NO314584B1 - Purinderivater og deres anvendelse til fremstilling av antikoagulanter - Google Patents

Description

Område for oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse er rettet mot purinderivater

og deres farmasøytisk akseptable salter som inhiberer enzymet, faktor Xa, og som derved er anvendbare som antikoagulanter. Oppfinnelsen angår også farmasøytiske preparater inneholdende derivatene eller deres farmasøytisk akseptable salter.

Bakgrunn for oppfinnelsen

Faktor Xa er et medlem av den trypsinlignende serin-proteaseklasse av enzymer. En en-til-en-binding av faktorer Xa og Va med kalsiumioner og fosfolipid danner protrombinasekomplekset

som omdanner protrombin til trombin. Trombin omdanner i sin tur fibrinogen til fibrin som polymeriserer for å danne uløselig fibrin.

I koagulasjonskaskaden er protrombinasekomplekset det sammenløpende punkt av de indre (overflateaktiverte) og ytre (karskade-vevsfaktor) baner (Biochemistry (1991), vol. 30, s.

10363; og Cell (1988), vol. 53, s. 505-518). Modellen for koagulasjonskaskaden er blitt ytterligere forfinet med oppdag-

elsen av virkningsmåten av vevsfaktor-baneinhibitoren (TFPI)

(Seminars in Hematology (1992), vol. 29, s. 159-161). TFPI er en sirkulerende multidomene-serinproteaseinhibitor med tre Kunitz-lignende områder som konkurrerer med faktor Va for fri faktor Xa.

Så snart det er dannet, blir det binære kompleks av faktor Xa og

TFPI en kraftig inhibitor av faktor Vila og vevsfaktorkompleks.

Faktor Xa kan aktiveres med to distinkte komplekser,

med vevsfaktor Vlla-kompleks på "Xa-sprengnings"-banen og av faktor IXa-VIIIA-komplekset (TENase) av den "forlengede Xa"-

bane i koagulasjonskaskaden. Etter karskade aktiveres "Xa-sprengnings"-banen via vevsfaktor (TF). Oppregulering av koagulasjonskaskaden finner sted via økt faktor Xa-produksjon via den "forlengede Xa"-bane. Nedregulering av koagulasjonskaskaden finner sted med dannelsen av faktor Xa-TFPI-komplekset som ikke bare fjerner faktor Xa, men også inhiberer ytterligere faktor-dannelse via "Xa-sprengnings"-banen. Koagulasjonskaskaden reguleres derfor naturlig av faktor Xa.

Den primære fordel ved inhibering av faktor Xa overfor trombin for å forhindre koagulasjon er den fokale rolle til faktor Xa mot de multiple funksjoner av trombin. Trombin katalyserer ikke bare omdannelsen av fibrinogen til fibrin, faktor VIII til VIIIA, faktor V til Va og faktor XI til Xla, men aktiverer også blodplater, er en monocyttkjemotaktisk faktor og mitogen for lymfocytter og glattmuskelceller. Trombin aktiverer protein C, in vivo antikoagulantinaktivatoren av faktor Va og Villa når den er bundet til trombomodulin. I sirkulasjon inaktiveres trombin hurtig av antitrombin III (ATIII) og heparin-kofaktor II (HCII) i en reaksjon som katalyseres av heparin eller andre proteoglykanassosierte glykosaminoglykaner, mens trombin i vev inaktiveres av proteasen neksin. Trombin utfører sine multiple cellulære aktiveringsfunksjoner via en unik "bundet ligand" trombinreseptor (Cell (1991), vol. 64, s. 1057) som krever det samme anioniske bindingssete og aktive sete som anvendes i fibrinogenbinding og spaltning og av trombomodulin-binding og protein C-aktivering. En forskjellig gruppe av in vivo molekylære mål konkurrerer således for å binde trombin, og de etterfølgende proteolytiske hendelser vil ha meget forskjellige fysiologiske konsekvenser avhengig av hvilken celletype og hvilken reseptor, modulator, substrat eller inhibitor som binder trombin.

Publiserte data med proteinene antistasin og flått-antikoagulerende peptid (TAP) viser at faktor Xa-inhibitorer er effektive antikoagulanter (Thrombosis and Haemostasis (1992), vol. 67, s. 371-376; og Science (1990), vol. 248, s. 593-596).

Det aktive sete av faktor Xa kan blokkeres av enten en mekanismebasert eller en tettbindende inhibitor (en tettbindende inhibitor avviker fra en mekanismebasert inhibitor ved mangel på en kovalent kjede mellom enzymet og inhibitoren). To typer av mekanismebaserte inhibitorer er kjent, reversible og irrever-sible, som skilles ved lettheten av hydrolysen av enzyminhibi-torkjeden (Thrombosis Res. (1992), vol. 67, s. 221-231; og Trends Pharmacol. Sei. (1987), vol. 8, s. 303-307). En serie av guani-dinoforbindelser er eksempler på tettbindende inhibitorer (Thrombosis Res. (1980), vol. 19, s. 339-349). Arylsulfonyl-arginin-piperidin-karboksylsyrederivater er også blitt vist å være tettbindende inhibitorer av trombin {Biochem. (1984), vol. 23, s. 85-90), så vel som en serie av arylamidinholdige forbindelser, innbefattende 3-amidinofenylarylderivater (Thrombosis Res.

(1983), vol. 29, s. 635-642) og bis(amidino)benzylsykloketoner (Thrombosis Res. (1980), vol. 17, s. 545-548). Disse forbindelser utviser imidlertid dårlig selektivitet for faktor Xa.

Beslektede publikasjoner

Publisert europeisk patentsøknad 0 540 051 (Nagahara et al.) beskriver aromatiske amidinderivater som er angitt å være i stand til å utvise en sterk antikoagulerende effekt via reversi-bel inhibering av faktor Xa.

Syntesen av a,a'-bis(amidinobenzyliden)sykloalkanoner og a,a<1->bis(amidinobenzyl)sykloalkanoner er beskrevet i Pharmazie

(1977), vol. 32, nr. 3, s. 141-145. Disse forbindelser er angitt å være serinproteaseinhibitorer.

Sammendrag av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse er rettet mot forbindelser eller deres farmasøytisk akseptable salter som inhiberer humanfaktor Xa og er derfor anvendbare som farmakologiske midler for behandling av sykdomstilstander som er karakterisert ved trombotisk aktivitet.

I ett aspekt tilveiebringer følgelig oppfinnelsen en forbindelse som er kjennetegnet ved at den er valgt fra gruppen bestående av følgende formler:

hvori:

Z<1> og Z<2> er hver -0-;

R<1> er hydrogen eller -OR<10>;

R<2> er -C(NH)NH2;

R<3> er -ClOjlKR^R<11>,

R<4> er hydrogen;

Rs er Ci-C6-alkyl;

R<6> er fenyl-Ci-Cs-alkyl;

hver R<1>0 og R1<1> er uavhengig hydrogen eller Ci-C6-alkyl;

som en enkelt stereoisomer eller en blanding derav; eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen et farmasøytisk preparat som er anvendbart ved behandling av et menneske med en sykdomstilstand, karakterisert ved trombotisk aktivitet, som er kjennetegnet ved at preparatet omfatter en terapeutisk effektiv mengde av en forbindelse ifølge krav 1

som en enkelt stereoisomer eller en blanding derav; eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, og en farmasøytisk aksep-tabel eksipiens.

