PT1601697E

PT1601697E - Purificação de anticorpos através de proteína a e cromatografia de troca iónica.

Info

Publication number: PT1601697E
Application number: PT04715906T
Authority: PT
Inventors: Julian Bonnerjea; Anna Preneta
Original assignee: Lonza Biologics Plc
Priority date: 2003-02-28
Filing date: 2004-03-01
Publication date: 2007-09-04
Also published as: EP1601697A1; EP1601697B1; AU2004215653B2; DK1601697T3; AU2004215653A1; CA2516518A1; WO2004076485A1

Description

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DESCRIÇÃO "PURIFICAÇÃO DE ANTICORPOS ATRAVÉS DE PROTEÍNA A E CROMATOGRAFIA DE TROCA IÓNICA" A presente invenção refere-se ao campo de purificação de anticorpos em produção biotecnológica. É um objectivo da presente invenção descrever um novo processo para purificação de tal anticorpo. A cromatografia em proteína A é utilizada de um modo vasto em produção industrial de anticorpos uma vez que permite purificação quase completa de anticorpos, isto é IgG de um modo habitual, num único passo a partir de sobrenadantes de cultura celular. As colunas de afinidade de proteína A são sujeitas de um modo inevitável a algum grau de perda de ligando a partir da coluna após corridas repetidas. De um modo parcial, isto pode ser devido a hidrólise proteolítica de proteína A a partir da coluna; em produção industrial de anticorpo para aplicações farmacêuticas, não podem ser adicionadas misturas de inibidores de proteases por motivos de regulação. Infelizmente, estes contaminantes de proteína A ou fragmento de proteína A mantêm a sua afinidade para IgG e são difíceis de remover a partir do anticorpo purificado devido a formação contínua de complexos. A remoção é obrigatória uma vez que a proteína A, a qual é uma proteína bacteriana irá desencadear uma resposta imunitária não desejada; adicionalmente, foi descrito que complexos modelo formados através de adição de proteína A, a IgG monomérica activam leucócitos que têm Fc e o sistema do complemento para gerar actividade oxidante e anafilotoxina in vitro (Ballint et ai., Câncer Res. 44, 734, 1984) . 2 A comercialização de espécie recombinante de Proteína A como apresentado em US6,399,750 cuja espécie recombinante está ligada à matriz da coluna através de uma única ligação tioéster permitiu colunas de proteína A com capacidade mais elevada. Como uma vantagem concomitante, a taxa de perda de tais matrizes de Proteína A recombinante é muitas vezes aumentada de um modo drástico em contraste com muitas matrizes tradicionais de Proteína A natural ligada em múltiplos pontos obtidas através de acoplamento CNBr. A remoção de contaminantes de proteína A deveria então ocorrer sem remoção simultânea de IgG em complexos.

Ballint et al. (ibd.) demonstraram que tais complexos de IgG-Proteína podem ser separados a partir de IgG que não está em complexos através de filtração em gel. A baixa produção e perda no rendimento de anticorpos são as desvantagens deste método. US 4,983,722 ensina separação selectiva de proteína A contaminante a partir de uma preparação de anticorpo purificado com proteína A através de absorção da mistura a um material de troca aniónica e a separar ambos os componentes através de eluição sequencial dos anticorpos e proteína A sob condições de aumento de força iónica. Este método de resolução é altamente dependente do pi do anticorpo o qual é específico e altamente variável para um dado anticorpo. Adicionalmente, a produção está limitada pelo declive do gradiente salino necessário para obter separação.

Jiskoot et al. (Developments in Biological Standardisation, 71, 73, 1990) descreve a utilização de colunas de troca 3 aniónica como um meio de remover Proteína A contaminante a partir de uma preparação de anticorpo, contudo, ao contrário da presente invenção, o fluxo obtido a partir do passo de troca iónica não contém anticorpo e portanto é material de desperdício. É um objectivo da presente invenção desenvolver outro método para separar proteína A ou fragmentos de proteína A a partir de anticorpo, de um modo preferido uma IgG, cujo método previne as desvantagens da técnica anterior. De acordo com a presente invenção, tal objectivo é solucionado de acordo com as reivindicações independentes 1 e 14.

De acordo com a presente invenção, é desenvolvido um método de purificação de um anticorpo cujo método compreende os passos de: Primeiro, purificação de um anticorpo através de cromatografia de afinidade em proteína A em que a proteína A é uma proteína A nativa ou um seu derivado funcional.

Segundo, aplicação do anticorpo purificado num material de troca iónica sob condições que permitem a ligação da proteína A ou do seu derivado funcional e terceiro, recolha do anticorpo, de um modo preferido recolha de pelo menos 70%, de um modo mais preferido recolha de pelo menos 80%, de um modo muito preferido recolha de pelo menos 90% da quantidade de anticorpo aplicada no material de troca iónica no fluxo do permutador iónico enquanto que qualquer proteína A ou derivado de proteína A contaminante está ligado ao material de troca iónica. A proteína A é uma proteína de superfície celular encontrada em Staphylococcus aureus. Esta tem a propriedade de se ligar à região Fc de um anticorpo de mamífero, em 4

particular de anticorpos de classe IgG. Dentro de uma dada classe de anticorpos, a afinidade varia ligeiramente no que respeita à origem da espécie e à subclasse ou alotipo de anticorpo (revisto em Surolia, A. et al., 1982, Protein A: Nature's universal, antibody', TIBS 7, 74-76; Langone et al., 1982, Protein A of staphylococcus aureus and related immunoglobulin receptors, Advances in Immunology 32: 157-252) . A proteina A pode ser isolada de um modo directo a partir de culturas de S. aureus que estão a produzir proteina A ou é expressa mais convenientemente de um modo recombinante em E. coli (Lofdahl et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80: 697-701). A sua utilização para purificação de anticorpos, em particular IgG monoclonal, está descrita de um modo amplo na técnica anterior (e.g. Langone et al., acima; Hjelm et al, 1972; FEBS Lett. 28: 73-76) . Para utilização em cromatografia de afinidade em proteina A, a proteina A é acoplada a uma matriz sólida tal como agarose em ligação cruzada, sem carga (Sepharose, livre de fraeção carregada de agarose natural), trisacril, dextrano em ligação cruzada ou materiais à base de sílica. Os métodos para tal são conhecidos de um modo comum na técnica, e.g. acoplamento através de funções amino primárias da proteína a uma matriz activada com CNBr. A proteína A liga-se com elevada afinidade e elevada especificidade à porção Fc de IgG, isto é a região de interface Cy2-Cy3 de IgG como descrito em Langone et al., 1982, acima. Em particular, esta liga-se de um modo forte aos alotipos ou subclasses humanos IgGl, IgG2, IgG3 e aos alotipos ou subclasses de rato IgG2a, IgG2b, IgG3. A proteína A apresenta também uma afinidade para a região Fab de imunoglobulinas que são codificadas pela família de genes VH, VHIII (Sasso et al., 1991, J. Immunol, 61: 3026-3031; Hilson et al., J Exp. Med., 178: 331-336 (1993)). A 5 sequência do gene que codifica para proteína A revelou duas regiões distintas de um modo funcional (Uhlen et al., J. Biol. Chem., 259: 1695-1702 (1984); Lofdahl et al., Proc. Nutl. Acad. Sei. (USA), 80: 697-701 (1983)). A região amino-terminal contém cinco domínios de ligação a IgG altamente homólogos (denominados E, D, A, B e C) , e a região terminal carboxilo liga a proteína à parede e membrana celulares. Todos os cinco domínios de ligação a IgG de proteína A se ligam a IgG através da região Fc, envolvendo e.g. em humanos os resíduos IgG-Fc 252-254, 433-435 e 311, como demonstrado pela estrutura cristalina em Deisenhofer et al. (1981, Biochemistry 20: 2361-2370) e em Sauer-Eriksson et ai. (1995, Structure 3: 265-278) no caso do domínio B de proteína A. A descoberta de dois locais principais de ligação adjacentes de um modo essencial na porção Fc foi confirmada no estudo de solução por RMN de Gouda et al., 1998, Biochemistry 37: 129-136. Em principio, cada um dos domínios de ligação a IgG A a E de proteína A é suficiente para ligação à porção Fc de uma IgG.

Adicionalmente, foi verificado que determinados alelos da família VH3 em homem controlam a ligação de um modo opcional de Ig humana através de proteína A (Ibrahim et al., 1993, J. Immunol. 151: 3597-3603; V-region mediated binding of human Ig by protein A) . No contexto da presente aplicação, noutro objectivo distinto da presente invenção, tudo o que foi dito que se aplica à ligação da região Fc de anticorpo à proteína A aplica-se também à ligação de anticorpos através do tal alelo de ligação à proteína A da família VH3 no caso em que a região Fc de tal anticorpo não permite em si mesma a ligação de elevada afinidade à proteína A. Pode ser considerada uma forma de realização equivalente do método principal, baseado em Fc, da presente 6 invenção; a última é descrita adicionalmente nas secções subsequentes.

Um anticorpo IgG é para ser entendido como um anticorpo de tal alotipo que pode estar ligado a proteína A numa forma de elevada afinidade. Adicionalmente, para além das porções Fc do anticorpo que são relevantes para ligação a proteína A, tal anticorpo não deve corresponder a um anticorpo que ocorra de um modo natural. Em particular nas suas porções de regiões de cadeia variável, este pode ser um anticorpo quimérico modificado ou enxertado com CDR como são desenvolvidos de um modo rotineiro na técnica. Um anticorpo IgG é para ser entendido como um anticorpo do tipo IgG, em resumo.

