KR20160082017A

KR20160082017A - 효소 및 초고압 추출법을 이용한 톳 추출물의 제조방법

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Publication number: KR20160082017A
Application number: KR1020140193618A
Authority: KR
Inventors: 윤광섭; 최면
Original assignee: 대구가톨릭대학교산학협력단
Priority date: 2014-12-30
Filing date: 2014-12-30
Publication date: 2016-07-08

Abstract

본 발명은 톳 분말에 물 및 효소를 첨가한 후 초고압 추출하여 제조하는 것을 특징으로 하는 수용성 다당류의 추출 수율 및 항산화 활성이 증진된 톳 추출물의 제조방법, 상기 방법으로 제조된 톳 추출물 및 상기 톳 추출물을 함유하는 가공식품에 관한 것이다.

Description

효소 및 초고압 추출법을 이용한 톳 추출물의 제조방법{Method for producing Hijikia fusiforme extract using enzyme and high hydrostatic pressure extraction technique}

다당류(polysaccharide)란 단당(monosaccharide)이 복수로 결합된 소재라고 정의할 수 있으며, 건강기능식품, 의료용품, 화장품 등 다양한 분야에서 활용되고 있으며 특히 기능성 건강식품 분야를 비롯해 미용, 의료분야에 주로 활용되고 있으며 대표적인 소재로는 히알루론산(hyaluronic acid), 베타글루칸(β-glucan), 후코이단(fucoidan) 등이 널리 사용되고 있다.

해조 유래 기능성 소재로서 대표적인 해조류 다당류는 알긴산(alginic acid), 카라기난(carrageenan), 한천(agar), 후코이단(fucoidan)이 보고되어 있으며, 건강기능성 분야에서 각광받는 새로운 기능성 물질을 함유하고 있어 해조자원의 고부가가치 창출 및 그에 따른 활용도가 높은 자원으로 인식되고 있다. 또한 육상생물과는 다른 생리활성 물질을 함유하고 있으며, 새로운 다당류를 포함한 생리활성 물질로서 항종양성, 항바이러스성, 항혈액응고 및 면역력 증가 등의 다양한 생리활성기능을 갖는 것으로 알려지고 있다.

한편, 톳(Hijikia fusiforme, Tott)은 우리나라의 중남 이남부에 분포하고, 특히 제주도와 서남해안에서 많이 생산되며 갈조류 모자반과에 속하며 형태는 원주상의 줄기로 체장 20~100 cm까지 성장하는 다년생 해조류이다. 톳은 독특한 맛과 함께 칼슘, 비타민 A 및 식이섬유소 함량이 풍부하여 당뇨병, 고혈압 예방, 대장암 및 변비 등에 효과가 좋으며 요오드 성분 함량이 많아 갑상선암 및 각기병 예방에 효과가 있다고 알려져 있다.

일반적으로 해조류의 유용성분을 추출할 때에는 열수 추출이나 산, 알칼리 또는 효소처리 등에 의하여 추출하는 방법을 사용하고 있다. 하지만, 그 중 효소적 방법은 특정한 결합만을 가수분해시킬 수 있는 장점을 갖고 있으나, 효소 확보의 어려움, 효소반응을 위한 고분자 다당체의 낮은 용해도 그리고 산업화 공정에서 효소사용으로 인한 높은 생산 단가 등 실용화에 제한이 있으며, 산 및 알칼리 처리방법은 생산단가는 낮으나 유용성분의 특히, 단순히 온도에 의한 추출은 다당류로 이루어진 물질 표면의 조직이 물러지도록 하여 유용 활성 성분 효능에 한계점을 지니고 있다.

기능성 소재개발을 위해 다양한 추출방법에 관한 기술이 요구되어 있는데, 그 중 식품산업 및 제약산업의 소재개발에 많이 적용하는 초고압(High-hydrostatic pressure(HHP)) 기술은 100~1,000 MPa의 압력을 이용하여 압력 매체로 물이나 오일을 이용해 압력을 순간적으로 균일하게 전달시키는 비가열처리 기술 중의 하나이며, 미생물의 형태, 생화학적 반응, 세포막 및 세포벽에 영향을 주는 것으로 알려져 있다. 주요 장점으로는 공정의 간편화와 시간 및 비용절감효과와 함께 상온 또는 저온에서 실행 가능하고, 단백질의 응고, 천연의 맛과 향미, 색, 신선도를 유지할 수 있으며, 모든 방향에서 압력이 균일하게 작용하므로 처리정도의 차이가 존재하지 않고, 플라스틱필름과 같은 파우치 형태의 백을 이용할 수 있어 실험이 용이하다.

최근에는 여러 국가에서 초고압 기술을 산업적으로 사용하고 있는 추세가 늘고 있으며 고품질, 고기능성 제품에 활용도가 높아져 기능성 식품, 의약품 및 화장품 소재개발 적용에 중요성이 커지고 있으나 초고압의 최적 조건이나 해조류를 소재로 하는 연구는 아직 미비한 상태이다.

