ME00277B - Polimerni konjugati mutiranog neublastina - Google Patents

Polimerni konjugati mutiranog neublastina

Info

Publication number
ME00277B
ME00277B MEP-2008-438A MEP2008438A ME00277B ME 00277 B ME00277 B ME 00277B ME P2008438 A MEP2008438 A ME P2008438A ME 00277 B ME00277 B ME 00277B
Authority
ME
Montenegro
Prior art keywords
neublastin
polypeptide
sequence
polymer
amino acid
Prior art date
Application number
MEP-2008-438A
Other languages
English (en)
Inventor
R Blake Pepinsky
Anthony Rossomando
Laura Silvian
Dinah Wen Yee Sah
Sjodin Paula Ann Boriack
Stephan S Miller
Original Assignee
Biogen Ma Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biogen Ma Inc filed Critical Biogen Ma Inc
Publication of ME00277B publication Critical patent/ME00277B/me

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/4756—Neuregulins, i.e. p185erbB2 ligands, glial growth factor, heregulin, ARIA, neu differentiation factor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

Oblast pronalaska
Predmetna prijava ima prioritet od Međunarodne patentne prijave PCT/US02/02319, podnete 25.01.2002., koja ima prioritet od U.S. privremene patentne prijave serijski br. 60/266,071, podnete 01.02.2001. (od koje je prijavilac odustao).
Predmetni pronalazak se odnosi na hemiju proteina, molekularnu biologiju, neurobiologiju, neurologiju i tretman bola.
Pozadina pronalaska
Neurotrofni faktori su prirodni proteini koji regulišu neuronsko preživljavanje tokom razvoja i regulišu plastičnost i strukturni integritet adultnog nervnog sistema. Neutrofni faktori mogu da se izoluju iz nervnog tkiva, kao i iz tkiva koje nije nervno. Tokom poslednjih dvadeset godina, otkriveni su mnogi neutrofni faktori. Ovi neutrofni faktori mogu da se klasifikuju u super porodice, porodice, potporodice i individualne vrste na osnovu njihove strukture i funkcije.
Super porodice neurotrofnih faktora obuhvataju super porodicu fibroblasnog faktora hrasta (FGF), super porodicu neurotrofina i super porodicu transformišućeg faktora rasta - β (TGF - β). Ligandi koji su povezani sa neurotrofnim faktorom deriviranim iz ćelijske linije glija ćelija (GDNF) predstavljaju porodicu proteina u okviru TGF - β super porodice. Ligandi povezani sa GDNF obuhvataju GDNF, persefin (PSP), neurturin (NTN) i neublastin (NBN ; poznat kao i artemin ili enovin). Članovi porodice liganada koji su povezani sa GDNF su okarakterisani, između ostalih stvari, pomoću sedam konzerviranih sisteminskih ostataka. Ovi ostaci formiraju intramolekulske i intermolekulske disulfidne mostove i omogućavaju uspostavljanje tercijarne i kvaternarne strukture dimerizovanog polipeptidnog liganda. Članovima ove porodice je takođe zajednička sposobnost da indukuju prevođenje signala putem više komponentnog receptorskog kompleksa koji se sastoji od ko-receptora GFRα porodice koji je povezan sa glikozilfosfatidilinozitolom (GPI), koji je član podporodice liganda povezanih sa GDNF i koji je RET tirozinkinaza receptor.
Aktivirani RET pokreće kaskadu prevođenja signala koja je odgovarna, barem delimično, za ispoljavanje efekata liganada povezanih sa GDNF. Prema tome, aktivacija RET može da predstavlja jedan željeni aspekt terapije koja deluje preko signalnog puta GFRα receptora, čime vrši utucaj na ćelijske procese.
Neublastin spada u GDNF porodicu zbog toga što poseduje zajedničke homologe regione sa drugim GDNF ligandima, uključujući motiv od sedam cisteina (npr., kao što je opisano u EP02/02691, PCT publikacije US02/02319 i US02/06388), kao i zbog svoje sposobnosti da se vezuje za i da aktivira RET receptor koji je deo GFRα kompleksa. Specifično, neublastin je visoko selektivan pri vezivanju za GFRα3 - RET receptorski kompleks. Prema tome, neublastin poseduje jedinstvene podregione u svojoj aminokiselinskoj sekvenci u poređenju sa drugim članovima porodice liganada povezanih sa GDNF.
Trenutno postojeći podaci sugerišu da neublastin može da ima protektivnu i regeneratornu ulogu u perifernom i centralnom nervnom sistemu i da kao posledica toga može biti koristan kao terapijsko sredsvo za neurodegenerativne poremećaje. Na primer, podaci sugerišu da neublastin možda poseduje efekte koji promovišu preživljavanje kod kultivisanih senzornih neurona iz ganglija dorzalnog korena i iz ganglija trigeminusa, kao i kod kultivisanih dopaminergičkih neurona supstancije nigre crne supstance (Baloh et al., Neuron 21: 1291 - 1302 (1998)). Stoga, izgleda da neublastin pospešuje preživljavanje neuronskih populacija uključujući senzorne i dopaminergičke neurone. Ovo je važno zbog toga što je degeneracija i disfunkcija neurona udružena sa stanjima bolesti. Na primer, patološka stanja senzorsnih i dopaminergičkih neurona se nalaze u osnovi periferne neuropatije i Parkinsonove bolesti, respektivno.
Zbog toga, primena neublastina može biti korisna, na primer, u tretmanu oboljenja koja su udružena sa neuronskom degeneracijom i disfunkcijom. Međutim, neublastin se brzo uklanja iz tela što može da utiče na dozni režim neublastina koji je neophodan u terapijskim primenama. Stoga, postoji potreba za modifikovanim polipeptidima neublastina sa pospešenom biološkom raspoloživošću. Prema tome, cilj predmetnog pronalaska je identifikacija modifikovanih oblika neublastina koji pokazuju povećanu biološku raspoloživost.
Suština pronalaska
Predmetni pronalazak obezbeđuje sa polimerom konjugovane mutirane dimere neublastina. Svaki dimer sadrži prvu amino - terminalnu aminokiselinu i od drugog polipeptida koji sadrži drugu amino - terminalnu aminokiselinu. Svaki od polipeptida ponaosob sadrži: (a) aminokiselinsku sekvencu koja poseduje najmanje 70%, 80%, 90% ili 95% identičnosti sekvence sa aminokiselinama 8 - 113 sekvence čiji je ID br. 1; (b) cisteinski ostatak na svakom od položaja 16,43, 47, 80, 81, 109 i 111 (numeracija prema sekvenci čiji je ID br. 1); (c) aminokiselinske ostatke kao što sledi: C na položaju 16, L na položaju 18, V na položaju 25, L na položaju 28, G na položaju 41, F na položaju 42, C na položaju 43, G na položaju 45, C na položaju 47, C na položaju 80, C na položaju 81, R na položaju 82, P na položaju 83, F na položaju 91, D na položaju 93, S na položaju 105, A na položaju 106, C na položaju 109 i C na položaju 111; kao i (d) LGLG ponavljajuću sekvencu, FRFC motiv, QPCCRP motiv, i SATACGC motiv. Dimer sadrži barem jednu aminokiselinsku supstituciju (u odnosu na sekvencu čiji je ID br. 1), koja obezbeđuje interno mesto za konjugaciju sa polimerom za koje se polimer vezuje.
Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje sa polimerom konjugovani mutirani neublastinski dimer koji sadrži prvi polipeptid i drugi polipeptid, pri čemu svaki od polipeptida sadrži 90 - 140, npr., 95 - 120 ili 100 - 110 aminokiselina sekvence čiji je ID br. 6, sa 1 - 6 aminokiselinskih supstitucija, pri čemu svaka supstitucija obezbeđuje mesto za konjugaciju sa polimerom za koje se polimer vezuje. Specifični primeri polipeptida prema predmetnom pronalasku obuhvataju NBN 113 (sekvenca čiji je ID br. 2), NBN140 (sekvenca čiji je ID br. 6), NBN 116 (sekvenca čiji je ID br. 7), NBN112 (sekvenca čiji je ID br. 8), NBN111 (sekvenca čiji je ID br. 9), NBN110 (sekvenca čiji je ID br. 10), NBN109 (sekvenca čiji je ID br. 11), NBN108 (sekvenca čiji je ID br. 12), NBN107 (sekvenca čiji je ID br. 13), NBN106 (sekvenca čiji je ID br. 14), NBN105 (sekvenca čiji je ID br. 15), NBN104 (sekvenca čiji je ID br. 16), NBN103 (sekvenca čiji je ID br. 17), NBN102 (sekvenca čiji je ID br. 18), NBN101 (sekvenca čiji je ID br. 19), NBN100 (sekvenca čiji je ID br. 20) i NBN99 (sekvenca čiji je ID br. 21).
Poželjno, najmanje jedna od dve amino - terminalnih aminokiselina u dimeruje konjugovana sa polimerom. Poželjne aminokiselinske supstancije obuhvataju zamenu arginskog ostatka lizinskim ostatkom (R[br. aminokis.]K; pri čemu [br. aminokis.] označava broj aminokiseline u odnosu na sekvencu čiji je ID br. 1), kao i zamenu asparaginskog ostatka lizinskim ostatkom (N[br. aminokis.]K) ili aspartatskim ostatkom (N[br. aminokis.]D). Specifični primeri takvih supstitucija jesu R14K, R39K, R68K, N95D, i N95K (numeracija prema sekvenci čiji je ID br. 1). Posebno poželjna supstitucija je N95K.
Poželjno, ukupno kombinovana molekulska masa polimera na dimeru je 20,000 - 40,000 Da. Poželjno, prosečna molekulska masa svakog polimera je 2,000 - 100,000 Da; Poželjnije, 5,000 - 50,000 Da; najpoželjnije oko 10,000 do 20,000 Da. Polimer može biti linearan ili razgranat. Poželjno polimer je polialkilenglikolni molekul, npr., to je polietilen glikolni (PEG) molekul. U nekim rešenjima, barem jedan polipeptid je glikoziliran.
U nekim rešenjima prema predmetnom pronalasku, sa polimerom konjugovani dimer sadrži prvi polipeptid i drugi polipeptid, pri čemu (a) svaki od polipeptida ponaosob sadrži 100 do 110 aminokiselina sekvence čiji je ID br. 1, (b) svaki polipeptid sadrži supstituciju asparagin - u - lizin na aminokiselini br. 95 u sekvenci čiji je ID br. 1, (c) dimer sadrži 3 ili 4 PEG molekula pri čemu je molekulska masa svakog PEG molekula oko 10,000 Da, a svaki PEG molekul je konjugovanna aminoterminalu ili na lizinu 95. Poželjno rešenje predstavlja homodiomer koji sadrži par monomera koji je označen kao 3(,4) × 10 kDa PEG NBN106 - N95K.
Predmetni pronalazak obuhvata nukleinsku kiselinu, npr., ekspresioni vektor DNK koji kodira polipeptid koji treba da se inkorporira u dimer prema predmetnom pronalasku. Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje ćeliju domaćina transformiranu nukleinskom kiselinom.
Predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za tretiranje neuropatskog bola kod sisara. Postupak obuhvata primenu kod sisara terapijski efikasne količine dimera prema predmetnom pronalasku. U nekim rešenjima, terapijski efikasna količina se nalazi u opsegu između 0,1 µg/kg do 1000 µg/kg ili od 1 µg/kg do 30 µg/kg. Primer može da se primenjuje na različite načine, npr., intramuskularno, subkutano ili intravenski. U nekim postupcima prema predmetnom pronalasku, dimer se primenjuje tri puta nedeljno. Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje postupak aktivacije RET receptora kod sisara. Postupak obuhvata primenu kod sisara efikasne količine navedenog dimera.
Ostale osobine i prednosti predmetnog pronalaska biće jasne na osnovu sledećih detaljnih opisa i patentnih zahteva.
Detaljan opis pronalaska
Osim ako nije drugačije navedeno, sve reference na položaj aminokiseline neublastina odnose se na numeraciju koja odgovara ilustrovanoj sekvenci čiji je ID br. 1.
Osim ukoliko nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni pojmovi koji se ovde koriste poseduju isto značenje koje je uobičajeno od strane stručnjaka, kojima je ovaj pronalazak i namenjen. Iako u praksi ili ispitivanju predmetnog pronalaska mogu da se koriste postupci i materijali koji su slični ili ekvivalentni onima koji su ovde opisani, poželjni postupci i materijali su opisani u tekstu ispod. Sve publikacije, patentne prijave, patenti i druge reference koje se ovde pominju inkorporirane su po referenci u potpunosti. U slučaju konflikta, predmetna specifikacija, uključujući definicije, ima prioritet. Dodatno, materijali, postupci i primeri su isključivo ilustrativne prirode i ni na koji način ne ograničavaju obim zaštite prema predmetnom pronalasku.
Kao što se ovde koristi, fraza "peptid neublastina divljeg tipa" označava prirodnu polipeptidnu sekvencu neublastina. Polipeptid neublastina divljeg tipa može dalje da se definiše navođenjem izvora neublastina, na primer, humani, mišji ili pacovski neublastin (videti npr., sekvence čiji su ID brojevi 2, 3 ili 4). Konsenzus polipeptidna sekvenca neublastina je predstavljena kao sekvenca čiji je ID br. 1.
Kao što se ovde koristi fraza "mutirani polipeptid neublastina" označava polipeptid koji sadrži barem određeni minimalni nivo identičnosti sekvence sa polipeptidom neublastina divljeg tipa, a koji sadrži barem jednu aminokiselinsku supstituciju, inserciju ili fuziju, u odnosu na polipeptid neublastina divljeg tipa, a koji pokazuje aktivnost neublastina (npr., kao što je opisano u Međunarodnoj patentnoj prijavi br. PCT/US02/02319 (WO 02/060929)).
Kao sto se ovde koristi, fraza "interno mesto za konjugaciju sa polimerom" ne - terminalni aminokiselinski ostatak u polipeptidu mutiranog neublastina, koji obezbeđuje bočni lanac koji je pogodan za konjugaciju sa polimerom.
Kao sto se ovde koristi, fraza "modifikovani polipeptid neublastina" označava polipeptid koji sadrži barem jedan povezani polimer.
Kao sto se ovde koristi, pojam "fuzija" označava ko - linearnu, kovalentnu vezu dva ili više polipeptida putem njihovih odgovarajućih peptidnih lanaca pomoću genetske ekspresije molekula polinukleotida koji kodira ove proteine u istom ramu očitavanja.
Kao sto se ovde koristi, pojam "identičnost" označava sličnost sekvence između dva polipeptida , molekula ili između dve nukleinske kiseline. Kad je određen položaj u obe se sekvence koje se porede zauzet od strane iste baze ili aminokiselinske monomerne podjedinice (na primer, ukoliko je određeni položaj u svakom od dva DNK molekula zauzet od strane adenina ili ukoliko je neki položaj u svakom od dva polipeptida zauzet od strane lizina), tada su odgovarajući molekuli homologi na datom položaju. Pojam "procenat identičnosti" između dve sekvence je funkcija broja poklapajućih položaja koje dele dve sekvence podeljen brojem položaja koji se porede, x 100. Na primer, ukoliko 6 od 10 položaja u dve sekvence se poklapaju, tada dve sekvence poseduju identičnost od 60%. Primera radi, DNK sekvence CTGACT i CAGGTT imaju 50% homologije (3 od ukupno 6 položaja se poklapaju). Generalno, poređenje se pravi onda kada su dve sekvence poravnate tako da se postiže maksimalna homologija. Takvo poravnavanje može da se obezbedi upotrebom, na primer, postupka opisanog od Needleman et al., J. Mol Biol. 48: 443 - 453 (1970), koji je na odgovarajući način implementiran u kompjuterskom programu kao što je Align program (DNAstar, Inc.). "Slične" sekvence su one koje kada su poravnate dele identične i slične aminokiselinske ostatke, pri čemu su slični ostaci konzervativne supstitucije ili "dozvoljene tackaste mutacije" odgovarajućih aminokiselinskih ostataka u poravnatoj referentnoj sekvenci. U ovom slučaju, "konzervativnom supstitucijom" ostatka u referentnoj sekvenci se smatra supstitucija pomoću ostatka koji je fizički ili funkcionalno sličan odgovarajućem referentnom ostatku, npr., koji poseduje sličnu veličinu, oblik, naelektrisanje, hemijska svojstva, uključujući sposobnost formiranja kovalentnih ili vodoničnih veza, i slično. Stoga, "sekvenca mutirana konzervativnom supstitucijom" se smatra ona sekvenca koja se razlikuje od referentne sekvence ili od sekvence divljeg tipa u jednoj ili u više konzervativnih supstitucija ili dozvoljenih tačkastih mutacija. "Procenat pozitivne homologije" između dve sekvence jeste funkcija broja položaja koji sadrže poklapajuće ostatke ili konzervativne supstitucije koje dele dve sekvence podeljeno brojem položajakoji se porede x 100. Na primer, ukoliko 6 od10 položaja u dve sekvence se poklapa, a 2 od 10 položaja sadrži konzervativne supstitucuje, tada dve sekvence poseduju 80% pozitivne homologije.
Polipeptidi mutiranog neublastina
Polipeptidi mutiranog neublastina prema predmetnom pronalasku zadržavaju neurotrofnu aktivnost i poseduju poboljšanu biološku raspoloživost u poređenju sa polipeptidom neublastina divljeg tipa. Na primer, mutirani neublastini prema predmetnom pronalasku aktiviraju RET genski proizvog u testu u koje neublastin divljeg tipa aktivira RET. Generalno, polipeptid mutiranog neublastina zadržava barem jednu od sledećih karakteristika, pri čemu dodatno sadrži barem jednu modifikaciju, kao žto je kreiranje internog mesta za konjugaciju sa polimerom:
(i) sedam konzerviranih cisteinskih ostataka na položajima 16, 43, 47, 80, 81, 109, i 111 kada se broji prema sekvencama čiji su ID brojevi od 1 - 4;
(ii) kada sadrži sledeće aminokiselinske ostatke:
C na položaju 16, L na položaju 18, V na položaju 25, L na položaju 28, G na položaju 29, L na položaju 30, G na položaju 31, E na položaju 36, F na položaju 40, R na položaju 41, F na položaju 42, C na položaju 43, G na položaju 45, C na položaju 47, C na položaju 80, C na položaju 81, R na položaju 82, P na položaju 83, F na položaju 91, D na položaju 93, S na položaju 105, A na položaju 106, C na položaju 109 i C na položaju 111, pri čemu se koristi numeracija shodno sekvencama čiji su ID brojevi 1 - 4;
(iii) kada sadrži LGLG ponovnu sekvencu, FRFC motiv, QPCCRP motiv, i SATACGC motiv.
U nekim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje nepotpuni polipeptid mutiranog neublastina, pri čemu aminoterminal nepotpunog polipeptida neublastina ne sadrži jednu ili više amino - terminalnih aminokiselina zrelog polipeptida neublastina, a koji je mutiran tako da poseduje interno mesto za vezivanje polimera. Poželjno, nepotpuni polipeptid mutiranog neublastina kada je dimerizovan, aktivira RET polipeptid. U nekim rešenjima, polipeptid mutiranog neublastina indukuje dimerizaciju RET polipeptida. Takva indukcija može da zahteva dodatne polipeptide ili ko- faktore, što je jasno stručnjacima.
Aminokiselinske sekvence humanog i mišjeg polipeptida neublastina su opisane u PCT publikaciji WO00/01815. Primeri polipeptida neublastina divljeg tipa prema predmetnom pronalasku su predstavljeni u tabeli 1A. Konsenzus sekvenci neublastina (konsenzus u odnosu na humanu, mišju, pacovsku sekvencu) predstavljena je u tabeli 1B.
U nekim rešenjima, barem jedan argininski (Arg ili R) ili asparaginski (Asn ili N) ostatak koji je prikazan masnim slovima u tabeli 1A supstituisan je sa različitim aminokiselinskim ostatkom. U poželjnom rešenju, polipeptid mutiranog neublastina ima lizinski (Lys ili K) ostatak supstituisan sa asparaginom na aminokiselinskom položaju 95, što je označeno zvezdicom u tabeli 1A, i označen je kao NBN - N95K. Generalno, N95K supstitucija dovodi do poboljšane rastvorljivosti. Ovo olakšava formulaciju preparata u visokim koncentracijama.
Predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid mutiranog neublastina konjugovon sa polimerom koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je, na primer, barem 70% identična sa aminokiselinama 8 - 113 čiji je ID br. 1 (takođe prikazana u tabeli 1). Jednom rešenju, jedan ili više arginina na položaju 14, položaju 39, položaju 68 ili asparigina na položaju 95 zamenjen je aminokiselinom koja se razlikuje od arginina i asparigina. U jednom rešenju, aminokiselina divljeg tipa je supstituisana lizinom ili cisteinom.
Supstituisani ostaci u polipeptidu mutiranog neublastina mogu da budu izabrani tako da pospešuju povezivanje sa polimerom, npr., sa polialkilen glikolnim polimerom, na položaju supstituisane aminokiseline. Pooželjno, mesta za modifikaciju su ona u regionima koji su dostupni rastvaraču u sekvenci polipeptida neublastina. Takva mesta mogu da se izaberu na osnovu inspekcije kristalne strukture odgovarajućeg neurotrofnog faktora, kao što je GDNF, čija je kristalna struktura opisana u Eigenbrot et al., Nat. Struct. Biol. 4: 435 - 38, 1997. Ova mesta takođe mogu biti izabrana na osnovu kristalne strukture neublastina, čija je kristalizacija i određivanje strukture opisana ispod. Takođe, navedena mesta mogu biti izabrana na osnovu strukturalnih - funkcionalnih informacija koje su obezbeđene za persefin/neublastin himerične proteine. Navedene himere su opisane u Baloh et al., J. Biol. Chem. 275: 3412 - 20, 2000. U tabeli 2 su prikazani primeri aminokiselina neublastina koje su dostupne rastvaraču ili koje su izložene na površini, a koje su identifikovane pomoću navedene metodologije.
U tabeli 2 je prikazana lista ostataka i brojevi u humanom neublastinu za koje se očekuje da budu izložene na površini. Prva kolona se odnosi na ostatke koji su izloženi na površini što je određeno pomoću ispitivanja strukture pacovskog GDNF dimera koji se sastoji od lanca A i B (PDB kod 1AGQ), što određuje da li se ostatak nalazi na površini strukture. Ova struktura se zatim poredi sa poravnanjem sekvence GDNF i neublastina (Baloh et al., Neuron 21: 1291 - 1302, 1998) čime se određuju odgovarajući ostaci u neublastinu. Druga i treća kolona, respektivno, odnose se na ostatke koji su izloženi na površini što je određeno ispitivanjem strukture humanog neublastinskog dimera formiranog od lanca A i B. Numeracija u tabeli 2 je ista kao i u tabeli 1.
n označava da ostaci nisu prisutni u strukturama GDNF ili neublastina. Ovo je posledica dizajna konstrukta, fleksibilnih regiona ili insercija u neublastin u odnosu na GDNF (ostaci 68 - 71).
- označava ostatke koji su unutra, tj., nisu na površini ili su to cisteinski ostaci koji su uključeni u formiranje disulfidnih veza. S obzirom da je ovaj protein cisteinski čvor, velika većina ostataka se nalazi na površini.
+ označava da je određeni ostatak eksponiran na površini u strukturi GDNF ili u strukturi neublastina, mada je petlja koja sadrži ostatke 66 - 75 vidljiva samo u jednom od GDNF monomera (pod pretpostavkom da je fleksibilan). Ova petlja takođe sadrži 4 ostatka koji su insertni u neublastinu u odnosu na GDNF.
U nekim rešenjima, polipeptid neublastina zadržava sedam konzerviranih Cys ostataka koji su karakteristika GDNF podporodice i TGF - beta super porodice.
U tabeli 3 je prikazana sekvenca humanog prepro NBN polipeptida pune dužine (sekvenca čiji je ID br. 5). Identifikovana su tri zrela oblika polipeptida neublastina. Ovi oblici su:
(i) polipeptid sa 140 aminokiselina koji je ovde označen kao NBN140, poseduje aminokiselinsku sekvencu čiji je ID br. 6;
(ii) polipeptid sa 116 aminokiselina koji je ovde označen kao NBN116, koji poseduje aminokiselinsku sekvencu čiji je ID br. 7; i
(iii) polipeptid od 113 aminokiselina koji je ovde označen kao NBN113, koji poseduje aminokiselinsku sekvencu čiji je ID br. 2;.
Tabela 3 ilustruje odnos između opisanih prepro sekvenci polipeptida neublastina prema predmetnom pronalasku. U redu 1 se nalazi polipeptid čija sekvenca ima ID br. 5, u redu 2 je prikazan polipeptid čija je sekvenca ID br. 6, u redu 3 je prikazan polipeptid čija sekvenca ima ID br. 7, a u redu 4 je prikazan polipeptid čija sekvenca ima ID br. 2. Sedam konzerviranih cisteinskih ostataka su označeni simbolima ( "*","#", "+", "|") koji pokazuju da su u zrelom dimerizovanom neublastinskom ligandu formiraju disulfidni mostovi i to intramolekulski (* sa *, # sa #, i + sa +), kao i intermolekulski ("|"). Znak ("^") ukazuje da je asparaginski ostatak na aminokiselinskom položaju 95 supstituisan lizinom u NBN106 - N95K.
U alternativnim rešenjima, sekvenca gore identifikovanih polipeptida neublastina je nepotpuna na amino - terminalu aminokiselinske sekvence. Primeri ovoga obuhvataju:
(iv) polipeptidnu sekvencu od 112 aminokiselina ovde označenu kao NBN112, koja poseduje 112 karboksi - terminalnih aminokiselina polipeptida neublastina , npr., aminokiseline 29 - 140 sekvence čiji je ID br. 6 (sekvence čiji je ID br. 8) ili aminokiseline 2 - 113 sekvenci čiji su ID brojevi 1, 3 ili 4.
(v) polipeptidnu sekvencu od 111 aminokiselina ovde označenu kao NBN111, koja poseduje 111 karboksi - terminalnih aminokiselina polipeptida neublastina , npr., aminokiseline 30 - 140 sekvence čiji je ID br. 6 (sekvence čiji je ID br. 9) ili aminokiseline 3 - 113 sekvenci čiji su ID brojevi 1, 3 ili 4.
(vi) polipeptidnu sekvencu od 110 aminokiselina ovde označenu kao NBN110, koja poseduje 110 karboksi - terminalnih aminokiselina polipeptida neublastina , npr., aminokiseline 31 - 140 sekvence čiji je ID br. 6 (sekvence čiji je ID br. 10) ili aminokiseline 4 - 113 sekvenci čiji su ID brojevi 1, 3 ili 4.
(vii) polipeptidnu sekvencu od 109 aminokiselina ovde označenu kao NBN109, koja poseduje 109 karboksi - terminalnih aminokiselina polipeptida neublastina , npr., aminokiseline 32 - 140 sekvence čiji je ID br. 6 (sekvence čiji je ID br. 11) ili aminokiseline 5 - 113 sekvenci čiji su ID brojevi 1, 3 ili 4.
(viii) polipeptidnu sekvencu od 108 aminokiselina ovde označenu kao NBN108, koja poseduje 108 karboksi - terminalnih aminokiselina polipeptida neublastina , npr., aminokiseline 33 - 140 sekvence čiji je ID br. 6 (sekvence čiji je ID br. 12) ili aminokiseline 6 - 113 sekvenci čiji su ID brojevi 1, 3 ili 4.
(ix) polipeptidnu sekvencu od 107 aminokiselina ovde označenu kao NBN107, koja poseduje 107 karboksi - terminalnih aminokiselina polipeptida neublastina , npr., aminokiseline 34 - 140 sekvence čiji je ID br. 6 (sekvence čiji je ID br. 13) ili aminokiseline 7 - 113 sekvenci čiji su ID brojevi 1, 3 ili 4.
(x) polipeptidnu sekvencu od 106 aminokiselina ovde označenu kao NBN106, koja poseduje 106 karboksi - terminalnih aminokiselina polipeptida neublastina , npr., aminokiseline 35 - 140 sekvence čiji je ID br. 6 (sekvence čiji je ID br. 14) ili aminokiseline 8 - 113 sekvenci čiji su ID brojevi 1, 3 ili 4.
(xi) polipeptidnu sekvencu od 105 aminokiselina ovde označenu kao NBN105, koja poseduje 105 karboksi - terminalnih aminokiselina polipeptida neublastina , npr., aminokiseline 36 - 140 sekvence čiji je ID br. 6 (sekvence čiji je ID br. 15) ili aminokiseline 9 - 113 sekvenci čiji su ID brojevi 1, 3 ili 4.
(xii) polipeptidnu sekvencu od 104 aminokiselina ovde označenu kao NBN104, koja poseduje 104 karboksi - terminalnih aminokiselina polipeptida neublastina , npr., aminokiseline 37 - 140 sekvence čiji je ID br. 6 (sekvence čiji je ID br. 16) ili aminokiseline 10 - 113 sekvenci čiji su ID brojevi 1, 3 ili 4.
(xiii) polipeptidnu sekvencu od 103 aminokiselina ovde označenu kao NBN103, koja poseduje 103 karboksi - terminalnih aminokiselina polipeptida neublastina , npr., aminokiseline 38 - 140 sekvence čiji je ID br. 6 (sekvence čiji je ID br. 17) ili aminokiseline 11 - 113 sekvenci čiji su ID brojevi 1, 3 ili 4.
(xiv) polipeptidnu sekvencu od 102 aminokiselina ovde označenu kao NBN102, koja poseduje 102 karboksi - terminalnih aminokiselina polipeptida neublastina , npr., aminokiseline 39 - 140 sekvence čiji je ID br. 6 (sekvence čiji je ID br. 18) ili aminokiseline 12 - 113 sekvenci čiji su ID brojevi 1, 3 ili 4.
(xv) polipeptidnu sekvencu od 101 aminokiselina ovde označenu kao NBN101, koja poseduje 101 karboksi - terminalnih aminokiselina polipeptida neublastina , npr., aminokiseline 40 - 140 sekvence čiji je ID br. 6 (sekvence čiji je ID br. 19) ili aminokiseline 13 - 113 sekvenci čiji su ID brojevi 1, 3 ili 4.
(xvi) polipeptidnu sekvencu od 100 aminokiselina ovde označenu kao NBN100, koja poseduje 100 karboksi - terminalnih aminokiselina polipeptida neublastina , npr., aminokiseline 41 - 140 sekvence čiji je ID br. 6 (sekvence čiji je ID br. 20) ili aminokiseline 14 - 113 sekvenci čiji su ID brojevi 1, 3 ili 4.
(xvii) polipeptidnu sekvencu od 99 aminokiselina ovde označenu kao NBN99, koja poseduje 99 karboksi - terminalnih aminokiselina polipeptida neublastina , npr., aminokiseline 42 - 140 sekvence čiji je ID br. 6 (sekvence čiji je ID br. 21) ili aminokiseline 15 - 113 sekvenci čiji su ID brojevi 1, 3 ili 4.
Polipeptidne sekvence ovih nepotpunih polipeptida neublastina su prikazane u tabeli 4 počevši od NBN113 do NBN99. Stvaranje disulfidnih mostova je onakvo kao što je opisano u tabeli 3.
Polipeptid mutiranog neublastina prema predmetnom pronalasku može biti, npr., najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ili 99% identičan sa aminokiselinama 8 - 113 sekvence čiji je ID br. 1. U nekim rešenjima, aminokiselinska sekvenca polipeptida mutiranog neublastina obuhvata aminokiselinsku sekvencu prirodnog polipeptida neublastina pacova, čoveka ili miša na položaj aminokiselina 1 -94 i 96 - 113 polipeptida mutiranog neublastina, npr., polipeptid poseduje aminokiselinske sekvence čiji su ID brojevi 2, 3 ili 4 na navedenim položajima.
Polipeptid mutiranog neublastina koji se razlikuje u sekvenci od onog koji je opisan kao sekvenca čiji je ID br. 1 - 4 može da obuhvati jednu ili više konzervativnih aminokiselinskih supstitucija. Alternativno, ili kao dodatak, polipeptid mutiranog neublastina može da se razlikuje po jednoj ili po više konzervativnih aminokiselinskih supstitucija ili po delecijama ili insercijama. Poželjno, supstitucije, insercije ili delecije ne narušavaju biološku aktivnost izolovanog proteina.