Um derivado funcional de proteína A é caracterizado por uma constante de ligação de pelo menos K = IO”8 M, de um modo preferido K = 10”9 M para a porção Fc de IgG2a de rato ou IgGl de humano. Uma concordância de interacção com tal valor para a constante de ligação é denominada "ligação de elevada afinidade" no contexto presente. De um modo preferido, tal derivado funcional de proteína A compreende pelo menos parte de um domínio funcional de ligação a IgG de proteína A selvagem cujo domínio é seleccionado a partir dos domínios naturais E, D, A, B, C ou das suas muteínas modificadas os quais mantiveram a funcionalidade de ligação a IgG. Um exemplo de tal é o fragmento 'Z' funcional de 59 aminoácidos de domínio B de proteína A cujo domínio pode ser utilizado para purificação de anticorpos como apresentado em US 6013763. De um modo preferido, contudo, um fragmento de ligação a anticorpo compreende pelo menos dois domínios intactos de ligação a Fc como definido neste parágrafo. Um exemplo é o das sequências de proteína A 7 recombinante descritos e.g. em EP-282 308 e EP-284 368, ambas da Repligen Corporation.

Sozinhos ou em combinação com uma proteína A ou um fragmento ou derivado de proteína A funcional como definido nas secções precedentes, são adicionalmente preferidos fragmentos de proteína A que são modificados de modo a permitir ligação em ponto único. Ligação em ponto único significa que a região de proteína está ligada através de uma ligação covalente única a um material de suporte cromatográfico da cromatografia de afinidade em proteína A. Tal ligação em ponto único através de resíduos reactivos de um modo apropriado são adicionalmente colocados de um modo ideal numa posição exposta de aminoácido, nomeadamente num anel, perto da região N- ou C-terminal ou noutro lugar na circunferência externa do enrolamento da proteína. Grupos reactivos apropriados são e.g. funções sulfidrilo ou amino. De um modo mais preferido, tal proteína A recombinante ou o seu fragmento funcional compreende uma cisteína na sua sequência de aminoácidos. De um modo muito preferido, a cisteína está compreendida num segmento que consiste nos últimos 30 aminoácidos do C-terminal da sequência de aminoácidos da proteína A recombinante ou do seu fragmento funcional. Numa forma de realização preferida adicional de tal tipo, a proteína A recombinante ou o seu fragmento funcional estão ligados pelo menos por 50% através de uma ligação enxofre tioéter ao suporte cromatográfico ou material de matriz do meio de cromatografia de afinidade em proteína A. Um exemplo de uma tal forma de realização é descrito e.g. em US 6399750 da Pharmacia e está comercialmente disponível sob a denominação comercial de Streamline™ ou MabSelect™ da Amersham-Biosciences, dependendo da natureza da matriz de suporte utilizada. No 8 contexto presente, tioéter é para ser entendido de um modo estrito como um esquema de ligação -S- independente de contexto quimico, que se desvia a este respeito da linguagem quimica normal; é possível, por exemplo, que a referida ponte 'tioéter' -S- seja parte de um grupo funcional maior tal como e.g. um tioéster ou um acetal misto, que se desvia a este respeito no contexto da presente aplicação da linguagem normal baseada em reactividade de químicos. De um modo preferido, a ponte tioéter é uma ponte tioéter no seu significado químico comum, estrito. Tal grupo tioéter em ponte pode ser e.g. gerado através de reacção do grupo sulfidrilo de um resíduo de cisteína da proteína A com um grupo epóxido incluído no material de suporte cromatográfico activado. Com um resíduo de cisteína terminal, tal reacção pode ser levada a cabo sob condições apropriadas para permitirem apenas acoplamento de um grupo sulfidrilo exposto, único, de uma proteína de modo a resultar em ligação em ponto único de apenas tal proteína.

Numa forma de realização preferida de um modo particular, a proteína A ou derivado funcional de proteína A é a proteína A recombinante descrita em US 6399750 a qual compreende um resíduo de cisteína próximo da região terminal, modificado, e está, de um modo preferido pelo menos por 50%, de um modo mais preferido pelo menos por 70%, acoplado ao material de suporte cromatográfico através do átomo de enxofre do referido resíduo de cisteína como o único ponto de ligação. Adicionalmente preferido, tal acoplamento foi atingido através de activação mediada por epóxido, de um modo mais preferido quer através de activação com 1,4-bis-(2,3-epoxipropoxi)butano de e.g. uma matriz de agarose tal como Sepharose Fast Flow (esferas de agarose em ligação cruzada 9 com epiclorohidrina, Amersham Biosciences, UK) ou através de activação com epiclorohidrina de e.g. uma matriz de agarose tal como Sepharose FF. Adicionalmente preferido em combinação com a forma de realização preferida referida anteriormente de acordo com este parágrafo é que o primeiro permutador iónico é um permutador aniónico, em particular um permutador aniónico à base de amina quaternária tal como Sepharose Q™ FF (Amersham-Biosciences/Pharmacia), de um modo muito preferido é um permutador aniónico que tem o grupo permutador funcional Q acoplado a um suporte de matriz cujo grupo Q é N,N,N-Trimetilamino-metilo, de um modo muito preferido o permutador aniónico é Sepharose Q™ FF da Pharmacia/Amersham Biosciences. 0 grupo amino quaternário é um forte permutador o qual não está adicionalmente susceptivel a alterações no pH do tampão de amostra/lavagem. A matriz permutadora de fluxo rápido é baseada em esferas de agarose de 45-165 pm que têm um elevado grau de ligação cruzada para elevada estabilidade física; adicionalmente a sefarose é desprovida da fracçâo de molécula carregada, sulfatada, de agarose natural e não permite adsorção não específica de anticorpo à matriz mesmo sob condições de elevadas aplicações de anticorpo. Um exemplo de uma tal forma de realização pode ser encontrada na secção experimental.

Uma proteína A contaminante é qualquer tipo de derivado de ligação a IgG, funcional, de uma proteína A ou de um seu derivado funcional como definido acima a qual é obtida após eluição de anticorpo ligado a partir de uma coluna de cromatografia de afinidade em proteína A. Tal espécie de proteína A contaminante pode resultar e.g. a partir da hidrólise de ligações peptídicas a qual ocorre de um modo muito provável através de acção de enzimas em particular em 10 produção industrial. A cromatografia em proteína A é aplicada como um passo precoce no processamento a jusante quando a solução de produto fresco, purificado de um modo grosseiro, ainda apresenta actividade de protease considerável. É provável que as células mortas no meio de cultura celular ou células sujeitas a ruptura na centrifugação inicial ou nos passos de filtração tenham libertado proteases; para fins de regulação, a suplementação do meio de cultura celular com inibidores de protease antes ou no decorrer do processamento a jusante não é efectuada de um modo habitual, em contraste com prática de investigação bioquímica. Exemplos são Fenil-metil-sulfonil-cloreto (PMSF) ou ácido ε-capróico. Tais agentes químicos não são desejáveis como aditivos na produção de biofarmacêuticos . É adicionalmente possível que derivados funcionais recombinantes ou fragmentos de proteína A sejam menos resistentes a protease do que proteína A selvagem, dependendo da estrutura terciária do enrolamento da proteína. Os segmentos de aminoácidos que ligam domínios de ligação a IgG individuais podem ser expostos uma vez reduzido o número total de domínios de ligação. Os contactos entre domínios podem contribuir possivelmente para a estabilidade de enrolamento de domínios. Pode ser também que a ligação de anticorpo através de proteína A ou dos seus derivados funcionais referidos influencie ou facilite a susceptibilidade a acção de protease, devido a alterações conformacionais induzidas após ligação do anticorpo. De novo, a proteína A selvagem ou de comprimento total ou os seus fragmentos modificados, funcionais, podem comportar-se de um modo diferente. De um modo preferido, a proteína A contaminante é ainda proteína de ligação a IgG, funcional, e assim está associada ao anticorpo purificado por proteína A quando aplicada no meio 11 de separação de troca iónica subsequente. A associação baseada em elevada afinidade de proteína A contaminante com o anticorpo purificado é o motivo porque é difícil separar de um modo eficaz proteína A contaminante de anticorpo purificado.