한국등록특허 제1182059호에는 항산화 활성을 갖는 톳 정유 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물이 개시되어 있으며, 한국공개특허 제2012-0111104호에는 이취가 제거된 유산균 발효 톳 분말의 제조방법이 개시되어 있으나, 본 발명의 효소 및 초고압 추출법을 이용한 톳 추출물의 제조방법과는 상이하다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 톳 추출 시 기존의 추출법의 문제점인 인체 독성, 낮은 추출 수율, 고비용 등의 문제점을 해결하고, 톳 추출물 내에 다당류 함량과 생리활성 효과가 증진되어 품질이 향상된 톳 추출물을 제조하기 위해, 반응표면분석법을 이용하여 최적의 톳 추출 방법을 확립하는 데 그 목적이 있다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 톳 분말에 물 및 효소를 첨가한 후 초고압 추출하여 제조하는 것을 특징으로 하는 수용성 다당류의 추출 수율 및 항산화 활성이 증진된 톳 추출물의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 수용성 다당류의 추출 수율 및 항산화 활성이 증진된 톳 추출물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 수용성 다당류의 추출 수율 및 항산화 활성이 증진된 톳 추출물을 함유하는 가공식품을 제공한다.

본 발명의 효소 및 초고압 추출조건을 통해 제조된 톳 추출물은 톳 유래 기능성 성분들을 효율적으로 추출하고, 항산화 활성 등과 같은 다양한 생리활성 효과도 증진되어, 상기 톳 추출물을 이용하여 식품, 의약품 산업 등에 유용하게 이용할 수 있는 효과가 있으며, 본 발명의 효소 및 초고압 추출방법을 이용한 톳 추출물은 기존의 유기용매에 의한 추출방법에 비해 친환경적이고, 기존의 추출법에 비해 간단한 공정으로 손쉽게 추출할 수 있는 이점이 있다.

도 1은 시간, 압력, 효소 농도에 따른 톳 추출물의 조다당의 수율의 반응표면(response surface)을 보여준다.
도 2는 시간, 압력, 효소 농도에 따른 톳 추출물의 조후코이단의 수율의 반응표면을 보여준다.
도 3은 시간, 압력, 효소 농도에 따른 톳 추출물의 총당 함량의 반응표면을 보여준다.
도 4는 시간, 압력, 효소 농도에 따른 톳 추출물의 환원당 함량의 반응표면을 보여준다.
도 5는 시간, 압력, 효소 농도에 따른 톳 추출물의 우론산 함량의 반응표면을 보여준다.
도 6은 시간, 압력, 효소 농도에 따른 톳 추출물의 리파아제 저해활성의 반응표면을 보여준다.
도 7은 시간, 압력, 효소 농도에 따른 톳 추출물의 ABTS 라디칼 소거 활성의 반응표면을 보여준다.
도 8은 추출시간과 압력에 대한 톳 추출물의 종속변수들에 대하여 제한조건으로 등고선 지도를 중첩하여 최적조건을 선정한 것이다.
도 9는 추출시간과 효소농도에 대한 톳 추출물의 종속변수들에 대하여 제한조건으로 등고선 지도를 중첩하여 최적조건을 선정한 것이다.
도 10은 추출압력과 효소농도에 대한 톳 추출물의 종속변수들에 대하여 제한조건으로 등고선 지도를 중첩하여 최적조건을 선정한 것이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 톳 분말에 물 및 효소를 첨가한 후 초고압 추출하여 제조하는 것을 특징으로 하는 수용성 다당류의 추출 수율 및 항산화 활성이 증진된 톳 추출물의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 톳 추출물의 제조방법에서, 상기 효소는 탄수화물 분해효소일 수 있으며, 예를 들면 상용효소인 비스코자임(viscozyme)일 수 있으며, 상기 비스코자임은 아라비나아제(arabinase), 셀룰라아제(cellulase), 베타 글루카나제(beta-glucanase), 헤미셀룰라아제(hemicellulase), 자일라나아제(xylanase)를 함유하는 복합효소이다. 상기 수용성 다당류는 후코이단 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 톳 추출물의 제조방법은, 보다 구체적으로는 톳 분말에 물과 톳 분말 중량대비 탄수화물 분해효소를 0.9~1.1% 첨가한 후 76~85 MPa의 압력에서 14~17시간 동안 초고압 추출하여 제조할 수 있으며,

더욱 구체적으로는, 톳 분말에 물을 0.8~1.2:12~18(w:v) 비율로 첨가한 후, 여기에 톳 분말 중량대비 탄수화물 분해효소를 0.9~1.1% 첨가하고, 76~85 MPa의 압력 및 40~60℃에서 14~17시간 동안 초고압 추출하여 제조할 수 있으며,

가장 구체적으로는, 톳 분말에 물을 1:15(w:v) 비율로 첨가한 후, 여기에 톳 분말 중량대비 탄수화물 분해효소를 1% 첨가하고, 80 MPa의 압력 및 50℃에서 15시간 동안 초고압 추출하여 제조할 수 있다.

상기 조건으로 톳을 추출하는 것이 다른 방법 및 조건으로 추출하는 것에 비해 추출물 내 다당류 추출 수율 향상과 후코이단 및 우론산 등과 같은 기능성 물질 함량을 증진시키고, ABTS 라디칼 소거활성이 향상된 톳 추출물을 제공할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 방법으로 제조된 수용성 다당류의 추출 수율 및 항산화 활성이 증진된 톳 추출물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 수용성 다당류의 추출 수율 및 항산화 활성이 증진된 톳 추출물을 함유하는 가공식품을 제공한다. 상기 가공식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 톳 추출물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 떡류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 가공식품을 모두 포함한다.

