NO331699B1 - Fremgangsmate for okning av utbyttet av et inerferon alfa-preparat - Google Patents

Abstract

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en fremgangsmåte for økning av utbyttet at et interferon alfa-preparat, som omfatter omdannelse av en pyruvatsupplementisoform av interferon alfa til interferon alfa, hvor supplementisoformen eksponeres for sinkløsninger som eventuelt omfatter en antioksidant.

Description

Område for oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for økning av utbyttet av et interferon alfa-preparat.

Bakgrunn

Naturlig forekommende proteiner er vidt anvendt for forskning og kliniske formål. Selv om slike proteiner kan erholdes fra deres naturlige kilde, kan rekombinante teknikker muliggjøre produksjon av disse proteiner fra ikke-naturlige kilder. Eksempelvis gir fermentering av mikroorganismer konstruert via rekombinant teknologi., slik som transformerte bakterier, store mengder humant interferon til en betydelig lavere pris enn hva som er mulig under anvendelse av naturlige kilder. Slike rekombinante DNA-teknikker er også blitt anvendt for å produsere andre viktige proteiner slik som insulin og vevsplasminogenaktivator.

Fra EP 0553494 er det kjent å refolde interferon alfa ved å anvende cystein og cystin.

Bakterier forandret ved rekombinante teknikker, produserer imidlertid også forurensninger og strukturelle isoformer av det protein som er beregnet på å bli produsert. Disse forurensninger og isoformer innbefatter oligomere proteiner og reduserte proteinisoformer (se US patentskrift nr. 4 765 903), cellerester og virus (se US patentskrift nr. 4 732 683) og pyruvatkjededc isoformer (se Rose et al., J. Biol. Chem. 257:19101 (1992); Promc et al., J. Biol. Chem. 266:13050 (1991): Stevens et al., J. Biol. Chem. 252:2998 (1977); og Shapiro et al., J. Biol. Chem. 255:3120 (1980)). Det er ønskelig å fjerne disse forurensninger under rensing av proteinet.

Selvsagt reduserer disse proteinisoformer renheten av det ønskede protein, og fremgangsmåter for fjerning av isoformene reduserer det totale utbytte. Hvis imidlertid proteinisoformene kan omdannes til det ønskede protein, er deres fjerning unødvendig, og det totale proteinutbytte vil bli signifikant forøkt. Hva som trengs, er en måte for å kunne identifisere uønskede proteinisoformer og omdanne disse til det ønskede protein. Foreliggende oppfinnelse dreier seg om slike behov.

Oppsummering av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en fremgangsmåte for økning av utbyttet av et interferon alfa-preparat. Fremgangsmåten er kjennetegnet ved at en pyruvatsupplementisoform av interferon alfa omdannes til interferon alfa ved eksponering av pyruvatsupplementisoformen av interferon alfa overfor en sinkløsning.

Selv om den foreliggende oppfinnelse ikke er begrenset til et bestemt interferon alfa, er interferon alfa i en foretrukket utførelses form interferon alfa-2b.

I foretrukne utførelsesformer omfatter sinklosningen en antioksidant. I særlig foretrukne utforelsesformer omfatter antioksidanten metionin. I en slik utførelsesform er den foretrukne konsentrasjon av metionin 5-40 mM.

Definisjoner

Som anvendt her, betyr uttrykket "supplementisoform" en proteinisoform som har strukturelle og/eller funksjonelle karakteristika lik el ønsket protein, hvori en spaltbar gruppe kan fjernes fra proteinet for å gi det ønskede protein. En "spaltbar gruppe" skal forstås å bety en kjemisk gruppe bundet til el ønsket protein som kan fjernes kjemisk. "Kjemisk fjerning" eller "fjernes kjemisk" som anvendt her, skal forstås å angi at en kjemisk gruppe er blitt separert fra et protein på kjemisk måte, innbefattende syreløsning, basisk losning eller mctallionkatalyse.

Hvis den spaltbare gruppe kan identifiseres kjemisk, kan supplementisoformen refereres til som en spesifikk type supplementisoform. Eksempelvis er en "pyruvatsupplementisoform" et ønsket protein som har en spaltbar gruppe bundet dertil som er identifiserbar som pyruvat.

