NO117914B - - Google Patents

Description

Fremgangsmåte for utvinning av cycloserin fra en kulturoppløsning.

Foreliggende oppfinnelse vedrører en

fremgangsmåte for utvinning av cycloserin fra det næringsmedium, hvori det er

dannet.

Det antibiotiske cycloserin er et anti-bakterielt middel med et bredt spektrum,

som er i besittelse av aktivitet like overfor

Gram-negative og Gram-positive bakterier,

innbefattet mycobakterier, som f. eks.

Mycobacterium ranae. Det nye antibioti-kum kan fremstilles av en art av mikro-organismer, som er blitt betegnet Streptomyces orchidaceaus. Antibiotikumet er en

amfotær substans som er i besittelse av

svakt sure og svakt basiske grupper, og

antibiotikumet er meget oppløselig i vann,

delvis oppløselig i glykoler, isopropylalko-hol, metanol, etanol og aceton. Materialet

er oppløselig i hexan, benzen, kloroform,

eter, petroleumeter, dioxan, 1-butanol, etyl-acetat og etylendiklorid. Antibiotikumet

smelter under spaltning ved ca. 153° C, og

hydrolyserer ved 140° C med 1 N klorvannstoffsyre. Fremstillingen av antibiotikumet

utføres f. eks. som beskrevet i norsk pa-tent nr. 91 789 ved kultivering av mikro-organismen Streptomyces orchidaceaus i et

næringsmedium. Et medium som inneholder en passende kilde for protein og en

passende kilde for kullhydrater er tilfreds-stillende for cycloserinfremstillingen, og der

tilføres luft til mediet som dyrkes ved en

temperatur mellom ca. 20 og 30° C.

Det er nå blitt oppdaget en fremgangsmåte for utvinning av det antibiotiske cycloserin fra urene vandige oppløsninger herav, innbefattet næringsmediet, i hvilket

det er fremstillet. Den nye fremgangsmåte

er hensiktsmessig, økonomisk og effektiv

med hensyn til å opnå gode utbytter av antibiotikumet enten i en amorf eller krystallinsk form.

Den nye fremgangsmåte for utvinning av cycloserin fra urene vandige oppløsnin-ger herav, innbefattet næringsmediet i hvilket det er fremstillet, går ut på at cycloserin utfelles fra en kulturoppløsning, eller fra en uren, vandig oppløsning av cycloserin som stammer fra en slik kultur-oppløsning, ved at et vannoppløselig metallsalt av et metall som er istand til å danne et vann-uoppløselig salt av cycloserin, fortrinsvis et sølvsalt eller et kobbersalt, tilsettes til nevnte urene, vandige oppløs-ning av cycloserin, det utfelte salt av cycloserin fjernes fra oppløsningen, det vann-uoppløselige salt av cycloserin oppslemmes med vann, metallionet av det uoppløselige salt av cycloserin utfelles ved at der tilsettes et anion som danner et vann-uopp-løselig salt med metallkationet i nevnte vann-uoppløselige salt av cycloserin, metallsaltet fjernes og cycloserin utvinnes fra den resulterende rensede vandige opp-løsning herav.

Ved utførelsen av oppfinnelsen filtreres eller klares på annen måte den urene vandige oppløsning av cycloserin. Det foretrekkes å filtrere og avfarve oppløsningen med aktivert benkull. Som angitt ovenfor, adsorberes antibiotikumet deretter fra den vandige oppløsning på et sterkt basisk ani-onutvekslerharpiks i hydroksydform. Passende sterke basiske anionutvekslerhar-pikser som kan anvendes, omfatter Dowex-1, Dowex-2, som begge fremstilles av Dow Chemical Company, Midland, Michigan, og Amberlite XE-75, Amberlite XE-98, Amberlite IRA-400, Amberlite IRA-410, fremstillet av Rohm og Haas Company, Philadel-phia, Pennsylvania.