이하, 본 발명의 실시예를 들어 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

1. 추출방법에 따른 톳 추출물의 품질특성

(1) 재료 및 추출물의 제조

톳은 2013년 4월에 전남 완도군 (주)금일수산에서 구입하여 사용하였으며, 물로 3~4회 수세하여 염분과 이물을 제거하고 건조 후 분쇄하여 사용하였다. 톳 건조분말 100 g에 증류수 1500 mL를 넣은 후 비스코자임(Viscozyme)을 중량 대 비율로 첨가한 후 0.1 M HCl을 이용하여 pH 4.5~4.7로 조정하였다. pH 조정 후 비닐 팩에 함께 넣어 공기가 들어가지 않도록 밀봉과 동시에 초고압 장치((TFS-SL, TOYO KOTASU Co., LTD)를 이용하여 초고압 처리하였다. 처리한 후 잔사를 분리한 다음 100℃에서 30분간 효소 불활성화를 실시하였다.

(2) 초고압 효소반응 추출장치 운용조건

초고압 효소반응 추출장치는 TFS-SL(TOYO KOTASU Co., LTD)을 사용하였으며, 운용조건으로는 온도 50℃, 시간 5~25시간, 압력 60~100 Mpa으로 설정하였고, 사용된 효소(Viscozyme L, novozyme) 농도는 0.3~0.9%의 조건으로 실험을 수행하였다.

(3) 초고압-효소분해를 이용한 유용물질의 추출 조건 최적화를 위한 실험계획

반응표면분석법(response surface methodology; RSM)을 이용하여 최적 추출조건 예측과 시간, 압력, 효소 농도에 따른 이화학적 품질특성 및 생리활성을 모니터링 실시하였다.

최적 추출 조건 설정을 위한 실험계획은 중심합성계획법에 의하여 설계하였고, 반응표면분석을 위해서는 SAS(statistical analysis system) 프로그램을 사용하였다. 중심합성계획에 의한 독립변수(Xi)의 실험계획은 표 1과 같이 시간(X1), 압력(X2), 효소농도(X3)를 -2, -1, 0, 1, 2의 5단계로 부호화 하였다.

중심합성계획법에 의한 독립변수의 범위와 값

Xi	작동 조건	Level
Xi	작동 조건	-2	-1	0	1	2
X1	시간(hr)	5	10	15	20	25
X2	압력(Mpa)	60	70	80	90	100
X3	효소 농도(%)	0.3	0.6	0.9	1.2	1.5

독립변수(Xi)는 중심합성계획법(central composite design, CCD)에 따라 표 2와 같이 16구간으로 설정하여 실험을 실시하였으며, 독립변수에 대한 실험 영역 결정은 예비실험 결과를 바탕으로 영향을 주는 변수로 설정하였다. 또한 이들 요인변수에 의해 영향을 받는 종속변수(Yn)는 다당류의 품질인자로서 다당 추출 수율(Y1), 조후코이단 추출(Y2), 총당(Y3), 환원당(Y4), 단백질 함량(Y5), 우론산 함량(Y6), 황산기 함량(Y7), 리파아제 저해능(Y8), ABTS 라디칼 소거능(Y9)으로 하였으며, 이들은 3회 반복 측정하여 그 평균값을 회귀분석에 사용하였다.

초고압 효소 추출 조건 방식

No.	독립 변수
No.	시간(hr)	압력(Mpa)	효소 농도(%)
1	20(1)	90(1)	1.2(1)
2	20(1)	90(1)	0.6(-1)
3	20(1)	70(-1)	1.2(1)
4	20(1)	70(-1)	0.6(-1)
5	10(-1)	90(1)	1.2(1)
6	10(-1)	90(1)	0.6(-1)
7	10(-1)	70(-1)	1.2(1)
8	10(-1)	70(-1)	0.6(-1)
9	25(2)	80(0)	0.9(0)
10	5(-2)	80(0)	0.9(0)
11	15(0)	100(2)	0.9(0)
12	15(0)	60(-2)	0.9(0)
13	15(0)	80(0)	1.5(2)
14	15(0)	80(0)	0.3(-2)
15	15(0)	80(0)	0.9(0)
16	15(0)	80(0)	0.9(0)

(4) 조다당 추출 수율 및 조후코이단 추출 수율

추출물로부터 조다당을 분리하기 위해 에탄올을 이용하여 다당류 성분을 침전시켰다. 총 두 차례에 걸쳐 반복적으로 수용화 및 에탄올 침전을 실시하였으며 이를 통해 조다당류 이외의 물질을 제거하고 부분 정제된 시료로 이용하고자 침전물을 동결건조(FD SFDSM12, Samwon, Korea)하여 실험에 이용하였다. 조후코이단의 경우 추출물에 85% 에탄올을 가하여 10분간 방치한 후 원심분리하여 얻은 침전물에 100배의 0.1 M MgCl₂를 첨가하여 30분간 방치한 후 다시 20% 에탄올을 중량의 2배를 첨가하여 원심분리(3,000×30분)하여 얻은 침전물을 동결건조(FD SFDSM12, Samwon, Korea)하여 실험에 이용하였다.

(5) 총당 및 환원당 함량

총당 함량은 페놀-황산법에 따라 측정하였다. 즉, 시료 1 mL에 5% 페놀 1 mL와 황산 5 mL를 가하여 발색시킨 다음 20분간 방치 후 분광광도계(UV1601, Shimadzu, Japan)를 이용하여 470 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총당의 정량은 글루코스 표준품을 사용하여 검량선을 작성하여 실시하였다. 환원당은 DNS(Dinitrosalicylic acid)법으로 측정하였다. 10배 희석한 시료 희석액 1 mL에 DNS 시약 3 mL을 가하여 잘 교반한 후 끓는 물에서 5분간 반응시켰다. 반응액을 냉각 후 550 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 이 측정치를 글루코스로 환산하여 표시하였다.