De um modo preferido, o anticorpo requerido para ser purificado é recolhido a partir de uma cultura celular antes da purificação do anticorpo através de cromatografia de afinidade em proteína A. De um modo mais preferido, a referida cultura celular é uma cultura celular de mamífero. As células de mamífero têm compartimentos grandes chamados lisossomas que têm enzimas de degradação os quais são sujeitas a ruptura após morte celular ou recolha. Em particular, a referida cultura celular pode ser uma cultura celular de mieloma tal como e.g. células NSO (Galfre, G. e Milstein, C. Methods Enzymology, 1981, 73,3). As células de mieloma são células de plasmacitoma, i.e. células de linhagem celular linfóide. Uma linha celular NSO modelo é e.g. linha celular ECACC N° 85110503, disponível de um modo gratuito a partir da European Collection of Cell Cultures (ECACC), Centre for Applied Microbiology & Research, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Reino Unido. Verificou-se que as NSO são capazes de dar origem a rendimentos de produto elevados de um modo extremo, em particular se utilizadas para produção de anticorpos recombinantes. Por sua vez, verificou-se que células NSO dão origem de um modo reprodutível a níveis muito mais elevados de proteína A contaminante do que outros tipos de células hospedeiras pelo menos com determinados sistemas de cromatografia de afinidade em proteína A que utilizam fragmentos recombinantes encurtados de proteína A selvagem cuja proteína A recombinante é de um modo possível proteína A 12 ligada em ponto único. Um exemplo de tal é resina de cromatografia de afinidade em rProteina A Streamline™ (Amersham Biosciences; de um modo essencial proteína A recombinante ligada em ponto único por ligação tioéster como descrito em US 6,399,750). Os níveis aproximados ou em excesso de 1000 ng de proteína A contaminante/mg de anticorpo poderiam ser obtidos com colunas de afinidade em rProteina A Streamline . O método da presente invenção distingue-se da técnica anterior na redução de um modo eficiente de proteína A contaminante de tais níveis elevados até < 1 ng/mg de anticorpo num único passo de purificação rápida, isto é com um factor de purificação de cerca de lOOOx. É adicionalmente preferido, sozinho ou em combinação com o parágrafo precedente, que o anticorpo que é para ser purificado através de cromatografia de afinidade em proteína A não seja tratado para inactivar proteases durante ou após recolha, de um modo mais preferido não esteja numa mistura pelo menos com um inibidor de protease suplementado de um modo exógeno após recolha. De um modo muito preferido, o referido inibidor de protease é seleccionado a partir do grupo que consiste em PMSF, péptidos específicos que inibem proteinase como descrito em Laskowski et ai., 1980, Protein inhibitors of proteinases, Ann. Rev. Biochem. 49, 593-626, e ácido épsilon-capróico. O processo de cromatografia de afinidade em proteína A foi descrito de um modo vasto na literatura da técnica e não precisa de ser adicionalmente descrito. Outro exemplo além dos citados acima é e.g. Duhamel et al., J. Immunological Methods 31, (1979) 211-217, pH Gradient elution of human IgGl, IgG2 and IgG4 from protein A-Sepharose. 13

De um modo preferido, a proteína A contaminante é reduzida até uma concentração de < 10 ng/mg de anticorpo, de um modo mais preferido < 4 ng/mg de anticorpo, de um modo muito preferido < 1 ng/mg de anticorpo no fluxo do primeiro permutador iónico, em que o anticorpo é para ser entendido de um modo preferido como referindo-se a IgG. 0 método de ensaio Elisa para validação destes valores limite é descrito em detalhe na secção experimental; deveria ser notado que a acidificação da amostra até um pH ^ 4, de um modo preferido na presença de um detergente suave, é crucial para determinação precisa da quantidade de proteína A perdida. É claro que o seu limite é para ser entendido de forma a que a capacidade de aplicação do primeiro permutador iónico para ligação a proteína A nunca é excedida, levando de um modo inevitável a saturação de proteína A contaminante. Um método apropriado baseado em Elisa para ensaio de proteína A ou fragmentos de proteína A é descrito em US 4,983,722. Os anticorpos apropriados anti-proteína A estão comercialmente disponíveis, e.g. da Sigma-Aldrich. Em particular quando se utilizam derivados de proteína A cujos derivados tenham sido modificados para conter grupos sulfidrilo adicionais, é importante a manutenção apropriada do padrão de proteína. Pode ser importante verificar o carácter monomérico de tal derivado puro de proteína A utilizado como um padrão para quantificação da amostra de teste, uma vez que di- ou multímeros covalentes formados através de pontes -S-S-poderiam levar a resultados errados. A verificação pode ser atingida de um modo fácil através de análise em SDS-PAGE sob condições redutoras e não-redutoras, como é habitual na técnica. A redução de tal solução padrão de derivado de proteína A através de DTT ou beta-mercaptoetanol ajuda de 14 um modo concordante nos erros ilusórios de medição na técnica de ELISA.

Adicionalmente preferido, no método de acordo com a presente invenção pelo menos 70%, de um modo mais preferido pelo menos 80%, de um modo muito preferido pelo menos 90% do anticorpo aplicado no primeiro permutador iónico podem ser recuperados no fluxo do permutador iónico. 0 primeiro permutador iónico é uma resina permutadora aniónica; a proteína A pode estar ligada através de ambos os tipos de resina como descrito (EP-289 129 Bl). O primeiro permutador iónico ou permutador aniónico pode ser manuseado no modo de coluna a uma determinada velocidade de fluxo ou em modo de processamento em série, submergindo a resina de troca iónica numa solução de amostra agitada de um modo suave e trocando adicionalmente o meio líquido através de filtração de um modo subsequente. Tendo em conta o pi de um dado anticorpo, é possível definir condições apropriadas de pH e força iónica para aplicação do primeiro permutador iónico, cujas condições resultam na retenção do anticorpo no fluxo enquanto que o contaminante de proteína A está ligado e é assim removido a partir do anticorpo. Como já foi dito anteriormente, o método de acordo com a presente invenção permite a separação mais rápida de anticorpo a partir de proteína A contaminante. Exemplos de grupos funcionais de tal primeiro permutador de troca iónica que estão ligados a um suporte de matriz são e.g. grupos amino primários, secundários, e de um modo particular terciários ou quaternários tais como aminometilo, dietilaminoetilo, trimetilaminoetilo, trimetilaminometilo e dietil-(2-hidroxipropilo)-aminometilo. São conhecidas na técnica matrizes de suporte 15 cromatográficas apropriadas para o permutador aniónico. Exemplos são resinas e esferas à base de agarose, esferas de dextrano, esferas de poliestireno e resinas de poliestireno/divinil-benzeno. De um modo muito preferido, o permutador iónico é um permutador aniónico à base de amina quaternária montado numa matriz de agarose tal como e.g. Sepharose CL-6B ou Sepharose Fast Flow (FF) da Amersham-Biosciences/Pharmacia. Um exemplo de tal é Sepharose Q™ da Amersham-Biosciences/Pharmacia. Adicionalmente preferido em conjunto com a utilização de um primeiro permutador aniónico é que o anticorpo seja um anticorpo monoclonal que tenha um ponto isoeléctrico (pi) o qual está pelo menos duas unidades de pH acima, isto é este é mais básico do que, o pi da proteína A utilizada no passo de cromatografia de afinidade em proteína A precedente; e.g. enquanto que a proteína A nativa tem um pi de cerca de 5,0, a proteína A recombinante Streamline tem um pi de cerca de 4,5. De um modo preferido, o anticorpo é um anticorpo monoclonal que tem um pondo isoeléctrico (pi) o qual é pelo menos 6,5 ou acima, de um modo mais preferido é 7,0 ou acima, de um modo muito preferido tem um pi de pelo menos 7,5 ou acima. Deveria ser tido em atenção que este se refere ao pi do anticorpo realmente recolhido e purificado, não o pi que pode ser previsto de um modo simples a partir da sequência de aminoácidos sozinha. A molécula de anticorpo realmente purificada pode sofrer modificações adicionais do esqueleto de polipéptidos tais como glicosilação, cujas modificações podem adicionar regiões carregadas e podem assim ter alterado o pi da molécula. Após determinação de pi através de focagem isoeléctrica (IEF) para produzir anticorpo, a micro-heterogeneidade de processamento pós-traducional da proteína de anticorpo, e.g. uma proteína de anticorpo monoclonal, leva a um intervalo de pi mais vasto para 16 moléculas individuais de glicoproteina de produto anticorpo, estas aparecem como uma mancha num gel IEF em vez de uma banda única e assim um valor numérico especifico pelo menos para a maioria de produto. 0 "pi de um anticorpo" refere-se àquela porção de moléculas de produto de anticorpo cujo pi está dentro do intervalo preferido de pi como especificado acima. Todas as definições adicionais desta descrição, tais como a proporção de % de anticorpo recuperada após um dado passo de purificação, se referem apenas à referida porção de anticorpo com pi concordante.

