상 피부에 비해 건선 병변의 기관 배양에서 OSM의 자발적 방출이 증가되는 것이 밝혀졌다(Kunsfeild et al 2004). 각질세포는 상기 분자에 대한 수용체를 발현하고, 리간드에 반응하며, 이는 각질세포 이동 및 재구성된 표피 두께의 증가를 야기시킨다. OSM과 33개의 상이한 사이토카인의 유전자 조절 효과를 비교하는 마이크로어레이 분석은 OSM이 효능있는 각질세포 활성제이며, 건선 피부의 특징인 S100A7 및 β-디펜신 2 발현과 같은 분자의 유도에서 전염증성 사이토카인과 상승작용으로 작용할 수 있는 것을 나타낸다(Gazel et al 2006).
염증성 폐 질병, 예를 들어, 천식 및 폐 섬유증에서의 OSM에 대한 역할이 또한 상기 문헌으로부터 암시된다. 이러한 질병은 상피하 섬유모세포의 증식 및 활성화가 동반되는 세포외 기질(ECM)의 증가된 침착을 특징으로 한다. OSM은 급성 폐 손상 동안, 특히, 폐렴의 경우 환자의 기관지폐포 세척 유체에서 검출된다(Grenier et al 2001).
OSM은 MS 환자의 뇌에서 검출되며, 여기서 이는 미세아교세포, 별아교세포 및 침윤 백혈구에 국소화된다(Ruprecht et al 2001). 또한, MS 환자로부터 분리된 PBMC는 건강한 대조군으로부터의 세포보다 OSM을 포함하는 더욱 많은 사이토카인을 자발적으로 방출하며, MS 환자는 증가된 혈청[OSM]에 대한 경향을 나타낸다(Ensoli et al 2002).
뇌에서 염증을 촉진하는 것에 더하여, OSM은 알츠하이머병, MS 및 HIV 환자의 서브셋의 특징인 신경변성에 직접적으로 기여할 수 있다. HIV 환자로부터의 단핵구 상층액은 현저한 신경모세포 성장 억제 및 신경세포 사멸을 야기시킨다. 이러한 효과는 배양 상층액에서 온코스타틴 M에 의해 매개되었다(Ensoli et al 1999). 많은 HIV 환자는 신경세포 손실에 의해 야기되는 뇌 위축으로 고통받으므로, OSM은 상기 병변의 한 매개체일 수 있다.
타무라 등(Tamura et al)에 의한 연구는 OSM이 신경병성 동통의 발달 및 유지와 관련될 수 있음을 암시한다(2003). 이들의 연구는 OSMβ 수용체를 발현하는 통각수용성 감각 뉴런의 서브셋을 나타내었다. 모든 OSMβR +ve 뉴런은 또한 신경병증 및 염증성 동통 둘 모두의 발달에 중요한 것으로 밝혀진 VR1 및 P2X3 수용체를 발현하였다(Jarvis et al 2002, Walker et al 2003). OSM -/- 마우스가 화학물질, 열, 내장 및 기계 동통에 대한 감소된 유해 반응을 나타낸 것으로 또한 밝혀졌다(Morikawa et al 2004). 흥미롭게도, 이러한 동물은 VR1+, P2X3+의 작은 크기의 뉴런에서 결핍은 가지나, 그렇지 않은 경우 동물은 정상을 나타낸다.
암세포의 생물학을 조절하는데 있어서 OSM을 뒷받침하는 역할이 또한 상기 문헌으로부터 암시되었다. OSM은 종양 세포주를 이용한 연구에서 성장 자극 특성 및 성장 억제 특성 둘 모두를 갖는 것으로 보고되었다(Grant and Begly 1999). 이는 카포시 육종 유래 세포(Miles et al 1992) 및 골수종 세포주(Zhang et al 1994)에 대한 효능있는 미토겐이다. OSM은 성장 속도를 감소시키고, 유방(Douglas et al 1998) 및 폐(McKormick et al 2000)를 포함하는 다수의 종양 세포주에서 분화를 증가시킨다. 그러나, OSM은 적어도 일부 유방암종 세포주의 성장을 억제할 수 있는 한편, 이는 세포 분리를 증가시키고, 전이 잠재성을 향상시킨다(Holzer et al 2004, Jorcyk et al 2006). OSM은 또한 일부 종양 세포주에서 히알루로난 수용체 CD44의 발현 및 활성화 상태를 상향조절하고(Cichy et al 2000), 이는 종양 성장 및 전이와 관련이 있다(Yu et al 1997). 또한, OSM의 혈관형성 특성 및 일부 종양 세포에서 다른 혈관형성 인자를 유도하는 이의 능력(Repovic et al 2003)은 OSM이 OSM을 발현하는 종양에서 종양 혈관형성에 기여할 수 있음을 암시한다. 과학 문헌에는 종양 생물학에서의 OSM 관련성이 암시되어 있으나, 복잡함을 나타내고 있다. OSM 중화가 일부 종양의 치료에 이로울 수 있는 것이 가능하다. 다른 한편으로, TNF 및 IL-6 중화와 같이, 이는 다른 종양에서 일부 잠재적 위험을 갖는다.
문헌으로부터의 증거는 심장혈관 질병에서의 OSM의 잠재적 역할을 암시한다. OSM은 죽상경화 병변에서 조직 대식세포에서 발견되고(Modur et al 1997), 혈관형성 인자로서(Vasse et al 1999), 혈관벽 취약성에 기여하는 것으로 생각되는 죽상경화판의 혈관신생 특징을 촉진할 수 있다. 그러나, OSM은 또한 내피세포에서 다른 혈관형성 인자인 VEGF(Wijelah et al 1997) 및 bFGF(Bernard et al 1999)의 발현을 유도한다. 흥미롭게도, 인간 내피세포는 다른 세포보다 약 10-20배 더 큰 OSM 수용체 밀도를 갖는다(Brown et al 1991).
따라서, RA 및 다른 질병 및 장애, 특히 만성 염증성 질병 및 장애, 예를 들어, 골관절염, 특발성 폐 섬유증, 암, 천식, 동통, 심장혈관 및 건선의 치료에 대한 치료 방법을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다. 특히, OSM(예를 들어, hOSM, 특히 이의 부위 II)에 특이적으로 결합하고, OSM과 gp130 사이의 상호작용의 조절에 반응하는 질병 및 장애의 치료에서 OSM과 gp130 사이의 상호작용을 조절(즉, 억제 또는 차단)하는 면역글로불린, 특히 항체를 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.
W099/48523호에서, 본 발명자는 염증성 질병 및 장애의 치료에서 OSM 길항제의 용도를 개시하였다. 이러한 개시는 관절염의 뮤린 모델에서 항-마우스 OSM 항체를 사용하였다.
본 명세서에 내에 개시된 모든 특허 및 참고문헌은 전체적으로 명백히 참조로서 본원에 포함된다.
도면의 간단한 설명
도 1: 인간 gp130 ELISA - 10G8, 9G2, 3E3 & 2B7에 의한 인간 gp130에 대한 인간 OSM 결합의 억제. 비-경쟁 항-OSM 마우스 항체(15E10)를 비교 목적을 위해 추가하였다. 도구(tool) 항체를 음성 대조군으로 사용하였다. 제시된 데이터는 4회의 검정 반복 중 하나를 나타낸다.
도 2: KB 세포 검정 - 10G8, 9G2, 3E3 & 2B7에 의한 인간 OSM의 억제. 비-경쟁 항-OSM 마우스 항체(15E10)를 비교 목적을 위해 추가하였다. 도구 항체를 음성 대조군으로 사용하였다. 제시된 데이터는 3회의 검정 반복 중 하나를 나타낸다.
도 3: KB 세포 검정 - 10G8, 9G2, 3E3 & 2B7에 의한 25% 인간 AB 혈청의 존재하에서의 인간 OSM의 억제. 비-경쟁 항-OSM 마우스 항체(15E10)를 비교 목적을 위해 추가하였다. 도구 항체를 음성 대조군으로 사용하였다. 제시된 데이터는 2회의 검정 반복 중 하나를 나타낸다.
도 4: 내인성 OSM 인간 gp130 검정 - 10G8, 9G2, 3E3 & 2B7 항체에 의한 인간 gp130에 대한 내인성 인간 OSM 결합의 억제. 비-경쟁 항-OSM 마우스 항체(110)를 비교 목적을 위해 추가하였다. 도구 항체를 음성 대조군으로 사용하였다. 제시된 데이터는 2개의 공여체 중 하나를 나타낸다.
도 5: KB 세포 검정 - 10G8, 9G2, 3E3 & 2B7에 의한 인간 LIF의 억제의 결핍. 비경쟁 항-OSM 마우스 항체(15E10)를 비교 목적을 위해 추가하였다. 시판되는 항-인간 LIF mAb(R&D Systems, MAB250)를 양성 대조군으로 사용하였다. 도구 항체를 음성 대조군으로 사용하였다.
도 6: KB 세포 검정 - 10G8, 9G2, 3E3 & 2B7에 의한 마모셋 OSM의 억제. 비-경쟁 항-OSM 마우스 항체(15E10)를 비교 목적을 위해 추가하였다. 도구 항체를 음성 대조군으로 사용하였다. 제시된 데이터는 2회의 검정 반복 중 하나를 나타낸다.
도 7: 2B7, 3 E3 , 9 G2 및 10 G8 하이브리도마의 VH 서열의 비교. 작은 박스로 표시된 잔기는 대다수로부터의 차이를 나타낸다. 서열을 가로지르는 큰 박스는 CDR을 나타낸다.
도 8: 2B7, 3 E3 , 9 G2 및 10 G8 하이브리도마의 VL 서열의 비교. 작은 박스로 표시된 잔기는 대다수로부터의 차이를 나타낸다. 서열을 가로지르는 큰 박스는 CDR을 나타낸다.
도 9: 가변 경쇄의 서열 분석 - 비-경쟁 항-OSM 마우스 모 항체 15E10과 비교된 10G8, 9G2, 3E3 및 2B7의 가변 경쇄의 서열 분석.
도 10: 가변 중쇄의 서열 분석 - 비-경쟁 항-OSM 마우스 모 항체 15E10과 비교된 10G8, 9G2, 3E3 및 2B7의 가변 중쇄의 서열 분석.
도 11: 직접 인간 OSM 결합 ELISA - 10G8 및 9G2 키메라와 15E10 키메라(15E10c)의 인간 OSM 결합의 비교.
도 12: 인간 gp130 ELISA - 10G8, 10G8 키메라, 9G2 & 9G2 키메라에 의한 인간 gp130으로의 인간 OSM 결합의 억제. 비-경쟁 항-OSM 마우스 항체(15E10)를 비교 목적을 위해 추가하였다. 도구 항체를 음성 대조군으로 사용하였다. 제시된 데이터는 3회의 검정 반복 중 하나를 나타낸다.
도 13: KB 세포 검정 - 10G8, 10G8 키메라, 9G2 & 9G2 키메라에 의한 인간 OSM의 억제. 비-경쟁 항-OSM 마우스 항체(15E10)를 비교 목적을 위해 추가하였다. 도구 항체를 음성 대조군으로 사용하였다. 제시된 데이터는 3회의 검정 반복 중 하나를 나타낸다.
도 14: KB 세포 검정 - 10G8, 10G8 키메라, 9G2 & 9G2 키메라에 의한 25% 인간 AB 혈청의 존재하에서의 인간 OSM의 억제. 비-경쟁 항-OSM 마우스 항체(15E10)를 비교 목적을 위해 추가하였다. 도구 항체를 음성 대조군으로 사용하였다. 제시된 데이터는 3회의 검정 반복 중 하나를 나타낸다.
도 15: 내인성 OSM 인간 gp130 검정 - 10G8, 10G8 키메라, 9G2 & 9G2 키메라 항체에 의한 인간 gp130에 대한 내인성 인간 OSM 결합의 억제. 비-경쟁 항-OSM 마우스 항체(15E10)를 비교 목적을 위해 추가하였다. 도구 항체를 음성 대조군으로 사용하였다. 제시된 데이터는 2개의 공여체 중 하나를 나타낸다.
도 16: 인간 LIF KB 세포 검정 - 10G8, 10G8 키메라, 9G2 & 9G2 키메라에 의한 인간 LIF의 억제 없음. 비-경쟁 항-OSM 마우스 항체(15E10)를 비교 목적을 위해 추가하였다. 항-인간 LIF 항체(MAB250, R&D Systems)를 양성 대조군으로 사용하였다. 도구 항체를 음성 대조군으로 사용하였다. 제시된 데이터는 3회의 검정 반복 중 하나를 나타낸다.
도 17: KB 세포 검정 - 인간화 10G8 L1 및 L4 변이체에 의한 인간 OSM의 억제. 15E10h를 비교를 위해 추가하였다. 제시된 데이터는 3회의 검정 반복 중 하나를 나타낸다.
도 18: 인간 gp130 ELISA - 인간화 10G8 H0L1, H1L1 및 H2L1 변이체에 의한 인간 gp130에 대한 인간 OSM 결합의 억제. 15E10h를 비교를 위해 추가하였다. 도구 항체를 음성 대조군으로 사용하였다. 제시된 데이터는 2회의 검정 반복 중 하나를 나타낸다.
도 19: 인간 OSM -10 G8 mAb 결합 복합체 - 인간 OSM과 10G8 mAb 경쇄 및 중쇄의 결합. OSM 수용체 결합 부위가 제시된다(부위 II 및 부위 III). 수용체 결합 영역에서 중요한 아미노산 잔기가 각 부위에 대해 나열되어 있다.
도 20: KB 세포 검정 - 인간화 10G8 H0L1 CDRH1 및 CDRL2 변이체 항체에 의한 인간 OSM의 억제. 15E10h를 비교를 위해 추가하였다. 도구 항체를 음성 대조군으로 사용하였다. 제시된 데이터는 3회의 검정 반복 중 하나를 나타낸다.
도 21: 인간 gp130 ELISA - 10G8 마우스 모, 10G8 키메라, 인간화 10G8 H0L1 모(H0L1) 및 H0(huCDRH1)L1에 의한 인간 gp130에 대한 인간 OSM 결합의 억제. 15E10h를 비교를 위해 추가하였다. 도구 항체를 음성 대조군으로 사용하였다. 제시된 데이터는 3회의 검정 반복 중 하나를 나타낸다.
도 22: KB 세포 검정 - 10G8 마우스 모, 10G8 키메라, 인간화 10G8 H0L1 모(H0L1) 및 H0(huCDRH1)L1에 의한 인간 OSM의 억제. 15E10h를 비교를 위해 추가하였다. 제시된 데이터는 3회의 검정 반복 중 하나를 나타낸다.
도 23: KB 세포 검정 - 10G8 마우스 모, 10G8 키메라, 인간화 10G8 H0L1 모(H0L1) 및 H0(H1)L1에 의한 25% 인간 AB 혈청의 존재하에서의 인간 OSM의 억제. 15E10h를 비교를 위해 추가하였다. 도구 항체를 음성 대조군으로 사용하였다. 제시된 데이터는 2회의 검정 반복 중 하나를 나타낸다.
도 24: 내인성 OSM 인간 gp130 검정 - 10G8 마우스 모, 10G8 키메라, 인간화 10G8 H0L1 모(H0L1) 및 H0(huCDRH1)L1에 의한 인간 gp130에 대한 내인성 인간 OSM 결합의 억제. 15E10h를 비교를 위해 추가하였다. 도구 항체를 음성 대조군으로 사용하였다. 제시된 데이터는 4개의 공여체 중 하나를 나타낸다.
도 25: 인간 LIF KB 세포 검정 - 10G8 마우스 모, 10G8 키메라, 인간화 10G8 H0L1 모(H0L1), H0(huCDRH1)L1에 의한 인간 LIF의 억제 없음. 15E10h를 비교를 위해 추가하였다. 항-인간 LIF 항체(MAB250, R&D Systems)를 양성 대조군으로 사용하였다. 도구 항체를 음성 대조군으로 사용하였다. 제시된 데이터는 3회의 검정 반복 중 하나를 나타낸다.
도 26: 인간 일차 간세포 검정 - (A) 3ng/ml 및 (B) 10ng/ml 인간 OSM으로 자극된 인간 간세포로부터의 H0(huCDRH1)L1에 의한 혈청 아밀로이드 A(SAA) 방출의 억제. 인간화 15E10을 비교 목적을 위해 추가하였다. 제시된 데이터는 3개의 간세포 공여체 중 하나를 나타낸다.
도 27: 인간 일차 간세포 검정 - (A) 3ng/ml 및 (B) 10ng/ml 인간 OSM으로 자극된 인간 간세포로부터의 H0(huCDRH1)L1에 의한 C-반응성 단백질(CRP) 방출의 억제. 인간화 15E10을 비교 목적을 위해 추가하였다. 제시된 데이터는 3개의 간세포 공여체 중 하나를 나타낸다.
도 28: 인간 RA 섬유모세포 -유사 검정 - (A) 0.3ng/ml 및 (B) 3ng/ml의 인간 OSM으로 자극된 인간 RA 섬유모세포-유사 윤활막세포(HFLS-RA) 세포로부터의 H0(huCDRH1)L1에 의한 IL-6 방출의 억제. 인간화 15E10을 비교 목적을 위해 추가하였다. 제시된 데이터는 3개의 HFLS-RA 공여체 중 하나를 나타낸다.
도 29: 인간 RA 섬유모세포 -유사 검정 - (A) 0.3ng/ml 및 (B) 3ng/ml의 인간 OSM으로 자극된 인간 RA 섬유모세포-유사 윤활막세포(HFLS-RA) 세포로부터의 H0(huCDRH1)L1에 의한 MCP-1 방출의 억제. 인간화 15E10을 비교 목적을 위해 추가하였다. 제시된 데이터는 3개의 HFLS-RA 공여체 중 하나를 나타낸다.
도 30: 인간 제정맥 내피세포 검정 - (A) 30ng/ml 및 (B) 100ng/ml의 인간 OSM으로 자극된 인간 제정맥 내피세포로부터의 H0(huCDRH1)L1에 의한 IL-6 방출의 억제. 인간화 15E10을 비교 목적을 위해 추가하였다. 제시된 데이터는 3회의 검정 반복 중 하나를 나타낸다.
도 31: 인간 폐 섬유모세포 검정 - 인간 OSM으로 자극된 인간 폐 섬유모세포로부터의 H0(huCDRH1)L1에 의한 MCP-1 방출의 억제. 인간화 15E10을 비교 목적을 위해 추가하였다. 제시된 데이터는 (A) 한 건강한 공여체 및 (B) 한 IPF 공여체를 나타낸다.
도 32: 인간 폐 섬유모세포 검정 - 인간 OSM으로 자극된 인간 폐 섬유모세포로부터의 H0(huCDRH1)L1에 의한 IL-6 방출의 억제. 인간화 15E10(표지된 항체 X)을 비교 목적을 위해 추가하였다. 제시된 데이터는 (A) 한 건강한 공여체 및 (B) 한 IPF 공여체를 나타낸다.
도 33: CDRH3 변이체 결합 데이터 - 알라닌 스캐닝을 CDRH3에서 발견된 잔기에 대해 수행하였다. 제공된 데이터는 결합 친화성이 상기 잔기의 변화에 의해 영향을 받는 것을 나타낸다.
도 34: hOSM과 gp130, LIFR 및 OSMR 사이의 상호작용의 예시.
항체의 명명법 - 불확실함을 피하기 위해, 15E10h 및 인간화 15E10은 동일 항체이며, 일부 도에서 표지된 항체 X이다. 또한, 10G8/A9 및 10G8는 동일한 항체이다.
발명의 개요
본 발명은 OSM에 특이적으로 결합하고, gp130 수용체에 대한 OSM의 결합을 억제하지만, 부위 II 잔기와 직접적으로 상호작용하지 않는, OSM에 결합할 수 있는 항원 결합 단백질, 예를 들어, 항체를 제공한다.
본 발명의 OSM 항체는 뮤린 mAb 10G8에 관한 것이거나, 이로부터 유래된다. 10G8 뮤린 중쇄 가변 영역 아미노산 서열은 SEQ ID NO:26으로 제공되고, 10G8 뮤린 경쇄 가변 영역 아미노산 서열은 SEQ ID NO:28로 제공된다.
본 발명의 중쇄 가변 영역(VH)은 하기 CDR 또는 이러한 CDR의 변이체를 포함할 수 있다(케이뱃(Kabat)(Kabat et al; Sequences of proteins of Immunological Interest NIH, 1987)에 의해 규정된 바와 같음):
SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:77의 CDRH1;
SEQ ID NO:2의 CDRH2;
SEQ ID NO:3의 CDRH3.
본 발명의 경쇄 가변 영역(VL)은 하기 CDR 또는 이러한 CDR의 변이체를 포함할 수 있다(케이뱃(Kabat et al; Sequences of proteins of Immunological Interest NIH, 1987)에 의해 규정된 바와 같음):
SEQ ID NO:4의 CDRL1;
SEQ ID NO:5 또는 SEQ ID NO:78의 CDRL2;
SEQ ID NO:6의 CDRL3.
본 발명은 또한 본원에 기재된 항원-결합 단백질 중 임의의 항원-결합 단백질의 중쇄를 엔코딩하는 폴리누클레오티드 서열, 및 본원에 기재된 항원-결합 단백질 중 임의의 항원-결합 단백질의 경쇄를 엔코딩하는 폴리누클레오티드 서열을 제공한다. 이러한 폴리누클레오티드는 동등한 폴리누클레오티드 서열에 해당하는 코딩 서열이나, 이러한 폴리누클레오티드 서열이 시작 코돈, 적절한 신호 서열 및 정지 코돈과 함께 발현 벡터에 클로닝될 수 있음이 이해될 것이다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 항원-결합 단백질 중 임의의 항원-결합 단백질의 중쇄 및/또는 경쇄를 엔코딩하는 하나 이상의 폴리누클레오티드를 포함하는 재조합의 형질전환되거나 트랜스펙션된 숙주 세포를 제공한다.
본 발명은 적합한 배양 배지, 예를 들어, 혈청-비함유 배양 배지에서 본원에 기재된 항원-결합 단백질 중 임의의 항원-결합 단백질의 중쇄를 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 포함하는 첫번째 벡터 및 본원에 기재된 항원-결합 단백질 중 임의의 항원-결합 단백질의 경쇄를 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 포함하는 두번째 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 본원에 기재된 항원-결합 단백질 중 임의의 항원-결합 단백질의 생성을 위한 방법을 추가로 제공한다.
본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 항원-결합 단백질 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물을 추가로 제공한다.
한 추가 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 치료학적 유효량의 항원 결합 단백질을 환자에 투여하는 단계를 포함하는, hOSM과 gp130 사이의 상호작용의 조절에 반응하는 질병 또는 장애를 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다.
따라서, RA 및 다른 질병 및 장애, 특히 만성 염증성 질병 및 장애, 예를 들어, 골관절염, 특발성 폐 섬유증, 동통, 염증성 폐 질병, 심장혈관 질병 및 건선의 치료를 위한 치료 방법을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다. 특히, OSM(예를 들어, hOSM, 특히 이의 부위 II)에 특이적으로 결합하고, OSM과 gp130 사이의 상호작용의 조절에 반응하는 질병 및 장애의 치료에서 상기 상호작용을 조절(즉, 억제 또는 차단)하는 면역글로불린, 특히 항체를 제공하는 것이 본 발명의 목적이다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 치료적 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 단백질을 염증성 질병 또는 장애에 걸린 인간 환자에 투여하는 단계를 포함하는, 상기 환자를 치료하는 방법이 제공된다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 표적 항원에 결합하는 비-인간 항체를 수득하는 단계, 항체-항원 공동 결정의 결정학적 구조를 수득하는 단계, 결정 구조로부터의 약 2-5Å까지 항원에 대한 결합에서 직접적으로 관련된 비-인간 항체의 잔기를 결정하는 단계, 결합에 관련되지 않은 잔기 중 하나 이상을 인간 서열로부터 유래된 잔기로 돌연변이시키는 단계, 및 상기 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 항체를 인간화시키는 방법이 제공된다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 OSM에 특이적으로 결합하고, 예를 들어, 인간 OSM(hOSM)에 특이적으로 결합하고, gp130 수용체에 대한 OSM의 결합을 억제하지만, 부위 II 잔기와 직접적으로 상호작용하지 않는 항원 결합 단백질을 제공한다.
본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 한 추가 양태에서, 항원 결합 단백질은 잔기 Q20, G120, Q16, N124에 직접 결합하지 않는다.
본원에 기재된 바와 같은 본원의 한 추가 양태에서, OSM에 특이적으로 결합하고, 예를 들어, 인간 OSM(hOSM)에 특이적으로 결합하고, gp130 수용체에 대한 OSM의 결합을 억제하고, hu OSM의 잔기 82, 83, 84, 90, 94, 112, 115, 122, 123, 152 중 하나 이상과 상호작용하는 항원 결합 단백질이 제공된다.
한 상기 양태에서, 본 발명은 OSM에 특이적으로 결합하고, 예를 들어, 인간 OSM(hOSM)에 특이적으로 결합하고, gp130 수용체에 대한 OSM의 결합을 억제하지만, 부위 II 잔기와 직접적으로 상호작용하지 않고, 경쟁 ELISA 검정에서 SEQ ID NO:79의 중쇄 및 SEQ ID NO:80의 경쇄를 갖는 항체와 경쟁하지 않는 항원 결합 단백질을 제공한다.
한 상기 양태에서, 본 발명은 OSM, 예를 들어, 인간 OSM으로의 결합에 대해 본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 단백질과 경쟁하는 항원 결합 단백질을 제공한다.
또 다른 양태에서, 항원 결합 단백질은, 예를 들어, Biacore에 의해 측정시 높은 친화성으로 인간 OSM에 결합하고, 이러한 항원 결합 단백질은 500pM 또는 그 미만의 친화성, 또는 400pM 또는 그 미만, 또는 300pM 또는 그 미만, 250pM 또는 그 미만, 또는 200pM 또는 그 미만, 또는, 예를 들어, 140pM 또는 그 미만의 친화성으로 인간 OSM에 결합한다. 한 추가 구체예에서, 항원 결합 단백질은 Biacore에 의해 측정시 약 100pM 내지 약 500pM 또는 약 100pM 내지 약 300pM, 또는 약 100pM 내지 약 250pM, 또는 약 100pM 내지 약 200pM의 친화성으로 인간 OSM에 결합한다. 본 발명의 한 구체예에서, 항원 결합 단백질은 250pm 미만의 친화성으로 OSM에 결합한다. 본 발명의 한 추가 구체예에서, 항원 결합 단백질은 140pm 미만의 친화성으로 OSM에 결합한다. 한 상기 구체예에서, 이는, 예를 들어, 실시예 2.5.1에 기재된 바와 같이 Biacore에 의해 측정된다.