(6) 단백질 함량

단백질 함량은 Lowry법에 따라 측정하였다. 실험 전에 A(증류수 100 mL에 0.5 g CuSO₄·5H₂O와 1 g Na₃C₆H₅O₇·2H₂O 용해) 및 B(증류수 1 L에 20 g Na₂CO₃와 4 g NaOH 용해) 용액을 제조하였다. 시료 0.5 mL에 2.5 mL의 C(1 mL A 용액과 50 mL B 용액) 용액을 가한 후 10분간 실온에 방치하였다. 그 후, D(10 mL Folin-Ciocalteu 페놀 시약과 10 mL 증류수) 용액 0.25 mL을 가하여 혼합한 후 20분간 실온에 방치한 다음 분광광도계(UV1601, Shimadzu, Japan)를 이용하여 750 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준곡선은 소혈청 알부민(Sigma, St. Louis, MO)를 이용하여 검량곡선을 작성한 후 함량 계산에 활용하였다.

(7) 우론산 함량

우론산 함량은 증류수에 용해되어 있는 시료 200 ㎕를 캡 튜브에 분취하고 4 M 황산암모늄(ammonium sulfate) 20 ㎕를 가하여 혼합하였다. 진한 황산에 25 mM의 농도로 용해시킨 붕사(sodium tetraborate) 1 mL를 첨가한 뒤 100℃에서 5분간 가열하고 실온에서 방냉하였다. 시험관의 방냉이 적절히 이루어지면 0.1% 카바졸(cabazole) 용액을 40 ㎕ 가하고 다시 100℃에서 15분간 반응시킨 다음 방냉한 후 520 nm에서 흡광도를 측정하였다. 우론산(Uronic acid) 함량은 D-글루쿠론산(D-glucuronic acid)으로 작성한 검량 곡선으로 계산하였다.

(8) 황산기 함량

황산기 함량은 Dodgson의 방법을 변형하여 1.0N HCl로 105~110℃에서 4시간 동안 가수분해한 후 가수분해액 0.2 mL에 4% TCA 용액 3.8 mL와 BaCl₂-젤라틴 시약 1 mL를 첨가하고 20분간 방치한 후 360 nm에서 흡광도를 측정하였으며 K₂SO₄를 표준품으로 사용하였다.

(9) ABTS 라디칼 소거능

ABTS 라디칼 소거활성은 Re 등의 방법에 따라 7.4 mM ABTS[2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt]와 2.6 mM 과황화칼륨(potassium persulfate)을 혼합하여 실온 암소에서 24시간 동안 방치하여 라디칼을 형성시킨 다음 실험 직전에 ABTS 용액을 732 nm에서 흡광도가 0.700±0.030이 되도록 인산완충액(PBS, pH 7.4)로 희석하여 사용하였다. 희석된 용액 950 ㎕에 추출물 50 ㎕를 가하여 암소에서 10분간 반응시킨 후 732 nm에서 흡광도를 측정하였으며 계산식, ABTS 라디칼 소거능(%) = 100 - [(샘플 흡광도/대조구 흡광도) × 100]에 의하여 활성을 산출하였다.

(10) 리파아제 저해활성

리파아제 저해활성은 Saisuburamaniyan 등의 방법을 변형하여 측정하였으며, 추출물 0.25 mL, 800 unit/mL 리파아제 0.5 mL과 0.05 M 인산칼륨 버퍼(pH 6.5) 0.5 mL를 혼합하여 37℃에서 15분간 전처리한 후 10%로 이소옥탄(isooctane)에 용해시킨 올리브 오일 1.25 mL를 첨가하여 37℃에서 20분간 진탕배양 하였다. 다음 아세톤 5 mL로 반응을 정지시킨 후 5% 아세트산제이구리(cupric acetate) 1 mL를 첨가하여 혼합한 뒤 상온에서 정치하여 상등액을 720 nm에서 흡광도를 측정하였으며 저해활성은 리파아제 저해능(%) = [1-(C_Abs - S_Abs) / (C_Abs - B_Abs)] × 100 : C_Abs; 대조구 흡광도, S_Abs; 시료 흡광도, B_Abs; 시료 무첨가구의 흡광도에 의하여 산출하였다.

(11) 통계처리

모든 실험은 3회 반복으로 행하여 평균치와 표준편차로 나타내었고, 유의성 검증은 version 12의 SPSS(Statistical Package for Social Science, SPSS Inc., Chicago, IL, USA) Software package program을 이용하여 Duncan's multiple range test를 행하였다.

실시예 1: 추출 시간, 추출 압력 및 효소 농도에 따른 톳의 품질변화 비교

반응표면분석(response surface methodology, RSM)은 하나 또는 그 이상의 반응변수와 정량적인 실험변수 또는 인자 집합과의 관계를 규명하는 실험 설계 방법이다. 반응표면분석을 통하여 독립변수와 반응변수간의 함수관계를 데이터로 추정하고 독립변수들의 어떠한 값에서 반응량이 최적화될 것인가를 찾아낼 수 있으며, 가장 적은 수의 실험으로 최적 조건을 도출할 수 있는 실험계획법으로 분석을 통하여 추정되는 적합한 반응표면의 통계적인 성질을 규명할 수 있다. 특히 공정 인자들의 최적 조건을 찾는데 효과적으로 사용됨으로써 품질관리에 유용하게 응용되고 있으며, 제조 공정의 개선 및 새로운 제품의 개발을 위한 연구에도 이용되고 있다.