Konzervativna supstitucija je supstitucija jedne aminokiseline drugom koja poseduje slične karakteristike. Konzervativne supstitucije obuhvataju supstitucije unutar sledećih grupa: valin, alanin, i glicin; leucin, valin i izoleucin; asparaginska kiselina i glutaminska kiselina; asparagin i glutamin; serin, cistein i treonin; lizin i arginin; kao i fenilalanin i tirozin. Nepolarne hidrofobne aminokiseline obuhvataju alanin, leucin, izoleucin, valin, prolin, fenilalanin, triptofan i metionin. Polarne neutralne aminokiseline obuhvataju glicin, serin, treonin, cistein, tirozin i glutamin. Pozitivno naelektrisane (bazne) aminokiseline obuhvataju arginin, lizin i histidin. Negativno naelektrisane (kisele) aminokiseline obuhvataju asparaginsku kiselinu i glutaminsku kiselinu Bilo koja supstitucija jednog člana gore navedene polarne, bazne ili kisele grupe drugim članom iste grupe može da se smatra konzervativnom supstitucijom.
Druge supstitucije mogu lako da se identifikuju od strane stručnjaka. Na primer, kada je u pitanju aminokiselina alanin, ona može da se supstituiše nekom od sledećih aminokiselina: D - alanin, glicin, beta - alanin, i D - cistein. Za lizin, zamena može da bude D - lizin, arginin, D - arginin, homo - arginin, metionin, D - metionin, ornitin, ili D - ornitin. Generalno, supstitucija je funkcionalno važnim regionima za koje može da se očekuje da će indukovati promene u svojstvima indukovanih polipeptida su one u kojima: (i) polarni ostatak, npr., serin ili treonin se supstituiše hidrofobnim ostatkom, npr., leucinom, izoleucinom, fenilanalinom ili analinom; (ii) cisteinski ostatak se supstituiše bilo kojim drugim ostatkom; (iii) ostatak koji poseduje elektropozitivni bočni lanac, npr., lizin, arginin ili histidin, supstituiše se ostatkom koji poseduje elektronegativni bočni lanac, npr., glutaminskom kiselinom ili asparaginskom kiselinom; ili (iv) ostatak koji poseduje krupan bočni lanac, npr., fenilalanin, supstituiše se ostatkom koji ne poseduje takav bočni lanac, npr., glicinom. Verovatnoća da jedna gore pomenuta nekonzervativna supstitucija može da izmeni funkcionalna svojstva proteina takođe korelira sa položajem supstitucije u odnosu na funkionalno važne regione proteina. Neke nekonzervativne supstitucije mogu shodno tome da ispolje malo ili nimalo bioloških svojstava.
U mnogim slučajevima, polipeptid mutiranog neublastina koji je konjugovan sa polimerom poseduje duži polu - život u serumu u odnosu na polu - život polipeptida divljeg tipa ili mutiranog polipeptida koji ne sadrži polimer. U nekim rešenjima, polipeptid mutiranog neublastina koji je konjugovan sa polimerom poseduje značajno povećanu potenciju in vivo u odnosu na potenciju polipeptida ili glikoziranog polipeptida u odsustvu polimera.
Polipeptid neublastina koji je konjugovan sa polimerom može da se obezbedi u vezi dimera koji sadrži barem jedan polipeptid neublastina koji je konjugovan sa polimerom. U nekim rešenjima, dimer je homodimer polipeptida mutiranog neublastina koji su konjugovani sa polimerom. U drugim rešenjima, dimer je homodimer nepotpunih polipeptida mutiranog neublastina koji su konjugovani sa polimerom. U drugim rešenjima, dimer je heterodimer koji sadrži jedan polipeptid mutiranog neublastina koji je konjugovan sa polimerom i jedan polipeptid neublastina divljeg tipa. U drugim rešenjima, dimer je heterodimer koji sadrži jedan polipeptid mutiranog neublastina koji je konjugovan sa polimerom, pri čemu je konjugacija sa polimerom izvedena na amino - terminalu, i pri čemu polipeptidi mogu , ali ne moraju biti nepotpuni. Drugi dimeri obuhvataju heterodimere ili homodimere polipeptida mutiranog neublastina konjugovanih sa polimerom koji mogu, ali ne moraju biti nepotpuni.
Predmetni pronalazak obezbeđuje zrele i nepotpune sekvence mutiranog polipeptida koje sadrže većinu aminokiselinskih ostataka sa karboksi - terminala prepro NBN polipeptida, kao što je to slučaj sa sekvencom čiji je ID br. 5 a koje su ovde označene kao NBN#, pri čemu znak "#" predstavlja broj karboksi - terminalnih ostataka koji su zadržani u odnosu na referentni polipeptid neublastina. Polipeptidi neublastina koji su konjugovani sa polimerom predstavljaju a koji su prisutni u biološki aktivnim neublastinskim dimerima mogu biti proizvodi dejstva proteaza ili dejstva hemijskog cepanja ili mogu biti eksprimirani iz rekombinantnog DNK konstrukta ili mogu biti sintetisani. Primeri polipeptida neublastina obuhvataju, npr., NBN140, NBN116 i NBN113. Dodatni polipeptidi neublastina prema predmetnom pronalasku obuhvataju NBN112, NBN111, NBN110, NBN109, NBN108, NBN107, NBN106, NBN105, NBN104, NBN103, NBN102, NBN101, NBN100 i NBN99 (sekvence čiji su ID brojevi 8 - 21).
Poželjni polipeptid neublastina koji je konjugovan sa polimerom jeste homodimer NBN106 - N95K koji je konjugovan ili sa tri PEG molekula od 10 kDa ("3x10 kDa PEG NBN106 - N95K"), ili sa četiri molekula PEG od 10 kDa ("4x10 kDa PEG NBN106 - N95K"). Takođe, poželjna je i smeša, mešana populacija NBN106 - N95K homodimera koji su konjugovani ili sa tri PEG molekula od 10 kDa ili sa četiri PEG molekula od 10 kDa, koja se ovde označava kao "3(,4)x10 kDa PEG NBN106 - N95K". Takođe poželjan je 3(,4)x10 kDa PEG NBN106 - N95K homodimer, pri čemu su dve amino - terminalne aminokiseline kovalentno povezane sa PEG molekulima, a treći i/ili četvrti PEG molekul je kovalentno povezan sa jednim ili sa oba supstituisana N95K ostatka.
U nekim rešenjima, polipeptidi neublastina koji su konjugovani sa polimerom se zasnivaju na konsenzus sekvenci sekvence čiji je ID br. 1. U određenim rešenjima, polipeptidi neublastina koji su konjugovani sa polimerom sadrže aminokiseline 1 - 7 sekvence čiji je ID br. 1, kao dodatak aminokiselinama 8 - 113.
U nekim rešenjima, polipeptid neublastina koji je konjugovan sa polimerom, kada je dimerizovan, vezuje sa GFRα3. U nekim rešenjima, polipeptid neublastina koji je konjugovan sa polimerom, kada je dimerizovan, stimuliše tirozin fosforilaciju RET polipeptida, bilo sam po sebi ili nakon vezivanja za GFRα3.
U nekim rešenjima, polipeptid neublastina koji je konjugovan sa polimerom, kada je dimerizovan, pospešuje preživljavanje neurona, npr., pospešuje preživljavanje senzornog neurona.
U nekim rešenjima, polipeptid neublastina koji je konjugovan sa polimerom, kada je dimerizovan, smanjuje ili otklanja patološke promene na neuronu, kao što je senzorni neuron.
U nekim rešenjima, polipeptid neublastina koji je konjugovan sa polimerom, kada je dimerizovan, pospešuje preživljavanje neurona, npr., autonomnog neurona ili dopaminergičkog neurona.
U nekim rešenjima, polipeptid neublastina koji je konjugovan sa polimerom, sadrži jednu, dve, tri, četri ili više aminokiselinskih supstitucija koje su izabrane iz grupe koju čine aminokiseline koje se razlikuje od arginina na položaju 14 u aminokiselinskoj sekvenci polipeptida koji je konjugovan sa polimerom, supstituciju sa aminokiselinom koja se razlikuje od arginina na položaju 39 u aminokiselinskoj sekvenci polipeptida konjugovanog sa polimerom, supstituciju sa aminokiselinom koja se razlikuje od arginina na položaju 68 polipeptida koji je konjugovan sa polimerom, i supstituciju sa aminokiselinom koja se razlikuje od asparagina na položaju 95 polipeptida koji je konjugovan sa polimerom. U nekim rešenjima, aminokiselina na jednom ili na više aminokiselinskih položaja 14, 39, 68 i 95 jeste lizin. Poželjno, aminokiseline 8 - 94 i 96 - 113 polipeptida neublastina koji je konjugovan sa polimerom su najmanje 90% identične sa aminokiselinama 8 - 94 i 96 - 113 sekvence čiji je ID br. 1. Poželjnije, aminokiselinske sekvence su najmanje 95% identične sa navedenom sekvencom. Najpoželjnije, aminokiselinska sekvenca polipeptida neublastina koji je konjugovan sa polimerom sadrži aminokiselinsku sekvencu koja se koja se prirodno javlja kod humanog, mišjeg ili pacovskog polipeptida neublastina na aminokiselinskim položajima 8 - 94 i 96 - 113 polipeptida neublastina koji je konjugovan sa polimerom. Na primer, aminokiseline 8 - 94 i 96 - 113 polipeptida neublastina koji je konjugovan sa polimerom može da sadrži aminokiselinsku sekvencu 8 - 94 i 96 - 113 sekvence čiji je ID br. 1, sekvence čiji je ID br. 2, sekvence čiji je ID br. 3 ili sekvence čiji je ID br. 4. U gore navedenim rešenjima, poželjni ostatak na aminokiselinskom položaju 95 jeste lizin ili cistein.
Predmetni pronalazak obuhvata konstrukt koji je heterodimer ili homodimer koji sadrži fuzione proteine neublastina konjugovanog sa polimerom, npr., polihistidin (His) - obeleženi neublastin čoja sekvenca ima ID br. 36 ili fuzioni protein neublastina u kome je fuziona podjedinica imunoglobulinski (Ig) polipeptid, polipeptid serumskog albumima ili polipeptid izveden iz replikaze. Fuzioni proteini neublastina mogu da poseduju pospešena farmakokinetska svojstva i biološku raspoloživost in vivo.
Predmetni pronalazak obezbeđuje molekul nukleinske kiseline koji kodira zreli ili nepotpuni polipeptid neublastina sa mutiranom polipeptidnom sekvencom. Molekul nukleinske kiseline koji kodira željeni polipeptid neublastina poželjno je obezbeđen u vektoru, npr, u ekspresionom vektoru. Molekul nukleinske kiseline mutiranog neublastina ili vektor koji sadrži isti, može biti obezbeđen u ćeliji. Ćelija može biti, npr., sisarska ćelija, ćelija gljive, ćelija gljivice, ćelija insekta ili bakterijska ćelija. Poželjna ćelija sisara jeste ćelija jajnika Kineskog hrčka ("CHO ćelija").
Takođe, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak dobijanja polipeptida neublastina koji je konjugovan sa polimerom putem kultivacije ćelije koja sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira polipeptid neublastina u uslovima koji omogućavaju ekspresiju polipeptida neublastina. U nekim rešenjima neublastin je konjugovan sa prirodnim molekulima. U specifičnim rešenjima, prirodni molekul jeste glikozil grupa. U određenim rešenjima, glikozilirani neublastin je eksprimiran, npr., u CHO ćeliji. Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje polipeptid neublastina koji eksprimiran u ćeliji. Slične nukleinske kiseline, vektori, ćelije domaćini i postupci za proizvodnju polipeptida su ovde opisani za fuzione proteine (kao što su fuzioni proteini neublastina i serumskog albumina) prema predmetnom pronalasku.
U nekim rešenjima, polipeptid neublastina koji je eksprimiran u ćeliji se prikuplja i konjuguje sa polimerom. U nekim rešenjima, polimer je polialkilen glikolni molekul. U određenim rešenjima, polimer je PEG molekul.
Predmetni pronalazak specifično obezbeđuje preparat koji sadrži polipeptid mutiranog neublastina koji je povezan sa polimerom koji se ne javlja u prirodi. Polipeptid mutiranog neublastina u preparatu poželjno sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70% identična sa aminokiselinama 8 - 113 sekvence čiji je ID br. 1, uz uslov da polipeptid neublastina koji je konjugovan sa polimerom obuhvata jednu ili više aminokiselinskih supstitucija koje su izabrane iz grupe koju čine aminokiselina koja se razlikuje od arginina na položaju 14 u aminokiselinskoj sekvenci polipeptida konjugovanog sa polimerom, aminokiselina koja se razlikuje od arginina na položaju 39 u aminokiselinskoj sekvenci polipeptida koji je konjugovan sa polimerom, aminokiselina koja se razlikuje od arginina na položaju 68 polipeptida koji je konjugovan sa polimerom, kao i aminokiselina koja se razlikuje od asparagina na položaju 95 polipeptida koji je konjugovan sa polimerom, pri čemu su položaji aminokiselina brojani prema polipeptidnoj sekvenci čija sekvenca ima ID br. 1.
Predmetni pronalazak obezbeđuje stabilan u vodi rastvorljiv polipeptid konjugovanog neublastina ili polipeptidni kompleks mutiranog neublastina koji sadrži polipeptid neublastina ili polipeptid mutiranog neublastina koji je povezan sa PEG molekulom, pri čemu je polipeptid neublastina ili polipeptid mutiranog neublastina povezan sa PEG molekulom pomoću labilne veze. U nekim rešenjima, labilna veza se može cepati pomoću biohemijske hidrolize, proteolize ili raskidanja sulfhidrilne veze. U nekim rešenjima, labilna veza se može cepati u in vivo uslovima.
Takođe, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za dobijanje polipeptida modifikovanog neublastina koji poseduje produženi polu - život u serumu u odnosu na neublastin divljeg tipa. Ovaj postupak obezbeđuje polipeptid neublastina ili polipeptid mutiranog neublastina, kao i povezivanje tog polipeptida ili mutiranog neublastina sa molekulom polimera koji se ne javlja u prirodi, čime se dobija preparat polipeptida neublastina povezan sa polimerom.
Polipeptidi mutiranog neublastina koji su povezani sa polimerom prema predmetnom pronalasku obuhvataju jednu ili više aminokiselinskih supstitucija u kojima, na primer, aminokiselina koja se razlikuje od arginina postoji na položaju 14 u aminokiselinskoj sekvenci polipeptida koji je konjugovan sa polimerom, aminokiselina koja se razlikuje od arginina na položaju 39 se javlja u aminokiselinskoj sekvenci polipeptida koji je konjugovan sa polimerom, aminokiselina koja se razlikuje od arginina na položaju 68 se javlja u polipeptidu koji je konjugovan sa polimerom ili aminokiselina koja se razlikuje od asparagina na položaju 95 se javlja u polipeptidu koji je konjugovan sa polimerom, pri čemu se položaji aminokiselina broje prema polipeptidnoj sekvenci čiji je ID br. 1.
Sinteza i izolacija polipeptida neublastina divljeg tipa i mutiranih
Polipeptidi neublastina mogu da se izoluju upotrbom postupaka koji su poznati u struci. Polipeptidi neublastina koji se javljaju u prirodi mogu biti izolovani iz ćelija ili tkiva pomoću odgovarajuće šeme prečišćavanja korišćenjem standardnih tehnika za prečišćavanje proteina. Alternativno, polipeptidi mutiranog neublastina mogu da se sintetišu hemijski upotrebom standardnih tehnika za sintezu peptida. Sinteza kratkih aminokiselinskih sekvenci je postupak koji je dobro ustanovljen u struci. Videti, npr., Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis (2. izdanje, 1984).
U nekim rešenjima, polipeptidi mutiranog neublastina se dobijaju upotrebom tehnika rekombinantne DNK. Na primer, molekul nukleinske kiseline koji kodira polipeptid mutiranog neublastina može da se insertuje u vektor, npr., u ekspresioni vektor, a nukleinska kiselina može tako da se uvede u ćeliju. Odgovarajuće ćelije obuhvataju, npr., ćelije sisara (kao što su humane ćelije ili CHO ćelije), ćelije gljiva, ćelije gljivica, ćelije insekata i bakterijske ćelije. Kada se ekspresija odvija u rekombinantnoj ćeliji, ćelija se poželjno kultiviše u uslovima koji dozvoljavaju ekspresiju polipeptida mutiranog neublastina. Polipeptid mutiranog neublastina može da se prikupi po želji iz suspenzije ćelije. Kao što se ovde koristi, pojam "prikupiti" označava da se mutirani polipeptid uklanja iz onih komponenti ćelije ili podloge kulture u kojima je prisutan pre procesa prikupljanja. Proces prikupljanja može da obuhvata jedan ili više koraka ponovnog sklapanja ili prečišćavanja.
Polipeptidi mutiranog neublastina mogu da se konstruišu upotrebom bilo kog od brojnih postupaka poznatih u struci. Jedan takav postupak jeste mutageneza usmerena na određeno mesto, tokom koga se specifični nukleotid (ili, ukoliko je to poželjno, mali broj specifičnih nukleotida) menja kako bi se izmenila jedna jedina aminokiselina ( ili, ukoliko je to poželjno, mali broj prethodno određenih amino ostataka) u kodu za polipeptid neublastina. Stručnjaci shvataju da mutageneza usmerena na određeno mesto jeste rutinski i široko upotrebljivana tehnika. Ustvari komercijalno su dostupni brojni kompleti za mutagenezu usmerenu na određeno mesto. Jedan takav komplet jeste "Transformer Site Directed Mutagenesis Kit" koji prodaje Clontech Laboratories (Palo Alto, CA).
Praksa prema predmetnom pronalasku koristi, osim ako drugačije nije naznačeno, konvencionalne tehnike ćelijske biologije, kultivacije ćelija, molekularne biologije, mikrobiologije, rekombinantne DNK, proteinske hemije i imunologije, koje su poznate u struci. Takve tehnike su opisane u literaturi. Videti, npr., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. izdanje. (Sambrook, Fritsch and Maniatis, urednici), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; DNA Cloning, Vol. I & II (D. N. Glover, urednik), 1985; Oligonucleotide Synthesis, (M. J. Gait, ed.) 1984; U. S. Patent br. 4, 683, 195 (Mullis et al.); Nucleic Acid Hybridization (B. D. Haines & S. J. Higgins, eds.), 1984; Transcription and Translation (B. D Hames & S. J. Higgins, urednici), 1984; Culture of Animal Cell (R. I. Freshney, urednik). Alan R. Liss, Inc., 1987; Immobilized Cell and Enzymes, IRL Press, 1986; A Practical Guide to Molecular Cloning (13. Perbal), 1984; Methods in Enzymology, Vol. 154 & 155 (Wu et al., urednici), Academic Press, New York; Gene Transfer Vectors for Mammmalian Cell (J. H. Miller & M. P. Calos, urednici), 1987, Cold Spring Harbor Laboratory; Immunochernical Methods in Cell and Molecular Biology (Mayer & Walker, urednici), Academic Press, London, 1987; Handbook of Experiment Immunology, Vol. I - IV (D. M. Weir & C. C. Blackwell, urednici), 1986; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1986.
Konjugacija polimerom
Hemijski modifikovani polipeptidi neublastina stučnjaci mogu da dobiju na osnovu opisa predmetnog pronalaska. Hemijske pod jedinice koje su poželjne za konjugaciju sa polipeptidom neublastina jesu u vodi rastvorljivi polimeri. Polimeri koji su rastvorljivi u vodi imaju tu prednost da protein sa kojim se vezuju ne precipitiraju u vodenom okruženju, kao što je fiziološko okruženje. Poželjno, polimer je farmaceutski prihvatljiv za dobijanje terapeutskog proizvoda ili preparata.
Ukoliko je to poželjno, za konjugaciju polipeptida neublastina može da se koristi jedan jedini molekul polimera, iako je moguće da se prikači i više od jednog molekula polimera. Preparati konjugovanog neublastina prema predmetnom pronalasku mogu da se upotrebe kako in vivo tako i u non - in vivo primenama. Dodatno, treba napomenuti da polimer koji se koristi za konjugaciju može da koristi bilo koju drugu grupu, pod jedinicu ili drugu vrstu za konjugovanje koja je poželjna za krajnju primenu. Primera radi, može biti od koristi u nekim rešenjima da se za polimer kovalentno veže funkcionalna pod jedinica koja narušava rezistenciju prema UV degradaciji ili antioksidaciji, ili koja narušava neko drugo svojstvo ili karakteristiku polimera. Kao dalji primer, može biti poželjno u nekim rešenjima da se polimer funkcionalizuje kako bi zadržao reaktivnost ili sposobnost ukrštenog vezivanja, čime se pospešuju različita svojstva ili karakteristike ukupnog konjugovanog materijala. Shodno tome, polimer može da sadrži bilo koju funkcionalnu grupu, ponavljajuće grupe, veze ili druge konstituentne strukture koje ne ograničavaju efikasnost preparata konjugovanog neublastina pri njegovim željenim upotrebama.
Stručnjak može da izabere željeni polimer na osnovu takvih razmatranja kao što su želja da polimer / proteinski konjugat bude upotrebljen terapijski, a ako je to slučaj, može uzeti u razmatranje željenu dozu, vreme cirkulacije, rezistenciju na proteolizu i druga razmatranja. Efikasnost derivatizacije može da se proceni primenom derivata u željenom obliku (npr., osmotskom pumpom ili poželjnije injekcijom ili infuzijom ili u obliku dalje formulacije za oralnu, plućnu ili drugu vrstu primene), nakon čega se određuje njegova efikasnost.
Odgovarajući u vodi rastvorljivi polimeri obuhvataju, bez ograničenja, PEG, kopolimere etilen glikola / propilen glikola, karboksimetilcelulozu, dekstran, polivinil alkohol, polivinil pirolidon, poli - 1, 3 - dioksolan, poli - 1, 3, 6 - trioksan, ko-polimer etilena / anhidrida maleinske kiseline, poliaminokiseline (bilo kao homopolimere ili slučajne ko - polimere), kao i dekstran ili poli (n - vinil pirolidon) PEG, propropilen glikol homopolimere, polipropilen oksid / etilen oksid ko-polimere, polioksietilirane poliole (npr., glicelor), polivinil alkohol, kao i njihove smeše.
Polimeri mogu imati bilo koju poželjnu molekulsku masu i mogu biti razgranati ili nerazgranati.
Kada je u pitanju PEG, odgovarajuća prosečna molekulska masa se kreće između 2 kDa i oko 100 kDa. Ovo omogućava lakoću u rukovanju i proizvodnji. Sručnjaci shvataju da prilikom pripremanja PEG, neki molekuli će težiti više, neki manje, u odnosu na željenu molekulsku masu. Stoga, molekulska masa se tipično specifikuje kao "prosečna molekulska masa". Mogu da se koriste i druge molekulske mase (veličine), što zavisi od željenog terapeutskog profila (npr., od trajanja željenog postepenog otpuštanja; od efekata, ukoliko postoje, na biološku aktivnost; od jednostavnosti pri rukovanju; od stepena ili nedostatka antigenosti i drugih poznatih efekata PEG na terapeutsi protein). U različitim rešenjima, molekulska masa je oko 2 kDa, oko 5 kDa, oko 10 kDa, oko 15 kDa, oko 20 kDa, oko 25 kDa, oko 30 kDa, oko 40 kDa ili oko 100 kDa. U određenim poželjnim rešenjima, prosečna molekulska masa svakog PEG lanca je oko 20 kDa. U određenim poželjnim rešenjima, prosečna molekulska masa je oko 10 kDa.
Broj molekula polimera koji su tako prikačeni može da varira, a stručnjak može da proceni efekat ovoga na funkciju. Stručnjak može da proizvodi mono - derivate ili može da obezbedi di -, tri -, tetra - ili neku kombinaciju derivatizacije, sa istim ili različitim hemijskim pod jedinicama (npr., sa polimerima, kao što su različite molekulske mase PEG - ova). Udeo polimernih molekula prema proteinskim (polipeptidnim) molekulima varira, kao i njihove koncentracije u reakcionoj smeši. Generalno, optimalni odnos (u terminima efikasnosti reakcije tako da nema viška neizreagovanog proteina ili polimera) biva određen od strane faktora kao što su željeni stepen derivatizacije (npr., mono, di -, tri -, itd.), od molekulske mase izabranog polimera, od toga da li je polimer razgranat ili nerazgranat i od uslova reakcije.
PEG molekuli (ili druge hemijske podjedinice) treba da se prikače za molekul proteina uz uzimanje u obzir efekata na funkcionalne i antigene proteina. Postoje brojni postupci povezivanja koji su dostupni stručnjacima. Videti, npr., EP 0 401384 (vezivanje za PEG za GM - CSF); Malik et al., Exp. Hematol. 20: 1028-1035, 1992 (PEGilacija GM - CSF upotrebom trezilhlorida).
Na primer, PEG može biti kovalentno povezan (pegilacija) putem aminokiselinskih ostataka preko reaktivne grupe, kao što je slobodna amino ili karboksilna grupa. Aminokiselinski ostaci koji poseduju slobodnu amino grupu obuhvataju lizinske ostatke i amino-terminalni aminokiselinski ostatak. Ostaci koji poseduju slobodnu karboksilnu grupu obuhvataju ostatke asparaginske kiseline, ostatke glutaminske kiseline i C - terminalni aminokiselinski ostatak. Za povezivanje PEG molekula kao reaktivna grupa takođe mogu da se upotrebe sulfhidrilne grupe. Kod terapeutskih upotreba, povezivanje može da se ostvari na amino grupi, npr., na N - terminalu ili na lizinskoj grupi. Moguće je da neko specifično želi amino - terminalni hemijski modifikovani protein.
Upotrebljavajući PEG kao ilustraciju za predmetne preparate stručnjak može da izabere neki od mnoštva PEG molekula (po molekulskoj masi, razgranatosti itd), moguće je podesiti udeo PEG molekula prema proteinu (ili peptidu) u reakcionoj smeši, moguće je izabrati tip pegilacione reakcije koja treba da se izvede, kao i postupak za dobijanje izabranog amino - terminalno pegiliranog proteina. Postupak za dobijanje amino-terminalno pegiliranog preparata (tj., postupak razdvajanja ove podjedinice od drugih monopegiliranih podjedinica, ukoliko je to potrebno) obuhvata prečišćavanje amino -terminalno pegiliranog materijala iz populacije pegiliranih proteinskih molekula. Selektivna amino - terminalna hemijska modifikacija može da se postigne putem reduktivne alkilacije koja koristi različitu reaktivnost različitih tipova primarnih amino grupa (lizin nasuprot amino - terminalu) koje su dostupne za derivatizaciju u određenom proteinu. Pod određenim uslovima reakcije, značajno selektivna derivatizacija proteina se postiže na amino- terminalu sa karbonilnom grupom koja sadrži polimer. Na primer, moguće je selektivno pegilirati amino - terminal proteina izvođenjem reakcije na pH vrednosti koja dozvoljava da se iskoristi prednost u pKa razlikama između epsilon-amino grupe lizinskog ostatka i alfa - amino grupe amino - terminalnom ostatku na proteinu. Takvom selektivnom derivatizacijom, kontroliše se povezivanje polimera rastvorljivog u vodi za protein: konjugacija sa polimerom se odvija dominantno na amino - terminalu proteina, pri čemu se ne javlja značajna modifikacija drugih reaktivnih grupa kao što je amino grupa lizinskog bočnog lanca.
Pri korišćenju reduktivne alkilacije, u vodi rastvorljivi polimer može biti onog tipa koji je opisan ranije, koji treba da poseduje jednu reaktivnu aldehidnu grupu za povezivanje sa proteinom. Može da se koristi PEG propionaldehid, koji poseduje jednu reaktivnu aldehidnu grupu.
Predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptide mutiranog neublastina koji su eksprimirani u prokariotima ili eukariotima ili koji se dobijaju sintetski. U nekim rešenjima neublastin je glikoziliran. U nekim specifičnim rešenjima, neublastinski dimer je konjugovan sa polimerom na svakom od amino- terminala i glikoziliran je na svakom od amino - terminala i glikoziliran je na svakom internom Asn95 ostatku. U drugim rešenjima, dimer mutiranog neublastina je konjugovan sa polimerom na svakom amino-terminalu i konjugovan je sa polimerom na jednom ili na oba interna Lys95 ostatka.
Pegilacija može da se izvede upotrebom bilo koje pogodne reakcije pegilacije. U struci su poznate različite reakcije pegilacije. Videti npr., Focus on Growth Factors, 3 (2): 4-10, 1992; EP 0 154 316; EP 0 401 384; kao i druge publikacije koje su ovde citirane a koje se odnose na pegilaciju. Pegilacija može da se izvede putem reakcije acilacije ili reakcije alkilacije sa reaktivnim PEG molekulom (ili sa analognim reaktivnim polimerom rastvorljivim u vodi).
Pegilacija pomoću acilacije generalno obuhvata reakciju derivata aktivnog esrta PEG. Za izvođenje pegilacije može da se upotrebi bilo koji poznati ili tek otkriveni reaktivni PEG molekul. Poželjni aktivirani PEG estar je PEG koji je esterifikovan sa N-hidroksisukcinimidom (NHS). Kao što se ovde koristi pojam "acilacija" obuhvata, bez ograničenja, sledeće tipove veza između terapijskog proteina i polimera rastvorljivog u vodi, kao što je PEG: amidna, karbamatna, uretanska i slične. Videti, Bioconjugate Chem. 5: 133 - 140, 1994. Reakcioni uslovi mogu biti izabrani između onih koji su poznati u struci za pegilaciju ili između onih koji su tek otkriveni, ali treba izbegavati uslove, kao što su temperatura, upotreba određenog rastvarača i pH vrednost koji inaktiviraju protein ili polipeptid neublastina koji treba da bude modifikovan.
Pegilacija pomoću acilacije generalno dovodi do poli - pegiliranog neublastina. Poželjno, veza kojom se ovo ostvaruje je amidna. Takođe, poželjno dobijeni proizvod je u značajnoj meri samo (npr., više od 95%) mono, di- ili tri-PEGiliran. Međutim, neke vreste sa većim stepenom pegilacije mogu da se formiraju u određenim količinama koje zavise od specifičnih uslova reakcije koje se koriste. Ukoliko je poželjno, više prečišćenih pegiliranih vrsta može biti izdvojeno iz reakcione smeše, to se posebno odnosi na neizreagovane vrste, primenom standardnih tehnika prečišćavanja u koje spadaju, između ostalog, dijaliza, isoljavanje, ultrafiltracija, jonoizmenjivačka hromatografija, hromatografija sa gel filtracijom i elektroforeza.
Pegilacija pomoću alkilacije generalno podrazumeva reakciju terminalnog aldehidnog derivata PEG sa neublastinom u prisustvu redukcionog sredstva. Pegilacija pomoću alkilacije takođe može da rezultuje dobijanjem poli - pegiliranog neublastinskog proteinskog proizvoda. Dodatno, moguće je manipulisati reakcionim uslovima kako bi se pospešila pegilacija u značajnoj meri samo na α-amino grupi amino-terminala neublastina (tj., kako bi se dobio mono - pegilirani protein). Bilo u slučaju mono-pegilacije ili poli - pegilacije, PEG grupe se poželjno vezuju za protein preko -CH2-NH- grupe. Sa posebnom referencom na -CH2- grupu ovaj tip veze se ovde označava kao "alkilna" veza.