I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen anvendelse av en forbindelse ifølge krav 1 som en enkelt stereoisomer eller en blanding derav; eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, for fremstilling av et medikament for behandling av en sykdomstilstand som er karakterisert ved trombotisk aktivitet i et menneske.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Definisjoner

Som anvendt i beskrivelsen og de medfølgende krav, har følgende uttrykk de angitte betydninger med mindre annet er spesifisert: "Eventuell" eller "eventuelt" betyr at den etterføl-gende beskrevne hendelse av omstendigheter kan eller kan ikke finne sted, og at beskrivelsen innbefatter tilfeller hvor angitte hendelse eller omstendighet finner sted, og omstendigheter hvor det ikke skjer. Eksempelvis betyr "eventuelt substituert aryl" at arylradikalet kan eller kan ikke være substituert, og at beskrivelsen innbefatter både substituerte arylradikaler og arylradikaler uten noen substitusjon. "Farmasøytisk akseptabelt salt" innbefatter både syre-og baseaddisjonssalter. "Farmasøytisk akseptabelt syreaddisjonssalt" angir de salter som bibeholder den biologiske effektivitet og egenskaper av de frie baser som ikke er biologiske eller på annen måte uønskede, og som dannes med uorganiske syrer slik som saltsyre, hydrobromsyre, svovelsyre, salpetersyre, fosforsyre og lignende, og organiske syrer slik som eddiksyre, trifluoreddiksyre,' propionsyre, glykolsyre, pyruvsyre, oksalsyre, maleinsyre, malonsyre, ravsyre, fumarsyre, vinsyre, sitronsyre, benzosyre. kanelsyre, mandelsyre, metansulfonsyre, etansulfonsyre, p-toluensulfonsyre, salisylsyre og lignende. "Farmasøytisk akseptabelt baseaddisjonssalt" angir de salter som bibeholder den biologiske effektivitet og egenskaper av de frie syrer som ikke er biologiske eller på annen måte uønskede. Disse salter fremstilles ved tilsetning av en uorganisk base eller en organisk base til den frie syre. Salter avledet fra uorganiske baser, innbefatter, men er ikke begrenset til, natrium-, kalium-, litium-, ammonium-, kalsium-, magnesium-, jern-, sink-, kobber-, mangan-, aluminiumsalter og lignende. Foretrukne, uorganiske salter er ammonium-, natrium-, kalium-, kalsium- og magnesiumsalter. Salter avledet fra organiske baser, innbefatter, men er ikke begrenset til, salter av primære, sekundære og tertiære aminer, substituerte aminer innbefattende naturlig forekommende substituerte aminer, sykliske aminer og basiske ionebytterharpikser, slik som isopropylamin, trimetyl-amin, dietylamin, trietylamin, tripropylamin, etanolamin, 2-dimetylaminoetanol, 2-dietylaminoetanol, trimetamin, disyklo-heksylamin, lysin, arginin, histidin, kaffein, prokain, hydra-bamin, kolin, betain, etylendiamin, glukosamin, metylglukamin, teobromin, puriner, piperazin, piperidin, N-etylpiperidin, polyaminharpikser og lignende. Særlig foretrukne, organiske baser er isopropylamin, dietylamin, etanolamin, trimetamin, disyklo-heksylamin, kolin og kaffein. "Terapeutisk effektiv mengde" refererer til den mengde av en forbindelse ifølge oppfinnelsen som, når den administreres til et menneske med behov for det, er tilstrekkelig til å bevirke behandling som definert nedenfor av sykdomstilstander som er karakterisert ved trombotisk aktivitet. Mengden av en forbindelse ifølge oppfinnelsen som utgjør en "terapeutisk effektiv mengde", vil variere avhengig av forbindelsen, sykdomstilstanden og dens strenghet, og alderen til det menneske som skal behandles, men kan bestemmes rutinemessig av fagmannen ut fra hans egen kunnskap og foreliggende beskrivelse. "Behandle" eller "behandling" som anvendt her, dekker behandling av en sykdomstilstand i et menneske, hvilken sykdomstilstand er karakterisert ved trombotisk aktivitet; og innbefatter: (i) forhindring av sykdomstilstanden i å oppstå i et menneske, i særdeleshet når et slikt menneske er predisponert for sykdomstilstanden, men er ikke blitt diagnostisert som å ha den; (ii) inhibering av sykdomstilstanden, dvs. stansing av dens utvikling; eller (iii) lindring av sykdomstilstanden, dvs. forårsake regresjon av sykdomstilstanden.

Utbyttet av hver av de her beskrevne reaksjoner er uttrykt som en prosent av det teoretiske utbytte.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen, eller deres far-masøytisk akseptable salter, kan ha asymmetriske karbonatomer i deres struktur. Forbindelsene ifølge oppfinnelsen og deres farmasøytisk akseptable salter kan derfor eksistere som enkle stereoisomerer, racemater, og som blandinger av enantiomerer og diastereomerer. Alle slike enkle stereoisomerer, racemater og blandinger derav er ment å være innen oppfinnelsens ramme.

Det skal bemerkes at når R<1> er den samme substituent som R<3>, R<2> er den samme substituent som R<4>, og Z<1> og Z<2> er det samme, er forbindelsene av formel (I) de samme som forbindelsene av formel (II), og forbindelsene av formel (III) er de samme som forbindelsene av formel (IV).

Nomenklaturen anvendt her, er en modifisert form av I.U.P.A.C.-systemet hvor forbindelsene ifølge oppfinnelsen er navngitt som derivater av purin. Eksempelvis er en forbindelse ifølge oppfinnelsen valgt fra formel (II), hvori Z<1> og Z<2> begge er

-O-; R<1> er -OR<10> hvori R<10> er fenyl; R<2> er -C(NH)NH2; R3 er -C(O)N(R10)R<11> hvori R" og R1<1> begge er metyl; R<4> er hydrogen; R<5 >er etyl; og R<6> er -(C(R<7>) (R<8>))n-R<9> hvori n er 1, R7 er hydrogen, R<8 >er etyl, og R<9> er -C(0)OR<10> hvori R1<0> er metyl, dvs. en forbindelse av følgende formel:

er her navngitt som 2-(3-dimetylaminokarbonylfenoksy)-6-(2-fenoksy-4-amidinofenoksy)-9-(1-metoksykarbonylpropyl)-8-etylpurin.

Anvendelighet og administrering

A. Anvendelighet

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen er inhibitorer av faktor Xa og er derfor anvendbare ved sykdomstilstander som er karakterisert ved trombotisk aktivitet basert på faktor Xa's rolle i koagulasjonskaskaden (se bakgrunn for oppfinnelsen ovenfor). En primær indikasjon for forbindelsene er profylakse for langtidsrisiko etter myokardialt infarkt. Ytterligere indikasjoner er profylakse av dyp venetrombose (DVT) etter or-topedisk kirurgi, eller profylakse av utvalgte pasienter etter et forbigående iskemisk anfall. Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan også være anvendbare for indikasjoner hvori kumarin for tiden anvendes, slik som for DVT eller andre typer av kirurgisk inter-vensjon, slik som koronar arterie-bypasstransplantasjon og per-kutan, transluminal koronarangioplasti. Forbindelsene er også anvendbare for behandling av trombotiske komplikasjoner assosiert med akutt, promyelocytisk leukemi, diabetes, multiple myelomer, disseminert, intravaskulær koagulasjon assosiert med septisk sjokk, purpura fulminanas-assosiert infeksjon, respirasjonsnøds-syndrom hos voksne, ustabil angina og trombotiske komplikasjoner assosiert med aortisk klaff- eller vaskulær protese. Forbindelsene er også anvendbare for profylakse av trombotiske syk-dommer, i særdeleshet hos pasienter som har en høy risiko for å utvikle slik sykdom.

I tillegg er forbindelsene ifølge oppfinnelsen anvendbare som in vi tro diagnostiske reagenser for selektiv inhibering av faktor Xa uten inhibering av andre komponenter av koagulasj onskaskaden.

B. Testing

De primære bioutprøvninger anvendt for å demonstrere den inhiberende effekt av forbindelsene ifølge oppfinnelsen på faktor Xa, er enkle kromogeniske utprøvninger som innbefatter bare serinprotease, den forbindelse ifølge oppfinnelsen som skal testes, substrat og buffer (se Thrombosis Res. (1979), vol. 16,

s. 245-254). Eksempelvis kan fire humane vevsserinproteaser anvendes i den primære bioutprøvning, fri faktor Xa, protrombinase, trombin (Ila) og vevsplasminogenaktivator (tPA). Utprøv-ningen for TPA har vært vellykket anvendt tidligere for å demonstrere uønskede bivirkninger ved inhibering av den fibrino-lytiske prosess (se f.eks. J. Med. Chem. (1993), vol. 36, s. 314-319). En annen bioutprøvning som er anvendbar ved demonstrering av anvendeligheten av forbindelsene ifølge oppfinnelsen ved inhibering av faktor Xa, viser styrken av forbindelsene mot fri faktor Xa i sitrert plasma. Eksempelvis vil den antikoagulerende effektivitet av forbindelsene ifølge oppfinnelsen bli testet under anvendelse av enten protrombintiden (PT) eller aktivert, partiell tromboplastintid (aPTT), mens selektiviteten av forbindelsene kontrolleres med trombinlevringstid- (TCT) utprøv-ningen. Korrelasjon av Ki i den primære enzymutprøvning med Ki for fri faktor Xa i sitrert plasma vil "screene" mot forbindelser som interagerer med eller inaktiveres av andre plasmakomponenter. Korrelasjon av Ki med utstrekningen av PT er en nødvendig in vitro demonstrasjon for at styrken i den frie faktor Xa inhiber-ingsutprøvning stemmer overens med styrken i en klinisk koagu-lasjonsutprøvning. I tillegg kan utstrekningen av PT i sitrert

plasma anvendes for å måle virkningsvarigneten i etterfølgende farmakodynamiske studier.

