KR20170046145A - 리포솜 캡슐화 친화 약제 - Google Patents

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Abstract

본 개시는 내부 공간을 갖는 리포솜, 상기 내부 공간 내에 배치된 생활성 항엽산제, 상기 리포솜의 외부에 부착된 입체 안정제 및 하나 이상의 엽산 수용체에 대한 특이적 친화도를 갖는 단백질을 포함하는 표적 잔기를 포함하는 리포솜 항엽산 조성물로서, 상기 표적 잔기가 상기 입체 안정제 및 상기 리포솜의 외부 중의 하나 이상에 부착되는 리포솜 항엽산 조성물을 제공한다.

Description

리포솜 캡슐화 친화 약제{LIPOSOME ENCAPSULATED AFFINITY DRUG}
암은 다양한 암 유형, 질환 진행에 관련된 메카니즘 및 근본적인 환자의 유전자 구성과 연관된 환자 가변성으로 인하여 치료하기 매우 까다로운 질환이다. 암을 치료하려는 초기의 노력은 항엽산염(antifolate)을 포함하는 세포독성제의 사용을 수반하였다. 항엽산염은 엽산(비타민 B9)의 작용을 길항(즉, 차단)하는 분자의 종류를 말한다. 엽산의 체내 주요 기능은 세린, 메티오닌, 티미딘 및 퓨린 생합성에 수반된 다양한 메틸트랜스퍼라제에 대한 보조인자로서 작용하는 것이다. 결과적으로 항엽산염은 세포 분열, DNA/RNA 합성 및 복구 및 단백질 합성을 억제한다.
항암제로서 항엽산염을 도입하는 근거는 엽산염(folate)이 세포 복제 동안 DNA(핵산) 합성에 대한 필수 성분이기 때문에, 모든 분열 세포의 생존에 중요한 엽산염을 기반으로 한 것이었다. 정상 세포 또는 암세포의 어떠한 세포에 의한 엽산염 흡수는 RFC(reduced-folate carrier)에 의하여 주로 매개되며, 이는 엽산염에 대한 친화도가 낮은 풍부한 막 관통 수송체이다.
암세포는 급성장하는 세포여서, 엽산염 형태의 DNA 전구체에 대한 수요가 높기 때문에, 항엽산염의 효과에 민감하다. 위장관을 라이닝하는 세포 및 골수의 세포와 같은, 급성장하는 정상 세포는 신속하게 게다가 주로 RFC를 통하여 공급되는 엽산염을 사용하여 분열한다. 그러므로, 항엽산염이 암세포에 침투하여 죽이기 위해 이용하는 RFC 매개 수송 메카니즘 또한 급성장 정상 세포를 죽이는 부수적인 효과가 발생될 잠재성이 있기 때문에, 정상 세포 또한 항엽산염에 민감하여, 불필요한 항엽산염 관련 독성을 유발한다.
항엽산염은 엽산염의 작용을 방해함으로써 작용하여, 암세포에서 암세포가 증식하거나 성장하는 데 필요한 DNA 전구체를 박탈한다. 한 종류로서 항엽산염은 암치료에서 이의 항증식성 효과에 사용되어 세포 성장 및 분열을 억제하여, 암세포가 죽도록 한다. 대부분의 정상 세포와 비교하여 증가된 엽산염 양을 필요로 하는 신속한 복제 암세포는 거의 70년 전 항암제로서의 항엽산염의 임상 개발로 이어졌다. 그러나, 항엽산염을 기반으로 한 요법이 암치료에 유효한 것으로 나타났지만, 이의 임상적 개발은 강력한 임상적 딜레마로 인하여 종종 무산되었다. 이러한 딜레마는 두 가지 대립적인 임상 역학으로부터 생겨난다. 한 편으로, 항엽산염은 엽산염 모방 분자가 되도록 디자인되며, 이들 대부분은 바람직한 막 관통 수송 메카니즘으로서 RFC를 사용하여 암세포에 이르도록 의도된다. 다른 한편으로, 체내 신속 재생 정상 조직, 예를 들면, 골수 또는 장관 조직 세포는 암세포와 같이, 매우 엽산염 의존적이기도 하고, 주요 막 관통 엽산염 세포 공급 메카니즘으로서 RFC를 사용하기도 한다. 이들 두 임상 역학의 최종 결과는 예를 들면, 골수 및 위장(GI)관 세포가 통상적으로 환자의 생명을 위협하는 항엽산염 관련 독성이 매우 만연하는 부위가 되었다는 것이다. 이들 독성 일부는 점막염, 설사, 빈혈, 호중구 감소증 및 낮은 백혈구 수를 포함하였다. 환자들의 이러한 항엽산염 관련 난치성 부작용의 결과는, 이러한 항엽산염이 또한 정상 세포내 허용되지 않은 독성의 형태의 쇠약하게 하는 부작용이 있는 경향이 있기 때문에, 매우 유효한 세포독성 또는 항암 특성을 나타내는 항엽산염이 통상적으로 이의 개발 동안 실패하거나, 이제까지는 임상적 실시에 제한적인 용도가 있다는 것이었다.
한 종류로서의 항엽산염은 환자에 대하여 심각하고 생명 위협적이기까지 한 독성의 연관된 위험에도 불구하고 여전히 암에 대한 유망한 치료 방식이다. 도전은 정상 세포에 대한 손상을 감소시키고/시키거나 피하는 방식으로 항엽산염을 유효하게 전달하는 방법을 알아내는 것이었다. 최근, 암에 대한 더 새로운 대체 요법의 이용 가능성 때문에, 항엽산염은 암세포를 죽이는 데 있어서의 항엽산염의 이례적인 유효성에도 불구하고 이러한 요법과 비교하여 이점이 없어졌다.
본원은 2014년 8월 14일자로 출원된 미국 가출원 제62/037,597호, 2015년 3월 9일자로 출원된 미국 가출원 제62/130,493호 및 2015년 3월 13일자로 출원된 미국 가출원 제62/133,265호에 대한 우선권을 주장한다. 이들 출원 각각은 본원에서 전체적으로 참조로 인용된다.
항암제(항신생물제)와 같은 수성 생활성제(bioactive agent)를 함유하며, 엽산 수용체 또는 수용체들에 대한 친화성 및 특이성을 갖는 중성 또는 음이온성 면역리포솜(immunoliposome)은 놀랍게도, 세포 표면에 엽산 수용체가 있는 세포에 대하여 유효하다.
일 예시적인 양태에서, 리포솜 항엽산 조성물이 제공된다. 리포솜 항엽산 조성물은, 내부 공간을 갖는 리포솜; 상기 내부 공간내 배치된 생활성 항엽산제; 리포솜의 외부에 부착된 PEG; 및 하나 이상의 엽산 수용체에 대한 특이적 친화도(specific affinity)를 갖는 단백질을 포함하는 표적 잔기를 포함하며, 상기 표적 잔기는 PEG와 리포솜의 외부 중 적어도 하나에 부착된다. 청구항 1의 리포솜 항엽산 조성물에 대하여, PEG는 수 평균 분자량(Mn)이 200 내지 5000달톤일 수 있다.
예시적인 리포솜 항엽산 조성물이 또한 제공된다. 예시적인 리포솜 항엽산 조성물은 내부 공간을 갖는 리포솜을 포함하는 배지; 상기 내부 공간 내에 배치된 수성 생활성 항엽산제; 하나 이상의 엽산 수용체에 대한 특이적 친화도를 갖는 단백질을 포함하는 표적 잔기를 포함하며, 상기 표적 잔기는 리포솜의 외부에 배치된다. 당해 조성물내 배지는 수용액일 수 있다. 수용액은 만니톨; 트레할로스(trehalose); 소르비톨; 및 수크로스로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 동결방지제를 포함할 수 있다. 리포솜 항엽산 조성물은 리포솜의 외부에 부착된 입체 안정제(steric stabilizer)를 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 표적 잔기는 입체 안정제 및 리포솜의 외부중 적어도 하나에 부착된다. 입체 안정제는 폴리에틸렌 글리콜(PEG); 폴리-L-리신(PLL); 모노시알로강글리오시드(GM1); 폴리(비닐 피롤리돈)(PVP); 폴리(아크릴아미드)(PAA); 폴리(2-메틸-2-옥사졸린); 폴리(2-에틸-2-옥사졸린); 포스파티딜 폴리글리세롤(phosphatidyl polyglycerol); 폴리[N-(2-하이드록시프로필) 메타크릴아미드]; 양친매성 폴리-N-비닐피롤리돈; L-아미노산계 중합체; 및 폴리비닐 알콜로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상이다. PEG는 수 평균 분자량(Mn)이 200 내지 5000달톤일 수 있다.
예시적인 조성물, 리포솜, 생성물, 키트 및 방법 중의 어느 것에서라도, 다음 단락들의 추가의 특징이 포함될 수 있다:
리포솜 항엽산 조성물은 PEG 및 리포솜의 외부 중 적어도 하나에 배치된 면역자극제 및 검출 가능한 마커 중의 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 리포솜 항엽산 조성물은 면역자극제 및 검출 가능한 마커 중의 하나 이상이 PEG 및 리포솜의 외부 중의 하나 이상에 공유 결합된다는 특징을 가질 수 있다. 면역 자극제는 단백질 면역 자극제; 핵산 면역 자극제; 화학적 면역 자극제; 합텐(hapten); 및 보조제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다. 예를 들면, 면역 자극제는 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)일 수 있다. 또 다른 예로서, 면역 자극제는 플루오레세인; DNP; β 글루칸; β-1,3-글루칸; 및 β-1,6-글루칸으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상이다. 검출 가능한 마커는 플루오레세인 및 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다. 예로서, 면역 자극제 및 검출 가능한 마커는 동일하며 - 예를 들면, 이는 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)일 수 있다.
리포솜 항엽산 조성물은 직경이 30-150nm, 예를 들면, 40-70nm 범위일 수 있다. 또 다른 특징으로서, 리포솜은 음이온성 리포솜 또는 중성 리포솜일 수 있다. 예를 들면, 리포솜의 제타 전위(zeta potential)는 0 이하, 예를 들면, 0 내지 -150mV 또는 -30 내지 -50mV의 범위일 수 있다.
리포솜 항엽산 조성물은 리포솜을 포함한다. 리포솜은 어떠한 리포솜 성분(liposomal component)으로라도 형성될 수 있다. 예를 들면, 리포솜 성분은 음이온성 지질 및 중성 지질 중의 하나 이상을 포함할 수 있다. 또 다른 예로서, 리포솜 성분은 DSPE; DSPE-PEG-말레이미드; HSPC; HSPC-PEG; 콜레스테롤; 콜레스테롤-PEG; 및 콜레스테롤-말레이미드로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상이다. 또 다른 예로서, 리포솜 성분은 DSPE; DSPE-PEG-FITC; DSPE-PEG-말레이미드; 콜레스테롤; 및 HSPC로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 포함한다.
논의된 바와 같이, 리포솜은 수용액을 내포할 수 있다. 예를 들면, 리포솜은 생활성 항엽산제 및 약제학적으로 허용되는 수성 담체를 내포할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 트레할로스, 예를 들면, 트레할로스 5 내지 20중량%를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는, 예를 들면, 5 내지 200mM의 농도 및 2.8 내지 6의 pH에서 시트레이트 완충제를 포함할 수 있다.
기타 성분들과 독립적으로, 약제학적으로 허용되는 담체는 아세트산나트륨 및 아세트산칼슘의 전체 농도 50 내지 500mM를 포함할 수 있다.
생활성 항엽산제는 수용성일 수 있다. 예로서, 리포솜 항엽산 조성물은 리포솜일 수 있고, 리포솜의 일부는 생활성 항엽산제 200,000 분자 미만을 포함할 수 있다. 예를 들면, 리포솜은 생활성 항엽산제 10,000 내지 100,000 분자를 포함할 수 있다.
생활성 항엽산제는 페메트렉시드(pemetrexed)를 포함할 수 있다. 또 다른 예시적인 양태에서, 생활성 항엽산제는 로메트렉솔(lometrexol)을 포함할 수 있다. 또 다른 예시적인 양태에서, 생활성 항엽산제는 메토트렉세이트(methotrexate); 랄리트렉시드(ralitrexed); 아미노프테린(aminopterin); 프랄라트렉세이트(pralatrexate); 로메트렉솔; 로메트렉솔의 티오펜 유사체(thiophene analog of lometrexol); 로메트렉솔의 퓨란 유사체(furan analog of lometrexol); 트리메트렉시드(trimetrexed); LY309887; 및 GW 1843U89로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상이다. 대안적으로, 또는 추가로, 생활성 항엽산제는 프로구아닐(proguanil); 피리메타민(pyrimethamine); 트리메토프림(trimethoprim) 및 GARFT 억제제의 6-치환된 피롤로 및 티에노[2,3-d]피롤로피리미딘 종류(6-Substituted Pyrrolo and Thieon[2,3-d]pyrrolopyrimidine class of GARFT inhibitors)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상이다. 로메트렉솔 유사체는 예를 들면, 문헌[참조: Habeck et al., Cancer Research, v. 54, page 1021-1026, Feb 15, 1994]에 기재되어 있다.
생활성 항엽산제 또는 어떠한 생활성제는 리포솜 항엽산 조성물 중에 pH 5-8에서 존재할 수 있다. 대안적으로, 리포솜 항엽산 조성물은 생활성 항엽산제를 pH 2-6에서 포함할 수 있다.
잔기, 예를 들면, 표적 잔기, 검출 가능한 레이블, 면역자극제, 입체 안정제 및 어떠한 임의의 잔기 및 제제 중의 어느 것이라도 리포솜 또는 리포솜 성분에 직접 또는 간접적으로 결합될 수 있다. 간접 결합은 입체 안정제(예: PEG), 관능기, 예를 들면, 말레이미드, 이온 결합(아비딘, 스트렙타비딘, 비오틴 등) 또는 결합 쌍(NTA-니켈 등)을 통한 결합을 포함할 수 있다. 예를 들면, PEG-말레이미드와 같이 이들 간접 결합 메카니즘의 조합이 또한 계획된다.
리포솜 항엽산 조성물 또는 기타 조성물에서, 표적 잔기는 말레이미드 관능기를 통하여 리포솜 성분 및 PEG 분자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상에 결합될 수 있다. 표적 잔기는 엽산 수용체 α(folate receptor alpha); 엽산 수용체 β(folate receptor beta); 및 엽산 수용체 δ(folate receptor delta)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상에 대한 특이적 친화도를 가질 수 있다. 예를 들면, 표적 잔기는 엽산 수용체 α; 엽산 수용체 β; 및 엽산 수용체 δ로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2개 이상에 대한 특이적 친화도를 갖는다. 추가의 예로서, 표적 잔기는 엽산 수용체 α; 엽산 수용체 β; 및 엽산 수용체 δ; 3개 전체에 대한 특이적 친화도를 가질 수 있다.
일 예시적인 양태에서, 표적 잔기는 종양 세포에 존재하지만 비종양 세포에는 부재하거나 비접근성인 종양 세포 표면 항원의 에피토프에 대한 특이적 친화도를 갖는다. 종양 세포는 예를 들면, 악성 세포일 수 있다. 종양 세포 표면 항원은 엽산 수용체 α; 엽산 수용체 β; 및 엽산 수용체 δ로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다. 친화도의 일 샘플 측정에서, 표적 잔기는 RFC에 대한 결합 친화도보다 2배, 5배, 10배, 25배, 100배, 500배 또는 5000배 이상 강한 친화도를 갖는 엽산 수용체를 결합할 수 있다.
표적 잔기를 수반하는 예시적인 양태에서, 표적 잔기는 항체의 항원 결합 서열을 포함하는 단백질일 수 있다. 항체의 항원 결합 서열은 항체 기원(antibody origin)의 하나 이상의 상보 결정 부위(complementary determining regions)를 포함한다. 단백질은 항체를 포함할 수 있다. 일 예시적인 양태에서, 표적 잔기는 항체; 인간화 항체(humanized antibody); 항체의 항원 결합 단편; 단일 쇄 항체; 단일-도메인 항체; 양특이성 항체; 합성 항체; 페길화 항체; 및 다량체 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상이다.
리포솜 항엽산 조성물 또는 리포솜 조성물의 리포솜은 리포솜당 200개 이하 또는 250개 이하의 표적 잔기를 포함할 수 있다. 예로서, 리포솜은 30 내지 200개의 표적 잔기를 포함할 수 있다.
한 측면은 또한 이의 표면상 엽산 수용체를 발현하는 종양에 생활성 항엽산제를 전달하는 방법에 관한 것이며, 당해 방법은 치료학적 유효 용량의 생활성 항엽산제를 종양에 전달하는 양의 리포솜 항엽산 조성물과 같은 조성물 중 어느 하나를 투여함을 포함한다. 투여는 주입; 주사; 비경구 투여; 및 국소 투여로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 대상체(subject)는 어떠한 동물 또는 어떠한 포유동물일 수 있다. 적합한 동물의 예는 본 개시에 열거되어 있다. 예를 들면, 대상체는 사람일 수 있다.
조성물은 어떠한 적합한 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 리포솜 항엽산 조성물 또는 리포솜 조성물의 한 가지 예시적인 제조방법은 (1) 리포솜 성분; (2) 수용액 중의 생활성 항엽산제; (3) 리포솜 성분에 임의로 이미 부착되거나 결합될 수 있는 표적 잔기를 포함하는 혼합물을 형성하는 단계를 포함한다. 다음 단계는 혼합물을 균질화시켜 상기 수용액 중의 리포솜을 형성하고; 혼합물을 막(membrane)을 통하여 압출시켜 수용액에 생활성 항엽산제를 내포하는 리포솜을 형성함을 수반한다. 당해 방법은 상기 압출 단계 이후 수용액 중의 리포솜 외부에 있는 과량의 생활성 항엽산제를 제거하는 임의의 단계를 포함할 수 있다. 당해 방법은 상기 제거 단계 이후 상기 조성물을 동결건조(lyophilization)하여 동결건조된 조성물을 형성하는 임의의 단계를 추가로 포함할 수 있다. 당해 방법은 또 다른 임의 단계를 포함할 수 있다. 당해 단계는 상기 동결건조 단계 이후 상기 동결건조 조성물을 용매에 용해시켜 상기 동결건조 조성물을 재구성하는 것이다.
혼합물은 만니톨; 트레할로스; 소르비톨; 및 수크로스로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다. 하나 이상의 리포솜 성분은 입체 안정제를 추가로 포함한다. 입체 안정제는 폴리에틸렌 글리콜(PEG); 폴리-L-리신(PLL); 모노시알로강글리오시드(GM1); 폴리(비닐 피롤리돈)(PVP); 폴리(아크릴아미드)(PAA); 폴리(2-메틸-2-옥사졸린); 폴리(2-에틸-2-옥사졸린); 포스파티딜 폴리글리세롤; 폴리[N-(2-하이드록시프로필) 메타크릴아미드] ; 양친매성 폴리-N-비닐피롤리돈; L-아미노산계 중합체; 및 폴리비닐 알콜로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다. PEG는 수 평균 분자량(Mn)이 200 내지 5000달톤일 수 있다. 조성물을 제조하는 방법에서, 용매는 수성 용매일 수 있다.
엽산 수용체를 선택적으로 표적으로 한 표적 리포솜 조성물(targeted liposomal composition)이 제공된다. 예시적인 표적 리포솜 조성물은 내부 공간을 갖는 리포솜; 상기 내부 공간 내에 배치된 생활성제; 리포솜의 외부에 부착된 입체 안정제 분자; 및 하나 이상의 엽산 수용체에 대한 특이적 친화도를 갖는 단백질을 포함하는 표적 잔기를 포함하며, 상기 표적 잔기는 입체 안정제 및 리포솜의 외부 중 적어도 하나에 부착된다. 입체 안정제는 폴리에틸렌 글리콜(PEG); 폴리-L-리신(PLL); 모노시알로강글리오시드(GM1); 폴리(비닐 피롤리돈)(PVP); 폴리(아크릴아미드)(PAA); 폴리(2-메틸-2-옥사졸린); 폴리(2-에틸-2-옥사졸린); 포스파티딜 폴리글리세롤; 폴리[N-(2-하이드록시프로필) 메타크릴아미드]; 양친매성 폴리-N-비닐피롤리돈; L-아미노산계 중합체; 및 폴리비닐 알콜로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다. 예를 들면, PEG는 수 평균 분자량(Mn)이 200 내지 5000달톤일 수 있다. 이러한 표적 리포솜 조성물에서, 생활성제는 엘립티신(ellipticine); 파클리탁셀(paclitaxel); 페메트렉시드; 메토트렉세이트; 랄리트렉시드; 아미노프테린; 프랄라트렉세이트; 로메트렉솔; 로메트렉솔의 티오펜 유사체; 로메트렉솔의 푸란 유사체; 트리메트렉시드; LY309887; GW 1843U89; 프로구아닐; 피리메타민; 트리메토프림 및 GARFT 억제제의 6-치환된 피롤로 및 티에노[2,3-d]피롤로피리미딘 종류로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 포함한다.
조성물은 예를 들면, (1) 리포솜 성분; (2) 수용액 중의 생활성제; (3) 표적 잔기를 포함하는 혼합물을 형성하여 제조될 수 있다. 다음 단계는 혼합물을 균질화시켜 상기 수용액 중의 리포솜을 형성하고; 혼합물을 막을 통하여 압출시켜 수용액에 생활성 항엽산제를 내포하는 리포솜을 형성함을 수반한다. 임의 단계는 상기 압출 단계 이후 리포솜의 외부의 수용액 중의 과량의 생활성 항엽산제를 제거함을 수반할 수 있다. 또 다른 임의 단계는 상기 제거 단계 이후 상기 조성물을 동결건조시켜 동결건조된 조성물을 형성함을 수반한다. 또 다른 임의 단계는 상기 동결건조 단계 이후 상기 동결건조 조성물을 용매에 용해시켜 상기 동결건조 조성물을 재구성함을 수반한다. 기타 성분 및 단계는 본원에서 논의된 바와 같은 기타 제조 방법으로부터 공유될 수 있다.
리포솜 항엽산 조성물을 포함하는, 어떠한 리포솜 조성물이라도 제공하기 위한 키트 또한 제공된다. 키트는 리포솜 성분, 조성물을 사용하여 생활성제를 캡슐화시키기 위한 설명서, 및 임의로 개별적인 용기내, 생활성제를 포함할 수 있다.