초고압-효소를 이용하여 최적 조건을 선정하고자 시간, 압력, 효소 농도에 따른 이화학적 품질분석을 비교하고 최적화를 실시하였다. 최적화를 위하여 중심합성계획에 의해 수행된 16개의 구간에서 조다당 수율, 조후코이단 함량, 총당, 환원당, 단백질 함량, 우론산 함량, 황산기 함량, 전자공여능, ABTS 라디칼 소거능, 리파아제 저해활성의 결과는 표 3에 나타내었다.

회귀분석에 대한 결정계수(R²)값에서 정확도가 높게 나타나는 다당 수율(0.9109), 조후코이단 함량(0.8997), 총당(0.8202), 환원당(0.9177), 우론산 함량(0.9186), 리파아제 저해활성(0.8310), ABTS 라디칼 소거능(0.8712)를 대상으로 각 독립변수의 변화에 따른 종속변수의 영향을 알아보고자 시간, 압력, 효소 농도에 따른 품질변화 정도를 도 1~7에 나타내었다.

톳 추출물의 처리조건에 따른 이화학적 품질특성

No.	수율 (%)	조후코이단 (%)	총당 (%)	환원당 (%)	단백질 (%)	우론산 (%)	황산기 (%)	ABTS 라디칼 소거능 (%)	리파아제 저해능 (%)
1	4.10±0.03	5.19±0.03	81.82±0.22	41.54±0.69	17.12±0.70	24.58±1.01	21.14±0.37	28.10±0.60	65.64±0.13
2	4.17±0.00	5.77±0.04	84.87±0.98	39.94±0.54	13.45±0.59	26.01±1.05	23.16±1.81	32.37±1.24	73.20±0.25
3	3.79±0.04	5.69±0.03	78.71±0.74	36.25±1.57	19.27±0.58	34.54±0.88	20.83±0.86	30.10±0.92	63.54±1.06
4	3.86±0.05	6.01±0.03	80.55±1.93	26.68±0.77	15.42±0.63	31.45±0.21	22.65±0.46	41.13±0.51	68.12±1.00
5	3.73±0.03	4.03±0.10	80.04±0.95	40.12±0.68	16.45±0.91	36.12±2.64	15.59±0.80	46.84±0.65	61.66±1.20
6	3.89±0.13	4.39±0.11	82.61±1.90	26.86±1.18	13.12±0.46	39.27±0.85	16.90±0.53	53.07±0.53	62.72±1.63
7	3.62±0.10	4.79±0.18	77.72±2.28	34.25±0.30	18.44±0.61	37.33±0.81	18.88±0.35	51.90±0.72	47.29±2.40
8	3.79±0.04	5.08±0.08	80.37±0.81	23.12±0.89	16.68±0.69	43.67±1.06	20.60±0.41	54.11±1.32	51.40±0.37
9	4.13±0.04	6.89±0.02	82.19±0.56	44.72±0.98	11.02±0.77	20.12±1.40	31.64±0.82	22.82±2.40	62.90±0.98
10	3.35±0.04	4.29±0.01	64.97±0.49	25.12±0.46	20.08±0.21	30.12±1.40	24.82±1.49	45.04±0.80	58.13±1.44
11	4.32±0.04	5.02±0.01	90.22±1.02	42.88±0.95	12.12±0.90	25.00±1.41	17.98±1.09	46.36±0.23	65.37±0.75
12	3.81±0.01	7.07±0.01	72.16±0.84	26.20±3.31	19.42±0.48	42.25±0.91	32.31±1.12	49.36±1.79	57.60±2.50
13	3.91±0.02	4.83±0.05	69.57±2.96	32.15±0.85	12.34±0.19	33.12±1.53	21.54±0.33	22.56±0.86	56.12±1.00
14	3.98±0.04	5.23±0.01	76.50±2.30	22.04±0.92	18.45±0.24	46.35±2.07	31.12±0.25	51.90±0.09	49.23±1.64
15	4.22±0.03	5.58±0.01	86.15±0.91	28.83±0.98	15.54±1.11	36.20±0.74	46.54±0.45	29.36±2.81	64.84±1.25
16	4.21±0.04	5.54±0.05	85.98±2.59	27.45±1.03	16.45±0.58	35.49±1.70	47.04±0.86	31.43±1.54	63.34±0.37
R ²	0.9109	0.8997	0.8202	0.9177	0.4743	0.9186	0.5786	0.8712	0.8310

(1) 조다당 추출 수율

시간, 압력, 효소 농도에 따른 톳 조다당의 수율은 도 1과 같다. 수율은 3.62~4.32%를 나타내었으며 시간과 압력의 관계에서 동일 압력에서는 시간이 증가함에 따라 수율이 증가하는 경향을 보였으며, 동일 시간에서는 압력이 증가함에 따라 수율 또한 증가하는 경향을 보였다. 시간과 효소 농도의 관계에서는 시간이 증가하고, 효소 농도가 낮아질수록 수율은 비례적으로 증가하는 경향을 보였다. 회귀분석 결과, 조다당 추출 수율에 대한 결정계수 R²은 0.9109로 높은 정확도를 나타내었으며 1% 이내의 유의수준에서 인정되었다. 이를 통해 시간, 압력, 효소 농도에 따라 조다당 추출 수율에 영향을 미침을 알 수 있었다.