Derivatizacija putem reduktivne alkilacije čime se dobija mono - pegilirani proizvod koristi diferencijalnu reaktivnost različitih tipova primarnih amino grupa (lizina u odnosu na amino - terminalnu grupu) koje su dostupne za derivatizaciju. Reakcija se izvodi pri pH vrednosti koja omogućava iskorišćavanje prednosti pKa razlika između epsilon-amino grupa lizinskih ostataka i α-amino grupe amino-terminalnog ostatka na proteinu. Takvom selektivnom derivatizacijom, kontroliše se povezivanje polimera rastvorljivog u vodi koji sadrži reaktivnu grupu kao što je aldehidna grupa: konjugacija sa polimerom se dominantno odvija na amino - terminalu proteina, bez značajne modifikacije drugih reaktivnih grupa, kao što su amino grupe bočnog lanca lizina.
Molekuli polimera koji se koriste i u acilaciji i u alkilaciju pa može da se izabere iz grupe koju čine polimeri rastvorljivi u vodi opisani ranije. Izabrani polimer treba da bude modifikovan tako poseduje jednu reaktivnu grupu, kao što je to slučaj sa aktivnim estrom za acilaciju ili aldehidom za alkelaciju, poželjno tako da stepen polimerizacije bude kontrolisan na način koji je obezbeđen u postupcima prema predmetnom pronalasku. Primer reaktivnog PEG aldehida jeste PEG propionaldehid, koji je rastvorljiv u vodi ili mono C1 - C10 alkoksi ili ariloksi derivati (videti U. S. Patent 5,252,714). Polimer može biti razgranat ili nerazgranat. U reakcijama acilacije, polimer (polimeri) koji je izabran treba da poseduje jednu jednu reaktivnu estarsku grupu. U slučaju reduktivne alkilacije po predmetnom pronalasku, polimer (polimeri) koji je izabran treba da poseduje jednu reaktivnu aldehidnu grupu. Generalno, polimer koji rastvorljiv u vodi nece biti izabran iz grupe koju čine prirodni glikozil ostaci jer takav pristup obično olakšava proizvodnju od strane sisarskih rekombinantnih ekspresionih sistema. Polimer može imati bilo koju molekulsku masu, a može biti razgranat ili nereazgranat.
Primer polimera koji je rastvorljiv u vodi a koji se ovde koristi jeste PEG. Kao što se ovde koristi, polietilen glikol obuhvata sve oblike PEG koji se koriste za derivatizaciju drugih proteina, uključujući, bez ograničenja, npr., mono-(C1 - C10) alkoksi- ili ariloksi-PEG.
Generalno, hemijska derivatizacija može da se izvede u bilo kojim uslovima koji su pogodni za reakciju biološki aktivne supstance sa aktiviranim molekulom polimera. Postupci za dobijanje pegiliranog neublastina generalno obuhvataju korake: (a) reakcije proteina ili polipeptida neublastina sa PEG (kao što je PEG derivat sa reaktivnim estrom ili aldehidnom grupom) u uslovima u kojima se molekul vezuje za jednu ili više PEG grupa, i (b) dobijanja proizvoda reakcije. Generalno, optimalni uslovi reakcija acilacije se određuju od slučaja do slučaja u zavisnosti od poznatog parametra i željenog rezultata. Na primer, što je veći odnos PEG: protein, veći je i procenat poli - pegiliranog proizvoda.
Postupak reduktivne alkilacije čime se dobija praktično homogena populacija monopolimera / neublastina generalno obuhvata sledeće korake: (a) proteina ili polipeptida neublastina sa reaktivnim PEG molekulom u uslovima pogodnim za reduktivnu alkilaciju, pri pH vrednosti koja je pogodna za selektivnu modifikaciju α-amino grupe na amino - terminalu neublastina; i pod (b) dobijanje proizvoda reakcije.
Prilikom dobijanja praktično homogene populacije monopolimera/neublastina, uslovi za reakciju reduktivne alkilacije su oni koji omogućavaju selektivno povezivanje polimera rastvorljivog u vodi sa amino - terminalom neublastina. Navedeni uslovi reakcije generalno obezbeđuju postojanje pKa razlika između amino grupa lizina i α-amino grupe na amino-terminalu proteina (pKa odgovara pH vrednosti pri kojoj 50% amino grupa je protonirano, a 50% nije). Vrednost pH takođe utiče na odnos polimera prema proteinu. Generalno, ukoliko je pH vrednost niža, biće poželjan veći višak polimera u odnosu na protein (tj., što je manje reaktivna amino - terminalna α-amino grupa, potrebno je više polimera da bi se postigli optimalni uslovi). Ukoliko je pH vrednost veća, odnos polimer : protein ne mora da bude tako veliki (tj., što su dostupnije reaktivne grupe, potrebno je manje molekula polimera). Za svrhe predmetnog pronalaska, pH vrednost se nalazi u opsegu od 3 - 9, poželjno 3 - 6.
Drugo važno razmatranje odnosi se na molekulsku masu polimera. Generalno, što je veća molekulska masa polimera, manje molekula polimera može biti vezano za protein. Slično tome, treba uzeti u obzir razgranatost polimera kada se vrši optimizacija ovih parametara. Generalno, što je veća molekulska masa (ili što je veći broj grana), veći je odnos polimer : protein. Generalno, za reakcije pegilacije koje se ovde koriste, poželjni opseg molekulske mase je od oko 2 kDa do oko 100 kDa. Poželjna prosečna molekulska masa je od oko 5 kDa do oko 50 kDa, posebno poželjno od oko 10 kDa do oko 20 kDa. Poželjna ukupna molekulska masa je od oko 10 kDa do oko 40 kDa.
U nekim rešenjima, polipeptid neublastina je povezan sa polimerom preko terminalne reaktivne grupe na polipeptidu. Alternativno, ili kao dodatak, polipeptid neublestina može biti povezan preko amino grupe na bočnom lancu nekog internog lizinskog ostatka, npr., lizinskog ostatka koji je uveden u aminokiselinsku sekvencu prirodnog polipeptida neublastina. Stoga, reakcija konjugacije takođe može biti razgranata u odnosu na ne - terminalnu reaktivnu grupu. Polimer sa reaktivnom grupom je ovde označen kao "aktivirani polimer". Reaktivna grupa selektivno reaguje sa reaktivnim grupama na proteinu, npr., sa slobodnim amino grupama.
Povezivanje može da se javi između aktiviranog polimera i bilo koje dostupne amino grupe na neublastinu, kao što je toα - amino grupe ili epsilon - amino grupe lizinskih ostataka ili ostataka koji su uvedeni u aminokiselinsku sekvencu polipeptida neublastina. Slobodne karboksilne grupe, poželjno aktivirane karbonilne grupe, hidroksi grupe, guanidil grupe, imidazol grupe, oksidirane ugljenohidratne podjedinice i merkapto grupe neublastina (ukoliko su dostupne) takođe mogu da se koriste kao mesta vezivanja.
Generalno, koristi se od oko 1,0 do10 mol aktiviranog polimera po molu proteina, što zavisi od koncentracije proteina. Krajnja količina predstavlja ravnotežu između maksimizirajućeg stepena reakcije i minimizirajućih nespecifičnih modifikacija proizvoda, pri čemu se u isto vreme definišuće hemijske reakcije održavaju na optimalnoj aktivnosti dok se istovremeno optimizuje, ukoliko je to moguće, poluživot proteina. Poželjno, najmanje oko 50% posto biološke aktivnosti proteina se zadržava, a najpoželjnije blizu 100% aktivnosti proteina se zadržava.
Polimer može biti povezan sa polipeptidom neublastina korišćenjem postipaka koji su poznati u struci. Na primer, u jednom rešenju, polialkilen glikolni molekul se vezuje sa lizinskom grupom na polipeptidu mutiranog neublastina. Veza sa lizinskom grupom može da se ostvari sa N-hidroksisucinimid (NHS) aktivnim estrom kao sto je PEG sukcinimidil sukcinat (SS - PEG) i sukcinimidin propionat (SPA - PEG). Odgovarajući polialkilen glikolni molekuli obuhvataju, npr., karboksimetil - NHS, norleucin - NHS, SC - PEG, tresilat, aldehid, epoksid, karbonilimidazol i PNP karbonat.
Dodatni aminski reaktivni PEG veznikci mogu da se supstituišu sa sukcinimidil grupom. Ovde spadaju, npr., izotiocijanati, nitrofenilkarbonati, epoksidi i benzotiazol karbonati. Uslovi se poželjno biraju tako da se maksimizira selektivnost i stepen reakcije.
Ukolilko je to poželjno, polipeptidi neublastina koji su konjugovani sa polimerom mogu da sadrže oznaku, npr., ozanku koja neknadno može da se otcepi proteolizom. Stoga, molekul lizina može biti selektivno modifikovan prvo u reakciji sa His - oznakom koja je modifikovana sa veznikom male molekulske mase kao što je Traut-ov reagens (Pierce) koji reaguje i sa lizinom i sa amino - terminalom, a zatim otpušta his - oznaku. Polipeptid tada sadrži slobodnu SH grupu koja može biti selektivno modifikovana sa PEG koji sadrži tiol reaktivnu grupu kao što je malaimid grupa, vinilsulfon grupa, haloacetatna grupa ili slobodna ili zaštićena SH grupa.
Traut-ov reagens može da se zameni sa bilo kojim veznikom koji će obezbediti specifično mesto za vezivanje PEG. Primera radi Traut-ov reagens može da se zameni sa SPDP, SMPT, SATA, ili SATP (svi dostupni od Pierce-a). Slično tome, moguće je da protein reaguje sa aminskim reaktivnim veznikom koji vrši inserciju maleimidne grupe (na primer, SMCC, AMAS, BMPS, MBS, EMCS, SMPB, SMPH, KMUS ili GMBS), haloacetatnu grupu (SBAP, SIA, SIAB), ili vinilsulfonsku grupu i reaguje tako da dovede do stvaranja proizvoda sa PEG koji sadrži slobodnu SH grupu. Jedino ograničenje za veličinu veznika koji se koristi jeste to da on ne sme da blokira naknadno uklanjanje amino-terminale oznake.
Tako, u drugim rešenjima polialkilenglikolni molekul se vezuje za cisteinsku grupu na polipeptidu mutiranog neublastina. Na vezivanje može da se utiče upotrebom, npr., maleimidne grupe, vinilsulfonske grupe, haloacetatne grupe, i tiolne grupe.
U poželjnim rešenjima, polipeptid neublastina koji je konjugovan sa polimerom u preparatu poseduje duži serumski polu život o odnosu na polu život polipeptida neublastina kome nedostaje polimer. Alternativno, ili kao dodatak, dimerni polipeptid neublastina koji je konjugovan sa polimerom u preparatu vezuje se za GFRα, aktivira RET, normalizuje patološke promene neurona, pospešuje preživljavanje neurona ili olakšava neuropatski bol ili ispoljava kombinaciju navedenih fizioloških funkcija. Testovi za određivanje sposobnosti polipeptida da pospeši preživljavanje neurona ili da normalizuje patološke promene neurona opisani su npr., u WO00/01815. Poželjno, neuron je senzorni neuron, autonomni neuron ili dopaminergički neuron.
U poželjnim rešenjima, obezbeđen je preparat u vidu stabilnog, u vodi rastvorljivog konjugovanog polipeptida neublastina koji sadrži polipeptid neublastina ili polipeptid mutiranog neublastina koji je povezan sa PEG molekulom. Ukoliko je to poželjno, polipeptid neublastina ili polipeptid mutiranog neublastina može biti povezan sa PEG podjedinicom preko labilne veze. Labilna veza može biti raskinuta, npr., biohemijskom hidrolizom, proteolizom ili sulfhidrilnim cepanjem. Npr., veza može biti raskinuta u uslovima in vivo (fiziološki uslovi).
Drugi parametri reakcije, kao što su vrsta rastvarača, trajanje reakcije, temperatura itd; kao i načini prečišćavanja proizvoda mogu da se odrede od slučaja do slučaja u zavisnosti od objavljenih informacija koje se odnse na derivatizaciju proteina sa polimerima rastvorljivim u vodi.
Ukoliko je to poželjno, može se koristiti jedan molekul polimera za konjugaciju po polipeptidu neublastina. Može da se poveže više od jednog molekula polimera za polipeptid. Preparati konjugovanog neublastina prema predmetnom pronalasku mogu da se koriste kako in vivo, tako i non - in vivo. Dodatno, treba napomenuti da polimer koji se konjuguje može da koristi bilo koji drugu grupu, molekul ili druge konjugovane vrste što zavisi od krajnje željene primene. Primera radi, u nekim rešenjima može biti od koristi da se polimer kovalentno veže sa funkcionalnom grupom koja umanjuje otpornost na UV degradaciju ili antioksidaciju ili koja utiče na druga svojstva ili karakteristike polimera. Kao dalji primer, može biti poželjno da se u nekim rešenjima polimer funkcionalizuje tako da ispoljava reaktivnost ili svojstvo ukrštenog vezivanja, čime se pospešuju različita svojstva ili karakteristike ukupnog konjugovanog materijala. Prema tome, polimer može da sadrži bilo koju funkcionalnu grupu, ponavljajući grupe, veze ili druge konstituentne strukture koje ne umanjuju efikasnost preparata konjugovanog muteina neublastina u željenim primenama.
Ilustrativni polimeri koji mogu biti od koristi za postizanje navedenih željenih karakteristika ovde su opisani u tekstu ispod u primerima reakcionih šema. U primenama sa kovalentno povezanim peptidom, polimer može biti funkcionalizovan, a zatim povezan sa slobodnom aminokiselinom peptida, kako bi se dobile labilne veze.
Reakcije mogu da se izvode primenom bilo kog pogodnog postupka koji se koristi za reagovanje biološki aktivnih materijala sa inertnim polimerima, poželjno pri pH vrednostima od 5 - 8, npr; pH vrednosti od 5, 6, 7 ili 8, ukoliko su reaktivne grupe locirane na α - amino grupi na amino - terminalu. Generalno, postupak obuhvata dobijanje aktiviranog polimera, a zatim reakciju proteina sa aktiviranim polimerom, čime se dobija polimer koji je rastvorljiv i pogodan za formulaciju. Gore navedene reakcije modifikacije mogu da se izvedu na nekoliko načina, u toku jednog ili nekoliko koraka.
Mogu se koristiti linearne ili razgranate forme PEG, kao i druge alkil forme. Dužina PEG može da varira. Najčešće forme variraju u veličini od 2K-100 kDa. S obzirom se u predmetnim primerima saopštava da ciljana PEG-ilacija na amino terminal ne utiče na farmakokinetska svojstva, činjenica da materijal zadržava fiziološku funkciju ukazuje da modifikacija na mestu ili mestima koja su opisana ovde nije oštećujuća. Posledično, prilikom proizvodnje mutantnih oblika neublastina koji mogu da obezbede dodatna mesta za vezivanje putem insercije lizinskih ostataka, verovatni ishod ovom pristupu jeste da navedene forme mogu biti PEGilirane i na lizinskim ostacima i na amino - terminalu obuhvaćen je obimom zaštite predmetnog pronalaska.
Polipeptid neublastina može biti vezan sa polimerom najednom ili više mesta. Npr, sa polipeptidom može biti vezan 1, 2, 3, 4 ili 5 molekula PEG. U nekim rešenjima, PEG molekul je povezan sa amino-terminalom i / ili aminokiselinama 14, 39, 68 i 95 polipeptida neublastina, numerisano kao što je prikazano na tabeli 1 i u sekvenci čiji je ID br. 1.
U poželjnim rešenjima, polipeptid neublastina koji je konjugovan sa polimerom u preparatu poseduje duži serumski poluživot u odnosu na život neublastina divljeg tipa ili u odnosu na mutirani polipeptid kome nedostaje polimer. Alternativno ili kao dodatak, polipeptid neublastina koji je konjugovan sa polimerom u preparatu se vezuje za GFRα3, aktivira RET, normalizuje patološke promene neurona, pospešuje preživljavanje neurona ili olakšava neuropatski bol ili poseduje kombinaciju navedenih fizioloških funkcija.
U nekim rešenjima, polipeptid mutiranog neublastina ili polimerni konjugat u komleksu poseduje fiziološku aktivnost koja je izabrana iz grupe koju čini: vezivanje za GFRα3, aktivacija RET, normalizacija patoliških promena neurona, pospešivanje neuronskog preživljavanja ili ublažavanje neuropatskog bola.
Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje multimerne polipeptide koji sadrže polipeptid neublastina koji je konjugovan sa polimerom. Multimerni polipeptidi su poželjno obezbeđeni kao prečišćeni multimerni polipeptidi. Primeri multimernih kompleksa obuhvataju, npr., dimerne komplekse. Multimerni kompleks može biti obezbeđen kao heteromerni ili homomerni kompleks. Stoga, multimerni kompleks može biti heterodimerni sa polimerom konjugovani polipeptidni kompleks koji sadrži jedan polipeptid mutiranog neublastina i jedan nemutirani neublastin ili može biti heterodimerni kompleks polipeptida konjugovanog sa polimerom koji sadrži dva ili više polipeptida mutiranog neublastina.
U nekim rešenjima polipeptid neublastina koji je konjugovan sa polimerom vezuje se sa GFRα3. Poželjno, vezivanje polipeptida neublastina konjugovanog sa polimerom stimuliše fosforilaciju RET polipeptida. U cilju određivanja vezivanja polipeptida za GFRα3, mogu da se koriste testovi koji su opisani u WO00/01815. Na primer, prisustvo neublastina u supernatantu podloge CHO ćelijske linije može da se prikaže upotrebom modifikovanog oblika testa ternarnog kompleksa koji je opisan od strane Sanicola et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, 94: 6238). U ovom testu, može da se oceni sposobnost molekula koji su slični sa GDNF da posreduju u vezivanju između ekstracelularnog domena RET i različitih koreceptora, kao što su GFRα1, GFRα2 i GFRα3. Rastvorljivi oblici RET i koreceptora se dobijaju u vidu fuzionih proteina. Fuzioni protein između ekstracelularnog domena pacovskog RET i placentne alkalne fosfataze (RET - AP) i fuzioni protein između ekstracelularnog domena pacovskog GFRα1(opisan u objavljenoj patentnoj prijavi WO9744356; 27.11.1997.) i Fc domena humanog IgG1 (rGFR(α1 - Ig) takođe je opisano (Sanicola et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, 94: 6238).
Poilimer prema predmetnom pronalasku je poželjno polialkilen glikol molekul, a još poželjnije PEG molekul. U nekim rešenjima, molekul polimera poseduje prosečnu molekulsku masu od oko100 Da do oko 25,000 Da; od oko 1000 Da do oko 20,000 Da; ili od oko 5000 Da do oko 20,000 Da. U nekim rešenjima, barem jedan molekul polimera poseduje prosečnu molekulsku masu od oko 5000 Da; prosečnu molekulsku masu od oko 10,000 Da; ili prosečnu molekulsku masu od oko 20,000 Da.
Funkcionalna grupa na polialkilen glikolnom molekulu može biti, npr., karboksimetil - NHS, norleucin - NHS, SC - PEG, trezilat, aldehid, epoksid, karbonilimidazol, ili PNP karbonat. Vezivanje može da se ostvari putem N - hidroksilsukcinimidnog (NHS) aktivnog estra. Aktivni estar može biti, npr., PEG sukcinimidil sukcinat (SS - PEG), sukcinimidil butirat (SPB - PEG), ili sukcinimidil propionat (SPA - PEG). U nekim rešenjima, polialkilen glikolni molekul je povezan sa cisteinskom grupom na polipeptidu neublastina ili polipeptidu mutiranog neublastina. Na primer, vezivanje može da se ostvari preko maleimidne grupe, vinilsulfonske grupe, haloacetatne grupe, i tiolne grupe. U različitim rešenjima, polipeptid neublastina ili polipeptid mutiranog neublastina sadrži jedan, dva, tri ili četiri PEG molekula.
U nekim rešenjima, polimer je povezan sa polipeptidom na onom mestu neublastina koje predstavlja N - terminal. U nekim rešenjima, polimer je povezan sa polipeptidom na mestu koje predstavlja ne - terminalnu aminokiselinu polipeptida neublastina ili polipeptida mutiranog neublastina. U nekim rešenjima, polimer je povezan sa aminokiselinom polipeptida neublastina ili polipeptida mutiranog neublastina koja je izložena dejstvu rastvarača.
U nekim rešenjima, polimer je povezan sa polipeptidom neublastina ili sa polipeptidom mutiranog neublastina na ostatku koji je izabran iz grupe koju čine; amino - terminalna aminokiselina polipeptida koji je konjugovan sa polimerom, aminokiselina na položaju 14 u aminokiselinskoj sekvenci polipeptida neublastina ili polipeptida mutiranog neublastina, aminokiselina na položaju 39 u aminokiselinskoj sekvenci polipeptida neublastina ili polipeptida mutiranog neublastina, aminokiselina na položaju 68 u aminokiselinskoj sekvenci polipeptida neublastina ili polipeptida mutiranog neublastina i aminokiselina na položaju 95 u aminokiselinskoj sekvenci polipeptida neublastina ili polipeptida mutiranog neublastina.
Fuzioni proteini neublastina koji je konjugovan sa polimerom
Ukoliko je to poželjno, polipeptid neublastina koji je konjugovan sa polimerom može biti obezbeđen u vidu fuzionog proteina. Derivati proteina prema predmetnom pronalasku u obliku fuzionog polipeptida takođe obuhvataju različite strukturne forme primarnog proteina koji zadržava biološku aktivnost.
Fuzioni proteini serumskog albumina i neublastina koji je konjugovan sa polimerom mogu da se konstruišu upotrebom postupaka koji su poznati u struci. Za povezivanje neublastina sa serumskim albuminom može da se upotrebi bilo koji od brojnih sredstava za ukršteno povezivanje koje sadrži odgovarajuću amino reaktivnu grupu i tiolnu reaktivnu grupu. Primeri odgovarajućih veznika obuhvataju aminske reaktivne veznike za ukršteno vezivanje koji insertuju tiol reaktivni maleimid. Ovde spadaju npr., SMCC, AMAS, BMPS, MBS, EMCS, SMPB, SMPH, KMUS ili GMBS. Drugi pogodni veznici insertuju tiol reaktivnu haloacetatnu grupu. Ovde spadaju, npr., SBAP, SIA, SIAB i ona jedinjenja koja obezbeđuju zaštićenu ili nezaštićenu tiol grupu za reakciju sa sulfhidrilnim grupama, čime se dobijaju reduktibilne veze SPDP, SMPT, SATA ili SATP, koje su sve komercionalno dostupne (npr., Pierce Chemicals). Stručnjak je upoznat da je moguće koristiti slične alternativne strategije za povezivanje amino - terminala neublastina sa serumskim albuminom.
Takođe, stručnjak može da proizvede konjugate sa serumskim albuminom koji nisu usmereni ka amino - terminalu neublastina ili na tiolnu grupu serumskog albumina. Ukoliko je to poželjno, fuzioni proteini serumskog albumina i neublastina mogu da se dobiju upotrebom tehnika genetskog inženjeringa, pri čemu se gen za neublastin fuzioniše sa genom za serumski albumin na njegovom amino - terminalu, karboksi-terminalu ili na oba kraja.
Bilo koji konjugat neublastina koji poseduje produžen polu - život, na primer, in vivo ili specifično u eksperimentalnim životinjama (uključujući i ljude) može da se dobije upotrebom sličnih strategija. Drugi primer konjugata neublastina koji predstavlja proizvod sa produženim polu - životom in vivo jeste fuzioni protein neublastina u kome je njegov fuzioni partner Ig.
Drugi derivati neublastina koji je konjugovan sa polimerom obuhvataju kovalentne ili agregatne konjugate mutiranog neublastina ili njegovih fragmenata sa drugim proteinima ili polipeptidima, kao što su oni koji se dobijaju sintezom u rekombinantnoj strukturi kao dodatni amino - terminali ili karboksi - terminali. Na primer, konjugovani peptid može biti signalna (ili vodeća) polipeptidna sekvenca na amino - terminalnom regionu proteina koja ko - translaciono ili post - translaciono usmerava transfer proteina sa njegovog mesta sinteze do njegovog mesta funkcije unutar ili spolja u odnosu na ćelijsku membranu ili zid (npr., vodeće sekvenca alfa faktora gljivice). Neublastinski receptorski proteini mogu da sadrže peptide koji su dodati tako da pospešuju prečišćavanju ili identifikaciji neublastina (npr., fuzioni proteini histidina/neublastina). Aminokiselinska sekvenca neublastina takođe može biti povezana sa peptidom Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (DYKDDDDK) (SEQ ID NO: 22) (Hopp et al., Biotechnology 6: 1204 (1988)). Navedena sekvenca je visoko antigena ili obezbeđuje epitop koji je reverzibilno vezan sa specifičnim monoklonskim antitelom, što omogućava brzo testiranje i pospešuje prečišćavanje eksprimiranog rekombinantnog proteina.
Ova sekvenca se takođe specifično sepa dejstvom goveđe mukozne enterokinaze na ostatku neposredno nakon Asp-Lys para.
Biološki aktivni polipeptidi
Polipeptidi prema predmetnom pronalasku mogu biti obezbeđeni u bilo kom biološki aktivnom obliku, uključujući oblik pre - pro - proteina, pro - proteina, zrelih proteina, glikoziliranih proteina, ne - glikoziliranih proteina, fosforilisanih proteina, ne - fosforilisanih proteina, u nepotpunim oblicima ili u drugim post-translacionim modifikovanim proteinskim oblicima. Biološki aktivni polipeptid neublastina obuhvata polipeptid koji, na primer, kada je dimerizovan, sam ili u prisustvu ko - faktora (kao što je GFRα3 ili RET), vezuje se za RET, indukuje dimerizaciju RET i autofosforilaciju RET.
Polipeptidi prema predmetnom pronalasku posebno možu biti N - glikozilirani polipeptid, koji je poželjno glikoziliran na N - ostatku koji je naznačen u listi sekvenci.
U nekim rešenjima, polipeptid prema predmetnom pronalasku poseduje aminokiselinsku sekvencu koja je predstavljena kao sekvenca čiji je ID br. 6, i zadržava glikozilirani asparaginski ostatak na položaju 122; ili poseduje aminokiselinsku sekvencu koja je predstavljena kao sekvenca čiji je ID br. 14, koja zadržava glikozilirani asparaginski ostatak na položaju 95, ili na analaognom položaju u bilo kom mutiranom neublastinskom polipeptidu, kada se izvrši poravnavanje upotrebom, npr., ClustalW kompjuterskog programa.
U nekim rešenjima, polipeptid prema predmetnom pronalasku poseduje aminokiselinsku sekvencu koja je predstavljena kao sekvenca čiji je ID br. 23, koja je ovde označena kao NBN114 - N95K, a koja sadrži lizinski ostatak koji supstituiše asparaginski ostatak na položaju 95 sekvence čiji je ID br. 2; ili poseduje aminokiselinsku sekvencu koja je predstavljena kao sekvenca čiji je ID br. 24, koja je ovde označena kao NBN106 - N95K; ili poseduje mutaciju na analognom položaju u bilo kom polipeptidu mutiranog neublastina, kad se izvrši poravnavanje, npr., upotrebom ClustalW kompjuterskog programa.
Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje fuzione proteine mutiranog neublastina, kao što su Ig - fuzioni proteini, kao što je opisano u npr., U. S. patentu br. 5,434,131 ili fuzione proteine sa serumskim albuminom.
U nekim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid koji poseduje aminokiselinsku sekvencu koja je prikazana kao sekvenca čiji je ID br. 1, s tim izuzetkom da poseduje jednu supstituciju ili da je aminokiselinska sekvenca najmanje oko 85% identična, najmanje oko 90% identična, još poželjnije najmanje oko 95% identična, još poželjnije najmanje oko 98% identična, a najpoželjnije najmanje oko 99% identična sa sekvencom koja je predstavljena kao sekvenca čiji je ID br. 1.
U drugim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid koji poseduje aminokiselinsku sekvencu koja je predstavljena kao sekvenca čiji je ID br. 2, s tim što poseduje jednu supstituciju ili je ta aminokiselinska sekvenca najmanje oko 85%, poželjno, najmanje oko 90%, još poželjnije najmanje oko 95%, još poželjnije najmanje oko 98%, a najpoželjnije najmanje oko 99% identična sa sekvencom koja je predstavljena kao sekvenca čiji je ID br. 2.
U drugim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid koji poseduje aminokiselinsku sekvencu koja je predstavljena kao sekvenca čiji je ID br. 3, s izuzetkom jedne supstitucije ili je ta aminokiselinska sekvenca najmanje oko 85%, poželjno, najmanje oko 90%, još poželjnije najmanje oko 95%, još poželjnije najmanje oko 98%, a najpoželjnije najmanje oko 99% identična sa sekvencom koja je predstavljena kao sekvenca čiji je ID br. 3.
U drugim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid koji poseduje aminokiselinsku sekvencu koja je predstavljena kao sekvenca čiji je ID br. 4, s izuzetkom jedne supstitucije ili je ta aminokiselinska sekvenca najmanje oko 85%, poželjno, najmanje oko 90%, još poželjnije najmanje oko 95%, još poželjnije najmanje oko 98%, a najpoželjnije najmanje oko 99% identična sa sekvencom koja je predstavljena kao sekvenca čiji je ID br. 4.
U drugim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid koji poseduje aminokiselinsku sekvencu koja je predstavljena kao sekvenca čiji je ID br. 5, s izuzetkom jedne supstitucije ili je ta aminokiselinska sekvenca najmanje oko 85%, poželjno, najmanje oko 90%, još poželjnije najmanje oko 95%, još poželjnije najmanje oko 98%, a najpoželjnije najmanje oko 99% identična sa sekvencom koja je predstavljena kao sekvenca čiji je ID br. 5.
U drugim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid koji poseduje aminokiselinsku sekvencu koja je predstavljena kao sekvenca čiji je ID br. 6, s izuzetkom jedne supstitucije ili je ta aminokiselinska sekvenca najmanje oko 85%, poželjno, najmanje oko 90%, još poželjnije najmanje oko 95%, još poželjnije najmanje oko 98%, a najpoželjnije najmanje oko 99% identična sa sekvencom koja je predstavljena kao sekvenca čiji je ID br. 6.
U drugim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid koji poseduje aminokiselinsku sekvencu koja je predstavljena kao sekvenca čiji je ID br. 7, s izuzetkom jedne supstitucije ili je ta aminokiselinska sekvenca najmanje oko 85%, poželjno, najmanje oko 90%, još poželjnije najmanje oko 95%, još poželjnije najmanje oko 98%, a najpoželjnije najmanje oko 99% identična sa sekvencom koja je predstavljena kao sekvenca čiji je ID br. 7.
U drugim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid koji poseduje aminokiselinsku sekvencu koja je predstavljena kao sekvenca čiji su ID brojevi 8 - 21, s izuzetkom jedne supstitucije ili je ta aminokiselinska sekvenca najmanje oko 85%, poželjno, najmanje oko 90%, još poželjnije najmanje oko 95%, još poželjnije najmanje oko 98%, a najpoželjnije najmanje oko 99% identična sa sekvencom koja je predstavljena kao sekvenca čiji su ID brojevi 8 - 21.
U drugim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid koji poseduje aminokiselinsku sekvencu koja je predstavljena kao sekvenca čiji je ID br. 36, s izuzetkom jedne supstitucije ili je ta aminokiselinska sekvenca najmanje oko 85%, poželjno, najmanje oko 90%, još poželjnije najmanje oko 95%, još poželjnije najmanje oko 98%, a najpoželjnije najmanje oko 99% identična sa sekvencom koja je predstavljena kao sekvenca čiji je ID br. 36.