0 modo de manuseamento de um primeiro permutador aniónico requer troca de tampão do eluato acidico ou neutralizado obtido a partir do passo de cromatografia de afinidade em proteína A com o tampão de equilíbrio do primeiro permutador aniónico. 0 tampão de equilíbrio e tampão de amostra são idênticos no método da presente invenção. Podem ser utilizados de um modo eficaz para tal fim aparelhos de ultrafiltração utilizados de um modo comum tais como aqueles vendidos pela Amicon ou Millipore; aqueles evitam os efeitos de diluição enquanto que utilizam e.g. matrizes de filtração porosas de baixo peso molecular tais como Sephadex G-25. O tampão de equilíbrio tem de um modo preferido uma concentração salina de um sal de deslocação tal como e.g. cloreto de sódio na gama de sal ala 150 mM, de um modo mais preferido a partir de 5 até 110 mM, de um modo muito preferido a partir de 20 até 100 mM. O pH do tampão de equilíbrio está de um modo preferido na gama de pH 6,5 até pH 9,0, de um modo mais preferido está na gama de pH 7,5 até pH 8,5, de um modo muito preferido está na gama de pH 7,9 até pH 8,4. Deve ser tido em atenção que a função amino N-terminal de uma proteína tem um valor de pKs de cerca de 9,25, assim a ligação de proteína A 17 contaminante e qualquer outra proteína já carregada de um modo negativo a um permutador aniónico irá tornar-se mais forte a pH mais básico; para uma dada aplicação, o pH do tampão de amostra poderia necessitar de ajustes para discriminação óptima de ligação e não-ligação para um dado par de anticorpo e proteína A contaminante que tenha valores de pi que difiram e diferente conteúdo de cadeias laterais de cisteína e histidina o que pode contribuir para alterações na carga dentro das gamas seleccionadas de pH. Adicionalmente, um pH mais básico interfere com interacções proteína A-anticorpo assim como qualquer aumento na força iónica; também, a força iónica necessita de ajustes para equilibrar a prevenção de ligação de anticorpo com a necessidade de anular a ligação de proteína A contaminante. 0 especialista depreende que a força iónica do tampão está inversamente relacionada de um modo habitual com o valor de pH; quanto mais fortemente a proteína A se ligar ao permutador aniónico dependendo do pH, mais sal é tolerado para prevenir a ligação de anticorpo e para interferir com potenciais interacções proteína A-anticorpo. Assim, os intervalos dados acima para pH e sal de deslocação são assim para ser entendidos como estando relacionados: Quanto mais baixo o pH, menos sal é aceitável dentro dos intervalos preferidos dados acima para aplicar a invenção. Adicionalmente é adicionada carga de sal pela substância tamponante de pH, aumentando adicionalmente a força iónica da solução. A força iónica pode ser determinada através da medida da condutividade do tampão de equilíbrio. O termo "condutividade" refere-se à capacidade de uma solução aquosa conduzir uma corrente eléctrica entre dois eléctrodos mede a quantidade total de iões tendo em conta a carga e mobilidade dos iões. Então, com uma quantidade crescente de iões presentes na solução aquosa, a solução 18 irá ter uma condutividade mais elevada. A unidade de medida para condutividade é mS/cm (miliSiemens/cm), e pode ser medida utilizando um aparelho de medição de condutividade disponível comercialmente, e.g. da Topac Inc. (Hingham, MA/E.U.A.) ou Honeywell. No contexto da presente aplicação, todos os valores numéricos fazem parte da condutividade específica a 25 °C. De um modo preferido, o tampão de amostra ou equilíbrio para o primeiro passo de troca aniónica tem uma condutividade de 0,5-5 mS/cm, de um modo mais preferido a partir de 1-3 mS/cm, de um modo muito preferido a partir de 1,25-2,5 mS/cm. De um modo ideal, este tem uma condutividade de cerca de 2 mS/cm. Exemplos de sais do tampão apropriados podem ser encontrados em Good, N.E. (1986, Biochemistry 5: 467-476). E.g. tampão Tris.HCl ou um tampão de hidrogenofosfato de sódio como utilizadas de um modo comum são substâncias tamponantes apropriadas. A concentração da substância tamponante está de um modo comum no intervalo de e.g. sal do tampão a 10-40 mM. Entre as potenciais espécies de aniões úteis para desenvolvimento de um tampão, são preferidas aquelas que têm baixa força específica de eluição de anião quando comparada com cloreto, cuja propriedade de baixa força de eluição está inversamente correlacionada de um modo aproximado com a densidade de carga iónica e é proporcional de um modo aproximado ao tamanho iónico. As comparações empíricas de força de eluição aniónica estão tabuladas em manuais padrão de bioquímica. De um modo mais preferido, a substância tamponante é um tampão fosfato. O hidrogenofosfato tem uma baixa força de eluição, em particular se utilizado a um pH de ou abaixo de 8, e excede adicionalmente por propriedades caotrópicas de um modo particularmente baixo. 19

Enquanto o modo de processamento em série é possível, o modo de processamento em coluna é preferido para o primeiro permutador aniónico. Naquele caso, uma velocidade de fluxo de cerca de 10 a 60 ml/h pode ser utilizada de um modo vantajoso. A concentração de aplicação de anticorpo aplicado pode estar de um modo favorável no intervalo de 10 a 30 mg de anticorpo/ml resina de troca. Depreende-se que a utilização de amostras diluídas de um modo extremo iria dar origem a rendimento diminuído de anticorpo, como é conhecido pelo especialista. O anticorpo requerido para ser purificado é recolhido no fluxo do processamento de aplicação incluindo cerca de um volume de coluna de lavagem com o mesmo tampão de equilíbrio. O pH do fluxo pode ser ajustado até pH neutro para melhorar a estabilidade e prevenir a agregação e/ou precipitação de proteína anticorpo.

Após o primeiro permutador aniónico, o anticorpo está pronto para utilização em aplicações ou pode ser considerando para requerer polimento adicional através de métodos de purificação habituais. Numa forma de realização preferida adicional, o primeiro passo de troca iónica é seguido de um segundo passo de troca iónica em cujo segundo passo o anticorpo é aplicado e ligado através do segundo meio de troca iónica e é eluído com um tampão excepto o tampão de amostra, através de sal e/ou pH aumentados, como um anticorpo não-agregado, monomérico de um modo essencial. "De um modo essencial" significa menos do que 5% neste contexto. De um modo preferido, sozinho ou em combinação com uma forma de realização preferida descrita nas secções precedentes, o segundo permutador iónico é um permutador catiónico. Tal combinação de um passo de cromatografia em proteína A seguido de um primeiro permutador aniónico e um 20 segundo passo permutador catiónico é nova. É bem conhecido que a maioria das proteínas contaminantes vestigiais obtidas a partir de um meio de cultura celular tem valores de pi muito mais baixos do que os anticorpos, em particular anticorpos IgG; a troca catiónica irá então permitir a remoção eficaz de ambos o anticorpo agregado e potenciais agentes infecciosos tais como cápsides virais assim como contaminantes de proteínas excepto anticorpos. Devido a uma operação acelerada, a recuperação altamente eficaz de anticorpo após aplicação, ligação e eluição a partir da co-e elevada capacidade de aplicação, permite também o manuseamento cíclico, repetido, com uma única carga de anticorpo com efeito aditivo do factor de purificação alcançado num único ciclo de ligação e eluição. De um modo preferido, o pH do tampão de amostra é cerca de pH 4 a 7, de um modo mais preferido pH 4,01 a 6, de um modo muito preferido pH 4,02 a 5,5. Adicionalmente preferido, o anticorpo é eluído a partir do permutador catiónico com um gradiente salino no intervalo a partir de 0,1 até 1,2 M de sal, em que o sal é de um modo preferido um sal de metal alcalino, de um modo mais preferido um sal de lítio, potássio ou sódio. De um modo preferido, a eluição ocorre a um pH a partir de pH 7 até 8 de modo a ter remoção máxima de agregados e dano mínimo para o anticorpo devido a condições acídicas. Preferida de um modo opcional, a eluição ocorre a um pH ácido a partir de pH 4 até 7, de um modo mais preferido 4,01 até 6 para maximizar a remoção de proteína A contaminante; níveis tão baixos como < 0,4 ng/mg de anticorpo podem ser concretizados deste modo. Este segundo passo de permutador iónico torna a filtração em gel tradicional discutível enquanto permite capacidade elevada assim como processamento rápido como é típico para permutadores iónicos. Os permutadores iónicos suportam 21 aplicações de 10-30 mg de anticorpo/ml de resina. Numa forma de realização preferida de um modo particular, o método de purificação de um primeiro permutador aniónico e um segundo passo de permutador catiónico no resultado de cromatografia em proteína A providencia anticorpo de grau clínico na ausência de um passo terminal de cromatografia por exclusão molecular (SEC) adicional cujo passo SEC iria ter um limite de exclusão de peso molecular apropriado para separar agregados de anticorpo e/ou complexos anticorpo-proteína A de anticorpo monomérico tal como uma IgG normal.

Numa nota geral, o método da presente invenção não pode ser utilizado para anticorpos que foram criados contra epítopos originados de proteína A. Tais anticorpos estão recusados, embora esta seja uma limitação óbvia para o especialista. A característica mais apelativa do método da presente invenção é que purificando anticorpos através de um permutador aniónico num modo de não-ligação ou fluxo, a capacidade da coluna não limita a produtividade de material; a capacidade é apenas decisiva no que diz respeito a pequenas quantidades de proteína A contaminante retida. Isto poupa muito de tempo de processamento e recursos materiais enquanto permite remoção muito eficaz de contaminante de proteína A.