Som anvendt her, refererer utlrykket "interferon alfa" til en familie av fremkall-bare utskilte proteiner som tilveiebringer motstand overfor virus på målceller, inhiberer celleproliferering og regulerer ekspresjon av MHC klasse I-antigener. Denne familie innbefatter, men er ikke begrenset til. interferon alfa-2a ("Rofcron". Hoffman La-Roche, Nutley, NJ). interferon alfa-2b ("Intron". Schering-Plough, Madison, NJ), interferon alfa-2c ("Berofor Alpha", Boehringer Ingelheim, Ingelheim, Tyskland) eller konsensusinterferon som definert ved bestemmelse av en konsensussekvens av naturlig forekommende interferon alfaer ("Infergen", Amgen. Thousand Oaks, CA).

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse angår isolering og rensing av proteiner, og det beskrives identifisering og rensing av supplementisoformer. Den foreliggende oppfinnelse angår fremgangsmåter for fremstilling av et ønsket protein fra supplementisoformer. Med foreliggende oppfinnelse tilveiebringes et høyrenset. ønsket protein ved korensing av del ønskede protein sammen med supplementisoformer og etter-følgende omdannelse av supplementisoformene til del ønskede protein. På denne måten reduseres mengden av supplementisoform, og det totale utbytte av det ønskede protein økes og/eller er mer høyrenset enn hva som tidligere kunne oppnås. Utbyttet av det ønskede protein kan økes så mye som ti ganger utbyttet som erholdt uten omdannelse av supplementisoformer.

Selv om foreliggende oppfinnelse ikke er begrenset av kilden til det ønskede protein eller supplementisoformene, er kilden, i én utførelsesform, mikroorganismer konstruert via rekombinante teknikker. Det er mange slike teknikker kjent innen faget. Slike transformerte mikroorganismer kan være eukaryotiske eller prokaryotiske celler, bakterier, pattedyrceller, etc. Eksempelvis kan interferon alfa produseres i bakterier ved å følge læren i US patentskrift 4 530 901. eller ved teknikkene beskrevet i europeisk patentsøknad, publikasjonsnr. EP032 134.

Likeledes er foreliggende oppfinnelse ikke begrenset til noen spesiell metode for ekstrahering av pyruvatsupplementisoformen fra den produserende celle. Når det ønskede protein er interferon alfa. er f.cks. metodene beskrevet i US patentskrifter nr. 4 315 852 og 4 364 863, egnet.

Likeledes er foreliggende oppfinnelse ikke begrenset av de spesielle rense-teknikker som anvendes for å isolere supplementisoformen fra det ønskede protein. Mange kromatografi- og andre separeringsteknikker er kjent innen faget og er anvend-bare her.

Selv om foreliggende oppfinnelse ikke er begrenset ved metoden for identifisering av supplementisoformen. kan identifisering av supplementisoformer utføres ved studering av molekylvekten av det ønskede protein og enhver forurensning som har en molkylvekt høyere enn det ønskede protein. Én slik metode er beskrevet i Rose et al., .1. Biol. Chem. 267:19101 (1992). Forurensninger som har en molekylvekt høyere enn det ønskede protein, kan eksponseres overfor degraderingsbctingelser (f.cks. ekstremt sur eller ekstremt basisk pH) og analyseres med hensyn til nedbrytningsprodukter. Hvis ett av disse nedbrytningsprodukter har den samme masse og/eller de strukturelle karakteristika som det ønskede protein, kan forurensningen betraktes som en supplementisoform som har en spaltbar gruppe.

Foreliggende oppfinnelse er heller ikke begrenset av temperaturen ved hvilken spaltningsrcaksjonen utføres. Jo høyere temperaturen er, jo hurtigere vil imidlertid supplementisoformen bli omdannet til det ønskede protein.