For ytterligere informasjon vedrørende utprøvninger for å demonstrere aktiviteten av forbindelsene ifølge oppfinnelsen, se R. Lottenberg et al., Methods in Enzymology (1981), vol. 80, s. 341-361, og H. Ohno et al., Thrombosis Research (1980), vol. 19, S. 579-588.

C. Generell administrering

Administrering av forbindelsene ifølge oppfinnelsen, eller deres farmasøytisk akseptable salter, i ren form eller i et egnet farmasøytisk preparat, kan utføres via enhver av de aksepterte administreringsmåter eller -midler som tjener lignende anvendelse. Administreringen kan således f.eks. være oral, nasal, parenteral, topisk, transdermal eller rektal, i form av fast, halvfast, lyofilisert pulver, eller væskedoseringsformer, slik som f.eks. tabletter, stikkpiller, piller, myke, elastiske og harde gelatinkapsler, pulvere, løsninger, suspensjoner eller aerosoler eller lignende, fortrinnsvis i enhetsdoseringsformer egnet for enkel administrering av eksakte doser. Preparatene vil innbefatte en konvensjonell farmasøytisk bærer eller eksipiens og en forbindelse ifølge oppfinnelsen som aktivt middel, og kan i tillegg innbefatte andre medisinske midler, farmasøytiske midler, bærere, adjuvanser, etc.

Avhengig av den beregnede administreringsmåte vil de farmasøytisk akseptable preparater generelt inneholde ca. 1 til ca. 99 vekt% av en forbindelse ifølge oppfinnelsen, eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, og 99 til 1 vekt% av en egnet farmasøytisk eksipiens. Fortrinnsvis vil preparatet inneholde ca. 5 til 75 vekt% av en forbindelse ifølge oppfinnelsen, eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, og hvor resten er egnede farmasøytiske eksipienser.

Den foretrukne administreringsrute er oral under anvendelse av et hensiktsmessig daglig doseregime som kan justeres i henhold til graden av strenghet av den sykdomstilstand som skal behandles. For slik oral administrering dannes et farmasøytisk akseptabelt preparat inneholdende en forbindelse ifølge oppfinnelsen, eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, ved inkorporering av enhver av de normalt anvendte eksipienser, slik som f.eks. farmasøytiske kvaliteter av mannitol, laktose, stivelse, pregelatinert stivelse, magnesiumstearat, natriumsakkarin, talkum, celluloseeterderivater, glukose, gelatin, sukrose, sitrat, propylgallat og lignende. Slike preparater kan anta form av løsninger, suspensjoner, tabletter, piller, kapsler, pulvere, formuleringer med forlenget frigivelse og lignende.

Fortrinnsvis vil slike preparater anta form av kapsel, kaplett eller tablett, og vil derfor også inneholde et for-tynningsmiddel slik som laktose, sukrose, dikalsiumfosfat og lignende; et oppbrytende middel slik som crosscarmelose-natrium eller derivater derav; et smøremiddel slik som magnesiumstearat og lignende; og et bindemiddel slik som en stivelse, gummiakasie, polyvinylpyrrolidon, gelatin, celluloseeterderivater og lignende.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen, eller deres far-masøytisk akseptable salter, kan også formuleres i en stikkpille under anvendelse av f.eks. ca. 0,5% til ca. 50% aktiv bestanddel anbrakt i en bærer som langsomt oppløses i kroppen, f.eks. polyoksyetylenglykoler og polyetylenglykoler (PEG), f.eks. PEG 1000 (96%) og PEG 4000 (4%).

Væskeformige, farmasøytisk administrerbare preparater kan f.eks. fremstilles ved oppløsning, dispergering, etc, av en forbindelse ifølge oppfinnelsen (ca. 0,5% til ca. 2 0%) eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, og eventuelle farmasøytiske adjuvanser i en bærer slik som f.eks. vann, saltvann, vandig dekstrose, glyserol, etanol og lignende, for derved å danne en løsning eller suspensjon.

Om ønsket, kan et farmasøytisk preparat ifølge oppfinnelsen også inneholde mindre mengder av hjelpesubstanser slik som fukte- eller emulgeringsmidler, pH-bufrende midler, anti-oksidanter og lignende, slik som f.eks. sitronsyre, sorbitan-monolaurat, trietanolaminoleat, butylert hydroksytoluen, etc.

Aktuelle metoder for fremstilling av slike doserings-former er kjent, eller vil være innlysende, for fagmannen, se f.eks. Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. utg., (Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 1990). Det preparat som skal administreres, vil i ethvert tilfelle inneholde en terapeutisk effektiv mengde av en forbindelse ifølge oppfinnelsen eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, for behandling av en sykdomstilstand som lindres ved inhibering av faktor Xa i henhold til foreliggende oppfinnelses lære.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen, eller deres far-masøytisk akseptable salter, administreres i en terapeutisk effektiv mengde som vil variere avhengig av et utall faktorer, innbefattende aktiviteten av den spesifikke forbindelse som anvendes, den metabolske stabilitet og lengden av virkningen av forbindelsen, alder, kroppsvekt, generell helse, kjønn, diett, måte og tid for administreringen, graden av ekskresjon, legemiddelkombinasjon, strengheten av den bestemte sykdomstilstand og den vert som gjennomgår behandling. Generelt er en terapeutisk effektiv daglig dose på fra ca. 0,14 mg til ca.

14,3 mg/kg kroppsvekt pr. dag av en forbindelse ifølge oppfinnelsen eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, fortrinnsvis fra ca. 0,7 mg til ca. 10 mg/kg kroppsvekt pr. dag, og mest fordelaktig fra 1,4 mg til ca. 7,2 mg/kg kroppsvekt pr. dag. For administrering til en 70 kg tung person vil f.eks. dose-området være fra ca. 10 mg til ca. 1,0 g pr. dag av en forbindelse ifølge oppfinnelsen eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, fortrinnsvis fra ca. 50 mg til ca. 700 mg pr. dag, og mest fordelaktig fra ca. 100 mg til ca. 500 mg pr. dag.

Foretrukne utførelsesformer

Blant forbindelsene ifølge oppfinnelsen som angitt ovenfor i sammendraget av oppfinnelsen, er en foretrukket gruppe de forbindelser hvori

Z<1> og Z<2> er hver -O-;

R<1> er hydrogen;

R<2> er -C(NH)NH2;

R<3> er -C(O)N(R<10>)R<11>;

R<*> er hydrogen;

R<5> er Ci-C6-alkyl;

R<6> er fenyl-Ci-C6-alkyl;

hver R10 og R<1X> er uavhengig hydrogen eller Ci-C6-alkyl.

Blant denne gruppe av forbindelser er en foretrukket undergruppe av forbindelser den undergruppe hvori R<3> er -C (0) N (R10) R11;

R<4> er hydrogen;

R<5> er metyl eller etyl;

R<6> er benzyl; og

R<1>0 og R1<1> er uavhengig hydrogen eller metyl.

Foretrukne forbindelser er en forbindelse av formel (I) hvori R<3> er -C (OjNtR^jR11 hvori R<10> og <R11> begge er metyl, R<4> er hydrogen, R<5> er metyl, og R<6> er benzyl, nemlig 2-(2-hydroksy-S-amidinof enoksy) -6-(3-dimetylaminokarbonyl)fenoksy)-8-metyl-9-benzylpurin.

Foretrukne forbindelser er en forbindelse av formel

(II) hvori R3 er -C(0)N(R10)R<11> hvori R<10> og R<11> begge er metyl, R<4 >er hydrogen, Rs er metyl, og R<6> er benzyl, nemlig 6-(2-hydroksy-B-amidinof enoksy) -2-(3-dimetylaminokarbonylfenoksy)-8-metyl-9-benzylpurin.

Fremstilling av forbindelser ifølge oppfinnelsen

Av hensiktsmessige grunner er den etterfølgende beskrivelse av fremstilling av forbindelsene ifølge oppfinnelsen rettet mot fremstilling av forbindelser av formel (I) og (II). Det skal imidlertid forstås at lignende synteseprosesser kan anvendes for å fremstille forbindelser av formel (III) og (IV) . Det skal også forstås at i den etterfølgende beskrivelse er kombinasjoner av substituenter og/eller variabler (f.eks. R7 og R<8>) i de viste forbindelser tillatelige bare hvis slike kombinasjoner resulterer i stabile forbindelser.