U daljim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid koji poseduje aminokiselinsku sekvencu koja je predstavljena kao sekvenca čiji su ID brojevi 1 - 21 i 36 s izuzetkom jedne supstitucije ili je ta aminokiselinska sekvenca najmanje oko 85%, poželjno, najmanje oko 90%, još poželjnije najmanje oko 95%, još poželjnije najmanje oko 98%, a najpoželjnije najmanje oko 99% identična sa sekvencom koja je predstavljena kao sekvenca čiji su ID brojevi 1 - 21 i 36.
U drugim rešenjima, mutirani polipeptid prema predmetnom pronalasku zadržava glavnu karakteristiku podporodice GDNF, tj., konzervirane cisteinske aminokiselinski ostatke označene u tabeli 3 i 4.
U nekim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje mutirani polipeptid koji kodira polinukleotidna sekvenca koja može da hibridizuje u veoma striktnim uslovima sa polinukleotidnom sekvencom koja kodira polipeptid čija sekvenca ima ID br. 1, sa komplementarnim lancem ove niti ili sa njenom podsekvencom. U nekim rešenjima, mutirani polipeptid prema predmetnom pronalasku kodira polinukleotidna sekvenca koja poseduje najmanje 70% identičnosti sa polinukleotidnom sekvencom koja kodira polipeptid čija sekvenca ima ID br. 1.
U nekim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje nove polipeptide koje kodira polinukleotidna sekvenca koja može da hibridizuje u veoma striktnim uslovima sa polinukleotidnom sekvencom koja kodira polipeptid čija sekvenca ima ID br. 2, sa njenim komplementarnim lancem ili sa njenom supsekvencom. U nekim rešenjima, mutirani polipeptid prema predmetnom pronalasku je kodiran od strane polinukleotidne sekvence koja poseduje najmanje 70% identičnosti sa polinukleotidnom sekvencom koja kodira polipeptid čija sekvenca ima ID br. 2.
U nekim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje mutirane polipeptide koje kodiraju polinukleotidne sekvence koje su sposobne da hibridizuju u veoma striktnim uslovima sa polinukleotidnim sekvencama koje kodiraju polipeptide čije sekvence imaju ID brojeve 8 - 21, lancima njihovih komplementarnih sekvenci ili sa njihovim supsekvencama. U drugim rešenjima, mutirani polipeptid prema predmetnom pronalasku kodiran je od strane polinukleotidne sekvence koja poseduje najmanje 70% identičnosti sa polinukleotidnom sekvencom koja kodira polipeptid čija sekvenca ima ID br. 8 - 21.
U nekim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje nove polipeptide koje kodira polinukleotidna sekvenca sposobna da hibridizuje u veoma striktnim uslovima sa polinukleotidnom sekvencom koja kodira polipeptid čija sekvenca ima ID br. 36, sa lancem njene komplementarne sekvence ili sa njenom supsekvencom. U nekim rešenjima, mutirani polipeptid prema predmetnom pronalasku kodiran je od strane polinukleotidne sekvence koja poseduje najmanje 70% identičnosti sa polinukleotidnom sekvencom koja kodira polipeptid čija sekvenca ima ID br. 36.
Biološko poreklo
Dimer nekonjugovanog polipeptida neublastina može da se izoluje, a potom konjuguje sa jednim ili sa više polimera, kako bi se dobio dimer polipeptida neublastina koji je konjugovan sa polimerom prema predmetnom pronalasku. Dimer polipeptida neublastina može da se izoluje iz ćelije sisara, poželjno iz humane ćelije ili iz mišje ćelije ili iz ćelija kulture ćelija jajnika Kineskog hrčka.
Neurotrofna aktivnost
Polipeptidi modifikovanog neublastina, uključujući nepotpune polipeptide neublastina prema predmetnom pronalasku korisni su za menjanje metabolizma, rasta, diferencijacije ili preživljavanje nerva ili neuronske ćelije. Posebno, polipeptidi modifikovanog neublastina se koriste za lečenje ili za ublažavanje poremećaja ili oboljenja kod žive životinje, npr., kod čoveka, pri čemu je poremećaj ili oboljenje osetljivo na aktivnost neurotrofnog sredstva. Navedeni tretmani i postupci su opisani detaljnije u tekstu koji sledi.
Farmaceutski preparati koji sadrže konjugate neublastina i polimere
Takođe, predmetni pronalazak obezbeđuju farmaceutski preparat koji sadrži dimer modifikovanog polipeptida neublastina.
Konjugati polimera i neublastina prema predmetnom pronalasku mogu da se primene sami, kao i u obliku farmaceutski prihvatljivih estara, soli i drugih fizioloških funkcionalnih derivata. U takvim farmaceutskim i medicinskim formulacijama, konjugat polimera i neublastina se poželjno koristi zajedno sa jednim ili sa više farmaceutski prihvatljivih nosilaca, a opciono i sa bilo kojim drugim terapijskim sastojcima.
Nosioci moraju biti farmaceutski prihvatljivi u smislu da su kompatabilni sa drugim sastojcima u formulaciji i da nisu nepotrebno štetni za recipijenta. Neublastin koji je konjugovan sa polimerom je obezbeđen u količini koja je efikasna da obezbedi željeno farmakološko dejstvo ili poželjni medicinski efekat kao što je to opisano ovde, kao i u količini koja je odgovarajuća za postizanje željene biološki raspoložive doze ili koncentracije in vivo.
Formulacije obuhvataju one koje su pogodne za perenteralnu kao i za ne parenteralnu primenu, a specifični načini primene obuhvataju oralnu, rektalnu, bukalnu, topisku, nazalnu, oftalmičku, supkutanu, intramuskularnu, intravensku, transdermalnu, intratekalnu, intra - artikularnu, intra - arterijsku, sub - arahnoidnu, bronhialnu, limfatičku, vaginalnu i intra - uterusnu primenu. Formulacije koje su pogodne za primenu aerosolom i za perenteralnu primenu, bilo lokalno ili sistemski, poželjne su prema predmetnom pronalasku.
Kada se neublastin koji je konjugovan sa polimerom koristi u formulaciji koja sadrži tečni rastvor, poželjno je da formulacija bude primenjena oralno, bronhialno ili parenteralno. Kada se neublastin konjugovan sa polimerom koristi u formulaciji tečne suspenzije ili u vidu praška biološki kompatibilnom nosiocu, formulacija se poželjno primenjuje oralno, rektalno ili bronhialno. Alternativno, formulacija može biti primenjena nazalno ili bronhialno, putem nebulizacije praška u gasu koji je nosilac, čime se formira gasovita disperzija praška koji se udiše od strane pacijenta iz kontejnera odgovarajućeg uređaja za nebulizaciju.
Formulacije koje sadrže proteine prema predmetnom pronalasku mogu pogodno da se obezbede u vidu jediničnog doznog oblika i mogu da se pripreme upotrebom bilo kog postupka koji je poznat u farmaciji. Takvi postupci generalno obuhvataju korak dovođena aktivnog sastojka u asocijaciju sa nosiocem koji predstavlja jedan ili više dodatnih sastojaka.
Tipično, formulacije se dobijaju putem uniformnog i intimnog dovođenja aktivnih sastojaka u asocijaciju sa tečnim nosiocem, sa fino podeljenim čvrstim nosiocem ili sa oba tipa nosioca, a potom, ukoliko je to potrebno, oblikovanje proizvoda u dozni oblik željene formulacije.
Formulacije prema predmetnom pronalasku koje su pogodne za oralnu primenu mogu da se obezbede u vidu diskretnih jedinica kao što su kapsule, sašete, tablete, ili bombone, od kojih svaka sadrži prethodno određenu količinu aktivnog sastojka u vidu praha ili granula; ili su obezbeđene u vidu suspenzije u vodenom rastvoru ili u nevodenom rastvoru, kao što je to slučaj sa sirupom, eliksirom ili emulzijom.
Formulacije koje su pogodne za parenteralnu primenu poželjno sadrže sterilni vodeni preparat aktivnog konjugata, koji je poželjno izotoničan sa krvlju recipijenta (npr., fiziološki soni rastvor). Takvi preparati mogu da sadrže sredstva za suspendovanje i sredstva za očvršćavanje ili druge sisteme mikro čestica koji su tako dizajnirani da usmere jedinjenje ka komponentama krvi ili ka jednom ili više organa. Formulacije mogu biti obezbeđene u obliku jediničnih doza ili višestrukih doza.
Formulacije u vidu nazalnog spreja sadrže prečišćene vodene rastvore aktivnog konjugata sa konzervansima i sredstvima za održavanje izotoničnosti. Takve formulacije su poželjno podešene na pH vrednost i izotoničnost tako da su kompatibilne sa primenom preko sluzokože nosa.
Formulacije za rektalnu primenu mogu da se obezbede u vidu supozitorija sa odgovarajućim nosiocem kao što je puter od kakaoa, hidrogenisane masti ili hidrogenisane masne kiseline. Oftalmički preparati, kao što su kapi za oči, dobijaju se na sličan način kao i nazalni sprej, s tim što su pH vrednost i faktor izotoničnosti poželjno podešeni tako da odgovaraju sluzokoži oka.
Topiske formulacije sadrže konjugate prema predmetnom pronalasku koji su rastvoreni ili suspendovani u jednoj ili u više podloga, kao što su mineralna ulja, petrolej, polihidroksilni alkoholi ili druge osnovne supstance koje se koriste za topiske farmaceutske formulacije.
Kao dodatak napred pomenutim sastojcima, formulacije prema predmetnom pronalasku mogu dalje da sadrže jedan ili više dodatnih sastojaka koji je izabran iz grupe koju čine diluenti, puferi, veštačke arome, sredstva za dezintegraciju, površinski aktivna sredstva, sredstava za očvršćavanje, lubrikanti, konzervansi (uključujući antioksidanse), kao i slične. Napred navedena razmatranja su takođe primenljiva na fuzione proteine neublastina prema predmetnom pronalasku (npr., na fuzione proteine neublastina i humanog serumskog albumina).
Shodno tome, predmetni pronalazak obezbeđuje odgovarajuće fuzione proteine za in vitro stabilizaciju konjugata neublastina i polimera u rastvoru, što je poželjna ilustrativna primena prema predmetnom pronalasku. Fuzioni proteini mogu da se koriste, na primer, da povećaju otpornost na enzimsku degradaciju polipeptida neublastina konjugovanog sa polimerom i da obezbede način za poboljšavanje produžetka polu-života, povećanje stabilnosti na sobnoj temperaturi i slično. Treba napomenuti da napred navedena razmatranja su takođe primenljiva na fuzione proteine neublastina i serumskog albumina (uključujući fuzione proteine humanog neublastina i humanog serumskog albumina) prema predmetnom pronalasku
Postupci tretiranja
Preparati prema predmetnom pornalasku mogu da se koriste za tretiranje ili ublažavanje poremećaja ili oboljenja kod sisara, npr., kod primata, uključujući čoveka, pri čemu je navedeni poremećaj ili oboljenje osetljivo na aktivnost neurotropnih sredstava.
Preparati prema predmetnom pronalasku mogu da se koriste direktno putem, npr., injektovanih, implantiranih ili ingestovanih farmaceutskih preparata u cilju tretiranja patološkog procesa koji je osetljiv na dejstvo neublastinskih polipeptida. Preparati mogu da se koriste za ublažavanje poremećaja ili oboljenja tela kod žive životinje, uključujući čoveka, pri čemu je poremećaj ili oboljenje osetljivo na aktivnost neurotrofnih sredstava. Poremećaj ili oboljenje može specifično da bude oštećenje nervnog sistema izazvano traumom, hirurškom intervencijom, ishemijom, infekcijom, metaboličkim bolestima, deficijencijama hranljivih sastojaka, malignitetom ili toksičnim sredstvima, kao i genetskim ili idiopatskim procesima.
Oštećenje može specifično da se javi kod senzornih neurona ili ganglionskih ćelija mrežnjače, uključujući neurone u ganglionima dorzalnih korenova ili u bilo kom od sledećih tkiva: u genukulatnom, petroznom i nodoznom ganglionu; u vestibuloakustičkom kompleksu osmog moždanog živca; u ventrolateralnom polu maksilomandibularnog lobusa gangliona trigeminusa; i u mezencefaličkom nukleusu trigeminusa.
U nekim rešenjima postupka prema predmetnom pronalasku, oboljenje ili poremećaj je neurodegenerativna bolest koja obuhvata oštećene i traumatizovane neurone, kao što je slučaj sa traumatskim oštećenjima perifernih nerava, produžene moždine i/ili kičmene moždine, sa ishemičnim neuronskim oštećenjem mozga, sa neuropatijom, a posebno sa perifernom neuropatijom, traumom ili povredom perifernog nerva, sa ishemijskim moždanim udarom, sa akutnom povredom mozga, sa akutnom povredom kičmene moždine, sa tumorima nervnog sistema, multiplom sklerozom, sa izloženošću neurotoksinima, sa metaboličkim bolestima kao što je dijabetes ili renalne disfunkcije i sa oštećenjima koja su izazvana infektivnim agensima, sa neurodegenerativnim poremećajima uključujući Alchajmerovu bolest, Hantingtonovu bolest, Parkinsonovu bolest, sa Parkinson - plus sindromima, sa progresivnom supranuklearnom paralizom (Stil - Ričardson - Olsevski sindrom), sa olivopontocerebelarnom atrofijom (OPCA), sa Šaj - Dragerovim sindromom (atrofija više sistema), sa Guamanian parkinsonizam - demencija kompleksom, sa amiotrofičnom lateralnom sklerozom ili sa bilo kojim drugim kongenitalnom ili neurodegenerativnom bolešću, kao i sa oštećenjem memorije koje je povezano sa demencijom.
U nekim rešenjima, neuroni senzornog i/ili autonomnog sistema mogu biti tretirani. Posebno, mogu biti tretirani nociceptivni i mehanoceptivni neuroni, posebno neuroni A-δ vlakana, C-vlakana i A-β vlakana. Dodatno, mogu biti tretirani neuroni simpatetičkog i parasimpatetičkog sistema.
U nekim rešenjima, mogu bniti tretirana oboljenja motornih neurona, kao što je amiotrofična lateralna skleroza (ALS) i spinalna mišićna atrofija. U drugim rešenjima, molekuli neublastina prema predmetnom pronalasku mogu da se koriste za pospešivanje oporavka nerva nakon traumatske povrede. Alternativno ili kao dodatak, u ovde opisanim postupcima može da se koristi kanal za vođenje nerva sa matriksom koji sadrži polipeptide neublastina koji su konjugovani sa polimerom ili fuzioni polipeptidi ili konjugati polipeptida mutiranog neublastina. Navedeni kanali za vođenje nerva su opisani, npr., u U.S. patentu br. 5,834,029.
U nekim rešenjima, preparati koji su ovde opisani (kao i farmaceutski preparati koji sadrže iste) koriste se u tretmanu perifernih neuropatija. U periferne neuropatije koje mogu da se tretiraju molekulima prema predmetnom pronalasku su neuropatije indukovane traumom, npr., one koje su izazvane fizičkom povredom ili oboljenjem, fizičko oštećenje mozga, fizičko oštećenje kičmene moždine, moždani udar udružen sa oštećenjem mozga, kao i neurološki poremećaji koji su povezani sa neurodegeneracijom. Takođe, ovde su obuhvaćene one neuropatije koje su posledica infekcije, izloženosti toksinu, kao i izloženosti leku. Takođe, ovde su dalje uključene one neuropatije koje su posledica sistemske ili metabiličke bolesti. Na primer, ovde opisani preparati takođe mogu da se upotrebe za tretiranje neuropatija koje su indukovane hemoterapijom (kao što su one koje su izazvane primenom hemoterapijskih sredstava, npr., taksola ili cisplatina); neuropatije koje su indukovane toksinom, neuropatije koje su izazvane lekom, neuropatije koje su izazvane deficijencijom vitamina, idiopatske neuropatije, dijabetska neuropatija i postherpetične neuralgije. Videti, npr., U. S. patente br. 5,496,804 i 5,916,555.
Dodatna stanja koja mogu da se tretiraju prema predmetnom pronalasku su mononeuropatije, višestruke mononeuropatije, kao i polineuropatije, uključujući aksonske i demijelinizujuće neuropatije.
U nekim rešenjima, preparati prema predmetnom pronalasku (kao i farmaceutski preparati koji sadrže iste) koriste se u tretmanu različitih poremećaja oka, uključujući gubitak fotoreceptora u mrežnjači kod pacijenata sa makularnom degeneracijom, sa oboljenjem retinitis pigmentosa, glaukomom i sličnim bolestima.
Postupci i farmaceutski preparati
Predmetni pronalazak obuhvata postupke za tretiranje neuropatskog bola, za tretiranje taktilne alodinije i za smanjenje gubitka osetljivosti na bol koje je udurženo sa neuropatijom. Postupci prema predmetnom pronalasku koriste dimerne polipeptide neublastina koji su konjugovani sa polimerom, uključujući dimere koji se sastoje od biološki aktivnih polipeptida neublastina pune dužine ili od biološki aktivnih polipeptida neublastina nepotpune dužine. Dodatno, predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutske preparate koji sadrže dimerne polipeptide neublastina konjugovane sa polipeptidom koji su suspendovani, rastvoreni ili dispergovani u farmaceutski prihvatljivom nosiocu.
1. Tretman neuropatskog bola
U nekim rešenjima, predmetni pronalazak obuhvata postupak za tretiranje neuropatskog bola kod subjekta i podrazumeva primenu kod subjekta efikasne količine dimera polipeptida neublastina koji je konjugovan polimerom. U nekim rešenjima, predmetni pronalazak obuhvata postupak za tretiranje neuropatskog bola kod subjekta i podrazumeva primenu kod subjekta farmaceutski efikasne količine dimera polipeptida neublastina koji je konjugovan polimerom, koji sadrži, na primer, polipeptide neublastina divljeg tipa, nepotpune dužine ili mutirane, uključujući, npr., bilo koju od sekvenci čiji su ID brojevi 1, 2, 6 - 21 i 36 ili njihove mutirane oblike, bilo same ili primenjujući istovremeno kod subjekta efikasnu količinu jedinjenja koje izaziva analgeziju, a koje je izabrano iz grupe koju čine opioidi, anti-aritmici, topijski analgetici, lokalni anestetici, antikonvulzivi, antidepresivi, kortikosteroidi i nesteroidni anti-inflamatorni lekovi (NSAID). U poželjnom rešenju, jedinjenje koje izaziva analgeziju je antikonvulziv. U drugom poželjnom rešenju, jedinjenje koje izaziva analgeziju je gabapentin ((1-aminometil)cikloheksan sirćetna kiselina) ili pregabalin (S-(+)-4-amino-3-(2-metilpropil) butanska kiselina).
Polipeptidi neublastina i nukleinske kiseline prema predmetnom pronalasku (kao i farmaceutski preparati koji sadrže ovde opisane dimere polipeptida neublastina koji su konjugovani polimerom) koriste se u tretmanu bola koji je udružen sa perifernim neuropatijama. U periferne neuropatije koje se mogu tretirati prema predmetnom pronalasku spadaju neuropatije indukovane traumom, npr., one koje su izazvane fizičkom povredom ili oboljenjem, fizičkom povredom mozga, fizičkom povredom kilmene moždine, moždanim udarom koji je uduržen sa oštećenjem mozga i neurološkim poremećajima koji su povezani sa neurodegeneracijom.
Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje tretmane za neuropatije izazvane hemoterapijom, (kao što su one koje su izazvane primenom hemoterapijskih sredstava, npr., taksolom ili cisplatinom); za neuropatije izazvane toksinom, neuropatije izazvane lekom, neuropatije izazvane patogenom (npr., izazvane virusom), neuropatije izazvane deficijencijom vitamina, za idiopatske neuropatije i za dijabetske neuropatije. Videti, npr., U.S. patente br. 5,496,804 i 5,916,555, koje su sve ovde inkorporirane po referenci. Predmetni pronalazak dalje može da se koristi za tretman mononeuropatija, višestruke mononeuropatije i polineuropatije, uključujući aksonske i demijelinizujuće neuropatije, i to upotrebom nukleotida i polipeptida neublastina prema predmetnom pronalasku.
Neuropatski bol može biti udružen sa brojnim perifernim neuropatijama, uključujući: (a) neuropatije izazvane traumom, (b) neuropatije izazvane hemoterapijom, (c) neuropatije izazvane toksinom (uključujući, bez ograničenja, neuropatije izazvane alkoholizmom, intoksikacijom vitaminom B6, intoksikacijom heksaugljenikom, amjodaronom, hloramfenikolom, disulfiramom, izoniazidom, zlatom, litijumom, metronidazolom, mizonidazolom, nitrofurantoinom), (d) neuropatije izazvane lekom, uključujući neuropatski bol izazvan terapeutskim lekom (kao u slučaju antikancerskih sredstava, posebno antikancerskih sredstava izabranih iz grupe koju čine taksol, taksoter, cisplatin, nokodazol, vinkristin, vindezin i vinblastin; kao i one izazvane antivirusnim sredstvima, posebno antivirusnim sredstvima izabranim iz grupe koju čine ddI, DDC, d4T, foskarnet, dapson, metronidazol i izonijazid), (3) neuropatije izazvane deficijencijom vitamina (uključujući, bez ograničenja, deficijenciju vitamina B12, vitamina B6 i vitamina E), (f) idiopatske neuropatije, (g) dijabetske neuropatije, (h) oštećenje nerva izazvano patogenom, (i) sa oštećenjem nerva izazvanim inflamacijom, (j) neurodegeneracija, (k) naslednu neuropatiju (uključujući, bez ograničenja, Fridrajsovu ataksiju, porodičnu amiloidnu polineuropatiju, Tangijerovu bolest, Fabrijevu bolest), (l) metaboličke poremećaje (uključujući, bez ograničenja, bubrežnu insuficijenciju i hipotireoidizam), (m) infektivne i virusne neuropatije (uključujući, bez ograničenja, neuropatski bol udružen sa leprom i Lajmskom bolešću, neuropatski bol koji je udružen sa infekcijom nekim virusom, posebno virusom koji je izabran iz grupe koju čine herpes virus (npr., herpes zoster virus može da izazove postherpeičnu neuralgiju), virus humane imunodeficijencije (HIV) i papiloma virus), (n) autoimune neuropatije (uključujući, bez ograničenja, Gijan - Bareov sindrom, hroničnu inflamatornu demijelinizujuću polineuropatiju, monoklonalnu gamapatiju neodređenog značaja sa polineuropatijom), (o) neuralgiju trigeminusa i sindrome uklještenja (uključujući, bez ograničenja, sindrom karpalnog tunela) i (p) druge sindrome sa neuropatskim bolom, uključujući post-traumatsku neuralgiju, bol u fantomskom ekstremitetu, bol kod multiple skleroze, kompleksne sindrome sa regionalnim bolom (uključujući, bez ograničenja, refleksnu simpatetičku distrofiju, kauzalgiju), bol koji je udružen sa neoplazijom, neuropatiju usled vaskulitisa / angiopatsku neuropatiju i ishijalgiju. Neuropatski bol može da se manifestuje kao alodinija, hiperalgezija, spontani bol ili fantomski bol.
2. Tretman taktilne alodinije
Pojam "taktilna alodinija" se tipično odnosi na stanje kod subjekta kod koga se bol izaziva stimulacijom kože (npr., dodirom) koja normalno nije bolna. Predmetni pronalazak obezbeđuje postupak tretiranja taktilne alodinije kod subjekta.
U nekim rešenjima, taktilna alodinija se tretira primenom kod subjekta farmaceutski efikasne količine samog dimera polipeptida mutiranog neublastina koji je konjugovan polimerom.
U povezanim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak tretiranja taktilne alodinije kod subjekta, bilo primenom kod subjekta efikasne količine samo dimera polipeptida neublastina nepotupne dužine koji je konjugovan polimerom, a koji sadrži polipeptide neublastina divljeg tipa nepotpune dužine ili mutirane, uključujući, npr., barem jednu od sekvenci čiji je ID broj 1, 2, 6 - 21 i 36 ili njihove mutirane oblike, bilo primenom kod subjekta efikasne količine polipeptida neublastina sa efikasnom količinom jedinjenja koje izaziva analgeziju, a koje je izabrano iz grupe koju čine opioidi, anti-aritmici, topijski analgetici, lokalni anestetici, antikonvulzivi, antidepresivi, kortikosteroidi i nesteroidni anti-inflamatorni lekovi (NSAID). U poželjnom rešenju, jedinjenje koje izaziva analgeziju je antikonvulziv. U drugom poželjnom rešenju, jedinjenje koje izaziva analgeziju je gabapentin ((1-aminometil)cikloheksan sirćetna kiselina) ili pregabalin (S-(+)-4-amino-3-(2-metilpropil) butanska kiselina).
U nekim rešenjima, dimer polipeptida mutiranog neublastina koji je konjugovan polimerom se primenjuje zajedno sa nekim terapijskim sredstvom, uključujući, bez ograničenja, antikancersko sredstvo ili antivirusno sredstvo. Antikancerska sredstva obuhvataju, bez ograničenja, taksol, taksoter, cisplatin, nokodazol, vinkristin, vindezin i vinblastin. Antivirusna sredstva obuhvataju, bez ograničenja, ddI, DDC, d4T, foskarnet, dapson, metronidazol i izonijazid.
3. Tretman smanjenja gubitka osetljivosti na bol
U drugom rešenju, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za smanjenje gubitka osetljivosti na bol kod subjekta koji boluje od neuropatije. U poželjnom rešenju, neuropatija je dijabetska neuropatija. U poželjnom rešenju, gubitak osetljivosti na bol je gubitak osetljivosti na termalni bol. Predmetni pronalazak obezbeđuje i profilaktički i terapeutski tretman.
Kod profilaktičkog tretmana, dimer polipeptida mutiranog neublastina koji je konjugovan polimerom se primenjuje kod subjekta kod koga postoji rizik za razvoj gubitka osetljivosti na bol; kod takvih subjekata se očekuje da imaju neuropatiju u ranom stadijumu. Tretman neublastinom u takvim okolnostima služi za preventivno lečenje pacijanata sa rizikom.
Kod terapeutskog tretmana, dimer polipeptida mutiranog neublastina koji je konjugovan polimerom se primenjuje kod subjekta kod koga je razvijen gubitak osetljivosti na bol zbog razvoja neuropatije; kod takvih subjekata se očekuje da imaju neuropatiju u kasnom stadijumu. Tretman dimerom polipeptida mutiranog neublastina koji je konjugovan polimerom u takvim okolnostima služi za očuvanje odgovarajuće osetljivosti na bol kod subjekta.
4. Tretman virusnih infekcija i neuropatija udruženih sa virusima
Obezbeđen je profilaktički tretman infektivnih i virusnih neuropatija. Profilaktički tretman je indikovan nakon dijagnostikovanja virusne infekcije i pre pojave neuropatskog bola. Tokom tretmana, dimer polipeptida mutiranog neublastina koji je konjugovan polimerom se primenjuje da bi sprečio pojavu neuropatskog bola, uključujući, bez ograničenja, neuropatski bol udružen sa leprom, Lajmskom bolešću, neuropatski bol udružen sa infekcijom virusom, posebno sa virusom koji je izabran iz grupe koju čine herpes virus (a posebno herpes zoster virus, koji može da izazove postherpetičnu neuralgiju), virus humane imunodeficijencije (HIV) i papiloma virus. U alternativnom rešenju, dimer polipeptida mutiranog neublastina koji je konjugovan polimerom se primenjuje da bi se smanjio intenzitet neuropatskog bola, u slučaju ako se pojavi.
Simptomi akutne virusne infekcije često obuhvataju pojavu osipa. Drugi simptomi obuhvataju, na primer, razvoj konstantnog bola u zahvaćenom području tela, što je uobičajena komplikacija infekcije herpes zosterom (pojasni herpes). Postherpetična neuralgija može da traje mesec dana ili duže, a može i da se pojavi nekolik meseci nakon nestanka simptoma sličnih osipu.
5. Tretman bolne dijabetske neuropatije
Obezbešen je tretman bolne dijabetske neuropatije. Profilaktički tretman dijabetskih neuropatija treba da počne nakon postavljanja inicijalne dijagnoze dijabetesa ili simptoma koj su udruženi sa dijabetesom, a pre pojave neuropatskog bola. Profilaktički tretman bolne dijabetske neuropatije takođe može da započne nakon utvrđivanja da subjekta poseduje rizik za razvoj dijabetesa ili simptoma koj su udruženi sa dijabetesom. Tokom tretmana, dimer polipeptida mutiranog neublastina koji je konjugovan polimerom se primenjuje da bi sprečio pojavu neuropatskog bola. U alternativnom rešenju, dimer polipeptida mutiranog neublastina koji je konjugovan polimerom se primenjuje da bi umanjio ozbiljnost neuropatskog bola koji se već pojavio.
6. Poremećaji nervnog sistema
U daljem rešenju, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak tretiranja ili sprečavanja nastanka poremećaja nervnog sistema kod subjekta (kao što je čovek) primenom kod subjekta kome je to potrebno terapijski efikasne količine polipeptida neublastina koji je konjugovan polimerom, pri čemu preparat sadrži polipeptid neublastina ili polipeptid mutiranog neublastina koji je povezan sa polimerom, ili sadrži kompleks koji obuhvata stabilni, u vodi rastvorljivi konjugovani polipeptid neublastina ili polipeptid mutiranog neublastina, pri čemu je u tom kompleksu polipeptid neublastina ili polipeptid mutiranog neublastina povezan sa polialkilenskim molekulom, kao što je , npr., PEG.
Poremećaj nervnog sistema može biti poremećaj perifernog nervnog sistema, kao što je periferna neuropatija ili sindrom neuropatskog bola. Ljudi predstavljaju poželjne subjekte za tretman.
Dimer polipeptida neublastina koji je konjugovan polimerom prema predmetnom pronalasku je koristan u tretmanu defekta neurona, uključujući, bez ograničenja, oštećene neurone i traumatizovane neurone. Periferni nervi koji su izloženi traumi obuhvataju, bez ograničenja, nerve produžene moždine ili kičmene moždine. Dimeri polipeptida neublastina koji su konjugovani polimerom prema predmetnom pronalasku su korisni u tretmanu neurodegenerativnih bolesti, npr., ishemijskog neuronskog oštećenja mozga; neuropatije, npr., periferne neuropatije, Alchajmerove bolesti, Hantingtonove bolesti, Parkinsonove bolesti, amiotrofične lateralne skleroze (ALS). Takvi dimeri polipeptida neublastina mogu da se koriste u tretmanu oštećenja memorije, npr., oštećenja memorije koje je udruženo sa demencijom.