Selv om kjemisk fjerning av en spaltbar gruppe kan produsere el protein med samme strukturelle karakteristika som det ønskede protein, er det enkelte ganger nød-vendig å oksidere reduserte sulfhydrylgrupper til disulfidbindinger. Dette muliggjør at proteinet antar riktig folding og blir et funksjonelt protein. Metoder for oksidering av sulfhydrylgrupper er kjent innen faget, og foreliggende oppfinnelse er ikke begrenset ved noen bestemt oksidasjonsmetode.

I én utførelsesform tar foreliggende oppfinnelse i betraktning beskyttelse av metioningrupper under oksidasjon for å forhindre dannelse av metioninsulfoksid. Metoder for beskyttelse av metioningrupper er kjent innen faget, og foreliggende oppfinnelse er ikke begrenset av bestemte metoder for beskyttelse av metioningrupper. Metoder innbefatter imidlertid anvendelse av antioksidanter som beskrevet av Lam et al., J. Pharm. Sei. 5(5:1250 (1997) og US patentskrift nr. 5 272 135.

Foreliggende oppfinnelse er heller ikke begrenset av metoden for implemen-tering av en oksidasjonsreaksjon. 1 én utførelsesform tar f.eks. foreliggende oppfinnelse i betraktning fjerning av en spaltbar gruppe etterfulgt av oksidasjon av sulfhydrylgrupper. I en annen utførelsesform tar foreliggende oppfinnelse i betraktning fjerning av spaltbare grupper og oksidering av sulfhydrylgrupper under de samme reaksjons-bclingelser.

Når den kjemiske fjerning av den spaltbare gruppe og oksidasjon av proteinet utføres i samme reaksjon, er foreliggende oppfinnelse likeledes ikke begrenset ved noen bestemt metode for fjerning av spaltbare grupper fra en supplementisoform og oksidering. I én utførelsesform utføres imidlertid en screeningsprosess for å bestemme de beste betingelser for kjemisk fjerning av den spaltbare gruppe. Eksempelvis kan forsøk under anvendelse av et område av pH-betingelser foretas, og mengden av resulterende ønsket protein med riktig strukturell integritet (dvs. ikke irreversibelt denaturert) og/eller mengden av spaltbar gruppe kan måles. En nedtegning av mengden av ønsket protein som har riktig strukturell integritet mot reaksjons-pH, vil generelt resultere i en klokkekurve hvor det høyeste punktet av kurven representerer den ideelle pH for kjemisk fjerning av den spaltbare gruppe. I en slik utførelsesform kan en lignende screening foretas for oksidasjonsreaksjonen. Hvis klokkekurvene for den kjemiske fjerningsreaksjon og oksidasjonsreaksjonen krysser hverandre, angir krysningspunktet de beste pH-betingelser for fjerning av den spaltbare gruppe og oksidering av hydroksylgruppene i samme reaksjon. For kjemisk fjerning og oksidasjon av en pyruvatsupplementisoform av interferon alfa, krysser de to kurver rundt pH 5, hvilket angir den beste pH ved hvilken cn kombinasjonsreaksjon skal utføres. Andre reaksjonsbetingelser som kan evalueres innbefatter saltkonsentrasjon, temperatur, etc.

Etter omdannelse av supplementisoformen til det ønskede protein kan ytterligere kromatografitrinn være nødvendig for å rense de ønskede proteiner fra forurensninger.

Etter at det ønskede protein er hensiktsmessig renset, kan det anbringes i en fonn egnet for terapeutisk bruk om ønsket. Når det ønskede protein er interferon alfa, er f.eks. formuleringene beskrevet i US patentskrifter nr. 4 847 079,4 496 537 og 5 766 582, egnet. Alternativt kan andre inertc, farmasøytisk akseptable bærere enten være faste eller væskeformige. Preparater i fast form innbefatter pulvere, tabletter, dispergerbare granuler, kapsler, pulverkapsler og stikkpiller. Pulverne og lablettene kan være omfattet av fra ca. 5 til ca. 95 % ønsket protein. Egnede faste bærere er kjent innen faget, f.cks. magnesiumkarbonat, magnesiumstearat, talkum, sukker eller laktose. Tabletter, pulvere, pulverkapsler og kapsler kan anvendes som faste doseringsformer egnet for oral administrering.