Experiências

1. Elisa de Proteína A

Foram descritos vários Elisas para teste de proteína A ou proteína A recombinante (ver US 4983722 e referências aí descritas). Para todo o trabalho abaixo descrito, foi 22 utilizado um Elisa em sandwich simples no qual o anticorpo de captura anti-proteina A revestido numa placa de microtitulação de 96 poços de fundo plano (Nunc™) retém a proteina A. A proteina A ligada é depois detectada com um anticorpo de detecção biotinilado anti-proteina A, o qual permite adicionalmente a ligação de peroxidase de rábano conjugada com estreptavidina (Amersham #RPN 1231). 0 anticorpo de coelho anti-proteina A disponível comercialmente (criado contra a proteina A natural de S. aureus) para captura está disponível na Sigma-Aldrich (#P-3775). Foi este anticorpo que foi utilizado durante este estudo. 0 anticorpo de detecção de coelho foi igualmente encomendado da Sigma-Aldrich (#3775). Após revestimento da proteina através de processo de adsorção não especifico, a proteina revestida é utilizada para reter anticorpo de captura de proteina A especifico para proteina A cujo anticorpo de captura é adicionalmente detectado com anti-proteina A biotinilado de coelho e peroxidaxe de rábano conjugada com estreptavidina. É utilizada benzidina de tetrametilo como o substrato cromogénico. As amostras de concentração desconhecida são lidas contra uma curva padrão utilizando a proteina A parental ou derivado de proteina A da proteina A contaminante requerida para ser detectada. Foi provado que o revestimento a pH acidico assim como a preparação apropriada do padrão são importantes. Em particular para proteina A recombinante modificada para conter resíduo de cisteína adicional tal como e.g. proteína A Streamline™ (Amersham Biosciences, anteriormente Pharmacia), verificou-se que a solução padrão necessita de pré-tratamento com um agente redutor sulfidrilo para assegurar o estado monomérico da solução de padrão de proteína. 23 0 padrão de proteína A selvagem, em contraste, está disponível comercialmente a partir de um número de companhias, e.g. Sigma-Aldrich/Suiça (#P6031) ou Pharmacia (#17-0770-01) e não necessita de tal pré-tratamento. Para as experiências abaixo descritas a observação de perda de proteína A contaminante a partir da matriz Streamline™, foram utilizadas como um padrão amostras de proteína A recombinante não conjugada obtida a partir do produtor. 1.1. Pré-tratamento de padrão de proteína A enriquecida com Cis A proteína A-Cis recombinante pura como comercialmente no material de coluna de cromatografia de afinidade em proteína A Streamline™ (Amersham Biosciences) foi obtida liofilizada a partir da Pharmacia/Amersham Biosciences. Foram dissolvidos até 20 mg/ml de proteína em Tris a 0,1M pH 8 contendo NaCl a 0,5 M, EDTA a 1 mM e ditioeritritol a 20 mM, incubados durante 15-30 min. à temperatura ambiente e dessalinizados com uma coluna de filtração em gel PD-10 descartável (Amersham Biosciences). Todos os tampões utilizados para manuseamento da solução padrão antes do revestimento deveriam ser tratados com N2 para prevenir a oxidação dos grupos tiol. A preparação do padrão de proteína foi levada a cabo na melhor das hipóteses de um modo imediato antes da utilização do padrão para revestimento das placas de microtitulação. De um modo opcional, foi preparada uma solução inicial a lmg/ml e mantida a -65 °C num congelador; após descongelar, o carácter monomérico de proteína A foi sujeito a ensaio a partir de uma alíquota aplicada num SDS-PAGE não redutor. A concentração de padrão de proteína foi determinada através de ensaio de Bradford (Bradford et al., 1976, Anal. 24

Biochem. 72: 248-254; Splittgerber et al., 1989, Anal.

Biochem. 179: 198-201) assim como através de análise automática de aminoácidos. O resultado de tal pré-tratamento é apresentado na Fig. 1 através de SDS-PAGE não redutor a 10% para um padrão de proteína A de estafilococos (poço 1: proteína A nativa; poço 2: após pré-tratamento) e proteína A recombinante Streamline™ não acoplada, pura (providenciada por cortesia de Pharmacia, agora Amersham-Biosciences; poço 4: proteína A recombinante nativa; poço 5: após pré-tratamento). O poço 1 é um marcador de peso molecular com as massas moleculares correspondentes estando indicadas no eixo vertical. A proteína A recombinante da Pharmacia contendo um resíduo de Cis adicional variou após redução até menor peso molecular; uma banda monomérica de cerca de 34 kD está preservada e muito mais intensa, decorrida de um modo óbvio da dissociação de dímeros de dissulfito em ponte. 1.2. Elisa 1.2.1. Preparação de amostra

Através de dois passos de diluição, foi preparada diluição a 1: 200.000 da solução inicial padrão de proteína A a 1 mg/ml para providenciar o padrão principal a 50 ng/ml. Deste, foram preparadas diluições abaixo de 0,2 ng/ml para ensaio da curva padrão. Adicionalmente, as diluições do padrão ('soluções padrão') foram utilizadas para equilibrar de amostras duplicadas de produto para ser testadas de modo a excluir a presença de substâncias interferentes na amostra.

Para teste de amostra de produto final, toda a amostra está dividida em 2 volumes iguais de 500 μΐ. Um é equilibrado 25 com a solução parão a 1000 ng/ml, ou a solução a 10 pg/ml se apropriado, para originar um conteúdo final em proteína A de 10 ng de proteína A por mg de anticorpo. A outra metade é equilibrada com o mesmo volume de tampão de amostra; assim o factor de diluição da amostra de produto devido ao padrão é tido em conta. Ambos os tipos de preparação irão ser referidos como "amostra equilibradas" de seguida. O tampão de amostra foi preparado a partir de 7,51 g de Glicina (base), 5,84 g de NaCl, 0,5 ml de Triton X-100 até um volume de 1 L com água desionizada ou bidestilada.

Para medições precisas óptimas, as concentrações de anticorpo nas amostras foram pré-determinadas através de Elisa habitual bem conhecido na técnica. Uma solução padrão adicional foi equilibrada com uma quantidade igual de um conhecido anticorpo padrão de afinidade de região constante comparável para proteína A, para determinar a eficácia do passo de acidificação e para resolver qualquer potencial erro sistemático introduzido pela ligação de anticorpo e consequente limpeza da proteína A a partir de captura no ensaio.

Acidificação: A 450 μΐ de amostra equilibrada ou padrão são adicionados 200 μΐ de tampão citrato a 0,2 M/Triton X-100 a 0,05% a pH 3,0. Todas as amostras foram realizadas em triplicado. Adicionalmente, as diluições de amostras foram preparadas e testadas em triplicado uma vez que os trabalhos de ensaio óptimos para concentrações de anticorpo estão no intervalo de 1 mg/ml e 0,2 mg/ml. O passo de acidificação é crucial no presente ensaio para libertar proteína A ou fragmentos de proteína A contaminantes os quais estavam de outro modo ligados ao excesso de anticorpo presente na solução de amostra. 26 1.2.2. Revestimento de placas de microtitulação com anticorpo 0 tampão de revestimento foi preparado a partir de Na2C03 a 1,59 g/L, NaHCCt a 2,93 g/L e azida de sódio a 0,20 g/L. O pH do tampão foi ajustado até pH 9,6. Adicionar 100 μΐ de solução de anticorpo por poço contendo anticorpo numa quantidade suficiente para não apresentar saturação para o padrão de proteína A. Revestir a placa com película plástica e colocar em câmara húmida. Incubar a 37 °C durante a noite durante 18 horas de um modo aproximado. Lavar todos os poços 3 vezes pelo menos com 300 μΐ de tampão de lavagem [NaCl a 5,8 g/L, Na2HPC>4 a 1,15 g/L, NaH2P0.H20 a 0,26 g/L, EDTA a 3,7 g/L, Tween-20 a 0,2 g/L, butanol a 10 ml/L, pH 7,2], e secar. Adicionar 250 μΐ de tampão de bloqueio [tampão de revestimento com caseína hammarsten a 0,5%] a cada poço e incubar durante 2 horas a temperatura ambiente num agitador orbital benchtop (velocidade 120 rpm). Lavar todos os poços pelo menos três vezes com 300 μΐ de tampão de lavagem, e secar. 1.2.3. Incubação de amostra e detecção

Plaquear padrões e amostras incluindo quaisquer amostras equilibradas com 100 μΐ/poço. Cobrir a placa com película plástica e incubar durante 90 minutos à temperatura ambiente num agitador orbital benchtop. Lavar todos os poços três vezes pelo menos com 300 μΐ de tampão de lavagem, e secar. Diluir anti-proteína A biotinilado de coelho à diluição óptima determinada de um modo prévio. Adicionar 100 μΐ/poço, cobrir a placa com película plástica e incubar durante 90 minutos à temperatura ambiente num agitador orbital. Repetir a lavagem. 27

Diluir peroxidaxe de rábano conjugada com estreptavidina à diluição óptima determinada de um modo prévio utilizando tampão conjugado [Na2HP04 a 1,15 g/L, NaCl a 5,84 g/L, NaH2P04.H20 a 0,26 g/L, EDTA a 3,73 g/L, Triton x-100 a 0,05% (v/v), pH 7,2]. Adicionar 100 μΐ/poço, cobrir a placa com película plástica e incubar durante 45 minutos à temperatura ambiente num agitador orbital. Repetir a lavagem. Adicionar 100 μΐ de solução de substrato de benzidina de tetrametilo preparada recentemente (TMB, número de produto ICN #980502). A solução de substrato é preparada assim: Uma solução inicial é preparada através de dissolução de 10 mg de TMB em 1 ml de DMSO. São adicionados 10 μΐ daquela solução inicial, são ainda adicionados 10 μΐ de H202 a uma solução aquosa de acetato de sódio a 2,05% (p/p) que foi ajustada até pH 6,0 com ácido cítrico a 0,5 M. Depreende-se que toda a água utilizada para preparar qualquer reagente do ensaio é da mais elevada qualidade, isto é ultrapura desionizada ou pelo menos água bidestilada. A solução de substrato é incubada à temperatura ambiente durante 8-11 minutos num agitador. A reacção é depois terminada através da adição de 50 μΐ por poço de solução de terminação [H2S04 a 13%]. Nos 10 min. após adição da solução de terminação, a absorvância a comprimento de onda de 450 nm dos poços é determinada num espectrofotómeto leitor de placas. O limite de detecção para tal Elisa é Proteína A a 0,2 ng/ml, com um intervalo de trabalho a partir de 0,2 até 50 ng/ml. A variabilidade de inter-ensaio é menor do que 10%. A Fig. 2 apresenta os níveis de proteína A recombinante perdida em eluatos de anticorpo a partir da cromatografia em proteína A recombinante Streamline™ com proteína A ligado em ponto único em ligação tioéter. O número de 28 ciclos refere-se a utilização repetida após eluição com cloreto de sódio a 1 M e re-equilibrio. Enquanto a perda a partir do meio de cultura celular de cultura celular de hibridoma estava de um modo tipico na ordem de 500 ppm, outros tipos de células originaram níveis tão altos como 1000 ppm. Uma visão geral na velocidade de perda a partir de matrizes originadas de um modo diferente é dada na

Tabela 1; a cromatografia foi realizada de acordo com instrução do produtor.