Dodatni primeri stanja ili oboljenja jesu poremećaji perifernog nervnog sistema, produžene moždine ili kičmene moždine, kao i neuropatije izazvane traumom, neuropatije izazvane hemoterapijom, neuropatije izazvane toksinom, neuropatije izazvane lekom, neuropatije izazvane deficijencijom vitamina, idiopatske neuropatije i dijabetske neuropatije, neuropatski bol udružen sa oštećenjem nerva izazvanim toksinom, oštećenjem nerva izazvanom patogenom, oštećenjem nerav izazvanom inflamacijom ili neurodegeneracijom. Dimera polipeptida neublastina prema predmetnom pronalasku je dodatno koristan u tretmanu neuropatskog bola, u tretmanu taktilne alodinije i smanjenju gubitka osetljivosti na bol udruženim sa neuropatijom.
7. Doziranje
Napred navedeni postupci podrazumevaju primenu kod subjekta, poželjno sistemski, formulacije koja sadrži dimer polipeptida mutiranog neublastina koji je konjugovan polimerom koji je nepotpune ili potpune dužine, u dozi od 0,01 μg/kg do 1000 μg/kg telesne mase subjekta, po dozi. Poželjno je doza u opsegu od 1 μg/kg do 100 μg/kg telesne mase subjekta, po dozi. Poželjnije, doza je u opsegu od 1 μg/kg do 30 μg/kg telesne mase subjekta, po dozi, npr., od 3 μg/kg do 10 μg/kg telesne mase subjekta, po dozi. Terapijski efikasne količine formulacije prema predmetnom pronalasku može da se primene kod subjekta kome je to potrebno u diznim režimima koje određuju stručnjaci, bez nepotrebne eksperimentacije.
8. Primena
Polipeptidni dimer koji se koristi u gore navedenim postupcima može da se primeni pomoću bilo kog sistema za dopremanje, a poželjno preko onog iz grupe koju čine intravenska primena, intramuskularna primena, intrapulmonarna primena, subkutana primena i intraperitonealna primena, a najpoželjnije putem intramuskularne primene, intravenske primene ili subkutane primene. Polipeptdi neublastina koji se koristi u napred navedenim postupcima takođe može da se primeni pomoću intratekalne primene.
Primena dimera polipeptida neublastina koji je konjugovan polimerom može biti, npr., sistemska ili lokalna. Formulacije obuhvataju one koje su pogodne za parenteralnu, kao i za ne-parenteralnu primenu, a specifični načini primene obuhvataju oralnu, rektalnu, bukalnu, topijsku, nazalnu, oftalmičku, subkutanu, intramuskularnu, intravensku, transdermalnu, intratekalnu, intra-artikularnu, intra-arterijsku, subarahnoidnu, bronhijalnu, limfatičku, vaginalnu i intrauterusnu primenu. Formulacije koje su pogodne za primenu u vidu aerosola i parenteralnu primenu, kako lokalno, tako i sistemski, obuhvaćene su obimom zaštite. Poželjne formulacije su one koje su pogodne za subkutanu, intramuskularnu ili intravensku primenu.
9. Dozni režimi
U nekim rešenjima, frekfencija doziranja za dimerni polipeptid prema predmetnom pronalasku podrazumeva primenu formulacije kod subjekta tri puta nedeljno tokom dve nedelje. U cilju optimizacije terapijske efikasnosti, dimerni polipeptid mutiranog neublastina koji je konjugovan sa polimerom se prvo primenjuje u različitim doznim režimima. Jedinična doza i režim doziranja zavise od faktora u koje sapadaju, npr., vrsta sisara koji je imunizovan, njegov imuni status, telesna masa sisara. Tipično, nivoi proteina u tkivu se prate korišćenjem odgovarajućeg testa za ispitivanje, koji je deo kliničkog postupka, npr., da bi se odredila efikasnog datog terapeutskog režima.
Frekfencija doziranja za dimerni polipeptid mutiranog neublastina koji je konjugovan sa polimerom prema predmetnom pronalasku spada u domen kompetencije i kliničke procene ordinirajućeg lekara. Tipično, režim primene se uspostavlja tokom kliničkih studija kojima se definišu optimalni parametri primene. Međutim, stručnjak može da odstupi, kako bi prilagodio režime primene starosnoj dobi subjekta, njegovom zdravstvenom stanju, telesnoj masi, polu i medicinskom statusu. Frekfencija doziranja takođe može da varira između akutnih i hroničnih tretmana za neuropatiju. Dodatno, frekfencija doziranja može da varira u zavisnosti od toga da li je tretman profilaktički ili terapijski.
Predmetni pronalazak je dalje ilustrovan sledećim neograničavajućim primerima.
Primeri
Primer 1: Biološka raspoloživost amino-terminalno pegiliranog neublastina
Primećeno je da se rekombinantni neublastini koji su derivirani iz CHO ćelija i E. coli ćelija brzo uklanjaju iz cirkulacije, ukoliko se primene intravenski kod pacova. Novoi proteina su bili ispod praga za detekciju u serumu nakon subkutane primene. U cilju povećanja biološke raspoloživosti neublastina, konstruisani su pegilirani oblici mutiranog neublastina.
Pošto se lizinski ostaci ne javljaju u sekvenci neublastina, pegilacija specifična za amino-grupu će rezultovati pegilacijom polipeptida neublastina divljeg tipa na njegovom amino-terimalu. Stoga, za svaki molekul dimera neublastina se vezuju dva molekula PEG. Shodno tome, PEG molekuli se prvo direktno usmeravaju na amino-terminal korišćenjem hemijskih reakcija specifičnih za amino grupu. Iznenađujuće, pegilacija neublastina divljeg tipa eksprimiranog u E. coli ćelijama, čak i kada se izvede sa dva molekula PEG od 20 kDa, ispoljava malo poželjnog uticaja na poluživot u cirkulaciji, što ukazuje da mehanizam klirensa prevazilazi efekat produženja poluživota za koji se očekuje da će se postići pegilacijom.
Primer 2: Konstrukcija pegiliranog mutiranog neublastina
Kao sledeća stavka, ispitivana je biološka raspoloživost mutiranih oblika neublastina koji su pegilirani na internim aminokiselinskim ostacima. Dizajnirana je serija od četiri mutanta kod kojih su zamenjeni prirodni ostaci na položajima 14, 39, 68 i 95 (brojano na način koji je prikazan kod sekvence čiji je ID br. 1) lizinskim insertima na navedenim mestima u sekvenci. Ovi lizinski ostaci obezbeđuju alternativna mesta za vezivanje PEG. Ova mesta su izabrana korišćenjem kristalne struklture GDNF (Nat. Struct. Biol. 4: 435 - 8, 1997) kao okvira za identifikaciju površinskih ostataka. Za identifikaciju funkcionalno važnih regiona strukture koji bi trebalo da se izbegavaju, korišćena je studija himere persefina/neublastina (J. Biol. Chem. 275: 3412 - 20, 2000).
U cilju eksprimiranja gena za divlji tip neublastina u E. coli ćelijama, konstruisani su singeni sa nižim sadržajem GC i sa preferiranim kodonima za E. coli. Singeni su klonirani u dva vektora, pET19b i pMJB164, koji je derivat pET19b. U plazmidu pET19b sekvenca koja kodira zreli domen neublastina (NBN113) je direktno fuzionisana sa inicijalnim metioninom. U plazmidu pMJB164, zreli domen neublastina je fuzionisan sa histidinskom oznakom (tj., sa 10 histidinskih ostataka), a od histidinske oznake je razdvojen mestom cepanja pomoću enterokinaze (sekvenca čiji je ID br. 35 i 36). Inicijalni metionin se nalazi ispred histidinske oznake.
Dve mutacije (R39 i R68) su usmerene ka regionu koji, na osnovu distribucije pozitivnih naelektrisanja na površini, može da predstavlja mesto vezivanja za heparin. Ovo mesto verovatno doprinosi brzom klirensu proteina. Treće mesto je usmereno ka položaju N95, koje je prirodno mesto glikozilacije u neublastinu divljeg tipa. Ovo mesto je prirodno modifikovano kompleksnom ugljenohidratnom strukturom. Stoga, očekuje se da modifikacija sa PEG na ovom mestu ne utiče na funkciju. Četvrto mesto (R14) je izabrano u regionu koji nije pokriven bilo kojim drugim modifikacijama. Mutant u kome je asparaginski ostatak na položaju 95 zamenjen lizinom ("N95 mutant") je izabran za ovde opisana ispitivanja.
Konstruisana su četiri različita mutirana pacovska neublastina koja sadrže jednu ili više alteracija u sekvenci divljeg tipa polipeptida pacovskog neublastina. Ovi mutirani neublastini sadrže pojedinačne aminokiselinske supstitucije: R14K, R68K, R39K ili N95K. U Tabeli 1A su masnim slovima prikazani primeri ovih tačkastih mutacija. U nomenklaturi "X1N1X2", X1 označava aminokiselinu polipeptida neublastina divljeg tipa, N1 označava numerički položaj X1 aminokiseline u sekvenci, numerisnao u odnosu na sekvencu čiji je ID br. 1, a X2 označava aminokiselinu kojom je supstituisana aminokiselina divljeg tipa na naznačenom numeričkom položaju N1.
Da bi se konstruisala pacovska N95K neublastinska mutacija, izvedena je na mesto usmerena mutageneza na plazmidu pCMB020, koji kodira pacovski neublastin divljeg tipa. Sekvenca nukleinske kiseline i aminokiselinska sekvenca koju ona kodira pacovskog neublastina divljeg tipa su prikazane ispod:
Tabela 6. Pacovska NBN sekvenca divljeg tipa
1 ATGGAACTGG GACTTGGAGA GCCTACTGCA TTGTCCCACT GCCTCCGGCC
51 TAGGTGGCAA CCAGCCTTGT GGCCAACCCT AGCTGCTCTA GCCCTGCTGA
101 GCAGCGTCAC AGAAGCTTCC CTGGACCCAA TGTCCCGCAG CCCCGCCTCT
151 CGCGATGTTC CCTCGCCGGT CCTGGCGCCC CCAACAGACT ACCTACCTGG
201 GGGACACACC GCACATCTGT GCAGCGAAAG AGCCCTGCGA CCACCGCCGC
251 AGTCTCCTCA GCCCGCACCC CCACCACCGG GTCCCGCGCT CCAGTCTCCT
301 CCCGCTGCGC TCCGCGGGGC ACGCGCGGCG CGTGCAGGAA CCCGGAGCAG
351 CCGCGCACGG GCTACAGATG CGCGCGGCTG CCGCCTGCGC TCACAGCTGG
401 TGCCGGTGAG CGCTCTCGGC CTGGGCCACA GCTCCGACGA GCTGATACGT
451 TTCCGCTTCT GCAGCGGTTC GTGCCGCCGA GCACGCTCCC CGCACGATCT
501 CAGCCTGGCC AGCCTGCTGG GCGCCGGGGC CCTGCGGTCT CCTCCCGGGT
551 CCCGGCCGAT CAGCCAGCCC TGTTGCCGGC CCACTCGCTA TGAGGCAGTC
601 TCCTTCATGG ACGTGAACAG CACCTGGAGA ACCGTGGACC ATCTCTCCGC
651 CACCGCCTGC GGCTGTCTGG GCTGA (sekvenca ID br.25)
1 MELGLGEPTA LSHCLRPRWQ PALWPTLAAL ALLSSVTEAS LDPMSRSPAS
51 RDVPSPVLAP PTDYLPGGHT AHLCSERALR PPPQSPQPAP PPPGPALQSP
101 PAALRGARAA RAGTRSSRAR ATDARGCRLR SQLVPVSALG LGHSSDELIR
151 FRFCSGSCRR ARSPHDLSLA SLLGAGALRS PPGSRPISQP CCRPTRYEAV
201 SFMDVNSTWR TVDHLSATAC GCLG* (sekvenca ID br.26)
Mutagenezom pCM020 korišćenjem oligonukleotida KD3-210 i KD3-211, dobijen je plazmid pCMB027:
KD3-210 5'-GTATCTTTCATGGACGTTATGTTCTACATGGAGAACC-3' (sekvenca ID br.27)
KD3-211 5'-GGTTCTCCATGTAGAACATACGTCCATGAAAGATAC-3' (sekvenca ID br.28)
U plazmidu pCMB027, kodon koji kodira asparagin na položaju 95 je zamenjen kodnom koji kodira lizin.
R14K mutirani neublastin je dobijen zamenom kodona koji kodira arginin na položaju 14 kodonom koji kodira lizin u kodirajućoj sekvenci neublastina plazmida pCMB020. Izvedena je na mesto usmerena mutageneza na plazmidu pCMB020 korišćenjem oligonukleotida KD3-254 i KD3-255:
KD3-254 5'-GCTCGTGCAACGGATGCAAAAGGCTGTCGTCTGCG-3' (sekvenca ID br.29)
KD3-255 5'-CGCAGACGACAGCCTTTTGCATCCGTTGCACGAGC-3' (sekvenca ID br.30)
Dobijeni konstrukt je nazvan pCMB029.
R68K mutirani neublastin je dobijen zamenom kodona koji kodira arginin na položaju 68 kodonom koji kodira lizin u kodirajućoj sekvenci neublastina plazmida pCMB020. Izvedena je na mesto usmerena mutageneza na plazmidu pCMB020 korišćenjem oligonukleotida KD3-258 i KD3-259:
KD3-258 5'-GGAGCCGGAGCACTAAAATCTCCCCCGGGATCTAGACC-3'(sekvenca ID br.31)
KD3-259 5'-GGTCTAGATCCCGGGGGAGATTTTAGTGCTCCGGCTCC-3'(sekvenca ID br.32)
Dobijeni konstrukt je nazvan pCMB030.
R39K mutirani neublastin je dobijen zamenom kodona koji kodira arginin na položaju 39 kodonom koji kodira lizin u kodirajućoj sekvenci neublastina plazmida pCMB020. Izvedena je na mesto usmerena mutageneza na plazmidu pCMB020 korišćenjem oligonukleotida KD3-256 i KD3-257:
KD3-256 5'-GACGAATTAATTAAGTTTCGTTTTTGTTCAGG-3' (sekvenca ID br.33)
KD3-257 5'-CCTGAACAAAAACGAAACTTAATTAATTCGTC-3' (sekvenca ID br.34)
Ekspresija i karakterizacija mutiranog neublastina eksprimiranog u E. coli
Radi ekspresije i prečišćavanja, plazmid koji kodira pacovski polipeptid neublastina N95K je eksprimiran u E. coli u vidu fuzionog proteina obeleženog histidinskom oznakom sa mestom cepanja putem enterokinaze neposredno uz 113-tu aminokiselinu neublastinske sekvence. E. coli ćelije su uzgajane u fermentatoru od 500 l, čime je dobijena pasta od zaleđenih ćelija. Ćelije E. coli su lizirane u APV Gaulin presi, a pacovski neublastin N95K je prikupljen iz nerastvorljive frakcije ispranog ćelijskog detritusa.
N95K mutirani neublastin je ekstrahovan iz ćelijskog detritusa upotrebom guanidin hidrohlorida, ponovo je zauzeo konformaciju, a histidinska oznaka je uklonjena enterokinazom (videti Primer 5). Proizvod je tada podvrgnut hromatografiji na Ni NTA agarozi (Qiagen) i na Backerbound WP CBX katjonskoj izmenjivačkoj smoli.
Tretman proizvoda obeleženog histidinskom oznakom pomoću enterokinaze je rezultovao aberantnim cepanjem proteina na argininu 7 u zreloj sekvenci. Rezultujući neublastinski proizvod bez aminokiselina 1 - 7 (NBN106-N95K) je potpuno aktivan u testu KIRA ELISA i strukturno se ne može razlikovati od zrelog oblika po svojoj prijemčivosti za denaturaciju indukovanu guanidinom, pa je zato korišćen u sledećim koracima rada.
Pacovski mutirani neublastin NBN106-N95K je pegiliran sa u proseku 3,3 PEG molekula po molekulu neublastina korišćenjem kao reaktanta metoksipoli(etilen glikol)-sukcinimidil propionata (SPA-PEG) molekulske mase 10000 Da. Rezultujući pegilirani proizvod je podvrgnut ekstenzivnoj karakterizaciji, uključujući analizu SDS-PAGE, hromatografiju sa ekskluzijom po veličini (SEC), HPLC reverzne faze, matriksom potpomognutu masenu spektrometriju sa laserskom desorpcijom/ jonizacijom (MALD/IMS), mapiranje peptida, procenu aktivnosti u testu KIRA ELISA i određivanje sadržaja endotoksina. Stepen čistoće neublastinskog N95K proizvoda pre pegilacije, mereno pomoću SDS-PAGE i SEC, veća je od 95%. Neublastinski N95K proizvod je migrirao u neredukcionim uslovima kao dimer, što je konzistentno sa njegovom predviđenom strukturom. Nakon pegilacije, rezultujući proizvod se sastoji od serije modifikovanih adukata koji sadrže: 2 PEG po molekulu, što predstavlja 5% proizvoda; 3 PEG po molekulu, što predstavlja 60% proizvoda; 4 PEG po molekulu, što predstavlja 30% po molekulu; kao i nekoliko minornih formi veće molekulske mase. U pegiliranom uzorku nije bilo traga agregatima. Rezidualni nivoi nemodifikovanog neublastina u proizvodu su ispod granica kvantifikacije. Sadržaj endotoksina ovog materijala je rutinski manji od 1 EU/mg. Specifična aktivnost pegiliranog neublastina mereno KIRA ELISA je 10 nM. Pegilirani proizvod je formulisan u konc. od 1,1 mg/ml u PBS, pH vrednost 6,5. Materijal koji ima sličnu potenciju kao i neublastin divljeg tipa (NBN113) može da se obezbedi u vidu zamrznute tečnosti, koja se skladišti na -70 °C.
Polipeptidi mutiranog neublastina R14K, R39K i R68K se eksprimiraju u ćelijama E. coli i mogu da se podvrgnu istim postupcima prečišćavanja, pegilacije i procene funkcije kao što je opisano gore za neublastin NBN106-N95K.
Dobijanje pegiliranog mutiranog neublastina NBN106-N95K
Zapremina od 230 ml ponovo konformisanog pacovskog N95K mutiranog neublastina (2,6 mg/ml) koji je proizveden u ćelijama E. coli i koji je uskladišten na 4 °C u 5 mM natrijum fosfatu, pH vrednost 6,5, i u 100 mM NaCl, razblažena je sa 77 ml vode, 14,4 ml 1 M HEPES, pH vrednost 7,5 i 2,8 g (10 mg/ml konačna konc.) PEG SPA od 10000 Da (Shearwater Polymers, Inc.). Uzorak je inkubiran na sobnoj temperaturi tokom 4 časa u mraku, a potom je tretiran sa 5 mM imidazolom (konačna konc.), filtriran je i uskladišten tokom noći na 4 °C. Proizvod je dobijen u vidu dve serije, od kojih jedna sadrži 130 ml N95K, a druga sadrži 100 ml N95K materijala. Pegilirani neublastin je prečišćen iz reakcione smeše na Fractogel EMD SO3 - (M) koloni (EM Industries). Kolona je radila na sobnoj temperaturi. Svi puferi su pripremljeni kao formulacije bez pirogena. U reakcionu smešu je dodat natrijum hlorid u konačnoj konc. od 87 mM, a uzorak je prenet u Fractogel kolonu od 45 ml (unutrašnji prečnik 5 cm).
Kolona je isprana jednom zapreminom rastvora 5 mM natrijum fosfata, pH vrednosti 6,5, i 80 mM NaCl, koja odgovara zapremini kolone rastvora, a zatim tri puta sa jednakim zapreminama rastvora 5 mM natrijum fosfata i 50 mM NaCl, koje odgovaraju zapremini kolone. Smola je potom prebačena na kolonu prečnika 2,5 cm, pa je pegilirani neublastin eluiran sa kolone ispiranjem šest puta sa 10 ml rastvora koji sadrži 5 mM natrijum fosfat, pH vrednost 6,5, 400 mM NaCl, tri puta sa 500 ml NaCl i 6 pura sa 600 mM NaCl. Frakcije dobijene eluiranjem su analizirane na sadržaj proteina pomoću merenja apsorbancije na 280 nm, a zatim je određivan stepen modifikacije pomoću SDS - PAGE. Izabrane frakcije su prikupljene, filtrirane kroz filter od 0,2 μm i razblažene sa vodom do konc. od 1,1 mg/ml pegiliranog pacovskog neublastina. Nakon određivanja nivoa endotoksina u pojedinačnim serijama, one su prikupljene i ponovo filtrirane kroz membranu sa porama od 0,2 μm. Krajnji materijal je podeljen na jednake delove i uskladišten na -70 °C.
UV spektar prečišćenog pegiliranog mutiranog neublastina NBN106-N95K
UV spektar (240 - 340 nm) pegiliranog NBN N95K je određen na čistom uzorku. Uzorak je analiziran u triplikatu. Pegilirani uzorak pokazuje maksimum apsorbancije na 275 - 277 nm i minimum apsorbancije na 247 - 249 nm. Ovaj rezultat je konzistentan sa onim koji je zabeležen za intermedijarni materijal. Koncentracija proteina pegiliranog proizvoda je procenjena na osnovu spektra korišćenjem koeficijenta ekstinkcije Σ2800,1%=0,50. Koncentracija proteina pegiliranog neublastinskog materijala je 1,1 mg/ml. U uzorku nije prisutna zamućenost, što je očigledno na osnovu nedostatka apsorbancije na 320 nm.
Karakterizacija pegiliranog mutiranog neublastina NBN106-N95K pomoću SDS - PAGE
Jednake količine pegiliranog neublastina koji sadrži 3, 1,5, 0,75 i 0,3 μg proizvoda su podvrgnute SDS - PAGE na gelu sa gradijentom 4 - 20% (Owl). Gel je obojen sa Coomassie brilliant blue R-250. Markeri za molekulsku masu (GIBC - BRL) su primenjeni paralelno.
SDS-PAGE analiza pegiliranog mutiranog neublastina NBN106-N95K u neredukujućim uslovima je otkrila seriju traka koje odgovaraju modifilkacijama sa 2, 3, 4 i više od 4 PEG molekula po molekulu neublastina. Glavna traka sa prividnom masom od 98 kDa sadrži modifikovani oblik sa 3 PEG po molekulu. U prečišćenom pegiliranom proizvodu, nepegilirani neublastin nije detektovan. Prisustvo smeše proizvoda sa 2, 3 i 4 prikačenih PEG je potvrđeno MALDI masenom spektrometrijskom analizom. Odnos proizvoda koji sadrže 2, 3 i 4 PEG je određen pomoću denzitometrije i iznosi 7, 62 i 30 procenata u odnosu na ukupni materijal, respektivno.
Karakterizacija pegiliranog mutiranog neublastina NBN106-N95K pomoću hromatografije sa ekskluzijom po veličini
Pegilirani mutirani neublastin NBN106-N95K je podvrgnut hromatografiji sa ekskluzijom po veličini na analitičkoj Superose 6 HR1O/30 FPLC koloni korišćenjem kao mobilne faze 5 mM MES, pH vrednosti 6,5, i 300 mM NaCl.Protok kroz kolonu je 20 ml/h. Frakcije dobijene eluiranjem su praćene pomoću apsorbancije na 280 nm. Pegilirani mutirani neublastin je eluiran kao pojedinačna maksimalna vrednost sa prividnom molekulskom masom od oko 200 kDa, što je konzistentno sa velikom hidrodinamskom zapreminom PEG. Nije primećen trag agregata. Slobodni neublastin, koji se eluira sa prividnom molekulskom masom od oko 30 kDa nije detektovan u preparatu.
Analiza pegiliranog mutiranog neublastina NBN106-N95K pomoću HPLC reverze faze
Pegilirani mutirani neublastin NBN106-N95K je podvrgnut HPLC reverzne faze na Vydac C4 (5 μm, 1 × 250 mm) koloni. Kolona je razvijena korišćenjem 60 mm gradijenta od 40 do 60% B (pufer A: 0,1% TFA, pufer B: 75% acetonitril / 0,085% TFA). Efluent kolone je praćen pomoću apsorbancije na 214 nm, a frakcije su prikupljene zbog naknadne analize. Pegilirani NBN106-N95K je frakcionisan na svoje različite di (60,5 mm), tri (63,3 mm) i tetra (67,8 mm) pegilirane komponente pomoću HPLC reverzne faze na C4 koloni. Relativni intenziteti maksimalnih vrednosti sugerišu da je odnos komponenti 5,4, 60,5 i 30,1%, respektivno. Identite maksimalnih vrednosti je potvrđen pomoću MALDI - MS. Nije bilo traga nepegiliranom NBN106-N95K (eluati na 5 - 15 mm) u proizvodu.
Analiza pegiliranog mutiranog neublastina NBN106-N95K pomoću masene spektrometrije
Pegilirani mutirani neublastin NBN106-N95K je desalinizovan na C4 Zip Tip i analiziran je masenom spektrometrijom na Voyager-DETM STR (PerSeptive Biosystems) masenom spektrometru za matriksom potpomognutu masenu spektrometriju sa laserskom desorpcijom/ jonizacijom sa vremenom proleta (MALD/TOF) korišćenjem sinapinske kiseline kao matriksa. Zapremina od 0,5 μl prečišćenog proteina je pomešana sa 0,5 μl matriksa na ploči za ciljanje. Masena spektrometrija pegiliranog mutiranog neublastina NBN106-N95K je otkrila jedinično i dvostruko naelektrisane oblike tri adukta. Primećene mase od 43803 Da, 54046 Da i 64438 Da su konzistentne sa modifikacijama od 2, 3 i 4 PEG po molekulu.
Analiza pegiliranog mutiranog neublastina NBN106-N95K pomoću mapiranja peptida
Specifičnost reakcije pegilacije je ocenjena pomoću mapiranja peptida. Pegilirani neublastin je razdvojen na di, tri i tetra pegilirane komponente, koje su potom redukovane, alkilirane i dalje razdvojene na njihove jednolančane komponente pomoću HPLC na C4 koloni. Ove komponente, kao i redukovani i alikilirane nepegilirani NBN106-N95K kao kontrola su digestovani pomoću Asp-N proteinaze, a dobijeni proizvodi cepanja su frakcionisani pomoću HPLC reverzne faze na Vydac C18 (5 μm, 1 × 250 mm) koloni uz upotrebu 60 mm gradijenta od 0 do 60% B (pufer A: 0,1% TFA, pufer B: 75% acetonitril / 0,085% TFA). Kolona je praćena pomoću apsorbancije na 214 nm.
Sekvenca pacovskog neublastina sadrži pet internih ostataka asparaginske kiseline, pa se zato očekuje daće pokazati jednostavan profil cepanja nakon digestije endoproteinazom Asp-N. Sve maksimalne vrednosti proizvoda digestije pacovskog N95K sa Asp-N su identifikovane masenom spektrometrijom i/ili Edman-ovim amino-terminalnim sekvencioniranjem, tako da mapa peptida može da se koristi kao jednostavno oruđe za ispitivanje navedenih mesta modifikacije na osnovu prisustva ili odsustva određene maksimalne vrednosti. Identite različitih maksimalnih vrednosti je sažeto prikazan u Tabeli 7.
Tabela 7.
S obzirom da je neublastin prirodno homodimer, pacovski mutirani neublastinski NBN106-N95K proizvod sadrži četiri potencijalna mesta za pegilaciju i to dva aminoterminalna amina iz svakog od lanaca i dva N95K mesta koja su projektovana u konstruktu. Na peptidoj mapi di-pegiliranog lanca, PEG modifikacijom je izmenjena samo maksimalna vrednost koja sadrži peptid sa N95K mutacijom. Nijedna od preostalih maksimalnih vrednosti nije promenjena PEG modifikacijom. Podaci dobijeni mapiranjem tako ukazuju da je PEG podjedinica specifično povezana za ovaj peptid, ali ne i za druge peptide koji su ispitivani. Drugo potencijalno mesto vezivanja je amino-terminal peptida koji je nakon digestije dugačak samo tri aminokiseline i on nije detektovan tokom mapiranja peptida. Pretpostavlja se da je dodatni molekul PEG prikačen za ovo mesto. Sa ovim zapažanjem je konzistentan mali procenat pacovskog mutiranog neublastina N95K koji nije nepotpun i koji sadrži zrelu Ala1 sekvencu. Ovaj peptid se eluira na 30 μm i vidljiv je na mapi peptida dobijenoj digestijom nepegiliranog proizvoda, ali je odsutan u proizvodima digestije pegiliranog mutiranog neublastina NBN106-N95K.
Primer 3: Procenjivanje potencije interno pegiliranog mutiranog neublastina NBN106-N95K pomoću ELISA sa aktivacijom receptor kinaze (KIRA)
Potencija pegiliranog mutiranog pacovskog neublastina je merena korišćenjem od neublastina zavisne aktivacije / fosforilacije c-Ret, kao reportera za aktivnost neublastina u ELISA koja je specifična za prisustvo fosforilisanog RET. Ćelije NB41A3-mRL3 (ćelije ćelijske linije adherentnog mišijeg neuroblastoma koje eksprimiraju RET i GFRα3) su nanete na ploču od 24 polja u konc. od 105 ćelija/polju u Dulbecco-vooj modifikovanoj Eagle podlozi (DMEM), uz dodatak 10% fetalnog govežeg seruma, pa su kultivisane tokom 18 časova na 37 °C uz 5% CO2.
Ćelije su isprane sa PBS i tretirane serijskim razblaženjima neublastina u 0,25 ml DMEM tokom 10 minuta na 37 °C i uz 5% CO2. Svaki uzorak je analiziran u duplikatu. Ćelije su isprane sa 1 ml PBS i lizirane su tokom 1 časa na 4 °C sa 0,30 ml 10 mM Tris HCl, pH vrednost 8,0, 0,5% Nonidet P40, 0,2% natrijum deoksiholatom, 50 mM NaF, 0,1 mM Na3VO4 i1 mM fenilmetilsulfonil fluoridom uz blago mešanje ploča. Lizati su dalje tretirani ponavljanim pipetiranjem, nakon čega je 0,25 ml uzorka prebačeno na ELISA ploču od 96 polja koja je obložena sa 5 μg/ml anti-RET mAt (AA.GE7.3) u 50 mM karbonatnom puferu, pH vrednost 9,6, na 4 °C tokom 18 časova, a potom je reakcija blokirana na sobnoj temp. tokom 1 časa upotrebom pufera za blokiranje (20 mM Tris HCl, pH vrednost 7,5, 150 mM NaCl, 0,1% Tween-20 (TBST) koji sadrži 1% normalnog mišijeg seruma i 3% goveđeg serumskog albumina).
Nakon dva časa inkubacije na sobnoj temperaturi, polja ploče su isprana 6 puta sa TBST. Fosforilisani RET je detektovan pomoću inkubacije polja ploče na sobnoj temperaturi tokom 2 časa sa anti-fosfotirozin 4G10 antitelom koje je konjugovano sa peroksidazom rena (HRP) u konc. od 2 μg/ml u puferu za blokiranje, zatim su polja isprana 6 puta sa TBST, pa je određena aktivnost HRP na 450 nm upotrebom reagensa za kolorimetrijsku detekciju. Merene su vrednosti apsorbancije uzoraka iz polja koja su tretirana lizatom ili puferom za lizu, pa je vrednost koja je korigovana za vrednost pozadinskog signala grafički prikazana kao funkcija koncentracije neublastina koji je prisutan u aktivacionoj smeši. Potencija pegiliranog mutiranog neublastina (3(,4) × 10 kDa PEG NBN106-N95K) u KIRA ELISA se ne razlikuje od potencije NBN113 materijala divljeg tipa (Tebal 8). Dva ciklusa zamrzavanja i odmržnjavanja nije ispoljilo dejstvo na potenciju, a nakon ovog tretmana nije bilo značajnijeg porasta zamućenosti uzorka, što ukazuje da su uzorci mogli sa sigurnošću odmrznuti za ispitivanje. U nezavisnim studijama koje procenjuju aktivnost proizvoda sa tri ili četiri PEG od 10 kDa po molekulu nezavisno, određeno je da je adukt sa tri PEG potpuno aktivan, dok proizvod sa četiri PEG poseduje smanjenu potenciju (Tabela 8). Ovi podaci pokazuju da 3(,4) × 10 kDa PEG NBN106-N95K i 3 × 10 kDa PEG NBN106-N95K aktiviraju RET u sličnoj meri i sa istom zavisnošću od doze kao i nemutirani neublastin (divlji tip) NBN113. Međutim, iako 4 × 10 kDa PEG NBN106-N95K aktivira RET u sličnoj meri kao i nemutirani NBN113 (divlji tip), 4 × 10 kDa PEG NBN106-N95K je otprilike 10 puta manje potentan od nemutiranog NBN113 (divlji tip) u aktivaciji RET. Procenje vrednosti EC50 su prikazane u Tabeli 8.
Primer 4: Farmakokinetska ispitivanja interno pegiliranog mutiranog pacovskog neublastina NBN106-N95K kod pacova i miševa
Ispitivana su farmakokinetska svojstva različitih pegiliranih i nepegiliranih mutiranih neublastinskih proizvoda na pacovskom i mišijem modelu (videti Tabelu 8 za sažeto prikazane rezultate).
Navedeni podaci otkrivaju pegilacija pacovskog mutiranog neublastina NBN106-N95K sa 3,3 PEG od 10000 Da ispoljava značajan efekat na poluživot i biološku raspoloživost neublastina. Nakon i.v. primene u dozi od 1 mg/kg kod Sprague Dawley pacova, nakon 7 minuta su detektovani maksimalni nivoi pegiliranog mutiranog neublastina od 3000 ng/ml, a nakon 24 časa su detektovani nivoi od 700 ng/ml, da ni nakon 72 časa bili registrovani nivoi od 100 ng/ml. Nasuprot tome, nakon i.v. primene nepegiliranog mutiranog neublastina N95K u dozi od 1 mg/kg, nakon 7 minuta su detektovani novoi od 1500 mg/ml, ali su posle toga nivoi brzo opali do 70 ng/ml nakon 3 časa, a nisu bili detektabilni nakon 7 časova. Efekti pegilacije su bili još izraženiji kod životinja koje su tretirane pegiliranim neublastinom putem subkutane primene.
Nakon primene doze od 1 mg/kg s.c., cirkulišući nivoi pegiliranog neublastina su dostigli maksimum od 200 ng/ml nakon 24 časa i ostali su na ovom nivou tokom trajanja trodnevne studije. Nasuprot tome, neublastin nije moga da se detektuje u bilo kom vremenskom trenutku nakon primene nepegiliranog mutiranog neublastina.
Analiza uzoraka pegiliranog N95K se komplikuju u prisustvu adukata koji sadrže 2, 3 i 4 PEG po molekulu, pošto svaki od njih pokazuje različiti pK profil. U ranim pK ispitivanjima, korišćeni su miševi da se pospeši ispitivanje između različitih kandidata i načina primene. Ispitivanja na miševima je otkrilo dramatične razlike u biološkoj raspoloživosti kandidata. Međutim, kada je kod pacova ocenjivan adukt sa 3,3 PEG od 10 kDa, nađeno je da on poseduje manju biološku rapsoloživost kod pacova, nego kod miševa. Ova razlika u biološkoj raspoloživosti je posebno naznačena nakon i.p. primene. Nivoi kod miševa su dostizali 1600 ng/ml nakon 7 časova i zadržavali su se na 400 ng/ml nakon 24 časa. Nasuprot tome, nivoi kod pacova su bili konstantno 100 ng/ml tokom 4 - 48 časova.