For fremstilling av stikkpiller smeltes først et lavtsmeltende voks, slik som en blanding av fettsyreglyserider (f.eks. kakaosmør). og den aktive bestanddel dispergeres homogent deri ved omrøring. Den smeltede, homogene blanding helles deretter over i støpeformer av egnet størrelse, tillates å avkjøles og derved stivne.

Væskeformige preparater innbefatter løsninger, suspensjoner og emulsjoner. Eksempelvis kan vann eller vann-propylenglykolløsninger for parenteral injeksjon anvendes, eller tilsetning av søtningsmidler og blakkgjøringsmidler for orale løsninger, suspensjoner og emulsjoner. Væskeformige preparater kan også innbefatte løsninger for intranasal administrering.

Aerosolpreparater egnet for inhalering, kan innbefatte løsninger og faste materialer i pulverform som kan være i kombinasjon med en farmasøytisk akseptabel bærer slik som en inert, komprimert gass.

Interferon alfa-preparatet fremstilt ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan også avgis transdermalt. De transdermale preparater kan anla form av kremer, lotions, aerosoler og/eller emulsjoner og kan være innbefattet i et transdermalt plaster av matriks- eller reservoartypen som hensiktsmessig innen faget for dette formål.

Mengden av aktiv forbindelse i en enhetsdose av preparat kan justeres fra ca.

0,01 mg til ca. 1 000 mg, og fortrinnsvis fra ca. 0.01 mg til ca. 750 mg. Alternativt kan den aktive forbindelse fremstilles ved internasjonale enheter hvor de foretrukne doser er mellom 3 millioner og 50 millioner internasjonale enheter. I en slik utførelsesform er 3 millioner. 5 millioner, 18 millioner, 25 millioner og 50 millioner enhetsdoser tatt i betraktning.

Det kan også fremstilles faste former som er beregnet på å bli omdannet, kort før bruk, til væskeformige preparater for enten oral, topisk eller parenteral administrering.

De etterfølgende eksempler tjener til å illustrere visse foretrukne utførelses-former og aspekter ved foreliggende oppfinnelse.

Eksempel 1: Screeningsprosess for omdannelse av pyruvatsupplementisoformer

Pyruvatsupplementisoformer kan dannes på innsiden av celler, hvori alfa-aminogruppen av den N-terminale aminosyrerest av et protein kondenseres med karbonylgruppen av pyruvat. Hvis pyruvatet interfererer med proteinstrukturen, er det bare når en slik pyruvat-proteinsupplementisoform hydrolyseres (pyruvat spaltes fra et protein) at proteinet fritt kan foldes igjen i dets ønskede form via termodynamisk fordelaktig strukturforandring. Hvis et ønsket protein har disulfidbindinger, skal en redusert isoform resulterende fra pyruvalspaltningen, oksideres som en del av refoldingen inn i den ønskede form.

Den etterfølgende prosedyre illustrerer hvordan de optimale betingelser kan bestemmes for å omdanne pyruvat-proteinsupplementisoform over i dens ønskede form. Hvis et ønsket protein ikke har disulfidbindinger, må, som diskutert tidligere, screening utføres for enkelt å maksimere pyruvatspaltningen (hydrolyse). Hvis et ønsket protein har disulfidbindinger, må screening utføres for å maksimere ikke bare pyruvatspaltning (hydrolyse), men også disulfidbindingsdannelse (oksidasjon).

1) Pyruvatutprovning:

En pyruvalutprøvning er nødvendig for å overvåke graden av hydrolyse for å forstå pyruvat-spaltningskinctikkcn. Eksempelvis kan "fritt" pyruvat kvantitativt bestemmes ved en kjemisk modifiscringsmetode eller en enzymatisk metode. 2.4-dinitrofenylhydrazin (DNPH) kan anvendes for å derivatisere pyruvat. En forsøksprøve skal ultra filtreres for å eliminere en pymvat-proleinsupplementisoform under anvendelse av en korrekt MWCO-membran. f.eks. en lOK-membran. Et filtrat inkuberes ved sur pT-1 med DNPH som reagerer med "fritt" pyruvat. DNPH-derivatisert pyruvat. 2,4-dinitrofenylhydrazon, kan lett analyseres på RP-HPLC under anvendelse av en C8-kolonne slik som en "Nucleosil C8"- (5 um) kolonne.