(2) 조후코이단 수율

시간, 압력, 효소 농도에 따른 톳 조후코이단의 수율은 도 2에 나타내었다. 후코이단은 육상식물에는 함유되어 있지 않고 갈조류에는 그 함유량이 1~20% 정도이며, 푸코오스(fucose), 갈락토스(galactose), 자일리오스(xylose), 만노오스(mannose), 우론산(uronic acid), 에스테르황산(ester sulfate) 등으로 이루어진 헤테로 산성다당류이다. 각각의 조건에 따른 조후코이단의 함량은 4.03~7.07%를 나타내었으며 시간과 압력의 관계에서는 시간이 길어짐에 따라 조후코이단의 수율은 높아지는 경향을 나타내었으며, 시간과 효소농도의 관계에서는 효소농도가 높아짐에 따라 수율이 낮아졌으며, 압력과 효소농도의 관계에는 두 조건 모두 낮아질수록 높은 수율을 나타내었다. 회귀분석 결과, 조후코이단 추출 수율에 대한 결정계수 R²은 0.8997로 높은 정확도를 나타내었으며 유의성이 5% 이내의 유의수준에서 인정되었다.

(3) 총당 및 환원당 함량

시간, 압력, 효소 농도에 따른 총당 및 환원당 함량은 도 3 및 도 4와 같다. 도 3의 총당 함량은 69.57~86.15%를 나타내었으며 시간과 압력의 관계에서 동일 압력에서는 시간이 증가함에 따라 총당 함량이 증가하는 경향을 보였으며, 동일 시간에서는 압력이 증가함에 따라 총당 함량 역시 증가하는 경향을 보였다. 또한 시간과 효소 농도의 관계에서는 동일 시간에서 효소 농도가 낮아질수록 총당 함량은 비례적으로 증가하는 경향을 보였다. 회귀분석 결과, 총당 함량에 대한 결정계수 R²은 0.8202로 나타났다. 물을 이용한 고온 추출 공정 시 시료가 받는 온도와 수증기 압력이 증가함에 따라 상온에서 반응하는 일반 물과 다르게 반응하여 유전상수는 감소하고 이온강도는 증가한 상태가 되어 해조류에서 당 가수분해 반응을 유발할 수 있다. 이런 원리를 이용하여 해조류의 세포벽이 파괴되고 물의 출입이 용이하여 시료의 당화성분 추출이 가능하며, 불순물이 없고 추출 효율을 증진시킬 수 있다. 따라서 톳의 경우 복합 다당류 형태로 구성되어 있기 때문에 적절한 온도를 통해 해조류의 유용성분의 추출을 용이하게 조절할 수 있다. 도 4의 환원당 함량의 경우 시간, 압력, 효소의 농도가 높아질수록 환원당의 함량 역시 증가하는 경향을 보였다. 회귀분석 결과, 결정계수 R²은 0.9177로 높은 정확도를 나타내었으며, 5% 이내의 유의수준에서 인정되었다.

(4) 우론산 함량

시간, 압력, 효소 농도에 따른 우론산 함량은 도 5와 같다. 우론산은 단당류 분자의 말단에 있는 제1급 알콜기가 산화되어 카르복실기가 된 것으로 6탄당에서 유도되는 우론산이 중요하다. 식물계에서는 글루쿠론산(glucuronic acid)이 식물 검질의 중요한 구성성분으로 존재하며 동물체내에서는 홀로 존재하기도 하며 페놀계의 독성 물질이 생기면 글루쿠론산이 결합하여 무독한 공액 글루쿠로니드(glucuronide)를 형성하여 소변으로 배설되고 중성 다당체에 비해 면역체계에 미치는 영향이 크다. 우론산 함량은 20.12~46.35%를 나타내었으며, 시간과 압력의 관계에서 동일 시간에서는 압력이 증가함에 따라 우론산 함량이 증가하였으며, 동일 압력에서는 시간이 증가함에 따라 우론산 함량이 감소하는 경향을 나타내었다. 시간과 효소 농도의 관계에서는 효소농도가 증가할수록 우론산 함량이 감소하는 경향을 나타내었다. 회귀분석 결과, 우론산 함량에 대한 결정계수 R²은 0.9186으로 높은 정확도를 나타내었으며, 5% 이내의 유의수준에서 인정되었다.

(5) 리파아제 저해활성 및 ABTS 라디칼 소거 활성

시간, 압력, 효소 농도에 따른 리파아제 저해활성 및 ABTS 라디칼 소거활성은 도 6 및 7과 같다. 도 6의 리파아제 저해활성은 47.29~73.20%를 나타내었으며, 시간과 압력의 관계에서 동일 시간에서는 압력이 증가함에 따라 리파아제 저해활성이 증가하였으며, 동일 압력에서는 시간이 증가함에 따라 역시 리파아제 저해활성이 증가하는 경향을 나타내었다. 시간과 효소 농도의 관계에서는 효소농도가 증가할수록 리파아제 저해활성이 낮아지는 것을 알 수 있었다. 회귀분석 결과, 리파아제 저해활성에 대한 결정계수 R²은 0.8310으로 나타났다. 도 7의 ABTS 라디칼 소거활성은 22.56~54.11%를 나타내었으며, 전체적으로 시간, 압력, 효소 농도가 증가할수록 ABTS 라디칼 소거활성이 높아지는 경향을 나타내었다. 또한 회귀분석 결과, ABTS 라디칼 소거활성에 대한 결정계수 R²은 0.8712으로 나타나, 5% 이내의 유의수준에서 인정되었다.