Tabela 1

Matriz Fornecedor Química de acoplamento Perda típica p.p.m. Capacidade de Trabalho (mgml-1) Velocida -de de Fluxo (cmh-1) Native Protein A Sepharose 4FF Amersham- Bioscien ces CNBr ligado em múltiplos pontos 10-20 5-20 30-300 rmp Protein A Sepharose Amersham- Bioscien ces Ligação em múltiplos pontos 10-20 5-20 30-300 Poros A High Capacity Applied Biosys- tems Ligação em múltiplos pontos 10-50 10 500-1000 Protein A Ceramic HyperD Biosepra Ligação em múltiplos pontos Até 300 10-20 200-500 rProtein A Sepharose Amersham- Bioscien ces Ligação em ponto único Ligação por tioéter 50-1000 20-20 30-300 MabSelect Amersham- Bioscien ces Ligação em ponto único 50-1000 20-40 500 STREAM-LINE rProtein A Amersham- Bioscien ces Ligação em ponto único Ligação por tioéter 50-1000 20-40 200-400

Adicionalmente a Fig. 3 providencia dados sobre perda reduzida de um modo não substancial de proteína A contaminante durante corridas repetidas da cromatografia de afinidade em proteína A com o mesmo material de matriz de afinidade; a Sepharose 4 FF (Amersham-Biosciences) com 29 proteína A selvagem ligada em múltiplos pontos foi utilizada de um modo repetido como descrito na secção 2.1. abaixo e o nível de proteína A contaminante no eluato, antes de qualquer processamento adicional de eluato, foi determinado através de Elisa como descrito acima.

2. Cromatografia em Proteína Ά e Sepharose Q 2.1. Cromatograf ia de afinidade em proteína A com Streamline™ 0 sobrenadante de cultura celular obtido a partir de cultura celular de mieloma NSO foi purificado de um modo grosseiro através de centrifugação e filtração em profundidade e concentrado através de ultrafiltração; a ultrafiltração foi também utilizada para alterar o fluído de cultura para PBS a pH 7,5. 0 titulado de anticorpo #5 produzido pelas células foi 0,2 mg/ml, foi aplicado um total de 1 L de sobrenadante alterado com tampão. O pi do anticorpo monoclonal #5 era 8,5. A coluna de proteína A Streamline™ (volume de 5,0 ml) foi equilibrada de um modo prévio com 10 volumes de coluna de glicina/glicinato a 50 mM pH 8,8, NaCl a 4,3 M; a velocidade de fluxo era 200 cm/h. Para aplicação, a coluna foi utilizada a uma velocidade de fluxo de 50 cmff1; a capacidade de aplicação era cerca de 20 mg/ml de material de matriz). Antes da eluição, a coluna foi lavada pelo menos com 10 volumes de coluna de tampão de equilíbrio de glicina suplementado com NaCl a 200 mM e Tween-20 a 0,1% adicionais. A eluição foi conseguida com tampão de eluição preparado de tampão glicina/HCl a 0,1 M pH 4,0. De um modo imediato após a eluição, as fracções de eluato compreendendo o pico de anticorpo foram neutralizadas com uma alíquota adequada de 30

TrisHCl a 0,5 Μ pH 7,5 e tampão alterado com um aparelho de diafiltração Amicon com tampão de amostra/equilíbrio (Tris/HCl a 10 mM pH 8,0, NaCl a 50 mM) para o passo de permutador aniónico subsequente para prevenir exposição prolongada a pH acidico. A concentração de anticorpo e a concentração de proteína A contaminante foram determinadas como descrito acima. O nível de proteína A contaminante no eluato atingiu 1434 ng/mg de anticorpo antes e atingiu 1650 ng/mg de anticorpo após diafiltração. A recuperação de anticorpo baseada no titulado da solução de sobrenadante alterada com tampão antes de aplicação era 81%; a concentração de anticorpo na solução diafiltrada era 3,6 mg/ml. 2.2. Passo de troca aniónica com Q-Sepharose FF no modo de não-ligação O anticorpo purificado da secção 2.1. foi adicionalmente processado como descrito: Uma coluna Q-Sepharose FF de 5,0 ml (Amersham Biosciences) foi empacotada com 10 ml de NaOH a 0,1 M, seguido de 2 volumes de coluna de Tris a 0,1 M pH 8, e equilibrada em 10 volumes de coluna de Tris a 10 mM pH 8/NaCl a 50 mM, a uma velocidade de fluxo de 75 cm/h. Após equilíbrio, a velocidade de fluxo foi reduzida até 50 cm/h. Foram aplicados 6 ml da solução de anticorpo diafiltrada na coluna e o fluxo foi recolhido para processamento adicional; o fluxo foi continuado para ser recolhido até, após ter sido aplicado na coluna com os 6 ml iniciais e tendo sido continuado a partir daí com tampão de amostra ou equilíbrio puro de Tris a 10 mM pH 8, NaCl a 50 mM, a adsorção do fluxo monitorizada a 280 nM ter voltada à linha de base. A recuperação total de anticorpo no fluxo foi 23 31 mg de anticorpo (87%) . A determinação do nivel de proteína A contaminante resultou em < 3 ng/mg de anticorpo. Verificou-se que processamento adicional desta série de anticorpos purificados por Q-Sepharose através de filtração em gel (cromatografia de exclusão molecular, SEC) sobre Sephacryl S-300 em tampão de Fosfato a 10 mM pH 7,0, NaCl a 140 mM a uma velocidade de fluxo de 10 cm/h com uma razão de aplicação de 15 mg de anticorpo por ml de gel não alterou mais este nivel de proteína A contaminante vestigial de um modo substancial. Por experiência, a SEC pode ser utilizada para adicionalmente reduzir níveis de cerca de 30-100 ng/mg de proteína A contaminante até cerca de 1-5 ng/mg. Assim a SEC tem um factor de purificação muito baixo no que diz respeito a quantidades vestigiais de proteína A, contribuindo de um modo possível para interacções de afinidade entre anticorpo e proteína A contaminante.

Contudo, devido à diluição inevitável de amostra e processamento lento com a mesma o que permite alguma decomposição da proteína de anticorpo, a SEC permite recuperação a 70% apenas da quantidade de anticorpo aplicado. Isto significa que a SEC irá resultar de um modo inevitável na perda de material enquanto necessita de mais tempo. A coluna de Q-Sepharose foi reciclada para utilização adicional através de eluição separada em NaCl a 2M e equilíbrio adicional como descrito acima. 3. Purificação de proteína A e Sepharose Q com subsequente passo de troca catiónica 32

Numa experiência adicional, foi utilizado o anticorpo da exp. 2.2. purificado num modo de não-ligação através de troca aniónica em Q-Sepharose. Em vez de testar um passo final de purificação SEC, adicional, o anticorpo recolhido no fluxo da coluna de Sepharose Q foi sujeito a um segundo passo de permutador catiónico com uma matriz SP-Sepharose FF (SP=Sulfopropilo-) da Amersham-Biosciences. A SP-Sepharose FF permitiu uma velocidade de fluxo de 100 cm/h com um rendimento reprodutível de anticorpo a 93% após aplicação, lavagem e eluição do anticorpo a partir do permutador catiónico.

Para aplicação, o pH da solução de anticorpo obtida após o passo de purificação com Sepharose Q foi ajustado até pH 4,5-5,0 com tampão acetato a 50 mM pH 4,5. A capacidade de aplicação foi colocada com material de matriz a 10 mg/ml a uma condutividade de aplicação de 17 mS/cm. O tampão acetato a 50 mM foi utilizado adicionalmente para lavagem até linha de base. Foi utilizado um tampão com alto teor de sal de acetato de Na a 50 mM pH 4,5, NaCl a 1 M para eluição de anticorpo; o anticorpo monomérico eluiu primeiro, enquanto os agregados costumavam eluir nas fracções a jusante a força iónica elevada. A utilização de um gradiente salino menos abrupto através de implementação de um gradiente salino no tampão de eluição antes de se bombear na coluna é igualmente exequível; a aplicação directa de um tampão com elevado teor em sal resulta em anticorpo menos diluído e de um modo consequente amostragem mais precisa e tempos de permanência mais curtos na solução acídica. Após eluição, o tampão acídico foi alterado de um modo rápido para PBS pH 7,5. O nível de proteína A contaminante no eluato acumulado foi determinado com < 0,4 ng/mg de anticorpo, verificou-se que anticorpo era monomérico em > 99% através de HPLC de exclusão molecular. 33 4. Cromatografia de afinidade em Proteína Ά Streamline™ com proteína A ligada em múltiplos pontos, feita por medida

Esta matriz de afinidade de proteína A Streamline™ ligada em múltiplos pontos foi feita por medida e fornecida pela Pharmacia Biotech (agora Amersham-Pharmacia). Foi produzida pelo fabricante através de acoplamento da mesma proteína A recombinante do tipo Streamline™ de 34 kD contendo um resíduo Cis terminal ao mesmo material de matriz Sepharose, mas utilizou química de CNBr tradicional para activação e acoplamento em vez de activação mediada por epóxido e condições de reacção selectivas apenas para acoplamento de grupos -SH (ver informação de produto do fabricante). 0 método de exp. 2.1 foi repetido e o nível de proteína A contaminante foi determinado com 353 ng/mg de anticorpo. Isto significa que a forma de acoplamento contribui de um modo parcial para perda de proteína aumentada a partir de matrizes de afinidade de proteína A recombinante de elevada capacidade, ligada em ponto único; as modificações na sequência de aminoácidos introduzidas em tal proteína A recombinante quando comparadas com a proteína A selvagem de comprimento total contribuem, também, de um modo considerável para perda aumentada de proteína. 5. Comparação paralela de métodos: Comparação com Método de Miles (US4,983,722)

A Patente de Miles (N°: 4,983,722) reivindica que a ligação a DEAE Sepharose utilizada como um segundo passo de cromatografia com um gradiente salino (NaCl a 0,025 M até 0,25 M) para eluição pode reduzir o conteúdo em Proteína A 34 lavada no eluato para menos do que 15ng/mg de anticorpo (o intervalo de proteína A era 0,9 até 14 ng/mg de anticorpo).