도 1a는 정상 조직을 나타내는 개략도이다.
도 1b는 암 조직을 나타내는 개략도이다.
도 2는 예시적인 양태 및 이의 결합 메카니즘을 나타내는 개략도이다.
도 3은 세포 표면상 엽산 수용체에 결합하는 형광색소 접합 항체를 나타내는 개략도이다.
도 4는 엽산 수용체 α를 발현하는 세포에 결합하고 이로 내재화하는 예시적인 리포솜을 나타내는 개략도이다.
도 5는 p38 단백질 키나제 경로를 사용한 세포 증식에서 예시적인 리포솜 조성물의 내재화의 효과를 나타내는 개략도이다.
도 6은 형광색소를 사용하는 KB 세포의 유동 세포측정 분석으로부터의 데이터를 나타낸다.
도 7은 형광색소를 사용하는 OVCAR-3(난소) 세포의 유동 세포측정 분석으로부터의 데이터를 나타낸다.
도 8은 형광색소를 사용하는 NCIH2452(중피종) 세포의 유동 세포측정 분석으로부터의 데이터를 나타낸다.
도 9는 형광색소를 사용하는 CCD841(정상 결장) 세포의 유동 세포측정 분석으로부터의 데이터를 나타낸다.
도 10은 형광색소를 사용하는 SL0003(폐) 세포의 유동 세포측정 분석으로부터의 데이터를 나타낸다.
도 11은 형광색소를 사용하는 CCD841(정상 결장) 세포의 유동 세포측정 분석으로부터의 데이터를 나타낸다.
도 12는 정상 세포 또는 암세포내 예시적 리포솜 조성물의 표면 수준을 나타내는 막대 그래프이다.
도 13은 RhodoRed를 사용하는 난소암세포의 유동 세포측정 분석으로부터의 데이터를 나타낸다.
도 14는 RhodoRed를 사용하는 KB 엽산 수용체 α 고 세포(KB folate receptor alpha high cells)의 유동 세포측정 분석으로부터의 데이터를 나타낸다.
도 15는 RhodoRed를 사용하는 정상 유방 세포의 유동 세포측정 분석으로부터의 데이터를 나타낸다.
도 16은 RhodoRed를 사용하는 정상 결장 세포의 유동 세포측정 분석으로부터의 데이터를 나타낸다.
도 17은 리포솜 농도 의존성 표적화 대 비표적화 리포솜 농도 의존성 검출을 나타내는 막대 그래프를 나타낸다.
도 18a는 미처리 세포의 유동 세포측정 분석으로부터의 데이터를 나타낸다.
도 18b는 예시적 양태에 따르는 예시적 리포솜 조성물로 처리된 세포의 유동 세포측정 분석으로부터의 데이터를 나타낸다.
도 19는 열거된 바와 같은 다양한 시약에 노출된 폐암세포를 나타낸다.
도 20은 성장 억제와 엽산 수용체 α 발현 사이의 상관 관계를 나타내는 선 그래프이다.
도 21은 결과를 요약하고 예시적인 양태의 예시적인 리포솜 조성물이 암세포 성장을 억제함을 나타내는 막대 그래프이다.
도 22a는 정상 세포의 세포 주기를 나타내는 개략도이다.
도 22b는 다양한 세포 주기 단계에서의 세포의 요오드화프로피듐 정량화를 나타내는 도표이다.
도 23a는 미처리된 세포의 요오드화프로피듐 정량(Propidium Iodide quantification)으로부터의 데이터를 나타낸다.
도 23b는 페메트렉시드로 처리된 세포의 요오드화프로피듐 정량화로부터의 데이터를 나타낸다.
도 24는 리포솜 조성물의 예시적 양태에 의한 세포 주기 정체를 나타내는 막대 그래프이다.
도 25는 성숙 호중구(maturing neutrophil)를 측정하는 Mac-1에 대한 세포의 분석을 나타낸다.
도 26a는 정상 세포로부터의 유동 세포측정 분석 데이터를 나타낸다.
도 26b는 페메트렉시드 처리된 세포로부터의 유동 세포측정 분석 데이터를 나타낸다.
도 27은 페메트렉시드 처리된 샘플 및 예시적인 양태 처리된 샘플에서의 분화 호중구의 수를 나타내는 막대 그래프이다.
위에서 논의된 바와 같은, 항엽산 약제는 일단 세포 내에 있는 엽산염의 작용을 방해하고, 세포에서 복제하고 증식시킬 필요가 있는 DNA 전구체를 박탈하여 작용하는 엽산염 모방 분자로서 디자인되었다. 암세포는 엽산염 형태의 DNA 전구체에 대한 높은 수요로 급성장하는 세포이기 때문에, 엽산염과 동일한 방식으로 항엽산 약제를 끌어올리고, 항엽산염의 효과에 민감한 결과이다. 그러나, 급성장하는 정상 세포, 예를 들면, 위장(GI)관을 라이닝하는 세포 및 골수의 세포, 예를 들면, 호중구는 신속하게 그리고 주로 RFC를 통하여 공급되는 엽산염을 사용하여 분열한다. 그러므로, 대부분의 항엽산염이 암세포에 침투하여 이를 죽이는 데 사용하도록 디자인된 RFC 매개된 수송 메카니즘은 정상 세포가 그 자체에 엽산염을 공급하는 데 사용하는 동일한 메카니즘이기 때문에, 정상 세포는 항엽산염의 독성 작용에 민감하다. 그 결과, 매우 유망하고 유효한 항엽산염을 사용하는 암의 치료는 급성장하는 정상 세포에 대한 부가적 손상을 유발하여, 항엽산염 관련된 심각하고 잠재적으로 생명 위협적인 독성을 유발하는 치료의 높은 가능성 때문에, 환자의 임상적 관리에서 곤란한 도전이었다.
위에서 논의된 바와 같이, 한 종류로서의 항엽산염은 세포 성장 및 분열을 억제하는 암의 치료에서 이의 항증식 효과를 위하여 사용되어, 암세포가 죽도록 한다. 신속하게 복제하는 암세포는 대부분의 정상 세포와 비교시 증가된 양의 엽산염을 필요로 한다. 이는 거의 70년전 항암제로서 항엽산염의 임상적 개발로 이어졌다. 그러나, 항엽산염을 기반으로 한 요법은 암치료에 유효한 것으로 나타났지만, 항엽산염의 임상 개발은 문제시되었고, 강력한 임상적 딜레마로 인하여 종종 무산되었다. 이러한 딜레마는 두 가지 대립적인 임상 역학으로부터 생겨난다. 한 편으로, 항엽산염은 엽산염 모방 분자가 되도록 디자인되며, 이들 대부분은 바람직한 막 관통 수송 메카니즘으로서 RFC를 사용하여 암세포에 이르도록 의도된다. 다른 한편으로, 체내 신속 재생 조직, 예를 들면, 골수 또는 장관 조직 세포는 암세포와 같이, 또한 매우 엽산염 의존적이고 또한 주요 막 관통 엽산염 세포 공급 메카니즘으로서 RFC를 사용한다. 이들 두 임상 역학의 최종 결과는 골수 및 위장(GI)관 세포가 환자의 생명을 위협하는 항엽산염 관련 독성이 가장 만연하는 부위가 되었다는 것이다. 이들 독성 일부는 점막염, 설사, 빈혈, 호중구 감소증 및 낮은 백혈구 수를 포함하였다. 이러한 독성은 단독으로 또는 함께, 항엽산염을 기반으로 한 치료로 인한 환자 사망의 원인이 되는 다수 사례에 나타났다. 결과는 이제까지 다수의 유효한 유망한 항엽산염이 암세포에 대한 유효성 부족 때문이 아니라, 환자 안전 우려 때문에, 이의 개발 동안 지속적으로 실패하였다는 것이다. 의약이 되는 단계에 이르게 된 소수는 역시 안전 우려로 인하여 임상 실시에서의 사용이 제한된다.
한 종류로서의 항엽산염은 환자에 대하여 심각하고 생명 위협적이기까지 한 독성의 연관된 위험에도 불구하고 여전히 암에 대한 유망한 치료 방식이다. 도전은 정상 세포에 대한 손상을 피하는 방식으로 이러한 매우 유효한 항엽산염을 전달하는 방법을 알아내는 것이다.
이전에는 RFC를 사용하여 항암제를 전달하는 데 일반적으로 노력이 집중되었다. 그러나, 본 발명자들은 이들로 제한되지는 않지만, 예를 들면, 엽산 수용체 α, 엽산 수용체 β 및/또는 엽산 수용체 δ를 포함하는, 엽산 수용체를 수반하는 암세포에서 특히 만연한 또 다른 경로를 이용한다. 암세포가 지속적인 이의 신속한 복제 및 증식 요구에 대하여 엽산염을 효율적으로 흡수하기 위하여 정상 세포와 대조적으로 엽산 수용체 α를 우선적으로 발현함이 암 생물학에서 관찰되었다. 암세포는 정상 세포와 비교하여 그 자체에 혈류에 함유된 엽산염을 공급하는 데 매우 효율적이다. 암세포가 이를 수행하는 한 가지 방법은 이의 엽산 수용체, 예를 들면, 엽산 수용체 α 과발현에 의해서이다. 암이 진행됨에 따라, 종양 세포 표면 엽산 수용체 α 수준은 필시 엽산염 공급에 대한 증가하는 요구로 인하여, 증가하는 경향이 있다.
엽산 수용체 α에 대한 이의 높은 친화도 때문에, 엽산(folic acid)은 우선적으로 세포독성 약제를 암세포에 전달하려는 목적으로, 세포독성 약제를 함유하는 리포솜에 접합되거나 세포독성 약제 자체에 접합되어, 항암 또는 세포독성 분자를 암세포로 전달하기 위한 표적 잔기로서 통상적으로 연구되었다. 이러한 접근은 대부분 환자 안전성 개선으로 이어지지 않았는데, 이는 본 발명자들이 인식한 바와 같이, 이러한 접근이 세포독성을 암세포에 전달하는 접근으로서의 엽산염 경로를 이용하면서, 정상 세포의 세포독성 약제로의 노출을 감소 및/또는 최소화하는 데 있어서 생물학적 주요 차이를 인정하지 못하기 때문이며; 표적 리간드로서의 엽산으로, 이러한 표적 약제가 여전히 RFC를 통하여 정상 세포에 의하여 끌어올려지기고 있었기 때문에, 정상 세포는 독성으로부터 확산되지 않고 있었다. 다시 말하면, 표적 잔기로서 엽산을 사용하는 표적 약제는, 이러한 구성물의 약제가 암세포 및 정상 세포 둘 다에 의하여 무차별적으로 끌어올려지는 기타 엽산 모방 분자와 같이 엽산 수용체 α 및 RFC 둘 다에 결합하기 때문에, 통상의 비표적 항엽산과 생물학적으로 차이가 없다. 그러므로, 표적 잔기로서 엽산을 사용하면 정상 세포를 피하는 한편, 암세포에 대한 세포독성제의 선택적 전달이 제공되지 않는다. 따라서, 표적 잔기로서의 엽산으로는, 약제 관련 독성으로 환자 관리에 우려가 남았다. 그 결과, 선도하는 전문가들은 암세포의 선택적 표적에 대한 수단으로서 엽산 수용체를 이용하려는 노력이 무효할 수 있어, 당업자의 노력을 엽산 수용체를 이용하려는 시도에서 돌릴 것을 제안하였다.
표적 잔기로 엽산 수용체에 대하여 항엽산염을 표적으로 하는 것은 이제까지 시도된 적이 없다. 항엽산염은 엽산염을 모방하기 때문에, 엽산 통로를 이용하여 표적 방식으로 항엽산염을 전달하는 것을 이용하려고 생각하지 않을 것이다. RFC는 이미 엽산염을 세포로 수송하므로, 이는 불필요한 것으로 여겨질 것이다. 이러한 이해로부터, 항엽산염이 엽산염을 모방하기 때문에, 항엽산 약제가 세포에 의한 엽산 수용체에 의하여 유효하게 끌어올려질 것이고, 예를 들면, 항체를 사용한 추가의 보조가 필요하지 않을 것이라고 결론짓는 것이 본래 타당하였다. 반직관적인 접근을 본 발명자들이 취하였다. 항엽산염 관련 독성을 감소시키거나 방지하기 위하여 항엽산염이 RFC를 통하여 정상 세포에 의하여 끌어올려지는 것을 막는 것이 중요하였기 때문에, 본 발명자들은 이러한 목표가 특히, 항엽산염 연구 분야에 유용한 것으로 인정받지 못했던 암 특이 형태학: 종양 조직 세포에 의한 극성의 손실을 이용하여, 달성될 수 있을 것임을 밝혀내었다.
세포 극성의 파괴 및 조직 해체는 진행된 상피 종양의 전형적 특징이다. 도 1a에 나타낸 바와 같이, 정상 단순 상피는 일반적으로 별개의 정점-기저 극성을 표시하는 개별적인 세포의 단층을 포함한다. 세포는 밀집되어 정점 접합 착체에 의하여 서로 연결되며(도 1a-101), 이는 정점 및 기저측 막 도메인을 분리한다. 극성이 보존되는 정상 조직에서, 엽산 수용체 α는 혈액 순환에서 엽산염과의 직접 접촉에서 벗어나 외부에 위치한 세포의 정점 표면에 부착된다(도 1a-102). 도 1b는 어떻게 고등급 내피 종양내 세포가 정점-기저 극성 및 전체 조직 해체의 손실을 표시하여, 엽산 수용체 α를 혈액 순환에서 엽산염과 직접 접촉하도록 하는지를 나타낸다(1b-103). 종양 조직 세포의 이러한 특징에 대해, 본 발명자들은 통상적인 사고에서 인정되는 것보다 항엽산염을 기반으로 한 요법에 대하여 더 큰 의의가 있다고 믿었다. 본 발명자들은 이것이 항암 요법으로서의 항엽산염을 회복시킬 상당한 잠재성을 갖는 한편, 항엽산염과 연관된 심각하고 때로는 생명 위협적인 관련 독성을 감소시키고/시키거나 최소화시키기까지 하는 것임을 밝혀내었다.
이와 관련하여, 본 발명자들은 암세포에서 고도로 발현되는 엽산 수용체, 예를 들면, 엽산 수용체 α, β 및 δ를 선택적으로 표적으로 하는 한편, RFC(정상 세포에 의하여 사용되는 엽산 통로)를 피하는 방식으로 항엽산제를 전달하여, 항엽산염을 종양 조직 세포에 선택적으로 노출시키는 한편, 항엽산염을 정상 세포에 노출시키는 것을 감소시키거나 피하는 화학적 독립체를 디자인하였다. 이는 극성(polarity)의 손실 이후, 종양 조직 세포가 엽산 수용체, 예를 들면, 엽산 수용체 α를 과발현 및 노출시킬 뿐만 아니라, 암세포내 엽산 수용체가 혈액 순환과 직접 접촉함을 인식하여 가능하며, 이들 둘 다 정상 조직에 대한 경우가 아니다. 이러한 접근은 또한 엽산 수용체 α에 대한 이의 구조적 및 기능적 유사점 때문에 기타 세포 표면 엽산 수용체로 연장할 수도 있다(예: 엽산 수용체 β, 엽산 수용체 δ 등).
당해 개시는 일반적으로 다양한 생활성제, 예를 들면, 항엽산염을 전달하는 데 유용한 리포솜 조성물, 리포솜 조성물의 제조방법 및 리포솜 조성물을 사용하여 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 엽산 수용체를 표적으로 하지만 구체적으로 RFC를 표적으로 하지는 않는 항엽산 캡슐화 리포솜을 제공하는 데 있어서의 특수 용도가 존재한다.
보다 구체적으로, 당해 개시는 하나 이상의 생활성제, 예를 들면, 항암제(항신생물제)를 함유하는 엽산 수용체 또는 하나 초과의 엽산 수용체에 대한 친화도 및 특이성을 갖는 중성 또는 음이온성 리포솜(즉, 비양이온성 리포솜)이 놀랍게도, 이의 세포 표면에서 엽산 수용체를 제공하고 발현하는 세포에 대하여 유효하다는 발견을 근거로 한다.
예시적인 양태에서, 리포솜 항엽산 조성물이 제공된다. 리포솜 항엽산 조성물은 내부 공간을 갖는 리포솜; 내부 공간 내에 배치된 생활성 항엽산제; 리포솜의 외부에 부착된 PEG 분자; 및 하나 이상의 엽산 수용체에 대한 특이적 친화도를 갖는 단백질을 포함하는 표적 잔기를 포함할 수 있으며, 상기 표적 잔기는 PEG 및 리포솜의 외부중 적어도 하나에 부착된다.
용어 부착(attach) 또는 부착된(attached)은 예를 들면, 공유 결합, 이온 결합(예: 아비딘-비오틴), 소수성 상호 작용에 의한 결합 및 말레이미드와 같은 관능기 또는 PEG와 같은 링커를 통한 결합 등의 전 유형의 결합을 말한다. 예를 들면, 검출 가능한 마커, 입체 안정제, 리포솜, 리포솜 성분, 면역자극제가 말레이미드 관능기 또는 PEG-말레이미드 그룹에 의하여 직접 서로 부착될 수 있다.
일부 예시적인 양태에서의 리포솜은 순환에서의 이의 지속성을 증가시킬 수 있는 입체 안정제를 포함한다. 기본 개념은 하나 이상의 입체 안정제, 예를 들면, 친수성 중합체(폴리에틸렌 글리콜(PEG)), 당지질(모노시알로강글리오시드(GMl)) 등은 리포솜 표면에 바로 인접한 공간을 점유하고, 이 공간으로부터 다른 거대분자를 배제한다는 것이다. 결과적으로, 리포솜 표면에 혈장 옵소닌이 접근 및 결합하는 것이 저해되고, 따라서 대식세포와 이러한 리포솜과의 상호 작용, 또는 기타 정화 메카니즘이 억제되고 순환에서의 리포솜의 지속성이 강화된다. 예시적인 양태에서, 입체 안정제 또는 입체 안정제의 개체군은 PEG 또는 PEG를 포함하는 배합물일 수 있다. 예시 양태에서, 입체 안정제는 수 평균 분자량(Mn)이 200 내지 5000달톤인 PEG일 수 있다. 이러한 PEG는 선형, 분지형, 성형 또는 빗형 구조와 같은 어떠한 구조라도 가질 수 있고 시판중이다.
다양한 예시적인 양태의 리포솜 조성물에 함유된 리포솜은 당해 기술분야에 공지되어 있거나 이후에 발견된 어떠한 리포솜이라도 될 수 있다. 일반적으로, 예시적인 양태의 리포솜은 어떠한 리포솜 구조라도, 예를 들면, 하나 이상의 지질 이중층에 의하여 외부 배지로부터 격리된 내부 공간을 갖는 구조, 또는 막이 내부를 격리시키는 친유성 중심부를 갖는 반투과성 막을 갖는 어떠한 마이크로캡슐을 가질 수 있다. 지질 이중층은 친수성 부분(친수성 잔기) 및 소수성 부분(소수성 잔기)를 특징으로 하는 양친매성 분자의 어떠한 배열이라도 될 수 있다. 통상적으로 이중층내 양친매성 분자는 소수성 잔기가 내부로 배향되는 한편, 친수성 잔기가 외부로 배향되는 2차원 시트로 배열된다. 예시적인 양태의 리포솜을 형성하는 양친매성 분자는 어떠한 공지된 또는 이후에 발견된 양친매성 분자, 예를 들면, 합성 또는 천연 기원의 지질 또는 생체적합성 지질일 수 있다. 예시적인 양태의 리포솜은 또한 양친매성 중합체 및 계면활성제, 예를 들면, 폴리머로솜 및 니오솜에 의하여 형성될 수도 있다. 이러한 개시의 목적으로, 제한 없이, 이러한 리포솜 형성 물질은 또한 "지질"이라고 한다.
리포솜 조성물은 액체일 수 있거나 건식, 예를 들면, 건조 분말 또는 건조 케이크의 형태일 수 있다. 건조 분말 또는 건조 케이크는 예를 들면, 동결건조 조건하에 1차 건조를 시킨 것일 수 있거나, 임의로 이는 1차 건조만 또는 1차 건조 및 2차 건조 둘 다를 시킨 것일 수 있다. 건조 형태에서, 분말 또는 케이크는 예를 들면, 수분이 1 내지 6%, 예를 들면, 2 내지 5%, 또는 2 내지 4%일 수 있다. 건조의 일 예시 방법은 동결건조(냉동-건조(free-drying) 또는 냉동데시케이션(cryodessication))이다. 당해 개시 내용의 조성물 및 방법중 어느 것이라도 리포솜, 동결건조 리포솜 또는 동결건조 리포솜으로부터 재구성된 리포솜을 수반할 수 있다. 동결건조에서는, 분자 보호 냉동 건조 물질인, 냉동건조보호제(lyoprotectant) 또는 동결 보호제(cryoprotectant)가 사용될 수 있다. 이러한 분자는 통상적으로 폴리하이드록시 화합물, 예를 들면, 당(단당류, 이당류 및 다당류), 폴리알콜 및 이의 유도체, 글리세롤 또는 폴리에틸렌글리콜, 트레할로스, 말토스, 수크로스, 글루코스, 락토스, 덱스트란, 글리세롤 및 아미노글리코사이드이다. 당해 냉동건조보호제 또는 동결보호제는 예를 들면, 리포솜 외부 또는 리포솜 내부 또는 리포솜 외부와 내부 둘 다의 용액을 10% 이하 또는 20% 이하 포함할 수 있다.
예시적인 양태의 리포솜은 예를 들면, 직경이 30-150nm(나노미터)의 범위일 수 있다. 기타 예시적인 양태에서, 리포솜은 예를 들면, 직경이 40-70nm의 범위일 수 있다.
예시 양태의 리포솜은 예를 들면, 바람직하게는 음이온성 또는 중성일 수 있다. 즉, 리포솜은 양이온성이 아니어야 한다. 전하(즉, 음이온성, 중성 또는 양이온성)의 결정은 리포솜의 제타 전위를 측정하여 수행할 수 있다. 예시적인 양태에서, 리포솜의 제타 전위는 0 이하이다. 또 다른 예시적인 양태에서, 리포솜의 제타 전위는 0-150mV의 범위이다. 또 다른 예시적인 양태에서, 제타 전위는 -30 내지 -50mV의 범위여야 한다.