실시예 2: 톳의 초고압-효소 추출 조건의 최적화

톳의 초고압-효소 추출 시 최적 조건을 찾기 위하여 표 3의 실험결과를 이용하여 반응표면분석법에 의해 수립된 2차식의 회귀모형에 적합하여 얻은 회귀계수값들을 표 4에 나타내었다. 주어진 종속변수에 대하여 얻어진 각 독립변수들인 시간, 압력, 효소 농도를 회귀식에 대입함으로서 주어진 실험구간 내에서의 예측값을 구할 수 있으며, 또한 종속변수 값의 변화 정도도 예측할 수 있다. 조다당 수율, 환원당, 우론산 함량에 대하여는 0.90 이상의 높은 결정 계수값을 나타내었다.

반응표면분석법에 의해 수립된 2차식의 회귀모형에 적합한 회귀계수값

계수	수율(%)	조후코이단(%)	총당(%)	환원당(%)	단백질(%)
βk0	0.225000	14.626250	-69.563125	97.814375	36.873125
βk1	0.105625	-0.012625	3.642375	-2.727250	-0.554125
βk2	0.055187	-0.247563	2.185438	-2.423000	-0.167438
βk3	0.722917	3.572917	63.510417	48.462500	-4.589583
βk11	-0.004750	0.000300	-0.124850	0.067800	-0.004450
βk12	0.000775	0.001775	0.007175	0.029850	0.003575
βk13	0.007500	-0.020833	0.027500	-1.018333	0.202500
βk22	0.000375	0.001213	-0.012188	0.016000	-0.000562
βk23	0.004583	-0.013750	-0.047083	-0.201667	0.057917
βk33	-0.750000	-1.472222	-36.194444	-2.902778	-1.666667
계수	우론산(%)	황산기(%)	리파아제 저해능(%)	ABTS 소거능(%)
βk0	73.759344	-353.230000	-104.596250	368.303125
βk1	2.271539	4.434875	6.009375	-1.052250
βk2	1.437138	8.139562	2.036062	-6.996875
βk3	97.858983	97.189583	65.327083	-51.154167
βk11	-0.122050	-0.185600	-0.035750	0.033850
βk12	-0.024475	0.019525	-0.046275	-0.011650
βk13	0.929167	-0.067500	-0.580833	-0.571667
βk22	-0.009250	-0.054112	-0.006512	0.043288
βk23	-0.055417	0.008750	0.002917	0.114167
βk33	6.694444	-56.833333	-35.875000	18.569444

표 5는 각 독립변수가 종속변수에 미치는 영향을 살펴본 것으로서, 시간 조건의 변화는 조후코이단 함량, 환원당, 우론산 함량 및 ABTS 라디칼 소거활성에 대하여는 5% 이내, 조다당 수율에 대하여 1% 이내의 수준으로 유의적인 관계를 나타내었다. 압력 조건의 변화는 환원당, 우론산 함량에 대하여 5% 이내의 유의성을 나타내었으며 효소 농도에 대해서는 큰 영향이 없는 것으로 나타났다.

각 독립변수에 따른 종속변수 변화 분석

공정 변수	DF	제곱합(Sum of squares)
공정 변수	DF	수율(%)	조후코이단(%)	총당(%)	환원당(%)	단백질(%)
시간(hr)	4	0.65**	5.80*	255.18	324.72*	20.44
압력(MPa)	4	0.23	2.78	169.62	321.89*	37.36
효소(%)	4	0.11	0.65	205.86	224.18	1.35
공정 변수	DF	우론산(%)	황산기(%)	리파아제 저해능(%)	ABTS 소거능(%)
시간(hr)	4	400.06*	406.39	264.53	900.07*
압력(MPa)	4	218.48*	551.96	196.08	336.12
효소(%)	4	95.36	461.05	258.85	476.08

^*5%에서 유의차, ^**1%에서 유의차

톳 추출물로부터 얻은 해조 다당류의 품질특성 결과에 대하여 주어진 실험구간에서 예측한 정상점과 이때의 실험조건을 표 6에 나타내었다. 회귀식에 의하여 예측된 정상값이 안장점으로 나타나 능선분석을 통하여 실험구간 내에서의 정상점과 이때의 설정 조건을 예측하고자 하였다. 조다당 추출 수율을 최대로 하는 조건은 시간은 19.94 hr, 압력은 99.61 Mpa이며 효소 농도는 0.89%로 처리하는 조건이며, 총당 및 환원당 함량을 최대로 하는 조건은 각각 시간은 17.36 hr, 21.56 hr, 압력은 93.18 Mpa, 69.76 Mpa, 효소 농도는 0.82%, 2.20%으로 나타났다. 우론산 함량의 경우 시간은 15.57 hr, 압력은 59.27 Mpa, 효소 농도는 1.31%로 처리하는 조건이며, 리파아제 저해활성 및 ABTS 라디칼 소거활성을 최대로 하는 조건은 각각 시간은 18.07 hr, 45.43 hr이며, 압력은 92.31 Mpa, 84.54 Mpa, 효소 농도는 0.77%, 1.82%로 나타났다.