또 다른 양태에서, 항원 결합 단백질은, 예를 들어, 용액 기반 Kinexa 방법에 의해 측정시 높은 친화성으로 인간 OSM에 결합하고, 이러한 항원 결합 단백질은 200pM 또는 그 미만의 친화성, 또는 150pM 또는 그 미만, 또는 10OpM 또는 그 미만, 또는 50pM 또는 그 미만, 또는, 예를 들어, 40pM 또는 그 미만의 친화성으로 인간 OSM에 결합한다. 한 추가 구체예에서, 항원 결합 단백질은 Kinexa에 의해 측정시 약 10pM 내지 약 200pM 또는 약 10pM 내지 약 150pM, 또는 약 10pM 내지 약 100pM, 또는 약 10pM 내지 약 70pM 또는 약 10pM 내지 약 40pM의 친화성으로 인간 OSM에 결합한다. 본 발명의 한 구체예에서, 항원 결합 단백질은 70pm 미만의 친화성으로 OSM에 결합한다. 본 발명의 한 추가 구체예에서, 항원 결합 단백질은 40pm 미만의 친화성으로 OSM에 결합한다. 한 상기 구체예에서, 이는, 예를 들어, 실시예 2.5.1에 기재된 바와 같이 Kinexa에 의해 측정된다.
또 다른 양태에서, 항원 결합 단백질은 인간 OSM에 결합하고, 세포 중화 검정에서 OSM을 중화시키며, 이러한 항원 결합 단백질은 약 10pM 내지 약 200pM, 또는 약 10pM 내지 약 150pM, 또는 약 10pM 내지 약 100pM, 또는 약 20pM 내지 약 100pM, 또는 약 20pM 내지 약 100pM의 IC50을 갖는다. 본 발명의 한 추가 구체예에서, 항원 결합 단백질은 OSM에 결합하고, 세포 중화 검정에서 OSM을 중화시키며, 이러한 항원 결합 단백질은 140pm 미만의 친화성과 함께 약 20pM의 IC50을 갖는다.
한 상기 구체예에서, 이는, 예를 들어, 실시예 2의 단락 2.2.1에 기재된 바와 같이 세포 중화 검정에 의해 측정된다.
한 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO:3의 CDRH3, 또는 CDRH3이 하기 위치(케이뱃 넘버링을 이용함) 중 하나 이상에서 하기에 기재된 대안적 아미노산으로 치환된 SEQ ID NO:3의 변이체를 포함하는 항원 결합 단백질을 추가로 제공한다:
위치 95가 Ala, Glu, Gly, His, Leu, Met, Pro, Gln, Ser, Thr, 또는 Val으로 치환됨;
위치 96이 Ala, Cys, Phe, Gly, His, Lys, Leu, Ser, Thr, Trp 또는 Tyr으로 치환됨;
위치 97이 Ala, Cys, Phe, Met 또는 Ser으로 치환됨;
위치 98이 Ala, Asp, Phe, Gly, Leu, Pro, Gln 또는 Trp으로 치환됨;
위치 99가 Ala, Cys, Pro, Ser, Val 또는 Tyr으로 치환됨;
위치 100B가 Glu로 치환됨;
위치 100C가 Ala, Glu, Phe, Gly, Val 또는 Trp로 치환됨;
위치 100D가 Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, Leu, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr으로 치환됨;
위치 101이 Glu, Gly, Ser, Thr 또는 Val으로 치환됨;
위치 102가 Ala, Phe, Gly, Leu, Pro, Gln, Arg, Ser, Tyr, His, Ile, Asp 또는 Trp으로 치환됨.
본 발명의 한 추가 양태에서, 항원 결합 단백질은 하기를 포함한다:
i) SEQ ID NO:3에 기재된 CDRH3, 또는 Val102가 Tyr, His, Ile, Ser, Asp 또는 Gly으로 치환된 SEQ ID NO:3의 변이체;
ii) SEQ ID NO:2에 기재된 CDRH2, 또는 Thr50이 Gly, Tyr, Phe, Ile, Glu 또는 Val으로 치환되고/되거나, Ile51이 Leu, Val, Thr, Ser 또는 Asn으로 치환되고/되거나, Ser52가 Phe, Trp 또는 His으로 치환되고/되거나, Gly53이 Asp, Ser 또는 Asn으로 치환되고/되거나, Gly54가 Ser으로 치환되고/되거나, Phe56이 Ser, Tyr, Thr, Asn, Asp 또는 Arg로 치환되고/되거나, Tyr58이 Gly, His, Phe, Asp 또는 Asn으로 치환된 SEQ ID NO:2의 변이체;
iii) SEQ ID NO:4에 기재된 CDRL1, Ser27A가 Asn, Asp, Thr 또는 Glu로 치환되고/되거나, Ser27C가 Asp, Leu, Tyr, Val, Ile, Asn, Phe, His, Gly 또는 Thr으로 치환되고/되거나, Asn31이 Ser, Thr, Lys 또는 Gly으로 치환되고/되거나, Phe32가 Tyr, Asn, Ala, His, Ser 또는 Arg로 치환되고/되거나, Met33이 Leu, Val, Ile 또는 Phe로 치환된 SEQ ID NO:4의 변이체;
iv) SEQ ID NO:6에 기재된 CDRL3, 또는 Leu89가 Gln, Ser, Gly 또는 Phe로 치환되고/되거나, His90이 Gln 또는 Asn으로 치환되고/되거나, Ser91이 Asn, Phe, Gly, Arg, Asp, His, Thr, Tyr 또는 Val으로 치환되고/되거나, Arg92가 Asn, Tyr, Trp, Thr, Ser, Gln, His, ala 또는 Asp로 치환되고/되거나, Glu93이 Asn, Gly, His, Thr, Ser, Ar 또는 Ala로 치환되고/되거나, Phe96이 Pro, Leu, Tyr, Arg, Ile, 또는 Trp로 치환된 SEQ ID NO:6의 변이체.
또 다른 한 추가 양태에서, 항원 결합 단백질은 하기를 추가로 포함한다:
v) SEQ ID NO:5 또는 SEQ ID NO:78에 기재된 CDRL2.
또 다른 한 추가 양태에서, 항원 결합 단백질은 하기를 추가로 포함한다:
vi) SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:77에 기재된 CDRH1, 또는 Tyr32가 Ile, His, Phe, Thr, Asn, Cys, Glu 또는 Asp로 치환되고/되거나, Ala33이 Tyr, Trp, Gly, Thr, Leu 또는 Val으로 치환되고/되거나, Met34가 Ile, Val 또는 Trp로 치환되고/되거나, Ser35가 His, Glu, Asn, Gln, Tyr 또는 Thr으로 치환된 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:77의 변이체.
CDR L1, L2, L3, H1 및 H2에 대한 변이체 CDR 서열은 돌연변이유발 및/또는 정준(canonical) 기술을 이용하여 결정되었다. 상보성 결정 영역(CDR) L1, L2, L3, H1 및 H2는 주쇄 형태의 유한수(finite number) 중 하나를 구조적으로 나타내는 경향이 있다. CDR의 특정 정준 구조 부류는 CDR의 길이, 및 CDR 및 프레임워크 영역 둘 모두 내의 중요 위치에 위치된 잔기(구조적 결정 잔기 또는 SDR)에 의해 결정된 루프 패킹 둘 모두에 의해 규정된다. 마틴 및 토른톤(Martin and Thornton)의 문헌[1996; J Mol Biol 263:800-815]에서 "중요 잔기" 정준 주형을 규정하는 자동화된 방법이 생성되었다. CDR의 세트에 대한 정준 부류를 규정하기 위해 클러스터 분석이 사용되며, 정준 주형은 이후 매몰 소수성(buried hydrophobics), 수소-결합 잔기, 및 보존된 글리신 및 프롤린을 분석함으로써 확인된다. 항체 서열의 CDR은 중요 잔기 주형에 대해 서열을 비교하고, 동일성 또는 유사성 매트릭스를 이용하여 각 주형을 스코어링(scoring)함으로써 정준 부류로 지정될 수 있다.
한 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO:3의 CDRH3, SEQ ID NO:2의 CDRH2, SEQ ID NO:4의 CDRL1 및 SEQ ID NO:6의 CDRL3를 포함하는 항원 결합 단백질을 제공하며, 이는 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:77의 CDRH1, 및 SEQ ID NO:5 또는 SEQ ID NO:78의 CDRL2를 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 항원 결합 단백질은 SEQ ID NO:3의 CDRH3, SEQ ID NO:2의 CDRH2, SEQ ID NO:4의 CDRL1, SEQ ID NO:5의 CDRL2, 및 SEQ ID NO:6의 CDRL3를 포함한다.
또 다른 양태에서, 항원 결합 단백질은 SEQ ID NO:3의 CDRH3, SEQ ID NO:2의 CDRH2, SEQ ID NO:1의 CDRH1, SEQ ID NO:4의 CDRL1, SEQ ID NO:5의 CDRL2, 및 SEQ ID NO:6의 CDRL3를 포함한다.
또 다른 양태에서, 항원 결합 단백질은 SEQ ID NO:3의 CDRH3, SEQ ID NO:2의 CDRH2, SEQ ID NO:1의 CDRH1, SEQ ID NO:4의 CDRL1, SEQ ID NO:78의 CDRL2, 및 SEQ ID NO:6의 CDRL3를 포함한다.
또 다른 양태에서, 항원 결합 단백질은 SEQ ID NO:3의 CDRH3, SEQ ID NO:2의 CDRH2, SEQ ID NO:77의 CDRH1, SEQ ID NO:4의 CDRL1, SEQ ID NO:5의 CDRL2, 및 SEQ ID NO:6의 CDRL3를 포함한다.
또 다른 양태에서, 항원 결합 단백질은 SEQ ID NO:3의 CDRH3, SEQ ID NO:2의 CDRH2, SEQ ID NO:77의 CDRH1, SEQ ID NO:4의 CDRL1, SEQ ID NO:78의 CDRL2, 및 SEQ ID NO:6의 CDRL3를 포함한다.
본 발명의 한 양태에서, 항원 결합 단백질은 CDRH1을 통해 OSM과 직접적으로 상호작용하지 않는다.
한 양태에서, 항원 결합 단백질은 CDRH1 또는 CDRL2를 통해 OSM과 직접적으로 상호작용하지 않는다.
본 발명의 항원 결합 단백질은 자연 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 동등물의 구조로 포맷화될 수 있는 본 발명의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 항원 결합 단백질은 적절한 경쇄와 페어링되는 경우 전장 항체, (Fab')2 단편, Fab 단편, 또는 이의 동등물(예를 들어, scFV, 바이-, 트리- 또는 테트라-바디, Tandabs 등)로 포맷화된 본 발명의 VH 영역을 포함할 수 있다. 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4; 또는 IgM; IgA, IgE 또는 IgD 또는 이들의 변형된 변이체일 수 있다. 항체 중쇄의 불변 도메인이 따라서 선택될 수 있다. 경쇄 불변 도메인은 카파 또는 람다 불변 도메인일 수 있다. 또한, 항원 결합 단백질은 모든 부류의 변형, 예를 들어, IgG 이합체, 더 이상 Fc 수용체에 결합하지 않거나 C1q 결합을 매개하지 않는 Fc 돌연변이를 포함할 수 있다. 항원 결합 단백질은 또한 항원 결합 영역 및 비-면역글로불린 영역을 포함하는 WO86/01533호에 기재된 유형의 키메라 항체일 수 있다.
불변 영역은 임의의 요구되는 기능에 따라 선택된다. IgG1은 보체로의 결합을 통해 용해 능력을 나타낼 수 있고/있거나, ADCC(항체 의존성 세포 세포독성)를 매개할 수 있다. 비-세포독성 차단 항체가 요구되는 경우 IgG4가 이용될 수 있다. 그러나, IgG4 항체는 생성에 있어서 불안정성을 나타낼 수 있고, 따라서 대안은 일반적으로 더욱 안정적인 IgG1을 변형시키는 것이다. 제안된 변형, 예를 들어, 위치 235 및 237에서의 돌연변이가 EP0307434호에 기재되어 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명에 따른 항원 결합 단백질, 예를 들어, 항체의 용해 또는 비-용해 형태를 제공한다.
특정 형태에서, 본 발명의 항체는 본원에 기재된 중쇄 가변 영역 중 임의의 중쇄 가변 영역을 갖는 전장(예를 들어, H2L2 테트라머)의 용해 또는 비-용해 IgG1 항체이다.
본 발명의 항원 결합 단백질은 SEQ ID NO:26 및 SEQ ID NO:28에 기재된 바와 같은 가변 영역을 갖는 뮤린 항체 또는 이의 비-뮤린 동등물, 예를 들어, 이의 래트, 인간, 키메라 또는 인간화 변이체로부터 유래되며, 예를 들어, 이들은 SEQ ID NO:54 및 SEQ ID NO:62에 기재된 바와 같은 중쇄 및 경쇄를 갖는 인간화 항체로부터 유래된다.
본 발명의 한 양태에서, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58 또는 SEQ ID NO:74 중 임의의 것으로부터 선택된 분리된 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항원 결합 단백질이 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:66 또는 SEQ ID NO:68 중 임의의 것으로부터 선택된 분리된 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항원 결합 단백질이 제공된다.
본 발명의 한 추가 양태에서, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58 또는 SEQ ID NO:74 중 임의의 것으로부터 선택된 분리된 중쇄 가변 도메인, 및 SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:66 또는 SEQ ID NO:68 중 임의의 것으로부터 선택된 분리된 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항원 결합 단백질이 제공된다.
본 발명의 한 추가 구체예에서, SEQ ID NO:54의 분리된 중쇄 가변 도메인, 및 SEQ ID NO:62의 분리된 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항원 결합 단백질이 제공된다. 한 추가 구체예에서, 항원 결합 단백질은 SEQ ID NO:74의 중쇄 가변 영역, 및 SEQ ID NO:62의 경쇄 가변 영역을 포함한다.
한 양태에서, 본 발명의 항원 결합 단백질은 SEQ ID NO:53에 의해 엔코딩되는 중쇄 가변 영역, 및 SEQ ID NO:61에 의해 엔코딩되는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 한 양태에서, 본 발명의 항원 결합 단백질은 SEQ ID NO:73에 의해 엔코딩되는 중쇄 가변 영역, 및 SEQ ID NO:61에 의해 엔코딩되는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
한 양태에서, 분리된 가변 중쇄를 엔코딩하는 폴리누클레오티드가 제공되며, 상기 폴리누클레오티드는 SEQ ID NO:53, 또는 SEQ ID NO:55, 또는 SEQ ID NO:57, 또는 SEQ ID NO:73을 포함한다.
한 양태에서, 분리된 가변 경쇄를 엔코딩하는 폴리누클레오티드가 제공되며, 상기 폴리누클레오티드는 SEQ ID NO:61, 또는 SEQ ID NO:63, 또는 SEQ ID NO:65, 또는 SEQ ID NO:67을 포함한다.
한 추가 양태에서, SEQ ID NO:53, 또는 SEQ ID NO:73을 포함하는 분리된 가변 중쇄를 엔코딩하는 폴리누클레오티드, 및 SEQ ID NO:61, 또는 SEQ ID NO:63, 또는 SEQ ID NO:65, 또는 SEQ ID NO:67을 포함하는 분리된 가변 경쇄를 엔코딩하는 폴리누클레오티드가 제공된다. 또 다른 한 추가 양태에서, SEQ ID NO:53 또는 SEQ ID NO:73을 포함하는 분리된 가변 중쇄를 엔코딩하는 폴리누클레오티드, 및 SEQ ID NO:61을 포함하는 분리된 가변 경쇄를 엔코딩하는 폴리누클레오티드가 제공된다.
한 추가 양태에서, 항원 결합 단백질은 본원에 기재된 바와 같은 경쇄 중 어느 하나와 조합된 본원에 기재된 바와 같은 가변 중쇄 중 어느 하나를 포함할 수 있다.
한 양태에서, 항원 결합 단백질은 본원에 기재된 본 발명에 따른 하나 이상의 CDR, 또는 본원에 기재된 본 발명에 따른 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 한 구체예에서, 항원 결합 단백질은 영장류 OSM에 결합한다. 한 상기 구체예에서, 항원 결합 단백질은 추가로 비-인간 영장류 OSM, 예를 들어, 시노몰구스 마카크(cynomolgus macaque) 원숭이 OSM에 결합한다. 또 다른 구체예에서, 항원 결합 단백질은 마모셋 OSM에 결합한다.
한 양태에서, Biacore 또는 Kinexa에 의해 측정시 1 nM 보다 강한 친화성으로 마모셋 및 인간 OSM 둘 모두에 결합하는 항원 결합 단백질이 제공된다.
마모셋 OSM을 중화시키는 상기 항체들의 능력은 마모셋 질병 모델, 예를 들어, 추가 적응증에 대한 MS의 EAE 모델에서 OSM의 역할을 평가하는 독특한 수단을 제공한다.
또 다른 양태에서, 항원 결합 단백질은 dAb, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 미니항체, 및 미니바디로 구성되는 군으로부터 선택된다.
본 발명의 한 양태에서, 항원 결합 단백질은 인간화 또는 키메라 항체이고, 한 추가 양태에서, 항체는 인간화 항체이다.
한 양태에서, 항체는 모노클로날 항체이다.
본 발명은 한 양태에서 하기를 포함하는 항원 결합 단백질을 추가로 제공한다:
i) SEQ ID NO:3에 기재된 CDRH3, 또는 CDRH3이 하기 위치(케이뱃 넘버링을 이용함) 중 하나 이상에서 하기에 기재되는 대안적 아미노산으로 치환된 SEQ ID NO:3의 변이체:
위치 95가 Ala, Glu, Gly, His, Leu, Met, Pro, Gln, Ser, Thr, 또는 Val으로 치환됨;
위치 96이 Ala, Cys, Phe, Gly, His, Lys, Leu, Ser, Thr, Trp 또는 Tyr으로 치환됨;
위치 97이 Ala, Cys, Phe, Met 또는 Ser으로 치환됨;
위치 98이 Ala, Asp, Phe, Gly, Leu, Pro, Gln 또는 Trp으로 치환됨;
위치 99가 Ala, Cys, Pro, Ser, Val 또는 Tyr으로 치환됨;
위치 100B가 Glu로 치환됨;
위치 100C가 Ala, Glu, Phe, Gly, Val 또는 Trp으로 치환됨;
위치 100D가 Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, Leu, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr으로 치환됨;
위치 101이 Glu, Gly, Ser, Thr 또는 Val으로 치환됨;
위치 102가 Ala, Phe, Gly, Leu, Pro, Gln, Arg, Ser, Tyr, His, Ile, Asp 또는 Trp으로 치환됨;
ii) SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:77에 기재된 CDRH1, 또는 Tyr32가 Ile, His, Phe, Thr, Asn, Cys, Glu 또는 Asp로 치환되고/되거나, Ala33이 Tyr, Trp, Gly, Thr, Leu 또는 Val으로 치환되고/되거나, Met34가 Ile, Val 또는 Trp으로 치환되고/되거나, Ser35가 His, Glu, Asn, Gln, Tyr 또는 Thr으로 치환된 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:77의 변이체;
iii) SEQ ID NO:2에 기재된 CDRH2, 또는 Thr50이 Gly, Tyr, Phe, Ile, Glu 또는 Val으로 치환되고/되거나, Ile51이 Leu, Val, Thr, Ser 또는 Asn으로 치환되고/되거나, Ser52가 Phe, Trp 또는 His로 치환되고/되거나, Gly53이 Asp, Ser 또는 Asn으로 치환되고/되거나, Gly54가 Ser으로 치환되고/되거나, Phe56이 Ser, Tyr, Thr, Asn, Asp 또는 Arg로 치환되고/되거나, Tyr58이 Gly, His, Phe, Asp 또는 Asn으로 치환된 SEQ ID NO:2의 변이체;
iv) SEQ ID NO:4에 기재된 CDRL1, 또는 Ser27A가 Asn, Asp, Thr 또는 Glu로 치환되고/되거나, Ser27C가 Asp, Leu, Tyr, Val, Ile, Asn, Phe, His, Gly 또는 Thr으로 치환되고/되거나, Asn31이 Ser, Thr, Lys 또는 Gly으로 치환되고/되거나, Phe32이 Tyr, Asn, Ala, His, Ser 또는 Arg로 치환되고/되거나, Met33이 Leu, Val, Ile 또는 Phe로 치환된 SEQ ID NO:4의 변이체;
v) SEQ ID NO:5 또는 SEQ ID NO:78에 기재된 CDRL2;
vi) SEQ ID NO:6에 기재된 CDRL3, 또는 Leu89가 Gln, Ser, Gly 또는 Phe로 치환되고/되거나, His90이 Gln 또는 Asn으로 치환되고/되거나, Ser91이 Asn, Phe, Gly, Arg, Asp, His, Thr, Tyr 또는 Val으로 치환되고/되거나, Arg92가 Asn, Tyr, Trp, Thr, Ser, Gln, His, ala 또는 Asp로 치환되고/되거나, Glu93이 Asn, Gly, His, Thr, Ser, Ar 또는 Ala로 치환되고/되거나, Phe96이 Pro, Leu, Tyr, Arg, Ile, 또는 Trp로 치환된 SEQ ID NO:6의 변이체;
vii) 하기 잔기를 포함하는 중쇄 프레임워크:
위치 2 Val, Ile 또는 Gly;
위치 4 Leu 또는 Val;
위치 20 Leu, Ile, Met 또는 Val;
위치 22 Cys;
위치 24 Thr, Ala, Val, Gly 또는 Ser;
위치 26 Gly;
위치 29 Ile, Phe, Leu 또는 Ser;
위치 36 Trp;
위치 47 Trp;
위치 48 Ile, met, Val 또는 Leu;
위치 69 Ile, Leu, Phe, Met 또는 Val;
위치 71 Arg;
위치 78 Ala, Leu, Val, Tyr 또는 Phe;
위치 80 Leu, Met;
위치 90 Tyr 또는 Phe;
위치 92 Cys;
위치 94 Arg, Lys, Gly, Ser, His 또는 Asn.
본 발명은 한 양태에서 하기를 포함하는 항원 결합 단백질을 추가로 제공한다:
i) SEQ ID NO:3에 기재된 CDRH3;
ii) SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:77에 기재된 CDRH1;
iii) SEQ ID NO:2에 기재된 CDRH2;
iv) SEQ ID NO:4에 기재된 CDRL1;
v) SEQ ID NO:5 또는 SEQ ID NO:78에 기재된 CDRL2;
vi) SEQ ID NO:6에 기재된 CDRL3;
vii) 하기 잔기를 포함하는 중쇄 프레임워크:
위치 2 Val, Ile 또는 Gly;
위치 4 Leu 또는 Val;
위치 20 Leu, Ile, Met 또는 Val;
위치 22 Cys;
위치 24 Thr, Ala, Val, Gly 또는 Ser;
위치 26 Gly;
위치 29 Ile, Phe, Leu 또는 Ser;
위치 36 Trp;
위치 47 Trp;
위치 48 Ile, met, Val 또는 Leu;
위치 69 Ile, Leu, Phe, Met 또는 Val;
위치 71 Arg;
위치 78 Ala, Leu, Val, Tyr 또는 Phe;
위치 80 Leu, Met;
위치 90 Tyr 또는 Phe;
위치 92 Cys;
위치 94 Arg, Lys, Gly, Ser, His 또는 Asn.
본 발명은 한 양태에서 하기를 포함하는 항원 결합 단백질을 추가로 제공한다:
i) SEQ ID NO:3에 기재된 CDRH3;
ii) SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:77에 기재된 CDRH1;
iii) SEQ ID NO:2에 기재된 CDRH2;
iv) SEQ ID NO:4에 기재된 CDRL1;
v) SEQ ID NO:5 또는 SEQ ID NO:78에 기재된 CDRL2;
vi) SEQ ID NO:6에 기재된 CDRL3;
vii) 하기 잔기를 포함하는 중쇄 프레임워크:
위치 2 Val;
위치 4 Leu;
위치 20 Leu;
위치 22 Cys;
위치 24 Ala;
위치 26 Gly;
위치 29 Phe;
위치 36 Trp;
위치 47 Trp;
위치 48 Val;
위치 69 Ile;
위치 71 Arg;
위치 78 Leu;
위치 80 Leu;
위치 90 Tyr;
위치 92 Cys;
위치 94 Arg.
본 발명은 한 양태에서 하기를 포함하는 항원 결합 단백질을 추가로 제공한다:
i) SEQ ID NO:3에 기재된 CDRH3;
ii) SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:77에 기재된 CDRH1;
iii) SEQ ID NO:2에 기재된 CDRH2;
iv) SEQ ID NO:4에 기재된 CDRL1;
v) SEQ ID NO:5 또는 SEQ ID NO:78에 기재된 CDRL2;
vi) SEQ ID NO:6에 기재된 CDRL3;
vii) 하기 잔기를 포함하는 중쇄 프레임워크:
위치 2 Val;
위치 4 Leu;
위치 20 Leu;
위치 22 Cys;
위치 24 Ala;
위치 26 Gly;
위치 29 Phe;
위치 36 Trp;
위치 47 Trp;
위치 48 Leu;
위치 69 Ile, Leu, Phe, Met 또는 Val;
위치 71 Arg;
위치 78 Ala;
위치 80 Leu, Met;
위치 90 Tyr 또는 Phe;
위치 92 Cys;
위치 94 Arg, Lys, Gly, Ser, His 또는 Asn.
본 발명의 항원 결합 단백질, 예를 들어, 항체는 본 발명의 항원 결합 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 발현 벡터를 이용한 숙주 세포의 트랜스펙션에 의해 생성될 수 있다. 발현 벡터 또는 재조합 플라스미드는 항원 결합 단백질에 대한 상기 코딩 서열을 숙주 세포 내에서의 복제 및 발현, 및/또는 숙주 세포로부터의 분비를 조절할 수 있는 통상적인 조절성 조절 서열과 작동가능하게 관련되도록 배치함으로써 생성된다. 조절성 서열은 프로모터 서열, 예를 들어, CMV 프로모터, 다른 공지된 항체로부터 유래될 수 있는 신호 서열을 포함한다. 유사하게, 상보적 항원 결합 단백질 경쇄 또는 중쇄를 엔코딩하는 DNA 서열을 갖는 두번째 발현 벡터가 생성될 수 있다. 특정 구체예에서, 상기 두번째 발현 벡터는 각각의 폴리펩티드 사슬이 기능적으로 발현될 수 있는 것을 보장하기 위해 코딩 서열 및 선택 마커가 관련된 것을 제외하고는 첫번째 발현 벡터와 동일하다. 대안적으로, 항원 결합 단백질에 대한 중쇄 및 경쇄 코딩 서열은 단일한 벡터에 존재할 수 있다.