Tabela 2:

Comparação de resíduos de Proteína A em amostras de eluato de Anticorpo 6A1 purificado em matrizes de afinidade de Proteína A ligadas em múltiplo e único ponto Matriz Amostra Níveis de Proteína A (ng/mg) rProtein A Sepharose (ligação em ponto único) Eluato de proteína A 20,2 rmp Protein A Sepharose (ligação em múltiplos pontos) Eluato de proteína A 2,16 Native Protein A Sepharose (ligação em múltiplos pontos) Eluato de proteína A < 2,0 O objectivo destas experiências foi confirmar estes resultados utilizando MabSelect (nova matriz de rProteína A ligada em ponto único) com um anticorpo de menor pi (pi 6,5-7,5), e comparar de um modo directo o método de não-ligação a Q-Sepharose (utilizando diferentes tampões de equilíbrio/aplicação) com o método da Patente Miles. Método aplicado: A purificação de anticorpo 6A1 (pi 6,5 - 7,5) incluiu dois passos de cromatografia que consistem no passo de Proteína A MabSelect seguido de cromatografia de troca aniónica em Q-Sepharose (não-ligação) , ou passo de cromatografia em DEAE Sepharose (ligação). Ver LO 9007 e LO 9375. 35

Cromatografia em Proteína Ά MabSelect

Matriz em coluna Proteína A recombinante MabSelect (rPA ligada em ponto único) Dimensões de coluna diâmetro interno de 1,6 cm x altura de fundo de 15 cm Volume de coluna 30 mL Velocidade de fluxo 500 cm/hr (16,80mL/min) operacional Limpeza guanidina HCl a 6M (2 volumes de coluna) Capacidade de aplicação matriz de 35 mg/ml Equilíbrio glicina/glicinato a 50 mM pH 8,0/ NaCl a 250 mM (8 volumes de coluna) Lavagem pós-aplicação glicina/glicinato a 50 mM pH 8,0/ NaCl a 250 mM (8 volumes de coluna) Tampão de eluição glicina a lOOmM pH 3,50 (6 volumes de coluna) Lavagem Ácido cítrico a lOOmM pH 2,1 (2 volumes de coluna) 0 sobrenadante de cultura contendo anticorpo 6A1 foi purificado numa coluna MabSelect (30ml), ligada a um sistema AKTA FPLC. As condições utilizadas foram como descrito na tabela acima. 0 anticorpo foi eluído utilizando glicina a 0,1M pH 3,5. Após eluição o pH do eluato foi ajustado até pH 7,0, e depois a amostra de eluato foi dividida em 5 alíquotas; cada alíquota foi depois 36 diafiltrada num tampão diferente para cromatografia de troca aniónica. A primeira aliquota foi diafiltrada em TrisHCl a 50mM pH 8/ NaCl a 75 mM para a corrida 1 de cromatografia em Q-Sepharose. A segunda aliquota foi diafiltrada em TrisHCl a 50mM pH8/ NaCl a 100 mM para a Corrida 2 de cromatografia em Q-Sepharose. A terceira aliquota foi diafiltrada em fosfato de sódio a 20mM pH 6,5/ NaCl a 80 mM para a Corrida 3 de cromatografia em Q-Sepharose. As aliquotas quatro e cinco foram alteradas com tampão em Tris HC1 a 25 mM pH 8,0/ NaCl a 25 mM para avaliação de método de ligação a DEAE Sepharose descrito na patente Miles. A diferença entre Corridas 4 & 5 é que na Corrida 4 o pico principal foi recolhido como uma fracção e diafiltrado em tampão fosfato salino padrão antes da análise enquanto que na Corrida 5, o pico de eluição foi fraccionado e sujeito a diálise num tampão fosfato preparado como descrito na Patente Miles.

As condições para cada uma das cinco corridas de colunas estão descritas abaixo:

Cromatografia em Q-Sepharose: Corrida 1

Matriz em coluna Q-Sepharose Fast Flow

Dimensões de coluna diâmetro interno de 1,6 cm x altura de fundo de 8 cm

Volume de coluna Preparação de coluna Velocidade de fluxo operacional Limpeza

16 mL

Empacotada em Hidróxido de sódio a 0,1 M a 150 cm/hr 100 cm/hr (3,35mL/min)

Hidróxido de Sódio a 0,1M (2 volumes de coluna) 37 (continuação)

Cromatografia em Q-Sepharose: Corrida 1

Capacidade de aplicação Equilíbrio Lavagem pós-aplicação Tampão de lavagem Lavagem matriz de 15 mg/ml

TrisHCl a 50mM pH 8,0/ NaCl a 75mM (8 volumes de coluna) TrisHCl a 50mM pH 8,0/ NaCl a 75mM (5 volumes de coluna) Cloreto de Sódio a 2 M (2 volumes de coluna)

Hidróxido de Sódio a 0,1M (2 volumes de coluna)

Cromatografia em Q-Sepharose: Corrida 2

Matriz em coluna Dimensões de coluna Volume de coluna Preparação de coluna Velocidade de fluxo operacional Limpeza Capacidade de aplicação Equilíbrio Lavagem pós-aplicação Tampão de lavagem Lavagem

Q-Sepharose Fast Flow diâmetro interno de 1,6 cm x altura de fundo de 8 cm 16 mL

Empacotada em Hidróxido de sódio a 0,1 M a 150 cm/hr 100 cm/hr (3,35mL/min)

Hidróxido de Sódio a 0,1M (2 volumes de coluna) matriz de 7,5 mg/ml TrisHCl a 50mM pH 8,0/ NaCl a lOOmM (8 volumes de coluna) TrisHCl a 50mM pH 8,0/ NaCl a lOOmM (5 volumes de coluna) Cloreto de Sódio a 2 M (2 volumes de coluna)

Hidróxido de Sódio a 0,1M (2 volumes de coluna) 38

Cromatografia em Q-Sepharose: Corrida 3

Matriz em coluna Q-Sepharose Fast Flow Dimensões de Diâmetro interno de 1,6 cm x altura coluna de fundo de 8 cm Volume de coluna 16 mL Preparação de Empacotada em Hidróxido de sódio a coluna 0,1 M a 150 cm/hr Velocidade de 100 cm/hr (3,35mL/min) fluxo operacional Limpeza Hidróxido de Sódio a 0,1M (2 volumes de coluna) Capacidade de matriz de 7,5 mg/ml aplicação Equilíbrio Fosfato de sódio a 20mM pH 6,5/ NaCl a 80mM Lavagem pós- Fosfato de sódio a 20mM pH 6,5/ NaCl aplicação a 80mM (5 volumes de coluna) Tampão de lavagem Cloreto de Sódio a 2 M (2 volumes de coluna) Lavagem Hidróxido de Sódio a 0,1M (2 volumes de coluna) 39 DEAE Sepharose: Corrida 4

Matriz em coluna DEAE Sepharose Dimensões de coluna Diâmetro interno de 1,6 cm x altura de fundo de 8 cm Volume de coluna 16 mL Preparação de coluna Empacotada em tampão de equilíbrio a 150 cm/hr Velocidade de fluxo 100 cm/hr (3,35mL/min) operacional

Limpeza Hidróxido de Sódio a 0,1M (2 volumes de coluna) Capacidade de matriz de 7,5 mg/ml aplicação Equilíbrio Fosfato de sódio a 25mM pH 8,6/ NaCl a 25mM (8 volumes de coluna) Lavagem pós- TrisHCl a 25mM pH 8,6/ NaCl a aplicação 25mM (5 volumes de coluna) Tampão de eluição TrisHCl a 25 mM pH 8,6/ NaCl a 25mM até TrisHCl a 25mM pH 8,6/ NaCl a 250mM (10 volumes de coluna) Limpeza Cloreto de Sódio a 2M (2 volumes de coluna) 40 Método de ligação DEAE Sepharose: Corrida 5 (Método de Miles)

Matriz em coluna DEAE Sepharose

Dimensões de coluna Diâmetro interno de 1,6 cm x altura de fundo de 8 cm

Volume de coluna Preparação de coluna Velocidade de fluxo operacional Limpeza Capacidade de aplicação 16 mL Empacotada em tampão equilíbrio a 150 cm/hr 100 cm/hr (3,35mL/min) Hidróxido de Sódio a 0,1M volumes de coluna) matriz de 7,5 mg/ml de (2

Equilíbrio

Lavagem pós-aplicação

Tampão de eluição

Lavagem

TrisHCl a 25mM pH 8,6/ NaCl a 25mM (8 volumes de coluna) TrisHCl a 25mM pH 8,6/ NaCl a 25mM (5 volumes de coluna) TrisHCl a 25 mM pH 8,6/ NaCl a 25mM até TrisHCl a 25mM pH 8,6/ NaCl a 250mM (10 volumes de coluna) Cloreto de Sódio a 2M (2 volumes de coluna)

As propriedades dos diferentes tampões utilizados neste estudo estão apresentadas na Tabela 3. Os perfis de eluição para cada uma das corridas de cromatografia de troca aniónica estão apresentados nas Figuras 2-5. 41

As amostras de eluato geradas a partir das 5 corridas de troca iónica foram sujeitas a ensaio quanto a níveis de Proteína A no ELISA de rPA. Os resultados estão apresentados na Tabela 4.