Dva iznenađujuća i neočekivana rezultata su se pojavila tokom pK studija, a prikazani su Tabeli 8: 1) pegilacija amino-terminalnih aminokiselina neglikoziliranog neublastina nije dovoljna da se značajno poveća poluživot u serumu; i 2) pegilacija amino-terminalnih aminokiselina neublastina, zajedno sa modifikacijama (npr., pegilacija ili glikozilacija) aminokiseline 95 je dovoljna da se značajno poveća poluživot proteina u serumu. Na primer, glikozilirani NBN104 (CHO) nema detektabilni poluživot nakon s.c. primene; međutim, glikozilirani 1 × 20 kDa PEG NBN104 (CHO) ima dugi poluživot u serumu nakon s.c. primene. Slično tome, 2 × 20 kDa PEG NBN113 ima kratki do umereno dugi poluživot u serumu nakon s.c. primene; međutim, glikozilirani 2 × 20 kDa PEG NBN113 (CHO) ima dugi poluživot u serumu nakon s.c. primene. Ovi rezultati ukazuju da konjugacija aminoterminalnih aminokiselina neublastina sa polimerom, zajedno sa konjugacijom polimerom interne aminokiseline (npr., na polo+aju 95) ili glikozilacija interne aminokiseline (npr., na položaju 95) rezultuje značajnim produženjem poluživota u serumu nakon sistemske primene.
I neublastin divljeg tipa i mutirani neublastin N95K su ponovo konformisani i prečišćeni do stepena većeg od 95% radi testova efikasnosti u modelu STZ dijabetične neuropatije kod pacova. Neublastin divljeg tipa je formulisan za direktnu primenu u ovom ispitivanju na životinjama, dok je N95K pripremljen za pefilaciju sa PEG-SPA od 10 kDa. Kako bi se postiglo ponovno konformisanje i prečišćavanje, razvijen je postupak ponovnog konformisanja sa korišćenjem hromatografije sa ekskluzijom po veličini (SEC), koji omogućava renaturaciju neublastina iz inkluzionih tela E. coli ćelija u velikim količinama i u velikim koncentracijama. Kao dodatak SEC, korišćeni su i koraci Ni - NTA i CM hromatografije na silika koloni, u cilju povećavanja krajnjeg stepena čistoće proteina. Proteini su podvrgnuti ekstenzivnoj karakterizaciji, uključujući upotrebu analize pomoću SDS-PAGE, hromatografije sa ekskluzijom po veličini, ESMS, procene aktivnosti pomoći KIRA ELISA i određivanja sadržaja endotoksina. SDS-PAGE i SEC krajnjih proteinskih proizvoda ukazuju na stepen čistoće koji je veći od 95%. Nivo endotoksina za svaki od proizvoda je <0,2 EU/mg. Specifična aktivnost oba proteina u KIRA ELISA je oko 10 nM. Neublastin divljeg tipa je formulisan u konc. od 1,0 mg/ml, a N95K je formulisan u konc. 2,6 mg/ml u fiziološkom rastvoru puferovanom fosfatom (PBS), pH vrednost 6,5. Neublastin divljeg tipa je podeljen na jednake delove u kivete od po 15 ml i uskladišten je zamrznut na -70 °C, dok je N95K podvrgnut pegilaciji pre podele u jednake delove i zamrzavanja.
Primer 5: Ponovno konformisanje i prečišćavanje neublastina divljeg tipa i mutiranog N95 neublastina
Oba oblika neublastina su eksprimirana u ćelijama E. coli kao fuzioni proteini sa histidinskom oznakom sa mestom cepanja enterokinazom koje je neposredno uz početnu a.k. zrele aminokiselinske sekvence od 113 a.k. Bakterije koje eksprimiraju neublastin divljeg tipa (1,8 kg ćelijskog detritusa) ili neublastin N95K (2,5 kg ćelijskog detritusa) je podvrgnuto lizi u 2 l PBS upotrebom APV GAulin prese. Nakon centrifugiranja (10000 o/min) u cilju usitnjavanja inkluzionih tela, odbačeni su supernatanti iz svakog od preparata. Usitnjena inkluziona tela su isprana dva puta puferom (0,02 M Tris-HCl, pH vrednost 8,5, 0,5 mM EDTA), a zatim su isprana dva puta istim puferom koji sadrži Triton X-100 (2%, v/v), a potom još dva puta puferom bez detergenta. Oba uzorka detritusa su solubilizovana upotrebom 6 M guanidin hidrohlorida, 0,1 M Tris pH vrednosti 8,5, 0,1 M DTT i 1 mM EDTA. Da bi se pospešio proces solubilizacije, svaki od detritusa je podvrgnut homogenizaciji korišćenjem politron homogenizatora, a potom je mešan tokom noći na sobnoj temperaturi. Solubilizovani proteini su klarifikovani centrifugiranjem pre denaturacione hromatografije na Superdex 200 koloni (5,5 l kolona, ekvilibrisana smešom 0,05 M glicina/H3PO4, pH vrednost 3,0, sa 2 M guanidin-HCl), pri protoku od 20 ml/min.
Denaturisani neublastin je identifikovan pomoću SDS-PAGE. Frakcije koje sadrže neublastin divljeg tipa ili N95K neublastin su prikupljene i koncentrovane do zapremine od oko 250 ml korišćenjem Amicon koncentratora za ćelije sa mešanjem od 2,5 l. Nakon filtracije u cilju uklanjanja svog taloga, koncentrovani protein je podvrgnut renaturacionoj hromatografiji na Superdex 200 koloni ekvilibrisanoj sa 0,1 M Tris-HCl, pH vrednost 7,8, 0,5 M guanidin-HCl, 8,8 mM redukovanog glutationa i 0,22 mM oksidovanog glutationa. Kolona je razvijena korišćenjem 0,5 M guanidin-HCl pri protoku od 20 ml/min. Frakcije koje sadrže renaturisani neublastin divljeg tipa ili neublastin N95K su identifikovane pomoću SDS-PAGE, prikupljene su i uskladištene na 4 °C do trenutka kada je potrebno ukoniti histidinsku oznaku.
Alternativni postupak ponovnog konformisanja neublastina divljeg tipa i mutiranog N95K neublastina pomoću razblaživanja
Da bi se neublastin ponovo konformisao pomoću razblaživanja, solubilizovani protein je brzo razblažen u puferu za ponovno konformisanje (0,5 M guanidin - HCl, 0,35 M lL-arginin, 50 mM kalijum fosfat (pH vrednost 7,8), 0,2 mM redukovanog glutationa, 1 mM oksidovanog glutationa i 0,1% Tween-80) u krajnjoj konc. od 0,1 mg/ml, pa je inkubiran na sobnoj temp. tokom 48 časova bez mešanja. Ponovo konformisani neublastin je potom koncentrovan 25 puta, pomešan sa 40 mM imidazolom i prenet na kolonu za hromatografiju koja sadrži Ni - NTA agarozu, kako bi se proizvod dalje koncentrovao i da bi se eliminisali proteini ćelije domaćina. Kolona je isprana zapreminom od 10 zapremina kolone sa puferom za ispiranje (40 mM imidazol, 0,5 M guanidin - HCl). Potom je neublastin eluiran iz smole sa 0,2 M imidazolom i 0,5 M guanidin - HCl.
Koncentrovanje neublastina koji je ponovo konformisan na koloni pomoću Ni-NTA hromatografije
Neublastin koji je ponovo konformisan na koloni je uskladišten na 4 °C tokom najmanje 24 časa pre nastavka prečišćavanja u cilju pospešivanja formiranja disulfidnih mostova izmežu monomera neublastina. Tokom ovog vremena, nastao je talog koji je uklonjen filtracijom kroz poletar sulfonsku (PES) filtersku jedinicu od 0,2 μm. Kako bi se umanjilo nespecifično vezivanje, rastvor proteina je pomešan sa 20 mM imidazolom pre nanošenja na Ni - NTA (Qiagen) kolonu od 100 ml koja je ekvilibrisana puferom za kolonu (0,5 M guanidin i 20 mM imidazol), pri protoku od 50 ml/min. Nakon nanošenja proteina, kolona je isprana do osnovne linije korišćenjem istog pufera. Neublastin je eluiran sa smole korišćenjemotprilike 300 ml pufera za eluiranje koji sadrži 0,5 M guanidin - HCl i 0,4 M imidazol. Nakon eluiranja, neublastin je dijaliziran tokom noći (korišćenjem tubinga za dijalizu od 10 kDa) na sobnoj temp. nasuprot deset zapremina 5 mM HCl. Dijaliza pospešuje hidrolizu kontaminanata i smanjuje konc. guanidin - HCl i imidazola do 0,05 M i 0,04 M, respektivno.
Skidanje histidinske oznake putem lizil endopeptidaze ili enterokinaze
Sledećeg dana, sav talog koji je nastao tokom dijalize je uklonjen filtracijom. Sledeći koraci prečišćavanja su primenjeni na neublastin koji je rekonformisan na koloni i pomoću razblaživanja. Uzorak proteina je formulisan kao 0,1 M rastvor NaCl dodavanjem NaCl iz matičnog rastvora od 5 M do krajnje konc. soli, uključujući preostali guanidin - HCl do otprilike 150 mM. Ova konc. je potvrđena korišćenjem merača provodnosti. Dodatno, dodat je 1 M HEPES, pH vrednost 7,8, do krajnje konc. od 25 mM. Da bi se uklonila His oznaka, divljem tipu neublastina je dodata lizil endopeptidaza, a N95K mutiranom neublastinu je dodata enterokinaza, oba enzima u odnosu od oko 1 : 300 u odnosu na neublastin. Za mutirani N95K neublastin je korišćena enterokinaza umesto lizil endopeptidaze zbog dodatnog mesta cepanja proteazom kod mutiranog proteina na položaju Lys95. Uzorci su mešani na sobnoj temp. tokom 2 časa, a razgradnja je praćena pomoću SDS-PAGE.
Uklanjanje histidinske oznake pomoću Ni - NTA hromatografije
Neublastin tretiran proteazom je nanet na Ni - NTA kolonu od 100 ml ekvilibrisanu sa 0,5 M guanidin - HCl i 20 mM imidazolom, pri protoku od 50 ml/min. Kolona je isprana do osnovnog nivoa istim puferom. Sav proteinski sadržaj prikupljen ispiranjem je prikupljen, a posebno proteinska frakcija koja sadrži neublastin bez histidinske oznake.
CM silika hromatografija
Nakon Ni-NTA hromatografije, protein je odmah podvrgnut daljem prečišćavanju na CM silika smoli. CM silika kolona od 20 ml je ekvilibrisana nanošenjem pufera (5 mM fosfat, pH vrednost 6,5, 150 mM NaCl) zajedno sa neublastimon, pri protoku od 20 ml/min. Kolona je isprana zapreminom pufera za sipiranje (5 mM fosfat, pH vrednost 6,5, 400 mM NaCl) koja odgovara dvadeset zapremina kolone, a protein je eluiran puferom za eluiranje koji sadrži 5 mM fosfat, pH vrednost 6,5, i 1 M NaCl. Eluirani protein je dijaliziran tokom noći nasuprot samog fosfata, kako bi se konc. soli smanjila na 10 mM za N95K i na 150 mM za neublastin divljeg tipa. Oba uzorka su filtrirana kroz PES filtersku jedinicu od 0,2 μm, analizirana su pomoću SDS-PAGE i uskladištena su na 4 °C do trenutka kada je potrebna dalja karakterizacija i/ili pegilacija.
Preparati proteina neublastina divljeg tipa i utiranog N95K neublastina su podvrgnuti analizi UV spektra, kako bi se ocenila njihova apsorbancija na 280 nm. Korišćenjem mikro kvarcne kivete i blankingom nasuprot samog pufera, zapremina od 100 μl neublastina divljeg tipa ili N95K mutiranog neublastina je konstantno skenirana od 230 nm do 330 nm korišćenjem Bekman spektrofotometra. Na osnovu ove analize, određeno je da je konc. neublastina divljeg tipa 1,1, mg/ml, a konc. N95K mutiranog neublastina 2,6 mg/ml (A280 nm - E0,1%=0,5 je korišćena za sve proteine). Manje od 1% istaloženog materijala je identifikovano na osnovu apsorbancije na 330 nm.
Da bi se procenio stepen čistoće oba proteinska preparata, svaki uzorak (0,5 mg) je podvrgnut hromatografiji sa ekskluzijom po veličini na 16/30 Superdex 75 koloni. Kolona je ekvilibrisana sa 5 mM fosfatom, pH vrednost 6,5, koji sadrži 400 mM NaCl i razvijena je uz protok od 1,5 ml/min. Na osnovu apsorbancije na 280 nm, i preparat neublastina divljeg tipa i preparat N95K mutiranog neublastina su migrirali u vidu pojedinačne maksimalne vrednosti sa očekivanom molekulskom masom (23 - 24 kDa) i nisu bili značajnije kontaminirani bilo kojim drugim proteinima.
Protein neublastina divljeg tipa i N95K mutirani neublastin su redukovani u 2,5 M guanidin - HCl, 60 mM Tris, pH vrednosti 8,0 i 16 mM DTT. Redukovani uzorci su desalinizirani prevođenjem preko C4 kolone i analizirani su on-line pomoću ESMS korišćenjem trostrukog kvadropolnog instrumenta. Neobrađeni ESMS podaci su razvijeni pomoću MaxEnt programa, kako bi se dobili maseni spektri. Ovaj postupak omogućava signalima višestrukih naelektrisanja da kolabiraju u vidu jedne maksimalne vrednosti koja direktno odgovara molekulskoj masi izraženoj u kilo Daltonima (kDa). Razvijeni maseni spektar za neublastin divljeg tipa pokazuje da je predominantna vrsta ona sa m.m. od 12046 Da, što se slaže sa predviđenom molekulskom masom od 12046,7 Da za oblik proteina od 113 aminokiselina. Takođe je primećena manja komponenta (12063 Da) koja sugeriše prisustvo oksidovanog proizvoda. U uzorku proteina N95K mutiranog neublastina su identifikovane tri maksimalne vrednosti. Glavna komponenta pokazuje prividnu molekulsku masu od 11345 Da , što se slaže sa predviđenom molekulskom masom proteina od 106 aminokiselina. Dve druge maksimalne vrednosti imaju mase od 11362 i 12061 Da, što sugeriše oksidaciju N95K i prisustvo oblika od 113 aminokiselina, respektivno.
Prisustvo oblika od 106 i 113 aminokiselina u preparatu proteina N95K mutiranog neublastina se pripisuje digestiji enterokinazom. Ova proteaza dobijena od Biozyme-a je prirodni enzimski preparat koji je prečišćen iz intestinalne mukoze govečeta i saopšteno je da poseduje malu kontaminaciju tripsinom (0,25 ng tripsina po μg enterokinaze). Stoga, moguće je da tripsin deluje naprotein N95K mutiranog neublastina na strani karboksi-terminala Arg7 čime stvara predominanti oblik od 106 aminokiselina. Sa druge strane, lizil endopeptidaza koja se koristi za digestiju neublastina divljeg tipa ispoljava samo prostu proteaznu aktivnost delujući na karboksi-terminalnu stranu lizinskog ostatka koji se nalazi u okviru histidinske oznake, kako bi se dobio zreli oblik neublastina od 113 aminokiselina. Oblici neublastina od 106 i 113 aminokiselina su podjednako aktivni u svim ispitivanjima i ponašaju se slično u testovima stabilnosti sa guanidin - HCl.
Aktivnost neublastina je određena na osnovu sposobnosti ovog proteina da stimuliše c-RET fosforilaciju u NB41A3-mRL3 ćelijama uz upotrebu KIRA ELISA koji je opisan u Primeru 3. Fosforilisani RET je detektovan inkubacijom (2 časa) uhvaćenog receptora sa anti-fosfotirozinskim antitelom konjugovanim sa peroksidazom rena (4G10 At; 0,2 μg/polju). Nakon inkubacije, polja su isprana šest putas sa TBST, a aktivnost HRP je detektovana na 450 nm kolorimetrijskim testom. Merene su vrednosti apsorbancije za polja koja su tretirana lizatom ili samo puferom za lizu, korigovane su za vrednost pozadinskog signala, a podaci su grafički prikazani kao funkcija koncentracije neublastina koji je prisutan u smeši za aktivaciju. Podaci pokazuju da prisustvo neublastinskih polipeptida rezultuje pojavi fosforilisanog RET, što ukazuje da je prečišćeni neublastin aktivan u ovom testu.
Primer 6: Dobijanje konjugata serumskog albumina i neublastina
Pacovski neublastin divljeg tipa u konc. od 1 mg/ml u PBS je tretiran sa 1 mM sulfo-SMCC (Perce) i desalinizovan je kako bi se uklonio višak veznika za ukršteno vezivanje. S obzirom da protein neublastina divljeg tipa sadrži samo jednu amino grupu na svom amino-terminalu i da ne sadrži sulfhidrilne grupe, očekuje se da reakcija sa SMCC rezultuje modifikacijom specifičnom za određeno mesto na neublastinu kod koje će SMCC biti povezan na amino-terminalu.
Sledeće, 60 μg konjugata neublastina i SMCC je inkubirano sa 120 μg goveđeg serumskog albumina, a u smeši je analiziran stepen ukrštenog vezivanja pomoću SDS-PAGE. BSA sadrži samo jednu slobodnu SH grupu, pa se na osnovu toga očekuje da reakcija sa konjugatom neublastina i SMCC rezultuje u modifikaciji na ovom mestu posredstvom maleimida na SMCC. Pod ovim uslovima, primećene su dve dodatne trake veće molekulske mase, što je konzistentno sa masom koja se očekuje pri modifikaciji neublastina sa jednim i sa dva molekula BSA, s obzirom da svaki molekul neublastina sadrži dva amino-terminala koji mogu da učestvuju u reakciji, što se slaže sa navedenim zapažanjem. Uporedo sa formiranjem ovih traka, primrćeno je smanjenje u intenzitetu traka neublastina - SMCC i BSA. Na osnovu intenziteta preostale neublastinske trake, izgleda da je reakcija dovršena 70 - 80%.
Monosupstituisani proizvod je prečišćen iz reakcione smeše podvrgavanjem materijala hromatografiji sa izmenom katjona i hromatografiji sa ekskluzijom po veličini na Superdex 200 koloni (Pharmacia), na način koji je opisan iznad u diskusiji o studijama pegilacije. Frakcije kolone sa gel filtracije su analizirane pomoću SDS-PAGE, a one koje sadrže monosupstituisani proizvod su analizirane na sadržaj proteina pomoću apsorbancije na 280 nm. S obzirom da je masa BSA skoro dva puta veća od one neublastina, koncentracija je podeljena sa faktorom 3, kako bi se dobio ekvivalent neublastina. Ova frakcija je podvrgnuta analizi funkcije pomoći KIRA ELISA. Vrednosti IC50 za neublastin divljeg tipa i za neublastin koji je konjugovan sa BSA su 3 - 6 nM, što ukazuje da konjugacija sa BSA ne kompromituje funkciju neublastina.
Mada su ova preliminarna ispitivanja izvedena sa BSA, odgovarajući proteini serumskog albumina pacova i ljudi takođe sadrže slobodne SH grupe. Posledično, sličan prilaz može da se primeni za dobijanje konjugata pacovskog serumskog albumina i pacovskog neublastina radi izvođenja ispitivanja pK i efikasnosti kod pacova, kao i za dobijanje konjugata humanog serumskog albumina i humanog neublastina radi izvođenja kliničkih ispitivanja. Slično tome, SMCC može da bude supstituisan nekim od brojnih veznika za ukršteno vezivanje koji sadrži reaktivnu amino grupu na jednoj strani i reaktivnu tiol grupu na drugoj strani. Primeri veznika sa reaktivnom amino grupom koji insertuju maleimid sa reaktivnom tiol grupom su AMAS, BMPS, MBS, EMCS, SMPB, SMPH, KMUS ili GMBS, a oni koji insertuju haloacetat sa reaktivnom tiol grupom su SBAP, SIA, SIAB, dok su oni koji obezbeđuju zaštićenu ili nezaštićenu tiol grupu za reakciju sa sulfhidrilnim grupama, čime se dobija proizvod sa reduktibilnim vezama, su SPDP, SMPT, SATA ili SATP, pri čemu se svi oni ogu nabaviti od Pierce-a. Takvi veznici služe samo kao primer, jer su moguće mnoge alternativne strategije za povezivanje amino-terminala neublastina sa serumskim albuminom. Vešt stručnjak takođe može da dobije konjugate sa serumskim albuminom koji nisu usmereni ka amino-terminalu neublstina ili ka tiol grupi serumskog albumina. Takođe se očekuje da će biti funkcionalni fuzioni proteini neublastina i serumskog albumina koji su dobijeni korišćenjem genetskog inženjeringa, pri čemu je gen za neublastin fuzionisan sa genom za serumski albumin, tako da se dobija proizvod sa vezom na amino-terminalu, karboksi-terminalu ili na oba kraja.
Ovaj postupak može da se proširi pomoću rutinskih adaptacija kod bilo kog konjugata neublstina i serumskog albumina, kojima se dobija proizvod sa produženim poluživotom kod životinja i posledično kod ljudi.
Primer 7: Kristalizacija i određivanje strukture humanog neublastina
Neublastin koji je obeležen sa selenometioninom je eksprimiran korišćenjem standardnog postupka kojim se inhibira biosinteza metionina (Van Duyne, et al., 1991, Science 252, 839 - 842). I neublastin divljeg tipa i neublastin sa inkorporiranim selenometioninom su koncentrovani do 17 mg/ml u 0,8 M argininu. Proteinska zaliha je koncentrovana do 17 mg/ml u 0,8 M argininu. Kristali su dobijeni postupkom difuzije pare sa visećom kapi (Jancarik, J. & Kim, S.H., 1991, J. Appl. Crystallogr. 24, 409 - 411) iz 1,25 M magnezijum sulfata, 0,1 M MES, pH vrednost 6,5, na 20 °C. Kristali sa najboljom reproducibilnošću su dobijeni pomoću mikrozasejavanja. Kristali su zaštićeni od mržnjenja dodavanjem 5% etilen glikol sažvakih 60 sekundi do konačne konc. od 1,25 M magnezijum sulfata, 0,1 M MES, pH vrednost 6,5 i 30% (v/v) etilen glikola, a potom su zamrznuti brzim prebacivanjem u tečni azot.
Kristali od oko 100 μm na svakoj strani su difraktovani do 1,6A na liniji zraka X4A kod National Synchrotron Light Source (Upton, NY). Obrada podataka sa HKL programskim paketom (Otwinowski (1993) u: Proceeding of the CCP4 Study Weekend: Data Collection and Processing (Sawer et al., urednici) str. 56 - 62, Daresbury Laboratory, Warrington) je otkrila da kristali pripadaju C2 prostornoj grupi sa jednim kovalentnim dimerom po asimetričnoj jedinici, kao i približne dimenzije ćelije od a=115 Å, b=33 Å i α = γ = 90°, β=99°.
Kristalna struktura je rešena višestrukim izomorfnim zamenama. Nativni kristali neublastina su potpoljeni u 1 mM PtCl4 tokom 4 časa, 10 mM IrCl3 tokom 72 časa i 10 mM IrCl6 tokom 18 časova, pa su prikupljeni podaci koji su obrađeni HKL programom (Otwinowski et al., navedeno gore). Inspekcijom izomorfa su primećena dva selenometioninska mesta i anomalna razlika u obrascima kristalizacije. Preostala mesta su locirana korišćenjem SOLVE (4). Faze su poboljšane pomoću RESOLVE (Terwilliger et al., 1999, Acta Crystallogr. D. 55, 849 - 861) do vrednosti od 0,56, a dobijene mape su bile dovoljnog kvaliteta da se prati neublastinski model. Alternirajući ciklusi izgradnje modela sa O2D (5 G.J. Kleywegt & T.A. Jones, "O2D - the manual", priručnik uz program, Uppsala, 1994), kao i korekcije sa CNX korišćenjem mlhl mete i korekcije na osnovu podataka o selenometioninu su doveli do stvaranja kompletnog modela proteina neublastina, sa izuzetkom prvih 13 amino-terminalnih aminokiselina, kao i 89 molekula vode i 6 sulfatnih anjona. Konačna Rslobodno je 28,5%, a R-faktor je 24,7% do 0,2 Å sa dobrom spektrohemijom.
Primer 8: Mesta za vezivanje sulfata i modelovanje heparin sulfata
Skup od tri sulfata na temenima skoro jedostranog trougla je lociran na preheliksnom regionu na površini neublastina i mogao bi da predstavlja vezno mesto za heparin sulfat. Postoje tri argininska ostatka koja izgleda ostvaruju ključne interakcije sa ovim sulfatnim grupama. Argininski ostatak R48 zajedno povezuje sve tri sulfatne grupe (br. 2, 6 i 3). Amidni ostatak u njegovoj osnovi interaguje sa sulfatom br. 2, dok guanidinska grupa iz bočnog lanca formira bifurkatnu vodoničnu vezu sa sulfatima br. 6 i br. 3. Drugi argininski ostatak (R49) formira vodoničnu vezu sa sulfatom br. 2, a treći argininski ostatak (R51) formira dugu vodoničnu vezu sa sulfatom br. 6.
Ove sulfo grupe na argininskim ostacima mogu da budu vezujući džepovi za heparin sulfat, a ukoliko dođe do mutacije u ostatke koji nisu pozitivno naelektrisani, onda može doći do smanjenja vezivanja heparin sulfata i moguće do smanjenja i/ili odlaganja klirensa molekula neublastina nakon primene in vivo. Model vezivanja heparin sulfata za neublastin može da se konstruiše prepokrivanjem sulfata glikozaminoglikana postojećim sulfo grupom iz kristalne strukture neublastina. n i n+2 sulfati koji su povezani sa saharidom u heparin sulfatu iz kristalne strukture FGF-1 koji je u kompleksu sa heparin sulfatom razdvojeni su za oko 8,5 Å (Pellegrini et al. (2000) Nature 407, 1029 - 1034). Ovo merenje se blisko poklapa sa rastojanjem između sulfata u skupu od tri sulfata u strukturi neublastina; sulfati br. 3 i br. 6 su razdvojeni 8,8 Å, a sulfati br. 3 i br. 2 su razdvojeni 8,1 Å. Ovo poklapanje merenja rastojanja može da ukazuje da je ovaj R48/R49/R51 motiv deo mesta za vezivanje heparina. Ovo sugeriše da mutacije na jednom mestu R48, R49 ili R51 u glutamat ili aspartat ili neku drugu aminokiselinu koja nije pozitivno naelektrisana može da umanji afinitet vezivanja heparin sulfata bez smanjenja aktivnosti vezivanja za receptor neublastina, čime se dobija biološki aktivan proizvod koji ima produženi poluživot kod životinja i ljudi. Da bi se ispitala ova mogućnost, stvorena je serija konstrukata koji sadrže jedan ili više mutanata u kojima je arginina mutiran u glutaminsku kiselinu. Mutirani neublastinski proizvodi su eksprimirani u E. coli ćelijama, prečišćeni su i rekonformisani, pa im je ispitana funkcija. Konačno, ispitivana je sposobnost proizvoda da veže heparin sulfat, kao i njihova farmakokinetika i farmakodinamika kod životinja.
Jedno ili više od ovih mesta takođe može da obezbedi druga mesta za pegilaciju, a to može da se postigne zamenom R sa K ili C i primenom gore opisanih postupaka.
Primer 9: Doziranje pegiliranog mutiranog neublastina NBN106-N95K kod otklanjanja taktilne i termalne hiperalgezije u životinjskom modelu neuropatskog bola zbog ligacije nerva
Ranije je pokazano da doza od 1 mg/kg neublastina divljeg tipa koji se primenjuje s.c. tri puta nedeljno dovodi do skoro potpunog otklanjanja i neuropatskog bola i do normalizacije ponašanja povezanog sa njim (taktilna alodinija i termalna hiperalgezija), izazvanog podvezivanjem kičmenog živca kod pacova, dok doza od 0,03 mg/kg neublastina divljeg tipa primenjena s.c. tri puta nedeljno nije imala efekta, a doze od 0,1 mg/kg i 0,6 mg/kg neublastina divljeg tipa primenjene tri puta nedeljno su imale intermedijerno dejtvo u ovom modelu.
Ovde se opisuju ispitivanja koja se odnose na efekat pegiliranog N95K neublastina na otklanjanje taktilne alodinije i termalne hiperalgezije u modelu Chung L5/L6 podvezivanja kičmenog živca ("SNL" model). Mužijaci Sprague - Dawley pacova (230 - 380 g) su podeljeni u dve grupe. Svi pacovi su podvrgnuti ligaciji kičmenog živca. Jednoj grupi pacova (n = 6) je dat vehikulum s.c. injekcijom. Drugoj grupi pacova (n = 6) je dat pegilirani N95K neublastin (3(,4) × 10 kDa PEG NBN106-N95K) s.c. injekcijom u dozi od 10 μg/kg. 3(,4) × 10 kDa PEG NBN106-N95K sadrži protein neublastina iz E. coli ćelija koji ima aminokiselinsku supstituciju Asn u Lys na položaju 95, koji je umanjen cepanjem (cepanje 7 aminokiselina na amino-terminalu; NBN106) i koji je pegiliran sa prosečno 3,3 PEG molekula po dimeru NBN, korišćenjem kao reaktanta metoksilpoli(etilen glikol)-sukcinimidil propionata (SPA-PEG) molekulske mase od 10000 Da. Vehikulum se sastoji od 5 mM fofata i 150 mM natrijum hlorida, pH vrednost 6,5. Subkutane injekcije su primenjene tokom dana 3, 5, 7, 10, 12 i 14 nakon operacije (nakon SNL). Za šraćenje taktilnih i termalnih odgovora su korišćeni testovi ponašanja Von Frey-a (Chaplan et al. (1994), J. Neurosci. Meth. 53: 55 - 63) i Hargreaves-a (Hargreaves et al. (1988), Pain 32: 77 - 88), respektivno.Ovi odgovori na bol su praćeni pre podvezivanja kičmenog živca da bi se ustanovio osnovni nivo odgovora, onda tokom dana 2 nakon SNL da se verifikuje prisustvo taktilne i termalne hiperalgezije, a potom tokom dana 3, 5, 7, 10, 12, 14 i 15 nakon SNL. Da bi se procenila statistička značajnost tretmana lekom u odnosu na tretman vehikulumom, sprovedena je jednostruka analiza varijanse (jednostruka ANOVA) upotrebom post-hoc Student - Neuman - Keuls (SNK) testa.
Oba tipa ponašanja izazvanog neuropatskim bolom (taktilna alodinija i termalna hiperalgezija) su razvijena u potpunosti do drugog dana nakon SNL, kao što je i očekivano. Subkutana primena 10 μg/kg 3(,4) × 10 kDa PEG NBN106-N95K je dovela do izraženog i statistički značajnog otklanjanja oba tipa ponašanja povezanog sa neuropatskim bolom kod pacova sa podvezanim kičmenim živcem. Kod pacova sa podvezanim kičmenim živcem, efekat 10 μg/kg 3(,4) × 10 kDa PEG NBN106-N95K na termalnu osetljivost i taktilnu alodiniju je prvo postao statistički značajan nakon 4 dana od početka primene pegiliranog N95K neublastina. Efekat 10 μg/kg 3(,4) × 10 kDa PEG NBN106-N95K na termalnu osetljivost i taktilnu alodiniju je dostigao plato oko 4 dana nakon početka primene pegiliranog N95K neublastina. Efekat 10 μg/kg 3(,4) × 10 kDa PEG NBN106-N95K nije nestao tokom intervala od 2 do 3 dana između primena. U stvari, primećena je izražena normalizacija ponašanja udruženih sa bolom između primena pegiliranog N95K neublastina tokom dana 5 i 7. U drugom eksperimentu (podaci nisu prikazani), subkutana primena doze od 3 μg/kg 3(,4) × 10 kDa PEG NBN106-N95K tokom dana 3, 5, 7, 10, 12 i 14 je dovela do značajne normalizacije ponašanja udruženog sa bolom (taktilna i termalna hiperalgezija) u SNL modelu, iako je početak efekta bio nešto sporiji.
Ovi podaci pokazuju da 3(,4) × 10 kDa PEG NBN106-N95K ima povećanu potenciju od najmanje 100 do 333 puta u odnosu na nemutirani neglikozilirani neublastin u odnosu na ponašanje udruženo sa taktilnom alodinijom i termalnom hiperalgezijom u SNL modelu. Bolja farmakokinetska svojstva 3(,4) × 10 kDa PEG NBN106-N95K u poređenju sa nemutiranim neglikoziliranim neublastinom ukazuju da efikasnost sistemski primenjenog neublastina korelira sa serumskim nivoima neublastina. Ovi rezultati pokazuju da polimerni konjugati mutiranog neublastina mogu da se koriste za lečenje neuropatskog bola kod pacijenata primenom značajno smanjenih doza, a potencijalno i sa smanjenom frekfencom doziranja, zbog njihove povećane biološke raspoloživosti u poređenju sa nekonjugovanim neublastinom.
Tabela 8. Biološka karakterizacija pegiliranog NBN
Napomena: nd znači nedetektabilan, + označava slabo - umereno izlaganje, ++ označava visoko izlaganje
Napomena: svi oblici su NBN113, osim ukoliko nije drugačije naznačeno
Napomena: svi oblici su derivirani iz E. coli, osim ako nije naznačeno da su derivirani iz CHO
Druga rešenja
Iako su ovde detaljno opisana određena rešenja, to je učinjeno samo primera radi i ni na koji način ne ograničava obim zaštite definisan pridodatim patentnim zahtevima, koji slede. Posebno, obimom zaštite predmetnog pronalaska je obuhvaćeno da je moguće napraviti različite supstitucije, alteracije i modifikacije predmetnog pronalaska, bez odstupanja od duha i obima zaštite predmetnog pronalaska koji su definisani patentnim zahtevima.
POLIMERNI KONJUGATI MUTIRANOG NEUBLASTINA
Apstrakt
Obezbeđen je dimer koji sadrži polipeptid mutiranog neublastina koji je povezan sa polimerom. Takvi dimeri pokazuju produženu biološku raspoloživost i u poželjnim rešenjima produženu biološku aktivnost u odnosu na oblike neublastina divljeg tipa.