선택된 숙주 세포는 통상적인 기술에 의해 첫번째 및 두번째 벡터 둘 모두로 공동 트랜스펙션(또는 간단히 단일 벡터에 의해 트랜스펙션)되어, 재조합 또는 합성 경쇄 및 중쇄 둘 모두를 포함하는 본 발명의 트랜스펙션된 숙주 세포가 생성된다. 트랜스펙션된 세포는 이후 통상적인 기술에 의해 배양되어 본 발명의 조작된 항원 결합 단백질이 생성된다. 재조합 중쇄 및/또는 경쇄 둘 모두의 결합을 포함하는 항원 결합 단백질이 적절한 검정, 예를 들어, ELISA 또는 RIA에 의해 배양물로부터 스크리닝된다. 유사한 통상적 기술이 다른 항원 결합 단백질을 작제하기 위해 이용될 수 있다.
본 발명의 방법 및 조성물의 작제에서 사용되는 클로닝 및 서브클로닝 단계에 적합한 벡터는 당업자에 의해 선택될 수 있다. 예를 들어, 클로닝 벡터의 통상적인 pUC 시리즈가 이용될 수 있다. 한 벡터 pUC19는 Amersham(Buckinghamshire, United Kingdom) 또는 Pharmacia(Uppsala, Sweden)와 같은 공급처로부터 시판된다. 추가로, 용이하게 복제될 수 있고, 다수의 클로닝 부위 및 선택 유전자(예를 들어, 항생제 내성)를 가지며, 용이하게 조작되는 임의의 벡터가 클로닝에 사용될 수 있다. 따라서, 클로닝 벡터의 선택은 본 발명에서 제한 요인이 아니다.
발현 벡터는 또한 이종성 DNA 서열, 예를 들어, 포유동물 디하이드로폴레이트 환원효소 유전자(DHFR)의 발현을 증폭시키는데 적합한 유전자를 특징으로 할 수 있다. 다른 벡터 서열은 폴리 A 신호 서열, 예를 들어, 소 성장 호르몬(BGH)으로부터의 폴리 A 신호 서열 및 베타글로빈 프로모터 서열(betaglopro)을 포함한다. 본원에서 유용한 발현 벡터는 당업자에게 널리 공지된 기술에 의해 합성될 수 있다.
상기 벡터의 구성요소, 예를 들어, 레플리콘, 선택 유전자, 인핸서, 프로모터, 신호서열 등은 시판 업체 또는 자연 공급원으로부터 수득될 수 있거나, 선택된 숙주에서 재조합 DNA의 생성물의 발현 및/또는 분비를 유도하는데 사용하기 위한 공지된 절차에 의해 합성될 수 있다. 다수의 유형이 포유동물, 박테리아, 곤충, 효모, 및 진균 발현을 위해 당 분야에 공지된 다른 적절한 발현 벡터가 또한 상기 목적을 위해 선택될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 항원 결합 단백질의 코딩 서열을 함유하는 재조합 플라스미드로 트랜스펙션된 세포주를 포함한다. 상기 클로닝 벡터의 클로닝 및 다른 조작에 유용한 숙주 세포가 또한 통상적이다. 그러나, E. 콜라이(E. coli)의 다양한 균주로부터의 세포가 본 발명의 항원 결합 단백질의 작제에서 클로닝 벡터의 복제 및 다른 단계에 사용될 수 있다.
본 발명의 항원 결합 단백질의 발현에 적합한 숙주 세포 또는 세포주는 포유동물 세포, 예를 들어, NS0, Sp2/0, CHO(예를 들어, DG44), COS, HEK, 섬유모세포 세포(예를 들어, 3T3), 및 골수종 세포를 포함하며, 예를 들어, 본 발명의 항원 결합 단백질은 CHO 또는 골수종 세포에서 발현될 수 있다. 인간 세포가 사용될 수 있고, 따라서 분자가 인간 당화 패턴으로 변형되는 것이 가능할 수 있다.
대안적으로, 다른 진핵생물 세포주가 이용될 수 있다. 적합한 포유동물 숙주세포의 선택, 및 형질전환, 배양, 증폭, 스크리닝 및 생성물 생성 및 정제를 위한 방법은 당 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 상기 언급된 문헌[Sambrook et al.]을 참조하라.
박테리아 세포가 재조합 Fab의 발현 또는 본 발명의 다른 구체예에 적합한 숙주 세포로 유용한 것이 입증될 수 있다(예를 들어, Pluckthun, A., Immunol. Rev., 130:151-188 (1992) 참조). 그러나, 폴딩되지 않거나 부적절하게 폴딩된 형태 또는 당화되지 않은 형태로 존재하는 박테리아 세포에서 발현된 단백질의 경향으로 인해, 박테리아 세포에서 생성된 임의의 재조합 Fab는 항원 결합 능력의 보유에 대해 스크리닝되어야 한다. 박테리아 세포에 의해 발현된 분자가 적절하게 폴딩된 형태로 생성된 경우, 박테리아 세포는 요망되는 숙주일 것이거나, 대안적 구체예에서, 분자는 박테리아 숙주에서 발현될 수 있고, 이후 재폴딩될 수 있다. 예를 들어, 발현에 사용되는 E. 콜리의 다양한 균주가 생물공학 분야에서 숙주 세포로 널리 공지되어 있다. B. 섭틸리스(B. subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 다른 바실러스 등의 다양한 균주가 또한 상기 방법에서 이용될 수 있다.
요망되는 경우, 당업자에게 공지된 효모 세포의 균주, 뿐만 아니라 곤충 세포, 예를 들어, 드로소필라(Drosophila) 및 레피돕테라(Lepidoptera) 및 바이러스 발현 시스템이 숙주 세포로서 또한 이용가능하다. 예를 들어, 문헌[Miller et al., Genetic Engineering, 8:277-298, Plenum Press (1986)] 및 이에 인용된 참고문헌을 참조하라.
벡터가 작제될 수 있는 일반적 방법, 본 발명의 숙주 세포를 생성시키는데 필요한 트랜스펙션 방법, 및 상기 숙주 세포로부터 본 발명의 항원 결합 단백질을 생성시키는데 필요한 배양 방법은 모두 통상적인 기술일 수 있다. 통상적으로, 본 발명의 배양 방법은 보통 현탁액 중에서 혈청액 비함유로 세포를 배양함에 의한 혈청 비함유 배양 방법이다. 마찬가지로, 생성된 후, 본 발명의 항원 결합 단백질은 암모늄 설페이트 침전, 친화성 컬럼, 컬럼 크로마토그래피, 겔 전기영동 등을 포함하는 당 분야의 표준 절차에 따라 세포 배양 내용물로부터 정제될 수 있다. 이러한 기술은 당 분야의 기술 범위 내이고, 본 발명을 제한하지 않는다. 예를 들어, 변경된 항체의 제조가 WO 99/58679호 및 WO 96/16990호에 기재되어 있다.
항원 결합 단백질의 또 다른 발현 방법은 미국 특허 번호 4,873,316호에 기재된 바와 같이 트랜스제닉 동물에서의 발현을 이용할 수 있다. 이는 포유동물로 트랜스제닉으로 통합되는 경우 암컷이 이의 모유에서 요망되는 재조합 단백질을 생성하는 것을 가능케 하는 동물 카세인 프로모터를 이용하는 발현 시스템에 관한 것이다.
본 발명의 한 추가 구체예에서, 본 발명의 항체의 경쇄 및/또는 중쇄를 엔코딩하는 벡터로 형질전환되거나 트랜스펙션된 숙주 세포를 배양하는 단계 및 이에 의해 생성된 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 본 발명의 항체를 생성하는 방법이 제공된다.
본 발명에 따르면,
(a) 항체의 중쇄를 엔코딩하는 첫번째 벡터를 제공하는 단계;
(b) 항체의 경쇄를 엔코딩하는 두번째 벡터를 제공하는 단계;
(c) 상기 첫번째 및 두번째 벡터를 이용하여 포유동물 숙주 세포(예를 들어, CHO)를 형질전화시키는 단계;
(d) 상기 숙주 세포로부터 배양 배지로 항체가 분비되도록 하는 조건하에서 단계 (c)의 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
(e) 단계 (d)의 분비된 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 인간 OSM에 결합하고 이의 활성을 중화시키는 본 발명의 항-OSM 항체를 생성시키는 방법이 제공된다.
요망되는 방법에 의한 발현 후, 항체는 적절한 검정의 사용에 의해 시험관내 활성에 대해 시험된다. 현재 통상적인 ELISA 검정 포맷이 OSM에 대한 항체의 정성적 및 정량적 결합을 평가하는데 이용된다. 추가로, 일반적인 청소 메커니즘에도 불구하고 신체 내의 항체의 지속성을 평가하기 위해 수행되는 차후의 인간 임상 연구 전에 중화 효능을 확인하기 위해 다른 시험관내 검정이 또한 이용될 수 있다. 치료 용량 및 지속기간은 인간 순환에서 본 발명의 분자의 상대 지속기간에 관한 것이며, 이는 환자의 치료되는 조건 및 전반적 건강에 따라 당업자에 의해 조정될 수 있다. 연장된 기간(예를 들어, 4 내지 6개월)에 걸친 반복된 투여(예를 들어, 주 1회 또는 2주에 1회)가 최대 치료 효능을 달성하는데 필요할 수 있음이 예견된다.
본 발명의 한 구체예에서, 적어도 하나의 발현 카세트를 포함하는 재조합의 형질전환되거나, 트랜스펙션되거나, 형질도입된 숙주 세포가 제공되며, 예를 들어, 상기 발현 카세트는 본원에 기재된 본 발명에 따른 항원 결합 단백질의 중쇄를 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 포함하고, 본원에 기재된 본 발명에 따른 항원 결합 단백질의 경쇄를 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 추가로 포함하거나, 2개의 발현 카세트가 존재하고, 첫번째 발현 카세트는 경쇄를 엔코딩하고, 두번째 발현 카세트는 중쇄를 엔코딩한다. 예를 들어, 한 구체예에서, 첫번째 발현 카세트는 본원에 기재된 본 발명에 따른 불변 영역에 연결된 불변 영역을 포함하는 항원 결합 단백질 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄를 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 포함하고, 본원에 기재된 본 발명에 따른 불변 영역에 연결된 불변 영역을 포함하는 항원 결합 단백질 또는 이의 항원 결합 단편의 경쇄를 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 포함하는 두번째 카세트를 추가로 포함하며, 예를 들어, 첫번째 발현 카세트는 SEQ ID NO:70, 또는 SEQ ID NO:76으로부터 선택된 중쇄를 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 포함하고, 두번째 발현 카세트는 SEQ ID NO:72로부터 선택된 경쇄를 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 포함한다.
본원에 기재된 서열(SEQ ID NO:25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 83)이 본원에 기재된 서열과 실질적으로 동일한 서열, 예를 들어, 적어도 90% 동일하고, 예를 들어, 적어도 91%, 또는 적어도 92%, 또는 적어도 93%, 또는 적어도 94% 또는 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97% 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 것이 이해될 것이다. 핵산에 대해, 용어 "실질적 동일성"은 2개의 핵산 또는 이의 지정된 서열이 최적으로 정렬되고 비교되는 경우 누클레오티드의 적어도 약 80%, 누클레오티드의 적어도 약 90% 내지 약 95%, 또는 적어도 약 98% 내지 약 99.5%에서 적절한 누클레오티드 삽입 또는 결실과 함께 동일한 것을 나타낸다. 대안적으로, 세그먼트가 선택된 하이브리드화 조건하에서 가닥의 상보체에 하이브리드화되는 경우에 실질적 동일성이 존재한다.
누클레오티드 및 아미노산 서열에 대해, 용어 "동일한"은 최적으로 정렬되고, 적절한 삽입 또는 결실과 함께 비교되는 경우 2개의 핵산 또는 아미노산 서열 사이의 동일성의 정도를 나타낸다. 대안적으로, 실질적 동일성은 DNA 세그먼트가 선택적 하이브리드화 조건하에서 가닥의 상보체에 하이브리드화되는 경우에 존재한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 본원에 기재된 바와 같은 불변 영역에 연결된 불변 영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 및/또는 경쇄를 엔코딩하는 하나 이상의 발현 카세트를 포함하는 벡터를 포함하는 안정적으로 형질전환된 숙주 세포가 제공된다. 예를 들어, 상기 숙주 세포는 경쇄를 엔코딩하는 첫번째 벡터 및 중쇄를 엔코딩하는 두번째 벡터를 포함할 수 있고, 예를 들어, 첫번째 벡터는 SEQ ID NO:70, 또는 SEQ ID NO:76으로부터 선택된 중쇄를 엔코딩하고, 두번째 벡터는 경쇄, 예를 들어, SEQ ID NO:72의 경쇄를 엔코딩한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 본원에 기재된 본 발명에 따른 숙주 세포가 제공되며, 상기 세포는 진핵생물 세포이고, 예를 들어, 상기 세포는 포유동물 세포이다. 이러한 세포주의 예는 CHO 또는 NS0를 포함한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 배양 배지, 예를 들어, 혈청 비함유 배양 배지에서 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 본원에 기재된 본 발명에 따른 불변 영역에 연결된 불변 영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 생성을 위한 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 본원에 기재된 본 발명에 따른 방법이 제공되며, 여기서 항체는 상기 항체를 함유하는 혈청 비함유 배양 배지와 관련하여 적어도 95% 또는 그 초과(예를 들어, 98% 또는 그 초과)로 추가로 정제된다.
또 다른 구체예에서, 항원 결합 단백질 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 사용을 위한 설명서와 함께 본원에 기재된 본 발명에 따른 조성물을 포함하는 부품 키트(kit-of-parts)가 제공된다.
본 발명의 치료제의 투여 방식은 숙주에게 작용제를 전달하는 임의의 적합한 경로일 수 있다. 본 발명의 항원 결합 단백질, 및 약학적 조성물은 비경구 투여, 즉, 피하(s.c), 수막강내, 복막내, 근내(i.m.) 또는 정맥내(i.v.) 투여에 특히 유용하다.
본 발명의 치료제는 약학적으로 허용되는 담체 중에 활성 성분으로서 유효량의 본 발명의 항원 결합 단백질을 함유하는 약학적 조성물로 제조될 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 예방적 작용제는 주사 준비 형태의 항원 결합 단백질을 함유하는 수성 현탁액 또는 수용액이다. 한 구체예에서, 현탁액 또는 용액은 생리학적 pH에서 완충된다. 한 구체예에서, 비경구 투여용 조성물은 약학적으로 허용되는 담체에 용해된 본 발명의 항원 결합 단백질 또는 이의 칵테일의 용액을 포함할 것이다. 한 구체예에서, 담체는 수성 담체이다. 다양한 수성 담체, 예를 들어, 0.9% 염수, 0.3% 글리신 등이 이용될 수 있다. 이들 용액은 멸균 제조될 수 있고, 일반적으로 미립자 물질을 함유하지 않는다. 이들 용액은 통상적인 널리 공지된 멸균 기술(예를 들어, 여과)에 의해 멸균될 수 있다. 조성물은 생리학적 조건에 근접시키기 위해 필요한 약학적으로 허용되는 보조 물질, 예를 들어, pH 조정제 및 완충제 등을 함유할 수 있다. 상기 약학적 제형 내의 본 발명의 항원 결합 단백질의 농도는 약 0.5 중량% 미만, 보통 약 1 중량% 또는 그 이상 내지 약 15 중량% 또는 20 중량% 만큼 매우 다양할 수 있고, 이는 주로 선택된 특정 투여 방식에 따라 유체 부피, 점도 등을 기초로 하여 선택될 것이다.
따라서, 근내 주사용의 본 발명의 약학적 조성물은 약 1 mL의 멸균 완충수, 및 약 1 ng 내지 약 100 mg, 예를 들어, 약 50 ng 내지 약 30 mg 또는 약 5 mg 내지 약 25 mg의 본 발명의 항원 결합 단백질, 예를 들어, 항체를 함유하도록 제조될 수 있다. 유사하게, 정맥내 주입용의 본 발명의 약학적 조성물은 약 250 ml의 멸균 링거액, 및 링거액 ml 당 약 1 내지 약 30 또는 5 mg 내지 약 25 mg의 본 발명의 항원 결합 단백질을 함유하도록 제조될 수 있다. 비경구적으로 투여가능한 조성물을 제조하는 실제 방법은 널리 공지되어 있거나, 당업자에게 명백할 것이며, 예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania]에 더욱 상세히 기재되어 있다. 본 발명의 정맥내 투여가능한 항원 결합 단백질 제형의 제조를 위해, 전체 내용이 참조로서 본원에 포함되고, 독자가 특별히 참조하는 문헌[Lasmar U and Parkins D "The formulation of Biopharmaceutical products", Pharma. Sci.Tech.today, page 129-137, Vol.3 (3rd April 2000); Wang, W "Instability, stabilisation and formulation of liquid protein pharmaceuticals", Int. J. Pharm 185 (1999) 129-188; Stability of Protein Pharmaceuticals Part A and B ed Ahern T.J., Manning M.C., New York, NY: Plenum Press (1992); Akers.M.J. "Excipient-Drug interactions in Parenteral Formulations", J. Pharm Sci 91 (2002) 2283-2300; Imamura, K et al "Effects of types of sugar on stabilization of Protein in the dried state", J Pharm Sci 92 (2003) 266-274; Izutsu, Kkojima, S. "Excipient crystalinity and its protein-structure-stabilizing effect during freeze-drying", J Pharm. Pharmacol, 54 (2002) 1033-1039; Johnson, R, "Mannitol-sucrose mixtures-versatile formulations for protein lyophilization", J. Pharm. Sci, 91 (2002) 914-922; and Ha,E Wang W, Wang Y.j. "Peroxide formation in polysorbate 80 and protein stability", J. Pharm Sci, 91, 2252-2264,(2002)]을 참조하라.
한 구체예에서, 약학적 제조물인 경우 본 발명의 치료제는 단위 용량 형태로 제공된다. 적절한 치료적 유효 용량은 당업자에 의해 용이하게 결정될 것이다. 적합한 용량은 환자의 체중에 따라 환자에 대해 계산될 수 있고, 예를 들어, 적합한 용량은 약 0.1 내지 약 20mg/kg, 예를 들어, 약 1 내지 약 20mg/kg, 예를 들어, 약 10 내지 약 20mg/kg 또는, 예를 들어, 약 1 내지 약 15mg/kg, 예를 들어, 약 10 내지 약 15mg/kg의 범위일 수 있다. 인간에서 질환, 예를 들어, 천식 또는 IPF를 효과적으로 치료하기 위해, 적합한 용량은 비경구, 예를 들어, 피하, 정맥내 또는 근내 투여될 수 있는 약 0.1 내지 약 1000 mg, 예를 들어, 약 0.1 내지 약 500mg, 예를 들어, 약 500mg, 예를 들어, 약 0.1 내지 약 100mg, 또는 약 0.1 내지 약 80mg, 또는 약 0.1 내지 약 60mg, 또는 약 0.1 내지 약 40mg, 또는, 예를 들어, 약 1 내지 약 100mg, 또는 약 1 내지 약 50mg의 본 발명의 항원 결합 단백질의 범위 내일 수 있다. 이러한 용량은 필요시 의사에 의해 적절히 선택된 적절한 시간 간격으로 반복될 수 있다.
본원에 기재된 항원 결합 단백질은 저장을 위해 동결건조될 수 있고, 사용 전에 적절한 담체 중에서 재구성될 수 있다. 이러한 기술은 통상적인 면역글로불린을 이용하여 효과적인 것으로 밝혀졌고, 당 분야에 공지된 동결건조 및 재구성 기술이 이용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 염증성 관절병증, 예를 들어, 류머티스 관절염, 소아 특발성 관절염, 골관절염, 건선성 관절염 및 강직성 척추염에 걸린 인간 환자를 치료하는 방법이 제공되며, 이러한 방법은 치료적 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 단백질을 상기 환자에 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 유형 1 당뇨병, 건선, 염증성 장 질병(IBD), 예를 들어, 크론병 및 궤양성 대장염(UC), 전신 홍반 루푸스(SLE, 루푸스), 아토피 피부염, 알레르기 비염, 만성 폐쇄폐병(COPD), 폐렴, 호산구성 식도염, 전신경화증(SS) 또는 특발성 폐 섬유증(IPF), 쇼그렌 증후군, 피부경화증, 혈관병증(예를 들어, 타카야수 동맥염, 거대세포(관자) 동맥염, 결절다발 동맥염, 베게너 육아종증, 가와사키병, 격리 CNS 혈관염, 처크-스트라우스 동맥염, 현미경적 다발성 동맥염/다발성 혈관염, 과민성 혈관염(알레르기 혈관염), 헤노흐-쉔라인 자색반, 및 특발성 한랭글로불린 혈관염), 미분화 척추관절병증(USpA), 강직성 척추염(AS), 이식편대 숙주병(GVHD), 원발성 쓸개관 간경화증(PBC), 원발성 경화성 담관염(PSC), 특발성 혈소판 자색반병(ITP), 다발경화증(MS), 및 천식으로부터 선택된 질병 또는 장애에 걸린 인간 환자를 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 치료적 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 단백질을 상기 환자에 투여하는 단계를 포함한다. 상기 언급된 질병 중 하나 이상이 본 발명의 치료 방법에 대한 표적 질병일 수 있다.
한 특정 양태에서, 질병 또는 장애는 골관절염(OA), 건선, 특발성 폐 섬유증(IPF), 전신 경화증(SS), 쇼그렌 증후군, 피부경화증, 또는 다발경화증(MS)으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
본 발명의 한 양태에서, 자가면역 질병은 골관절염이다.
본 발명의 한 양태에서, 자가면역 질병은 건선이다.
본 발명의 한 양태에서, 자가면역 질병 또는 장애는 섬유성 질병 또는 장애이다.
본 발명의 한 양태에서, 자가면역 질병은 특발성 폐 섬유증(IPF)이다.
본 발명의 한 양태에서, 자가면역 질병은 전신 경화증(SS)이다.
본 발명의 한 양태에서, 자가면역 질병은 쇼그렌 증후군이다.
본 발명의 한 양태에서, 자가면역 질병은 피부경화증이다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 치료적 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 단백질을 연골 퇴행에 걸리거나(상기 연골 퇴행에 민감한) 인간 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 환자에서 연골 퇴행을 감소시키거나 방지하는 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 치료적 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 단백질을 TNF 알파 감소에 반응하는 질병 또는 장애에 걸린 환자에 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서 TNF 알파 생성을 생성을 감소시키는 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 치료적 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 단백질을 관절염 질병 또는 장애의 관절외 증상으로 고통받는 인간 환자에 투여하는 단계를 포함하는, 관절염 질병 또는 장애, 예를 들어, 펠티 증후군의 관절외 증상을 치료하고/하거나 죽상경화판의 형성을 치료하는 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 치료적 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 단백질을 내피세포 기원의 질병에 걸린 인간 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 환자를 치료하는 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 치료적 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 단백질을 섬유성 질병 또는 장애, 예를 들어, 특발성 폐 섬유증, 진행성 전신 경화증(피부경화증), 간 섬유증, 간 육아종, 주혈흡충증, 및 리슈만편모충증에 걸린 인간 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 환자를 치료하는 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 치료적 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 단백질을 중추신경계의 질병 또는 장애, 예를 들어, 다발경화증(MS), 알츠하이머병(AD) 및 기타 치매에 걸린 인간 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 환자를 치료하는 방법, 및 또한 동통, 특히 신경병증 및/또는 염증성 동통의 치료에서의 용도가 제공된다.
본원에 기재된 바와 같은 질병 및 장애의 치료를 위한 약제의 제조에서의 본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 단백질의 용도가 또한 제공된다.
예를 들어, 본 발명의 한 양태에서, hOSM과 gp130 사이의 상호작용의 조절에 반응하는 질병 및 장애의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 단백질의 용도가 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 염증성 관절병증, 예를 들어, 류머티스 관절염, 소아 특발성 관절염, 골관절염, 건선성 관절염 및 강직성 척추염의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 단백질의 용도가 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 유형 1 당뇨병, 건선, 염증성 장 질병(IBD), 예를 들어, 크론병 및 궤양성 대장염(UC), 전신 홍반 루푸스(SLE, 루푸스), 아토피 피부염, 알레르기 비염, 만성 폐쇄폐병(COPD), 폐렴, 호산구성 식도염, 전신경화증(SS) 또는 특발성 폐 섬유증(IPF), 쇼그렌 증후군, 피부경화증, 혈관병증(예를 들어, 타카야수 동맥염, 거대세포(관자) 동맥염, 결절다발 동맥염, 베게너 육아종증, 가와사키병, 격리 CNS 혈관염, 처크-스트라우스 동맥염, 현미경적 다발성 동맥염/다발성 혈관염, 과민성 혈관염(알레르기 혈관염), 헤노흐-쉔라인 자색반, 및 특발성 한랭글로불린 혈관염), 미분화 척추관절병증(USpA), 강직성 척추염(AS), 이식편대 숙주병(GVHD), 원발성 쓸개관 간경화증(PBC), 원발성 경화성 담관염(PSC), 특발성 혈소판 자색반병(ITP), 다발경화증(MS), 및 천식으로부터 선택된 질병 또는 장애의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 단백질의 용도가 제공되며, 상기 방법은 치료적 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 단백질을 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
예를 들어, 한 특정 양태에서, 골관절염(OA), 건선, 특발성 폐 섬유증(IPF) 또는 다발경화증(MS)의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 항원 결합 단백질의 용도가 제공된다.
본 발명의 다른 양태 및 장점은 상세한 설명 및 이의 구체예에서 추가로 기재된다.
