KR20200085390A - Ripk3을 포함하는 당뇨병성 신증 진단용 바이오마커 및 이의 용도 - Google Patents

Ripk3을 포함하는 당뇨병성 신증 진단용 바이오마커 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 RIPK3의 단백질 또는 이의 유전자의 mRNA의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 당뇨병성 신증 진단용 조성물, 및 상기 조성물을 포함하는, 당뇨병성 신증 진단용 키트, 상기 당뇨병성 신증 진단을 위한 정보의 제공 방법, 당뇨병성 신증 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명은, 당뇨병성 신증 진단용 조성물을 제공함으로서, 당뇨병성 신증 환자에게서 발현이 변화하는 RIPK3의 단백질 또는 그 유전자의 발현 수준을 측정 및 비교함으로서, 당뇨병성 신증의 조기진단 및 질병 정도를 유의적으로 예측 또는 파악할 수 있다.

Description

RIPK3을 포함하는 당뇨병성 신증 진단용 바이오마커 및 이의 용도{A biomarker for diagnosing diabetic nephropathy comprising RIPK3 and the uses thereof}
본 발명은 당뇨병성 신증 진단용 조성물, 상기 조성물을 포함하는, 당뇨병성 신증 진단용 키트, 상기 당뇨병성 신증 진단을 위한 정보의 제공 방법을 제공한다.
당뇨병은 높은 혈당 수치가 오랜기간 동안 지속되는 대사 질환으로, 통상적으로 제1형 당뇨병, 제2형 당뇨병, 임신 당뇨병 등으로 분류된다. 제1형 당뇨병은 췌장이 충분한 인슐린을 만들어 내지 못하는 것에 의해 발병하며, ‘인슐린 의존당뇨병’ 또는 ‘연소성 당뇨병”이라고도 한다. 제2형 당뇨병은 세포가 인슐린에 적절하게 반응하기 못하는 인슐린 저항이 있는 것이 특징이다. 이외의 임신 중에 처음 발생하거나 진단되는 모든 형태의 내당능 장애를 임신 당뇨병이라 한다.
당뇨병은 노인인구의 증가와 생활습관의 변화로 유병률이 크게 증가하고 있으며, 2025년에는 전세계 당뇨병 환자가 약 3억명에 이를 것으로 추정되고 있다.
당뇨병성 신증은 당뇨병에 의해 나타나는 합병증으로, 고혈압 등에 의해 지속적으로 신장 내부의 사구체가 손상되어 신장 기능이 저하되는 질환이다. 이는 말기 신부전증의 가장 흔한 원인으로, 당뇨병 환자의 20~40%에서 발생하는 것으로 알려져 있다.
당뇨병성 신증의 병인은 아직 정확하게 밝혀져 있지 않으며, 신장 내의 혈역학적 변화, 사구체 단백의 포도당화, 솔비톨의 축적 등의 복합적 요인들이 관련되어 있는 것으로 여겨진다.
대한 신장학회의 2011년 말 기준으로 통계에 의하면 전체 투석 환자의 원인 질환 중 47.1%를 차지하고 있다. 전 세계적으로도 이와 비슷한 빈도를 보이고 있다. 당뇨병 치료제의 전세계 시장 규모는 2015년에 약 708억 달러에 달하며, 당뇨병성 신증 치료제 시장은 2014년 22억 달러 규모로 연평균 5.6%로 성장하여 2020년 31억 달러에 달할 것으로 예상되고 있다. 당뇨병 환자의 급격한 증가에 따라 당뇨병성 신증 환자 역시 현저히 증가하는 추세이다.
대한 신장학회의 ‘2004년 우리나라 신 대체 요법의 현황'에 대한 보고에 따르면 만성 신부전의 원인질환으로 당뇨병성 신증이 43.4%를 차지하고 그 뒤로 고혈압성 사구체경화증 16.2%, 만성 사구체 신염이 12.5%를 각각 차지함으로써 우리나라에서도 인구 고령화로 인한 당뇨병과 같은 만성질환에 따른 신장질환 환자 증가 추세가 고착화되고 있음을 알 수 있다. 그러나 현재 당뇨병성 신증에 대한 선택적인 치료방법은 아직 없는 실정이다.