톳 추출물의 품질특성 결과에 따른 실험구간에서 예측한 정상점과 이때의 실험조건

공정 변수	Levels for optimum response
공정 변수	수율(%)	조후코이단(%)	총당(%)	환원당(%)
시간(hr)	19.94 (19.65)	243.40 (20.70)	17.36 (17.85)	21.56 (22.10)
압력(MPa)	99.61 (97.69)	-76.92 (63.66)	93.18 (98.94)	69.73 (94.08)
효소(%)	0.89 (0.88)	-0.15 (0.85)	0.82 (0.81)	2.20 (0.92)
R-square	0.9109	0.8997	0.8202	0.9177
유의성	0.0149	0.0206	0.0945	0.0120
예측값	4.35 (4.35)	22.34 (6.85)	90.01 (89.59)	37.57 (50.34)
Morphology	S.P.^a) (max.)	S.P. (max.)	S.P. (max.)	S.P. (max.)
공정 변수	우론산(%)		리파아제 저해능(%)	ABTS 소거능(%)
시간(hr)	15.57 (11.83)		18.07 (24.27)	45.43 (11.30)
압력(MPa)	59.27 (74.62)		92.31 (74.62)	84.54 (63.41)
효소(%)	1.31 (0.35)		0.77 (0.74)	1.82 (0.65)
R-square	0.9186		0.8310	0.8712
유의성	0.0116		0.0811	0.0403
예측값	39.33 (47.07)		68.74 (70.48)	2.19 (57.90)
Morphology	S.P. (max.)		S.P. (max.)	S.P. (max.)

^a)S.P.= Saddle Point

실시예 3: 톳의 초고압-효소 최적 추출 조건 선정

초고압-효소 추출을 이용하여 톳 추출물의 최적 조건을 찾기 위하여 9개의 종속변수 중에서 톳 추출물로부터 얻어낸 조다당의 품질에 영향을 미치고 R-square 값이 높은 6개를 선정하였다. 각 반응변수들의 대응값이 일치하지 않아 적절한 제한조건을 필요로 하기 때문에 톳 추출 공정에 있어서 종속변수의 제한 조건으로 톳 추출물로 얻어낸 조다당의 이화학적 품질특성과 생리활성을 고려하여 조다당 수율 4.0~4.2%, 조후코이단 수율 5.0~5.5%, 총당 함량 84~88%, 환원당 함량 30~35%, 우론산 함량 35~40%, 리파아제 저해활성 60~67%, ABTS 라디칼 소거활성 30~40%로 결정하였을때, 만족하는 등고선 지도(contour map)를 작성하였다. 각 조건이 일치하는 영역을 등고선 지도를 중첩하여 최적화를 시도하였다. 도 9~11은 반응변수 중 유의성이 있으며, 톳 추출물로부터 얻어낸 다당의 품질특성으로 중요하다고 판단되는 변수들로서 조다당 추출 수율, 조후코이단 함량, 총당 함량, 환원당 함량, 우론산 함량, 리파아제 저해활성, ABTS 라디칼 소거활성 항목에 대하여 제한조건으로 등고선 지도를 중첩하여 최적조건을 선정하였다. 톳 추출물로부터 얻어낸 조다당의 품질특성에 따른 처리 조건은 표 7에서 보는 것과 같이 시간은 14~17 hr, 압력은 76~85 Mpa, 효소 농도는 0.9~1.1%이었으며, 최적 조건은 시간 15 hr, 압력 80 Mpa, 효소농도는 1.0% 처리하는 것으로 나타났고, 최적 조건에서 추출한 톳 추출물의 종속변수 예측값과 실측값은 표 8에서 보는 바와 같이 큰 차이를 나타내지 않았다.

톳 추출물의 최적 조건 선정

조건	최적 조건 범위	최적 조건
추출 시간(hr)	14~17	15
추출 압력(Mpa)	76~85	80
효소 농도(%)	0.9~1.1	1.0

톳 추출물의 최적 조건에서의 반응변수 예측값과 실측값

반응변수	예측값	실측값	E/P¹⁾
조다당 수율(%)	4.1	4.21±0.02	1.0268
조후코이단 수율(%)	5.3	5.52±0.03	1.0415
총당(%)	86	84.57±1.35	0.9834
환원당(%)	33	30.22±0.76	0.9158
우론산 함량(%)	38	35.29±1.27	0.9287
리파아제 저해능(%)	64	61.34±2.10	0.9584
ABTS 소거능(%)	35	33.73±1.06	0.9637

¹⁾ E/P: 실측값/예측값

Claims

톳 분말에 물 및 효소를 첨가한 후 초고압 추출하여 제조하는 것을 특징으로 하는 수용성 다당류의 추출 수율 및 항산화 활성이 증진된 톳 추출물의 제조방법.
제1항에 있어서, 톳 분말에 물과 톳 분말 중량대비 탄수화물 분해효소를 0.9~1.1% 첨가한 후 76~85 MPa의 압력에서 14~17시간 동안 초고압 추출하여 제조하는 것을 특징으로 하는 수용성 다당류의 추출 수율 및 항산화 활성이 증진된 톳 추출물의 제조방법.
제2항에 있어서, 톳 분말에 물을 0.8~1.2:12~18(w:v) 비율로 첨가한 후, 여기에 톳 분말 중량대비 탄수화물 분해효소를 0.9~1.1% 첨가하고, 76~85 MPa의 압력 및 40~60℃에서 14~17시간 동안 초고압 추출하여 제조하는 것을 특징으로 하는 수용성 다당류의 추출 수율 및 항산화 활성이 증진된 톳 추출물의 제조방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 수용성 다당류의 추출 수율 및 항산화 활성이 증진된 톳 추출물.
제4항의 수용성 다당류의 추출 수율 및 항산화 활성이 증진된 톳 추출물을 유효성분으로 함유하는 가공식품.