한 양태에서, 본 발명은 염증성 질병 및/또는 장애, 예를 들어, 염증성 관절병증, 예를 들어, 류머티스 관절염, 소아 특발성 관절염, 골관절염, 건선성 관절염 및 강직성 척추염, 또는 유형 1 당뇨병, 건선, 염증성 장 질병(IBD), 예를 들어, 크론병 및 궤양성 대장염(UC), 전신 홍반 루푸스(SLE, 루푸스), 아토피 피부염, 알레르기 비염, 만성 폐쇄폐병(COPD), 폐렴, 호산구성 식도염, 전신경화증(SS) 또는 특발성 폐 섬유증(IPF), 쇼그렌 증후군, 피부경화증, 혈관병증(타카야수 동맥염, 거대세포(관자) 동맥염, 결절다발 동맥염, 베게너 육아종증, 가와사키병, 격리 CNS 혈관염, 처크-스트라우스 동맥염, 현미경적 다발성 동맥염/다발성 혈관염, 과민성 혈관염(알레르기 혈관염), 헤노흐-쉔라인 자색반, 및 특발성 한랭글로불린 혈관염을 포함함), 미분화 척추관절병증(USpA), 강직성 척추염(AS), 이식편대 숙주병(GVHD), 원발성 쓸개관 간경화증(PBC), 원발성 경화성 담관염(PSC), 특발성 혈소판 자색반병(ITP), 다발경화증(MS), 및 천식으로부터 선택된 염증성 질병 및/또는 장애의 치료 또는 예방을 위한, 본 발명의 항원 결합 단백질 또는 이의 기능성 단편 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 본원에 기재된 바와 같은 치료적 유효량의 본 발명에 따른 항원 결합 단백질을 투여하는 단계를 포함하는, 염증성 장애 또는 질병에 걸린 인간 환자를 치료하는 방법이 제공되며, 예를 들어, 약학적으로 허용되는 담체와 조합된 본원의 본 발명에 따른 항원 결합 단백질을 포함하는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 염증성 장애 또는 질병에 걸린 인간 환자를 치료하는 방법이 제공된다. 한 추가 구체예에서, 염증성 관절병증, 예를 들어, 류머티스 관절염, 소아 특발성 관절염, 골관절염, 건선성 관절염 및 강직성 척추염으로부터 선택된 염증성 장애 또는 질병, 또는 유형 1 당뇨병, 건선, 염증성 장 질병(IBD), 예를 들어, 크론병 및 궤양성 대장염(UC), 전신 홍반 루푸스(SLE, 루푸스), 아토피 피부염, 알레르기 비염, 만성 폐쇄폐병(COPD), 폐렴, 호산구성 식도염, 전신경화증(SS) 또는 특발성 폐 섬유증(IPF), 쇼그렌 증후군, 피부경화증, 혈관병증(타카야수 동맥염, 거대세포(관자) 동맥염, 결절다발 동맥염, 베게너 육아종증, 가와사키병, 격리 CNS 혈관염, 처크-스트라우스 동맥염, 현미경적 다발성 동맥염/다발성 혈관염, 과민성 혈관염(알레르기 혈관염), 헤노흐-쉔라인 자색반, 및 특발성 한랭글로불린 혈관염을 포함함), 미분화 척추관절병증(USpA), 강직성 척추염(AS), 이식편대 숙주병(GVHD), 원발성 쓸개관 간경화증(PBC), 원발성 경화성 담관염(PSC), 특발성 혈소판 자색반병(ITP), 다발경화증(MS), 및 천식으로부터 선택된 염증성 장애 또는 질병에 걸린 인간 환자를 치료하는 방법이 제공된다.
본 발명의 한 대안적 양태에서,
a) 인간 수용체 프레임워크에 하나 이상의 비-인간 CDR을 통합시켜 키메라 또는 인간화 항체를 생성시키는 단계;
b) 키메라 또는 인간화 항체를 이의 항원에 결합시키는 단계;
c) 항원에 대한 결합에 직접적으로 관련된 항체의 잔기를 결정하는 단계;
d) 단계 (c)에서 관련되지 않은 잔기 중 하나 이상을 인간 점라인 서열로 돌연변이시키는 단계;
e) 상기 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 비-인간 항체 또는 이의 항체 단편을 인간화시키는 방법이 제공된다.
한 추가 양태에서, 항원에 대한 결합과 관련된 항체의 잔기는 결정학, 상동성 모델링, 단백질 도킹(docking), 돌연변이유발 또는 선형 펩티드 맵핑에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 한 상기 양태에서, 항체-항원 공동 결정의 결정학적 구조가 수득되고, 결합과 관련된 잔기는 약 2-5Å 사이에 존재하는 것으로 결정된다.
용어 비-인간은 인간 점라인 서열에 더욱 가깝도록 하는 일부 방식으로 돌연변이되거나 치환될 수 있는 임의의 항체를 포함한다. 이러한 방식에서, 면역원성의 가능성이 감소된다.
한 양태에서, 적어도 하나의 CDR이 점라인으로 복귀된다. 한 추가 양태에서, 적어도 2개의 CDR이 점라인으로 복귀된다. 또 다른 한 추가 양태에서, 적어도 5개의 잔기가 점라인으로 복귀되고, 예를 들어, 적어도 7개 또는 적어도 8개 또는 적어도 9개 또는 적어도 10개의 잔기가 점라인으로 복귀된다.
인간 수용체로의 비-인간 모노클로날 항체 또는 이의 단편의 전달은 종종 추가로 적절한 CDR 영역-항원 상호작용을 재확립시키기 위해 프레임워크 내의 변화의 도입에 의지하며, 이들은 종종 역 돌연변이로 언급된다. 본 발명의 한 구체예에서, 적절한 CDR-영역-항원 상호작용을 재확립시키기 위해 역 돌연변이가 요구된다.
한 대안적 구체예에서, 인간 수용체 프레임워크가 하나 이상의 비-인간 CDR과 함께 항체에 통합되어 키메라 항체가 생성될 수 있다. 또 다른 대안적 구체예에서, 서열은 올리고-합성에 의해 생성될 수 있다. 비-인간 항체의 CDR(또는 과가변 영역 잔기)이 VL 및/또는 VH 인간 수용체 프레임워크에 통합된다. 예를 들어, 케이뱃 CDR 잔기, 초티아(Chothia) 과가변 루프 잔기, Abm 잔기, 및/또는 접촉 잔기에 해당하는 잔기가 통합될 수 있다.
한 구체예에서,
a) 표적 항원에 결합하는 비-인간 항체를 수득하는 단계;
b) 항체-항원 공동 결정의 결정학 구조를 수득하는 단계;
c) 결정 구조로부터 약 2-5Å까지 항원에 대한 결합과 직접 관련된 비-인간 항체의 잔기를 결정하는 단계;
e) 단계 (c)에서 관련되지 않은 잔기 중 하나 이상을 인간 서열로부터 유래된 잔기로 돌연변이시키는 단계;
f) 상기 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 항체를 인간화시키는 방법이 제공된다.
본원에 기재된 방법의 한 추가 구체예에서, 항체 또는 항체 결합 단편은 이의 항원에 대한 결합을 보유한다. 예를 들어, 항체 또는 항체 결합 단편은 비-인간 항체와 비교시 이의 항원에 대한 결합을 보유한다. 예를 들어, 단계 f)의 항체는 단계 a)의 비-인간 항체의 10배 내 또는 10배 초과의 결합 친화성(KD)을 가지며, 예를 들어, 단계 f)의 항체는 단계 a)의 비-인간 항체의 3-5배 내 또는 3-5배 초과의 결합 친화성(KD)을 갖는다.
예를 들어, 항체 또는 항체 결합 단편은 Biacore에 의해 측정시 비-인간 항체의 1000nM 내, 또는 Biacore에 의해 측정시 비-인간 항체의 500nM 내, 또는 Biacore에 의해 측정시 비-인간 항체의 100nM 내의 이의 항원에 대한 결합을 보유한다. 예를 들어, 항체 또는 항체 결합 단편은 Biacore에 의해 측정시 비-인간 항체의 500pM 내, 또는 Biacore에 의해 측정시 비-인간 항체의 300pM 내, 또는 Biacore에 의해 측정시 비-인간 항체의 100pM 내의 이의 항원에 대한 결합을 보유한다. 예를 들어, 단계 f)의 항체는 400pM과 동등하거나 그 미만, 또는 300pM과 동등하거나 그 미만, 또는 200pM과 동등하거나 그 미만, 또는 140pM과 동등하거나 그 미만인 친화성(KD)으로 이의 항원에 결합한다.
본원에 기재된 방법의 또 다른 구체예에서, 항체 또는 항체 결합 단편은 비-인간 항체 또는 항체 단편과 동등한 정준 구조를 보유한다.
또 다른 구체예에서, 비-인간 항체 또는 이의 항체 단편은 비-인간 동물, 예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 카멜리드(camelid) 또는 상어로부터 유래된다. 한 추가 구체예에서, 비-인간 항체 또는 이의 항체 단편은 마우스로부터 유래된다.
또 다른 구체예에서, 비-인간 항체 또는 이의 항체 단편은 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체 또는 다중특이적 항체이거나, 이는 면역글로불린 단일 가변 도메인, 예를 들어, 카멜리드 또는 상어 면역글로불린 단일 가변 도메인일 수 있거나, 이는 비-인간 비 항체 단백질 스캐폴드의 유도체인 도메인일 수 있다.
또 다른 한 추가 구체예에서, 비-인간 항체는 모노클로날 항체이다.
본원에 기재된 방법의 한 구체예에서, 적어도 2개의 비-인간 CDR이 인간 수용체 서열에 통합되거나, 적어도 3개의 CDR 또는 적어도 4개의 CDR 또는 적어도 5개의 CDR 또는 6개 모두의 CDR이 인간 수용체 서열에 통합된다.
본원에 기재된 방법의 한 추가 구체예에서, 항원 결합에서 직접 관련되지 않고 이미 인간 서열이 아닌, 인간 서열로부터 유래된 잔기로 돌연변이되는 잔기는 CDR 또는 프레임워크 영역 내, 또는 둘 모두 내의 잔기일 수 있다. 한 추가 구체예에서, 적어도 1개의 CDR이 인간 점라인 서열로 돌연변이되거나, 적어도 2개의 CDR이 돌연변이되거나, 적어도 3개의 CDR이 돌연변이되거나, 적어도 4개의 CDR이 돌연변이된다.
또 다른 구체예에서, 적어도 5개의 잔기가 인간 점라인 서열로 돌연변이되거나, 적어도 7개의 잔기, 또는 적어도 10개의 잔기 또는 적어도 15개의 잔기 또는 적어도 20개의 잔기 또는 적어도 40개의 잔기 또는 적어도 60개의 잔기가 인간 점라인 서열로 돌연변이된다.
본원에 기재된 방법의 또 다른 구체예에서, 항원에 대한 결합과 직접적으로 관련된 항체의 잔기는 약 2-5Å 사이, 또는 약 3-5Å 사이 또는 약 3-4Å 사이 또는 약 3.5Å에서 결정된다.
본원에 기재된 방법의 또 다른 한 추가 구체예에서, 상기 방법에 의해 수득가능한 항체가 제공된다.
정의
본원에서 사용되는 용어 "항원 결합 단백질"은 인간 OSM에 결합하고 이를 중화시킬 수 있는 항체, 항체 단편 및 다른 단백질 작제물을 나타낸다.
용어 Fv, Fc, Fd, Fab, 또는 F(ab)2는 이들의 표준 의미로 사용된다(예를 들어, Harlow et al., Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988) 참조).
용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 본원에서 사용되며, 이는 특별히 모노클로날 항체(전장 모노클로날 항체를 포함함), 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체(예를 들어, 이중특이적 항체)를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동종 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 나타내고, 즉, 개별적 항체를 포함하는 집단은 작은 양으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 단일 항원 결합 부위에 대해 고도로 특이적이다. 또한, 다양한 결정기(에피토프)에 대해 특이적인 다양한 항체를 통상적으로 포함하는 폴리클로날 항체 제조물과는 대조적으로, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일한 결정기에 대해 특이적이다.
"키메라 항체"는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 공여 항체 부류 또는 하위부류로부터 유래된 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 반면, 사슬(들)의 나머지가 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 조작된 항체의 유형, 뿐만 아니라 요망되는 생물학적 활성을 나타내는 한 상기 항체의 단편을 나타낸다(US Patent No . 4,816,567 and Morrison et al . Proc . Natl . Acad . Sci . USA 81:6851-6855) (1984)).
"인간화 항체"는 비-인간 공여 면역글로불린으로부터 유래된 CDR을 갖고, 분자의 나머지 면역글로불린-유래 부분이 하나(또는 그 초과)의 인간 면역글로불린(들)로부터 유래되는 조작된 항체의 유형을 나타낸다. 또한, 프레임워크 지지 잔기는 결합 친화성을 보존하기 위해 변경될 수 있다(예를 들어, Queen et al., Proc. Natl Acad Sci USA, 86:10029-10032 (1989), Hodgson et al., Bio/Technology, 9:421 (1991) 참조). 적합한 인간 수용체 항체는 공여 항체의 누클레오티드 및 아미노산 서열에 대한 상동성에 의해 통상적인 데이터베이스, 예를 들어, KABAT® 데이터베이스, Los Alamos 데이터베이스, 및 Swiss Protein 데이터베이스로부터 선택된 것일 수 있다. 공여 항체의 프레임워크 영역에 대한 상동성(아미노산 기준)을 특징으로 하는 인간 항체가 공여 CDR의 삽입을 위한 중쇄 불변 영역 및/또는 중쇄 가변 프레임워크 영역을 제공하기에 적합할 수 있다. 경쇄 불변 또는 가변 프레임워크 영역을 제공할 수 있는 적합한 수용체 항체는 유사한 방식으로 선택될 수 있다. 수용체 항체 중쇄 및 경쇄가 동일 수용체 항체로부터 유래되는 것이 요구되지는 않는 것이 인지되어야 한다. 종래 분야는 상기 인간화 항체를 생성시키는 여러 방식을 기재하고 있으며, 예를 들어, EP-A-0239400호 및 EP-A-054951호를 참조하라.
폴리누클레오티드 및 폴리펩티드에 대한 "동일성"은 경우에 따라 하기 (1) 및 (2)에 제공된 알고리즘을 이용하여 계산된 비교를 의미한다:
(1) 폴리누클레오티드에 대한 동일성은 제공된 서열 내의 누클레오티드의 전체 수에 100으로 나누어진 동일성 퍼센트를 규정하는 정수를 곱한 후, 상기 서열 내의 누클레오티드의 상기 전체 수로부터 그 곱을 공제하거나, 하기 식에 의해 계산되고:
nn ≤ xn - (xn·y),
상기 식에서, nn은 누클레오티드 변경의 수이고, xn은 제공된 서열 내의 누클레오티드의 전체 수이고, y는 95%에 대해 0.95, 97%에 대해 0.97, 또는 100%에 대해 1.00이고, ·는 곱셈 연산자에 대한 기호이고, xn 및 y의 임의의 비-정수 곱은 xn으로부터 이를 공제시키기 전에 가장 가까운 정수로 반내림된다. 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리누클레오티드 서열의 변경은 상기 코딩 서열에서 논센스, 미스센스 또는 프레임시프트 돌연변이를 발생시킬 수 있고, 이에 의해 상기 변경 후에 폴리누클레오티드에 의해 엔코딩되는 폴리펩티드를 변경시킬 수 있다.
(2) 폴리펩티드에 대한 동일성은 아미노산의 전체 수에 100으로 나누어진 동일성 퍼센트를 규정하는 정수를 곱한 후, 아미노산의 상기 전체 수로부터의 결과를 공제하거나, 하기 식에 의해 계산되고:
na ≤ xa - (xa·y),
상기 식에서, na는 아미노산 변경의 수이고, xa는 서열 내의 아미노산의 전체 수이고, y는 95%에 대해 0.95, 97%에 대해 0.97, 또는 100%에 대해 1.00이고, ·는 곱셈 연산자에 대한 기호이고, xa 및 y의 임의의 비-정수 곱은 xa로부터 이를 공제시키기 전에 가장 가까운 정수로 반내림된다.
"분리된"은 이의 자연 상태로부터 "사람에 의해" 변경된 것을 의미하고, 이의 본래의 환경으로부터 변경되거나 분리되거나, 변경 및 분리된 것을 의미한다. 예를 들어, 살아있는 유기체에 자연적으로 존재하는 폴리누클레오티드 또는 폴리펩티드는 "분리된" 것이 아니고, 이의 자연 상태의 공존하는 물질로부터 분리된 동일 폴리누클레오티드 또는 폴리펩티드가 "분리된" 것이며, 이는 세포가 폴리누클레오티드 또는 폴리펩티드가 분리된 것과 동일한 종 또는 유형의 세포일지라도, 상기 폴리누클레오티드 또는 폴리펩티드가 상기 세포로 다시 도입되는 경우를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 명세서 및 수반되는 청구항 전체에 걸쳐, 용어 "포함하는" 및 "포함하다"는 "구성되는" 및 "구성되다"를 포함한다. 즉, 상기 용어는 문맥이 허용하는 경우 특별히 언급되지 않은 다른 구성요소 또는 정수의 포함이 가능한 것을 뜻하는 것이다.
본 발명의 항원 결합 단백질과 관련하여 본 명세서 전체에 걸쳐 사용되는 용어 "특별히 결합하는"은 항원 결합 단백질이 인간 OSM(hOSM)에 결합하고, 다른 인간 단백질에 결합하지 않거나 유의하지 않게 결합하는 것을 의미한다. 그러나, 상기 용어는 본 발명의 항원 결합 단백질이 또한 OSM의 다른 형태, 예를 들어, 영장류 OSM과 교차 반응할 수 있다는 사실을 배제하지 않는다.
본 발명의 항원 결합 단백질과 관련하여 본 명세서 전체에 걸쳐 사용되는 용어 "직접적으로 상호작용하는"은 항원 결합 단백질이 인간 OSM(hOSM)에 결합하는 경우 항원 결합 단백질 상의 특정 잔기가 hOSM 상의 특정 잔기의 3.5Å 내에 존재하는 것을 의미한다.
본 발명의 항원 결합 단백질과 관련하여 본 명세서 전체에 걸쳐 사용되는 용어 "억제하다"는 OSM의 생물학적 활성이 본 발명의 항원 결합 단백질의 부재하에서의 OSM의 활성에 비해 본 발명의 항원 결합 단백질의 존재하에서 감소되는 것을 의미한다. 억제는 리간드 결합을 차단하거나, 리간드가 수용체를 활성화시키는 것을 방지하거나, OSM을 하향 조절하거나, 효과기 작용기에 영향을 미치는 것 중 하나 이상으로 인한 것일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 항체는 OSM을 중화시킬 수 있다. 중화의 수준은 여러 방식, 예를 들어, KB 세포 중화 검정에서 하기 실시예 2.2.1에 기재된 바와 같은 검정의 이용에 의해 측정될 수 있다. OSM은 Gp130/OSMR 복합체를 통한 신호전달을 통해 KB 세포로부터의 인터루킨 6 방출을 유도할 수 있다. 이러한 검정에서 OSM의 중화는 IL6 생성을 억제하는 항-OSM 모노클로날 항체의 능력을 평가함으로써 측정된다.
항체 또는 이의 항원 결합 단편이 중화시킬 수 있는 경우, 이는 인간 OSM과 이의 gp130 수용체 사이의 상호작용의 억제를 나타낸다. 인간 OSM에 대한 중화 활성을 갖는 것으로 간주되는 항체는 실시예 2.2.1에 기재된 바와 같은 KB 세포 중화 검정에서 10 마이크래그램/ml 미만, 또는 5 마이크로그램/ml 미만, 또는 2 마이크로그램/ml 미만, 또는 1 마이크로그램/ml 미만 또는 0.1 마이크로그램/ml 미만의 IC50을 갖는다.
"CDR"은 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 과가변 도메인인 항체의 상보성 결정 영역 아미노산 서열로 정의된다. 면역글로불린의 가변 부분 내에 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR(또는 CDR 영역)이 존재한다. 따라서, 본원에서 사용되는 "CDR"은 3개 모두의 중쇄 CDR, 또는 3개 모두의 경쇄 CDR(또는 적절한 경우 모든 중쇄 및 모든 경쇄 CDR 둘 모두)을 나타낼 수 있다.
CDR은 항원 또는 에피토프에 대한 항체의 결합을 위한 접촉 잔기 대부분을 제공한다. 본 발명의 관심 CDR은 공여 항체 가변 중쇄 및 경쇄 서열로부터 유래되고, 이는 자연 발생 CDR의 유사체를 포함하고, 이러한 유사체는 또한 이들이 유래된 공여 항체와 동일한 항원 결합 특이성 및/또는 중화 능력을 공유하거나 보유한다.
항체의 CDR 서열은 케이뱃 넘버링 시스템(Kabat et al; (Sequences of proteins of Immunological Interest NIH, 1987)에 의해 결정될 수 있고, 대안적으로, 이들은 초티아 넘버링 시스템(Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948), 접촉 정의 방법(MacCallum R.M., and Martin A.C.R. and Thornton J.M, (1996), Journal of Molecular Biology, 262 (5), 732-745) 또는 당업자에게 공지된 항체 내의 잔기를 넘버링하고 CDR을 결정하는 임의의 다른 확립된 방법에 의해 결정될 수 있다. 당업자가 이용가능한 CDR 서열에 대한 다른 넘버링 규칙은 "AbM"(University of Bath) 및 "접촉"(University College London) 방법을 포함한다. "최소 결합 단위"를 제공하기 위해 케이뱃, 초티아, AbM 및 접촉 방법 중 적어도 2개를 이용하여 최소 중첩 영역이 결정될 수 있다. 최소 결합 단위는 CDR의 하위-부분일 수 있다.
하기 표 1은 각각의 CDR 또는 결합 단위에 대한 각각의 넘버링 규칙을 이용한 한 정의를 나타낸다. 가변 도메인 아미노산 서열을 넘버링하기 위해 표 1에서 케이뱃 넘버링 계획이 이용된다. CDR 정의 중 일부가 이용되는 개별적 간행물에 따라 다양할 수 있음이 인지되어야 한다.
Figure pct00001
본 명세서 전체에 걸쳐, 항체 서열 내의 아미노산 잔기는 케이뱃 계획에 따라 넘버링된다. 유사하게, 용어 "CDR", "CDRL1", "CDRL2", "CDRL3", "CDRH1", "CDRH2", "CDRH3"는 문헌[Kabat et al; Sequences of proteins of Immunological Interest NIH, 1987]에 기재된 바와 같은 케이뱃 넘버링 시스템을 따른다.
용어 "VH" 및 "VL"은 항체의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 각각 나타내는 것으로 본원에서 사용된다.
본원에서 사용되는 용어 "도메인"은 단백질의 나머지와 독립적으로 3차 구조를 갖는 폴딩된 단백질 구조를 나타낸다. 일반적으로, 도메인은 단백질의 별개의 기능적 특성을 담당하며, 많은 경우에 단백질 및/또는 도메인의 나머지의 기능의 손실 없이 다른 단백질에 첨가되거나, 제거되거나, 전달될 수 있다. "항체 단일 가변 도메인"은 항체 가변 도메인의 특징적인 서열을 포함하는 폴딩된 폴리펩티드 도메인이다. 따라서, 이는 완전한 항체 가변 도메인, 및, 예를 들어, 하나 이상의 루프가 항체 가변 도메인의 특징이 아닌 서열로 대체된 변형된 가변 도메인, 또는 트렁케이션되거나 N-말단 또는 C-말단 연장을 포함하는 항체 가변 도메인, 뿐만 아니라 전장 도메인의 적어도 결합 활성 및 특이성을 보유한 가변 도메인의 폴딩된 단편을 포함한다.
구 "면역글로불린 단일 가변 도메인"은 다양한 V 영역 또는 도메인과 독립적으로 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 가변 도메인(VH, VHH, VL)을 나타낸다. 면역글로불린 단일 가변 도메인은 다른 다양한 가변 영역 또는 가변 도메인을 갖는 포맷(예를 들어, 동종다합체 또는 이종다합체)로 제공될 수 있고, 상기 다른 영역 또는 도메인은 단일 면역글로불린 가변 도메인에 의한 항원 결합에 필요하지 않다(즉, 면역글로불린 단일 가변 도메인은 추가 가변 도메인과 독립적으로 항원에 결합한다). "도메인 항체" 또는 "dAb"는 본원에서 사용되는 용어인 항원에 결합할 수 있는 "면역글로불린 단일 가변 도메인"과 동일하다. 면역글로불린 단일 가변 도메인은 인간 항체 가변 도메인일 수 있으나, 이는 또한 설치류(예를 들어, WO 00/29004호에 개시되어 있음), 너스 샤크(nurse shark) 및 카멜리드 VHH dAb와 같은 다른 종으로부터의 단일 항체 가변 도메인을 포함한다. 카멜리드 VHH는 경쇄가 자연적으로 결여된 중쇄 항체를 생성하는, 낙타, 라마, 알파카, 단봉낙타, 및 과나코를 포함하는 종으로부터 유래되는 면역글로불린 단일 가변 도메인 폴리펩티드이다. 이러한 VHH 도메인은 당 분야에서 이용가능한 표준 기술에 따라 인간화될 수 있고, 이러한 도메인은 본 발명에 따른 "도메인 항체"인 것으로 여전히 간주된다. 본원에서 사용되는 "VH"는 카멜리드 VHH 도메인을 포함한다. NARV는 너스 샤크를 포함하는 연골성 어류에서 확인된 면역글로불린 단일 가변 도메인의 또 다른 유형이다. 이들 도메인은 또한 신규한 항원 수용체 가변 영역(통상적으로, V(NAR) 또는 NARV로 약어화됨)으로 공지되어 있다. 추가 세부사항에 대해서는, 문헌[Mol. Immunol. 44, 656-665 (2006)] 및 US20050043519A호를 참조하라.
용어 "에피토프-결합 도메인"은 상이한 V 영역 또는 도메인과 독립적으로 항원 또는 에피토프에 특별히 결합하는 도메인을 나타내고, 이는 도메인 항체(dAb), 예를 들어, 인간, 카멜리드 또는 상어 면역글로불린 단일 가변 도메인일 수 있거나, 이는 자연 리간드가 아닌 리간드에 대한 결합을 획득하기 위해 단백질 조작에 적용된 CTLA-4(에비바디(Evibody)); 리포칼린(lipocalin); 단백질 A 유래 분자, 예를 들어, 단백질 A의 Z-도메인(어피바디, SpA), A-도메인(아비머(Avimer)/맥시바디(Maxibody)); 열 충격 단백질, 예를 들어, GroEI 및 GroES; 트랜스페린(transferrin)(트랜스-바디(trans-body)); 앙키린(ankyrin) 반복 단백질(DARPin); 펩티드 앱타머; C-유형 렉틴 도메인(테트라넥틴(Tetranectin)); 인간 γ-크리스탈린(γ-crystallin) 및 인간 유비퀴틴(affilins); PDZ 도메인; 인간 프로테아제 억제제의 전갈 톡신쿠니츠(toxinkunitz) 유형 도메인; 및 피브로넥틴(애드넥틴(adnectin))으로 구성되는 군으로부터 선택된 스캐폴드의 유도체인 도메인일 수 있다.