당뇨병성 신증은 초기에는 대부분 증상이 없다. 당뇨병성 신증이 진행될수록 소변 검사에서 단백뇨가 나타나고, 단백뇨의 양이 많아지면, 소변에 거품이 나며, 하지 부종 등이 나타날 수 있다.
당뇨병성 신증의 진행과정에서 미세알부민뇨가 출현하는 초기단계에서는 엄격한 혈당조절과 저단백 식사요법으로 미세알부민뇨를 경감 혹은 다음 단계로의 진행을 억제-지연시킬 수 있는 것으로 보고되고 있다. 그러므로 당뇨병성 신증이 말기 신장병으로 진행되는 것을 막을 수 있도록 초기에 진단하는 것이 중요하다. 그러나 종래의 진단에 사용되는 단백뇨는 당뇨병성 신증 이외의 고혈압 및 심혈관 질환의 지표이기도 하는 등 다른 질병과 연관성이 높아 직접적으로 당뇨병성 신증의 진행 정도를 판정하기 어려운 상태이다.
이에, 당뇨병성 신증을 조기에 진단할 수 있는 신규한 바이오 마커의 발굴이 시급한 실정이다.
대한민국 등록특허 제10-1240208호
본 발명의 하나의 목적은, RIPK3의 단백질 또는 이의 유전자의 mRNA의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 당뇨병성 신증 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는, 당뇨병성 신증 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 당뇨병성 신증 진단을 위한 정보의 제공 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 당뇨병성 신증 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하나의 양태로서, RIPK3의 단백질 또는 이의 유전자의 mRNA의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 당뇨병성 신증 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명에서, 상기 당뇨병성 신증 진단용 조성물은 RIPK3의 단백질 또는 이의 유전자의 mRNA의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 당뇨병성 신증 진단용 조성물일 수 있다.
본 발명에서 용어, “당뇨병성 신증”은 당뇨병에 의해 유발된 신장병을 의미하며, 사구체경화증(glomerulosclerosis), 혈관병소(vascular lesion) 및 세뇨관 간질성 질환(tubulointerstitial disease)을 모두 포함하나 특히 당뇨병성 사구체경화증을 의미한다.
본 발명에서 사용된 용어 “진단”은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 당뇨병성 신증 발병 여부를 확인하는 것으로서, 당뇨병성 신증 발병 여부를 조기에 확인 할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 “RIPK3”은 Receptor-interacting serine/threonine-protein kinase 3, RIP3 또는 RIPK3로 표기될 수 있으며, 상기 RIPK3을 코딩하는 유전자의 구체적인 염기서열 및 단백질 정보는 NCBI에 공지되어 있다(NCBI: NP_006862.2)
본 발명의 일실시예에서, 정상환자와 당뇨병 환자의 혈장 및 소변에서 RIPK3의 단백질의 발현 수준을 비교하였으며, 당뇨병 환자에서 정상환자에 비해 RIPK3의 단백질 농도가 높음을 확인하였다. 또한, 당뇨병성 신증을 진단하는데 이용되는 알부민뇨 수준에 따라 제2형 당뇨병 환자를 정상 알부민뇨군(normoalbuminuria group), 미세알부민뇨군(microalbuminuria group), 단백뇨군(macroalbuminuria group)로 분류하여 RIPK3의 단백질의 발현 수준을 분석한 결과, 알부민뇨의 수준이 높을수록, 즉 당뇨병성 신증이 심화될수록 RIPK3의 단백질의 농도가 높게 측정됨을 확인하였다.
또한, 상기 환자들을 대상으로 장기적으로 추가 관찰한 결과, RIPK3의 농도가 증가되어 있던 당뇨환자들이 매년 알부민뇨의 증가 비율이 더 빠른 것을 확인하였다. 또한, RIPK3의 농도가 증가되어 있던 당뇨환자에서 신기능 저하가 진행될 가능성 역시 더 높음을 확인하였다.
따라서, RIPK3의 발현이 증가하는 경우, 당뇨병성 신증으로 진단할 수 있음을 확인하였다.