Etter adsorpsjonen av antibiotikumet på det sterkt basiske anionutvekslerhar-piks, utvaskes antibiotikumet fra harpikset under anvendelse av en vandig oppløsning av et material, som har en anion som er i stand til å utdrive cycloserin fra harpikset, og en slik anion skal være en annen enn OH-. Passende utvaskningsmaterialer omfatter vannoppløselige sulfater, klorider, acetater, formiater, fosfater, citrater, oxa-later etc. og svovelsyre, saltsyre, eddiksyre, maursyre, fosforsyre, citronsyre, oxalsyre etc. Fremgangsmtåen for adsorbering av cycloserin på anionutvekslerharpikset vil være klar for fagfolk; en hensiktsmessig fremgangsmåte er å føre den vandige opp-løsning av antibiotikumet gjennom en kolonne, som inneholder harpikset, inntil maksimumsmengden av antibiotikumet er blitt adsorbert på harpikset, hvilket fremgår av at antibiotikumet passerer kolonnen og gjenfinnes i økende mengder i avløpet fra kolonnen. Ved utvasking av antibiotikumet fra harpikset føres utvasknings-midlet i vandig oppløsning gjennom kolonnen, inntil antibiotikumet er blitt fullstendig utvasket, hvilket fremgår av at av-løpet ikke inneholder noe av antibiotikumet.

Etter utvaskningen av antibiotikumet fra anionutvekslerharpikset avfarves elu-atet med aktivert kullstoff, hvis dette er nødvendig, og derpå utfelles antibiotikumet fra den vandige oppløsning som et uoppløselig metallsalt. Ved utførelsen av dette trinn ved fremgangsmåten tilsettes til den vandige oppløsning av cycloserin et vannoppløselig salt av et metall, som danner et uoppløselig salt med antibiotikumet, således at metallsaltet av cycloserin utfelles. Før tilsetningen av metallsaltet til cycloserinoppløsningen, reguleres cyclose-rinoppløsningens pH til en verdi mellom ca. 5,5 og 9,0, og pH re-reguleres til en verdi innen dette område etter tilsetningen av metallsalter. Det foretrekkes å anvende en pH av 6,5. Ved en pH under 5,5 dannes meget lite uoppløselig metallsalt av cycloserin, men ved en pH over 9,0 dannes over-skytende mengder av metallhydroksyd ved tilsetning av det vannoppløselige metallsalt til den vandige oppløsning av cycloserin. Metallsalter som har vist seg å danne uoppløselige salter med det antibiotiske cycloserin, omfatter sølv, kobber, kvikksølv, sink, bly, aluminium og kobolt, og følgelig kan vannoppløselige salter av disse metaller tilsettes til en vandig oppløsning av det antibiotiske cycloserin, og antibiotikumet vil bli utfelt som et salt av det anvendte metall. Passende vannoppløselige salter av de forskjellige ovennevnte metaller omfatter sølvnitrat, kupriklorid, kobbersulfat, kvikksølvacetat, sinknitrat, sinksulfat, bly-acetat, blynitrat, aluminiumklorid, kobolt-nitrat, koboltklorid, koboltsulfat etc.

Det er naturligvis selvsagt at uoppløse-lige metallsalter av det antibiotiske cycloserin kan utfelles fra en hvilken som helst vandig oppløsning av antibiotikumet og vi har funnet at antibiotikumet kan utfelles som et uoppløselig metallsalt fra et klaret næringsmedium, i hvilket det er fremstillet, uten at det er nødvendig å adsorbere antibiotikumet på et anionutvekslerhar-piks og utvaske antibiotikumet fra dette. Når der anvendes en slik fremgangsmåte, filtreres næringsmediet i hvilket antibiotikumet er fremstillet, og derpå klares mediet under anvendelse av aktivert kullstoff, idet kullstoffet oppslemmes i det filtrerte næringsmedium, og derpå frafiltreres det aktive kullstoff, så at man får en delvis renset vandig oppløsning av antibiotikumet. Antibiotikumet kan utfelles fra det klarete næringsmedium som et uoppløselig metallsalt, slik som beskrevet ovenfor. Etter utfellingen av cycloserinet og fjernelsen av det uoppløselige metallsalt fra den over-liggende væske, oppslemmes derpå det uoppløselige metallsalt i vann, og der tilsettes til dette et material som er i stand til å utfelle metallionet som et uoppløselig salt, hvorved cycloserinet frigjøres, og dette går i oppløsning i det tilstedeværende vann. Hvis vi f. eks. har utfelt cycloserinet som Sølvsaltet, kan sølvsaltet av cycloserinet oppslemmes i vann, og der tilsettes klorvannstoffsyre til dette. Sølvet utfelles som sølvklorid, mens cycloserinet går i vandig oppløsning i den frie syreform. Hvis der anvendes tilstrekkelig klorvannstoffsyre, kan cycloserinet omdannes til hydrokloridet samtidig som sølvet utfelles som sølvklorid. På samme måte kan der anvendes svovelvannstoff, og sølvet utfelles som sølvsulfid og cycloserinet går i oppløsning i det tilstedeværende vann. En kombinasjon av metallutfelningsmidler kan anvendes, dvs. både klorvannstoffsyre og svovelvannstoff kan anvendes for å sikre en fullstendig fjernelse av sølvet. Hvis det uoppløselige kobbersaltet av cycloserinet oppslemmes i vann og der tilsettes svovelvannstoff, vil kobberet utfelles som kobbersulfid og cycloserinet vil gå i oppløsning i det tilstedeværende vann. På lignende måte kan kvikksølv utfelles som sulfid og de andre metaller kan fjernes på en lignende måte.