리포솜의 특성은 리포솜을 제조하는 데 사용된 지질의 특성의 영향을 받는다. 매우 다양한 지질이 리포솜을 제조하는 데 사용되었다. 이는 양이온성, 음이온성 및 중성 지질을 포함한다. 양이온성 지질은 유전자 형질감염제(gene transfection agent)로서 통상적으로 사용되는 양이온성 리포솜을 제조하는 데 사용된다. 양이온성 리포솜에 대한 양전하는 세포 표면상 음전하와의 상호 작용을 가능하게 한다. 세포에 양이온성 리포솜이 결합한 이후, 리포솜은 세포내이입을 통하여 세포 내에 수송된다. 그러나, 양이온성 리포솜은 정상 세포 및 종양 세포 둘 다에 결합된다. 예시적인 양태는 특이적으로 및 선택적으로 종양 세포를 표적으로 하는 한편, 정상 세포는 실질적으로 피하려는 것이기 때문에, 양이온성 지질의 사용은 바람직하지 않다. 예를 들면, HSPC 등의 중성 지질과 PEG-DSPE 등의 음이온성 지질의 혼합물을 사용하면 정상 세포에 비특이적으로 결합될 가능성이 덜한 음이온성 리포솜이 형성된다. 종양 세포에 대한 특이 결합은 종양 표적 항체, 예를 들면, 엽산 수용체 α 항체, 엽산 수용체 β 항체 및/또는 엽산 수용체 δ 항체를 포함하는 엽산 수용체 항체를 사용하여 달성될 수 있다.
예로서, 지질의 하나 이상(또는 일부)은 친수성 및 소수성 부분(통상적으로 친수성 헤드 및 소수성 테일)을 갖는다고 정의된, 양친매성 지질이다. 소수성 부분은 통상적으로 소수성 상으로(예: 이중층 내부) 배향하는 한편, 친수성 부분은 통상적으로 수성 상 쪽으로(예: 이중층 외부) 배향한다. 친수성 부분은 극성 또는 하전된 그룹, 예를 들면, 카보하이드레이트, 포스페이트, 카복실, 설페이토, 아미노, 설포하이드릴, 니트로, 하이드록시 및 기타 유사 그룹을 포함할 수 있다. 소수성 부분은 제한 없이 장쇄 포화 및 불포화 지방족 탄화수소 그룹 및 하나 이상의 방향족, 지환족 또는 헤테로사이클릭 그룹(들)에 의하여 치환된 그룹을 포함하는 비극성 그룹을 포함할 수 있다. 양친매성 화합물의 예는 이들로 제한되지는 않지만, 인지질, 아미노지질 및 스핑고지질을 포함한다.
통상적으로, 예를 들면, 지질은 인지질이다. 인지질은 제한 없이 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜세린 등을 포함한다. 기타 지질 막 성분, 예를 들면, 콜레스테롤, 스핑고미엘린, 카디오리핀 등이 사용될 수 있음을 이해하여야 한다.
예시적인 양태에서, 지질은 음이온성 및 중성 인지질을 포함하는 음이온성 및 중성(쯔비터이온성 및 극성 포함) 지질일 수 있다. 중성 지질은 선택된 pH에서의 비하전되거나 중성인 쯔비터이온성 형태로 존재한다. 생리학적 pH에서, 이러한 지질은 예를 들면, 디올레오일포스파티딜글리세롤(DOPG), 디아실포스파티딜콜린, 디아실포스파티딜에탄올아민, 세라마이드, 스핑고미엘린, 세팔린, 콜레스테롤, 세레브로사이드 및 디아실 글리세롤을 포함한다. 쯔비터이온성 지질의 예는 제한 없이 디올레오일포스파티딜콜린(DOPC), 디미리스토일포스파티딜콜린(DMPC) 및 디올레오일포스파티딜세린(DOPS)을 포함한다. 음이온성 지질은 생리학적 pH에서 음으로 하전된 지질이다. 이러한 지질은 제한 없이 포스파티딜글리세롤, 카디오리핀, 디아실포스파티딜세린, 디아실포스파티딘산, N-도데카노일 포스파티딜에탄올아민, N-석시닐 포스파티딜에탄올아민, N-글루타릴포스파티딜에탄올아민, 리실포스파티딜글리세롤, 팔미토일올레오일포스파티딜글리세롤(POPG), 및 중성 지질에 접합된 기타 음이온성 개질 그룹을 포함한다.
집합적으로, 음이온성 및 중성 지질은 본원에서 비양이온성 지질이라고 한다. 이러한 지질은 인을 함유할 수 있지만 이것으로 제한되지는 않는다. 비양이온성 지질의 예는 레시틴, 리소레시틴, 포스파티딜에탄올아민, 리소포스파티딜에탄올아민, 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE), 디팔미토일 포스파티딜 에탄올아민(DPPE), 디미리스토일포스포에탄올아민(DMPE), 디스테아로일-포스파티딜-에탄올아민(DSPE), 팔미토일올레오일-포스파티딜에탄올아민(POPE), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린(POPC), egg 포스파티딜콜린(EPC), 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 디올레오일포스파티딜콜린(DOPC), 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 디올레오일포스파티딜글리세롤(DOPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG), 팔미토일올레오일포스파티딜글리세롤(POPG), 16-0-모노메틸 PE, 16-0-디메틸 PE, 18-1-트랜스 PE, 팔미토일올레오일-포스파티딜에탄올아민(POPE), l-스테아로일-2-올레오일포스파티디에탄올아민(SOPE), 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 스핑고미엘린, 세팔린, 카디오리핀, 포스파티딘산, 세레브로사이드, 디세틸포스페이트 및 콜레스테롤을 포함한다.
예시적인 양태의 리포솜은 리포솜 성분(liposomal component)(liposome component이라고도 함)을 사용하는 어떠한 리포솜 어셈블리 방법을 사용하여 어셈블링될 수 있다. 리포솜 성분은 예를 들면, 지질, 예를 들면, DSPE, HSPC, 콜레스테롤 및 이들 성분의 유도체를 포함한다. 기타 적합한 지질은 예를 들면, 아반티 폴라 리피즈 인코포레이티드(Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, Alabama, U.S.A.)에서 시판중이다. 음이온성 리포솜의 제조에 적합한 이용 가능한 음으로 또는 중성으로 하전된 지질의 부분 목록은 예를 들면, 다음 중의 하나 이상일 수 있다: DLPC, DMPC, DPPC, DSPC, DOPC, DMPE, DPPE, DOPE, DMPA·Na, DPPA·Na, DOPA·Na, DMPG·Na, DPPG·Na, DOPG·Na, DMPS·Na, DPPS·Na, DOPS·Na, DOPE-글루타릴·(Na)2, 테트라미리스토일 카디오리핀·(Na)2, DSPE-mPEG-2000·Na, DSPE-mPEG-5000·Na, 및 DSPE-말레이미드 PEG-2000·Na.
이러한 지질의 유도체는 예를 들면, 적어도, 리포솜 성분에 대한 하나 이상의 입체 안정제 및/또는 관능기의 결합(바람직하게는 공유 결합)을 포함하며, 그 후 입체 안정제 및/또는 관능기가 리포솜 성분의 부분이라고 고려되어야 한다. 관능기는 단백질 등의 또 다른 잔기에 리포솜 성분을 부착시키는 데 사용될 수 있는 그룹을 포함한다. 이러한 관능기는 적어도, 말레이미드를 포함한다. 이러한 입체 안정제는 폴리에틸렌 글리콜(PEG); 폴리-L-리신(PLL); 모노시알로강글리오시드(GM1); 폴리(비닐 피롤리돈)(PVP); 폴리(아크릴아미드)(PAA); 폴리(2-메틸-2-옥사졸린); 폴리(2-에틸-2-옥사졸린); 포스파티딜 폴리글리세롤; 폴리[N-(2-하이드록시프로필) 메타크릴아미드]; 양친매성 폴리-N-비닐피롤리돈; L-아미노산계 중합체; 및 폴리비닐 알콜로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 포함한다.
리포솜 성분은 여기에 결합된 어떠한 분자(들)(즉, 약품/시약/단백질)라도 포함할 수 있기 때문에, 리포솜 성분은 예를 들면, 적어도, DSPE, DSPE-PEG, DSPE-말레이미드, HSPC; HSPC-PEG; HSPC-말레이미드; 콜레스테롤; 콜레스테롤-PEG; 및 콜레스테롤-말레이미드를 포함할 수 있다. 바람직한 양태에서, 리포솜을 구성하는 리포솜 성분은 DSPE; DSPE-FITC; DSPE-말레이미드; 콜레스테롤; 및 HSPC를 포함한다.
예시적 양태에서, 지질 이중층의 하나 이상의 성분이 관능화(반응성)된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 관능화 성분은 시약 및 잔기를 지질에 가교결합시키는 데 사용될 수 있는 반응성 그룹을 포함하는 성분이다. 지질이 관능화(functionalized)되는 경우, 이것이 형성한 어떠한 리포솜이라도 또한 관능화된다.
예시적 양태에서, 반응성 그룹은 가교결합제(또는 기타 잔기)와 반응하여 가교결합을 형성하는 것이다. 반응성 그룹은 지질 위에 어느 곳에라도 위치하여 지질을 통해 가교결합제와 접촉되어 또 다른 잔기(즉, 입체 안정제, 표적 잔기 등)와 가교결합할 수 있다. 일부 양태에서, 이는 예를 들면, 인지질을 포함한, 지질의 헤드 그룹에 존재한다. 반응성 그룹의 예는 말레이미드 그룹이다. 말레이미드 그룹은 이것으로 제한되지는 않지만, 디티올트레이톨(DTT) 등의 디티올 가교결합제의 존재하에 서로 가교결합될 수 있다.
예시적인 양태는 기타 관능화 지질, 기타 반응성 그룹 및 기타 가교결합제의 사용을 고려한다는 것을 이해하여야 한다. 말레이미드 그룹 외에, 반응성 그룹의 기타 예는, 이들로 제한되지는 않지만, 기타 티올 반응성 그룹, 아미노 그룹, 예를 들면, 1급 및 2급 아민, 카복실 그룹, 하이드록실 그룹, 알데히드 그룹, 알킨 그룹, 아지드 그룹, 카보닐, 할로 아세틸(예: 요오도아세틸) 그룹, 이미도에스테르 그룹, N-하이드록시석신이미드 에스테르, 설프하이드릴 그룹, 피리딜 디설파이드 그룹 등을 포함한다.
관능화(functionalized) 및 비관능화(non-functionalized) 지질은 아반티 폴라 5 리피즈(Avanti Polar 5 Lipids, Alabaster, Ala.)를 포함한 다수의 상업적 출처로부터 입수 가능하다.
예시적 양태의 리포솜은 이의 외부에 배치된 면역 자극제, 검출 가능한 마커 또는 둘 다를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, 면역 자극제 또는 검출 가능한 마커는 예를 들면, 임의로 입체 안정제 외부를 포함한, 리포솜의 외부에 이온 결합 또는 공유 결합될 수 있다.
면역 자극제(immuno stimulant), 면역 자극기(immunostimulator), 합텐 및 보조제로도 공지된, 면역 자극제(immunostimulatory agent)는 이의 성분들 중의 어느 것의 활성화를 유도하거나 이의 활성을 증가시켜 면역계를 자극시키는 물질이다.
이러한 면역 자극제는 합텐, 보조제, 단백질 면역 자극제, 핵산 면역 자극제 및 화학적 면역 자극제 중의 하나 이상을 포함할 수 있다. 다수의 보조제는 면역 반응을 자극하도록 디자인된 물질, 예를 들면, 지질 A, 보르타델라 페르투시스(Bortadella pertussis) 또는 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) 유도된 단백질을 함유한다. 특정한 보조제는 예를 들면, 프로이드의 불완전 보조제 및 완전 보조제(Freund's Incomplete Adjuvant and Complete Adjuvant, Difco Laboratories, Detroit, Mich.); 머크 보조제(Merck Adjuvant) 65(Merck and Company, Inc., Rahway, N.J.); AS-2(SmithKline Beecham, Philadelphia, Pa.); 알루미늄 하이드록사이드 겔(alum) 또는 인산알루미늄 등의 알루미늄 염; 칼슘, 철 또는 아연의 염; 아실화 티로신의 불용성 현탁물; 아실화 당; 양이온 또는 음이온 유도체화 다당류; 폴리포스파젠; 생분해성 미소구체; 모노포스포릴 지질 A 및 퀼 A. 시토카인, 예를 들면, GM-CSF, 인터류킨-2, -7, -12로서 시판중이고, 기타 유사 성장 인자가 또한 보조제로서 사용될 수도 있다. 바람직한 양태에서, 면역 자극제는 플루오레세인, DNP, β 글루칸(beta glucan), β-1,3-글루칸(beta-1,3-glucan), β-1,6-글루칸(beta-1,6-glucan)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
검출 가능한 마커는 예를 들면, 적어도, 당해 기술분야에 공지된 어떠한 적합한 수단에 의해서라도, 예를 들면, 자기 공명 영상(MRI), 광학 영상, 형광/발광 영상 또는 핵 영상 기술에 의하여 검출 가능한, 방사성 동위 원소, 형광 화합물, 생물 발광 화합물, 화학 발광 화합물, 금속 킬레이터, 효소, 염료, 잉크, 자기 화합물, 생체 촉매 또는 안료를 포함한다.
면역 자극제 및/또는 검출 가능한 마커는 이를 리포솜으로 공배양시켜 외부에 부착될 수 있다. 예를 들면, 면역 자극제 및/또는 검출 가능한 마커는 소수성 상호 작용에 의하여 또는 이온 결합에 의하여, 예를 들면, 아비딘/비오틴 결합 또는 금속 킬레이트화 결합(예: Ni-NTA)에 의하여 리포솜 막과 결합될 수 있다. 대안적으로, 면역 자극제 또는 검출 가능한 마커는 예를 들면, 리포솜 성분 또는 PEG인 입체 안정제에 공유 결합되는 것과 같이, 리포솜의 외부에 공유 결합될 수 있다.
하나의 예시적 시약은 본 발명자들의 실험을 기준으로, 놀랍게도 면역 자극제와 검출 가능한 마커 둘 다로서 작용할 수 있는 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)이다.
예시적 양태는 또한 내부 공간을 내포하는 리포솜에 대해 제공한다. 예시적 양태에서, 내부 공간은 이것으로 제한되지는 않지만, 수용액을 포함할 수 있다. 내부 공간은 생활성제, 예를 들면, 항엽산제 및 약제학적으로 허용되는 수성 담체를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 예를 들면, 트레할로스를 포함할 수 있다. 예시적 양태에서, 트레할로스는 예를 들면, 트레할로스 약 5 내지 20중량% 또는 5 내지 20%의 전체 농도의 하나 이상의 냉동건조보호제 또는 동결보호제의 어떠한 조합으로 존재할 수 있다. 내부 공간은 예를 들면, 5 내지 200mM의 농도의 시트레이트 완충제를 포함할 수 있다. 시트레이트 완충제는 pH 2.8 내지 6으로 내부 공간을 완충시킬 수 있다. 트레할로스 또는 시트레이트 농도에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체는 50 내지 500mM의 아세트산나트륨 및 아세트산칼슘의 전체 농도를 포함할 수 있다.
예시적 양태에서, 생활성 항엽산제는 예를 들면, 수용성 생활성제일 수 있다. 즉, 생활성제는 수용액을 형성할 수 있다. 예시적 양태에 따라, 각각의 리포솜은 생활성제 200,000분자 미만을 함유하는 내부 공간을 포함할 수 있다. 예를 들면, 예시적 양태에서, 리포솜은 생활성 항엽산제 10,000 내지 100,000을 포함할 수 있다.
예시적 양태에서, 생활성제는 페메트렉시드, 로메트렉솔, 메토트렉세이트, 랄리트렉시드, 아미노프테린, 프랄라트렉세이트, 이의 로메트렉솔 유사체, 로메트렉솔의 티오펜 유사체, 로메트렉솔의 푸란 유사체, 트리메트렉시드, LY309887; 및 GW 1843U89로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다. 또 다른 양태에서, 생활성제는 프로구아닐, 피리메타민, 트리메토프림 및 6-치환된 피롤로 및 GARFT 억제제의 티에노[2,3-d]피롤로피리미딘 종류로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다. 하나의 바람직한 양태에서, 생활성 항엽산제는 페메트렉시드이다. 또 다른 예시적 양태에서, 생활성 항엽산제는 로메트렉솔이다.
생활성제를 포함하는 용액의 pH는 예를 들면, 5 내지 8 또는 2 내지 6으로 설정될 수 있다.
예시적 양태에 따라, 실시예의 리포솜 조성물에 함유된 리포솜은 또한 표적 리포솜, 예를 들면, 리포솜의 표면에 하나 이상의 표적 잔기 또는 생물분배 조절제를 포함하는 리포솜일 수도 있다. 표적 리포솜의 예시적 양태는 예를 들면, 면역리포솜이라고 할 수 있다. 표적 잔기는 목적하는 표적에 특이적으로 결합하거나 이와 상호 작용할 수 있는 어떠한 제제라도 될 수 있다. 예시적 양태에서, 표적 잔기는 엽산 수용체, 예를 들면, 엽산 수용체 α, 엽산 수용체 β 및/또는 엽산 수용체 δ에 대한 특이성 및 친화도로 결합하는 잔기일 수 있다. 엽산 수용체는 RFC와 구별되고 이와 상이하고, 세포의 내부로의 상이한 통로를 이용한다. 예시적인 양태에 따라, 표적 잔기는 특이적이고 우선적으로, 리포솜 포획된 독립체가 이의 목적하는 효과를 발휘하는 표적 세포에 결합하고/하거나 이로 내재화한다. 표적 세포는 예를 들면, 암세포, 종양 세포 및/또는 전이 세포일 수 있다. 예시적 양태에서, 표적 잔기를 운반하는 리포솜은 표적 세포에 의하여 내재화된다.
본 개시의 예시적 양태들 중의 어느 것에서라도, 표적 잔기는 항체의 항원 결합 서열을 갖는 단백질일 수 있다. 예시적 양태에서, 단백질은 예를 들면, 적어도, 항체의 항원 결합 부위의 3차원 구조를 가질 수 있다. 표적 잔기로서의 이러한 단백질의 한 가지 예는 항체이다. 그러나, 완전한 항체는 필요하지 않다. 예를 들면, 예시적 양태들 중의 어느 하나의 표적 잔기인 단백질은 항체 기원의 하나 이상의 상보 결정 부위(CDRs)를 포함할 수 있다. 표적 잔기로서 작용할 수 있는 적합한 단백질의 예는 항체, 인간화 항체(humanized antibody), 항체의 항원 결합 단편(antigen binding fragment of an antibody), 단일 쇄 항체(single chain antibody), 단일-도메인 항체(single-domain antibody), 양특이성 항체(bi-specific antibody), 합성 항체(synthetic antibody), 페길화 항체(pegylated antibody) 및 다합체성 항체(multimeric antibody)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 포함한다. 항체는 이들 특징의 조합을 가질 수 있다. 예를 들면, 인간화 항체는 항원 결합 단편일 수 있고, 역시 페길화 및 다합체화될 수 있다. 엽산 수용체 α에 대한 항체는 시판중이다.
사용될 수 있는 예시적 항체는 엽산 수용체 α에 대한 뮤린(murine) 항체이다. 서열은 미국 특허 제5646253호에 기재되어 있다. 예를 들면, 개시된 서열을 기반으로 하여, 유전자가 합성되어 일시적 발현 벡터로 위치되고, 항체가 HEK-293 일시적 발현 시스템에서 생성되었다. 항체는 완전 항체, Fab 또는 논의된 다양한 항체 변이들 중의 어느 하나일 수 있다
리포솜 각각은 예를 들면, 30 내지 250개의 표적 잔기, 예를 들면, 30-200개의 표적 잔기를 포함할 수 있다. 대안적으로, 리포솜 각각은 220개 미만의 표적 잔기, 예를 들면, 200개 미만의 잔기를 포함할 수 있다. 표적 잔기는 예를 들면, 리포솜의 외부에 공유 결합되어 부착될 수 있다. 리포솜의 외부에 존재하는 분자는 예를 들면, 적어도 지질, 입체 안정제, 말레이미드, 콜레스테롤 등을 포함할 수 있다. 예시적 양태에서, 표적 잔기는 말레이미드 관능기를 통하여 리포솜 성분 및 입체 안정제, 예를 들면, PEG 분자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상에 공유 결합될 수 있다. 모든 표적 잔기가 PEG 등의 하나의 성분에 결합되는 것이 가능하다. 또한, 표적 잔기가 상이한 성분에 결합되는 것도 가능하다. 예를 들면, 일부 표적 잔기는 지질 성분 또는 콜레스테롤에 결합될 수 있고, 일부 표적 잔기는 입체 안정제(예: PEG)에 결합될 수 있고 기타 표적 잔기는 검출 가능한 마커 또는 또 다른 표적 잔기에 결합될 수 있다.
예시적 양태에서, 표적 잔기는 항원이 엽산 수용체 α, 엽산 수용체 β 및 엽산 수용체 δ로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 항원에 대한 친화도 및 특이성을 갖는다. 예시적 양태에서, 표적 잔기는 엽산 수용체 α, 엽산 수용체 β 및 엽산 수용체 δ로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2개 이상의 항원에 대한 특이적 친화도(즉, 친화도 및 특이성)를 갖는다. 또 다른 예시적 양태에서, 표적 잔기는 예를 들면, 엽산 수용체 α; 엽산 수용체 β; 및 엽산 수용체 δ인 3개의 항원에 대한 특이적 친화도를 갖는다. 때로는 표적 잔기가 완전한 항원에 결합되지 않고 항원내 다수의 에피토프중 한 에피토프에만 결합되기 때문에, 표적 잔기는 항원의 한 에피토프에 대한 친화도 및 특이성을 가질 수 있다. 예시적인 양태에서, 표적 잔기는 종양 세포에 존재하지만 비-종양 세포에는 없거나 접근할 수 없는 종양 세포 표면 항원 상의 에피토프에 대한 특이적 친화도를 갖는다. 예를 들면, 일부 상황에서, 종양 항원은 정상 세포와 악성 암세포 둘 다의 표면에 존재할 수 있지만, 종양 에피토프는 암세포에서 노출될 수 있을 뿐이다. 추가의 예로서, 종양 항원은 암세포 특이 에피토프가 존재하도록 하는 암에서의 확인 변화를 경험할 수 있다. 위에서 기재한 바와 같은 에피토프에 대한 특이적 친화도를 갖는 표적 잔기는 예시적 양태에서 유용하고 계획된 것이다. 이들 양태에서, 암세포 특이성 에피토프를 갖는 종양 세포는 암세포일 수 있다. 이러한 종양 세포 표면 항원의 예는 적어도, 엽산 수용체 α, 엽산 수용체 β 및 엽산 수용체 δ를 포함한다.