본 발명에서 용어 “마커(marker)”란 정상군 개체와 당뇨병성 신증을 가진 개체를 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 본 발명의 당뇨병성 신증을 가지는 개체에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩티드, 단백질 또는 핵산, 유전자, 지질, 당지질, 당단백질 또는 당 등과 같은 유기 생체 분자들을 모두 포함한다. 특히 본 발명에서는 본 발명의 당뇨병성 신증을 가지는 개체에서 변화되는 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 사용된 용어 “mRNA 수준 측정”이란 당뇨병성 신증을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 당뇨병성 신증 진단용 유전자들의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 mRNA의 양을 측정한다. 이를 위한 분석 방법으로는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 프라이머 쌍 또는 프로브이며, 상기 유전자들의 핵산 정보가 GeneBank 등에 알려져 있으므로 당업자는 상기 서열을 바탕으로 이들 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있다.
상기 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
바람직하게 당뇨병성 신증 진단을 위하여, 상기 mRNA 수준을 측정하는 제제는 RIPK3의 단백질의 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍, 프로브 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 “프라이머 쌍”은 표적 유전자 서열을 인지하는 정방향 및 역방향의 프라이머로 이루어진 모든 조합의 프라이머쌍을 포함하나, 바람직하게는, 특이성 및 민감성을 가지는 분석 결과를 제공하는 프라이머 쌍이다. 프라이머의 핵산 서열이 시료내 존재하는 비-표적 서열과 불일치하는 서열이어서, 상보적인 프라이머 결합 부위를 함유하는 표적 유전자 서열만 증폭하고 비특이적 증폭을 유발하지 않는 프라이머일 때, 높은 특이성을 부여할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 “프로브”란 시료 내의 검출하고자 하는 표적 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 의미하며, 상기 결합을 통하여 특이적으로 시료 내의 표적 물질의 존재를 확인할 수 있는 물질을 의미한다. 프로브 분자의 종류는 당업계에서 통상적으로 사용되는 물질로서 제한은 없으나, 바람직하게는 PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid), 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, RNA 또는 DNA 일 수 있으며, 가장 바람직하게는 PNA이다. 보다 구체적으로, 상기 프로브는 바이오 물질로서 생물에서 유래되거나 이와 유사한 것 또는 생체외에서 제조된 것을 포함하는 것으로 예를 들어, 효소, 단백질, 항체, 미생물, 동식물 세포 및 기관, 신경세포, DNA, 및 RNA일 수 있으며, DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, RNA는 게놈 RNA, mRNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, 단백질의 예로는 항체, 항원, 효소, 펩타이드 등을 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, “안티센스 올리고뉴클레오티드”는 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체로서, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 서열은 상기 유전자들의 mRNA에 상보적이고 상기 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미한다. 이는 상기 유전자 mRNA의 번역, 세포질 내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드의 길이는 6 내지 100 염기, 바람직하게는 8 내지 60 염기, 보다 바람직하게는 10 내지 40 염기일 수 있다. 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 통상의 방법으로 시험관 내에서 합성되어 생체 내로 투여하거나 생체 내에서 안티센스 올리고뉴클레오티드가 합성되도록 할 수 있다. 시험관 내에서 안티센스 올리고뉴클레오티드를 합성하는 한가지 예는 RNA 중합효소 I를 이용하는 것이다. 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 하는 한 가지 예는 다중클로닝부위(MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 것이다. 상기 안티센스 RNA는 서열 내에 번역 중지 코돈이 존재하도록 하여 펩타이드 서열로 번역되지 않도록 하는 것이 바람직하다.
본 발명에 사용된 용어 “단백질 수준 측정”이란 당뇨병성 신증 진단을 위하여 생물학적 시료에서 당뇨병성 신증 진단용 마커 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정이다. 상기 마커 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있으며, 바람직하게는 항체를 이용하지 않고 단백질 발현 수준 자체를 측정한다.
상기 단백질 수준 측정 또는 비교 분석 방법으로는 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 면역조직화학(immunohistochemistry) 분석, 면역세포화학(immunocytochemistry) 분석, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏, 및 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay) 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.
당뇨병성 신증 진단을 위하여 바람직하게 상기 단백질 수준을 측정하는 제제는 RIPK3의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함할 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 “항체”는 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 상기 RIPK3의 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다.
또한 본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.
본 발명은 다른 양태로서, 상기 당뇨병성 신증 진단용 조성물을 포함하는, 당뇨병성 신증 진단용 키트를 제공한다.