CTLA-4(세포독성 T 림프구-결합 항원 4)는 주로 CD4+ T-세포에서 발현되는 CD28-패밀리 수용체이다. 이의 세포외 도메인은 가변 도메인-유사 Ig 폴드를 갖는다. 항체의 CDR에 상응하는 루프는 다양한 결합 특성을 부여하기 위해 이종성 서열로 치환될 수 있다. 다양한 결합 특이성을 갖도록 조작된 CTLA-4 분자는 또한 에비바디로 공지되어 있다. 추가 세부사항을 위해, 문헌[Journal of Immunological Methods 248 (1-2), 31-45 (2001)]을 참조하라.
리포칼린은 작은 소수성 분자, 예를 들어, 스테로이드, 빌린(bilin), 레티노이드 및 지질을 운반하는 세포외 단백질의 패밀리이다. 이들은 다양한 표적 항원에 결합하도록 조작될 수 있는 원뿔 구조의 개방 말단에 다수의 루프를 갖는 단단한 β-시트 이차 구조를 갖는다. 안티칼린(anticalin)은 160 내지 180개의 아미노산 크기이고, 리포칼린으로부터 유래된다. 추가 세부사항에 대해서는, 문헌[Biochim Biophys Acta 1482: 337-350 (2000)], US7250297B1호 및 US20070224633호를 참조하라.
어피바디는 항원에 결합하도록 조작될 수 있는 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 단백질 A로부터 유래된 스캐폴드이다. 도메인은 약 58개의 아미노산의 3-나선 다발로 구성된다. 표면 잔기의 무작위화에 의해 라이브러리가 생성되었다. 추가 세부사항에 대해서는, 문헌[Protein Eng. Des. Sel. 17, 455-462 (2004)] 및 EP1641818A1호를 참조하라.
아비머는 A-도메인 스캐폴드 패밀리로부터 유래된 다중도메인 단백질이다. 약 35개의 아미노산의 자연 도메인은 규정된 이황화결합된 구조를 채택한다. A-도메인의 패밀리에 의해 나타난 자연 변이의 셔플링(shuffling)에 의해 다양성이 생성된다. 추가 세부사항에 대해서는, 문헌[Nature Biotechnology 23(12), 1556-1561 (2005) and Expert Opinion on Investigational Drugs 16(6), 909-917 (June 2007)]을 참조하라.
트랜스페린은 단량체 혈청 운반 당단백질이다. 트랜스페린은 증식허용 표면 루프 내의 펩티드 서열의 삽입에 의해 다양한 표적 항원에 결합하도록 조작될 수 있다. 조작된 트랜스페린 스캐폴드의 예는 트랜스-바디를 포함한다. 추가 세부사항에 대해서는, 문헌[J. Biol. Chem 274, 24066-24073 (1999)]을 참조하라.
지정된 앙키린 반복 단백질(Designed Ankyrin Repeat Proteins, DARPins)은 세포골격에 대한 온전한 막 단백질의 부착을 매개하는 단백질의 패밀리인 앙키린으로부터 유래된다. 단일 앙키린 반복은 2개의 α-나선 및 β-턴으로 구성되는 33개의 잔기의 모티프이다. 이들은 각 반복의 첫번째 α-나선 및 β-턴 내의 잔기를 무작위화시킴으로써 다양한 표적 항원에 결합하도록 조작될 수 있다. 이들의 결합 접촉면은 모듈의 수를 증가(친화성 성숙의 방법)시킴으로써 증가될 수 있다. 추가 세부사항에 대해서는, 문헌[J. Mol. Biol. 332, 489-503 (2003), PNAS 100(4), 1700-1705 (2003) and J. Mol. Biol. 369, 1015-1028 (2007)] 및 US20040132028A1호를 참조하라.
피브로넥틴은 항원에 결합하도록 조작될 수 있는 스캐폴드이다. 애드넥틴은 인간 피브로넥틴 유형 III(FN3)의 15개의 반복 단위의 10번째 도메인의 자연 아미노산 서열의 백본으로 구성된다. β-샌드위치의 한 말단의 3개의 루프는 애드넥틴이 관심 치료 표적을 특이적으로 인지하는 것을 가능케 하도록 조작될 수 있다. 추가 세부사항에 대해서는, 문헌[Protein Eng. Des. Sel. 18, 435-444 (2005)], US20080139791호, WO2005056764호 및 US6818418B1호를 참조하라.
펩티드 앱타머는 활성 부위에 삽입된 속박 가변 펩티드 루프를 함유하는 불변 스캐폴드 단백질, 통상적으로 티오레독신(thioredoxin)(TrxA)으로 구성되는 조합 인지 분자이다. 추가 세부사항에 대해서는, 문헌[Expert Opin. Biol. Ther. 5, 783-797 (2005)]을 참조하라.
미세소체는 3-4개의 시스테인 브릿지를 함유하는 25-50개의 아미노산 길이의 자연 발생 미세단백질(microprotein)로부터 유래되며 - 미세단백질의 예는 KalataB1 및 코노톡신(conotoxin) 및 크노틴(knottin)을 포함한다. 미세단백질은 미세단백질의 전체 폴드에 영향을 미치지 않고 25개 이하의 아미노산을 포함하도록 조작될 수 있는 루프를 갖는다. 조작된 크노틴 도메인의 추가 세부사항에 대해서는, WO2008098796호를 참조하라.
다른 에피토프 결합 도메인은 다양한 표적 항원 결합 특성을 조작하기 위해 스캐폴드로 사용되는 단백질을 포함하고, 이는 인간 γ-크리스탈린 및 인간 유비퀴틴(아필린(affilins)), 인간 프로테아제 억제제의 쿠니츠 유형 도메인, Ras-결합 단백질 AF-6의 PDZ-도메인, 전갈 독소(카리브도톡신(charybdotoxin)), C-유형 렉틴 도메인(테트라넥틴)을 포함하며, 이들은 문헌[Non-Antibody Scaffolds from Handbook of Therapeutic Antibodies (2007, edited by Stefan Dubel) and Protein Science 15:14-27 (2006)]의 챕터 7에 개관되어 있다. 본 발명의 에피토프 결합 도메인은 상기 대안적 단백질 도메인 중 임의의 대안적 단백질 도메인으로부터 유래될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "항원-결합 부위"는 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 상의 부위를 나타내며, 이는 단일 도메인, 예를 들어, 에피토프-결합 도메인일 수 있거나, 이는 표준 항체에서 발견될 수 있는 바와 같은 쌍을 이룬 VH/VL 도메인일 수 있다. 본 발명의 일부 구체예에서, 단쇄 Fv(ScFv) 도메인은 항원-결합 부위를 제공할 수 있다.
용어 "mAbdAb" 및 dAbmAb"는 본 발명의 항원-결합 단백질을 나타내기 위해 본원에서 사용된다. 상기 2개의 용어는 상호교환적으로 사용될 수 있고, 본원에서 사용되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본원에서 사용되는 용어 "항원 결합 단백질"은 항체, 항체 단편, 예를 들어, 도메인 항체(dAb), ScFv, FAb, FAb2, 및 다른 단백질 작제물을 나타낸다. 항원 결합 분자는 적어도 하나의 Ig 가변 도메인, 예를 들어, 항체, 도메인 항체(dAb), Fab, Fab', F(ab')2, Fv, ScFv, 디아바디, mAbdAb, 어피바디, 헤테로컨쥬게이트 항체 또는 이중특이적 항체를 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 항원 결합 분자는 항체이다. 또 다른 구체예에서, 항원 결합 분자는 상이한 V 영역 또는 도메인과 독립적으로 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 dAb, 즉, 면역글로불린 단일 가변 도메인, 예를 들어, VH, VHH 또는 VL이다. 항원 결합 분자는 2개의 표적에 결합할 수 있고, 즉, 이들은 이중 표적화 단백질일 수 있다. 항원 결합 분자는 항체 및 항원 결합 단편의 조합물, 예를 들어, 모노클로날 항체에 연결된 하나 이상의 도메인 항체 및/또는 하나 이상의 ScFv일 수 있다. 항원 결합 분자는 또한 비-Ig 도메인, 예를 들어, OSM에 대한 결합을 획득하기 위해 단백질 조작에 적용된 CTLA-4(에비바디); 리포칼린; 단백질 A 유래 분자, 예를 들어, 단백질 A의 Z-도메인(어피바디, SpA), A-도메인(아비머/맥시바디); 열 충격 단백질, 예를 들어, GroEI 및 GroES; 트랜스페린(트랜스-바디); 앙키린 반복 단백질(DARPin); 펩티드 앱타머; C-유형 렉틴 도메인(테트라넥틴); 인간 γ-크리스탈린 및 인간 유비퀴틴; PDZ 도메인; 인간 프로테아제 억제제의 전갈 톡신쿠니츠 유형 도메인; 및 피브로넥틴(애드넥틴)으로 구성되는 군으로부터 선택된 스캐폴드의 유도체인 도메인을 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 "항원 결합 단백질"은 인간 OSM을 길항시키고/시키거나 중화시킬 수 있을 것이다. 또한, 항원 결합 단백질은 OSM에 결합하고, 자연 리간드가 gp130 수용체에 결합하고/하거나 이를 활성화시키는 것을 방지함으로써 OSM 활성을 억제하고/하거나 차단할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "효과기 기능"은 항체 의존성 세포 매개 세포독성 활성(ADCC), 보체-의존성 세포독성 활성(CDC) 매개 반응, Fc-매개 포식작용 및 FcRn 수용체를 통한 항체 재이용 중 하나 이상을 나타내는 것을 의미한다. IgG 항체에 대해, ADCC 및 ADCP를 포함하는 효과기 기능은 중쇄 불변 영역과 면역 세포의 표면 상에 존재하는 Fcγ 수용체의 패밀리의 상호작용에 의해 매개된다. 인간에서, 이들은 FcγRI(CD64), FcγRII(CD32) 및 FcγRIII(CD16)를 포함한다. 항원에 결합된 항원 결합 단백질과 Fc/Fcγ 복합체의 형성 사이의 상호작용은 세포독성, 면역 세포 활성화, 포식작용 및 염증성 사이토카인의 방출을 포함하는 광범위한 효과를 유도한다.
항원 결합 단백질의 불변 영역과 다양한 Fc 수용체(FcR) 사이의 상호작용은 항원 결합 단백질의 효과기 기능을 매개하는 것으로 생각된다. 유의한 생물학적 효과는 효과기 기능의 결과, 특히, 항체-의존성 세포 세포독성(ADCC), 보체의 고정(보체 의존성 세포독성 또는 CDC), 및 항원 결합 단백질의 반감기/청소일 수 있다. 보통, 효과기 기능을 매개하는 능력은 항원에 대한 항원 결합 단백질의 결합을 필요로 하며, 모든 항원 결합 단백질이 모든 효과기 기능을 매개하지는 않을 것이다.
효과기 기능은 ADCC 효과기 기능을 측정하기 위해, 예를 들어, 자연살세포에 대해 FcγRIII의 결합을 통하거나 단핵구/대식세포에 대해 FcyRI을 통하는 것을 포함하는 다수의 방식으로 측정될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항원 결합 단백질은 자연살세포 검정에서 ADCC 효과기 기능에 대해 평가될 수 있다. 상기 검정의 예는 문헌[Shields et al, 2001 The Journal of Biological Chemistry, Vol. 276, p6591-6604; Chappel et al, 1993 The Journal of Biological Chemistry, Vol 268, p25124-25131; Lazar et al, 2006 PNAS, 103; 4005-4010]에서 발견될 수 있다. CDC 기능을 결정하는 검정의 예는 문헌[1995 J Imm Meth 184:29-38]에 기재된 것을 포함한다.
인간 불변 영역의 일부 아이소형(isotype), 특히 IgG4 및 IgG2 아이소형은 본질적으로 a) 고전 경로에 의한 보체의 활성화, 및 b) 항체-의존성 세포 세포독성의 기능이 결핍되어 있다. 항원 결합 단백질의 중쇄 불변 영역에 대한 다양한 변형은 요망되는 효과기 특성에 따라 수행될 수 있다. Fc 수용체에 대한 결합을 감소시키고, 이에 따라 ADCC 및 CDC를 감소시키는 특정 돌연변이를 함유하는 IgG1 불변 영역이 따로 기재되었다(Duncan et al. Nature 1988, 332; 563-564; Lund et al. J. Immunol. 1991, 147; 2657-2662; Chappel et al. PNAS 1991, 88; 9036-9040; Burton and Woof, Adv. Immunol. 1992, 51;1-84; Morgan et al., Immunology 1995, 86; 319-324; Hezareh et al., J. Virol. 2001, 75 (24); 12161-12168).
본 발명의 한 구체예에서, 불변 영역을 포함하는 항원 결합 단백질이 제공되며, 상기 항원 결합 단백질은 감소된 ADCC 및/또는 보체 활성화 또는 효과기 기능을 갖는다. 한 상기 구체예에서, 중쇄 불변 영역은 IgG2 또는 IgG4 아이소형의 자연적으로 불능화된 불변 영역 또는 돌연변이된 IgG1 불변 영역을 포함할 수 있다. 적합한 변형의 예는 EP0307434호에 기재되어 있다. 한 예는 위치 235 및 237에서 알라닌 잔기의 치환을 포함할 수 있다(EU 지표 넘버링).
잔기 Asn297에 특정 돌연변이 또는 변경된 당화를 함유하는 인간 IgG1 불변 영역은 또한 Fc 수용체에 대한 결합을 가능케 하는 것으로 기재되었다. 일부 경우에, 이들 돌연변이는 또한 ADCC 및 CDC를 향상시키는 것으로 밝혀졌다(Lazar et al. PNAS 2006, 103; 4005-4010; Shields et al. J Biol Chem 2001, 276; 6591 -6604; Nechansky et al. Mol Immunol, 2007, 44; 1815-1817).
본 발명의 한 구체예에서, 상기 돌연변이는 239, 332 및 330(IgG1)으로부터 선택된 위치 중 하나 이상, 또는 다른 IgG 아이소형 내의 동등한 위치에 존재한다. 적합한 돌연변이의 예는 S239D 및 I332E 및 A330L이다. 한 구체예에서, 본원에 기재된 본 발명의 항원 결합 단백질은 S239D 및 I332E와 같이 위치 239 및 332에서 돌연변이되거나, 한 추가 구체예에서, 이는 S239D 및 I332E 및 A330L과 같이 239 및 332 및 330으로부터 선택된 3개 이상의 위치에서 돌연변이된다(EU 지표 넘버링).
본 발명의 한 대안적 구체예에서, 변경된 당화 프로파일을 갖는 중쇄 불변 영역을 포함하는 항원 결합 단백질이 제공되며, 상기 항원 결합 단백질은 향상된 효과기 기능을 갖는다. 예를 들어, 항원 결합 단백질은 향상된 ADCC 또는 향상된 CDC를 갖거나, 이는 향상된 ADCC 및 CDC 효과기 기능 둘 모두를 갖는다. 변경된 당화 프로파일을 갖는 항원 결합 단백질을 생성시키기에 적합한 방법의 예는 WO2003011878호, WO2006014679호 및 EP1229125호에 기재되어 있으며, 상기 모두는 본 발명의 항원 결합 단백질에 적용될 수 있다.
본 발명은 또한 a) 본원에 기재된 바와 같은 분리된 핵산을 포함하는 발현 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계로서, 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제를 엔코딩하는 FUT8 유전자가 재조합 숙주 세포에서 비활성화되는 단계; 및 b) 항원 결합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 항원 결합 단백질의 생성을 위한 방법을 제공한다.
항원 결합 단백질의 생성을 위한 상기 방법은, 예를 들어, FUT8 유전자의 기능성 카피가 결핍된 CHOK1SV 세포가 기능성 FUT8 유전자를 갖는 세포에서 생성된 동일한 모노클로날 항체에 비해 증가되는 향상된 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC) 활성을 갖는 모노클로날 항체를 생성시키는, BioWa, Inc.(Princeton, NJ)로부터 이용가능한 POTELLIGENT™ technology system을 이용하여 수행될 수 있다. POTELLIGENT™ technology system의 양태는 모두 참조로서 본원에 포함되는 US7214775호, US6946292호, WO0061739호 및 WO0231240호에 기재되어 있다. 당업자는 또한 다른 적절한 시스템을 인지할 것이다.
본 발명의 한 구체예에서, 키메라 중쇄 불변 영역을 포함하는 항원 결합 단백질, 예를 들어, IgG3으로부터의 적어도 하나의 CH2 도메인을 갖는 키메라 중쇄 불변 영역을 포함하는 항원 결합 단백질이 제공되며, 상기 항원 결합 단백질은 향상된 효과기 기능을 갖고, 예를 들어, 이는 향상된 ADCC 또는 향상된 CDC, 또는 향상된 ADCC 및 CDC 기능을 갖는다. 한 상기 구체예에서, 항원 결합 단백질은 IgG3으로부터의 하나의 CH2 도메인을 포함할 수 있거나, 둘 모두의 CH2 도메인은 IgG3으로부터 유래될 수 있다.
또한, a) 본원에 기재된 바와 같은 분리된 핵산을 포함하는 발현 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계로서, 상기 발현 벡터가 IgG1 및 IgG3 Fc 도메인 아미노산 잔기 둘 모두를 갖는 Fc 도메인을 엔코딩하는 핵산 서열을 포함하는 단계; 및 b) 항원 결합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 항원 결합 단백질을 생성하는 방법이 제공된다.
항원 결합 단백질의 생성을 위한 상기 방법은, 예를 들어, 재조합 숙주 세포가, IgG1 및 IgG3 Fc 도메인 아미노산 잔기 둘 모두를 갖는 키메라 Fc 도메인을 엔코딩하는 핵산 서열이 발현되어 상기 키메라 Fc 도메인이 결핍된 달리 동일한 항원 결합 단백질에 비해 증가되는 향상된 보체 의존성 세포독성(CDC) 활성을 갖는 항원 결합 단백질을 생성시키는 발현 벡터를 포함하는, BioWa, Inc.(Princeton, NJ) 및 Kyowa Hakko Kogyo(현재, Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd.) Co., Ltd.로부터 이용가능한 COMPLEGENT™ technology system을 이용하여 수행될 수 있다. COMPLEGENT technology system의 양태는 각각이 참조로서 본원에 포함되는 WO2007011041호 및 US20070148165호에 기재되어 있다. 한 대안적 구체예에서, CDC 활성은 IgG 사슬의 Fc 영역으로 서열 특이적 돌연변이를 도입시킴으로써 증가될 수 있다. 당업자는 또한 다른 적절한 시스템을 인지할 것이다.
이러한 변형은 단독으로 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 효과기 기능을 추가로 향상시키기 위해 서로 조합되어 사용될 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명의 한 상기 구체예에서, 돌연변이된 중쇄 불변 영역 및 키메라 중쇄 불변 영역을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하는 항원 결합 단백질이 제공되며, 예를 들어, 상기 항원 결합 단백질은 IgG3으로부터의 적어도 하나의 CH2 도메인 및 IgG1으로부터의 하나의 CH2 도메인을 포함하고, IgG1 CH2 도메인은 239 및 332 및 330으로부터 선택된 위치에 하나 이상의 돌연변이(예를 들어, 돌연변이는 S239D 및 I332E 및 A330L로부터 선택될 수 있음)를 가져, 상기 항원 결합 단백질은 향상된 효과기 기능을 갖고, 예를 들어, 이는 향상된 ADCC 또는 향상된 CDC의 기능 중 하나 이상을 갖고, 예를 들어, 이는 향상된 ADCC 및 향상된 CDC를 갖는다. 한 구체예에서, IgG1 CH2 도메인은 돌연변이 S239D 및 I332E를 갖는다.
본 발명의 한 대안적 구체예에서, 키메라 중쇄 불변 영역을 포함하고, 변경된 당화 프로파일을 갖는 항원 결합 단백질이 제공된다. 한 상기 구체예에서, 중쇄 불변 영역은 IgG3으로부터의 적어도 하나의 CH2 도메인 및 IgG1으로부터의 하나의 CH2 도메인을 포함하고, 푸코스 대 만노스의 비가 0.8:3 또는 그 미만이 되도록 하는 변경된 당화 프로파일을 가지며, 예를 들어, 상기 항원 결합 단백질은 탈푸코실화(defucosylation)되어 상기 항원 결합 단백질은 상기 돌연변이 및 변경된 당화 프로파일이 결핍된 면역글로불린 중쇄 불변 영역을 갖는 동등한 항원 결합 단백질과 비교하여 향상된 효과기 기능을 갖고, 예를 들어, 이는 향상된 ADCC 또는 향상된 CDC의 기능 중 하나 이상을 갖고, 예를 들어, 이는 향상된 ADCC 및 향상된 CDC를 갖는다. 한 대안적 구체예에서, 항원 결합 단백질은 적어도 하나의 IgG3 CH2 도메인 및 IgG1으로부터의 적어도 하나의 중쇄 불변 도메인을 갖고, 둘 모두의 IgG CH2 도메인은 본원에 기재된 제한에 따라 돌연변이된다.
본 발명의 한 양태에서, a) 본원에 기재된 바와 같은 분리된 핵산을 함유하는 발현 벡터를 함유하는 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계로서, 상기 발현 벡터가 IgG1 및 IgG3 Fc 도메인 아미노산 잔기 둘 모두를 갖는 키메라 Fc 도메인을 엔코딩하는 Fc 핵산 서열을 추가로 포함하고, 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제를 엔코딩하는 FUT8 유전자가 재조합 숙주 세포에서 비활성화되는 단계; 및 b) 항원 결합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 본원에 기재된 본 발명에 따른 항원 결합 단백질을 생성시키는 방법이 제공된다.
항원 결합 단백질의 생성을 위한 상기 방법은, 예를 들어, 키메라 Fc 도메인이 결핍되어 있고 올리고당류 상에 푸코스를 갖는 달리 동일한 모노클로날 항체에 비해 증가되는 ADCC 및 CDC 향상된 활성 둘 모두를 갖는 항원 결합 단백질을 생성시키는, POTELLIGENT™ 및 COMPLEGENT™ technology systems을 조합시킨 BioWa, Inc.(Princeton, NJ)으로부터 이용가능한 ACCRETAMAB™ technology system을 이용하여 수행될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 돌연변이된 중쇄 불변 영역 및 키메라 중쇄 불변 영역을 포함하는 항원 결합 단백질이 제공되며, 상기 항원 결합 단백질은 변경된 당화 프로파일을 가져 상기 항원 결합 단백질은 향상된 효과기 기능을 갖고, 예를 들어, 이는 향상된 ADCC 또는 향상된 CDC의 기능 중 하나 이상을 갖는다. 한 구체예에서, 돌연변이는 위치 239 및 332 및 330으로부터 선택되고, 예를 들어, 돌연변이는 S239D 및 I332E 및 A330L로부터 선택된다. 한 추가 구체예에서, 중쇄 불변 영역은 IgG3으로부터의 적어도 하나의 CH2 도메인 및 IgG1으로부터의 하나의 Ch2 도메인을 포함한다. 한 구체예에서, 중쇄 불변 영역은 푸코스 대 만노스의 비가 0.8:3 또는 그 미만이 되도록 하는 변경된 당화 프로파일을 갖고, 예를 들어, 항원 결합 단백질은 탈푸코실화되어, 상기 항원 결합 단백질은 동등한 비-키메라 항원 결합 단백질 또는 상기 돌연변이 및 변경된 당화 프로파일이 결핍된 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 비해 향상된 효과기 기능을 갖는다.
본 발명의 항원 결합 단백질을 변형시키는 또 다른 수단은 면역글로불린 불변 도메인 또는 FcRn(Fc 수용체 신생아) 결합 도메인의 변형에 의해 상기 단백질의 생체내 반감기를 증가시키는 것을 포함한다.
성체 포유동물에서, 신생아 Fc 수용체로도 공지된 FcRn은 IgG 아이소형의 항체에 결합하고, 분해로부터 이를 지키는 보호 수용체로 작용함으로써 혈청 항체 수준을 유지시키는데 중요한 역할을 한다. IgG 분자는 내피세포에 의해 세포내이입되고, 이들이 FcRn에 결합하는 경우, 순환으로 재순환된다. 대조적으로, FcRn에 결합하지 않는 IgG 분자는 세포에 진입하고, 리소좀 경로로 표적화되고, 여기서 이들은 분해된다.
신생아 FcRn 수용체는 항체 청소 및 조직을 통한 세포질통과(transcytosis) 둘 모두와 관련된 것으로 생각된다(Junghans R.P (1997) Immunol. Res 16. 29-57 and Ghetie et al (2000) Annu.Rev.lmmunol. 18, 739-766 참조). 인간 FcRn과 직접적으로 상호작용하는 것으로 결정된 인간 IgG1 잔기는 Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434 및 His435를 포함한다. 본 단락에 기재된 상기 위치 중 임의의 위치에서의 교환은 본 발명의 항원 결합 단백질의 증가된 혈청 반감기 및/또는 변경된 효과기 특성을 가능케 할 수 있다.
본 발명의 항원 결합 단백질은 FcRn에 대한 불변 도메인 또는 이의 단편의 친화성을 증가시키는 아미노산 변형을 가질 수 있다. 치료 및 진단 IgG 및 다른 생활성 분자의 반감기를 증가시키는 것은 상기 분자 투여의 양 및/또는 빈도의 감소를 포함하는 많은 이점을 갖는다. 한 구체예에서, 따라서, 본원에 제공된 본 발명에 따른 항원 결합 단백질 또는 상기 아미노산 변형 중 하나 이상을 갖는 IgG 불변 도메인의 전부 또는 일부(FcRn 결합 부분)를 포함하는 융합 단백질, 및 상기 변형된 IgG 불변 도메인에 컨쥬게이션된 비-IgG 단백질 또는 비-단백질 분자가 제공되며, 변형된 IgG 불변 도메인의 존재는 항원 결합 단백질의 생체내 반감기를 증가시킨다.
PCT 공개 번호 WO 00/42072호에는 변경된 FcRn 결합 친화성을 갖는 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드가 개시되어 있으며, 상기 폴리펩티드는 Fc 영역의 아미노산 위치 238, 252, 253, 254, 255, 256, 265, 272, 286, 288, 303, 305, 307, 309, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 386, 388, 400, 413, 415, 424, 433, 434, 435, 436, 439, 및 447 중 어느 하나 이상에서 아미노산 변형을 포함하고, Fc 영역 내의 잔기의 넘버링은 EU 지표의 넘버링이다(Kabat et al).
PCT 공개 번호 WO 02/060919 A2호에는 야생형 IgG 불변 도메인에 비해 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하는 IgG 불변 도메인을 포함하는 변형된 IgG가 개시되어 있으며, 상기 변형된 IgG는 야생형 IgG 불변 도메인을 갖는 IgG의 반감기에 비해 증가된 반감기를 갖고, 상기 하나 이상의 아미노산 변형은 위치 251, 253, 255, 285-290, 308-314, 385-389, 및 428-435 중 하나 이상에 존재한다.