Etter fjernelsen av metallionet som anvendes ved dannelsen av det uoppløse-lige metallsalt av antibiotikumet avfarves fortrinsvis hvis dette er nødvendig den vandige oppløsning av antibiotikumet, og derpå frysetørkes den under vakuum for å få et amorft preparat av meget høy ren-hetsgrad. Den amorfe form er skikket for de fleste øyemed for det antibiotiske material.

Det antibiotiske cycloserin kan krystalliseres fra en vandig oppløsning i ste-denfor at det fåes i amorf form. Materialet krystalliseres ved å tilsette et med vann blandbart oppløsningsmiddel til en renset vandig oppløsning av antibiotikumet og det antibiotiske material er uopp-løselig eller bare svakt oppløselig i det vannblandbare oppløsningsmiddel. Passende vannblandbare oppløsningsmidler som kan anvendes for å krystallisere cycloserin fra en vandig oppløsning, omfatter aceton, metanol, dioxan etc.

De følgende eksempler skal anføres for å klargjøre utvinningen av cycloserin fra urene vandige oppløsninger herav.

Eksempel 1.

287 liter av næringsmediet, i hvilket cycloserin ble fremstilt og som inneholdt 4,8 enheter cycloserin pr. ml, ble filtrert og ført gjennom en kolonne, som inneholdt 10 liter Dowex-2 (et sterkt basisk anion-utvekslerharpiks) i OH—form med en strømningshastighet av 1200 ml pr. minutt. Kolonnen ble derpå vasket med vann og cycloserinet utvasket fra harpikset med 0,2 N svovelsyre med en hastig-het av 1200 ml pr. minutt, og utvasknings-væsken ble oppsamlet i 18 to-liters frak-sjoner. pH i utvaskningsfraksj onen ble derpå regulert til ca. 7,0, hvoretter utvask-ningsf raks j onen ble blandet med avfar-vende kullstoff og derpå filtrert fra dette. Den avfarvete utvaskningsvæske ble derpå tilsatt 0,5 mg sølvnitrat pr. enhet av den antibiotiske aktivitet som utvask-ningsvæsken inneholdt og pH ble opprett-holdt ved 6,5 ved hjelp av natriumhydrok-syd. Et krystallinsk sølvderivat av cycloserin ble utfelt fra væsken og filtrert fra, vasket med aceton og tørket i vakuum. Den følgende tabell angir resultatene for ni av de ovennevnte utvaskningsfraksjo-ner.

10 gram av det krystallinske sølvderi-vat fra eluat nr. 14 som er vist i den ovenfor anførte tabell, ble blandet med 60 ml vann, og til denne blanding ble tilsatt 89 ml 0,5165 N saltsyre. Sølvklorid ble utfelt fra oppløsningen og ble fjernet fra denne ved filtrering. Den gjenværende oppløsning ble frysetørket under vakuum, så at man fikk 4,4 gram av fast, amorft cycloserin, som ved prøve viste seg å inneholde 5,15 enheter/mg.