바람직하게, 상기 키트는 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction) 키트, DNA 칩 키트, ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 키트, 단백질 칩 키트 또는 래피드(rapid) 키트 일 수 있다.
또한, 바람직하게, 상기 당뇨병성 신증 진단용 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함하여 구성될 수 있다.
바람직하게, 상기 진단용 키트는 역전사 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단용 키트일 수 있다. RT-PCR(역전사 중합효소반응) 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 상기 각 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오타이드로서, 약 7 bp 내지 50 bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 10 bp 내지 30 bp 의 길이이다. 또한 대조군 유전자의 핵산 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그 외 역전사 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNAse, RNAse 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
바람직하게 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단용 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
또한 바람직하게는, ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트일 수 있다. ELISA 키트는 상기 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.
또한, 바람직하게는, 5분내 분석결과를 알 수 있는 신속한 테스트를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 래피드(rapid) 키트 일 수 있다. 래피드 키트는 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 래피드 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 래피드 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 특이항체와 2차 항체가 고정된 나이트로 셀룰로오스 멤브레인, 항체가 결합된 비드에 결합된 멤브레인, 흡수패드와 샘플 패드 등 다른 물질 등을 포함할 수 있다.
본 발명은 다른 양태로서, 당뇨병성 신증 진단을 위한 정보의 제공 방법을 제공한다.
본 발명의 정보의 제공 방법은 생물학적 시료로부터 RIPK3의 단백질 또는 이의 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계 및 상기 단계에서 측정된 단백질의 발현 수준 또는 유전자의 발현 수준을 정상 대조군 시료와 비교하는 단계를 포함한다.
본 발명에서 사용된 용어 "생물학적 시료"란 당뇨병성 신증 발병에 의해 유전자 발현 수준 또는 단백질 발현 수준이 차이가 나는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
상기 RIPK3은 모두 정상 대조군과 비교하여, 당뇨병성 신증이 있는 개체에서 유전자 발현 수준 또는 해당 단백질의 발현 수준이 변화하는 특징을 가지므로, 상기 수준이 변화하면 당뇨병성 신증으로 진단할 수 있다.
구체적으로, 당뇨병성 신증 의심 개체의 분리된 시료의 상기 단백질의 발현 수준 또는 유전자의 발현 수준이 정상 대조군 시료의 단백질의 발현 수준 또는 유전자의 발현 수준보다 높을 경우 당뇨병성 신증으로 판단할 수 있다.
바람직하게, 본 발명의 상기 유전자의 발현 수준은 mRNA 발현 수준을 측정하거나 비교할 수 있다.
상기 mRNA 발현 수준 측정 또는 비교는 역전사 중합효소반응, 경쟁적 역전사 중합효소반응, 실시간 역전사 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 또는 DNA 칩 등을 사용할 수 있으나, 본 발명은 이들에 제한되는 것이 아니다. 상기 측정 방법들을 통하여 정상 대조군에서의 mRNA 발현량과 당뇨병성 신증 환자의 mRNA 발현량을 확인할 수 있고, 이들 발현량 정도를 비교함으로써 당뇨병성 신증 발병 여부를 진단 또는 예측할 수 있다.
바람직하게 본 발명의 상기 단백질 발현 수준은 해당 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 측정 및 비교할 수 있다. 상기 항체와 생물학적 시료 내의 해당 단백질이 항원-항체 복합체를 형성하도록 하고, 이를 검출하는 방법을 이용한다.
본 발명에서 사용된 용어 "항원-항체 복합체"는 생물학적 시료 중의 해당 단백질 항원과 이를 인지하는 항체의 결합물을 의미한다. 상기 항원-항체 복합체의 검출은 당업계에 공지된 바와 같은 방법, 예를 들어 분광학적, 광화학적, 생물화학적, 면역화학적, 전기적, 흡광적, 화학적 및 기타 방법을 이용하여 검출할 수 있다.
본 발명의 목적상, 상기 단백질 발현 수준 측정 또는 비교 분석 방법으로는 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 면역조직화학(immunohistochemistry) 분석, 면역세포화학(immunocytochemistry) 분석, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LCMS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏, 및 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay) 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 다른 양태로서, 당뇨병성 신증 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 당뇨병성 신증 치료제의 스크리닝 방법은 분리된 세포, 분리된 조직 또는 인간을 제외한 동물에 당뇨병성 신증 치료제 후보물질을 처리하는 단계, 상기 후보물질 처리군에서 RIPK3의 단백질의 발현수준을 측정하는 단계 및 상기 측정된 RIPK3의 단백질의 발현수준이 후보물질을 처리하지 않은 대조군보다 감소하면 상기 후보물질을 당뇨병성 신증 치료제로 선택하는 단계를 포함한다.