A. Fremstilling av forbindelser av formel ( Ila)

Forbindelser av formel (Ila) er forbindelser av formel (II) hvori Z<1> og Z<2> begge er -0- og R<2> er -C(NH)NH2. Disse forbindelser kan fremstilles som illustrert i det etterfølgende reaksjonsskjema 1 hvori: R<1> hydrogen eller JOR<10> og R<4> er hydrogen; R<5> er Ci-C6-alkyl; R<6> er fenyl-Ci-C6-alkyl; hver R10 og R1<1> er uavhengig hydrogen eller Ci-Ce-alkyl; og R<14> er al kyl:

Forbindelser av formel (A), formel (B), formel (D), formel (G) og formel (K) er kommersielt tilgjengelige, f.eks.

fra Aldrich Chemical Co., eller Sigma Chemical Co., eller ICN Biomedicals, eller kan fremstilles i henhold til metoder kjent innen faget.

Generelt fremstilles forbindelsene av formel (Ila)

ved først å behandle en forbindelse av formel (A) i ét aprotisk løsningsmiddel slik som acetonitril, ved temperaturer mellom -10 °C og 10 °C, fortrinnsvis ved 0 °C, med en ekvimolar mengde av en forbindelse av formel (B) i nærvær av en base, f.eks. cesiumkarbonat. Reaksjonsblandingen tillates å omrøres ved omgivende temperatur i 12 til 20 timer, fortrinnsvis ca. 16 timer. Forbindelsen av formel (C) isoleres deretter fra reaksjonsblandingen ved standard isoleringsteknikker slik som ekstraksjon, fjerning av løsningsmidlet i vakuum og flashkromatografi.

Forbindelsen av formel (C) i et aprotisk løsningsmid-del, fortrinnsvis acetonitril, ved temperaturer mellom ca. -10 °C og 10 °C, fortrinnsvis ved 0 °C, i nærvær av en base, fortrinnsvis cesiumkarbonat, behandles med en ekvimolar mengde av en forbindelse av formel (D). Den resulterende reaksjonsblanding oppvarmes til ca. 50 °C i 3 til 6 timer, fortrinnsvis ca. 4 timer. Forbindelsen av formel (E) isoleres fra reaksjonsblandingen ved standard teknikker, slik som filtrering, fjerning av løsningsmidler i vakuum og flashkromatografi.

Forbindelsen av formel (E) i et protisk løsningsmiddel slik som metanol, ved temperaturer fra ca. -10 °C til ca. 10 °C, fortrinnsvis ved 0 °C, behandles deretter med et sterkt oksida-sjonsmiddel slik som kaliummetabisulfitt (KHS05) i vann. Den resulterende reaksjonsblanding tillates å omrøres ved omgivende temperatur i 12 til 16 timer, fortrinnsvis ca. 15 timer. Bland-ingen konsentreres og ekstraheres med et aprotisk løsningsmiddel slik som metylenklorid, under dannelse av den tilsvarende sul-fonylforbindeIse av formel (F). Forbindelsen av formel (F) oppløses i et aprotisk løsningsmiddel, fortrinnsvis acetonitril, ved temperaturer fra ca. -10 °C til 10 °C, fortrinnsvis ca. 0 °C, i nærvær av en base, fortrinnsvis cesiumkarbonat. En forbindelse av formel (G) tilsettes deretter til løsningen, og den resulterende reaksjonsblanding omrøres ved omgivende temperatur i ca. 12 til ca. 16 timer, fortrinnsvis ca. 16 timer. Forbindelsen av formel (H) isoleres deretter fra reaksjonsblandingen ved standard isoleringsteknikker, slik som fjerning av løsningsmiddel i vakuum og flashkromatografi.

Forbindelsen av formel (H) reduseres under standard reduksjonsbetingelser, slik som Zn/HCl. Den resulterende amino-forbindelse av formel (J) isoleres fra reaksjonsblandingen via standardteknikker slik som nøytralisering med en svak base, f.eks. NaHC03, etterfulgt av ekstraksjon med et organisk løs-ningsmiddel, slik som etylacetat og fjerning av løsningsmidlet i vakuum. Forbindelsen av formel (J) behandles med et imidat av formel (K) i et polart løsningsmiddel, slik som i en blanding av tetrahydrofuran (THF) og etanol, ved temperaturer på fra ca. 60 °C til ca. 75 °C, fortrinnsvis ca. 70 °C, i 2 til 4 timer, fortrinnsvis ca. 3 timer. Forbindelsen oppvarmes deretter under vakuum ved fra ca. 150 °C til ca. 200 °C, fortrinnsvis ved ca. 170 °C, i fra ca. 1 til 3 timer, fortrinnsvis ca. 2 timer. Reaksjonsblandingen konsentreres deretter under dannelse av en olje som ytterligere renses ved standard renseteknikker (filtrering, ekstraksjon og fjerning av løsningsmidlet i vakuum) under dannelse av purinet av formel (L).

Forbindelsen av formel (L) oppløses i en alkanol, fortrinnsvis etanol, ved 0 °C, og den resulterende løsning mettes deretter med en uorganisk syregass, fortrinnsvis saltsyre. Reaksjonsblandingen forsegles og tillates å oppvarmes til omgivende temperatur over en periode på fra 12 timer til 16 timer. Reaksjonsblandingen konsentreres, og et polart løs-ningsmiddel slik som eter, tilsettes til den konsentrerte blanding. Det resulterende bunnfall oppløses i en alkanol, fortrinnsvis etanol, og den resulterende løsning avkjøles til ca. 0 °C og behandles deretter med vannfri ammoniakk (gass) i ca. 5 til 20 minutter. Reaksjonsblandingen forsegles deretter og oppvarmes til temperaturer på fra mellom omgivende temperatur og 100 °C, fortrinnsvis ved ca. 60 °C i fra ca. 2 til 6 timer, fortrinnsvis ca. 2 timer. Reaksjonsblandingen avkjøles, og løsningsmidlene fordampes. En forbindelse av formel (Ila) isoleres fra reaksjonsblandingen ved standard isoleringsteknikker, slik som filtrering, fordampning av løsningsmidlene og rensing ved preparativ HPLC.

Istedenfor å behandle den resulterende løsning ovenfor med vannfri ammoniakk, kan alternativt den resulterende løsning behandles med en forbindelse av formel NH2OR<10> for å gi en forbindelse av formel (II) hvori R<2> er -C(NH)N(H)OR<10.>

Forbindelser av formel (Ila) hvori R3 er -C(NH)NH2, fremstilles fra de tilsvarende cyanforbindelser på en lignende måte som beskrevet ovenfor for forbindelser av formel (L).

B. Fremstilling av forbindelser av formel ( Ia)

Forbindelser av formel (Ia) er forbindelser av formel (I) hvori Z<1> og Z<2> er -O- og R2 er -C(NH)NH2. Disse forbindelser kan fremstilles som illustrert i det etterfølgende reaksjonsskjema 2, hvori X er halogen; R<1> er uavhengig hydrogen eller -OR<10 >og R<4> er hydrogen; R3 er -C(NH)NH2; R<5> er Ci-Cs-alkyl; R6 er fenyl-Ci-C6-alkyl; hver R10 og R1<1> er uavhengig hydrogen eller Ci-C6-alkyl; og R<14> er alkyl:

Generelt fremstilles forbindelser av formel (Ia) ved først å behandle en forbindelse av formel (A) med en forbindelse av formel (G) på lignende måte som beskrevet ovenfor for fremstilling av forbindelser av formel (H) fra forbindelser av formel (F) og (G), for å gi en forbindelse av formel (M). Forbindelsen av formel (M) behandles deretter med en forbindelse av formel (D) på lignende måte med hva som er beskrevet ovenfor for forbindelsen av formel (C), for å gi en forbindelse av formel (N). Forbindelsen av formel (N) oksideres deretter til den tilsvarende forbindelse av formel (0) på lignende måte med hva som er beskrevet ovenfor for forbindelsene av formel (E). Forbindelsen av formel (0) behandles med en forbindelse av formel (B) på lignende måte med hva som er beskrevet ovenfor for forbindelsen av formel (A), for å gi en forbindelse av formel (P) som deretter reduseres til den tilsvarende forbindelse av formel (Q) på lignende måte med hva som er beskrevet ovenfor for forbindelser av formel (H). Forbindelsen av formel (Q) behandles deretter med et alkylimidat av formel (K) på lignende måte som beskrevet ovenfor for forbindelsen av formel (J), for å gi en forbindelse av formel (R) som omdannes til det tilsvarende amidinderivat av formel (Ia) på lignende måte som beskrevet ovenfor for forbindelsen av formel (L).