예시적인 양태는 내부 공간을 갖는 리포솜을 포함하는 배지; 상기 내부 공간 내에 배치된 수성 생활성 항엽산제; 하나 이상의 엽산 수용체에 대한 특이적 친화도를 갖는 단백질을 포함하는 표적 잔기를 포함하는 리포솜 항엽산 조성물에 관한 것이며, 상기 표적 잔기는 리포솜의 외부에 배치된다. 예시적 양태에서 배지는 수용액이다. 예시적 양태에서, 내부 공간, 외부 공간(즉, 배지) 또는 내부 공간과 배지 둘 다는 위에 열거된 하나 이상의 냉동건조보호제 또는 동결보호제를 함유한다. 예시적 양태에서, 동결보호제 만니톨, 트레할로스, 소르비톨 및 수크로스가 바람직하다.
위에서 논의된 바와 같이, 예시적 양태의 리포솜은 순환에서의 이의 지속성을 증가시킬 수 있는 입체 안정제를 포함할 수 있다. 기본 개념은 하나 이상의 입체 안정제, 예를 들면, 친수성 중합체(폴리에틸렌 글리콜(PEG)), 당지질(모노시알로강글리오시드(GM1)) 등이 리포솜 표면에 바로 인접한 공간을 점유하고, 이 공간으로부터 기타 거대분자를 배제한다는 것이다. 결과적으로, 리포솜 표면에 대한 혈장 옵소닌의 접근 및 결합이 저해되고, 따라서 대식세포와 이러한 리포솜과의 상호 작용, 또는 기타 정화 메카니즘이 억제되고 순환에서의 리포솜의 지속성이 강화된다.
입체 안정제를 혼입시키는 예시적 양태들 중의 어느 하나에 대하여, 입체 안정제는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리-L-리신(PLL), 모노시알로강글리오시드(GM1), 폴리(비닐 피롤리돈)(PVP), 폴리(아크릴아미드)(PAA), 폴리(2-메틸-2-옥사졸린), 폴리(2-에틸-2-옥사졸린), 포스파티딜 폴리글리세롤, 폴리[N-(2-하이드록시프로필)메타크릴아미드], 양친매성 폴리-N-비닐피롤리돈, L-아미노산계 중합체 및 폴리비닐 알콜로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다. 예시적 양태에서, 입체 안정제 또는 입체 안정제의 개체군은 PEG이다. 예시적 양태에서, 입체 안정제는 수 평균 분자량(Mn)이 200 내지 5000달톤인 PEG이다. 이러한 PEG는 선형, 분지형, 성형 또는 빗형 구조와 같은 어떠한 구조라도 가질 수 있고 시판중이다.
예시적 양태에 따라, 리포솜 조성물은 예시적 양태의 예시적 리포솜 조성물과 담체, 예를 들면, 약제학적으로 허용되는 담체를 함유하는 약제학적 조성물로서 제공될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체의 예는 정상 염수, 등장성 덱스트로스, 등장성 수크로스, 링거액(Ringer's solution) 및 행크액(Hanks' solution)이다. 완충 물질은 첨가되어 저장 안정성에 대해 최적인 pH를 제공할 수 있다. 예를 들면, pH 약 6.0 내지 약 7.5, 보다 바람직하게는 6.5가 리포솜 막 지질의 안정성에 최적이고, 포획 독립체의 탁월한 보유를 위하여 제공된다. 통상적으로 2-20mM 농도의 히스티딘, 하이드록시에틸피페라진-에틸설포네이트(HEPES), 모르폴리노에틸설포네이트(MES), 석시네이트, 타르트레이트 및 시트레이트가 예시적인 완충 물질이다. 기타 적합한 담체는 예를 들면, 물, 완충 수용액, 0.4% NaCl, 0.3% 글리신 등을 포함한다. 단백질, 탄수화물 또는 중합체성 안정제 및 긴장성 조절제, 예를 들면, 젤라틴, 알부민, 덱스트란 또는 폴리비닐피롤리돈을 가할 수 있다. 조성물의 긴장성은 글루코스 또는 보다 불활성인 화합물, 예를 들면, 락토스, 수크로스, 만니톨 또는 덱스트린으로 0.25-0.35mol/kg의 생리학적 수준으로 조절할 수 있다. 이러한 조성물은 통상적인, 익히 공지된 살균 기술에 의하여, 예를 들면, 여과시켜 살균될 수 있다. 수득한 수용액은 사용을 위하여 포장되거나 무균 조건하에 여과하거나 동결건조시킬 수 있으며, 동결건조 제제는 투여 전에 무균 수성 배지와 배합한다.
약제학적 리포솜 조성물은 또한 기타 약제학적으로 허용되는 보조 물질, 예를 들면, pH 조절 및 완충제, 긴장성 조절제 등, 예를 들면, 아세트산나트륨, 나트륨 락테이트, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘 등을 필요한 만큼 함유하여 생리학적 조건에 가깝게 할 수 있다. 추가로, 리포솜 현탁물은 저장시 유리-라디칼 및 지질-과산화 손상에 대하여 지질을 보호하는 지질-보호제를 포함할 수 있다. 친유성 유리-라디칼 ??처, 예를 들면, α-토코페롤 및 수용성 철 특이 킬레이터, 예를 들면, 페리옥사민이 적합하다.
유동 약제학적 제형 중의 예시적인 양태의 리포솜의 농도는 폭넓게 변화될 수 있으며, 즉 통상적으로 약 0.05중량% 미만 또는 약 2-10중량% 이상 내지 30 내지 50중량% 이하이고, 선택된 특정한 투여 방식에 따라, 주로 유체 용적, 점도 등에 의하여 선택된다. 예를 들면, 농도는 증가되어 처리와 연관된 유체 하중을 저하시킬 수 있다. 이는 죽상경화증 연관된 울혈성 심부전 또는 중증 고혈압 환자에 있어서 특히 바람직할 수 있다. 대안적으로, 자극 지질로 구성된 리포솜 약제학적 조성물은 저 농도로 희석되어 투여 부위에서의 염증을 줄일 수 있다.
예시적인 양태는 생활성제, 예를 들면, 항엽산염을 이의 표면 위에 엽산 수용체를 발현하는 종양에 전달하는 방법에 관한 것이다. 예시적인 방법은 본 개시에서의 리포솜을 포함하는 조성물 중의 어느 하나 이상을 치료학적 유효 용량의 생활성 항엽산제를 종양에 전달하는 양으로 투여하는 단계를 포함한다.
투여된 리포솜 약제학적 조성물의 양은 리포솜 내부에 포획된 특정 치료 독립체, 치료되는 질환 상태, 사용되는 리포솜 유형 및 임상의의 판단에 좌우된다. 일반적으로, 투여된 리포솜 약제학적 조성물의 양은 특정한 치료 독립체의 치료학적 유효 용량을 전달하기에 충분하다.
치료학적 유효 용량을 전달하는 데 필요한 리포솜 약제학적 조성물의 양은 약제 시험의 기술 분야에서 통상적인, 시험관내 및 생체내 방법에서의 관례에 의하여 측정될 수 있다. 예를 들면, 문헌[참조: D. B. Budman, A. H. Calvert, E. K. Rowinsky (editors). Handbook of Anticancer Drug Development, LWW, 2003]을 참조한다. 다양한 치료학적 독립체에 대한 치료학적 유효 용량은 당업자에게 익히 공지되어 있으며; 예시적인 양태에 따라, 약제학적 리포솜 조성물을 통하여 전달된 치료학적 독립체는 이의 정규 비-리포솜 제형에서의 동량의 치료학적 독립체를 투여하여 수득된 활성과 적어도 동일하거나 더 높은 활성을 제공한다. 통상적으로 예시적인 양태의 리포솜 약제학적 조성물에 대한 투여량은 예를 들면, 체중 kg당 치료학적 독립체 약 0.005 내지 약 500㎎, 보다 종종, 체중 kg당 치료학적 독립체 약 0.1 내지 약 100㎎의 범위일 수 있다.
유효량은 의학적으로 바람직한 결과를 제공하기에 충분한 제제의 투여량이다. 유효량은 바람직한 결과, 치료되거나 예방되는 특정 조건, 치료되는 대상체의 연령 및 신체 상태, 상태의 중증도, 치료 기간, 동시 또는 병용 치료의 특성(존재하는 경우), 특정 투여 경로 및 건강 요원의 지식 및 전문 기술 내의 유사 인자에 따라 변화한다. 사용되는 최대 용량, 즉 최고 안전 용량은 안전한 의학적 판단에 따르는 것이 일반적으로 바람직하다.
예를 들면, 대상체가 종양이 있는 경우, 유효량은 종양 용적 또는 하중(예를 들면, 종양을 이미지화하여 측정됨)을 감소시키는 양일 수 있다. 유효량은 또한 혈액 또는 기타 체액 또는 조직내 암세포의 존재 및/또는 빈도에 의하여 평가될 수도 있다(예: 생검). 종양이 조직 또는 기관의 정상 기능에 영향을 미치는 경우, 유효량은 조직 또는 기관의 정상 기능을 측정하여 평가될 수 있다. 일부 경우, 유효량은 하나 이상, 바람직하게는 전체 증상을 줄이거나 제거하는 데 필요한 양이다.
예시적인 양태는 약제학적 조성물을 제공한다. 약제학적 조성물은 바람직하게는 약제학적으로 허용되는 담체에 샘플 리포솜 및 바람직하게는 항엽산제(들)를 포함하는 무균 조성물이다.
용어 "약제학적으로 허용되는 담체"는 예를 들면, 예시적인 양태에 의하여 고려된 사람 또는 기타 대상체에 투여하기에 적합한 하나 이상의 혼화성 고형 또는 액상 충전제, 희석제 또는 캡슐화 물질을 말한다.
용어 "담체"는 리포솜 조성물이 투여하기 용이하게 함께 배합되는, 천연 또는 합성의, 유기 또는 무기 성분이다. 약제학적 조성물의 성분은 실질적으로 이의 목적하는 약제학적 효능을 손상시키는 상호 작용을 배제하는 방식으로 혼합한다. 적합한 완충제는 아세트산 및 염(1-2% W/V); 시트르산 및 염(1-3% W/V); 붕산 및 염(0.5-2.5% W/V); 및 인산 및 염(0.8-2% W/V)을 포함한다. 적합한 보존제는 벤즈알코늄 클로라이드(0.003-0.03% W/V); 클로로부탄올(0.3-0.9% W/V); 및 파라벤(0.01-0.25% W/V)을 포함한다.
본원에서 달리 언급되지 않는 한, 다양한 투여 경로가 이용 가능하다. 선택된 특정한 방식은 물론, 선택된 특정 활성제, 치료되는 특정 상태 및 치료 효능에 필요한 투여량에 좌우된다. 제공된 방법은, 일반적으로 말하자면, 임상적으로 허용되지 않는 부작용을 유발하지 않고 목적하는 반응의 유효 수준을 생성하는 어떠한 방식이라도 의미하는, 의학적으로 허용되는 어떠한 투여 방식이라도 사용하여 실시될 수 있다. 가능한 투여 경로는 근육내, 피하, 정맥내, 동맥내, 복막내, 관절내, 경막내수내, 수막공간내, 흉골내 주사 또는 주입 등의 비경구 경로에 의한 주사뿐만 아니라, 경구, 코, 점막, 설하, 기관내, 눈, 직장, 질, 안구, 국소, 경피, 폐, 흡입을 포함한다.
예시적 양태에서, 리포솜 약제학적 조성물은 액상 용제 또는 현탁제로서 예를 들면, 주입 조성물, 주사 조성물, 비경구 조성물 또는 국소 조성물로서 제조될 수 있다. 그러나, 주사전 액상 비히클내 용제 또는 현탁제에 적합한 고체 형태 또한 제조될 수 있다. 조성물은, 예를 들면, 또한 당해 기술분야에 공지된 방법에 따라 장용제피 정제 또는 겔 캡슐로 제형화될 수 있다.
예시적 양태에 따라 중추 신경계의 종양에 제형화된 리포솜 약제를 전달하기 위하여, 리포솜을 종양으로 직접 느린 지속적 두개내 주입(운반 강화 전달 또는 CED)하는 것이 특히 유리할 수 있다. 문헌(참조: Saito, et al., Cancer Research, vol. 64, p. 2572-2579, 2004; Mamot, et al., J. Neuro-Oncology, vol. 68, p. 1-9, 2004)을 참조한다. 조성물은 예를 들면, 조직 표면에 직접 적용할 수도 있다. 서방성, pH 의존 방출성 또는 기타 특정 화학 또는 환경 상태 매개 방출성 투여가 예를 들면, 데포 주사 또는 침식성 이식물 등의 수단에 의하여, 또한 특히 예시적 양태에 포함된다. 몇 가지 특정 예가 예시를 위하여 아래에 열거된다.
경구 투여를 위하여, 화합물은 예를 들면, 리포솜 조성물을 당해 기술분야에 익히 공지된 약제학적으로 허용되는 담체와 배합하여 용이하게 제형화될 수 있다. 이러한 담체는 치료되는 대상체에 의한 경구 섭취를 위한, 정제, 환제, 당제, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 필름, 현탁제 등으로서 제형화를 가능하게 한다. 적합한 부형제는, 예를 들면, 충전제, 예를 들면, 락토스, 수크로스, 만니톨 또는 소르비톨을 포함하는 당; 셀룰로스 제제, 예를 들면, 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 트라가칸트 검, 메틸 셀룰로스, 하이드록시프로필메틸셀룰로스, 나트륨 카복시메틸셀룰로스 및/또는 폴리비닐피롤리돈(PVP)을 포함할 수 있다. 임의로, 경구 제형은 또한 내부 산 조건을 중화시키기 위한 염수 또는 완충제 중에서 제형화되거나, 어떠한 담체 없이 투여될 수 있다.
경구 사용될 수 있는 약제학적 제제는 젤라틴으로 제조된 푸쉬-핏(push-fit) 캡슐뿐만 아니라, 젤라틴 및 가소제, 예를 들면, 글리세롤 또는 소르비톨로 제조된 연질, 밀봉 캡슐을 포함한다. 푸쉬-핏 캡슐은 적합한 액체, 예를 들면, 수용액, 완충액, 지방유, 액체 파라핀 또는 액체 폴리에틸렌 글리콜에 현탁된 리포솜 조성물을 함유할 수 있다. 또한, 안정제를 가할 수 있다. 경구 투여용 전 제형은 이러한 투여에 적합한 투여량이어야 한다.
구강 투여를 위하여, 조성물은 통상적인 방식으로 제형화된 정제 또는 로젠지의 형태로 복용할 수 있다.
흡입에 의한 투여를 위하여, 조성물은 적합한 추진제, 예를 들면, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 기타 적합한 기체의 사용으로, 가압 팩 또는 분무기로부터 에어로졸 분무 제시의 형태로 편리하게 전달될 수 있다. 가압 에어로졸의 경우, 투여 단위는 밸브를 제공하여 계량된 양을 전달함으로써 결정될 수 있다.
조성물을 전신에 전달하는 것이 바람직한 경우, 이는 주사, 예를 들면, 볼러스 주사 또는 연속 주입에 의한 비경구 투여를 위하여 제형화될 수 있다. 주사용 제형은 단위 투여 형태, 예를 들면, 앰풀 또는 다용량 용기에 제공될 수 있다. 약제학적 비경구 제형은 성분들의 수용액을 포함한다. 수성 주사 현탁제는 현탁제의 점도를 증가시키는 물질, 예를 들면, 나트륨 카복시메틸 셀룰로스, 소르비톨 또는 덱스트란을 함유할 수 있다. 대안적으로, 리포솜의 현탁제는 오일계 현탁제로서 제조될 수 있다. 적합한 친유성 용매 또는 비히클은 지방유, 예를 들면, 참기름 또는 합성 지방산 에스테르, 예를 들면, 에틸 올레에이트 또는 트리글리세라이드를 포함한다.
대안적으로, 리포솜 조성물은 사용 전 적합한 비히클, 예를 들면, 무균 무 발열원수와 구성하기 위한 분말 형태 또는 동결건조 형태일 수 있다.
조성물은 예를 들면, 코코아 버터 또는 기타 글리세라이드 등의 통상적인 좌제 기제를 함유하는, 좌제 또는 정체 관장과 같은 직장 또는 질 조성물로 제형화될 수도 있다.
예시적인 양태는 예시적인 양태의 조성물 및 리포솜을 사용하여, 제제를 예를 들면, 고형 종양 암을 포함하는 암을 갖거나 이를 발달시킬 위험이 있는 대상체에 투여함을 고려한다. 예시적인 양태에서, 암은 예를 들면, 이의 세포 표면상 엽산 수용체의 발현에 의하여 구별될 수 있다. 엽산 수용체는 예를 들면, 엽산 수용체 α, 엽산 수용체 β 또는 엽산 수용체 δ를 포함할 수 있다. 예시적인 양태는 조성물이 다량의 생활성제를 단독으로 또는 배합하여 정상 세포(즉, 엽산 수용체를 발현하지 않는 세포)로의 과도한 전달 없이 이들 대상체에게 전달할 수 있음을 고려한다.
엽산 수용체를 발현하는 어떠한 암이라도 치료될 수 있다. 일부 암은 초기 단계에서 엽산 수용체를 발현할 수 있는 한편, 다수의 암은 말기에 엽산 수용체를 발현할 수 있음을 주목하여야 한다. 암은 암종, 육종 또는 흑색종일 수 있다. 암종은 제한되지는 않지만, 기저 세포 암종, 담도암, 방광암, 유방암, 자궁 경부암, 융모막 암종, CNS 암, 결장 및 직장암, 콩팥 또는 신장 세포암, 후두암, 간암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암(NSCLC, 선암, 거대(또는 연맥) 세포 암종 및 편평 세포 암종), 구강암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 피부암(기저 세포암 및 편평상피 세포암), 위암, 고환암, 갑상선암, 자궁암, 직장암, 호흡기계의 암 및 비뇨기계의 암을 포함한다.
육종은 뼈(골육종) 및 연조직(섬유육종)에서 발생하는 간엽 신생물이다. 육종은 제한되지는 않지만, 지방육종(점액성 지방육종 및 다형성 지방육종 포함), 평활근 육종, 횡문근 육종, 악성 말초 신경초 종양(신경초종, 신경섬유육종 또는 신경성 육종이라고도 함), 유잉(Ewing) 종양(유잉 골 육종, 걸외(즉, 뼈가 아닌) 유잉 육종 및 원시성 신경외배엽 종양 포함), 윤활막 육종, 혈관 육종, 맥관육종, 림프관육종, 카포시(Kaposi) 육종, 혈관내피종, 데스모이드 종양(공격성 섬유종증이라고도 함), 융기성 피부섬유육종(DFSP), 섬유 조직구종(MFH), 혈관주위세포종, 악성 간엽세포종, 포상 연부 육종, 상피모양 육종, 투명 세포 육종, 결합조직성 소세포 종양, 위장관 간질 종양(GIST) 및 연골육종을 포함한다.
흑색종은 피부 및 기타 기관의 멜라닌세포계로부터 발생하는 종양이다. 흑색종의 예는 이들로 제한되지는 않지만, 악성흑색점 흑색종, 표재 확장성 흑색종, 결절성 흑색종 및 말단 흑자 흑색종을 포함한다.
암은 고형 종양 림프종일 수 있다. 그 예로는 호지킨(Hodgkin) 림프종, 비-호지킨 림프종 및 B 세포 림프종이 포함된다.
암은 이들로 제한되지는 않지만, 골암, 뇌암, 유방암, 결장암, 결합 조직암, 소화기계의 암, 자궁암, 식도암, 눈암, 두경부암, 위암, 상피내 신생물, 흑색종 신경모세포종, 비-호지킨 림프종, 비소세포 폐암, 전립선암, 망막아세포종 또는 횡문근 육종일 수 있다.
예시적인 양태는 본원에서 고려된 바와 같은 제제의 전달로부터 이익을 얻을 가능성이 있는 어떠한 대상체에게라도 실시될 수 있다. 사람 대상체가 예시적 양태에서 바람직한 대상체이지만, 대상체는 또한 애완동물(예: 개, 고양이, 토끼, 페릿 등), 가축 또는 농장 동물(예: 소, 돼지, 양, 닭 및 기타 가금류), 순종 말 등의 말, 실험실 동물(예: 마우스, 래트, 래빗 등), 포유동물 등의 동물을 포함할 수도 있다. 대상체는 또한 어류 및 기타 수생 종을 포함한다.
제제가 전달되는 대상체는 정상 대상체일 수 있다. 대안적으로, 이는 진단될 수 있는 또는 하나 이상의 특정 제제의 전달로부터 이익을 얻을 수 있는 상태를 갖거나 이를 발달시킬 위험이 있을 수 있다. 예시적 양태에서, 이러한 상태는 암(예: 고형 종양암 또는 비-고형 암, 예를 들면, 백혈병)을 포함한다. 보다 바람직한 양태에서, 이들 상태는 이의 세포 표면에 엽산 수용체를 발현하는 세포를 수반하는 암을 포함한다.
예시적인 양태에 의하여 포함되는 상태를 진단하기 위한 시험은 당해 기술분야에 공지되어 있으며, 통상의 의료 종사자에게 친숙하다. 세포형이 엽산 수용체를 발현할지에 대한 결정은 시판중인 항체를 사용하여 내릴 수 있다. 이러한 실험실 시험은 제한되지는 않지만, 현미경 분석, 배양 의존성 시험(예: 배양물) 및 핵산 검출 시험을 포함한다. 이는 습식 마운트, 착색 강화 현미경 검사, 면역 현미경 검사(예: FISH), 하이브리드화 현미경 검사, 입자 응집, 효소 유사 결합 면역흡착 분석, 뇨 스크리닝 시험, DNA 탐침 하이브리드화, 혈청 검사 등을 포함한다. 의료 종사자는 일반적으로 전체적인 병력을 고려하여 위에서 열거된 실험실 시험을 수행하는 외에 완전한 신체 검사를 수행한다.