본 발명의 용어, “후보물질”은 통상적인 선정방식에 따라 당뇨병성 신증 치료의 가능성을 지닌 것으로 추정되거나 또는 무작위적으로 선정된 개별적인 핵산, 단백질, 기타 추출물 또는 천연물, 또는 화합물 등이 될 수 있다.
본 발명에서 발현 수준 측정은 RIPK3의 단백질의 발현수준을 측정하는 것일 수 있다.
본 발명의 용어 "대조군"이란 당뇨병성 신증 치료제 후보물질을 처리하지 않은 분리된 세포, 분리된 조직 또는 인간을 제외한 동물로 상기 후보물질을 처리한 군과 병렬 관계에 속하는 분리된 세포, 분리된 조직 또는 인간을 제외한 동물을 의미한다.
본 발명의 “당뇨병성 신증 치료제의 스크리닝 방법”은, 당뇨병성 신증에 RIPK3의 발현이 관련됨을 확인함으로써, RIPK3의 발현을 치료제 후보물질을 처리하지 않은 대조군 세포와 비교하는 방식으로 고안되었다.
당뇨병성 신증을 예방 또는 치료할 수 있는 후보물질의 부재 하에 분리된 세포, 분리된 조직 또는 인간을 제외한 동물에서의 RIPK3의 단백질의 수준을 측정하고, 또한, 상기 후보물질의 존재 하에서 RIPK3 단백질의 수준을 측정하여 양자를 비교한 후, 상기 후보물질이 존재할 때의 RIPK3의 단백질의 수준이 상기 후보물질의 부존재 하에서의 수준보다 감소시키는 물질을 당뇨병성 신증 예방 또는 치료용 제제로 예측할 수 있다.
상기 분리된 세포로는 인체에서 분리된 primary 세포일 수 있으며, 구체적으로 신장 근위세관 세포(Kidney proximal tubule cells), 신장 원위세관 세포(Kidney distal tubule cells), 신장 집합관 세포(Kidney collecting duct cells), 신장 사구체족 세포(Kidney glomerulus podocytes), 신사구체 간질세포(Kidney glomerulus mesangial cells), 신장 사구체 내피세포(Kidney glomerulus endothelial cells), 또는 신장 벽 상피 세포(Kidney parietal epithelial cells)를 사용할 수 있다. 또한, HK-2(ATCC® CRL-2190™, Human kidney tubular epithelial cells) 또는 인간 신장 족세포주(Human kidney podocyte cells)와 같이 기존에 확립된 세포주를 사용할 수도 있다.
상기에서 기술한 바와 같이, 본 발명은, 당뇨병성 신증 진단용 조성물을 제공함으로서, 당뇨병성 신증 환자에게서 발현이 변화하는 RIPK3의 단백질 또는 그 유전자의 발현 수준을 측정 및 비교하여 당뇨병성 신증의 조기진단 및 질병 정도를 유의적으로 예측 또는 파악할 수 있다.
도 1은 정상 대조군과 제2형 당뇨병 환자군(정상 알부민뇨군(normoalbuminuria group), 미세알부민뇨군(microalbuminuria group), 단백뇨군(macroalbuminuria group))의 혈청(plasma)에서 RIPK3의 단백질 농도를 비교한 것이다.
도 2는 정상 대조군과 제2형 당뇨병 환자군(정상 알부민뇨군(normoalbuminuria group), 미세알부민뇨군(microalbuminuria group), 단백뇨군(macroalbuminuria group))의 소변(urine)에서 RIPK3의 단백질 농도를 비교한 것이다.
도 3은 전체 제2형 당뇨병 환자에서 RIPK3의 단백질 농도와 연간 소변내의 알부민-크레아틴 비율 변화의 상관관계를 분석한 결과이다.
도 4는 정상 알부민뇨군의 제2형 당뇨병 환자에서 RIPK3의 단백질 농도와 연간 소변내의 알부민-크레아틴 비율 변화의 상관관계를 분석한 결과이다.