I tillegg gjelder alle de forskjellige substituentom-dannelser som er beskrevet ovenfor for forbindelsene av formel (Ila), også for forbindelsene av formel (Ia) for å gi ytterligere forbindelser ifølge oppfinnelsen som ikke er vist i det foregå-ende reaksjonsskjema.

I tillegg kan lignende reaksjoner utføres på lignende utgangsmaterialer og mellomprodukter for å gi de tilsvarende forbindelser av formel (III) og forbindelser av formel (IV).

I tillegg kan alle forbindelser ifølge oppfinnelsen som eksisterer i fri basefortn eller fri syreform, omdannes til deres farmasøytisk akseptable salter ved behandling med den egnede uorganiske eller organiske syre, eller med den egnede uorganiske eller organiske base. Salter av forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan også omdannes til den frie baseform eller til den frie syreform eller til et annet salt ved metoder velkjente innen faget.

De etterfølgende spesifikke fremstillinger og eksempler er tilveiebrakt som en henvisning til å medhjelpe til utøvelse av oppfinnelsen.

Fremstilling 1

Forbindelser av formel ( C) og formel ( P)

A. Til 4,6-diklor-5-nitro-2-metyltiopyrimidin (5,0 g, 20,8 mmol) i 200 ml acetonitril ved 0 °C ble det tilsatt cesiumkarbonat (8,82 g, 27,1 mmol) etterfulgt av tilsetning av 3-hydroksy-4-benzyloksybenzonitril (4,69 g, 20,8 mmol), og den resulterende reaksjonsblanding ble omrørt i 16 timer. De flyktige bestanddeler ble fordampet, og residuet ble kromatografert på silikagel (heksan/etylacetat, 2:1) under dannelse av 5,0 g 2-metyltio-4-klor-5-nitro-6-(2-benzyloksy-5-cyanfenoksy)pyridin, en forbindelse av formel (C).

C. På lignende måte ble 2-metylsulfonyl-4-benzylamino-5-nitro-6-(3-dimetylaminokarbonylfenoksy)pyrimidin behandlet med 3-hydroksy-4-benzyloksybenzonitril i nærvær av cesiumkarbonat under dannelse av 2-(2-benzyloksy-5-cyanfenoksy)-4-benzylamino-5-nitro-6-(3-dimetylaminokarbonylfenoksy)pyrimidin, en forbindelse av formel (P).

Fremstilling 2

Forbindelser av formel ( E) og formel ( N)

A. Til 6-(2-benzyloksy-5-cyanfenoksy)-4-klor-5-nitro-2-metyltiopyrimidin (2,5 g, 5,83 mmol) i 50 ml acetonitril ved 0 °C ble det tilsatt cesiumkarbonat (2,47 g, 7,58 mmol), etterfulgt av 0,64 ml benzylamin, og reaksjonsblandingen ble oppvarmet til 50 °C i 4 timer. Reaksjonsblandingen ble filtrert, filtratet ble fordampet, og residuet ble kromatografert på silikagel (etylacetat:heksan) under dannelse av 1,82 g (65%) 6-(2-benzyloksy-5-cyanfenoksy)-4-(benzyl)amino-5-nitro-2-metyl-tiopyrimidin, en forbindelse av formel (E). C. På lignende måte ble det til 2-metyltio-4-klor-5-nitro-6-(3-dimetylaminokarbonylfenoksy)pyrimidin (3,19 g,

8,65 mmol), en forbindelse av formel (M), i 90 ml acetonitril ved 0 °C tilsatt cesiumkarbonat (3,66 g, 11,2 mmol), etterfulgt av tilsetning av benzylamin (0,95 ml, 8,65 mmol). Reaksjonsblandingen ble oppvarmet til 75 °C i 4 timer. Reaksjonsblandingen ble filtrert, filtratet ble fordampet, og residuet ble kromatografert på silikagel (etylacetat:metanol, 10:1) under dannelse av 1,76 g (48%) 2-metyltio-4-(benzyl)amino-5-nitro-6-(3-dimetylaminokar-bonylf enoksy) pyrimidin, en forbindelse av formel (N).

Fremstilling 3

Forbindelser av formel ( F) og ( 0)

A. Til 2-metyltio-4-benzylamino-5-nitro-6-(2-benzyl-oksy-5-cyanfenoksy)pyrimidin (1,82 g, 3,76 mmol) i 40 ml MeOH og 40 ml dioksan ved 0 °C ble det tilsatt kaliummetabisulfitt (KHS05)

(3,59 g, 11,3 mmol) i 40 ml vann. Suspensjonen fikk oppvarmes til omgivende temperatur og ble omrørt i 15 timer. Reaksjonsblandingen ble konsentrert til 25 ml og ekstrahert med 200 ml metylenklorid. Det organiske lag ble tørket (Na2S04) , ble fordampet og kromatografert på silikagel (2:1, heksan/etylacetat) under dannelse av 0,26 g 2-metylsulfonyl-4-benzylamino-5-nitro-6-(2-benzyl-

oksy-5-cyanfenoksy)pyrimidin, en forbindelse av formel (F) som et hvitt, fast materiale. C. På lignende måte ble 2-metyltio-4-benzylamino-5-nitro-6-(3-dimetylaminokarbonylfenoksy)pyrimidin, en forbindelse av formel (N), oksidert under dannelse av 2-metylsulfonyl-4-benzylamino-5-nitro-6-(3-dimetylaminokarbonylfenoksy)pyrimidin, en forbindelse av formel (0).

Fremstilling 4

Forbindelser av formel ( H) og ( M)

A. Til 2-metylsulfonyl-4-benzylamino-5-nitro-6-(2-benzyloksy-5-cyanfenoksy)pyrimidin, en forbindelse av formel (F)

(0,69 g, 1,38 mmol) i 15 ml acetonitril ved 0 °C ble det tilsatt cesiumkarbonat (0,58 g, 1,80 mmol), etterfulgt av tilsetning av 3-(dimetylaminokarbonyl)fenol (0,20 g, 1,24 mmol), og reaksjonsblandingen ble omrørt i 16 timer. De flyktige bestanddeler ble fordampet, og residuet ble kromatografert på silikagel (CH2C12/-etylacetat, 7:2) under dannelse av 0,29 g 2-(3-dimetylaminokar-bonyl f enoksy ) -4-benzylamino-5-nitro-6-(2-benzyloksy-5-cyan-fenoksy)pyrimidin, en forbindelse av formel (H). C. På lignende måte ble 2-metyltio-5-nitro-4,6-di-klorpyrimidin behandlet med 3-(dimetylaminokarbonyl)fenol i nærvær av cesiumkarbonat under dannelse av 2-metyltio-5-nitro-4-klor-6-(3-dimetylaminokarbonylfenoksy)pyrimidin, en forbindelse av formel (M).

Fremstilling 5

Forbindelser av formel ( J) og formel ( Q)

A. 2-(3-dimetylaminokarbonylfenoksy)-4-benzylamino-5-nitro-6-(2-benzyloksy-5-cyanfenoksy)pyrimidin, en forbindelse av formel (H) (0,29 g, 0,47 mmol) og 0,1 g granulær sink ble blandet med 10 ml THF og 1,0 ml 10% vandig HCl. Reaksjonsblandingen ble oppvarmet til 80 °C i 90 minutter. De flyktige bestanddeler ble fordampet. Mettet, vandig NaHC03 ble tilsatt, og løsningen ble ekstrahert med 300 ml etylacetat. Det organiske lag ble tørket (Na2S04) og fordampet under dannelse av 0,27 g 2-(3-dimetylamino-karbonylfenoksy)-4-benzylamino-5-amino-6-(2-benzyloksy-5-cyanofenoksy)pyrimidin, en forbindelse av formel (J). C. På lignende måte ble 2-(2-benzyloksy-5-cyanfenok-sy)-4-benzylamino-5-nitro-6-(3-dimetylaminokarbonyl)fenoksy-pyrimidin (1,2 g, 1,95 rnrnol), en forbindelse av formel (P), redusert under dannelse av 1,30 g 2-(2-benzyloksy-5-cyanfenoksy)-4- benzylamino-5-amino-6-(3-dimetylaminokarbony1)fenoksypyrimidin, en forbindelse av formel (Q).