Eksempel II

1 gram av det amorfe cycloserin, som man fikk som beskrevet ovenfor i eksempel I, ble oppløst i 7,5 ml vann og til denne oppløsning ble tilsatt 5 ml aceton. Krystallinsk cycloserin som ble utfelt fra oppløs-ningen etter at der var tilsatt ytterligere 5 ml aceton for å sikre en fullstendig kry-stallisering. Krystallene ble filtrert fra opp-løsningen og vasket med aceton for å gi

0,6177 g av lufttørkete krystaller, som oppviste ved prøve 4,32 enheter pr. mg og inneholdt 14 pst. fuktighet. Ved fjernelse av fuktigheten ved tørkning, oppviste materialet 5,02 enheter pr mg.

Eksempel III

102 ml av næringsmediet som inneholdt 5 enheter pr. ml av cycloserin, ble blandet med 4 pst. aktivt kullstoff, og blandingen ble omrørt og filtrert. Til filtratet ble tilsatt 170 mg sølvnitrat og sølvsaltet av cycloserin ble utfelt i form av små hvite krystaller. Krystallene ble filtrert og tørket, så at man fikk 160 mg krystallinsk sølvsalt av cycloserin. Det krystallinske sølvsalt av cycloserin ble oppslemmet med 10 ml vann og der ble tilsatt 1,47 ml av 0,505 N saltsyre. Sølvsaltet utfeltes fra oppløsningen og ble sentrifugert fra denne. Den gjenværende oppløsning ble behandlet med aktivt kull og derpå frysetørket under vakuum så at man fikk cycloserinhydroklorid med 4,85 enheter/mg.

Eksempel IV

100 ml vandig oppløsning av cycloserin, som inneholder 88 enheter cycloserin pr. ml, ble blandet med 4,89 gram kobbersulfat og pH ble regulert til 6,7 med natri-umhydroksyd. Der ble dannet en utfelling av kobbersaltet av cycloserin, og dette ble frafiltrert, vasket med aceton og tørket, så at man fikk 3,92 gram av kobbersaltet av cycloserin, som oppviste 1,88 enheter/mg. gjennom suspensjonen svovelvannstoff i 5 1 gram av kobbersaltet av cycloserin ble suspendert i 20 ml vann og man lot boble gjennom suspensjonen svovelvannstoff i 5 minutter. Uoppløselig kobbersulfid ble utfelt fra oppløsningen og ble frafiltrert. —

Filtratet ble frysetørket under vakkum så at man fikk 0,457 gram cycloserin som oppviste 3,3 enheter/mg.

Claims (2)

1. Fremgangsmåte for utvinning av cycloserin ved at det isoleres fra en kultur-oppløsning i hvilken det er fremstilt f. eks. ved hjelp av streptomyces orchidaceaus, karakterisert ved at cycloserin utfelles fra en slik kulturoppløsning, eller fra en uren, vandig oppløsning av cycloserin som stammer fra en slik kulturoppløsning, ved at et vannoppløselig metallsalt av et metall som er istand til å danne et vann-uoppløselig salt av cycloserin, fortrinnsvis et sølvsalt eller et kobbersalt, tilsettes til nevnte urene, vandige oppløsning av cycloserin ved en pH-verdi fra 5,5 til 9, fortrinnsvis 6,5, det utfelte salt av cycloserin fjernes fra oppløs-ningen, det vann-uoppløselige salt av cycloserin oppslemmes med vann, metallionet av det uoppløselige salt av cycloserin utfelles ved at der tilsettes et anion som danner et vann-uoppløselig salt med metallkationet i nevnte vann-uoppløselige salt av cycloserin, metallsaltet fjernes og cycloserin utvinnes fra den resulterende, rensete vandige oppløsning herav.

2. Fremgangsmåte som angitt i på-stand 1, karakterisert ved at den vandige, urene oppløsning av cycloserin før utfellingen med et metallsalt renses ved at opp-løsningen på i og for seg kjent måte føres gjennom en sterk basisk anionutvekslings-harpiks i OH-form, hvoretter cycloserinet utvaskes fra harpikset med et anion av annen art enn OH—.