도 5는 당뇨환자에서 기저 RIPK3 농도에 따른 신장 기능 저하를 카플란-마이어 곡선으로 분석한 결과이다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 첨부한 도면을 참고로 하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
<실험예 1> 제 2형 당뇨병 환자의 혈장 및 소변에서 RIPK3 단백질의 발현
당뇨병성 신증이 심화될수록 알부민뇨의 수치가 증가하는 것으로 알려져 있다. 따라서 당뇨병성 신증에 따른 RIPK3의 단백질의 수준변화를 확인하기 위해, 상기 당뇨병 환자는 알부민뇨의 기준으로 나누어 각 군의 환자의 혈장(Plasma)에서 RIPK3의 단백질 수준을 분석하였다(도 1).
정상 대조군(non-diabetic control)의 수는 19명이며, 제2형 당뇨병 환자의 수는 140명이었다. 이중 당뇨병 환자는 알부민뇨의 수준에 따라 정상 알부민뇨군(normoalbuminuria group) 76명, 미세알부민뇨군(microalbuminuria group) 41명, 단백뇨군(macroalbuminuria group) 23명으로 분류하였다.
각 환자의 혈장(plasma)에서 RIPK3의 단백질 농도를 분석한 결과, 정상 대조군과 비교하여 당뇨병 환자의 혈장에서 RIPK3의 단백질 농도가 높게 측정되는 것을 확인하였다.
다음으로 상기의 혈장 분석 환자를 대상으로 소변에서 RIPK3 의 단백질 수준을 분석하였다. 채취된 소변 샘플 중 변성 또는 샘플의 양이 부족한 환자는 분석에서 제외하여, 당뇨병이 없는 정상 대조군 21명과 제2형 당뇨병 환자 116명 소변에서 RIPK3의 단백질 수준을 분석하였다(도 2).
당뇨병성 신증에 따른 소변에서의 RIPK3의 단백질의 수준 변화를 확인하기 위해, 상기 당뇨병 환자를 알부민뇨의 수준에 따라 정상 알부민뇨군(normoalbuminuria group) 62명, 미세알부민뇨군(microalbuminuria group) 36명, 단백뇨군(macroalbuminuria group) 18명으로 분류하였다. 소변 내의 RIPK3 단백질 수준은 소변 내의 크래아틴(creatinine) 수준에 맞춰 조정하였다.
분석결과, 혈장 실험과 유사하게 당뇨병 환자의 소변에서 RIPK3 단백질의 발현 수준이 증가하는 것을 확인하였으며, 알부민뇨의 수준이 증가할수록 RIPK3의 단백질 수준 역시 증가함을 확인하였다.
당뇨병성 신증이 심화될수록 알부민뇨가 증가하는데, 이와 맞추어 RIPK3의 단백질 수준 역시 점차 증가되는 양상을 보임을 확인하였다.
따라서 당뇨병성 신증이 심화될수록 RIPK3의 단백질의 수준이 증가하는 바, RIPK3의 단백질 수준을 측정하여 당뇨병성 신증의 진단에 활용할 수 있다.
<실험예 2> 당뇨병 환자에서 혈장 내의 RIPK 단백질 농도에 따른 알부민뇨의 변화 또는 신기능의 저하
다음으로 RIPK3의 단백질과 당뇨병성 신증의 관계를 확인하고자, 상기 환자들을 대상으로 알부민뇨와 신기능을 장기적으로 추가 관찰하였다.
도 3 내지 4은 혈장 내의 RIPK3의 농도와 연간 소변내의 알부민-크레아틴 비율 변화(urine albumin-to-creatinine-ratio, UACR)의 상관관계를 분석한 결과이다.
도 3은 전체 제2형 당뇨병 환자에서 RIPK3 농도에 따른 알부민-크레아틴 비율 변화를 분석한 결과이다. 분석결과, 전체 제2형 당뇨병 환자의 혈장에서 RIPK3 농도가 높을수록 알부민-크레아틴 비율의 증가 속도가 높음을 확인하였으며, 추가적으로 도 4에서 정상 알부민뇨인 당뇨환자, 즉 기존에 당뇨병성 신증이 명확하지 않았던 당뇨환자에서 역시 혈장의 RIPK3의 단백질 농도가 높을수록 소변내의 알부민-크레아틴 비율의 증가가 빠름을 확인하였다.