문헌[Shields et al. (2001, J Biol Chem; 276:6591-604)]에서는 인간 IgG1 항체의 Fc 영역 내의 잔기를 변경시킨 후, 인간 FcRn에 대한 결합을 평가하는 알라닌 스캐닝 돌연변이유발을 이용하였다. 알라닌으로 변경되는 경우 FcRn에 대한 결합을 효과적으로 폐기시키는 위치는 I253, S254, H435, 및 Y436을 포함한다. E233-G236, R255, K288, L309, S415, 및 H433과 같은 다른 위치는 결합에서 덜 현저한 감소를 나타내었다. 여러 아미노산 위치는 알라닌으로 변경된 경우 FcRn 결합에서 개선을 나타내었고, 특히 이들은 P238, T256, E272, V305, T307, Q311, D312, K317, D376, E380, E382, S424, 및 N434이다. 많은 다른 아미노산 위치는 FcRn 결합에서 약간의 개선(D265, N286, V303, K360, Q362, 및 A378)을 나타내거나, 변화를 나타내지 않았다(S239, K246, K248, D249, M252, E258, T260, S267, H268, S269, D270, K274, N276, Y278, D280, V282, E283, H285, T289, K290, R292, E293, E294, Q295, Y296, N297, S298, R301, N315, E318, K320, K322, S324, K326, A327, P329, P331, E333, K334, T335, S337, K338, K340, Q342, R344, E345, Q345, Q347, R356, M358, T359, K360, N361, Y373, S375, S383, N384, Q386, E388, N389, N390, K392, L398, S400, D401, K414, R416, Q418, Q419, N421, V422, E430, T437, K439, S440, S442, S444, 및 K447).
가장 현저한 효과는 조합 변이체가 FcRn에 대한 개선된 결합을 갖는 것을 발견하였다. pH 6.0에서, E380A/N434A 변이체는 자연 IgG1에 비해 FcRn에 대해 8배를 초과하는 결합을 나타내었고, E380A에 대해서는 2배 및 N434A에 대해서는 3.5배였다. 상기에 T307A를 추가하는 것은 자연 IgG1에 비해 결합에 있어서 12배 개선을 초래하였다. 한 구체예에서, 본 발명의 항원 결합 단백질은 E380A/N434A 돌연변이를 포함하며, FcRn에 대한 증가된 결합을 갖는다.
문헌[Dall'Acqua et al. (2002, J Immunol. ;169:5171-80)]에는 마우스 FcRn에 대한 인간 IgG1 힌지-Fc 단편 파지 디스플레이 라이브러리의 무작위 돌연변이유발 및 스크리닝이 기재되어 있다. 여기에는 위치 251, 252, 254-256, 308, 309, 311, 312, 314, 385-387, 389, 428, 433, 434, 및 436의 무작위 돌연변이유발이 개시되어 있다. IgG1-인간 FcRn 복합체 안정성에서의 주요 개선은 Fc-FcRn 접촉면 전체에 걸친 밴드 내에 위치된 잔기 치환(M252, S254, T256, H433, N434, 및 Y436), 및 V308, L309, Q311, G385, Q386, P387, 및 N389와 같이 주변의 잔기의 더 적은 정도의 치환에서 발생한다. 인간 FcRn에 대해 가장 높은 친화성을 갖는 변이체는 M252Y/S254T/T256E 및 H433K/N434F/Y436H 돌연변이를 조합시킴으로써 수득되었고, 이는 야생형 IgG1에 비해 친화성에서 57배 증가를 나타내었다. 상기 돌연변이된 인간 IgG1의 생체내 작용은 야생형 IgG1에 비해 시노몰구스 원숭이에서 혈청 반감기에서 거의 4배 증가를 나타내었다.
따라서, 본 발명은 FcRn에 대한 최적화된 결합을 갖는 항원 결합 단백질의 변이체를 제공한다. 한 바람직한 구체예에서, 항원 결합 단백질의 상기 변이체는 상기 항원 결합 단백질의 Fc 영역 내에 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하며, 상기 변형은 상기 모 폴리펩티드에 비해 Fc 영역의 226, 227, 228, 230, 231, 233, 234, 239, 241, 243, 246, 250, 252, 256, 259, 264, 265, 267, 269, 270, 276, 284, 285, 288, 289, 290, 291, 292, 294, 297, 298, 299, 301, 302, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 315, 317, 320, 322, 325, 327, 330, 332, 334, 335, 338, 340, 342, 343, 345, 347, 350, 352, 354, 355, 356, 359, 360, 361, 362, 369, 370, 371, 375, 378, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 390, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 403, 404, 408, 411, 412, 414, 415, 416, 418, 419, 420, 421, 422, 424, 426, 428, 433, 434, 438, 439, 440, 443, 444, 445, 446 및 447로 구성되는 군으로부터 선택되고, Fc 영역 내의 아미노산의 넘버링은 케이뱃 내의 EU 지표의 넘버링이다. 본 발명의 한 추가 양태에서, 변형은 M252Y/S254T/T256E이다.
추가로, 다양한 간행물에는 분자에 FcRn-결합 폴리펩티드를 도입(WO 97/43316; U.S. Patent N° 5,869,046; U.S. Patent N° 5,747,035; WO 96/32478; WO 91/14438)시키거나, FcRn-결합 친화성이 보존되나, 분자와 다른 Fc 수용체에 대한 친화성이 크게 감소된 항체를 융합(WO 99/43713)시키거나, 항체의 FcRn 결합 도메인과 융합(WO 00/09560; U.S. Patent N° 4,703,039)시킴에 의해 반감기가 변형된 생리학적 활성 분자를 수득하는 방법이 기재되어 있다.
추가로, 감소된 생물학적 반감기를 갖는 항원 결합 단백질을 생성시키는 방법이 또한 제공된다. His435가 알라닌으로 돌연변이된 변이체 IgG는 FcRn 결합의 선택적 손실, 및 현저히 감소된 혈청 반감기를 발생시킨다(Firan et al. 2001, International immunology 13:993). 미국 특허 번호 6,165,745호에는 항원 결합 단백질을 엔코딩하는 DNA 세그먼트에 돌연변이를 도입시킴으로써 감소된 생물학적 반감기를 갖는 항원 결합 단백질을 생성시키는 방법이 개시되어 있다. 돌연변이는 Fc-힌지 도메인의 위치 253, 310, 311, 433, 또는 434에서 아미노산 치환을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "비 인간 항체 또는 이의 항체 단편"은 인간이 아닌 임의의 종으로부터 기원되는 항체 또는 이의 단편을 나타내는 것을 의미하며, 여기서 인간은 키메라 항체를 포함한다.
용어 "공여 항체"는 이의 가변 도메인, CDR, 또는 이의 다른 기능적 단편 또는 유사체의 아미노산 서열을 첫번째 면역글로불린 파트너에 제공하여, 공여 항체의 항원성 특이성 및 중화 활성 특징을 갖는 변경된 면역글로불린 코딩 영역 및 결과로서 발현된 변경된 항체를 제공하는 항체(모노클로날, 및/또는 재조합)를 나타낸다.
용어 "수용체 항체"는 중쇄 및 경쇄 프레임워크 영역 및/또는 중쇄 및/또는 경쇄 불변 영역을 엔코딩하는 아미노산 서열 모두(또는 임의의 일부, 바람직하게는 모두)를 첫번째 면역글로불린 파트너에 제공하는 공여 항체에 이종성인 항체(모노클로날 및/또는 재조합)를 나타낸다. 인간 항체는 수용체 항체이다. 본원에서 사용되는 용어 "인간 수용체 서열"은 인간 항체 또는 이의 항체 단편으로부터 유래된 VH 또는 VL 프레임워크의 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항체 단편의 프레임워크 또는 비-인간 종으로부터의 CDR이 통합될 수 있는 인간 컨센서스 서열 프레임워크를 나타내는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 CDR 또는 과가변 영역의 "통합"은 비-인간 CDR이 인간 수용체 프레임워크와 함께 위치되는 임의의 의미를 포함한다. 이는 다양한 방식으로 달성될 수 있고, 예를 들어, 요망되는 아미노산 서열을 엔코딩하는 핵산이 비-인간 가변 도메인 서열을 엔코딩하는 핵산을 이의 프레임워크 잔기가 인간 수용체 프레임워크 잔기로 변경되도록 돌연변이시키거나, 인간 가변 도메인 서열을 엔코딩하는 핵산을 CDR이 비-인간 잔기로 변경되도록 돌연변이시키거나, 요망되는 서열을 엔코딩하는 핵산을 합성함으로써 생성될 수 있음이 인지될 것이다. 한 구체예에서, 최종 서열은 인 실리코(in silico)로 생성된다.
본 발명은 이제 실시예로만 기재된다. 첨부된 청구항은 하기 실시예 중 하나 이상의 개괄을 포함할 수 있다.
실시예
실시예 1: 모노클로날 항체 생성 및 선택
1.1: 면역화 방법
항 인간 OSM mAb S168110G08(1)1A09("10G8")를 재조합 당화 인간 OSM(K598)으로 면역화된 마우스로부터 유래된 하이브리도마로부터 확인하였다. 암컷 SJL 마우스(n=2, Harlan, UK, HOST SP06-06031)를 복막내로 AS02-유사 애쥬번트와 함께 전체 10μg의 단백질을 이용하여 통상적으로 면역화시켰다. 5μg 단백질로 부스터 면역화시켰다. 각 부스터 후 시험 혈액을 채취하였고, 최적 반응을 갖는 마우스(168#4)를 하이브리도마 융합을 위해 선택하였다(R16092/177-198). 비장을 절제하고, 분쇄시키고, PEG1500 유도되는 체세포 융합을 마우스 골수종 세포 X63 AG8 653.GFP.Bcl-2.11(BioCat 112754; R17209/58)을 이용하여 수행하였다. 융합체를 10 x 96 웰 플레이트 및 메틸셀룰로스 함유 반고체 배지 중 5 Nunc Omnitrays에 플레이팅시켰다. 반고체 배지로부터 5 x 96 웰 플레이트로 집락을 채집하였다.
1.2: 스크리닝 방법
1.2.1: 일차 스크린
항-OSM 백-업(back-up) 항체에 대한 일차 스크린은 gp130 수용체 결합으로부터 인간 및 시노몰구스 OSM 둘 모두를 억제하는 항-부위 II 분자에 대해 선택하기 위해 인간 OSM에 결합할 수 있는 하이브리도마 물질을 선택하는 것을 기초로 하였다. 상기 스크린으로부터의 양성 하이브리도마 상층액을 최고의 결합 하이브리도마를 선택하기 위해 BIACore 분리속도(off-rate) 동역학에 의해 분석하였다.
과량의 3000개의 클론을 융합으로부터 회수하였고, 이 중 86개는 결합 ELISA에 의해 인간 OSM에 대한 평가가능한 결합을 나타내었다. 항-부위 II 활성에 대한 분석을 인간 및 시노몰구스 OSM을 이용하여 gp130 ELISA에 의해 양성 하이브리도마에 대해 수행하였고, 인간 gp130에 대한 결합으로부터 인간 및 시노몰구스 OSM 둘 모두를 억제한 하이브리도마 클론을 BIACore 분리속도 동역학 분석에 적용시켰다. 분리속도 분석에 의한 상위 4개의 인간 OSM 결합자 10G8, 9G2, 3E3 및 2B7를 모노클로닝시켰고, 다시 스크린하였다. 각 하이브리도마로부터의 모노클론 사이의 BIACore 및 ELISA 결합 활성 또는 gp130 억제에서 차이가 없었다. 딸 클론(daughter clone) 10G8.A9, 9G2.C1, 2B7.A6 및 3E3.A1을 냉동보존시키고, 혈청 비함유 스케일-업(scale-up) 및 정제에 사용하였다. 이들을 이차 스크리닝으로 진행시켰다.
1.2.2: 이차 스크린
4개의 딸 클론 10G8/A9, 9G2/C1, 2B7/A6 및 3E3/A1을 순위화시키기 위한 이차 스크리닝은 인간/시노몰구스 OSM에 대한 BIACore 동역학 분석; 인간/시노몰구스 OSM을 이용한 인간 gp130 ELISA; 인간/시노몰구스 OSM을 이용한 KB 세포 중화 검정을 포함하였다. 이에 더하여, 내인성의 호중구-유래 인간 OSM을 중화시키는 능력은 25% 인간 AB 혈청에서 중화 능력을 보유하며, 인간 LIF에 대한 반응성을 평가하였다.
BIACore 분석:
BIACore 분석은 10G8, 9G2, 3E3 및 2B7이 대안적 비-경쟁 항-OSM 마우스 항체(15E10)보다 인간 OSM에 대해 높은 친화성을 갖는 것을 나타내었다(표 1). 10G8은 인간(~550pM) 및 시노몰구스(~310pM) OSM 둘 모두에 대해 가장 큰 친화성을 나타내었다. 15E10에 비하여, 10G8은 인간에 대해 8배/0.9 log 증가된 친화성, 및 시노몰구스 OSM에 대해 11배/1 log 증가된 친화성을 가졌다. 10G8 및 9G2 둘 모두는 인간 OSM에 비해 시노몰구스 OSM에 대해 증가된 친화성을 나타내었다.
표 1: BIACore 동역학 - 15E10에 비한 4개의 항-OSM 백-업 리드(lead) 항체 10G8, 9G2, 3E3 및 2B7.
Figure pct00002
인간 gp130 ELISA:
인간 gp130 ELISA는 비교적 높은 수준(25ng/ml)의 OSM을 이용하며, 이는 리간드가 과량으로 존재함에 따라 더욱 낮은 친화성 항체로부터 높은 친화성 항체를 분리시키는 능력을 감소시킨다. 상기 검정의 4회 반복 후, 10G8은 이러한 검정에서 gp130 수용체에 대한 결합으로부터 인간 및 시노몰구스 OSM 둘 모두를 차단하는데 있어서 가장 효능있는 항체인 것으로 밝혀졌다(도 1; 표 2).
표 2: 인간 gp130 ELISA - 인간 및 시노몰구스 OSM에 대한 10G8, 9G2, 3E3 및 2B7 활성을 순위화시키기 위한 인간 gp130 ELISA의 4회 반복의 요약. 비-경쟁 마우스 항체 15E10 및 음성 대조군 도구 항체를 비교 목적을 위해 추가하였다.
Figure pct00003
인간 gp130 검정을 25% 인간 AB 혈청의 존재하에서 반복하였다. 상기 검정의 2회 반복은 15E10와 함께 4개 모두의 리드 항체 10G8, 9G2, 3E3 및 2B7이 gp130에 대한 결합으로부터 인간 및 시노몰구스 OSM을 차단하는 이들의 능력을 보유한 것을 나타내었다(데이터는 제시하지 않음).
KB 세포 중화 검정:
OSM은 KB 세포(gp130 및 OSM 수용체에 대한 mRNA를 발현하는 인간 상피세포주)로부터 IL-6 방출을 유도한다. 간단히, KB 세포는 37℃에서 16-18시간 동안 1 ng/ml OSM +/- 다양한 항체 농도로 자극되고, IL6 방출이 ELISA에 의해 모니터된다. KB 세포 중화 검정은 gp130 검정에 비해 감소된 양의 OSM을 이용한다(1 ng/ml 대 25ng/ml). 이는 상기 KB 세포 중화 검정을 저 친화성 중화제로부터 고 친화성 중화제를 분리시키기 위한 더욱 식별력이 있는 검정으로 만든다. 항체 15E10과 비교하는 경우, 10G8은 KB 세포 중화 검정에서 인간 OSM에 대해 15배/1.2 log 더 효능이 있었다. 상기 검정의 3회 반복으로부터, 10G8은 모든 반복에서 첫번째 순위였고, 인간 OSM에 대해 8ng/ml 및 시노몰구스에 대해 6ng/ml의 평균 IC50 값을 발생시켰다(도 2; 표 3). 9G2는 상기 검정에서 두번째 순위였고, 인간 및 시노몰구스 OSM에 대해 각각 18ng/ml 및 15ng/ml의 IC50이었다.
표 3: KB 세포 중화 검정 - 인간 및 시노몰구스 OSM에 대한 10G8, 9G2, 3E3 및 2B7 활성을 순위화시키기 위한 KB 세포 중화 검정의 3회 반복의 요약. 항체 15E10을 비교 목적을 위해 추가하였다. 도구 항체를 음성 대조군으로 사용하였다.
Figure pct00004
25% 인간 AB 혈청의 존재하에서, 10G8, 9G2 및 3E3은 인간 및 시노몰구스 OSM 둘 모두를 중화시키는 이들의 능력을 보유하였다(도 3). 15E10 및 2B7은 IC50 값을 계산하기에 충분한 양질의 적합된 곡선을 발생시키는데 실패하였다. 비-인간 혈청 KB 세포 검정을 이용하여, 가장 효능있는 항체는 10G8이었고, 9G2는 두번째 순위였다. 활성에서 일부 감소가 25% AB 혈청의 존재하에서 관찰되었다. 어느 정도까지, 이는 상기 검정 판독을 간섭하는 AB 혈청으로 인한 것일 수 있다. 비-인간 혈청에서 보다 더욱 높은 IL-6 백그라운드 수준이 상기 검정에서 관찰되었다.
내인성 인간 OSM(gp130 검정):
4개 모두의 리드 항체 10G8, 9G2, 3E3 및 2B7 뿐만 아니라 항체 15E10은 4개의 별개의 공여체로부터 내인성 인간 OSM을 억제하였다(도 4). 이러한 자연 OSM은 건강한 인간 호중구의 GM-CSF-자극으로부터 발생되었다.
인간 LIF 반응성(KB 세포 중화 검정):
인간 LIF는 인간 OSM에 대한 IL-6 패밀리의 가장 가깝게 관련된 일원이다. 최초 연구는 10G8, 9G2, 3E3 및 2B7과 인간 LIF 사이에 반응성이 없음을 나타내었는데, 이는 이들 항체가 OSM-특이적인 것을 나타낸다(도 5).
마모셋 OSM 반응성(KB 세포 중화 검정):
4개 모두의 리드 분자 10G8, 9G2, 3E3 및 2B7은 KB 세포 중화 검정에서 마모셋 OSM을 중화시키는 것으로 밝혀졌다(도 6). 15E10 및 3개의 추가 항-인간 OSM 항체의 패널 10D3DLE, OM4.11.17 및 OM4.11.31은 또한 마모셋 OSM을 중화시키는데 실패하였다.
2회의 검정 반복으로부터, 10G8이 마모셋 OSM의 가장 효능있는 중화제였고, 9G2가 두번째 순위였다.
1.2.3: 진행을 위해 선택된 모노클로날
4개의 항체로부터, 10G8을 상기 나열된 검정 모두에서 첫번째 순위임을 기초로 하여 키메라화를 위한 리드 항체로 선택하였다. 9G2를 또한 인간화가 어려운 경우에 백-업 분자로서 키메라화를 위해 선택하였다.
1.3: 항체 조작 및 리드 항체 시리즈 선택
1.3.2: 가변 영역 서열
4개의 선택된 모노클로날 2B7, 3E3, 9G2 및 10G8에 대한 가변 유전자를 분리시키고, 동시에 서열분석하여 해당 키메라 항체의 생성을 가능케 하였다. 전체 RNA를 하이브리도마 세포 펠렛으로부터 추출하였다. 중쇄 및 경쇄 V-유전자 코딩 서열을 RT-PCR 또는 5'RACE에 의해 증폭시킨 후, 서열 분석을 위해 TA 클로닝하였다. V-유전자 증폭을 각 항체에 대해 이중으로 수행하여, 2개의 독립적 반응으로부터 정확한 서열의 이후의 확인을 가능케 하였다. 가변 중쇄 및 가변 경쇄의 서열을 모든 4개의 하이브리도마 클론에 대해 수득하였다. 단백질 서열의 정렬은 항체가 가변 중쇄 및 경쇄 영역 둘 모두에서 높은 정도의 서열 동일성을 가진 것을 나타내었다(도 7 & 8). 상기 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 서열이 SEQ ID NO:26-48에 기재되어 있다. 표 A를 참조하라.
4개의 리드 모노클로날과 항체 15E10 사이의 서열 비교는 경쇄(도 9) 또는 중쇄(도 10)와 단지 50-60% 동일성을 나타낸다. 이는 이들 항체가 항체 15E10에 의해 인지되는 에피토프와 별개의 에피토프에 결합하는 것을 나타낸다.
1.3.3: 항체 클로닝
1.3.3.1: 키메라의 작제
상기 기재된 마우스 VH 및 VL 영역을 코돈 최적화된 인간 감마 1 Fc 야생형 및 인간 카파 불변 영역 각각에 이식함으로써 10G8 및 9G2 둘 모두를 키메라 항체로 생성시켰다. 키메라 항체를 클로닝된 마우스 V-영역의 기능을 확인하기 위해 사용하였고, 정제시키고, 인간화 작제물을 시험하는 경우 참조로 사용하였다. PCR 프라이머를 2.3.1에서 결정된 5' 및 3' DNA 서열을 기초로 하여 설계하여, Rlx 및 pTT5 포유동물 발현 벡터로 클로닝시키는데 필요한 제한 부위를 포함시켰다. 자연 신호 서열을 Campath 신호 서열로 대체하도록 프라이머를 또한 설계하였다. Hind III 및 SpeI 부위를 VH 도메인을 구성하고, 인간 γ1 C 영역을 함유하는 변형된 Rld 또는 pTT5 벡터로 클로닝되도록 설계하였다. 프레임워크 4 서열로의 SpeI 부위의 도입은 위치 108에서 FR4 내의 하나의 아미노산 변화를 발생시켰다. 9G2 VH 영역에 대해, 내부 SpeI 부위는 DNA 서열의 5'-말단에 존재하였고, 9G2 키메라에 대한 PCR 프라이머를 상기 내부 SpeI 부위를 제거하도록 설계하였다. Hind III 및 BsiWI 부위를 VL 도메인을 구성하고, 인간 κC 영역을 함유하는 변형된 Rln 또는 pTT5 벡터로 클로닝되도록 설계하였다.
정확한 VH 및 VL 서열을 갖는 클론을 확인하고, CHO 또는 HEK 세포에서의 발현을 위해 플라스미드를 제조하였다.
1.3.3.2: 키메라의 발현
키메라 10G8 및 9G2 VH 및 VL 도메인을 각각 엔코딩하는 Rld 및 Rln 플라스미드를 전기천공에 의해 CHOE1A 세포에 공동트랜스펙션시키고, 폴리클로날 세포 배양에서 발현시켰다. 키메라 10G8 및 9G2 VH 및 VL 도메인을 엔코딩하는 pTT 플라스미드를 일시적 에피솜 발현을 가능케 하는 지질 트랜스펙션 방법을 이용하여 HEK293 세포로 공동트랜스펙션시켰으며, 에피솜 발현 시스템에서의 트랜스펙션은 mg 양의 항체를 잠재적으로 생성시킬 수 있다. 생성된 키메라 항체(10G8c 및 9G2c)를 단백질 A 세파로스 상에서의 친화성 크로마토그래피에 의해 세포 배양 상층액으로부터 정제하였다. 정제된 항체를 SDS-PAGE 분석 및 크기 배제 크로마토그래피에 의해 QC하였다.
1.3.3.3: 결합 검정 데이터
인간 OSM 결합 ELISA:
10G8 및 9G2 키메라 둘 모두는 15E10 키메라(15E10c)보다 더 많은 정도로 인간 OSM에 성공적으로 결합하였다(도 11). 이는 인간 OSM이 1μg/ml로 코팅되고, 결합된 항체가 항-인간 IgG를 이용하여 검출된 직접 ELISA였다.
BIACore 분석:
BIACore 분석은 마우스 모 항체에 비해 키메라 10G8 및 9G2 분자에서 인간 또는 시노몰구스 OSM 결합에서 손실이 거의 없거나 손실이 없는 것을 나타내었다(표 4). 9G2 키메라(1.33nM)에 앞서 10G8 키메라(654pM)가 첫번째 순위였다. 모든 항체는 인간 OSM에 비해 시노몰구스 OSM에 대해 증가된 친화성을 나타내었다.
표 4: BIACore 동역학 - 10G8, 10G8 키메라, 9G2 & 9G2 키메라 항체의 결합 동역학.
Figure pct00005
1.3.3.4: 기능 검정 데이터
인간 gp130 ELISA:
인간 gp130 ELISA는 비교적 높은 수준의 OSM(25ng/ml)을 사용하며, 이는 리간드가 과량으로 존재함에 따라 낮은 친화성 항체로부터 높은 친화성 항체를 분리시키는 능력을 감소시킨다. 상기 검정의 3회 반복 후, 10G8 키메라는 gp130 수용체에 대한 결합으로부터 인간 및 시노몰구스 OSM 둘 모두를 억제하는데 가장 효과적인 항체였다. 10G8 마우스 모 및 10G8 키메라에 대한 값은 상기 검정에서 매우 유사하였다(도 12; 표 5). 9G2와 이의 키메라 사이에 현저한 차이가 없었다.
표 5: 인간 gp130 ELISA - 인간 및 시노몰구스 OSM에 대한 10G8, 10G8 키메라, 9G2 & 9G2 키메라 활성을 순위화시키기 위한 인간 gp130 ELISA의 3회 반복의 요약. 항체 15E10을 비교 목적을 위해 추가하였다. 도구 항체를 음성 대조군으로 사용하였다.
Figure pct00006
인간 gp130 검정을 인간 및 시노몰구스 OSM 둘 모두에 대한 인간 AB 혈청의 존재하에서 반복하였다. 모든 분자는 25% 혈청에서 이들의 활성을 보유하였다. 인간 및 시노몰구스 OSM에 대해, 10G8 키메라 및 10G8 마우스 모가 각각 첫번째 및 두번째 순위였다. 상기 두 항체에 대한 IC50 값은 유사하였다. 세번째 순위인 9G2 키메라와 이의 마우스 모 사이에 현저한 차이가 관찰되지 않았다(데이터는 제시하지 않음).
KB 세포 중화 검정:
10G8 마우스 모는 키메라와 유사하게 작용하였다(도 13; 표 6). 9G2 마우스 모 및 키메라는 본 검정에서 각각 세번째 및 네번째 순위였다.
표 6: KB 세포 중화 검정 - 인간 및 시노몰구스 OSM에 대한 10G8, 10G8 키메라, 9G2 & 9G2 키메라 활성을 순위화시키기 위한 KB 세포 중화 검정의 3회 반복의 요약. 항체 15E10을 비교 목적을 위해 추가하였다. 도구 항체를 음성 대조군으로 사용하였다.