Claims (13)

1.Polipeptid neublastina, naznačen time što sadrži supstituciju jednog ili više arginina na položaju 48,· arginina na položaju 49 ili arginina na položaju 51 sa aminokiselinskim ostatkom koji nije pozitivno naelektris .
2.Polipeptiprema zahtevu l, naznačen time što je aminokiselinski ostatak koji nije pozitivno naelektrisan glutaminska kiselina.
3.Polipeptid prema zahtevu l, naznačen time što je argininski ostatak na položaju 48 supstituisan glutiuninskom kiselinom.
4.Polipeptid prema zahtevu l, naznačen time što je argininski ostatak na položaju 49 supstituisan glutaminskom kiselinom.
5.Polipeptid prema zahtevu l, naznačen time što je argininski ostatak na položaju 51 supstituisan glutaniinskom kisel.iJiom.
6.Postupak indukcije savijanja denaturisanog polipeptida neublastina, naznačen time što navedeni postupak obuhvata uspostavljanje kontakta denaturisanog polipeptida neublastina sa količinom pufera za ponovno savijanje koja je efikasna da izazove savijanje polipeptida, pri čemu se pufer za ponovno savijanje sastoji od (i) kalijum fosfata, pH vrednost 7,8, u koncentraciji od 50 mM, (ii) guanidin- HCl u kocentraciji od 0,5 M, (iii) L-arginina u koncentraciji od 0,35 M, (iv) Tween - 80 u koncentraciji od O,l%;(v) oksidovanog glutationa u koncentraCiji od l mM i (vi) redukovanog glutationa u koncentraciji od 0,2 mM.
7. Postupak prema zahtevu 6, naznačen time što je polipeptid neublastina divlji tip neublastina.
8.Postupak prema zahtevu 6, naznačen time što je polipeptid neublastina mutirani neublastin.
9.Dimer, naznačen time što se sastoji od prvog polipeptida neublastina i drugog polipeptida neublastina, pri čemu (a) barem jedan polipeptid je glikoziliran i (b) barem jedan polipeptid je konjugovan na svom N-terminalu sintetičkim polimerom koji je rastvorljiv u vodi.
10.Dimer prema zahtevu 9, naznačen time što je sintetički polimer koji je rastvorljiv u vodi polietilen glikol (PEG).
11.Dimer prema zahtevu 9, naznačen time što je aminokiselinska sekvenca prvog i drugog polipeptida neublastina NBN104 (sekvenca čiji je ID broj 16).
12.Dimer prema zahtevu 10, naznačen time što je aminokiselinska sekvenca prvog i drugog polipeptida neublastina NBN104 (sekvenca čiji je ID broj 16).
13. Dimer koji je konjugovan polimerom, naznačen time što sadrži prvi polipeptid koji obuhvata prvu amino-terminalnu aminokiselinu i drugi polipeptid koji obuhvata drugu amino-terminalnu aminokiselinu, pri čemu svaki polipeptid individualno sadrži: a) aminokiselinsku sekvencu okarakterisanu time što je najmanje 70% identična sa sekvencom aminokiselina 8 - 113 sekvence čiji je ID broj l; b) cisteinski ostana svakom od položaja 16, 43, 47, 80, 81, 109. i 111, kada su polipeptidi numerisani prema sekvenci čiji je ID br. l; c) sledeće aminokiselinske ostatke: C na položaju 16, L na položaju 18, V na položaju 25, L na položaju 28, G na položaju 29, L na položaju 30, G na položaju 31, E na položaju 36, F na položaju 40; R na položaju 41, F na položaju 42, C na položaju 43, G na položaju 45, C na položaju 47, C na položaju 80, C na položaju 81, Rna položaju 82, P na položaju 83, F na položaju 91, D na položaju 93, S na položaju 105, A na položaju 106, C na položaju l09 i C na položaju ll l, pri čemu su svi numerisani prema sekvenci čiji je ID broj l; i d) LGLG ponovnu sekvencu, FRF.C motiv, QPCCRP motiv iBATACGC motiv; pri čemu barem· prvi polipeptid sadrži najmanje jednu nokiselinsku supstituciju, inserciju ili fuziju u poređenju sa sekvencom čiji jID broj l ipri čemu supstitucija, insercija ili fuzija obezbeđuje interno mesto za konjugaciju sa polimerom za koje se polimer konjuguje.
MEP-2008-438A 2001-02-01 2004-02-02 Polimerni konjugati mutiranog neublastina ME00277B (me)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US26607101P 2001-02-01 2001-02-01
US10/356,264 US7442370B2 (en) 2001-02-01 2003-01-31 Polymer conjugates of mutated neublastin
PCT/US2004/002763 WO2004069176A2 (en) 2001-02-01 2004-02-02 Polymer conjugates of mutated neublastin