Da derivatiseringsreaksjonen er støkiometrisk, er en kvantitativ måling av pyruvat også mulig. Et enzymsett (f.eks. laktatdehydrogenase/NADH) kan også anvendes for å måle pyruvat. Denne metode krever ikke prøveultraifltrering da dens milde betingelser ikke spalter pyruvat fra en pyruvat-proteinsupplementisoform under inkubering.

For å måle den kombinerte mengde fritt pyruvat og pyruvat bundet til et protein, skal alt bundet pyruvat spaltes fra før derivatiseringen. Da DNPH-derivatiserings-metoden krever meget sur pH og relativt lang inkuberingstid, kan pyruvat spaltes fra og deretter derivatiseres med DNPH under inkuberingen. En prøve skal derfor anvendes uten å bli ultrafilrrert i DNPH-derivatiscringsmetoden for å måle en kombinert mengde av fritt og bundet pyruvat i prøven.

2) Isoformbestem meise:

Minst tre isoformer eksisterer for proteiner med disulfidbindinger, og to isoformer eksisterer for proteiner uten disulfidbindinger. Generelt angitt, kan et ønsket protein og dets reduserte form lett oppløses med RP-HPLC. 1 tilfellet av et protein med disulfidbindinger vil screening være meget effektivt hvis tre isoformer (supplementisoform, redusert og ønsket protein) kan analyseres kvantitativt på RP-HPLC. Det vil ikke være noe absolutt behov for pyruvatbestemmelsen, og det er mulig å identifisere hvilket trinn som er hastighetsbegrensende hvis slikt er tilfelle. Imidlertid er det vanligvis vanskelig å oppløse en pyruvat-proteinsupplementisoform fra en redusert form. I dette tilfelle er en pyruvatbestemmelse nødvendig for å optimalisere hvert omdannelsestrinn.

3) Måling av isoformsammensetning:

Når en ønsket form ikke har disulfidbindinger, kan isoformsammensetningen bestemmes uten vanskelighet da en pyruvat-proteinsupplementisoform lett kan oppløses fra en ønsket form på RP-HPLC.

Når den ønskede form har disulfidbindinger og en proleinsupplementisoform ikke er separerbar fra dens reduserte form. skal et pyruvat bundet til et protein, måles for å bestemme isoformsammensetningen. Den molare mengde pyruvat bundet til ct protein, som er mengden av en protcinsupplementisoform, er den kombinerte mengde fritt og bundet pyruvat ■*■ mengden av fritt pyruvat. Dette kan måles under anvendelse av en prøve med og uten ultrafiltrering i DNPH-metoden. Mengden av en redusert form er da forskjellen mellom den kombinerte mengde av en proteinsupplementisoform og en redusert form målt med RP-HPLC og mengden av pyruvat bundet til et protein bestemt med en pyruvatbestemmelse. Isoformsammensetningen kan deretter beregnes.

4) Screening av optimale betingelser:

Hvorvidt en ønsket form har disulfidbindinger eller ikke, skal screenings-kritericne være de samme for å maksimere den spesifikke omdannelsesgrad av supplementisoformen til en ønsket form.

4.1) Når et ønsket protein ikke har noen disulfidbinding:

I dette tilfelle spaltes en ønsket protcinibrm som pyruvat fra en pyruvat-proteinsupplementisoform. Pyruvatspaltning behøver ikke å overvåkes ved pyruvatbestemmelse i dette tilfelle, da det er bare ett trinn, hydrolyse, som er involvert i omdannelsen av supplementisoformen til en ønsket form. Overvåkning både av forsvinningen av supplementisoformen og dannelse av en ønsket form på RP-HPLC er f.eks. tilstrekkelig. Inkuberingsbetingelser for å maksimere omdannelsen av en supplementisoform til et ønsket protein må finnes.