Figure pct00007
25% 인간 AB 혈청의 존재하에서, 10G8, 10G8 키메라, 9G2 & 9G2 키메라는 인간 및 시노몰구스 OSM 둘 모두를 중화시키는 이들의 능력을 보유하였다(도 14). 활성의 일부 감소가 25% AB 혈청의 존재하에서 관찰되었다. IC50 값은 1 μg/ml 항체 시작 농도를 이용하여 계산될 수 없으나, 명백한 적정 중화 효과가 관련되지 않은 음성 대조군을 제외한 모든 항체에 대해 관찰되었다. 이러한 활성에서의 감소는 어느 정도까지는 상기 검정 판독을 간섭하는 AB 혈청으로 인한 것일 수 있다. 본 검정에서 비-인간 혈청에서보다 높은 IL-6 백그라운드 수준이 관찰되었다.
내인성 인간 OSM(gp130 검정):
10G8, 10G8 키메라, 9G2 & 9G2 키메라는 2개의 별개의 공여체로부터의 내인성 인간 OSM을 억제하였다(도 15). 이들 2 공여체에 대해, 10G8 및 10G8 키메라는 공통으로 첫번째 순위인 한편, 9G2 및 이의 키메라는 각각 세번째 및 네번째 순위였다(표 7). 이러한 자연 OSM이 건강한 인간 호중구의 GM-CSF-자극으로부터 생성되었다.
표 7: 내인성 OSM 인간 gp130 검정 - 내인성 인간 OSM에 대한 10G8, 10G8 키메라, 9G2 & 9G2 키메라 활성의 평가를 위한 gp130 ELISA에서의 2개의 호중구 공여체의 요약. 도구 항체를 음성 대조군으로 사용하였다.
Figure pct00008
인간 LIF 반응성(KB 세포 중화 검정):
인간 LIF는 인간 OSM에 대한 IL-6 패밀리의 가장 가깝게 관련된 일원이다. 인간 LIF KB 세포 검정의 3회 반복은 10G8, 10G8 키메라, 9G2, 및 9G2 키메라가 인간 LIF를 중화시키지 않은 것을 나타내었다. 시판되는 항-인간 LIF 항체는 본 검정에서 LIF를 중화시켰다(도 16). 이는 상기 항체들이 OSM-특이적인 것을 입증한다.
실시예 2: 인간화
2.1.1: 중쇄 인간화 방법
인간 V 유전자 점라인 데이터베이스의 BLAST 분석 후, 마우스 10G8 가변 중쇄 서열과 74%의 동일성(CDR을 포함함)을 갖는 인간 점라인 IGHV3_7)이 인간화를 위한 바람직한 수용체 프레임워크로 선택되었다. 점라인 V 영역을 적합한 FR4와 인 실리코로 조합시켰고, 이러한 경우 JH2 미니유전자(Kabat Vol.II)는 서열 유사성을 기초로 하였다. JH2 미니유전자 잔기의 처음 6개의 잔기는 공여 항체로부터의 도입 CDR에 의해 대체되는 CDR3 영역 내에 포함되었다. 3개의 인간화된 중쇄 변이체를 서열 비교 및 항체 기능에 대한 가능한 영향을 기초로 하여 생성시켰다. 작제물 HO는 10G8(케이뱃 정의를 이용함)으로부터 상기 선택된 인간 수용체 프레임워크로의 마우스의 직접 이식이었다. 작제물 H1 및 H2는 H0을 기초로 하며, 이들 둘 모두는 각각 위치 2 및 105에 각 작제물 내에서 상이한 하나의 추가 프레임워크 돌연변이를 포함한다.
2.1.2: 경쇄 인간화
인간 V 유전자 점라인 데이터베이스의 BLAST 분석 후, 마우스 10G8 가변 경쇄 서열과 64%의 동일성을 갖는 인간 점라인 IGKV4_1)(CDR을 포함함)을 인간화를 위한 바람직한 수용체 프레임워크로 선택하였다. 점라인 V 영역을 적합한 FR4와 함께 인 실리코로 조합시켰고, 이러한 경우, J-영역 카파 4 미니유전자(Kabat Vol. II)는 서열 유사성을 기초로 하였다. JK-4 미니유전자 잔기의 처음 2개의 잔기는 CDR3 영역 내에 해당하며, 마우스 10G8 경쇄 CDR3 내의 마지막 2개의 잔기와 동일하다. 5개의 인간화 경쇄 변이체를 서열 비교 및 항체 기능에 대한 가능한 영향을 기초로 하여 생성시켰다. 작제물 L0은 10G8(케이뱃 정의를 이용함)으로부터 상기 선택된 인간 수용체 프레임워크로의 마우스 CDR의 직접 이식이었다. 작제물 L1, L2 및 L3은 L0를 기초로 하며, 이들 각각은 위치 46, 84 및 103에 각 작제물 내에서 상이한 하나의 추가 프레임워크 돌연변이를 포함한다. 작제물 L4는 상기 역 돌연변이 3개 모두를 포함한다.
2.1.3: 인간화 벡터의 작제
인간화 가변 영역의 DNA 서열은 LETO 1.0 소프트웨어(Entelechon GmbH)를 이용하여 최적화된 서열이었고, 이는 중첩 올리고누클레오티드의 형성 및 PCR 증폭에 의해 새로이 합성되었다. 프라이머는 포유동물 발현 벡터로의 클로닝을 위한 제한 부위 및 분비를 위한 인간 면역글로불린 신호 서열을 포함하였다. 인간화 가변 중쇄 영역 H0-H2를 HindIII 및 SpeI을 이용하여 인간 감마 1 불변 영역을 함유하는 포유동물 발현 벡터로 클로닝하였다. 동시에, 인간화 가변 경쇄 영역 L0-L4를 HindIII 및 BsiWI를 이용하여 인간 카파 불변 영역을 함유하는 포유동물 발현 벡터로 클로닝하였다.
2.1.4: 인간화 변이체의 패널의 최초 스크리닝
인간화 변이체의 패널(3 중쇄 x 5 경쇄 = 15)을 스크린하고 협소화시키기 위해, 항체를 HEK 세포에서 발현시키고, BIACore, ELISA 및 기능 검정에 의해 평가하였다.
2.2: 인간화 10G8 항체 생물학적 검정: 키메라 대 인간화 mAb
2.2.1: 이차 스크린
표 9에 나열된 인간화 10G8 항체를 순위화시키기 위한 이차 스크리닝은 인간 OSM에 대해 BIACore 동역학 분석; 인간/시노몰구스 OSM을 이용한 인간 gp130 ELISA; 인간/시노몰구스 OSM을 이용한 KB 세포 중화 검정을 포함하였다. 상기에 더하여, 25% 인간 AB 혈청에서 gp130 결합을 차단하는 능력을 평가하였다.
BIACore 분석:
트랜스펙션 상층액에 대한 최초 BIACore 분석은 L1 및 L4 인간화 변이체가 L0, L2 및 L3 인간화 변이체보다 인간 OSM에 대해 더 높은 친화성을 가진 것을 나타내었다(표 8). 이들 경쇄 돌연변이는 직접-이식 단독(H0L0) 및 10G8 키메라와 비교하여 친화성을 개선시켰다. 중쇄 변이체 H1 및 H2는 직접-이식 HO에 비해 항체의 친화성에 거의 영향을 미치지 않았다.
스케일-업 정제된 L1 및 L4 변이체에 대한 분석은 인간 및 시노몰구스 OSM 둘 모두에 대한 상기 mAb의 친화성 사이에 매우 적은 차이가 존재하는 것을 나타내었다(표 9).
표 8: BIACore 동역학 - 10 G8 키메라에 비한 15개의 항- OSM 백-업 인간화 10G8 항체 트랜스펙션 상층액의 인간 OSM 결합 동역학.
Figure pct00009
표 9: BIACore 동역학 - 10 G8 키메라에 비한 항- OSM 인간화 10 G8 L1 및 L4 변이체 항체의 정제된 배치( batch )의 시노몰구스 및 인간 OSM 결합 동역학.
Figure pct00010
KB 세포 중화 검정:
KB 세포 중화 검정은 gp130 검정에 비해 감소된 양의 OSM을 이용한다(1 ng/ml 대 25ng/ml). 이는 상기 KB 세포 중화 검정을 저 친화성 중화제로부터 고 친화성 중화제를 분리시키기 위한 더욱 식별력이 있는 검정으로 만든다. 최초 H0, H1, H2, L0, L1, L2, L3 및 L4 변이체 작제물의 KB 세포 검정 스크린은 L1 작제에서의 우수성을 나타내었다(데이터는 제시하지 않음). BIACore 분석에서 잘 수행된 L4 변이체와 함께 이들은 추가 검정을 위해 더욱 큰 배치로 생성되었다. 상기 검정의 3회 반복으로부터, 인간화 10G8 L1 변이체가 첫번째 순위였고, 이는 인간 OSM에 대해 14ng/ml 및 시노몰구스에 대해 10ng/ml의 평균 IC50 값을 생성시켰다(도 17; 표 10).
표 10: KB 세포 중화 검정 - 인간 및 시노몰구스 OSM 에 대한 인간화 10 G8 L1 및 L4 변이체 활성을 순위화시키기 위한 KB 세포 중화 검정의 3회 반복의 요약.
Figure pct00011
인간화 10G8 L1 변이체가 L4 변이체에 비해 KB 세포 검정에서 더 큰 생물학적 활성을 나타냄에 따라 상기 인간화 10G8 L1 변이체를 추가 시험을 위해 선택하였다. L4 변이체는 CHO-E1a 시스템에서 매우 낮은 생성 수율을 가졌고, 이는 또한 이들을 추가 진행에서 제외되도록 하였다.
인간 gp130 ELISA :
인간 gp130 ELISA는 비교적 높은 수준의 OSM(25ng/ml)을 이용하며, 이는 리간드가 과량으로 존재함에 따라 낮은 친화성 항체로부터 높은 친화성 항체를 분리시키는 이의 능력을 감소시킨다. 인간화 10G8 L1 변이체를 이용한 상기 검정의 2회 반복 후, 3개 모두의 변이체는 본 검정에서 gp130 수용체에 대한 결합으로부터 인간 및 시노몰구스 OSM 둘 모두를 차단하는데 있어서 동일효능을 나타내었다(도 18). 인간 gp130 검정을 또한 25% 인간 AB 혈청의 존재하에서 수행하였다. 상기 검정의 2회 반복은 모든 항체, 인간화 10G8 H0L1, H1L1 및 H2L1 변이체가 gp130에 대한 결합으로부터 인간 및 시노몰구스 OSM을 차단하는 이들의 능력을 보유한 것을 나타내었다(데이터는 제시하지 않음).
2.3: 10G8 mAb-OSM 복합체의 Fab 단편 및 결정의 분리
2.3.2: Fab 단편의 생성
10G8 모 항체로부터의 Fab 단편을 20mM 포스페이트 완충액 pH 7, 10mM EDTA 및 10mM L-시스테인을 함유하는 완충액 중에서 37℃에서 20시간 동안 비드 고정된 파파인(Pierce 20341)을 이용한 분해에 의해 생성시켰다. 분해 후, 1회용 플라스틱 컬럼을 이용하여 비드를 분리시킨 후, 오염 Fc 단편 및 분해되지 않은 항체를 단백질 A 유형 크로마토그래피(MabSelect, GE Healthcare 17-5438-03)를 이용하여 Fab 단편으로부터 제거하였다. Fab 단편을 함유하는 결합되지 않은 분획을 이동상으로서 25mM HEPES pH 7.7, 150mM NaCl 완충액을 이용하여 Superdex 200pg 크기 배제 크로마토그래피(SEC)(GE Healthcare 17-1069-01)를 이용하여 추가로 정제하였다. 4℃에서 1.5시간 동안 1:1의 몰 비로 11.5mg의 정제된 Fab(GRITS30249)와 5.75mg의 재조합 OSM(GRITS23122)을 혼합하여 복합체를 제조하였다. 이후, 복합체를 Superdex 200pg SEC를 이용하여 복합체화되지 않은 물질로부터 정제하였다. 용해된 복합체를 10kmwco 막(Vivaspin VS2002)이 설비된 원심분리 농축 장치를 이용하여 44mg/ml의 전체 단백질(수득량 9.2mg)로 농축시켰다. 복합체 성분을 N-말단 서열분석, 질량분광법 및 SDS-PAGE를 이용하여 확인하였다. Fab 단편의 OSM 기능성 결합 활성을 gp130 억제 검정을 이용하여 확인하였다(데이터는 제시하지 않음).
2.3.2: 10G8-OSM 복합체 결정화
10G8 OSM Fab 단편을 OSM과 복합체화시키고, 이를 침전물로서 PEG3500을 이용하여 20℃에서 결정화시켰다. 결정화를 최적화시키고, 분석을 위해 유럽 싱크로트론 방사선 시설(European Synchrotron Radiation Facility, ESRF)에 보내고, 3.5Å에서 구조를 밝혀내었다. 10G8 mAb는 우수한 표면 상보성으로 OSM의 나선 B 및 C에 결합하였고, 순전히 입체구조적 방해에 의해 gp130 수용체 결합으로부터 OSM 부위 II를 차단하였고, 부위 II로부터의 임의의 잔기와 직접적인 상호작용은 없었다. 3.5Å에서 밝혀지는 경우 결합과 직접적으로 관련된 유일한 잔기(5Å 미만의 거리)가 표 11 및 도 19에 예시되어 있다. 경쇄는 상기 차단 효과 대부분을 담당하였다. 4개의 CDR은 직접적으로 또는 물 매개 상호작용을 통해 OSM, CDRH2, H3 및 CDRL1 및 L3의 나선 B 및 C에 결합하였다. 결합 10G8 mAb에 대해 OSM 분자의 유의한 왜곡이 없었다. CDR 중 2개인 CDRH1 및 L2가 비-결합임에 따라, 항체의 변이체를 제조하였고, 이들 중 하나 또는 둘 모두는 인간 서열로 다시 복귀되었다. 이는 직접 인간화 이식보다 덜 면역원성인 분자를 발생시킬 수 있다.
표 11:
Figure pct00012
2.3.3
2.3.4: 인간화 10G8 항체: 인간 CDR 치환
OSM과 복합체화된 항-OSM 10G8 mAb의 사내(in-house) 확인된 결정 구조는 CDRH1 및 CDRL2가 항원 결합에서 직접적으로 관련되지 않은 것으로 확인되었다. 상기 마우스 점라인 CDR을 대체하기 위해 적합한 인간 점라인 CDR을 선택하였다. 2개의 CDRH1 및 2개의 CDRL2 인간 점라인 서열을 항원 결합에 대한 이들의 효과에 대해 시험하였다. 중쇄 및 경쇄 CDR 둘 모두에 대해, 본래의 인간 점라인 수용체 프레임워크로부터의 서열을 시험(각각, IGHV3_7 및 IGKV4_1)하였고, 또한 CDR 및 플랭킹 프레임워크 상동성을 기초로 하여 선택된 2개의 추가 인간 점라인 서열을 시험(IGHV3_23 및 IGKV1_5)하였다. 인간 점라인 CDRH1 및 CDRL2 서열을 인간화 HO 및 L1 V-영역에서 각각의 마우스 CDR로 교환하였다. 새로운 V-영역을 단락 1.1.4에서와 같이 중첩 올리고누클레오티드의 형성 및 PCR 증폭에 의해 새로이 합성하였다.
2.4: 인간화 10G8 항체 생물학적 검정: 인간화 10G8 H0L1 mAb 대 인간화 비-결합 CDR을 갖는 인간화 10G8 mAb
2.4.1: 이차 스크린
BIACore 분석:
다양한 인간화 10G8 H0L1 CDRH1 및 CDRL2 작제물로부터의 트랜스펙션 상층액에 대한 BIACore 분석은 예비-후보 mAb의 인간 OSM 친화성을 완전히 보유한 유일한 항체가 H0(IGHV3_23)L1 분자인 것을 나타내었다(표 12). 다음으로 최적의 KD 값을 갖는 2개의 추가 분자 H0L1(IGKV4_1) 및 H0(IGHV3_23)L1(IGK4_1)과 함께 상기 작제물을 스케일-업 시키고, 추가 연구를 위해 정제하였다.
표 12: BIACore 동역학 - 10 G8 키메라와 비교한 항- OSM 백-업 인간화 10 G8 H0L1 CDRH1 및 CDRL2 변이체 항체의 트랜스펙션 상층액의 시노몰구스 및 인간 OSM 결합 동역학.
Figure pct00013
KB 세포 중화 검정:
KB 세포 중화 검정은 인간화 10G8 H0(IGHV3_23)L1 작제물(H0('CDRH1)L1로 표지됨)이 모 인간화 10G8 H0L1(H0L1로 표지됨) mAb에 대해 매우 유사한 효능을 나타내는 것을 나타내었다. 인간 서열에 대한 비-결합 CDRL2의 임의의 복귀는 H0L1(IGKV4_1)(표지된 H0L1(huCDRL2)) 및 H0(IGHV3_23)L1(IGK4_1)(표지된 H0(huCDRH1)L1(huCDRL2)) 항체에 대한 데이터로부터 관찰되는 바와 같이 중화 활성에서 감소를 나타내었다(도 20, 표 13).
표 13: KB 세포 중화 검정 - 인간 및 시노몰구스 OSM 에 대한 인간화 10 G8 H0L1 CDRH1 및 CDRL2 변이체 활성을 순위화시키기 위한 KB 세포 중화 검정의 3회 반복의 요약.
Figure pct00014
이들 데이터로부터, 완전한 특성규명을 위한 리드 예비-후보 mAb로서 인간화 10G8 H0(huCDRH1)L1을 선택하였다.
2.5: 인간화 10G8 항체 생물학적 검정: 인간화 10G8 H0(IGHV3_23)L1 mAb
2.5.1: 이차 스크린
BIACore 분석:
BIACore 분석을 정제된 H0(IGHV3_23)L1 mAb에서 수행하고, 10G8 키메라 및 인간화 10G8 H0L1 모 mAb에 대해 순위화시켰다. 인간 및 시노몰구스 OSM 둘 모두에 대한 친화성에서 H0(IGHV3_23)L1 mAb와 모 H0L1 mAb 사이에 차이가 거의 없거나 차이가 없었다(표 6). H0(IGHV3_23)L1 mAb는 대안적 비-경쟁 항-OSM 인간화 항체 15E10h에 비해 인간 OSM에 대해 6.5배(0.8 log) 증가된 친화성을 가졌다. OSM의 새로운 배치를 본 연구에 사용하였으나, 이는 낮은 KD 값을 발생시켰고, 인간화 변이체와 비-경쟁 항체 사이의 차이는 동일하게 유지되었다.
표 14: BIACore 동역학 - 10G8 키메라 및 인간화 10G8 H0L1 모 mAb 및 대안적 비-경쟁 항-OSM 인간화 항체 15E10h에 비한 정제된 H0(IGHV3_23)L1 mAb의 시노몰구스 및 인간 OSM 결합 동역학.
Figure pct00015
Kinexa 분석
Kinexa(Sapidyne Instruments 3200) 용액 상 친화성을 인간, 시노몰구스 마카크(cynomolgus macaque), 레서스 마카크(rhesus macaque) 및 마모셋 OSM에 대한 항-OSM 항체 H0(huCDRH1)L1 및 인간화 15E10(관련되지 않은 OSM 항체)의 전체 친화성을 결정하기 위해 이용하였다(표 15). 인간화 15E10을 비교 목적을 위해 추가하였다.
OSM 비드를 흡착(폴리메틸메타크릴레이트 비드-PMMA) 또는 아민 커플링(NHS-활성화 세파로스 비드)에 의해 제조하였다. 연구된 OSM 분자의 범위는 다양한 농도의 OSM으로 코팅된 비드의 생성을 필요로 하였다. 검정의 용액 상 부분에 대해, 고정된 농도의 항체를 광범위한 OSM 농도와 함께 인큐베이션하고, 분석을 진행시키기 전에 적어도 2시간 동안 실온에서 인큐베이션시켜 평형에 도달시켰다. 이후, OSM 비드를 형광 염료로 표지된 적절한 이차 항체(시험되는 작제물에 따라 항-인간 또는 항-마우스)를 이용하여 이후에 검출되는 OSM 비드 매트릭스에 대한 자유 항체 결합에 의해 용액상 샘플 내에 존재하는 자유 항체의 양을 결정하는데 사용하였다. 결합 곡선을 기계가 본래 갖는 Kinexa Pro 분석 소프트웨어를 이용하여 적합화시켰다. 다양한 시작 농도의 항체를 이용한 다수의 수행을 이후에 편집하고, n-곡선 분석 소프트웨어를 이용하여 분석하여, 더욱 정확한 친화성 결정을 제공하였다.
H0(huCDRH1)L1은 Biacore 분석에 의해 이전에 평가된 바와 같이 인간 OSM에 대해 더 높은 친화성을 나타내었다. 항체가 칩 표면에 결합된 Biacore와는 달리, Kinexa는 친화성을 평가하기 위해 유체 상태의 자유 항체 및 리간드를 이용하며, 이는 자연 상태에 더 가깝다.
표 15: Kinexa 동역학 - 정제된 항- OSM 백-업 항체 H0 ( huCDRH1 )L1 및 인간화 15E10의 인간, 시노몰구스 , 레서스 및 마모셋 OSM 결합 동역학.
** 친화성은 마모셋 OSM에 대해 매우 불량하며, 이는 수용체 유도 실험에 대해 uM 양의 OSM을 사용하는데 40nM를 초과하는 항체가 필요함을 의미한다.
종합적 결론은 마모셋 OSM에 대한 인간화된 15E10의 결합이 인간 OSM에 대한 것보다 현저히 불량하다는 것이다.
인간 gp130 ELISA :
인간 gp130 ELISA는 과량의 OSM(25ng/ml)을 이용하며, 따라서 이는 더 낮은 친화성 항체로부터 높은 친화성 항체를 분리시키는 이의 능력을 감소시킨다. gp130 검정의 3회 반복 후, 10G8 마우스 모, 10G8 키메라, 인간화 10G8 H0L1 모(H0L1) 및 H0(huCDRH1)L1이 모두 본 검정에서 gp130 수용체에 대한 결합으로부터 인간 및 시노몰구스 OSM 둘 모두를 차단하는데 효능이 있는 것을 확인하였다(도 21). 본 검정에서 항원의 높은 수준으로 인해, 명백한 순위가 식별될 수 없었다.
25% 인간 AB 혈청 및 25% 푸울링된 인간 윤활액의 존재하에서 인간 gp130 검정을 반복하였다. 각 매트릭스에 대한 본 검정의 3회 반복은 15E10h와 함께 모든 항체, 10G8 마우스 모, 10G8 키메라, 인간화 10G8 H0L1 모(H0L1) 및 H0(huCDRH1)L1이 gp130에 대한 결합으로부터 인간 및 시노몰구스 OSM을 차단하는 이들의 능력을 보유한 것을 나타내었다(데이터는 제시하지 않음).
KB 세포 중화 검정:
KB 세포 중화 검정은 낮은(1 ng/ml) 수준의 OSM이 사용됨으로 인해, gp130 검정보다 낮은 친화성 중화제로부터 높은 친화성 중화제를 분리시키기 위한 더욱 식별력이 있는 검정이다. 상기 검정의 3회 반복으로부터, (H0(huCDRH1)L1은 인간 OSM에 대해 30ng/ml, 시노몰구스 OSM에 대해 41 ng/ml, 및 마모셋 OSM에 대해 36ng/ml의 평균 IC50 값을 제공하였다(도 22; 표 17).
표 17: KB 세포 중화 검정 - 인간, 시노몰구스 및 마모셋 OSM 에 대한 H0(huCDRH1)L1 활성을 순위화시키기 위한 KB 세포 중화 검정의 3회 반복의 요약. 15E10h를 비교 목적을 위해 추가하였다.
Figure pct00017
25% 인간 AB 혈청 또는 25% 푸울링된 인간 윤활액의 존재하에서, (H0(huCDRH1)L1 및 15E10h는 인간 및 시노몰구스 OSM 둘 모두를 중화시키는 이들의 능력을 보유하였다(도 23). 활성에서의 일부 저하가 25% AB 혈청 또는 25% 푸울링된 윤활액의 존재하에서 관찰되었다. 이는 상기 검정 판독을 방해하는 상기 매트릭스로 인한 것일 가능성이 가장 크다. 일반 검정보다 본 검정에서 더 높은 IL-6 백그라운드 수준이 관찰되었다.
15E10h와는 달리, H0(huCDRH1)L1은 KB 세포 중화 검정에서 마모셋 OSM을 중화시키는 것으로 밝혀졌다. 3개의 추가 항-인간 OSM 항체의 패널 10D3DLE, OM4.11.17 및 OM4.11.31은 또한 마모셋 OSM을 중화시키는데 실패하였다.
내인성 인간 OSM gp130 검정:
10G8 마우스 모, 10G8 키메라, 인간화 10G8 H0L1 모(H0L1) 및 H0(huCDRH1)L1 뿐만 아니라 15E10h는 4개의 별개의 공여체로부터의 내인성 인간 OSM을 억제하였다(도 24). 상기 4개의 공여체의 결과로부터, H0L1 모와 H0(huCDRH1)L1 mAb 사이에 거의 차이가 없었고; 이들은 10G8 마우스 모 및 이의 키메라보다 순위가 높았다(표 18). H0(huCDRH1)L1은 15E10h에 비해 효능에 있어서 약 12배(1.09 log) 증가를 가졌다. 자연 OSM을 건강한 인간 호중구의 GM-CSF-자극으로부터 발생시켰다.
표 18: 내인성 OSM 인간 gp130 검정 - 내인성 인간 OSM 에 대한 10 G8 마우스 모, 10 G8 Ch , 인간화 10 G8 H0L1 모( H0L1 ) 및 H0 ( huCDRH1 )L1 활성을 평가하기 위한 gp130 ELISA 에서의 4개의 호중구 공여체의 요약. 15 E10h 를 비교 목적을 위해 추가하였다. 관련되지 않은 항체를 음성 대조군으로 사용하였다.
Figure pct00018
인간 LIF 반응성( KB 세포 중화 검정):
인간 LIF는 인간 OSM에 대한 IL-6 패밀리의 가장 가깝게 관련된 일원이다. 인간 LIF KB 세포 검정의 3회 반복은 10G8 마우스 모, 10G8 키메라, 인간화 10G8 H0L1 모(H0L1) 및 H0(huCDRH1)L1 또는 15E10h가 인간 LIF를 중화시키지 않은 것을 나타내었다. 15E10h가 비교 목적을 위해 추가되었다. 시판되는 항-인간 LIF 항체는 본 검정에서 LIF를 중화시켰다(도 25). 이는 상기 항체가 OSM-특이적인 것을 입증한다.