Fremstilling 6

Forbindelser av formel ( L) og ( R)

A. 2-(3-dimetylaminokarbonylfenoksy)-4-(benzyl)amino-5- amino-6-(2-benzyloksy-5-cyanfenoksy)pyrimidin, en forbindelse av formel (J), (0,26 g, 0,44 mmol), ble behandlet med etylimidat-hydroklorid (0,17 g, 1,3 mmol) i THF/etanol ved 80 °C i 6 timer og ble deretter konsentrert til en olje. Residuet ble oppvarmet i et sandbad under vakuum til 170 °C i 2,0 timer, ble avkjølt og filtrert gjennom en pute av silika og eluert med 5% metanol i metylenklorid. Fordampning av de flyktige bestanddeler ga 0,20 g 2-(3-dimetylaminokarbonylfenoksy)-6-(2-benzyloksy-5-cyanfenoksy)-8-metyl-9-benzylpur.in, en forbindelse av formel (L) . C. På lignende måte ga behandling av 2-(2-benzyloksy-5-cyanfenoksy)-4-(benzyl)amino-5-amino-6-(3-dimetylaminokar-bonyl) f enoksypyrimidin (1,14 g, 1,94 mmol) med etylimidat-hydroklorid (0,31 g, 2,53 mmol) 0,65 g 2-(2-benzyloksy-5-cyan-fenoksy)-6-(3-dimetylaminokarbonyl)fenoksy-8-metyl-9-benzylpurin, en forbindelse av formel (R).

Eksempel 1

Forbindelser av formel ( I) og ( II)

A. 6-(2-benzyloksy-5-cyanfenoksy)-2-(3-dimetylamino-karbonyl) f enoksy-8-metyl-9-benzylpurin (0,2 g, 0,33 mmol) ble oppløst i 5,0 ml etanol i et trykkar ved 0 °C og mettet med HCl-gass. Reaksjonsblandingen ble forseglet og fikk oppvarmes til omgivende temperatur i løpet av 16 timer. Reaksjonsblandingen ble deretter konsentrert til 20 ml, og eter ble tilsatt. Det resulterende bunnfall ble oppløst i 30 ml etanol, ble avkjølt til 0 °C, og ammoniakkgass ble boblet gjennom løsningen i 10 minutter. Reaksjonsblandingen ble forseglet og oppvarmet til 60 °C i 2 timer. Reaksjonsblandingen fikk avkjøles, røret ble åpnet med forsiktighet, og de flyktige bestanddeler ble fordampet under dannelse av 0,152 g urent produkt. Rensing ved preparativ HPLC ga 0,015 g 6-(2-hydroksy-5-amidinofenoksy)-2-(3-dimetylaminokar-bonyl) f enoksy- 8 -me tyl- 9 -benzylpurin, en forbindelse av formel (II) NMR (DMSO-ds) 9,10 (brs, 2), 8,80 (brs, 2), 7,80 (d, 1), 7,70 (d, 1), 7,10-7,50 (m, 10), 5,40 (s, 2), 3,00 (brs, 6), 2,70 (s, 3) . C. På lignende måte ble 0,65 g 2-(2-benzyloksy-5-cyanfenoksy)-6-(3-dimetylaminokarbonyl)fenoksy-8-metyl-9-benzylpurin omdannet til 0,39 g 2-(2-hydroksy-5-amidinofenoksy)-6-(3-dimetylaminokarbonyl)fenoksy-8-metyl-9-benzylpurin, en forbindelse av formel (I) NMR (DMS0-ds) 9,10 (brs, 2), 8,80 (brs, 2), 7,70 (d, 1), 7,65 (d, 1), 7,50 (dd, 1), 7,25-7,40 (m, 8), 7,10 (d, 1), 5,40 (s, 2), 3,00 (s, 3), 2,90 (s, 3), 2,70 (s, 3).

Eksempel 2

Dette eksempel illustrerer fremstilling av represen-tative farmasøytiske preparater for oral administrering inneholdende en forbindelse ifølge oppfinnelsen eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, f.eks. 2-(3-dimetylaminokarbonylfenoksy)-6-(2-hydroksy-4-amidinofenoksy)-9-(1-metoksykarbonylpropyl)-8-metyl-9-benzylpurin:

De ovenfor angitte bestanddeler ble blandet og fylt i hardskallede gelatinkapsler inneholdende 100 mg hver.

De ovenfor angitte bestanddeler med unntak av magnes-iumstearatet ble kombinert og granulert under anvendelse av vann som granuleringsvæske. Formuleringen ble deretter tørket, blandet med magnesiumstearat og formet til tabletter med en egnet tab-letteringsmaskin.

Forbindelsen ifølge oppfinnelsen ble oppløst i pro-pylenglykol, polyetylenglykol 400 og polysorbat 80. En tilstrekkelig mengde vann ble deretter tilsatt under omrøring under dannelse av 100 ml av løsningen som ble filtrert og fylt i flasker.

De ovenfor angitte bestanddeler ble smeltet, blandet og fylt i myke, elastiske kapsler.

Forbindelsen ifølge oppfinnelsen ble oppløst i cellu-lose/sal tvannsløsningen, ble filtrert og fylt i flasker for bruk.

Eksempel 3

Dette eksempel illustrerer fremstilling av en repre-sentativ farmasøytisk formulering for parenteral administrering, inneholdende en forbindelse ifølge oppfinnelsen eller et farma-søytisk akseptabelt salt derav, f.eks. 2-(3-dimetylamino-karbonyl f enoksy) -6-(2-fenoksy-4-amidinofenoksy)-9-(1-metoksy-karbonylpropyl)-8-metylpurin:

Forbindelsen ifølge oppfinnelsen ble oppløst i pro-pylenglykol, polyetylenglykol 400 og polysorbat 80. En tilstrekkelig mengde av 0,9% saltvannsløsning ble deretter tilsatt under omrøring under dannelse av 100 ml av I.V.-løsningen som ble filtrert gjennom et 0,2 um membranfilter og ble forpakket under sterile betingelser.

Eksempel 4

Dette eksempel illustrerer fremstilling av et repre-sentativt farmasøytisk preparat i stikkpilleform, inneholdende en forbindelse ifølge oppfinnelsen, eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, f.eks. 2-(3-dimetylaminokarbonylfenoksy)-6-(2-fenoksy-4-amidinofenoksy)-9-(1-metoksykarbonylpropyl)-8-etyl-9-benzylpurin:

Bestanddelene ble smeltet sammen og blandet på et dampbad og helt over i former inneholdende 2,5 g totalvekt.

Eksempel 5

Dette eksempel illustrerer fremstilling av en repre-sentativ farmasøytisk formulering for innånding, inneholdende en forbindelse ifølge oppfinnelsen, eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, f.eks. 2-(3-dimetylaminokarbonylfenoksy)-6-(2-fenoksy-4-amidinofenoksy)-9-(1-metoksykarbonylpropyl)-8-etyl-9-benzylpurin:

Bestanddelene ble malt, blandet og forpakket i en inhaleringsanordning utstyrt med en doseringspumpe.

Eksempel 6

Dette eksempel illustrerer fremstilling av en repre-sentativ farmasøytisk formulering i forstøvet form, inneholdende en forbindelse ifølge oppfinnelsen, eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, f.eks. 2-(3-dimetylaminokarbonylfenoksy)-6-(2-fenoksy-4-amidinofenoksy)-9-(1-metoksykarbonylpropyl)-8-etylpurin:

Forbindelsen ifølge oppfinnelsen ble oppløst i etanol og blandet med vann. Formuleringen ble deretter forpakket i en forstøver utstyrt med en doseringspumpe.

Eksempel 7

Dette eksempel illustrerer fremstilling av en repre-sentativ farmasøytisk formulering i aerosol form, inneholdende en forbindelse ifølge oppfinnelsen, eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, f.eks. 2-(3-dimetylaminokarbonylfenoksy)-6-(2-fenoksy-4-amidinofenoksy)-9-(1-metoksykarbonylpropyl)-8-etylpurin:

Forbindelsen ifølge oppfinnelsen ble dispergert i oljesyre og drivmidlene. Den resulterende blanding ble deretter helt over i en aerosolbeholder utstyrt med en måleventil.

Eksempel 8

(In vitro utprøvning for faktor Xa, trombin og vevsplasminogenaktivator)

Denne utprøvning viser aktiviteten av forbindelsene ifølge oppfinnelsen mot faktor Xa, trombin og vevsplasminogenaktivator. Aktivitetene ble bestemt som en begynne1sesgrad av spalting av peptidet p-nitroanilid av enzymet. Spaltningspro-duktet, p-nitroanilin, absorberes ved 405 nm med en molar eks-tinksjonskoeffisient på 9 920M"<1> cm"<1>.