Det første trinn er å undersøke reaksjonskinetikken med hensyn til et arbeids-område for den proteinsupplementisoformkonsentrasjon som skal anvendes i screeningen. Hvis kinetikken er av første orden med hensyn til supplementisoform-konsentrasjonen. har prøvekonsentrasjonen ingen innflytelse på kinetikken, og enhver konsentrasjon kan anvendes under screeningen eller parameterevalueringen. Ellers bør konsentrasjonen holdes konstant under screeningen.

Det kan være mange parametre som påvirker hydrolysctrinnet. Hoved-parametrene kan være pH, temperatur, metallioner (slik som sink, jern(Ill), jern(II), Cu, Mg. etc), ledningsevne, buffere, lys og omrøring. Ved måling av effekten av en inkuberingsparameter på omdannelsen av en supplementisoform til en ønsket form kan hver parameter optimaliseres. Eksempelvis inkuberes flere alikvoter av en prøve inneholdende en pyruvat-proteinsupplemcntisoform ved et tilstrekkelig område av forskjellige pl-l-verdier, hvor alle de andre parametre holdes ved deres respektive best anslåtte verdier. Omdannelsesreaksjonen i hver alikvot måles etter en bestemt inkubcringsperiode (f.eks. over natten. Den pH ved hvilken den høyeste omdannelse erholdes, bestemmes som den optimale pH. Et slikt forsøk gjentas for å optimalisere andre parametre med optimale verdier av de optimaliserte parametrer anvendt istedenfor deres tidligere best antatte verdier. Dette er en typisk optimaliseringsteknikk.

Inkuberings-pH påvirker hydrolysegraden. Generelt fører lavere pl-1 til mer hydrolyse. Høyere temperatur øker også hydrolyse. Hydrolyse ved en meget sur pH. slik som pH 2, kan imidlertid ikke fungere når det er en irreversibel utfelling av en supplementisoform eller et ønsket protein, eller hvis proteinet denatureres irreversibelt. Nærvær av enkelte metallkationer kan katalysere hydrolysen. Selv om et metallkation katalyserer pyruvatspaltningen, kan en slik katalyse være sterkt metallkationkonsentra-sjonsavhengig. Et meget bredt område av metallionkonsentrasjon skal derfor anvendes når metallkationer screenes.

Det kan også være interaksjoner blant parametrene. Det kan f.eks. være mulig at det er forskjellig optimal pH avhengig av hvorvidt et metallion er til stede eller ikke når et slikt kation har en innflytelse på omdannelsen. Når det gjelder en pyruvatsupplementisoform, resulterer nærvær av Zn-kation i en forskjellig optimal pH for pyruvalspaltning (pH 7,8-8.6). Det er derfor nødvendig å variere samtidig ikke bare en ny parameter som skal optimaliseres, men også andre viktige parametre for virkelig å optimalisere denne.

4.2) Når et ønsket protein har disulfidbindinger:

l en to-trinnsomdannelsesprosess spaltes en redusert form fra supplementisoformen via hydrolyse og omdannes deretter til en ønsket form via oksidasjon.

Ideelt sett isoleres en proteinsupplementisoform og en redusert form. og prosedyren som er beskrevet ovenfor for tilfellet av et protein uten disulfidbindinger. anvendes på hver av supplementisoformen og den reduserte form for å optimalisere hvert trinn. En hovedforskjell er at oksygenoverføring og enkelte oksidanter slik som oksidert glutalion (GS-SG) i tillegg til parametrene angitt ovenfor, kan optimaliseres for oksidasjonstrinnet. Hvis GS-SG oksiderer bare en redusert form. vil den sterkt øke oksidasjonen av disulfidbindingsdannelsestrinnet. Imidlertid vil det sannsynligvis være et lavt utbytte eller omdannelse hvis GS-SG også oksiderer supplementisoformen og den oksiderte supplementisoform ikke lett hydrolyseres.

Fra hver optimal tilstand kan de optimale betingelser for omdannelsen av supplementisoformen til en ønsket form bestemmes. Hvis de er rimelig nær, innstilles de intermediære tilstander som optimale tilstander. Teoretisk angitt, kan det være forskjellige optimale tilstander avhengig av begynnelsesforholdet mellom pyruvat-proleinsupplementisoformen og en redusert form i en prøve. Eksempelvis skal de optimale tilstander være forskjellige når supplementisoformen utgjør den absolutte majoritet, når en redusert fonn er i absolutt majoritet. Det skal derfor tas i betraktning at prøvesammensetningen skal tas hensyn til når de optimale tilstander bestemmes fra de individuelle optimale tilstander for hydrolysen og oksidasjonen.