암을 앓고 있는 대상체는 예를 들면, 검출 가능한 암세포를 갖는 대상체일 수 있다. 암을 발달시킬 위험이 있는 대상체는 예를 들면, 암을 발달시킬 정규 확률치보다 높은 대상체일 수 있다. 이들 대상체는 예를 들면, 암을 발달시킬 더 높은 가능성과 연관된 것으로 입증된 유전적 기형을 갖는 대상체, 암에 대한 가족적 기질을 갖는 대상체, 담배, 석면 또는 기타 화학적 독소 등의 암 유발제(즉, 발암 물질)에 노출된 대상체 및 이전에 암에 대해 치료받고 명백한 차도를 보인 대상체를 포함한다.
예시적인 양태에서, 당해 방법은 리포솜 항엽산 조성물을 엽산 수용체를 발현하는 세포보다 더 높은, 예를 들면, 2배 이상 더 높은 비율로 종양에 선택적으로 전달할 수 있다.
예시적인 양태는 본 개시의 조성물 중의 어느 하나의 제조방법에 관한 것이다. 예시적 양태에서, 당해 방법은 (1) 리포솜 성분; (2) 수용액 중의 생활성 항엽산제; 및 (3) 표적 잔기를 포함하는 혼합물을 형성함을 수반한다. 혼합물은 그 다음 균질화되어 상기 수용액 중의 리포솜을 형성할 수 있다. 추가로, 혼합물은 막을 통하여 압출되어 수용액에 생활성 항엽산제를 내포하는 리포솜을 형성할 수 있다. 리포솜 성분이 관능화 지질 및 표적 잔기에 부착된 지질, 검출 가능한 레이블 및 입체 안정제, 또는 이들 모두의 어떠한 부분 집합을 포함하는 본 개시의 어떠한 지질(콜레스테롤 포함)이라도 포함함을 이해한다. 수용액 중의 생활성 항엽산염이 예를 들면, 완충제, 염, 동결보호제 등을 포함하는 리포솜의 내부 또는 외부에 대하여 논의된 어떠한 시약 및 약품이라도 포함할 수 있음이 추가로 주목된다.
당해 방법은 상기 제거 단계 이후 조성물을 동결건조하여 동결건조 조성물을 형성하는 임의 단계를 추가로 포함할 수 있다. 위에서 기술한 바와 같이, 수용액 중의 생활성 항엽산제는 본 개시에 열거된 어떠한 동결보호제라도 될 수 있는 동결보호제를 포함할 수 있다. 조성물이 동결건조되어야 하는 경우, 동결보호제가 바람직할 수 있다.
추가로, 동결건조 단계 이후, 당해 방법은 상기 동결건조 단계 이후 동결건조 조성물을 용매에 용해시켜 상기 동결건조 조성물을 재구성하는 임의 단계를 포함할 수 있다. 재구성 단계는 익히 공지되어 있다. 한 가지 바람직한 용매는 물이다. 기타 바람직한 용매는 염 용액 및 완충 용액을 포함한다.
특정 예시적인 양태가 논의되어 있지만, 리포솜은 당해 기술분야에 공지되어 있거나 공지될 어떠한 방법에 의해서라도 제조될 수 있음을 이해하여야 한다. 예를 들면, 문헌[참조: G. Gregoriadis (editor), Liposome Technology, vol. 1-3, 1st edition, 1983; 2nd edition, 1993, CRC Press, 45 Boca Raton, Fla]을 참조한다. 리포솜 조성물을 제조하는 데 적합한 방법의 예는 압출, 역상 증발, 초음파처리, 용매(예: 에탄올) 주사, 미세유동화, 세제 투석, 에테르 주사 및 탈수/재수화를 포함한다. 리포솜의 크기는 저압 압출에 사용된 막의 기공 크기 또는 미세유동화 또는 기타 적합한 방법에 이용된 압력 및 통과 수를 통제하여 조절될 수 있다.
일반적으로, 생활성 항엽산제는 리포솜의 안에, 즉 리포솜의 안쪽(내부) 공간에 함유되어 있다. 예시적인 양태에서, 치환된 암모니아는 리포솜을 둘러싼 외부 배지로부터 부분적으로 또는 실질적으로 완전히 제거된다. 이러한 제거는 당업자에게 공지된 어떠한 적합한 수단에 의해서라도, 예를 들면, 희석, 이온 교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 투석, 한외여과, 침전 등에 의하여 달성될 수 있다. 그러므로, 한 가지 임의 단계는 상기 압출 단계 이후 리포솜의 외부에서 수용액 중의 생활성 항엽산제를 제거하는 단계를 포함할 수 있다.
또 다른 예시적 양태는 내부 공간을 갖는 리포솜, 상기 내부 공간에 배치된 생활성제, 리포솜의 외부에 부착된 입체 안정제 분자 및 하나 이상의 엽산 수용체에 대한 특이적 친화도를 갖는 단백질을 포함하는 표적 잔기를 포함하는, 선택적으로 엽산 수용체를 표적으로 하는 표적 리포솜 조성물에 관한 것으로서, 상기 표적 잔기는 입체 안정제 및 리포솜의 외부 중 적어도 하나에 부착된다.
이러한 예시적 양태의 성분들은 본 개시의 기타 양태에 대하여 기재된 것과 동일할 수 있다. 예를 들면, 생활성제, PEG일 수 있는 입체 안정제는 본 개시의 다른 부분에 기재된 바와 같다.
예시적 양태에서, 예시적 양태의 생활성제는 엘립티신; 파클리탁셀 또는 본 개시에 열거된 기타 생활성제일 수 있다. 엘립티신 또는 파클리탁셀에 관한 제제 또한 계획된다. 이들은 적어도, 탁산, 예를 들면, 도세탁셀 및 카바지탁셀을 포함한다.
예시적인 양태는 조성물 및 방법의 시험관내 적용을 추가로 고려한다. 시험관내 용도는 예를 들면, 세포의 부분모집단의 선택적 치료가 필요한 세포 배양 및 조직 공학 등의 용도일 수 있다. 예를 들면, 정상 환자 또는 암을 앓고 있는 환자로부터의 줄기 세포의 배양 동안, 세포는 샘플 조성물 또는 논의된 바와 같은 샘플 리포솜으로 치료하여 세포의 암 부분모집단을 처리할 수 있다. 암 부분모집단은 공여자가 암을 원래 갖기 때문에 또는 세포가 시험관내 절차 동안 자발적으로 변형되기 때문에 발생할 수 있다.
예시적 양태에 따라, 리포솜 및 리소폼 조성물은 리포솜을 포함한 용기, 임의로, 독립체 및 설명서, 예를 들면, 하나 이상의 적용에서 리포솜 조성물을 사용하는 데 관한 절차 또는 정보를 포함한 용기를 포함하는 키트에 제공될 수 있다. 이러한 설명서는 어떠한 매체를 통해서라도, 예를 들면, 하드 페이퍼 카피, 전자 매체 또는 설명서를 포함하는 데이터베이스 또는 웹사이트로의 접근을 통하여 제공될 수 있다.
실시예
다음 실시예는 어떠한 방식, 형상 또는 형태로라도, 명시적으로 또는 암시적으로 발명을 설명하지만 이를 제한하지 않는 것으로 의도된다. 이는 사용될 수 있는 것들을 대표하지만, 당업자에게 공지된 기타 절차, 방법론 또는 기술이 대안적으로 사용될 수 있다.
실시예 부문에서의 절차를 포함한 본 개시의 절차를 사용하여, 예시적 조성물 및 예시적 리포솜, 예를 들면, 리포솜 항엽산 조성물을 구성한다. 예시적 조성물은 예시적 리포솜을 포함한다. 예시적 조성물과 예시적 리포솜 둘 다 실시예 부분 및 본 개시 전체에 기재된 실험에서 사용되고, 본 개시의 특정 양태이고, 본 개시의 전체 영역을 한정하는 것을 의미하지 않는다.
실시예 1: 페메트렉시드 및 합 텐을 함유하는 엽산 수용체 α 표적 리포솜의 제조
페메트렉시드 리포솜의 제조
페메트렉시드 이나트륨 칠수화물(ALIMTA)은 중성 pH에서 100㎎/㎖의 용해도로 매우 수 가용성이다. 페메트렉시드는 다음 절차에 의하여 리포솜에 캡슐화된다. 우선, 리포솜 막의 지질 성분은 중량 측정하여 약 65℃의 온도에서 에탄올 중의 농축 용액으로서 배합한다. 이 실시예에서, 사용된 지질은 수소화 대두 포스파티딜 콜린, 콜레스테롤, DSPE-PEG-2000(1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000]), PEG-DSPE-말레이미드 및 PEG-DSPE-FITC이다. HSPC:콜레스테롤:PEG-DSPE의 몰 비는 약 55:40:5이다. 그 다음, 페메트렉시드는 100㎎/㎖의 농도로 수성 완충제에 용해한다. 약제 용액은 65℃로 가열한다. 에탄올성 지질 용액은 작은 천공 침을 사용하여 페메트렉시드 용액으로 주사한다. 이 단계 동안 약제 용액은 자기 교반기를 사용하여 잘 교반한다. 혼합을 승온(63℃-72℃)에서 수행하여 지질이 반드시 액정 상태(지질이 지질 전이 온도 Tm = 51℃-54℃ 미만의 온도에 도달하는 겔 상태와 대조적으로)가 되도록 한다. 그 결과, 지질은 수화되고 수성 코어내 페메트렉시드를 함유하는 다중 이중층(다중판) 소포(MLV)를 형성한다.
필터 압출을 사용한 MLV의 축소
MLV는 적층(트랙 식각 폴리카보네이트) 막을 통한 3회 통과를 사용하여 고압 압출에 의하여 목적하는 크기의 단판(단일 이중층) 소포로 분해한다. 제1 통과 동안 사용된 막은 기공 크기가 200nm이다. 제2 통과 동안 사용된 막은 기공 크기가 100nm이고 이후 최종 통과로서 기공 크기가 80nm이다. 압출 동안 온도는 Tm을 초과하여 유지하여 지질 막의 가소성을 보장한다. 압출 결과, 크고 크기가 이질적이고 판상인 MLV는 이의 내부에서 약제를 격리시키는 작고 균질하고(80-100nm) 단판상 소포(ULV)로 바뀐다. 후면 산란 검출기(90°)를 갖는 맬번 제타사이저 나노(Malvern Zetasizer Nano) ZS 기구(Southborough, MA)를 석영 마이크로 큐벳에서 25℃에서 유체역학 크기(직경)를 측정하기 위하여 사용하였다. 샘플을 분석 전 제형 매트릭스 중에서 50배로 희석시켰다.
본 발명자들의 결과는 필터 압출을 사용하여 축소된 리포솜이 평균 입자 크기가 85nM이고 PDI가 0.007이고 제타 전위가 -43.7임을 나타낸다. 필터 압출에 대한 대안으로서, 고압 미세유동화가 또한 사용되어 리포솜을 축소시킬 수 있다. 본 발명자들은 크기가 40nm 이상, 예를 들면, 30-150nm(데이터는 나타내지 않음) 또는 30nm보다 작은, 특히 고압 필터 압출 또는 미세유동화 단독 또는 조합과 같은 방법을 사용하여 40 내지 120nm인 리포솜을 생성할 수 있었다.
접선 유동 여과(Tangential Flow Filtration; TFF ) 및 약제 제형
페메트렉시드를 함유하는 ULV를 생성한 후, 적합한 완충제에 대한 투석 또는 접선 유동 투석여과를 사용하여 리포솜외 페메트렉시드를 제거한다. 어떠한 완충 용액이라도 사용될 수 있지만, 당해 실시예에서 사용된 완충제는 5mM 시트르산나트륨, 60mM 염화나트륨, pH 6.1이었다. 투석 완료시, 0.22μ 필터를 사용하여 필터 살균한다.
항-엽산 수용체 α 항체의 티올화 ( Thiolation )
리포솜 상에서 항체를 PEG-DSPE-말레이미드 잔기에 접합시키기 위하여, 항체는 티올화될 필요가 있다. 당해 실시예에서, 트라우트 시약(Traut's reagent, Themo Fisher Scientific)을 사용하여 항체의 티올화를 달성한다. 항체를 새로이 제조된 pH 8.1의 인산염 완충 염수 중의 14mM 트라우트 시약과 5mM EDTA에 가한다. 60분 동안 약하게 교반하여 배양한 후, 티올화 항체를 최소 4시간 동안 25mM HEPES pH 7.0, 60 mM NaCl 200용적에 대하여 투석하여 과량의 트라우트 시약으로부터 분리한다.
티올화 항체의 페메트렉시드 리포솜으로의 접합
사용되는 티올화 항체의 양은 리포솜당 항체의 목적하는 수를 기준으로 하여 계산한다. 티올화 항체의 각각의 제조의 2배 과량을 투석여과된 무균 리포솜에 가한다. 반응 용기를 질소 기체로 덮고, 4℃의 실온에서 서서히 교반하면서 밤새 배양한다. 접합 반응은 수성 lOOmM L-시스테인-HCl 저장 용액을 반응 혼합물 중의 15mM의 최종 농도로 가함으로써 미반응 말레이미드 그룹을 차단하여 중단시킨다. 그 다음, 유리 티올화 항체를 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 항체 접합 리포솜으로부터 분리한다.
실시예 2: 실험에 사용된 세포주
실험에 사용된 세포주는 ATCC(American Type Culture Collection of Manassas, Virginia, U.S.A) 등의 공급원으로부터 시판중이다. 세포주, 이의 ATCC 접근 번호 및 성장 조건을 아래에 열거한다.
Calu-3(ATCC HTB-55); EMEM(Cat. # 30-2003); 10% HI FBS; 1% Pen/Strep; 1% L-글루타민.
KB; EMEM(Cat. # 30-2003); 10% HI FBS; 1% Pen/Strep; 1% L-글루타민.
CCD841(ATCC CRL-1790); EMEM(Cat. # 30-2003); 10% HI FBS; 1% Pen/Strep; 1% L-글루타민.
Hs578Bst(ATCC HTB-125); 하이브리-케어(Hybri-Care) 배지 pH 7.0(Cat.# 46-X); 30ng/㎖ 마우스 EGF; 10% HI FBS; 1% Pen/Strep; 1% L-글루타민.
NCI-H2087(ATCC CRL-5922); RPMI-1640(Cat. # 30-2001); 5% HI FBS; 1% Pen/Strep; 1% L-글루타민.
NCI-H2452(ATCC CRL-5946); RPMI-1640(Cat. # 30-2001); 10% HI FBS; 1% Pen/Strep; 1% L-글루타민.
OVCAR-3(ATCC HTB-161); RPMI-1640(Cat. # 30-2001); 20% HI FBS; 1% Pen/Strep; 1% L-글루타민.
SKBR3; 맥코이(McCoy) 5A 배지; 10% HI FBS; 1% Pen/Strep; 1% L-글루타민.
SL0003(ATCC PTA-6231); F-12K 배지; 10% HI FBS; 1% Pen/Strep; 1% L-글루타민.
A549(ATCC CCL-185); F-12K 배지; 10% HI FBS; 1% Pen/Strep; 1% L-글루타민.
실시예 3: 하나의 샘플 구성의 결합 특이성 측정
세포 표면상 엽산 수용체 α의 수준을 형광색소와 접합된 단클론 항체로 유동 세포측정법에 의하여 측정하였다. 항체 치료 전 라인(참조: 예를 들면, 도 6, 라인 602 및 604)과 비교한 항체의 결합 후 우측으로의 이동(참조: 예를 들면, 도 6, 라인 606)은 유동 세포측정법에 의한 수용체의 검출을 나타낸다. 히스토그램(예: 도 6, 라인 606)이 미처리 세포(참조: 예를 들면, 도 6, 라인 602 및 604)에 대하여 우측으로 더 이동할수록 세포 표면상에서 수용체의 수준은 더 높다. 플롯은 엽산 수용체 α의, 암세포상에서는 높은 수준이나 정상 세포상에서는 거의 검출되지 않는 수준을 나타낸다.
구성된 예시적 리포솜 조성물의 일부인 예시적 리포솜은 엽산 수용체 α 양성인 세포에 대한 세포 표면에 결합되지만, 엽산 수용체 α 음성인 세포에는 결합되지 않는다. 예시적인 리포솜은 엽산 수용체 α에 대한 항체를 함유한다. 예시적인 리포솜이 엽산 수용체 α+ 세포로 단시간(30분) 동안 배양되는 경우, 유동 세포측정법에 의하여 리포솜내 통합된 FITC의 수준을 측정함으로써 세포 표면상 예시적인 리포솜이 검출될 수 있다. 히스토그램의 피크 이동은 예시적인 리포솜이 세포 표면에 검출됨을 나타낸다. 피크가 우측으로 더 이동할수록, 예시적인 리포솜은 세포에서 더 검출된다.
이 실험에서, 본 발명자들은 예시적 리포솜의 세포로의 결합을 측정하여 이의 친화도 및 특이성에 접근하였다. 간략하게, 검출 가능한 레이블을 포함하는 예시적인 리포솜을 세포와 동시배양하고, 세포를 유동 세포측정법에 의하여 분석하였다. 다음 데이터는 예시적인 리포솜이 엽산 수용체 α 양성 암세포에 결합하지만, 엽산 수용체 α 음성, 정상 세포에는 결합하지 않음을 나타낸다.
도 3은 세포 표면상 엽산 수용체 α 의 측정을 나타내는 개략도이다.
도 6은 유동 세포측정법에 의하여 측정된 바와 같은 엽산 수용체 α의 높은 표면 수준을 발현하는 KB 암 세포주의 대표적인 히스토그램이다. 도 6에서, 레이블 602 = 항체 없음; 레이블 604 = 동형 대조군; 레이블 606 = 항-엽산 수용체 α APC이다.
도 7은 유동 세포측정법에 의하여 측정된 바와 같은 엽산 수용체 α의 높은 표면 수준을 발현하는 OVCAR-3 암 세포주의 대표적인 히스토그램이다. 도 7에서, 레이블 702 = 항체 없음; 레이블 704 = 항-엽산 수용체 α APC이다.
도 8은 유동 세포측정법에 의하여 측정된 바와 같은 엽산 수용체 α의 높은 표면 수준을 발현하는 NCIH2452 암 세포주의 대표적인 히스토그램이다. 도 8에서, 레이블 802 = 항체 없음; 레이블 804 = 동형 대조군; 레이블 806 = 항-엽산 수용체 α APC이다.
도 9는 엽산 수용체 α의 낮은 표면 수준을 발현하는 결장 상피로부터 유도된 정상 세포주의 대표적인 히스토그램이다. 도 9에서, 레이블 902 = 항체 없음; 레이블 904 = 동형 대조군; 906 = 항-엽산 수용체 α APC이다.
도 2는 세포 표면에 결합하는 예시적인 리포솜을 나타내는 개략도이다.
도 10은 SL0003(폐) 세포주의 대표적인 히스토그램이다. 폐암 세포주는 예시적인 리포솜의 높은 수준을 결합한다. 레이블 1002 = 미처리 세포. 레이블 1004 = 예시적인 리포솜 처리된 세포.
도 11은 CCD841(정상 결장) 세포주의 대표적인 히스토그램이다. 엽산 수용체 α-음성 세포주는 예시적인 리포솜에 거의 결합하지 않는다. 레이블 1102 = 미반응 세포. 레이블 1104 = 예시적인 리포솜 처리 세포.
도 12는 결장(CCD841) 및 유방(Hs578)으로부터 유도된 정상 세포와 비교한 세포 표면 상에서 결합하는 예시적인 리포솜의 높은 수준을 나타내는 폐(SL0003) 및 난소(OVCAR-3) 세포로부터 유도된 복합 데이터(P<0.05)를 나타낸다. 37℃에서 30분 또는 4시간 동안 배양시 검출된 예시적인 리포솜의 표면 수준을 나타낸다.
이들 실험에서, 검정을 다음과 같이 수행하였다:
세포를 회수하고, PBS 중의 0.2% 소 혈청 알부민(FACS buffer.)에서 세척하였다. 세포를 FACS 완충제 중의 100㎕ 용적으로 재현탁시켰다. APC와 접합된 항-엽산 수용체 α 단클론 5㎕를 가하였다(cat# FAB5646A; R&D Systems). 세포를 4℃에서 암실에서 30분 동안 배양하였다. FACS 완충제 100㎕를 가하여 세포를 세척한 다음, 세포를 유동 세포측정(FL4)에 의하여 평가하였다. 세포 표면상 예시적 리포솜을 측정하기 위하여, 세포를 회수하고, 계수(count)하고, PBS 중의 0.2% 소 혈청 알부민(FACS buffer.)에서 세척하였다. 20,000개의 세포를 FACS 완충제 중에서 100㎕ 용적으로 재현탁시켰다. 예시적인 리포솜 2㎕를 세포에 가하였다. 세포를 37℃에서 30분 동안 배양하고, FACS 완충제로 세척하고, 유동 세포측정법에 의하여 평가하였다.
실시예 4: 샘플 조성물 및 샘플 리포솜에 대한 RhodoRed 실험
도 4는 세포내 샘플 리포솜을 나타내는 개략도이다. 샘플 리포솜은 pH-RhodoRed로 표지되었고, 이는 세포의 엔도-리소솜에서와 같은, 감소된 pH의 존재하에 형광 발광한다. 내재화가 미반응 세포에 대한 피크의 우측으로의 이동으로서 보여진다.