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ME00277B true ME00277B (me) 2011-05-10

Family

ID=46123760

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MEP-2008-438A ME00277B (me) 2001-02-01 2004-02-02 Polimerni konjugati mutiranog neublastina

Country Status (3)

Country Link
US (2) US7442370B2 (me)
ME (1) ME00277B (me)
WO (1) WO2004069176A2 (me)

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7442370B2 (en) 2001-02-01 2008-10-28 Biogen Idec Ma Inc. Polymer conjugates of mutated neublastin
US7276580B2 (en) * 2001-03-12 2007-10-02 Biogen Idec Ma Inc. Neurotrophic factors
US20040077543A1 (en) * 2001-03-28 2004-04-22 Sah Dinah W. Y. Treatment using neublastin polypeptides
DE60336754D1 (de) 2002-02-14 2011-05-26 Univ R Enzymbehandlung von nahrungsmitteln für zöliakie-sprue
US8143210B2 (en) 2002-02-14 2012-03-27 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Enzyme treatment of foodstuffs for celiac sprue
JP4571776B2 (ja) * 2002-11-05 2010-10-27 Ｊｘ日鉱日石エネルギー株式会社 潤滑油組成物
EP1563300B1 (en) 2002-11-20 2012-04-18 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Diagnostic method for celiac sprue
CA2864810A1 (en) 2003-04-18 2004-11-04 Biogen Idec Ma, Inc. Polymer-conjugated glycosylated neublastin
US7579313B2 (en) * 2003-11-18 2009-08-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Transglutaminase inhibitors and methods of use thereof
BRPI0514534A (pt) 2004-08-19 2008-06-17 Biogen Idec Inc variantes de neublastina
NZ553420A (en) 2004-08-19 2010-02-26 Biogen Idec Inc Refolding transforming growth factor beta family proteins
TWI501774B (zh) 2006-02-27 2015-10-01 Biogen Idec Inc 神經性病症之治療
EP1993590B1 (en) * 2006-03-01 2013-12-25 Biogen Idec MA Inc. Compostions and methods for administering gdnf ligand family proteins
CA2680590C (en) * 2007-03-16 2017-10-17 Jonathan David Gass Combination enzyme therapy for digestion of dietary gluten
US8148105B2 (en) * 2007-03-16 2012-04-03 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Scaleable manufacturing process for cysteine endoprotease B, isoform 2
JP5583005B2 (ja) 2007-05-01 2014-09-03 バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド 血管新生を増大させるための組成物および方法
WO2009020964A2 (en) * 2007-08-08 2009-02-12 Biogen Idec Ma Inc. Anti-neublastin antibodies and uses thereof
KR20150139982A (ko) * 2007-11-05 2015-12-14 데벨로겐 악틴게젤샤프트 제약학적으로 용도되는 신규한 뉴트린 접합체
JP2010043063A (ja) * 2008-05-09 2010-02-25 Agency For Science Technology & Research 川崎病の診断及び治療
US10317376B2 (en) 2012-04-11 2019-06-11 Bioverativ Therapeutics Inc. Methods of detecting glycosaminoglycans

Family Cites Families (90)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4352883A (en) 1979-03-28 1982-10-05 Damon Corporation Encapsulation of biological material
US4353888A (en) 1980-12-23 1982-10-12 Sefton Michael V Encapsulation of live animal cells
US4407957A (en) 1981-03-13 1983-10-04 Damon Corporation Reversible microencapsulation of a core material
EP0154316B1 (en) 1984-03-06 1989-09-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified lymphokine and production thereof
US5525464A (en) 1987-04-01 1996-06-11 Hyseq, Inc. Method of sequencing by hybridization of oligonucleotide probes
US4883666A (en) 1987-04-29 1989-11-28 Massachusetts Institute Of Technology Controlled drug delivery system for treatment of neural disorders
US5158881A (en) 1987-11-17 1992-10-27 Brown University Research Foundation Method and system for encapsulating cells in a tubular extrudate in separate cell compartments
US5283187A (en) 1987-11-17 1994-02-01 Brown University Research Foundation Cell culture-containing tubular capsule produced by co-extrusion
DE3829752A1 (de) 1988-09-01 1990-03-22 Akzo Gmbh Integrale asymmetrische polyaethersulfonmembran, verfahren zur herstellung und verwendung zur ultrafiltration und mikrofiltration
DE3829766A1 (de) 1988-09-01 1990-03-22 Akzo Gmbh Verfahren zur herstellung von membranen
EP0401384B1 (en) 1988-12-22 1996-03-13 Kirin-Amgen, Inc. Chemically modified granulocyte colony stimulating factor
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US5800992A (en) 1989-06-07 1998-09-01 Fodor; Stephen P.A. Method of detecting nucleic acids
US5194596A (en) * 1989-07-27 1993-03-16 California Biotechnology Inc. Production of vascular endothelial cell growth factor
US5350836A (en) * 1989-10-12 1994-09-27 Ohio University Growth hormone antagonists
GB8927546D0 (en) 1989-12-06 1990-02-07 Ciba Geigy Process for the production of biologically active tgf-beta
US5084350A (en) 1990-02-16 1992-01-28 The Royal Institution For The Advance Of Learning (Mcgill University) Method for encapsulating biologically active material including cells
US5618531A (en) 1990-10-19 1997-04-08 New York University Method for increasing the viability of cells which are administered to the brain or spinal cord
US5252714A (en) 1990-11-28 1993-10-12 The University Of Alabama In Huntsville Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde
CA2109085C (en) 1991-04-25 2003-03-11 Keith E. Dionne Implantable biocompatible immunoisolatory vehicle for delivery of selected therapeutic products
WO1993000951A1 (en) 1991-07-02 1993-01-21 Inhale, Inc. Method and device for delivering aerosolized medicaments
MX9205293A (es) 1991-09-20 1993-05-01 Syntex Sinergen Neuroscience J Factores neurotrofico derivado del glial
US5939524A (en) * 1991-12-09 1999-08-17 The Scripps Research Institute Platelet GPIII P1A1 and P1A2 epitopes, their preparation and use
US5414135A (en) * 1991-12-30 1995-05-09 Sterling Winthrop Inc. Vinyl sulfone coupling of polyoxyalkylenes to proteins
US5785049A (en) 1994-09-21 1998-07-28 Inhale Therapeutic Systems Method and apparatus for dispersion of dry powder medicaments
ES2179831T3 (es) 1992-09-29 2003-02-01 Inhale Therapeutic Syst Liberacion en los pulmones de fragmentos activos de hormona paratiroidiana.
US6472178B1 (en) 1998-02-27 2002-10-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acids encoding a modified ciliary neurotrophic factor and method of making thereof
US5349056A (en) 1992-10-09 1994-09-20 Regeneron Pharmaceuticals Modified ciliary neurotrophic factors
CA2092271C (en) 1993-03-09 2009-10-13 Eddie Reed Use of g-csf for treating taxol side-effects
ATE218893T1 (de) 1993-08-12 2002-06-15 Neurotech Sa Biokompatible immunoisolatorische kapseln, die genetisch veränderte zellen enthalten
DE4339605A1 (de) 1993-11-20 1995-05-24 Beiersdorf Ag Desodorierende Wirkstoffkombinationen auf der Basis von alpha, omega-Alkandicarbonsäuren und Fettsäurepartialglyceriden
US5834029A (en) 1994-07-20 1998-11-10 Cytotherapeutics, Inc. Nerve guidance channel containing bioartificial three-dimensional hydrogel extracellular matrix derivatized with cell adhesive peptide fragment
US5824784A (en) 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
US5795716A (en) 1994-10-21 1998-08-18 Chee; Mark S. Computer-aided visualization and analysis system for sequence evaluation
US5770577A (en) 1994-11-14 1998-06-23 Amgen Inc. BDNF and NT-3 polypeptides selectively linked to polyethylene glycol
US5780014A (en) 1995-04-14 1998-07-14 Inhale Therapeutic Systems Method and apparatus for pulmonary administration of dry powder alpha 1-antitrypsin
US5654007A (en) 1995-06-07 1997-08-05 Inhale Therapeutic Systems Methods and system for processing dispersible fine powders
US5739307A (en) 1995-08-28 1998-04-14 Washington University Polynucleotide encoding neurturin neurotrophic factor
US5733729A (en) 1995-09-14 1998-03-31 Affymetrix, Inc. Computer-aided probability base calling for arrays of nucleic acid probes on chips
US6184200B1 (en) 1995-09-28 2001-02-06 Amgen Inc. Truncated glial cell line-derived neurotrophic factor
US5641749A (en) 1995-11-29 1997-06-24 Amgen Inc. Method for treating retinal ganglion cell injury using glial cell line-derived neurothrophic factor (GDNF) protein product
US6063757A (en) 1995-11-29 2000-05-16 Urso; Richard G. Wound treatment method with nerve growth factor
US6084076A (en) * 1995-12-21 2000-07-04 Ajinomoto Co., Inc. Method of refolding human activin A
US6299895B1 (en) 1997-03-24 2001-10-09 Neurotech S.A. Device and method for treating ophthalmic diseases
US6677135B1 (en) 1996-05-08 2004-01-13 Biogen, Inc. Ret ligand (RetL) for stimulating neutral and renal growth
US5754524A (en) 1996-08-30 1998-05-19 Wark; Barry J. Computerized method and system for analysis of an electrophoresis gel test
US6083725A (en) 1996-09-13 2000-07-04 Transkaryotic Therapies, Inc. Tranfected human cells expressing human α-galactosidase A protein
AU736670B2 (en) * 1996-09-26 2001-08-02 Medical Research Council Chaperone fragments
KR100195886B1 (ko) 1996-11-01 1999-06-15 김상조 당뇨병 치료용 의약조성물
EP0961830A1 (en) 1997-01-29 1999-12-08 Neurosearch A/S EXPRESSION VECTORS AND METHODS FOR $i(IN VIVO) EXPRESSION OF THERAPEUTIC POLYPEPTIDES
ATE375363T1 (de) 1997-07-14 2007-10-15 Bolder Biotechnology Inc Derivate des wachstumshormons und verwandte proteine
US20020055467A1 (en) 1998-07-06 2002-05-09 Johansen Teit E. Novel neurotrophic factors
US6593133B1 (en) * 1998-07-06 2003-07-15 Nsgene A/S Neurotrophic factors
WO2000004050A2 (en) 1998-07-14 2000-01-27 Janssen Pharmaceutica N.V. Neurotrophic growth factor
US7067473B1 (en) 1998-07-14 2006-06-27 Janssen Pharmaceutica N.V. Neurotrophic growth factor
CA2344277A1 (en) 1998-09-22 2000-03-30 University Of Maryland, Baltimore Cystine knot growth factor mutants
US20020002269A1 (en) 1998-09-29 2002-01-03 Jeffrey D. Milbrandt Artemin, a neurotrophic factor
AU2354600A (en) 1998-12-09 2000-06-26 Amgen, Inc. Grnf4 a neurotrophic factor
US6361771B1 (en) 1999-04-06 2002-03-26 Neurotech S.A. ARPE-19 as a platform cell line for encapsulated cell-based delivery
JP2003525916A (ja) * 1999-04-22 2003-09-02 エイドゲントシッシュ テクニーシェ ホッシュール チューリッヒ モディファイドタンパク質マトリクス
DK1185648T3 (da) 1999-06-02 2007-07-30 Genentech Inc Fremgangsmåder og sammensætninger til inhibition af neoplastisk cellevækst
WO2001030375A2 (en) 1999-10-29 2001-05-03 Biopharm Gesellschaft Zur Biotechnologischen Entwicklung Von Pharmaka Mbh Use of gdnf for treating corneal defects
CA2327208A1 (en) 2000-11-30 2002-05-30 The Government Of The United States Of America Methods of increasing distribution of therapeutic agents
BR0116749A (pt) 2000-12-22 2006-11-28 Genentech Inc usos de artemina ou seu agonista e artigo manufaturado
UA82983C2 (ru) 2001-02-01 2008-06-10 Байоджен Айдек Ма Інк. Полимерные коньюгаты найбластина и способы их использования
US7442370B2 (en) 2001-02-01 2008-10-28 Biogen Idec Ma Inc. Polymer conjugates of mutated neublastin
US7276580B2 (en) 2001-03-12 2007-10-02 Biogen Idec Ma Inc. Neurotrophic factors
US20040077543A1 (en) 2001-03-28 2004-04-22 Sah Dinah W. Y. Treatment using neublastin polypeptides
EP1395279B1 (en) 2001-03-28 2011-10-05 Biogen Idec MA Inc. Use of neublastin polypeptides for treating neuropathic pain
ATE546146T1 (de) 2001-04-24 2012-03-15 Purdue Research Foundation Verfahren und zusammensetzungen zur behandlung von nervengewebeverletzungen in säugetieren
US7164007B2 (en) * 2001-06-20 2007-01-16 Genentech, Inc. Anti-PR020044 antibodies
US20040028613A1 (en) 2001-06-25 2004-02-12 Nastech Pharmaceutical Company Inc Dopamine agonist formulations for enhanced central nervous system delivery
US7129085B2 (en) 2001-10-11 2006-10-31 Bristol-Myers Squibb Company Polynucleotides encoding a human leucine-rich repeat domain containing protein, HLLRCR-1
EP1314739A1 (en) 2001-11-22 2003-05-28 Bayer Ag Process for renaturation of recombinant, disulfide containing proteins at high protein concentrations in the presence of amines
GB0205022D0 (en) 2002-03-04 2002-04-17 Univ Cambridge Tech Materials and methods for the treatment of cns damage
JP4310608B2 (ja) 2002-04-25 2009-08-12 東洋紡績株式会社 Ｈｓｐ７０ファミリータンパク質基質結合ドメインフラグメントの利用方法
CA2864810A1 (en) 2003-04-18 2004-11-04 Biogen Idec Ma, Inc. Polymer-conjugated glycosylated neublastin
RU2005138368A (ru) 2003-06-10 2006-07-27 ЭнЭсДЖЕНЕ А/С (DK) Улучшенная секреция нейбластина
US7598059B2 (en) * 2003-10-02 2009-10-06 Biogen Idec Ma Inc. Neublastin expression constructs
US20050180957A1 (en) 2004-01-16 2005-08-18 Scharp David W. Method of using fibrin-bound angiogenic factors to stimulate vascularization of transplant site of encapsulated cells
KR100917403B1 (ko) 2004-06-23 2009-09-14 티슈진, 인코포레이티드 신경 재생
US7598356B2 (en) 2004-07-08 2009-10-06 Board of Regents of the University of Nebraska by and on behalf of the University of Nebraska Medical Center Method for purifying a protein of the cystine-knot superfamily
GB2416539A (en) * 2004-07-24 2006-02-01 Reckitt Benckiser Liquid cleaning composition, catalyst therefor and methods of cleaning
NZ553420A (en) 2004-08-19 2010-02-26 Biogen Idec Inc Refolding transforming growth factor beta family proteins
BRPI0514534A (pt) 2004-08-19 2008-06-17 Biogen Idec Inc variantes de neublastina
WO2007042040A2 (en) 2005-10-11 2007-04-19 Ns Gene A/S TREATMENT OF RETINOPATHIES USING GFRα3 AGONISTS
TWI501774B (zh) 2006-02-27 2015-10-01 Biogen Idec Inc 神經性病症之治療
EP1993590B1 (en) 2006-03-01 2013-12-25 Biogen Idec MA Inc. Compostions and methods for administering gdnf ligand family proteins
WO2007127803A2 (en) 2006-04-25 2007-11-08 The Regents Of The University Of California Administration of growth factors for the treatment of cns disorders
JP5583005B2 (ja) * 2007-05-01 2014-09-03 バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド 血管新生を増大させるための組成物および方法

Also Published As

Publication number Publication date
US20050142098A1 (en) 2005-06-30
WO2004069176A3 (en) 2007-09-20
US20080306212A1 (en) 2008-12-11
US8119114B2 (en) 2012-02-21
US7442370B2 (en) 2008-10-28
WO2004069176A2 (en) 2004-08-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8119114B2 (en) Polymer conjugates of mutated neublastin
JP4423338B2 (ja) ニューブラスチンのポリマー結合体および同様の使用方法。
JP2011078434A (ja) 変異ニューブラスチンのポリマー結合体
HK1156051A (en) Polymer conjugates of mutated neublastin
HK1085663B (en) Mutated neublastin