일차 인간 간세포 검정:
인간 일차 간세포는 OSM에 민감하며, OSM 자극에 반응하여 급성기 단백질, 예를 들어, SAA 및 CRP를 방출한다. H0(huCDRH1)L1은 3개의 별개의 공여체로부터 용량 의존성 방식으로 간세포에서의 인간 OSM-유도성 SAA(도 26) 및 CRP(도 27) 방출을 억제하였다. 인간화 15E10을 비교 목적을 위해 추가하였다.
다른 일차 인간 세포 유형을 이용하여 동등한 검정을 수행하였다. 이들은 인간 제정맥 내피세포; 류머티스 관절염 환자로부터의 인간 섬유모세포 유사 윤활막세포; 건강한 사람 및 특발성 폐 섬유증 환자로부터의 인간 폐 섬유모세포를 포함하였다(데이터는 제시하지 않음). 이전 검정과 같이, H0(huCDRH1)L1은 인간화 15E10에 비해 OSM의 우수한 중화를 나타낸다. H0(huCDRH1)L1과 인간화 15E10 사이의 효능의 배수 차이는 세포주 및 OSM 농도에 따라 다양하다.
2.6: 생물리학적 특징
H0(huCDRH1)L1의 기본 생물리학적 프로파일을 인간화 10G8 H0L1 모 mAb와 함께 수행하였다. 항체를 하기와 같은 환경 스트레스에 적용시켰다:
- 4℃ 또는 37℃에서 14일 동안의 인큐베이션에 의한 온도;
- 5회의 동결-해동 주기;
- 48시간 동안 37℃에서 1% 중탄산암모늄과의 인큐베이션에 의한 강제화된 탈아미드화.
어떠한 항체도 상기 언급된 스트레스 후 생물리학적 변경에서의 손실 또는 활성에서의 손실을 나타내지 않았다.
2.6: CDRH3 변이체 인간화 항체
2.6.1: CDRH3 변이체 인간화 항체의 작제
CDRH3(SEQ ID NO:3)의 각각의 잔기의 대안적 아미노산 잔기로의 치환을 기본 분자로서 pTT 플라스미드(National Research Council Canada, 변형된 다수 클로닝 부위(Multiple Cloning Site, MCS)를 가짐)에서 중쇄 HO(IGHV3_23) 전장 서열 SEQ ID NO:75(가변 서열: SEQ ID NO:74)를 이용하여 수행하였다. 부위-특이적 돌연변이유발 기술(SDM)을 사용하였고, 이에 의해 아미노산 치환 위치에 서열 NNK(N = A/T/G/C; K = G 또는 T)를 갖는 올리고누클레오티드가 설계된다. 중합효소 연쇄반응(PCR)을 사용하여 변화를 함유하는 새로운 플라스미드를 생성시켰고, 아미노산 변화를 갖는 클론을 확인하기 위해 DNA 서열분석을 수행하였다. 이러한 방식으로, 12개의 CDRH3 위치 각각에서 10 내지 17개의 상이한 아미노산을 갖는 변이체를 분리하였다. HO(IGHV3_23) 변이체를 포함하는 pTT 벡터를 L1 경쇄(SEQ ID NO:72)와 함께 공동 트랜스펙션시키고, 결합에 대해 상층액을 시험함으로써 CDRH3 변이체 항체를 생성시켰다.
164개의 CDRH3 변이체를 생성시키고, 이후의 분석에서 시험하였다(2.6.2 및 2.6.3 참조).
2.6.2: HEK 293 6E 세포에서의 CDRH3 변이체 발현
중쇄(HO (IGHV3_23)) CDRH3 변이체 및 경쇄 L1을 엔코딩하는 pTT 플라스미드를 HEK 293 6E 세포에 일시적으로 공동 트랜스펙션시키고, 작은 규모로 발현시켜 항체를 생성시켰다. 조직 배양 상층액으로부터 항체를 직접 평가하였다.
2.6.3: CDRH3-변이체 조직 배양 상층액의 동역학 분석
CDRH3 스크린에 대한 최초 동역학 분석을 ProteOn XPR36(Biorad Laboratories)에서 수행하였고, BiaCore T100에서의 더욱 정확한 동역학 분석을 위해 특정 상층액을 선택하였다.
ProteOn 분석을 위해, 항-인간 IgG(GE Healthcare/Biacore BR-1008-39)를 일차 아민 커플링에 의해 GLM 칩(Biorad Laboratories 176-5012)에 커플링시켰다. CDRH3 변이체를 상기 표면에 직접 포획시키고, 재조합 인간 OSM을 256, 64, 16, 4 및 1 nM과 함께 이중 곡선을 이중 참조하기 위해 사용되는 완충 주입액 단독(즉, OnM)으로 포획된 항체 표면 상에 통과시켰다. OSM 결합 사건 후, 포획 표면을 3M MgCl2를 이용하여 재생시켰고, 재생은 또 다른 주기의 포획 및 결합 분석을 준비하기 위해 이전에 포획된 항체를 제거하였다. 이후, 데이터를 ProteOn 분석 소프트웨어 고유의 1:1 모델(물질 전달(mass transport)을 가짐)에 적합화시켰다. 작업을 HBS-EP(Biacore/GE-Healthcare BR-1006-69)를 이용하여 수행하였고, 분석 온도는 25℃였다.
Biacore T100을 이용하여 작제물의 분석을 위해 유사한 방법을 이용하였으며, 항-인간 IgG(GE Healthcare/Biacore BR-1008-39)를 일차 아민 커플링에 의해 CM5 칩(GE Healthcare/Biacore BR-1006-68)에 커플링시켰고, 항체를 상기 표면에 포획시켰고, 재조합 인간 OSM을 256, 64, 16, 4 및 1 nM과 함께 결합 곡선을 이중 참조하는데 사용되는 완충액 주입 단독(즉, 0nM)으로 포획된 항체 표면 상을 통과시켰다. 3M MgCl2 또는 100mM 인산의 펄스를 이용하거나 둘 모두의 시약을 이용하여 재생시켰다. 데이터를 Biacore T100 분석 소프트웨어 고유의 1:1 모델에 적합시켰다. 작업을 HBS-EP(Biacore/GE-Healthcare BR-1006-69)를 이용하여 수행하였고, 분석 온도는 25℃였다. 결합 데이터 결과에 대해서는 도 33을 참조하라.
서열 요약 (표 A)
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021

서열 목록
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Figure pct00025
Figure pct00026
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Figure pct00028
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Figure pct00035
Figure pct00036
Figure pct00037
SEQUENCE LISTING <110> Glaxo Group Limited <120> ANTIGEN BINDING PROTEINS <130> PB63694 <160> 84 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Murine <400> 1 Asn Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Murine <400> 2 Thr Ile Ser Asp Gly Gly Ser Phe Thr Tyr Tyr Leu Asp Asn Val Arg 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Murine <400> 3 Asp Val Gly His Thr Thr Phe Trp Tyr Phe Asp Val 1 5 10 <210> 4 <211> 15 <212> PRT <213> Murine <400> 4 Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Ala Ala Gly Tyr Asn Phe Met His 1 5 10 15 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Murine <400> 5 Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Murine <400> 6 Leu His Ser Arg Glu Phe Pro Phe Thr 1 5 <210> 7 <211> 5 <212> PRT <213> Murine <400> 7 Ser Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 8 <211> 17 <212> PRT <213> Murine <400> 8 Thr Ile Ser Asp Gly Gly Ser Phe Thr Tyr Tyr Phe Ala Asn Ile Gln 1 5 10 15 Gly <210> 9 <211> 12 <212> PRT <213> Murine <400> 9 Asp Val Gly Leu Thr Thr Phe Trp Tyr 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<212> PRT <213> Murine <400> 20 Thr Ile Ser Asp Gly Gly Ser Phe Thr Tyr Tyr Leu Asp Asn Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 21 <211> 12 <212> PRT <213> Murine <400> 21 Asp Val Gly His Thr Thr Phe Trp Tyr Phe Asp Val 1 5 10 <210> 22 <211> 15 <212> PRT <213> Murine <400> 22 Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Ala Ser Gly Tyr Asn Phe Met His 1 5 10 15 <210> 23 <211> 7 <212> PRT <213> Murine <400> 23 Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser 1 5 <210> 24 <211> 9 <212> PRT <213> Murine <400> 24 Gln His Ser Arg Glu Phe Pro Phe Thr 1 5 <210> 25 <211> 363 <212> DNA <213> Murine <400> 25 gaaatgcaac tggtggagtc tggggaaggc ttagtggagc ctggagggtc cctgaaactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt aactatgcca tgtcttgggt tcgccagact 120 ccggaaaaga gcctggagtg ggtcgcaacc attagtgatg gtggtagttt cacctactat 180 ctagacaatg taaggggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caacctgtat 240 ttgcaaatga gccatttgaa gtctgacgac acagccatgt attactgtgc aagagatgtg 300 ggacatacta ccttttggta cttcgatgtc tggggctcag ggaccgcggt caccgtctcc 360 tca 363 <210> 26 <211> 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and Mus musculus <400> 74 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Asp Gly Gly Ser Phe Thr Tyr Tyr Leu Asp Asn Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Val Gly His Thr Thr Phe Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly 100 105 110 Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 75 <211> 1353 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens and Mus musculus <400> 75 gaggtgcagc tggtggaaag cggcggcggc ctggtccagc ccggcgggag cctgagactc 60 tcttgcgccg ctagcggctt caccttcagc agctacgcca tgagctgggt gaggcaggcc 120 cccggcaagg gcctggagtg ggtggccacc atcagcgacg gcggcagctt cacctactat 180 ctggacaacg tgaggggcag gttcaccatc agcagggaca acgccaagaa cagcctgtac 240 ctgcagatga acagcctgag ggccgaggat accgccgtgt actactgcgc cagggacgtc 300 ggccacacca ccttctggta cttcgacgtc tggggcaggg gcacactagt gaccgtgtcc 360 agcgccagca ccaagggccc cagcgtgttc cccctggccc ccagcagcaa gagcaccagc 420 ggcggcacag ccgccctggg ctgcctggtg aaggactact tccccgaacc ggtgaccgtg 480 tcctggaaca gcggagccct gaccagcggc gtgcacacct tccccgccgt gctgcagagc 540 agcggcctgt acagcctgag cagcgtggtg accgtgccca gcagcagcct gggcacccag 600 acctacatct gtaacgtgaa ccacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaggtggag 660 cccaagagct gtgacaagac ccacacctgc cccccctgcc ctgcccccga gctgctggga 720 ggccccagcg tgttcctgtt cccccccaag cctaaggaca ccctgatgat cagcagaacc 780 cccgaggtga cctgtgtggt ggtggatgtg agccacgagg accctgaggt gaagttcaac 840 tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcacaat gccaagacca agcccaggga ggagcagtac 900 aacagcacct accgggtggt gtccgtgctg accgtgctgc accaggattg gctgaacggc 960 aaggagtaca agtgtaaggt gtccaacaag gccctgcctg cccctatcga gaaaaccatc 1020 agcaaggcca agggccagcc cagagagccc caggtgtaca ccctgccccc tagcagagat 1080 gagctgacca agaaccaggt gtccctgacc tgcctggtga agggcttcta ccccagcgac 1140 atcgccgtgg agtgggagag caacggccag cccgagaaca actacaagac caccccccct 1200 gtgctggaca gcgatggcag cttcttcctg tacagcaagc tgaccgtgga caagagcaga 1260 tggcagcagg gcaacgtgtt cagctgctcc gtgatgcacg aggccctgca caatcactac 1320 acccagaaga gcctgagcct gtcccctggc aag 1353 <210> 76 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens and Mus musculus <400> 76 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Asp Gly Gly Ser Phe Thr Tyr Tyr Leu Asp Asn Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Val Gly His Thr Thr Phe Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly 100 105 110 Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Pro Gly Lys 450 <210> 77 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 77 Ser Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 78 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 78 Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser 1 5 <210> 79 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens and Mus musculus <400> 79 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Arg Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Met 50 55 60 Ser Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Lys Ser Pro Asn Ser Asn Phe Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Arg 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 80 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens and Mus musculus <400> 80 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Glu 35 40 45 Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr 115 120 125 Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 140 Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 145 150 155 160 Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 180 185 190 Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 195 200 205 Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 81 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens and Mus musculus <400> 81 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Arg Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Met 50 55 60 Ser Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Lys Ser Pro Asn Ser Asn Phe Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Arg 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 82 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens and Mus musculus <400> 82 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Glu 35 40 45 Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 83 <211> 759 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 83 atgggggtac tgctcacaca gaggacgctg ctcagtctgg tccttgcact cctgtttcca 60 agcatggcga gcatggcggc tataggcagc tgctcgaaag agtaccgcgt gctccttggc 120 cagctccaga agcagacaga tctcatgcag gacaccagca gactcctgga cccctatata 180 cgtatccaag gcctggatgt tcctaaactg agagagcact gcagggagcg ccccggggcc 240 ttccccagtg aggagaccct gagggggctg ggcaggcggg gcttcctgca gaccctcaat 300 gccacactgg gctgcgtcct gcacagactg gccgacttag agcagcgcct ccccaaggcc 360 caggatttgg agaggtctgg gctgaacatc gaggacttgg agaagctgca gatggcgagg 420 ccgaacatcc tcgggctcag gaacaacatc tactgcatgg cccagctgct ggacaactca 480 gacacggctg agcccacgaa ggctggccgg ggggcctctc agccgcccac ccccacccct 540 gcctcggatg cttttcagcg caagctggag ggctgcaggt tcctgcatgg ctaccatcgc 600 ttcatgcact cagtggggcg ggtcttcagc aagtgggggg agagcccgaa ccggagccgg 660 agacacagcc cccaccaggc cctgaggaag ggggtgcgca ggaccagacc ctccaggaaa 720 ggcaagagac tcatgaccag gggacagctg ccccggtag 759 <210> 84 <211> 252 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 84 Met Gly Val Leu Leu Thr Gln Arg Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala 1 5 10 15 Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met Ala Ala Ile Gly Ser Cys Ser 20 25 30 Lys Glu Tyr Arg Val Leu Leu Gly Gln Leu Gln Lys Gln Thr Asp Leu 35 40 45 Met Gln Asp Thr Ser Arg Leu Leu Asp Pro Tyr Ile Arg Ile Gln Gly 50 55 60 Leu Asp Val Pro Lys Leu Arg Glu His Cys Arg Glu Arg Pro Gly Ala 65 70 75 80 Phe Pro Ser Glu Glu Thr Leu Arg Gly Leu Gly Arg Arg Gly Phe Leu 85 90 95 Gln Thr Leu Asn Ala Thr Leu Gly Cys Val Leu His Arg Leu Ala Asp 100 105 110 Leu Glu Gln Arg Leu Pro Lys Ala Gln Asp Leu Glu Arg Ser Gly Leu 115 120 125 Asn Ile Glu Asp Leu Glu Lys Leu Gln Met Ala Arg Pro Asn Ile Leu 130 135 140 Gly Leu Arg Asn Asn Ile Tyr Cys Met Ala Gln Leu Leu Asp Asn Ser 145 150 155 160 Asp Thr Ala Glu Pro Thr Lys Ala Gly Arg Gly Ala Ser Gln Pro Pro 165 170 175 Thr Pro Thr Pro Ala Ser Asp Ala Phe Gln Arg Lys Leu Glu Gly Cys 180 185 190 Arg Phe Leu His Gly Tyr His Arg Phe Met His Ser Val Gly Arg Val 195 200 205 Phe Ser Lys Trp Gly Glu Ser Pro Asn Arg Ser Arg Arg His Ser Pro 210 215 220 His Gln Ala Leu Arg Lys Gly Val Arg Arg Thr Arg Pro Ser Arg Lys 225 230 235 240 Gly Lys Arg Leu Met Thr Arg Gly Gln Leu Pro Arg 245 250

Claims (29)

  1. 온코스타틴 M(OSM)에 특이적으로 결합하고, gp130 수용체에 대한 OSM의 결합을 억제하지만, 부위 II 잔기와 직접적으로 상호작용하지 않는, 항원 결합 단백질.
  2. 제 1항에 있어서, 항원 결합 단백질이 잔기 Q20, G120, Q16, N124 중 어느 하나에 직접 결합하지 않는 항원 결합 단백질.
  3. 제 1항에 있어서, 인간 OSM의 잔기 82, 83, 84, 90, 94, 112, 115, 122, 123, 152 중 하나 이상과 상호작용하는 항원 결합 단백질.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 단백질이 SEQ ID NO:3의 CDRH3 또는 SEQ ID NO:3의 변이체를 포함하며, 상기 SEQ ID NO:3의 변이체가 하기 중 하나 이상을 포함하는 항원 결합 단백질:
    Ala, Glu, Gly, His, Leu, Met, Pro, Gln, Ser, Thr, 또는 Val으로 치환된 위치 95;
    Ala, Cys, Phe, Gly, His, Lys, Leu, Ser, Thr, Trp 또는 Tyr으로 치환된 위치 96;
    Ala, Cys, Phe, Met 또는 Ser으로 치환된 위치 97;
    Ala, Asp, Phe, Gly, Leu, Pro, Gln 또는 Trp으로 치환된 위치 98;
    Ala, Cys, Pro, Ser, Val 또는 Tyr으로 치환된 위치 99;
    Glu로 치환된 위치 100B;
    Ala, Glu, Phe, Gly, Val 또는 Trp으로 치환된 위치 100C;
    Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, Leu, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr으로 치환된 위치 100D;
    Glu, Gly, Ser, Thr 또는 Val으로 치환된 위치 101;
    Ala, Phe, Gly, Leu, Pro, Gln, Arg, Ser, Tyr, His, Ile, Asp 또는 Trp으로 치환된 위치 102.
  5. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 단백질이 하기를 포함하는 항원 결합 단백질:
    i) SEQ ID NO:3에 기재된 CDRH3, 또는 Val 102가 Tyr, His, Ile, Ser, Asp 또는 Gly으로 치환된 SEQ ID NO:3의 변이체;
    ii) SEQ ID NO:2에 기재된 CDRH2, 또는 Thr50이 Gly, Tyr, Phe, Ile, Glu 또는 Val으로 치환되고/되거나, Ile51이 Leu, Val, Thr, Ser 또는 Asn으로 치환되고/되거나, Ser52가 Phe, Trp 또는 His로 치환되고/되거나, Gly53이 Asp, Ser 또는 Asn으로 치환되고/되거나, Gly54가 Ser으로 치환되고/되거나, Phe56이 Ser, Tyr, Thr, Asn, Asp 또는 Arg로 치환되고/되거나, Tyr58이 Gly, His, Phe, Asp 또는 Asn으로 치환된 SEQ ID NO:2의 변이체;
    iii) SEQ ID NO:4에 기재된 CDRL1, 또는 Ser27A가 Asn, Asp, Thr 또는 Glu로 치환되고/되거나, Ser27C이 Asp, Leu, Tyr, Val, Ile, Asn, Phe, His, Gly 또는 Thr으로 치환되고/되거나, Asn31이 Ser, Thr, Lys 또는 Gly으로 치환되고/되거나, Phe32가 Tyr, Asn, Ala, His, Ser 또는 Arg로 치환되고/되거나, Met33이 Leu, Val, Ile 또는 Phe로 치환된 SEQ ID NO:4의 변이체;
    iv) SEQ ID NO:6에 기재된 CDRL3, 또는 Leu89가 Gln, Ser, Gly 또는 Phe로 치환되고/되거나, His90이 Gln 또는 Asn으로 치환되고/되거나, Ser91이 Asn, Phe, Gly, Arg, Asp, His, Thr, Tyr 또는 Val으로 치환되고/되거나, Arg92가 Asn, Tyr, Trp, Thr, Ser, Gln, His, ala 또는 Asp로 치환되고/되거나, Glu93이 Asn, Gly, His, Thr, Ser, Ar 또는 Ala로 치환되고/되거나, Phe96이 Pro, Leu, Tyr, Arg, Ile 또는 Trp으로 치환된 SEQ ID NO:6의 변이체.
  6. 제 5항에 있어서, 항원 결합 단백질이 하기를 추가로 포함하는 항원 결합 단백질:
    i) SEQ ID NO:1에 기재된 CDRH1, 또는 Tyr32가 Ile, His, Phe, Thr, Asn, Cys, Glu 또는 Asp로 치환되고/되거나, Ala33이 Tyr, Trp, Gly, Thr, Leu 또는 Val으로 치환되고/되거나, Met34가 Ile, Val 또는 Trp으로 치환되고/되거나, Ser35가 His, Glu, Asn, Gln, Tyr 또는 Thr으로 치환된 SEQ ID NO:1의 변이체;
    ii) SEQ ID NO:5에 기재된 CDRL2.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 단백질이 SEQ ID NO:3의 CDRH3, SEQ ID NO:2의 CDRH2, SEQ ID NO:4의 CDRL1, 및 SEQ ID NO:6의 CDRL3를 포함하는 항원 결합 단백질.
  8. 제 7항에 있어서, 항원 결합 단백질이 SEQ ID NO:1의 CDRH1 및 SEQ ID NO:5의 CDRL2를 추가로 포함하는 항원 결합 단백질.
  9. 제 8항에 있어서, 항원 결합 단백질이 하기를 포함하는 항원 결합 단백질:
    i) SEQ ID NO:3에 기재된 CDRH3;
    ii) SEQ ID NO:1에 기재된 CDRH1;
    iii) SEQ ID NO:2에 기재된 CDRH2;
    iv) SEQ ID NO:4에 기재된 CDRL1;
    v) SEQ ID NO:5에 기재된 CDRL2;
    vi) SEQ ID NO:6에 기재된 CDRL3; 및
    vii) 하기 잔기를 포함하는 중쇄 프레임워크:
    위치 2 Val, Ile 또는 Gly,
    위치 4 Leu 또는 Val,
    위치 20 Leu, Ile, Met 또는 Val,
    위치 22 Cys,
    위치 24 Thr, Ala, Val, Gly 또는 Ser,
    위치 26 Gly,
    위치 29 Ile, Phe, Leu 또는 Ser,
    위치 36 Trp,
    위치 47 Trp,
    위치 48 Ile, met, Val 또는 Leu,
    위치 69 Ile, Leu, Phe, Met 또는 Val,
    위치 71 Arg,
    위치 78 Ala, Leu, Val, Tyr 또는 Phe,
    위치 80 Leu, Met,
    위치 90 Tyr 또는 Phe,
    위치 92 Cys,
    위치 94 Arg, Lys, Gly, Ser, His 또는 Asn.
  10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 단백질이 CDRH1 또는 CDRL2를 통해 OSM과 직접적으로 상호작용하지 않는 항원 결합 단백질.
  11. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO:73에 의해 엔코딩되는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:71에 의해 엔코딩되는 경쇄 가변 영역을 추가로 포함하는 항원 결합 단백질.
  12. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO:74의 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:72의 경쇄 가변 영역을 추가로 포함하는 항원 결합 단백질.
  13. 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 단백질이 인간화 항체인 항원 결합 단백질.
  14. 제 13항에 있어서, 항체가 IgG1인 항원 결합 단백질.
  15. 제 13항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, OSM에 결합하는 경우, 공동 결정이 대략 a=168.525A, b=81.614A, c=55.540A 및 베타=106.60도의 치수를 갖는 유닛 셀(unit cell)을 포함하는 항원 결합 단백질.
  16. 항원 결합 단백질이 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody), 테트라바디(tetrabody), 미니항체(miniantibody), 미니바디(minibody), 분리된 VH 또는 분리된 VL인 단편인, 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항의 CDR을 포함하는 항원 결합 단백질.
  17. 제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 단백질이 비-인간 영장류 OSM에 추가로 결합하는 항원 결합 단백질.
  18. 제 1항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 단백질이 40pm 미만의 친화성으로 OSM에 결합하는 항원 결합 단백질.
  19. 제 1항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 단백질이 경쟁 ELISA 검정에서 SEQ ID NO:79의 중쇄 및 SEQ ID NO:80의 경쇄를 갖는 항체와 경쟁하지 않는 항원 결합 단백질.
  20. 제 1항 내지 제 19항 중 어느 한 항의 항원 결합 단백질과 경쟁하는 항원 결합 단백질.
  21. Biacore 또는 kinexa에 의해 측정시 1 nM보다 강한 친화성으로 마모셋(Marmoset) 및 인간 OSM 둘 모두에 결합하는 항원 결합 단백질.
  22. 적어도 하나의 발현 카세트를 포함함으로써, 이러한 발현 카세트가 제 12항에 따른 항원 결합 단백질의 중쇄를 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 포함하고, 제 12항에 따른 항원 결합 단백질의 경쇄를 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 추가로 포함하는, 재조합의 형질전환되거나, 트랜스펙션되거나, 형질도입된 숙주 세포.
  23. 제 22항에 있어서, 세포가 포유동물 세포인 숙주 세포.
  24. 제 23항에 있어서, 세포가 CHO 또는 NSO인 숙주 세포.
  25. 제 1항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 단백질 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물.
  26. 제 25항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 염증성 장애 또는 질병에 걸린 인간 환자를 치료하는 방법.
  27. 염증성 관절병증(inflammatory arthropathy), 류머티스 관절염(rheumatoid arthritis), 골관절염(osteoarthritis), 특발성 폐 섬유증(idiopathic pulmonary fibrosis, IPF), 전신경화증(Systemic sclerosis), 쇼그렌 증후군(Sjogrens syndrome), 피부경화증(Scleroderma) 및/또는 건선(psoriasis)에 걸린 인간 환자를 치료하는데 있어서 청구항 25항의 조성물의 용도.
  28. a) 키메라 또는 인간화 항체를 생성시키기 위해 인간 수용체 프레임워크로 하나 이상의 비-인간 CDR을 통합시키는 단계;
    b) 키메라 또는 인간화 항체를 이의 항원에 결합시키는 단계;
    c) 항원에 결합된 항체의 에피토프/파라토프(paratope) 구조를 결정하는 단계;
    d) 항원에 대한 결합에 직접적으로 관련된 항체의 잔기를 결정하는 단계;
    e) 단계 (d)에서 관련되지 않은 잔기 중 하나 이상을 인간 점라인(germline) 서열로 돌연변이시키는 단계; 및
    f) 상기 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 비-인간 항체 또는 이의 항체 단편을 인간화시키는 방법.
  29. 제 28항의 방법에 의해 수득가능한 항체.
KR1020137016213A 2010-11-23 2011-11-21 온코스타틴 ｍ (ｏｓｍ)에 대한 항원 결합 단백질 Ceased KR20130119948A (ko)

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