도 13은 예시적 리포솜의 RhodoRed-표지된 세포가 난소암 세포에 의하여 내재화됨을 나타낸다. 이는 피크 1504(예시적인 조성물/예시적인 리포솜으로 처리된 세포)가 미처리 피크 1502의 우측으로 이동하기 때문에, 분명하다. 유사하게, 도 14에서, 본 발명자들은 미처리 피크 1502에 대하여, 예시적인 리포솜의 양이 증가하는 처리 피크가 각각 10㎕, 20㎕, 30㎕, 40㎕ 및 50㎕를 나타내는 피크 1504, 1506, 1508, 1510 및 1512에서 보여지는 바와 같이 우측으로 이동하기 시작함을 확인한다(도 17 참조). 동일한 데이터가 도 17에서의 막대 그래프에서 플롯팅된다. 도 17에서, 항-엽산 수용체 α(FOLR1)가 부족한 대조 pH-RhodoRed-표지된 리포솜을 비교를 위하여 평가하였다. 항-FOLRl이 부족한 리포솜은 KB 세포에 의하여 내재화되지 않았다. 대조적으로, pH-RhodoRed 표지된 샘플 리포솜은 KB 세포에 의하여 내재화되었다. 나타낸 바와 같은, 도 17에서의 이 데이터는 또한 도 14에 의하여 정량화된 바와 같은, 37℃에서 18시간의 배양, 용량 반응의 결과이다. 엽산 수용체 α 음성 정상 세포주(유방 세포; 좌측 패널 및 결장; 우측 패널)는 pH-RhodoRed 표지된 샘플 리포솜을 내재화시키지 않았다. 도 15는 내재화가 정상 유방 세포에서 최소임을 나타낸다. 피크 1704는 피크 1702에 대하여 약간만 이동한다. 도 16은 피크 1802 및 1804가 실질적으로 이동하지 않았으므로, 내재화는 정상 결장 세포에서 최소임을 나타낸다.
내재화를 추가로 평가하기 위하여, SL0003 폐암 세포를 PhosFlow에 의하여 MAP 키나제 활성화 수준에 대하여 평가하였다. 키나제를 활성화시키는 세포 내부의 샘플 리포솜을 도 5에 나타낸다. 도 18A 및 18B는 30분 후처리시 P38의 인산화의 기저 수준의 감소에 대한 페메트렉시드의 효과를 나타낸다. 도 18a는 52.5% 인산화 p38을 갖는 미반응 세포를 나타낸다. 세포가 도 18b에서 예시적인 리포솜을 포함하는 예시적인 조성물로 처리되는 경우, 이 백분율은 8.95%로 감소된다. 도 19는 30분 후처리시 암세포 및 정상 세포내 p38의 인산화 수준의 정량화를 나타낸다. "표적 리포솜"이라고 표지된, 샘플 리포솜 및 샘플 조성물은 SL0003 폐암 세포에서의 p38 활성화에 영향을 미친다.
본 발명자들은 데이터를 다음과 같이 해석한다: 샘플 리포솜은 FOLRl 양성인 세포에 진입하고, 샘플 리포솜은 세포로 진입하는 경우 유동 세포측정법에 의해서 검출될 수 있을 뿐인 염료(RhodoRed)로 표지되었다. 다양한 세포를 상이한 양의 RhodoRed-표지된 샘플 리포솜의 양을 상이하게 하여 배양하고, 형광 수준을 유동 세포측정법에 의하여 측정하였다(FL2.). RhodoRed 표지된 샘플 리포솜은 FOLRl을 발현하는 암세포로 진입하지만, FOLRl 음성인 정상 세포로는 진입하지 않는다. 피크가 우측으로 이동하는 난소암 세포가 나타나며, 이는 약제가 세포로 진입함을 나타낸다(도 13). 동일한 실험을 적정량의 RhodoRed-표지된 샘플 리포솜을 갖는 FOLRl 고 KB 세포로 수행하였다(도 14). 이들 데이터는 도 17에 정량화된다. 샘플 리포솜은 고농도로 처리시 KB 세포로 진입하였지만, 항-FOLRl 항체가 부족한 대조 리포솜은 세포에 진입할 수 없었다.
세포로 진입하는 샘플 리포솜의 제2 측정은 세포내 활성화 경로이다. 세포는 키나제, 이 경우 p38을 활성화시켜 이의 수용체에 결합하는 리간드에 반응한다. 활성화된 키나제는 유동 세포측정법에 의하여 측정할 수 있다. 세포는 30분 동안 샘플 리포솜으로 배양한 다음, 약한 세제로 용해시켰다. 활성화 p38 키나제를 유동 세포측정법에 의하여 항체로 검출한다. 레드 라인 게이트하에서의 이동은 더 높은 수준의 인산화 p38을 나타낸다(도 18a 및 18b 참조). 암세포는 더 높은 기저 수준의 활성화 키나제를 가질 수 있다. 이 경우, 페메트렉시드는 샘플 리포솜 내부의 페메트렉시드가 활성임을 나타내는 샘플 리포솜과 유사하게 p38 활성화를 감소시킨다(도 19).
실험 조건은 다음과 같다:
도 4, 13, 14, 15, 16 및 17에 대하여: RhodoRed-표지된 샘플 리포솜의 흡수 측정. 세포(OvCAR-3, KB, 정상 결장 및 정상 유방)는 실험 전날밤 7,000 세포/웰로 플레이팅한 세포였다. 다음 날, 세포를 다음으로 처리하였다: 1) 약제 없음, 2) RhodoRed-표지된 항-FOLRl 단클론 항체(MABFRAH H/L) Ab - (lul); 3) 샘플 리포솜(리포솜 FOLRl Ab 접합 - (5ul); 4) 비표적 pH RhodoRed 리포솜 - (5ul)/ 항-FOLRl이 없는 리포솜. 세포를 37℃에서 18시간 및 24시간 동안 배양하였다. 빙냉 FACS 완충제 100㎕를 가하고, 세포를 유동 세포측정법(FL2)으로 평가하였다.
또한, 도 17에 대하여, 측정 p38 인산화(PhosFlow) SL0003, 정상 결장 세포 및 정상 유방 세포를 10,000 세포/웰로 접종하였다. 세포를 다음: 새로운 페메트렉시드(50μM, 10μM), LEAF-001(Liposome 070715 MPF; 5traut/50 Mab, 15traut/50Mab, 45traut/50Mab)(13.33X 희석), 항-엽산 수용체 α(MABFRA H/L 1.01㎎/㎖)(13.33X 희석)으로 처리하여 샘플 리포솜 중의 항체의 효과를 측정하거나, 처리하지 않았다. 세포를 약하게 혼합하고, 배양기에 신속하게 넣었다. 각 시점(30분 - 4시간)에서, 배양기로부터 플레이트를 제거하고, 2%의 최종 농도에 대하여 포름알데히드로 즉시 고정하였다. 플레이트를 실온에서 5분 동안 배양하였다. 배지 25㎕를 제거하였다. FACS 완충제 25㎕를 가하였다. 세포 용해 완충제(FACS 완충제, 0.2% 트리톤 X-100, 0.3% 포름알데히드) 100㎕를 가하였다. 세포를 1.5㎖ 원심분리 관으로 회수하고, 3분 동안 와동시켜 세포를 용해시켰다. PE-접합된 항-P38(BD Pharmingen) 항체 또는 PE-접합된 동형 대조군을 가하고, 세포를 4℃의 암실에서 30분 동안 배양하였다. FACS 완충제 200㎕를 가하여 세척하였다. 관을 회전시키고, 상청액을 조심스럽게 제거하였다. 세포를 유동 세포측정 상에서(FL2에서) 판독하였다.
실시예 5: MTS 검정(MTS Assay)
MTS(3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카복시메톡시페닐)-2-(4-설포페닐)-2H-테트라졸륨) 검정은 세포 대사 활성을 평가하기 위한 익히 공지된 비색 분석이다. 세포주는 검정에 대하여 사용되었고, 이의 성장 조건은 다음과 같다:
(a) Calu-3: EMEM, 10% HI FBS, 1% Pen/Strep, IX L-글루타민;
(b) KB: EMEM, 10% HI FBS, 1% Pen/Strep, IX L-글루타민;
(c) NCI-H2087: RPMI, 5% HI FBS, 1% Pen/Strep, IX L-글루타민;
(d) NCI-H2452: RPMI, 10% HI FBS, 1% Pen/Strep, IX L-글루타민;
(e) SKBR3: McCoy's, 10% HI FBS, 1% Pen/Strep, IX L-글루타민;
(f) CHO: FreeStyle CHO, 5% HI FBS, l% Pen/Strep, IX L-글루타민;
(g) A549: F-12K, 10% HI FBS, l% Pen/Strep, IX L-글루타민; 및
(h) SL0003: F-12K, 10% HI FBS, l% Pen/Strep, IX L-글루타민.
전날 밤, 세포를 96 웰 조직 배양 플레이트에서 각각의 세포주에 대하여 필요한 세포의 양에 따라 접종한다. 각각의 웰에서의 최종 용적은 100㎕이다(참조를 위하여 세포주의 표 참조; 모든 세포주는 ATCC로부터 수득함). 사용된 세포주 및 검정 조건은 다음과 같다:
(1) Calu-3: 웰당 10000 세포. 스톡은 3.1×l05/㎖: 세포 3.55㎖를 완성 배지 7.45㎖로 희석. 100㎕를 각각의 웰에 이동(㎕는 마이크로리터를 말함).
(2) KB: 웰당 3000 세포. 스톡은 2.0×l05/㎖: 세포 1.65㎖를 완성 배지 9.35㎖로 희석. 100㎕를 각각의 웰에 이동.
(3) NCI-H2087: 웰당 3000 세포. 스톡은 3.7×l05/㎖: 세포 892㎕를 완성 배지 lO.l㎖로 희석. 100㎕를 각각의 웰에 이동.
(4) NCI-H2452: 웰당 5000 세포. 스톡은 5.0×l04/㎖: 희석할 필요 없음.
(5) SKBR3: 웰당 4000 세포. 스톡은 5.5×l05/㎖: 세포 800㎕를 완성 배지 lO.2㎖로 희석. 100㎕를 각각의 웰에 이동.
(6) CHO: 웰당 3000 세포. 스톡은 3.6×l05/㎖: 세포 1㎖를 완성 배지 11㎖로 희석. 100㎕를 각각의 웰에 이동.
(7) A549: 웰당 3000 세포. 스톡은 2.3×l05/㎖: 세포 1.43㎖를 완성 배지 9.57㎖로 희석. 100㎕를 각각의 웰에 이동.
(8) SL0003: 웰당 3000 세포. 스톡은 2.3×l05/㎖: 세포 1.43㎖를 완성 배지 9.57㎖로 희석. 100㎕를 각각의 웰에 이동.
접종된 세포를 37℃ 및 5% CO2에서 밤새 배양한다. 다음날, 약제를 세포-특이적 세포 배양 배지에서 제조하고, 세포에 첨가된 2배 희석 농도를 적정하였다. 제제는 다음과 같다:
페메트렉시드 칠수화물(5mM 스톡). 상부 희석 lOuM: 스톡 2㎕를 완성 배지 998㎕에 가함.
예시적인 리포솜/리포솜 FOLR-1 Ab(0.4㎎/㎖ = 666.67μμΜ). 상부 희석 10μM: 스톡 9㎕를 완성 배지 591㎕에 가함.
리포솜 로트 0707F(스톡은 2mM). 상부 희석 10μM: 스톡 3㎕를 완성 배지 597㎕에 가함.
4일째에, 세포 증식에 대한 효과를 MTS 검정으로 측정하였다. 시약(Celltiter 96® Aqueous One Solution) 10㎕를 각각의 웰에 가하였다. 이는 광범위한 세포 증식이 존재하는 경우 짙은 자색으로 바뀌는 비색 검정이다. 플레이트를 37℃에서 2시간 동안 배양하고, 흡광도를 490n메서 측정하였다. 각각의 세포주에 대하여 100%에서 설정된 미처리 세포 흡광도 값을 사용하여 세포 성장 억제율(%)을 계산하였다.
실시예 6: 세포 증식에 대한 샘플 리포솜 효과
도 20은 암세포에 대한 엽산 수용체 α 표면 수준이 샘플 리포솜 성장 억제에 대한 민감성과 상호 연관됨을 나타낸다. A의 억제 수준이 나타나 있다; p=0.05. 세포 주기에 대한 샘플 리포솜의 효과를 추가로 평가하기 위하여, SL0003(폐암) 세포는 페메트렉시드 또는 샘플 리포솜으로 4일 동안 처리하였다.
도 21은 폐암 또는 유방암 환자로부터 유도된 세포주가 페메트렉시드 또는 예시적인 리포솜의 적정 농도로 처리되었음을 나타내는 차트이다. 세포를 37℃에서 90시간 동안 배양하고, 세포 생존율 및 수를 MTS에 의하여 평가하였다. 10mM 페메트렉시드가 추정된 샘플 리포솜과 비교한 10mM 페메트렉시드로부터의 결과가 나타나 있다. 샘플 리포솜은 페메트렉시드와 유사한 효능을 나타낸다.
세포를 용해시켰고, 요오드화프로피듐으로 표지되어 세포 주기(도 23a) 페메트렉시드 처리를 정량화하는 DNA는 세포가 S기(도 23b)를 축적하도록 유도한다. 샘플 리포솜이 S기에서의 세포의 축적을 갖는 페메트렉시드와 세포 주기에 대한 동일한 효과를 유도함을 나타내는 복합 데이터를 도 24에 나타낸다.
이 데이터는 페메트렉시드가 암세포가 분열하는 것을 중지시켜 유효한 화학요법임을 나타낸다. 본 발명자들은 샘플 리포솜 내에 함유된 페메트렉시드가 세포가 분열하는 것을 억제하는 데 유효한지를 시험하였다. 몇 가지 암 세포주를 페메트렉시드의 추정 매치된 농도를 갖는 10mM 페메트렉시드 또는 샘플 리포솜으로 4일 동안 처리하였다. 그 다음, 세포를 분열된 세포의 수에 대하여 평가하였다. 데이터는 샘플 리포솜 및 페메트렉시드가 세포주 각각에 대하여 유사한 효과를 가짐을 나타낸다.
세포 표면상 FOLR1 발현(도 20 참조)은 샘플 리포솜에 대한 민감도와 상관 관계에 있다. 본 발명자들은 세포가 분열하는 능력에 대한 페메트렉시드의 효과의 제2 측정을 사용하였다. 페메트렉시드로 처리된 세포는 새로운 DNA를 생성할 수 없고 세포 주기의 S기에 포획되게 된다. 샘플 리포솜은 페메트렉시드와 동일한 효과를 갖는다.
실시예 7: 세포 주기에 대한 샘플 리포솜의 효과의 평가
SL0003(폐암) 세포를 MTS 검정을 설명하는 실시예에 기재된 바와 같이 제조하였다(실시예 5).
이 검정을 위하여, 세포를 4일 또는 5일 동안 배양하였다(5일째를 나타냄). 보다 구체적으로, SC0003 세포(폐 선암종)를 96 웰 플레이트에 접종하고, LEAF-001 또는 페메트렉시드의 적정 농도로 그 다음날 처리하였다. 5일째에, 세포를 FACS 완충제, 0.2% 트리톤 X-100, 0.3% 포름알데히드로 용해시켰다. DNA를 요오드화 프로피듐으로 30분 동안 착색시키고, 요오드화프로피듐으로 표지하여 세포 주기를 평가하였다.
세포를 세척하고, 유동 세포측정법(FL2)에 의하여 평가하였다. 도 22a는 세포 주기를 나타내는 개략도를 나타낸다. 실험 결과는 도 22b에 나타낸다. 전구체 푸린 및 피리미딘 뉴클레오티드의 형성을 억제함으로서, 페메트렉시드는 DNA 및 RNA의 형성을 방지하고, 이는 정상 세포 및 암 세포 둘 다의 성장 및 생존에 필요하다.
실시예 8: 샘플 리포솜은 골수 유도된 호중구에 대한 페메트렉시드의 독성을 감소시킴
CD34+ 세포는 IL-3, 줄기 세포 인자 및 G-CSF로 호중구로 분화하도록 유도되었다. 2일째까지, 난소에 나타낸 성숙한 호중구가 비약적으로 증가된다(도 26a). 페메트렉시드(2-50mM)의 존재하에, 호중구 분화가 억제된다. 도 26b; n=4 공여체.
도 25a 및 도 25b의 그려진 원내 호중구에 대한 Mac-1 발현을 도 25에 나타낸다. 도 27에서 볼 수 있는 바와 같이, 샘플 리포솜(10mM 페메트렉시드)은 호중구 분화에 대한 페메트렉시드의 독성을 감소시킨다(n=3 공여체). 세포를 10mM 페메트렉시드에서 샘플 리포솜의 계산된 추산으로 2일 동안 처리하였다. 분화 호중구의 수를 도 26a 및 26b에 나타낸 바와 같은 유동 세포측정법에 의하여 평가하였다. 원은 Mac-1 및 CD 15를 발현하는 성숙 호중구를 나타낸다.
페메트렉시드 처리로부터의 부작용들 중의 하나는 혈류내 호중구의 감소이다. 이는 골수내 성숙 호중구로 분화하거나 발달하지 않는 CD34+ 줄기 세포의 결과이다. 본 발명자들은 동일 용량의 페메트렉시드(lOmM)와 비교하여 호중구 분화에 대한 샘플 리포솜의 효과를 측정하였다. 4개의 공여체로부터의 줄기 세포를 구입하고, 성장 인자의 패널로 처리하여 호중구 분화를 유도하였다. 페메트렉시드로 또한 처리된 CD34+ 세포는 성숙 호중구로 발달하지 못하였다.
Mac-1이라고 하는 분자의 수준을 보다 성숙한 호중구에서 상승시킨다. 이러한 분자를 플롯에 그린 원내 세포에서 상승시킨다. 적색으로의 이동은 세포 상의 상승된 수준을 나타낸다.
대조적으로, 샘플 리포솜은 보다 많은 세포가 호중구로 발달하도록 함으로써 이러한 독성을 감소시킬 수 있었다. 예를 들면, 도 27을 참조한다.
실험을 다음과 같이 수행하였다: CD34+ 줄기 세포를 ATCC로부터 입수하였다. CD34+ 세포를 37℃에서 1분 동안 해동시켰다. 얼음 위에서, 세포를 차가운 줄기 세포 배지("StemSpan SFEM" - Stem Cell Tech. cat.# 9650), 10% 열 활성화 소 태아 혈청(HI FBS)으로 이동시켰다. 각각의 바이얼은 세포 약 5×105/㎖를 함유하였다. 세포를 96 웰 조직 배양 플레이트 ~ 35,000 세포/웰에 위치시켰다.
호중구 GROWTH 배지는 위와 같은 StemSpam 배지에 줄기 세포 인자 사람(SCF-Sigma H8416, lot# MKBT8036V) 100ng/㎖, 과립구 집락-자극 인자, 사람(G-CSF- Sigma H5541, lot# SLBC9602V) 20ng/㎖, IL3 재조합 사람(Sigma SRP3090, lot #1008AFC13) 10ng/㎖를 함유하였다.
세포를 또한 다음과 같이 처리하였다: 1) 성장 시토카인 없이 StemSpam 배지 단독; 2) StemSpam 배지 + 성장 시토카인, 3) 50, 10 또는 2μM 페메트렉시드, 4) 샘플 리포솜(10μM 페메트렉시드와 등가) 또는 5) 항-엽산염 α Ab(1.01㎎/㎖) - 5ug/㎖.
세포를 1-5일 동안 배양하고, 각 시점에서 CD15, Mac-1 및 CD34에 대한 항체로 유동 세포측정법에 의하여 성숙 호중구에 대하여 검정하였다. 플롯상 원에 나타낸 세포는 Mac-1 및 CD34를 발현하는 성숙 호중구이다.
실시예 9: 결과 및 고찰
엽산 수용체 α 발현은 비암성 상태에서 사람의 태아/배아 단계를 넘어선 특정 기관으로 제한된다. 도 1a에 나타낸 바와 같이, 정상 극성의 설정에서, 정상 단순 상피는 별개의 정점-기저 극성을 나타내는 개별적인 세포의 단층을 포함한다. 세포는 밀집되어 정점-접합 착체에 의하여 서로 연결되고, 이는 정점 및 기저측 막 도메인을 분리한다(도 1a 레이블 101). 극성이 보존되는 정상 조직에서, 엽산 수용체 α는 혈액 순환에서 엽산염과의 직접 접촉을 벗어나 떨어져 위치한 세포의 정점 표면에 부착된다(도 1a 레이블 102). 대조적으로, 조직 해체 및 세포 극성의 붕괴는 진행된 상피성 종양의 특징이다. 도 1b는 어떻게 고-등급 상피성 종양내 세포가 엽산 수용체 α가 혈액 순환에서 엽산염과 직접 접촉하도록 하는, 전체 조직 해체 및 정점-기저 극성의 손실을 나타내는지를 보여준다(도 1b, 레이블 103). 또한, 일반적으로 종양 조직 세포는 정상 세포보다 더 높은 수준의 엽산 수용체 α를 발현하여 이 수용체를 발현하게 된다. 정상 상피 세포로부터의 종양 조직 세포의 이러한 분화 특징은 항암 요법으로서 항엽산염을 회복하는 한편, 연관된 중증의, 때로는 생명 위협적인 독성을 최소화하도록 디자인된 새로운 화학적 독립체의 디자인의 핵심에 있다. 이러한 화학적 독립체는 엽산이 아니라 엽산 수용체 α 특이 표적 잔기로, 구체적으로 엽산 수용체 α를 선택적으로 표적으로 하는 방식으로 항엽산제를 전달하여 RFC를 우회시킨다. 이러한 종양 조직 세포는 이 수용체가 혈액 순환과 직접 접촉하는 동안 엽산 수용체 α를 과발현하기 때문에, 이러한 접근은 단지 세포 극성의 손실로 인하여 항엽산의 종양 조직 세포로의 노출을 제한한다. 수용체가 순환 혈액과 직접 접촉하지 않기 때문에, 이는 엽산 수용체 α가 발현되는 제한된 정상 조직에 대한 경우가 아니다.
이 시점으로부터, 엽산 수용체 α는 또한 엽산 수용체 α 단백질을 인코딩하는 유전자를 설명하는 엽산 수용체 α와 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 두 용어 모두 엽산 수용체 α 단백질을 설명하는 데 상호 교환적으로 사용된다. 또한, 새로운 화학적 독립체를 예시를 목적으로, 예시적인 리포솜(표적 리포솜(targeted liposome)이라고도 함)이라고 한다. 예시적인 조성물 및 예시적인 리포솜의 제조방법은 명세서 전체 및 적어도 실시예 1에 개시되어 있다. 아래의 논의는 몇 개의 실시예 조성물 및 몇 개의 예시적인 리포솜에 대하여 수행된 일부 실험을 말한다. 이는 모든 가능한 예시적인 조성물 및 모든 가능한 예시적인 리포솜을 정의함을 의미하지 않는다.