도 5에서는 기저 RIPK3 농도에 따른 신기능 저하를 확인하고자, 기저 RIPK3의 농도에 따라 삼분위수로 나누어 신장병 진행(renal progression)을 분석하였다. 도 5은 신장병 진행(renal progression)을 사건(event)으로 지정하여 생존분석(survival analysis)을 시행한 후, 생존 곡선을 표시한 것이다. 신장병 진행(renal progression) 사건은 만성신장 질환 단계 변화에 따라 추정된 사구체 여과속도(estimated glomerular filtration rate, eGFR)가 지속적으로 25% 감소되는 경우로 정의하였다. Y축의 숫자는 해당 시점에 사건(신장병 진행)이 발생하지 않을 확률을 의미한다. 다시 말해, 신장병 진행이 전혀 발생하지 않은 경우가 1.00에 해당하고 사건이 하나하나 발생함에 따라 점차 0.00에 가까워지게 된다.
분석결과, 기저 RIPK3 단백질의 수준이 높을수록 신장병 진행이 발생할 가능성이 높음을 확인하였다. 즉, 신장 기능이 나빠지기 이전의 기저 RIPK3 농도를 이용하여 앞으로의 신장 기능의 악화를 예상할 수 있었다. 따라서 당뇨병성 신증의 조기 정밀 진단 지표로 RIPK3을 활용할 수 있다.

Claims (12)

  1. RIPK3의 단백질 또는 이의 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제를 포함하는 당뇨병성 신증 진단용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍, 프로브 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드인 것인, 당뇨병성 신증 진단용 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 단백질 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 것인, 당뇨병성 신증 진단용 조성물.
  4. 제1항에 따른 조성물을 포함하는, 당뇨병성 신증 진단용 키트.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 키트는 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction) 키트, DNA 칩 키트, ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 키트, 단백질 칩 키트 또는 래피드(rapid) 키트인 것인, 당뇨병성 신증 진단용 키트.
  6. 생물학적 시료로부터 RIPK3의 단백질 또는 이의 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    상기 단계에서 측정된 단백질의 발현 수준 또는 유전자의 발현 수준을 정상 대조구 시료와 비교하는 단계를 포함하는, 당뇨병성 신증 진단을 위한 정보의 제공 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    당뇨병성 신증 의심 개체의 분리된 시료의 상기 단백질의 발현 수준 또는 유전자의 발현 수준이, 정상 대조군 시료의 단백질의 발현 수준 또는 유전자의 발현 수준보다 높은 경우 당뇨병성 신증으로 판단하는 것을 특징으로 하는, 당뇨병성 신증 진단을 위한 정보의 제공 방법.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 유전자의 발현 수준은 상기 유전자의 mRNA 발현 수준인, 당뇨병성 신증 진단을 위한 정보의 제공 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 mRNA 발현 수준 측정은 역전사 중합효소반응, 경쟁적 역전사 중합효소반응, 실시간 역전사 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 또는 DNA 칩에 의한 것인, 당뇨병성 신증 진단을 위한 정보의 제공 방법.
  10. 제6항에 있어서,
    상기 단백질 발현 수준 측정은 해당 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하는 것인, 당뇨병성 신증 진단을 위한 정보의 제공 방법.
  11. 제6항에 있어서,
    상기 단백질 발현 수준 측정은 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 면역조직화학(immunohistochemistry) 분석, 면역세포화학(immunocytochemistry) 분석, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏, 및 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 이용하여 수행하는 것을 특징으로 하는, 당뇨병성 신증 진단을 위한 정보의 제공 방법.
  12. 분리된 세포, 분리된 조직 또는 인간을 제외한 동물에 당뇨병성 신증 치료제 후보물질을 처리하는 단계;
    상기 후보물질 처리군에서 RIPK3의 단백질의 발현수준을 측정하는 단계; 및
    상기 측정된 RIPK3의 단백질의 발현수준이 후보물질을 처리하지 않은 대조군보다 감소하면 상기 후보물질을 당뇨병성 신증 치료제로 선택하는 단계를 포함하는, 당뇨병성 신증 치료제의 스크리닝 방법.
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