Sluttelig bekreftes de optimale tilstander for omdannelsen eksperimentelt. Det er ofte nyttig å fininnstille de optimale betingelser for omdannelsen for å identifisere et hastighetsbegrensendc trinn hvis slikt eksisterer. Den stabile akkumulering av redusert fonn med inkuberingstiden indikerer at oksidasjonstrinnet er hastighetsbegrensendc Når akkumulering skjer, skal betingelser som er mer fordelaktige for oksidasjonen, slik som mer oksygen, høyere pH og høyere temperatur, anvendes for å maksimere dannelsen av den ønskede form. Hvis det alltid er et lavt nivå av redusert protein, men signifikant dannelsesgrad av en ønsket fonn, er spaltningstrinnet hastighetsbegrensendc Når dette skjer, kan inkuberingsbetingelsene forandres slik at de kan forbedre spaltningstrinnet. som vil lede til maksimering av dannelsen av den ønskede form.

Hvis de optimale betingelser for kjemisk fjerning av en spaltbar gruppe og oksidasjon av proteinet er meget langt fra hverandre, kan de utføres trinnvis. Eksempelvis utføres de optimale betingelser for hydrolysetrinnet først, og de optimale betingelser for oksidasjonstrinnet anvendes når hydrolysen er praktisk talt fullført.

Når del ikke er enkelt å isolere hver isofonn, blir pyruvatbestemmelsen nødvendig, spesielt når de to isoformer ikke kan oppløses på RP-HPLC. Ved overvåkning av pyruvatfrigivelse kan hydrolysetrinnet først optimaliseres. Det andre trinn optimaliseres når det første trinn er praktisk talt over eller meget langsomt. Fra disse optimale betingelser bestemmes de totale optimale omdannelsesbetingelser og bekreftes eksperimentelt. En alternativ løsning er at den totale omdannelse optimaliseres etter at hydrolysetrinnet er optimalisert. Denne løsning kan være mer praktisk når det er vanskelig å optimalisere det andre trinn på grunn av interferens forårsaket av signifikant og kontinuerlig supplementisoformhydrolyse. Som nevnt tidligere, er pH, temperatur, oksygenoverføring, metallkationer og oksidanter viktige parametre som må optimaliseres.

Interaksjoner mellom parametrene blir mer viktige for to-trinnsomdannelsesprosessen enn de er for en-trinnsomdannelsesprosessen.

For å bekrefte al det ikke er noen innvirkning av slike optimale tilstands-parametre på en ønsket fonn, skal en ønsket form renses, og dens egenskaper, innbefattende biologisk spesifikk aktivitet og renhet, skal full ut kontrolleres.

Eksempel 2: Omdannelse av pyruvatsupplementisoform til interferon alfa2b

Spaltningen av pyruvat og dannelsen av disulfidbindingene ble utført ved forhøyet temperatur (30-37 °C) og en reaksjons-pH på 5,2-5.6. Disse reaksjonsbetingelser er unike ved at begge reaksjoner finner sted sekvensvis under de samme reaksjonsbetingelser, og at bioaktivt protein gjenvinnes.

Fraksjonene inneholdende toppen av protein UV-absorbans som eluerte fra proteinisoleringskromatografien, ble samlet sammen og slerilitetsfiItrert ved 0,45 uM. 3 g metionin pr. liter proteinansamling ble tilsatt til proteinansamlingen og omrørt inntil oppløsning. pH på ansamlingen ble justert til 5,2-5,6 med fortynnet natriumhydroksid. Natriumkloridkonsentrasjonen ble ikke justert: den var mellom 150-200 mM NaCl.

En lagerløsning med pH 5,5bcstående av 10 mM acetat, 200 mM metionin og 200 mM NaCl. ble tilsatt til proteinansamlingen til en sluttkonsentrasjon på 20 mM metionin.