도 2는 예시적인 리포솜 및 어떻게 이것이 엽산 수용체 α를 발현하는 세포에 결합되는지를 나타낸다. 합텐 이외에, FTIC는 엽산 수용체 α-발현 세포의 표면상 엽산 수용체 α에 예시적인 리포솜을 결합시키는 가시화를 가능하게 하는 이미징제로서 작용하는 한편, 도 3은 한편으로는 엽산 수용체 α에 대한 결합을 도큐먼팅하고, 다른 한편으로는 세포 표면에 노출된 엽산 α 수용체의 수를 정량화하도록 디자인된 구성물을 나타낸다.
도 4는 RhodoRed를 사용하여 세포를 발현하는 엽산 수용체 α로 예시적인 리포솜을 내재화시킴을 나타낸다. 활동은 예시적인 리포솜이 생활성제 하중과 독립적으로 내재됨을 나타내는 것이다. 도 5는 응력에 대한 세포 반응을 벗어난 판독으로서 p38 단백질 키나제 경로를 사용하는 세포 증식에 대한 예시적인 리포솜의 내재화의 효과를 추가로 나타낸다.
그 다음의 일련의 예시(도 6-11)는 사용된 엽산 수용체 α 표적 항체가 엽산 수용체 α에 우선적으로 결합되는 것을 먼저 나타내는 실험 및 결과를 설명한다. 이 실험에서, 세포 표면상 엽산 수용체 α의 수준을 형광색소와 접합된 단일클론 항체로 유동 세포측정법에 의하여 측정하였다. 우측으로의 이동은 유동 세포측정에 의한 수용체의 검출을 나타낸다. 히스토그램이 더 우측으로 이동할수록, 세포 표면상에서 수용체의 수준은 더 높아진다. 플롯은 암세포 상에서는 고 수준의 엽산 수용체 α를 나타내지만(도 6-8), 정상 세포 상에서는 거의 검출되지 않는 수준을 나타낸다(도 9).
예시적인 리포솜은 엽산 수용체 α를 우선적으로 표적으로 하는 항체를 가질 수 있다. 예시적인 리포솜이 단기간 동안(30분) 엽산 수용체 α 양성 세포로 배양되는 경우, 유동 세포측정법에 의하여 예시적인 리포솜에 통합된 FITC의 수준을 측정함으로써 세포 표면상 예시적인 리포솜을 검출할 수 있다. 히스토그램 라인의 우측으로의 이동은 예시적인 리포솜이 세포 표면에서 검출됨을 나타낸다. 히스토그램이 더 우측으로 이동할수록, 예시적인 리포솜 약제는 세포 상에서 더 많이 검출된다. 실험은 예시적인 리포솜이 폐암 세포를 발현하는 엽산 수용체 α에 결합되지만(도 10), 정상 결장 상피 세포에는 결합하지 않음을 나타낸다(도 11).
위에서 기재된 예시적인 리포솜 결합 실험을 엽산 수용체 α(폐-SL0003 및 난소-OVCAR-3)를 과발현하는 다중 암 세포주 및 결장(CCD841) 및 유방(Hs578) 조직으로부터 유도된 정상 세포를 사용하여 반복하였다. 도 12는 높은 수준의 세포 표면 엽산 수용체 α를 갖는, 폐(SL0003) 및 난소(OVCAR-3) 암세포로부터 유도된 복합 데이터가 결장(CCD841) 및 유방(Hs578)으로부터 유도된 정상 세포와 비교하여 세포 표면 상에서 결합하는 현저하게 보다 더 높은 수준의 예시적인 리포솜을 나타냄을 보여준다(p-값 <0.05). 도 12에 나타낸 데이터는 37℃에서 30분 및 4시간 배양에서 검출된 예시적인 리포솜의 표면 수준을 포함한다.
또 다른 일련의 실험을 수행하여 세포를 발현하는 엽산 수용체 α에 결합시 예시적인 리포솜이 세포로 추가로 끌려 들어감(내재화)을 나타내었다. 이를 두 가지 방법으로 평가하였다:
우선, 예시적인 리포솜들을 세포로 진입하는 경우 유동 세포측정법에 의해서 검출될 수 있을 뿐인 염료(RhodoRed)로 표지하였다(도 4). 다양한 세포를 상이한 양의 RhodoRed-표지된 예시적인 리포솜으로 배양하고, 형광 수준을 유동 세포측정법으로 측정하였다(FL2). 우측으로 이동되어 예시적인 리포솜이 세포로 진입하였음을 나타내는 난소암 세포가 도 13에 나타나 있다. RhodoRed 표지된 예시적인 리포솜은 엽산 수용체 α를 발현하는 암세포로 진입하지만(도 13-14), 엽산 수용체 α 음성인 정상 세포에는 진입하지 않는다(도 15-16).
동일한 실험을 이번에는 적정량의 RhodoRed-표지된 예시적인 리포솜으로 KB 세포를 발현하는 높은 엽산 수용체 α에서 특별히 수행하였다. 도 17에 나타낸 바와 같이, 예시적인 리포솜은 고 농도로 처리시 KB 세포로 진입하지만, 항-엽산 수용체 α 항체가 부족한 대조 리포솜은 세포로 진입할 수 없었다.
종합하면, RhodoRed 실험으로부터의 이러한 결과는 예시적인 리포솜의 디자인 구성물에 사용된 기술이 엽산 또는 이의 유사체 이외의 엽산 수용체 표적 잔기를 갖춘, 전달 시스템으로서의 예시적인 리포솜이 이의 리포솜 생활성제 하중에 상관없이 암세포 발현 엽산 수용체 α에 진입하도록 한다는 증거를 제공한다. 추가로, 동일한 실험은 예시적인 리포솜에 의하여 암세포를 발현하는 한편, 정상 세포의 생활성제 하중으로의 노출을 제한하는 엽산 수용체 α의 우선적인 표적화를 나타낸다.
세포로 진입하는 예시적인 리포솜의 제2 측정은 세포외 활성화 경로를 평가하는 것을 기반으로 하였다. 세포는 활성화 p38 단백질 키나제 경로에 의하여 내재화 또는 이의 수용체에 결합하는 리간드로부터의 응력에 반응한다(도 20). 활성화 키나제는 유동 세포측정법에 의하여 측정할 수 있다. 세포를 예시적인 리포솜으로 30분 동안 배양한 다음, 약한 세제로 용해시켰다. 활성화 p38 키나제를 유동 세포측정법에 의하여 항체로 검출하였다. 암세포는 보다 높은 기저 수준의 활성화 키나제를 가질 수 있다(도 18a). 조절 라인 게이트하의 이동은 보다 높은 수준의 인산화 p38(phosphorylated p38)을 나타낸다. 이 경우, 페메트렉시드는 두 개의 상이한 농도(10μM 및 50μM)에서 유사하게 p38 활성화를 감소시킨다. 예시적인 리포솜은 인산화 p38을 감소시켜 예시적인 리포솜 내부의 페메트렉시드가 활성임을 보다 실질적으로 나타낸다(도 19).
또 다른 일련의 실험을 수행하여 페메트렉시드가 암세포가 분열하는 것을 중단시키는 데 유효한 화학요법임에 따라 예시적인 리포솜이 매치된 농도에서 유리 페메트렉시드와 유사한 정도로 세포 증식을 억제함을 나타내었다. 전구체 퓨린 및 피리미딘 뉴클레오티드의 형성을 억제함으로써, 페메트렉시드는 정상 세포 및 암세포 둘 다의 성장 및 생존에 필요한, DNA 및 RNA의 형성을 방지한다. 이는 두 가지 방법으로 수행되었다:
우선, 본 발명자들은 예시적인 리포솜 내에 함유된 페메트렉시드가 세포 증식이라고도 하는, 세포가 분열하는 것을 억제하는 데 유효한지를 시험하였다. 몇 개의 암 세포주를 페메트렉시드의 추정 매치된 농도로 10mM 페메트렉시드 또는 예시적인 리포솜으로 4일 동안 처리하였다. 그 다음, 세포를 분열된 세포의 수에 대하여 평가하였다. 결과는 세포 성장 억제와 암세포 표면상 엽산 수용체 α 발현 사이에 상관 관계가 존재함을 나타내었다(도 20). 결과는 예시적인 리포솜에 대한 암세포를 발현하는 엽산 수용체 α의 민감도가 존재할뿐만 아니라, 예시적인 리포솜 및 페메트렉시드가 세포주 각각에 대한 유사한 효과를 가짐을 추가로 나타내었다(도 21).
세포 주기에 대한 예시적인 리포솜의 효과를 추가로 평가하기 위하여, 제2 접근을 사용하여 세포가 분열하는 능력에 대한 페메트렉시드의 효과를 측정하였다. 근거는 페메트렉시드로 처리된 세포는 새로운 DNA를 생성할 수 없고 세포 주기의 S기에 포획되게 된다는 것이었다(도 22a 및 22b). 폐암 또는 유방암 환자로부터 유도된 세포주는 페메트렉시드 또는 예시적인 리포솜의 적정 농도로 처리하였다. 세포를 37℃에서 90시간 동안 배양하고, 세포 생존력 및 수를 MTS에 의하여 평가하였다. 세포를 용해시키고, DNA를 요오드화프로피듐으로 표지하여 세포 주기를 정량화하였다(도 23a). 데이터는 페메트렉시드 처리가 세포를 S기에서 축적하도록 유도함을 나타내었다(도 23b). 추가로, SC0003 세포(폐 선암종)를 96 웰 플레이트에 접종하고 그 다음 날 예시적인 리포솜 또는 페메트렉시드의 적정 농도로 처리하였다. 5일째에, 세포를 고정하고 용해시키고, DNA를 요오드화프로피듐으로 표지하여 세포 주기를 평가하였다. 결과는 예시적인 리포솜이 S기에서의 세포의 축적에 의하여 측정된 바와 같이 세포주 각각에 대하여 페메트렉시드와 세포 주기에 대한 동일한 효과를 유도함을 나타내었다(도 24).
또 다른 실험을 수행하여 골수 세포에 대한 예시적인 리포솜의 영향을 평가하였다. 근거는 페메트렉시드 함유 치료와 같은, 항엽산제 치료로부터의 부작용들 중의 하나는, 혈류내 호중구의 감소로, 심각하고 때로는 생명 위협적인 감염을 유도한다는 것이다. 이는 골수내 성숙한 호중구로 분화되지 않거나 발달하지 않는 CD34+ 줄기 세포로 인한 것이다. 본 발명자들은 페메트렉시드(10mM)의 동일한 용량과 비교하여 호중구 분화에 대한 예시적인 리포솜의 효과를 측정하였다. 4개의 사람 공여자로부터의 줄기 세포를 구입하고, 성장 인자의 패널로 처리하여 호중구 분화를 유도하였다. 보다 구체적으로, CD34+ 줄기 세포를 IL-3, 줄기 세포 인자 및 G-CSF로 호중구로 분화하도록 유도하였다. 세포를 10mM 페메트렉시드로 2일 동안 또는 10mM 페메트렉시드의 예시적인 리포솜의 계산된 추정치로 2일 동안 처리하였다. 분화된 호중구의 수를 유동 세포측정법에 의하여 평가하였다.
결과는 도 25 및 도 26a의 타원 영역에 나타낸 바와 같이, 페메트렉시드의 부재하에, 2일째까지 성숙한 호중구의 비약적 증가가 있음을 나타내었다. 그러나, 페메트렉시드(2-50mM)의 존재하에, 호중구 분화가 억제되어(도 26b; n=4 공여체), 페메트렉시드로 처리된 CD34+ 줄기 세포가 성숙 호중구로 발달하지 못하였음을 나타내었다. 유리 페메트렉시드와 대조적으로, 예시적인 리포솜은 유사한 페메트렉시드 농도에서 페메트렉시드와 비교시 보다 많은 CD34+ 줄기 세포가 분화된 호중구로 발달되고 성숙하도록 함으로써 이러한 독성을 감소시킬 수 있었다(도 27).
종합하면, 수행된 실험으로부터의 이러한 결과는 예시적인 리포솜의 디자인 구성물에 사용된 기술이 엽산 또는 이의 유사체 이외의 엽산 수용체 표적 잔기를 갖춘, 생활성제/하중의 전달 시스템으로서의 예시적인 리포솜이 이의 리포솜 생활성제 하중과 상관없이 엽산 수용체 α를 발현하는 종양 세포에 진입하고, 암세포를 발현하는 엽산 수용체 α에서의 생활성제의 효능을 보존하고, 페메트렉시드 하중과 같은 항엽산제 하중의 독성 효과에 정상 세포가 노출되는 것을 최소화함으로써, 통상적으로 연관되는 심각하고 때로는 생명 위협적인 독성 없이, 한 종류로서의 항엽산염과 같은, 매우 효과적이지만 독성인 제제를 임상적인 설정에 달리 재도입하는 기회를 제공하도록 한다는 증거를 제공한다.
본 발명을 현재로서 바람직한 양태를 참조하여 설명하였지만, 본 발명의 의도를 벗어나지 않고 다양한 변형이 가능함을 이해하여야 한다. 따라서, 본 발명의 영역은 첨부한 청구항을 이러한 청구항에 부여된 전체 동등물의 영역과 함께 참조로 하여 결정되어야 한다. 특허원 및 공개를 포함한, 모든 인용 논문 및 문헌의 개시 내용은 모든 목적으로 본원에서 참조로 인용된다.

Claims (142)

  1. 내부 공간을 갖는 리포솜;
    상기 내부 공간 내에 배치된 생활성 항엽산제;
    상기 리포솜의 외부에 부착된 폴리에틸렌글리콜(PEG); 및
    적어도 하나의 엽산 수용체에 대한 특이적 친화도를 갖는 단백질을 포함하는 표적 잔기;를 포함하며,
    상기 표적 잔기가 상기 폴리에틸렌글리콜(PEG) 및 상기 리포솜의 외부 중 적어도 하나에 부착된, 리포솜 항엽산 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 폴리에틸렌글리콜(PEG)의 수 평균 분자량(Mn)이 200 내지 5000달톤인, 리포솜 항엽산 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 폴리에틸렌글리콜(PEG) 및 상기 리포솜의 외부 중 적어도 하나에 배치된 '면역 자극제, 검출 가능한 마커 및 말레이미드 중 적어도 하나'를 추가로 포함하는, 리포솜 항엽산 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 면역 자극제 및 상기 검출 가능한 마커 중 적어도 하나가 상기 폴리에틸렌글리콜(PEG) 및 상기 리포솜의 외부 중 적어도 하나에 공유 결합되는, 리포솜 항엽산 조성물.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 면역 자극제는,
    단백질 면역 자극제; 핵산 면역 자극제; 화학적 면역 자극제; 합텐; 및 보조제(adjuvant);로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나인, 리포솜 항엽산 조성물.
  6. 제3항에 있어서,
    상기 면역 자극제는,
    플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)인, 리포솜 항엽산 조성물.
  7. 제3항에 있어서,
    상기 면역 자극제는
    플루오레세인; DNP; β 글루칸; β-1,3-글루칸; 및 β-1,6-글루칸;으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나인, 리포솜 항엽산 조성물.
  8. 제3항에 있어서,
    상기 검출 가능한 마커는,
    플루오레세인 및 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나인, 리포솜 항엽산 조성물.
  9. 제3항에 있어서,
    상기 면역 자극제 및 상기 검출 가능한 마커가 동일한, 리포솜 항엽산 조성물.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 리포솜의 직경이 30 내지 150nm의 범위인, 리포솜 항엽산 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 리포솜의 직경이 40 내지 70nm의 범위인, 리포솜 항엽산 조성물.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 리포솜은,
    음이온성 리포솜 또는 중성 리포솜인, 리포솜 항엽산 조성물.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 리포솜의 제타 전위가 0 이하인, 리포솜 항엽산 조성물.
  14. 제12항에 있어서,
    상기 리포솜의 제타 전위가 0 내지 -150mV의 범위인, 리포솜 항엽산 조성물.
  15. 제12항에 있어서,
    상기 리포솜의 제타 전위가 -30 내지 -50mV의 범위인, 리포솜 항엽산 조성물.
  16. 제1항에 있어서,
    상기 리포솜이 리포솜 성분들로부터 형성되는, 리포솜 항엽산 조성물.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 리포솜 성분은,
    음이온성 지질 및 중성 지질 중 적어도 하나를 포함하는, 리포솜 항엽산 조성물.
  18. 제16항에 있어서,
    상기 리포솜 성분은,
    DSPE; DSPE-PEG-말레이미드; HSPC; HSPC-PEG; 콜레스테롤; 콜레스테롤-PEG; 및 콜레스테롤-말레이미드;로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나인, 리포솜 항엽산 조성물.
  19. 제16항에 있어서,
    상기 리포솜 성분은,
    DSPE; DSPE-PEG-FITC; DSPE-PEG-말레이미드; 콜레스테롤; 및 HSPC;로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나를 포함하는, 리포솜 항엽산 조성물.
  20. 제1항에 있어서,
    상기 리포솜이 수용액을 내포하는, 리포솜 항엽산 조성물.
  21. 제1항에 있어서,
    상기 리포솜이 생활성 항엽산제 및 약제학적으로 허용되는 수성 담체를 내포하는, 리포솜 항엽산 조성물.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 약제학적으로 허용되는 담체가 트레할로스를 포함하는, 리포솜 항엽산 조성물.
  23. 제21항에 있어서,
    상기 약제학적으로 허용되는 담체가 트레할로스를 5 내지 20중량% 포함하는, 리포솜 항엽산 조성물.
  24. 제21항에 있어서,
    상기 약제학적으로 허용되는 담체는,
    5 내지 200mM의 농도 및 pH 2.8 내지 6의 시트레이트 완충제를 포함하는, 리포솜 항엽산 조성물.
  25. 제21항에 있어서,
    상기 약제학적으로 허용되는 담체는,
    전체 농도 50 내지 500mM의 아세트산나트륨 및 아세트산칼슘을 포함하는, 리포솜 항엽산 조성물.
  26. 제1항에 있어서,
    상기 생활성 항엽산제가 수용성인, 리포솜 항엽산 조성물.
  27. 제1항에 있어서,
    각각의 리포솜이 상기 생활성 항엽산제를 200,000 분자 미만 포함하는, 리포솜 항엽산 조성물.
  28. 제27항에 있어서,
    각각의 리포솜이 상기 생활성 엽산제를 10,000 내지 100,000 분자 포함하는, 리포솜 항엽산 조성물.
  29. 제1항에 있어서,
    상기 생활성 항엽산제가 페메트렉시드인, 리포솜 항엽산 조성물.
  30. 제1항에 있어서,
    상기 생활성 항엽산제가 로메트렉솔인, 리포솜 항엽산 조성물.
  31. 제1항에 있어서,
    상기 생활성 항엽산제는,
    메토트렉세이트; 랄리트렉시드; 아미노프테린; 프랄라트렉세이트; 로메트렉솔; 로메트렉솔의 티오펜 유사체; 로메트렉솔의 퓨란 유사체; 트리메트렉시드; LY309887; 및 GW 1843U89;로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나인, 리포솜 항엽산 조성물.
  32. 제1항에 있어서,
    상기 생활성 항엽산제는,
    프로구아닐; 피리메타민; 트리메토프림 및 GARFT 억제제의 6-치환된 피롤로 및 티에노[2,3-d]피롤로피리미딘 종류로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나인, 리포솜 항엽산 조성물.
  33. 제1항에 있어서,
    상기 생활성 항엽산제가 pH 5 내지 8인, 리포솜 항엽산 조성물.
  34. 제1항에 있어서,
    상기 생활성 항엽산제가 pH 2 내지 6인, 리포솜 항엽산 조성물.
  35. 제1항에 있어서,
    상기 표적 잔기는,
    리포솜 성분 및 폴리에틸렌글리콜(PEG) 분자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나에 말레이미드 관능기 통하여 공유 결합되는, 리포솜 항엽산 조성물.
  36. 제1항에 있어서,
    상기 표적 잔기는,
    엽산 수용체 α; 엽산 수용체 β; 및 엽산 수용체 δ;로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나에 대한 특이적 친화도를 갖는, 리포솜 항엽산 조성물.
  37. 제1항에 있어서,
    상기 표적 잔기는,
    엽산 수용체 α; 엽산 수용체 β; 및 엽산 수용체 δ;로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 2개에 대한 특이적 친화도를 갖는, 리포솜 항엽산 조성물.
  38. 제1항에 있어서,
    상기 표적 잔기는,
    엽산 수용체 α; 엽산 수용체 β; 및 엽산 수용체 δ;에 대한 특이적 친화도를 갖는, 리포솜 항엽산 조성물.
  39. 제1항에 있어서,
    상기 표적 잔기는,
    종양 세포에 존재하지만 비-종양 세포에는 존재하지 않거나 접근할 수 없는, '종양 세포 표면 항원 상의 에피토프'에 대한 특이적 친화도를 갖는, 리포솜 항엽산 조성물.
  40. 제39항에 있어서,
    상기 종양 세포가 악성 세포인, 리포솜 항엽산 조성물.
  41. 제39항에 있어서,
    상기 종양 세포 표면 항원은,
    엽산 수용체 α; 엽산 수용체 β; 및 엽산 수용체 δ;로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나인, 리포솜 항엽산 조성물.
  42. 제1항에 있어서,
    상기 표적 잔기는,
    항체의 항원 결합 서열을 포함하는 단백질인, 리포솜 항엽산 조성물.
  43. 제42항에 있어서,
    항체의 상기 항원 결합 서열이 항체 기원의 적어도 하나의 상보성 결정 부위를 포함하는, 리포솜 항엽산 조성물.
  44. 제42항에 있어서,
    상기 단백질이 항체를 포함하는, 리포솜 항엽산 조성물.
  45. 제42항에 있어서,
    상기 표적 잔기는,
    항체; 인간화 항체; 항체의 항원 결합 단편; 단일 쇄 항체; 단일-도메인 항체; 양특이성 항체; 합성 항체; 페길화 항체; 및 다합체 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상인, 리포솜 항엽산 조성물.