Reagenser og løsninger:

Dimetylsulfoksid (DMSO) (Baker analysekvalitet).

Prøvebuffer:

50 mM TrisHCl, 150 mM NaCl, 2,5 mM CaCl2 og 0,1% polyetylenglykol 6000, pH 7,5.

Enzymer (Enzyme Research Lab.):

1. Human faktor Xa-lagerløsning: 0,281 mg/ml i prøvebuf-fer, lagret ved -80 °C (arbeidsløsning (2X): 106 ng/ml eller 2 nM i prøvebuffer, fremstilt før bruk). 2. Human trombinlagerløsning: Lagret ved -80 °C {arbeidsløsning (2X): 1 200 ng/ml eller 4 0 nM i prøvebuffer, fremstilt før bruk). 3. Human vevsplasminogenaktivator (tPA) (Two chains, Sigma) lagerløsning: 1 mg/ml, lagret ved -80 °C (arbeidsløsning (2X): 1 361 ng/ml i prøvebuffer, fremstilt før bruk).

Kromogene substrater (Pharmacia Hepar Inc.):

1. S2222 {FXa-utprøvning) lagerløsning: 6 mM i dH20, lagret ved 4 °C (arbeidsløsning (4X): 656 uM i prøvebuffer). 2. S2302 (trombinutprøvning) lagerløsning: 10 mM i dH20, lagret ved 4 °C (arbeidsløsning (4X) : 1 2 00 uM i

prøvebuffer).

3. S2288 (tPA-utprøvning) lagerløsning: 10 mM i dH20, lagret ved 4 °C (arbeidsløsning (4X) : 1 484 uM i prøvebuffer).

(Alle substratarbeidsløsninger ble fremstilt på prøvedag 5).

Standard inhibitorforbindelseslagerløsning:

5 mM i DMSO, lagret ved -20 °C.

Testforbindelser (forbindelser ifølge oppfinnelsen) lagerløs-ninger:

10 mM i DMSO, lagret ved -20 °C.

Prøveprosedyre;

Utprøvninger ble utført i 96-brønns mikrotiterplater

i et totalt volum på 200 ul. Utprøvningskomponentene var i sluttkonsentrasjon på 50 mM TrisHCl, 150 mM NaCl, 2,5 mM CaCl2, 0,1% polyetylenglykol 6000, pH 7,5, i fravær eller nærvær av standardinhibitoren eller testforbindelser og enzym og substrat til følgende konsentrasjoner: (1) 1 nM faktor Xa og 164 uM S2222;

(2) 20 nM trombin og 300 uM S2302; og (3) 10 nM tPA og 371 uM S2288. Konsentrasjoner av standardinhibitorforbindelsen i utprøvningen var fra 5 uM til 0,021 uM i 1 til 3 fortynning. Konsentrasjon av testforbindelsene i utprøvningen var typisk fra 10 uM til 0,041 uM i 1 til 3 fortynning. For kraftige testforbindelser ble de anvendte konsentrasjoner i faktor Xa-utprøv-ningen ytterligere fortynnet 100 ganger (100 nM til 0,41 nM) eller 1 000 ganger (10 nM til 0,041 nM). Alle substratkonsen-trasjoner som ble anvendt, var lik deres Km-verdier under foreliggende utprøvningsbetingelser. Utprøvningene ble utført ved omgivende temperatur.

Det første trinn i utprøvningen var fremstilling av

10 mM testforbindelseslagerløsninger i DMSO (for kraftige testforbindelser ble 10 mM lagerløsninger ytterligere fortynnet til 0,1 eller 0,01 mM for faktor Xa-utprøvningen), etterfulgt av fremstilling av testforbindelses-arbeidsløsningene (4X) ved en seriefortynning av 10 mM lagerløsninger med "Biomek 1000" (eller "Multiprobe 204") i 96 dype brønnplater som følger:

(a) Fremstill en 40 uM arbeidsløsning ved fortynning av

10 mM lagerløsning 1 til 250 i prøvebuffer i 2 trinn: 1

til 100 og 1 til 2,5.

(b) Utfør ytterligere 5 seriefortynninger (1:3) av 40 uM-løsningen (600 ul for hver konsentrasjon). Totalt seks fortynnede testforbindelsesløsninger ble anvendt i

utprøvningen.

Standard inhibitorforbindelse (5 mM lagerløsning) eller DMSO (kontroll) gjennomgikk de samme fortynningstrinn som de som er beskrevet ovenfor for testforbindelsene.

Det neste trinn i utprøvningen var å avgi 50 ul av testforbindelses-arbeidsløsningene (4X) (fra 40 uM til 0,164 uM) in duplo til mikrotiterplater med "Biomek" eller "MP204". Til dette ble det tilsatt 100 ul enzymarbeidsløsning (2X) med "Biomek" eller "MP204". De resulterende løsninger ble inkubert ved omgivende temperatur i 10 minutter.

Til løsningene ble det tilsatt 50 ul substratarbeids-løsning (4X) med "Biomek" eller "MP204".

Enzymkinetikken ble målt ved 405 nm ved 10 sekunders intervaller i 5 minutter i en "THERMOmax" plateleser ved omgivende temperatur.

Beregning av Kj av testforbindelser:

Enzymhastigheter ble beregnet som mOD/min basert på de første to minutters avlesninger. IC50-verdiene ble bestemt ved tilpasning av dataene til log-logit-ligningen (lineær) eller Morrison-ligningen (ikke-lineær) med EXCEL-spredeark. Ki-verdier ble deretter erholdt ved dividering av IC50 med 2. Rutinemessig ble Ki- (faktor Xa) verdier på mindre enn 3 nM beregnet fra Morrison-1igningen.

De etterfølgende data refererer til den in vitro bestemmelse som er beskrevet ovenfor.

Eksempel 9

{ In vitro utprøvning for human protrombinase)

Denne utprøvning viser evnen til forbindelsene ifølge oppfinnelsen til å inhibere protrombinase. Protrombinase (PTase) katalyserer aktiveringen av protrombin for å gi fragment 1,2 pluss trombin med meizotrombin som mellomprodukt. Denne utprøv-ning er en endepunktsutprøvning. Aktivitet av protrombinase måles ved aktiviteten av trombin (ett av reaksjonsproduktene) eller ved mengden av dannet trombin/tid basert på en trombin standardkurve (nM vs mOD/min). For bestemmelse av IC50 (PTase) av forbindelsene ifølge oppfinnelsen ble PTase-aktivitet uttrykt ved trombin-aktivitet (mOD/min).

Materialer:

Enzymer:

1. Human faktor Va (Haematologic Technologies Inc., kat. nr. HCVA-0110) arbeidsløsning: 1,0 mg/ml i 50%

glyserol, 2 mM CaCl2, lagret ved -20 °C.

2. Human faktor Xa (Enzyme Res. Lab. kat. nr. HFXalOll) arbeidsløsning: 0,281 mg/ml i prøvebuffer (uten BSA),

lagret ved -80 °C.

3. Humant protrombin (Fil) (Enzyme Res. Lab., kat. nr. HP1002) arbeidsløsning: Fortynnet Fil til 4,85 mg/ml i prøvebuffer (uten BSA), lagret ved -80 °C.

Fosfolipid- (PCPS) vesikler:

PCPS-vesikler (80% PC, 20% PS) ble fremstilt ved modifikasjon av metoden rapportert av Barenholz et al., Biochemistry (1977), vol. 16, s. 2806-2810. Fosfatidylserin (Avanti Polar Lipids, Inc., kat. nr. 840032): 10 mg/ml i kloroform, renset fra hjerne, lagret ved -20 °C under nitrogen eller argon. Fosfatidylkolin (Avanti Polar Lipids, Inc., kat. nr. 850457) : 50 mg/ml i kloroform, syntetisk 16:0-18:1 pal-mitoyl-oleoyl, lagret ved -20 °C under nitrogen

eller argon.

"Spectrozyme-TH" (American Diagnostica Inc., kat. nr. 238L,

50 umol, lagret ved romtemperatur) arbeidsløsning:

Oppløst 50 umol i 10 ml dH20.

BSA (Sigma Chem Co., kat. nr. A-7888, fraksjon V, RIA-kvalitet).