Proteinansamlingen ble overført til et reaksjonskar og temperaturen ble hevet til 37 °C med jevn omrøring. Proteinansamlingen ble inkubert ved 36-38 °C i 24-30 timer.

Ved 24-30-timerstidspunktet ble reaksjonblandingen filtrert gjennom et dypfilter etterfulgt av et 0,45 (iM filter for å fjerne utfellingen. Ansamlingen ble deretter konsentrert og diafiltrert mot 10 mM acetat, pH 5,5, ved 2-10 °C.

Eksempel 3: Omdannelse av pyruvatsupplementisoform til interferon alfa2b under anvendelse av sink

Pyruvatsupplementisoform ble omdannet til interferon alfa2b ved 34 °C og pH 8,2 med sink (1 M). Reaksjonsløsningen ble omrørt under reaksjonen. Når omdannelsen var ca. 80%. kan reaksjonstemperaturen på løsningen reduseres til 4 °C for å stoppe reaksjonen.

Løsningsfremstilling: 1 M tris-buffer: holdt ved 4 °C, I M tris-base + HC1 ved pH 8,3. 1 mM Zn-løsning: holdt ved 4 °C, 1 mM ZnS04H20 + 10 mM Na-acetat + 175 mM NaCl ved pH 5,5.

Fraksjonene inneholdende toppen av UV-absorbans som eluerte fra protcinrensingskromatografien, ble samlet sammen og sterilitetsfiltrert ved 0,2 u.M. Ca. 0,083 (V/V) av 1 M tris-buffercn ble langsomt tilsatt til proteinansamlingen (pH på en typisk proteinansamling er i området på 5.2 til 5,5) som ble omrørt ved en pH på ca. 8,2. 1 mM Zn-løsningen ble langsomt tilsatt til den basiske proteinansamling under omrøring for å oppnå et 0,6 til 1.0 molarforhold av Zn-kation til total pyruvatsupplementisoform. f.eks. hvis en pyruvatsupplementisoformkonsentrasjon er 1.0 mg/ml, er 30 p.M av Zn eller 0,03 (V/V) av 1 mM Zn-løsningen nødvendig. Det anvendes frisk Zn-kationløsning.

Reaksjonsløsningen ble oppvarmet til 34 °C i en reaktor mens den ble omrørt. Reaksjonstemperaturen ble kontrollert ved 34 °C under reaksjonen. Kontinuerlig omrøring er også nødvendig i den grad at blandingen i reaksjonsløsningen er tilstrekkelig, men ikke kraftig nok til å danne bobler. En viss ventilasjon i reaktoren skal tillates for oksygenoverføring inn i reaksjonsløsningen. Hvis på den annen side reaktoren er ca. halvfull av reaksjonsløsning, er en slik ventilasjon ikke nødvendig. Under reaksjonen kan en reaksjonsprovc tas for å følge omdannelsen under anvendelse av RP-HPLC. Når reaksjonen er over, kan temperaturen reduseres til 4 °C for neste kromatografitrinn.

Claims (9)

1. Fremgangsmåte for økning av utbyttet av et interferon alfa-preparat.karakterisert vedat en pyruvatsupplementisoform av interferon alfa omdannes til interferon alfa ved eksponering av angitte pyruvatsupplementisoform av interferon alfa overfor sinkløsning.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1. karakterisert vedat angitte interferon alfa er interferon alfa2b.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert vedat angitte sinkløsning er ved pH 7.8 til pH 8,6.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert vedat angitte sinkløsning er ved 30-38 °C.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert vedat angitte sinkløsning omfatter en antioksidant.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert vedat angitte antioksidant omfatter metionin.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert vedal angitte metionin er ved en konsentrasjon på 5-40 mM.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert vedat den videre omfatter rensingen av angitte interferon alfa2b ved å anvende kromatografi.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 8, karakterisert vedat angitte kromatografi omfatter agarosebasert fargestoff-affinitetskromatografi etterfulgt av agarosebasert anionbytterkromalografi, som etter-følges av et krystallisasjonstrinn.