  46. 제1항에 있어서,
    각각의 리포솜이 200개까지의 표적 잔기를 포함하는, 리포솜 항엽산 조성물.
  47. 제1항에 있어서,
    각각의 리포솜이 30 내지 200개의 표적 잔기를 포함하는, 리포솜 항엽산 조성물.
  48. 엽산 수용체를 표면에서 발현하는 종양에 생활성 항엽산제를 전달하는 방법에 있어서,
    치료학적 유효량의 생활성 항엽산제를 종양에 전달하도록 하는 양으로 제1항에 따르는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  49. 제48항에 있어서,
    상기 종양은 대상체(subject)에 존재하고,
    상기 투여는,
    주입;
    주사;
    비경구 투여; 및
    국소 투여;로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  50. 제49항에 있어서,
    상기 대상체가 사람인, 방법.
  51. 제48항에 있어서,
    엽산 수용체를 발현하지 않는 세포에 전달하는 것보다 2배를 초과하는 비율로 종양에 리포솜 항엽산 조성물을 선택적으로 전달하는, 방법.
  52. 제16항에 따르는 조성물의 제조방법에 있어서,
    리포솜 성분, 수용액 중의 생활성 항엽산제, 표적 잔기를 포함하는 혼합물을 형성하는 단계;
    상기 혼합물을 균질화시켜 상기 수용액 중의 리포솜을 형성하는 단계; 및
    상기 혼합물을 막(membrane)을 통하여 압출시켜 생활성 항엽산제를 내포하는 리포솜을 수용액에 형성하는 단계;를 포함하는, 제조방법.
  53. 제52항에 있어서,
    상기 압출 단계 이후, 수용액 중에서 리포솜 외부에 있는 과량의 생활성 항엽산제를 제거하는 단계;를 추가로 포함하는, 제조방법.
  54. 제53항에 있어서,
    상기 제거 단계 이후, 상기 조성물을 동결건조하여 동결건조 조성물을 형성하는 단계;를 추가로 포함하는, 제조방법.
  55. 제54항에 있어서,
    상기 동결건조 단계 이후, 상기 동결건조 조성물을 용매에 용해시켜 상기 동결건조 조성물을 재구성(reconstituting)하는 단계를 추가로 포함하는, 제조방법.
  56. 제52항에 있어서,
    상기 혼합물은,
    만니톨; 트레할로스; 소르비톨; 및 수크로스;로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나를 포함하는, 제조방법.
  57. 제52항에 있어서,
    적어도 하나의 리포솜 성분이 입체 안정제를 추가로 포함하는, 제조방법.
  58. 제52항에 있어서,
    상기 입체 안정제는,
    폴리에틸렌글리콜(PEG); 폴리-L-리신(PLL); 모노시알로강글리오시드(GM1); 폴리(비닐 피롤리돈)(PVP); 폴리(아크릴아미드)(PAA); 폴리(2-메틸-2-옥사졸린); 폴리(2-에틸-2-옥사졸린); 포스파티딜 폴리글리세롤; 폴리[N-(2-하이드록시프로필) 메타크릴아미드]; 양친매성 폴리-N-비닐피롤리돈; L-아미노산계 중합체; 및 폴리비닐 알콜;로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나인, 제조방법.
  59. 제58항에 있어서,
    상기 폴리에틸렌글리콜(PEG)의 수 평균 분자량(Mn)이 200 내지 5000달톤인, 제조방법.
  60. 제55항에 있어서,
    상기 용매가 수성 용매인, 제조방법.
  61. 리포솜 항엽산 조성물에 있어서,
    내부 공간을 갖는 리포솜을 포함하는 배지;
    상기 내부 공간 내에 배치된 수성 생활성 항엽산제;
    적어도 하나의 엽산 수용체에 대한 특이적 친화도를 갖는 단백질을 포함하는 표적 잔기;를 포함하며,
    상기 표적 잔기가 상기 리포솜의 외부에 배치되는, 리포솜 항엽산 조성물.
  62. 제61항에 있어서,
    상기 배지가 수용액인, 리포솜 항엽산 조성물.
  63. 제61항에 있어서,
    상기 배지는,
    만니톨; 트레할로스; 소르비톨; 및 수크로스;로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 동결보호제를 포함하는 수용액인, 리포솜 항엽산 조성물.
  64. 제61항에 있어서,
    상기 리포솜의 외부에 부착된 입체 안정제;를 추가로 포함하며,
    상기 표적 잔기는,
    상기 입체 안정제 및 상기 리포솜의 외부 중 적어도 하나에 부착되는, 리포솜 항엽산 조성물.
  65. 제64항에 있어서,
    상기 입체 안정제는,
    폴리에틸렌글리콜(PEG); 폴리-L-리신(PLL); 모노시알로강글리오시드(GM1); 폴리(비닐 피롤리돈)(PVP); 폴리(아크릴아미드)(PAA); 폴리(2-메틸-2-옥사졸린); 폴리(2-에틸-2-옥사졸린); 포스파티딜 폴리글리세롤; 폴리[N-(2-하이드록시프로필) 메타크릴아미드]; 양친매성 폴리-N-비닐피롤리돈; L-아미노산계 중합체; 및 폴리비닐 알콜로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나인, 리포솜 항엽산 조성물.
  66. 제65항에 있어서,
    상기 폴리에틸렌글리콜(PEG)의 수 평균 분자량(Mn)이 200 내지 5000달톤인, 리포솜 항엽산 조성물.
  67. 제61항에 있어서,
    상기 입체 안정제 및 상기 리포솜의 외부 중 적어도 하나에 배치된, '면역 자극제, 검출 가능한 마커 및 말레이미드' 중 적어도 하나를 추가로 포함하는, 리포솜 항엽산 조성물.
  68. 제67항에 있어서,
    상기 면역 자극제 및 상기 검출 가능한 마커 중 적어도 하나가 입체 안정제 및 리포솜의 외부 중 적어도 하나에 공유 결합되는, 리포솜 항엽산 조성물.
  69. 제67항에 있어서,
    상기 면역 자극제는,
    단백질 면역 자극제; 핵산 면역 자극제; 화학적 면역 자극제; 합텐; 및 보조제;로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나인, 리포솜 항엽산 조성물.
  70. 제67항에 있어서,
    상기 면역 자극제는,
    플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)인, 리포솜 항엽산 조성물.
  71. 제67항에 있어서,
    상기 면역 자극제는,
    플루오레세인; DNP; β 글루칸; β-1,3-글루칸; 및 β-1,6-글루칸;으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나인, 리포솜 항엽산 조성물.
  72. 제67항에 있어서,
    상기 검출 가능한 마커는,
    플루오레세인 및 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나인, 리포솜 항엽산 조성물.
  73. 제67항에 있어서,
    상기 면역 자극제 및 상기 검출 가능한 마커가 동일한, 리포솜 항엽산 조성물.
  74. 제61항에 있어서,
    상기 리포솜의 직경이 30 내지 150nm인, 리포솜 항엽산 조성물.
  75. 제74항에 있어서,
    상기 리포솜의 직경이 40 내지 70nm인, 리포솜 항엽산 조성물.
  76. 제61항에 있어서,
    상기 리포솜이 음이온성 리포솜 또는 중성 리포솜인, 리포솜 항엽산 조성물.
  77. 제76항에 있어서,
    상기 리포솜의 제타 전위가 0 이하인, 리포솜 항엽산 조성물.
  78. 제76항에 있어서,
    상기 리포솜의 제타 전위가 0 내지 -150mV의 범위인, 리포솜 항엽산 조성물.
  79. 제76항에 있어서,
    상기 리포솜의 제타 전위가 -30 내지 -50mV의 범위인, 리포솜 항엽산 조성물.
  80. 제61항에 있어서,
    상기 리포솜이 리포솜 성분들로부터 형성되는, 리포솜 항엽산 조성물.
  81. 제80항에 있어서,
    상기 리포솜 성분은,
    음이온성 지질 및 중성 지질 중 적어도 하나를 포함하는, 리포솜 항엽산 조성물.
  82. 제80항에 있어서,
    상기 리포솜 성분은,
    DSPE; DSPE-PEG; DSPE-말레이미드; HSPC; HSPC-PEG; HSPC-말레이미드; 콜레스테롤; 콜레스테롤-PEG; 및 콜레스테롤-말레이미드로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 리포솜 항엽산 조성물.
  83. 제80항에 있어서,
    상기 리포솜은,
    리포솜 성분들로부터 형성되고,
    상기 리포솜 성분들은,
    DSPE; DSPE-FITC; DSPE-말레이미드; 콜레스테롤; 및 HSPC로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나를 포함하는, 리포솜 항엽산 조성물.
  84. 제61항에 있어서,
    상기 리포솜이 수용액을 내포하는, 리포솜 항엽산 조성물.
  85. 제84항에 있어서,
    상기 리포솜이 생활성 항엽산제 및 약제학적으로 허용되는 수성 담체를 내포하는, 리포솜 항엽산 조성물.
  86. 제85항에 있어서,
    상기 약제학적으로 허용되는 담체가 트레할로스를 포함하는, 리포솜 항엽산 조성물.
  87. 제86항에 있어서,
    상기 약제학적으로 허용되는 담체가 트레할로스를 5 내지 20중량% 포함하는, 리포솜 항엽산 조성물.
  88. 제85항에 있어서,
    상기 약제학적으로 허용되는 담체는,
    5 내지 200mM의 농도 및 pH 2.8 내지 6의 시트레이트 완충제를 포함하는, 리포솜 항엽산 조성물.
  89. 제85항에 있어서,
    상기 약제학적으로 허용되는 담체는,
    전체 농도 50 내지 500mM의 아세트산나트륨 및 아세트산칼슘을 포함하는, 리포솜 항엽산 조성물.
  90. 제61항에 있어서,
    상기 생활성 항엽산제가 수용성인, 리포솜 항엽산 조성물.
  91. 제61항에 있어서,
    각각의 리포솜은,
    생활성 항엽산제 200,000 분자 미만을 포함하는, 리포솜 항엽산 조성물.
  92. 제91항에 있어서,
    각각의 리포솜은,
    생활성 항엽산제 10,000 내지 100,000개를 포함하는, 리포솜 항엽산 조성물.
  93. 제61항에 있어서,
    상기 생활성 항엽산제가 페메트렉시드인, 리포솜 항엽산 조성물.
  94. 제61항에 있어서,
    상기 생활성 항엽산제가 로메트렉솔인, 리포솜 항엽산 조성물.
  95. 제61항에 있어서,
    상기 생활성 항엽산제는,
    메토트렉세이트; 랄리트렉시드; 아미노프테린; 프랄라트렉세이트; 로메트렉솔; 트리메트렉시드; LY309887; 및 GW 1843U89;로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나인, 리포솜 항엽산 조성물.
  96. 제61항에 있어서,
    상기 생활성 항엽산제는,
    프로구아닐; 피리메타민; 트리메토프림 및 GARFT 억제제의 6-치환된 피롤로 및 티에노[2,3-d]피롤로피리미딘 종류로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상인, 리포솜 항엽산 조성물.
  97. 제61항에 있어서,
    상기 생활성 항엽산제가 pH 5 내지 8인, 리포솜 항엽산 조성물.
  98. 제61항에 있어서,
    상기 생활성 항엽산제가 pH 2 내지 6인, 리포솜 항엽산 조성물.
  99. 제61항에 있어서,
    상기 표적 잔기는,
    리포솜 성분 및 입체 안정제 분자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나에 말레이미드 관능기를 통하여 공유 결합되는, 리포솜 항엽산 조성물.
  100. 제61항에 있어서,
    상기 표적 잔기는,
    엽산 수용체 α; 엽산 수용체 β; 및 엽산 수용체 δ;로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나에 대한 특이적 친화도를 갖는, 리포솜 항엽산 조성물.
  101. 제61항에 있어서,
    상기 표적 잔기는,
    엽산 수용체 α; 엽산 수용체 β; 및 엽산 수용체 δ;로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 2개에 대한 특이적 친화도를 갖는, 리포솜 항엽산 조성물.
  102. 제61항에 있어서,
    상기 표적 잔기는,
    엽산 수용체 α; 엽산 수용체 β; 및 엽산 수용체 δ에 대한 특이적 친화도를 갖는, 리포솜 항엽산 조성물.
  103. 제61항에 있어서,
    상기 표적 잔기는,
    종양 세포에 존재하지만 비-종양 세포에는 없거나 접근할 수 없는, 종양 세포 표면 항원 상의 에피토프에 대한 특이적 친화도를 갖는, 리포솜 항엽산 조성물.
  104. 제103항에 있어서,
    상기 종양 세포가 악성 세포인, 리포솜 항엽산 조성물.
  105. 제103항에 있어서,
    상기 종양 세포 표면 항원은,
    엽산 수용체 α; 엽산 수용체 β; 및 엽산 수용체 δ로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나인, 리포솜 항엽산 조성물.
  106. 제61항에 있어서,
    상기 표적 잔기는,
    항체의 항원 결합 서열을 포함하는 단백질인, 리포솜 항엽산 조성물.
  107. 제106항에 있어서,
    항체의 상기 항원 결합 서열이 항체 기원의 적어도 하나의 상보성 결정 부위를 포함하는, 리포솜 항엽산 조성물.
  108. 제106항에 있어서,
    상기 단백질이 항체를 포함하는, 리포솜 항엽산 조성물.
  109. 제106항에 있어서,
    상기 표적 잔기는,
    항체; 인간화 항체; 항체의 항원 결합 단편; 단일 쇄 항체; 단일-도메인 항체; 양특이성 항체; 합성 항체; 페길화 항체; 및 다합체 항체;로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나인, 리포솜 항엽산 조성물.
  110. 제61항에 있어서,
    각각의 리포솜이 200개까지의 표적 잔기를 포함하는, 리포솜 항엽산 조성물.
  111. 제110항에 있어서,
    각각의 리포솜이 30 내지 200개의 표적 잔기를 포함하는, 리포솜 항엽산 조성물.
  112. 엽산 수용체를 표면에서 발현하는 종양에 생활성 항엽산제를 전달하는 방법에 있어서,
    치료학적 유효량의 생활성 항엽산제를 종양에 전달하도록 하는 양으로 제61항에 따르는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  113. 제112항에 있어서,
    상기 종양은 대상체에 존재하며,
    상기 투여는,
    주입; 주사; 비경구 투여; 및 국소 투여;로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  114. 제113항에 있어서,
    상기 대상체가 사람인, 방법.
  115. 제112항에 있어서,
    엽산 수용체를 발현하지 않는 세포에 전달하는 것보다 2배 초과의 비율로 종양에 리포솜 항엽산 조성물을 선택적으로 전달하는, 방법.
  116. 제80항에 따르는 조성물의 제조방법에 있어서,
    리포솜 성분; 수용액 중의 생활성 항엽산제; 및 표적 잔기;를 포함하는 혼합물을 형성하는 단계;
    상기 혼합물을 균질화시켜 상기 수용액 중의 리포솜을 형성하는 단계; 및
    상기 혼합물을 막을 통하여 압출시켜 수용액에 생활성 항엽산제를 내포하는 리포솜을 형성하는 단계;를 포함하는, 제조방법.
  117. 제116항에 있어서,
    상기 압출 단계 이후, 수용액 중에서 리포솜 외부에 있는 과량의 생활성 항엽산제를 제거하는 단계;를 추가로 포함하는 제조방법.
  118. 제117항에 있어서,
    상기 제거 단계 이후, 상기 조성물을 동결건조하여 동결건조 조성물을 형성하는 단계;를 추가로 포함하는 제조방법.
  119. 제118항에 있어서,
    상기 동결건조 단계 이후, 상기 동결건조 조성물을 용매에 용해시켜 상기 동결건조 조성물을 재구성하는 단계;를 추가로 포함하는 제조방법.
  120. 제116항에 있어서,
    상기 혼합물은,
    만니톨; 트레할로스; 소르비톨; 및 수크로스로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나를 포함하는 제조방법.
  121. 제116항에 있어서,
    적어도 하나의 리포솜 성분들이 입체 안정제를 추가로 포함하는 제조방법.
  122. 제121항에 있어서,
    상기 입체 안정제는,
    폴리에틸렌글리콜(PEG); 폴리-L-리신(PLL); 모노시알로강글리오시드(GM1); 폴리(비닐 피롤리돈)(PVP); 폴리(아크릴아미드)(PAA); 폴리(2-메틸-2-옥사졸린); 폴리(2-에틸-2-옥사졸린); 포스파티딜 폴리글리세롤; 폴리[N-(2-하이드록시프로필) 메타크릴아미드]; 양친매성 폴리-N-비닐피롤리돈; L-아미노산계 중합체; 및 폴리비닐 알콜로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나인 제조방법.
  123. 제122항에 있어서,
    상기 폴리에틸렌글리콜(PEG)의 수 평균 분자량(Mn)이 200 내지 5000달톤인 제조방법.
  124. 제119항에 있어서,
    상기 용매가 수성 용매인 제조방법.
  125. 엽산 수용체를 선택적으로 표적으로 하는 표적 리포솜 조성물에 있어서,
    내부 공간을 갖는 리포솜;
    상기 내부 공간 내에 배치된 생활성제;
    상기 리포솜의 외부에 부착된 입체 안정제 분자; 및
    적어도 하나의 엽산 수용체에 대한 특이적 친화도를 갖는 단백질을 포함하는 표적 잔기;를 포함하며,
    상기 표적 잔기는 상기 입체 안정제 및 리포솜의 외부 중 적어도 하나에 부착되는, 표적 리포솜 조성물.
  126. 제125항에 있어서,
    상기 입체 안정제는,
    폴리에틸렌글리콜(PEG); 폴리-L-리신(PLL); 모노시알로강글리오시드(GM1); 폴리(비닐 피롤리돈)(PVP); 폴리(아크릴아미드)(PAA); 폴리(2-메틸-2-옥사졸린); 폴리(2-에틸-2-옥사졸린); 포스파티딜 폴리글리세롤; 폴리[N-(2-하이드록시프로필) 메타크릴아미드]; 양친매성 폴리-N-비닐피롤리돈; L-아미노산계 중합체; 및 폴리비닐 알콜;로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나인, 표적 리포솜 조성물.
  127. 제126항에 있어서,
    상기 폴리에틸렌글리콜(PEG)의 수 평균 분자량(Mn)이 200 내지 5000달톤인, 표적 리포솜 조성물.
  128. 제125항에 있어서,
    상기 생활성제는,
    엘립티신; 파클리탁셀; 페메트렉시드; 메토트렉세이트; 랄리트렉시드; 아미노프테린; 프랄라트렉세이트; 로메트렉솔; 트리메트렉시드; LY309887; GW 1843U89; 프로구아닐; 피리메타민; 트리메토프림 및 GARFT 억제제의 6-치환된 피롤로 및 티에노[2,3-d]피롤로피리미딘 종류;로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나를 포함하는, 표적 리포솜 조성물.
  129. 엽산 수용체를 표면에서 발현하는 종양에 생활성 항엽산제를 전달하는 방법에 있어서,
    치료학적 유효량의 생활성 항엽산제를 종양에 전달하도록 하는 양으로 제125항에 따르는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  130. 제129항에 있어서,
    상기 종양은 대상체에 존재하고,
    상기 투여는,
    주입; 주사; 비경구 투여; 및 국소 투여;로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  131. 제130항에 있어서,
    상기 대상체가 사람인 방법.
  132. 제129항에 있어서,
    엽산 수용체를 발현하지 않는 세포에 전달하는 것보다 2배 초과의 비율로 종양에 리포솜 항엽산 조성물을 선택적으로 전달하는 방법.
  133. 제125항에 따르는 조성물의 제조방법에 있어서,
    상기 리포솜은 리포솜 성분들로부터 형성되며,
    상기 제조방법은,
    리포솜 성분, 수용액 중의 생활성제, 표적 잔기를 포함하는 혼합물을 형성하는 단계;
    상기 혼합물을 균질화시켜 상기 수용액 중의 리포솜을 형성하는 단계; 및
    상기 혼합물을 막을 통하여 압출시켜 수용액에 생활성 항엽산제를 내포하는 리포솜을 형성하는 단계;를 포함하는 제조방법.
  134. 제133항에 있어서,
    상기 압출 단계 이후, 수용액 중의 리포솜 외부에 있는 과량의 생활성 항엽산제를 제거하는 단계;를 추가로 포함하는 제조방법.
  135. 제134항에 있어서,
    상기 제거 단계 이후, 상기 조성물을 동결건조하여 동결건조 조성물을 형성하는 단계;를 추가로 포함하는 제조방법.
  136. 제135항에 있어서,
    상기 동결건조 단계 이후, 상기 동결건조 조성물을 용매에 용해시켜 상기 동결건조 조성물을 재구성하는 단계;를 추가로 포함하는 제조방법.
  137. 제133항에 있어서,
    상기 혼합물은,
    만니톨; 트레할로스; 소르비톨; 및 수크로스로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나를 포함하는 제조방법.
  138. 제133항에 있어서,
    적어도 하나의 리포솜 성분들이 입체 안정제를 추가로 포함하는 제조방법.
  139. 제138항에 있어서,
    상기 입체 안정제는,
    폴리에틸렌글리콜(PEG); 폴리-L-리신(PLL); 모노시알로강글리오시드(GM1); 폴리(비닐 피롤리돈)(PVP); 폴리(아크릴아미드)(PAA); 폴리(2-메틸-2-옥사졸린); 폴리(2-에틸-2-옥사졸린); 포스파티딜 폴리글리세롤; 폴리[N-(2-하이드록시프로필) 메타크릴아미드]; 양친매성 폴리-N-비닐피롤리돈; L-아미노산계 중합체; 및 폴리비닐 알콜;로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나인 제조방법.
  140. 제139항에 있어서,
    상기 폴리에틸렌글리콜(PEG)의 수 평균 분자량(Mn)이 200 내지 5000달톤인 제조방법.
  141. 제136항에 있어서,
    상기 용매가 수성 용매인 제조방법.
  142. 제80항에 따르는 조성물을 제공하는 키트에 있어서,
    상기 리포솜 성분들,
    상기 조성물을 사용하여 생활성제를 캡슐화시키기 위한 설명서, 및
    임의로, 별도의 용기 내에 생활성제를 포함하는, 키트.
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