Prøvebuffer: 50 mM TrisHCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 2,5 mM CaCl2,

0,1% PEG 6000 (BDH) , 0,05% BSA (Sigma, Fr.V, RIA-kvalitet).

For en- plateutprøvning ble følgende arbeidsløsninger fremstilt: 1. Protrombinasekompleks:

(a) 100 uM PCPS (27,5 ul PCPS lagerløsning

(4,36 mM) fortynnet til sluttelig 1 200 ul med prøvebuffer. (b) 25 nM human faktor Va: 5,08 ul Va-lagerløsning (1 mg/ml) ble fortynnet til sluttelig 1 200 ul med prøvebuffer.

(c) 5 pM human faktor Xa: Xa lagerløsning

(0,281 mg/ml) ble fortynnet 1:1 220 000 med prøvebuffer. Minst 1 200 ul ble fremstilt.

Like volumer (1 100 ul) av hver komponent ble kombinert i rekkefølgen PCPS, Va og Xa. Disse fikk stå ved omgivende temperatur i 5 til 10 minutter og ble anvendt umiddelbart eller lagret i is (brakt til omgivende temperatur før bruk).

2. 6 uM humant protrombin (Fil): 124 ul Fil lagerløsning (4,85 mg/ml) ble fortynnet til sluttelig 1 400 ul med prøvebuffer. 3. 20 mM EDTA/prøvebuffer: 0,8 ml 0,5 M EDTA (pH 8,5) pluss 19,2 ml prøvebuffer. 4. 0,2 mM "Spectrozyme"-TH/EDTA-buffer: 0,44 ml SPTH lagerløsning (5 mM) pluss 10,56 ml 20 mM EDTA/prøve-buffer.

5. Testforbindelser (forbindelser ifølge oppfinnelsen):

En arbeidsløsning (5X) ble fremstilt fra 10 mM lager-løsning (DMSO), og en serie på 1:3 fortynning ble foretatt. Forbindelsene ble utprøvet ved 6 konsentrasjoner in duplo.

Prøvebetingelser og prosedyre:

Protrombinasereaksjon ble utført i 50 ul sluttblanding inneholdende PTase (20 uM PCPS, 5 nM hFVa og 1 pM hFXa), 1,2 uM humanfaktor II og variert konsentrasjon av testforbindelser (5 uM til 0,021 uM eller lavere konsentrasjonsområde). Reaksjonen ble startet ved tilsetning av PTase og inkubert i 6 minutter ved romtemperatur. Reaksjonen ble stoppet ved tilsetning av EDTA/buffer til sluttelig 10 mM. Aktivitet av trombin (produkt) ble deretter målt i nærvær av 0,1 mM "Spectrozyme"-TH som substrat ved 405 nm i 5 minutter (10 sekunders intervaller) ved omgivende temperatur i en "THERMOmax" mikroplateleser. Reak-sjonene ble utført i 96-brønns mikrotiterplater.

I det første trinn av utprøvningen ble 10 ul fortynnet testforbindelse (5X) eller buffer tilsatt til platene in duplo. 10 ul protrombin (hFII) (5X) ble deretter tilsatt til hver brønn. Deretter ble 30 ul PTase tilsatt til hver brønn og ble blandet i ca. 30 sekunder. Platene ble deretter inkubert ved omgivende temperatur i 6 minutter.

I det neste trinn ble 50 ul 20 mM EDTA (i prøvebuffer) tilsatt til hver brønn for å stoppe reaksjonen. De resulterende løsninger ble deretter blandet i ca. 10 sekunder. 100 ul 0,2 mM "Spectrozyme" ble deretter tilsatt til hver brønn. Trombinreak-sjonsgraden ble deretter målt ved 405 nm i 5 minutter ved 10 sekunders intervaller på en "Molecular Devices" mikroplateleser.

Beregninger:

Trombinreaksjonshastighet ble uttrykt som mOD/min under anvendelse av OD-avlesninger fra 5-minuttersreaksjonen. IC50-verdier ble beregnet med log-logit-kurvetilpasningsprogram.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen utviste evne til å inhibere protrombinase da de ble testet i denne utprøvning.

Eksempel 10

{ In vivo utprøvning)

Følgende utprøvning viser forbindelsenes evne som antikoagulanter.

Hannrotter (250-330 g) ble bedøvet med natriumpento-barbital (90 mg/kg, i.p.) og ble preparert for kirurgi. Den venstre halsarterie ble kanylert for måling av blodtrykk, så vel som for blodprøvetaking for å overvåke klumpningsvariabler (protrombintid (PT) og aktivert, partiell tromboplastintid (aPTT)). Halevenen ble kanylert med det formål å administrere testforbindelsene (dvs. forbindelsene ifølge oppfinnelsen og standarder) og tromboplastininfusjonen. Abdomen ble åpnet via et midtlinjesnitt, og abdominal vena cava ble isolert 2-3 cm fra nyrevenen. Alle veneforgreninger i dette 2-3 cm segment av den abdominale vena cava ble ombundet. Etter all kirurgi fikk dyrene stabiliseres før forsøket ble startet. Testforbindelsene ble administrert som en intravenøs bolus (t = 0). 3 minutter senere (t = 3) ble en 5-minutters infusjon av tromboplastin startet. 2 minutter inn i infusjonen (t = 5) ble den abdominale vena cava ligert ved både den proksimale og distale ende. Karet fikk stå i 60 minutter, hvoretter det ble skåret ut fra dyret, splittet, levringen (hvis noen) ble forsiktig fjernet og veid. Statistisk analyse av resultatene ble utført under anvendelse av en Wil-coxon-tilpasset (pairs signed rank) test.

Når forbindelsene ifølge oppfinnelsen ble testet i denne utprøvning, viste de evne til å inhibere levring av blod.

Claims (7)

1. Forbindelse, karakterisert: ved at den er valgt fra gruppen bestående av følgende formler: hvori: Zl og Z<2> er hver -0-; R<1> er hydrogen eller -OR<10>; R<2> er -C (NH)NHa; R<3> er -C(0)N(R1(|R11, R<4> er hydrogen; R<5> er Ci-C6-alkyl ; R<6> er fenyl-Ci-C6-alkyl ; hver R<1>0 og R1<1> er uavhengig hydrogen eller d-C6-alkyl; som en enkelt stereoisomer eller en blanding derav; eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

2. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at Z<1> og Z<2> er hver -0-; R<1> er hydrogen; R<2> er -C(NH)NH2; R<3> er -C (0) N (R10) R11; R<4> er hydrogen; R<5> er Ci-Cs-alkyl; R<6> er fenyl-Ci-C<g->alkyl; hver R<1>0 og R1<1> er uavhengig hydrogen eller Ci-Cs-alkyl.

3. Forbindelse ifølge krav 2, karakterisert ved at R<3> er -C(b)N(RX0)R11; R<4> er hydrogen; R<5> er metyl eller etyl; R<6> er benzyl; og R<1>0 og R1<1> er uavhengig hydrogen eller metyl.

4. Forbindelse ifølge krav 3, karakterisert ved at forbindelsen er en forbindelse av formel (I) hvori R<3> er -C(O)N(R10)R1<1> hvori R<10> og R<11 >begge er metyl, R<4> er hydrogen, R<5> er metyl, og R<6> er benzyl, nemlig 2-(2-hydroksy-5-amidinofenoksy)-6-(3-dimetylaminokar-bonyl) fenoksy)-8-metyl-9-benzylpurin.

5. Forbindelse ifølge krav 3, karakterisert ved at forbindelsen er en forbindelse av formel (II) hvori R<3> er -C(0)N(R10)R1<1> hvori R<10> og R<11 >begge er metyl, R<4> er hydrogen, R<5> er metyl, og Rs er benzyl, nemlig 6-(2-hydroksy-5-amidinofenoksy)-2-(3-dimetylaminokarbonyl-fenoksy)-8-metyl-9-benzylpurin.

6. Farmasøytisk preparat som er anvendbart ved behandling av et menneske med en sykdomstilstand, karakterisert ved trombotisk aktivitet, karakterisert ved at preparatet omfatter en terapeutisk effektiv mengde av en forbindelse ifølge krav 1 som en enkelt stereoisomer eller en blanding derav; eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, og en farmasøytisk aksep-tabel eksipiens.

7. Anvendelse av en forbindelse ifølge krav 1 som en enkelt stereoisomer eller en blanding derav; eller et farma-søytisk akseptabelt salt derav, for fremstilling av et medikament for behandling av en sykdomstilstand som er karakterisert ved trombotisk aktivitet i et menneske.