Tabela 3:

Tampões utilizados neste estudo Tampão de equilíbrio Número de corrida Condutividade (mS/cm) Resina PH TrisHCl a 50mM pH 8,0/ NaCl a 75 mM 1 10,74 Q-Sepharose (não- ligação) 8,00 TrisHCl a 50mM pH 8,0/ NaCl a 100 mM 2 12,85 Q-Sepharose (não- ligação) 8,01 Fosfato de sódio a 20mM pH 6,5/ NaCl a 80mM 3 10,20 Q-Sepharose (não- ligação) 6,50 TrisHCl a 50mM pH 8,6/ NaCl a 25 mM 4/5 3,35 DEAE- Sepharose (ligação) 8, 60 TrisHCl a 25mM pH 8,6/ NaCl a 250 mM 4/5 24,54 DEAE- Sepharose (ligação) 8, 61 * Tampão de eluição de gradiente

As fracções ao longo do perfil de eluição de Corrida 5 em DEAE-Sepharose (método de Miles) foram recolhidas e 42 analisadas no ELISA de rProteína A; os resultados estão apresentados na Tabela 5.

Tabela 4: Resultados de ELISA de rProteína A ID de amostra Niveis de rProteína A (ng/mg) Concentração de anticorpo (mg/ml) % de Recuperação Volumes de Eluição (CV's)* Eluato de Q Sepharose Corrida 1 < 0,4 1, 42 82 4,5 Eluato de Q Sepharose Corrida 2 2,94 1,49 70 3,5 Eluato de Q Sepharose Corrida 3 0,73 1,86 85 3,4 Acumulado de eluato de DEAE Sepharose Corrida 4 (acumulado de todas as fracções) 1,72 2,16 75 2,5 Acumulado de eluato de DEAE Sepharose (Método de Miles) Corrida 5 (acumulado de fracções 2 a 6) 1,55 1, 83 73 3 *Onde CV's indica volumes de coluna 43

Tabela 5: Níveis de rProteína A em fracções de Eluato ao longo do pico de eluição obtido durante a separação de ligação a DEAE-Sefarose (Método de Miles); Corrida 5 Número de Fracção Níveis de rProteína A (ng/mg) Absorvância (A2so) 1 3, 33 0, 018 2 0,4 0,108 3 0,4 0,22 4 0,4 0,169 5 2,01 0,092 6 16,7 0,042 7 6,38 0, 016 A recuperação mais elevada (85%) e melhor libertação de rProteína A para este anticorpo (6A1; pi 6,5 - 7,5) foi obtida sob condições de não-ligação em Q-Sepharose utilizando tampão fosfato de sódio a 20 mM pH 6,5/NaCl a 80 mM (que corresponde à Corrida 3) . A Corrida 1 também apresentou boa recuperação (82%) e libertação de rProteína A contudo, o volume de eluição para esta corrida foi significativamente mais elevado do que o esperado para um método de não-ligação; sugerindo atraso parcial do anticorpo na coluna neste sistema tampão. O aumento da concentração de NaCl (Corrida 2) resultou em libertação menor de rProteína A, daí o sistema de tampão utilizado na Corrida 3 ter sido mais apropriado para este anticorpo. Foi nossa observação prévia que o sistema de tampão utilizado na Corrida 1 é mais apropriado para anticorpos com pi elevado e que aquele utilizado na Corrida 3 é útil de um modo particular para anticorpos neutros ou ligeiramente acídicos. Estas experiências foram realizadas a capacidades 44 semelhantes (resina a 7,5 mg/ml) nós esperaríamos ser capazes de utilizar este método de não-ligação a capacidades muito mais elevadas (> 30 mg/ml). Nós esperaríamos que este método de não-ligação fosse aplicável a muitos permutadores aniónicos por exemplo Q-Hyper D em adição a adsorventes de membrana de troca aniónica (tais como Mustang Q, Intercept Q e Sartobind Q) . Nós esperaríamos que este processo fosse mais aplicável a produção em larga escalar comparado com o método de Miles na medida em que seriam aplicadas elevadas capacidades etc.

No caso de Corrida 5 (método de Miles) , foi observado fraccionamento de rProteína A ao longo do pico de eluição principal como apresentado na tabela 5. É portanto necessária acumulação cuidada de fracções para assegurar boa libertação de rProteína A. Isto tem um impacto na recuperação (73%) e mesmo neste caso não originou libertação tão boa como aquela obtida com o método de não-ligação. Portanto para o método de Miles é mais difícil atingir boa libertação e elevada recuperação para linhas celulares/anticorpos nos casos onde é observada fuga mais elevada (tal como aquele obtida de um modo comum com matrizes ligadas em ponto único).

Os dados da Corrida 5 são representativos das condições descritas na patente de Miles.

Uma visão geral de comparações de métodos e os dados obtidos é apresentada na Tabela 6, abaixo. 45

Tabela 6

Sumário de Níveis de rProteína A a Diferentes Fases de Purificação de

Anticorpo. NSO acc. para o Ex.5

Sobrenadante de Cultura

Ligação Não-ligação Não-ligação * Todos os exemplos foram levados a cabo com aplicação de trocas a 7,5 mg/ml ou capacidade de aplicação a 15mg/ml:

Concentração e diafiltração (TrisHCl a 50mM/ NaCl a 75 mM pH 8,00) &

Troca Aniónica Q (< 0,4) (TrisHCl a 50mM/ NaCl a 75 mM pH 8,00) 46

Nota: Os níveis de rProteína A estão apresentados em ng/mg entre parêntesis rectos; note-se que nem todos os sobrenadantes de linhas celulares NSO clonais originam níveis semelhantes de contaminação de proteína A. 6. Purificação de um Anticorpo de pi elevado

Um anticorpo de pi elevado (pi 9,0-9,3) foi purificado utilizando Cromatografia de Afinidade em Proteína A (MabSelect - matriz de Proteína A recombinante ligada em ponto único), seguida de cromatografia de troca aniónica em Q-Sepharose (sob condições de não-ligação; para remoção de contaminantes vestigiais) seguida de cromatografia de troca catiónica em SP-Sepharose (sob condições de ligação para remoção de agregados). 47

Anticorpo X (pi > 8,00) ▼

Proteína A Mab Select

Concentração/ Diafiltração ▼

Cromatografia em Q-Sepharose ▼

Concentração/ Diafiltração ▼

Cromatografia em SP-Sepharose Materiais e Métodos Experimentais

Cromatografia em Proteína Ά MabSelect

Mab ponto cm x

Matriz em coluna Proteína A recombinante

Select (rPA ligada em único)

Dimensões de coluna diâmetro interno de 1,6 altura de fundo de 15 cm 48 (continuação)

Cromatografia em Proteína Ά MabSelect

Volume de coluna Velocidade de fluxo operacional Limpeza Capacidade de aplicação Equilíbrio

Lavagem pós-aplicação Tampão de eluição

Lavagem

30 mL 500 cm/hr (16,80mL/min) guanidina HC1 a 6M (2 volumes de coluna) matriz de 35 mg/ml glicina/glicinato a 50mM pH 8,0/ NaCl a 250mM (8 volumes de coluna) glicina/glicinato a 50mM pH 8,0/ NaCl a 250mM (8 volumes de coluna) glicina a lOOmM pH 3,50 (6 volumes de coluna) Ácido cítrico a lOOmM pH 2,1 (2 volumes de coluna) O sobrenadante de cultura contendo anticorpo de pi elevado foi purificado numa coluna de Afinidade de Proteína A MabSelect (30ml) ligada a um sistema AKTA FPLC. As condições utilizadas foram como descrito na tabela abaixo. O anticorpo foi eluído utilizando glicina a 0,1M pH 3,5. A seguir à eluição, o eluato foi mantido a pH 3,69 (não foi necessário ajuste) durante 60 min (passo de inactivação de vírus a pH baixo), e depois neutralizado até pH 8 utilizando Tris Base a 2 M. Foram realizados três ciclos em Proteína A; a recuperação de produto foi determinada através de A280nm e é apresentada na Tabela 7 para cada ciclo. 49

Tabela 7: % de Recuperação em Coluna de Proteína A Mab

Select Número de Ciclo % de Recuperação 1 81 2 81 3 80

Após cromatografia em Proteína A MabSelect os eluatos de cada um dos três ciclos foram acumulados juntos e alterado o tampão em Tris a 25mM pH 8,0 (tampão de equilíbrio de Q-Sepharose) utilizando um concentrador celular em agitação Amicon equipado com membrana Millipore de 10kDa.

Cromatografia em Q-Sepharose

Matriz em coluna Q-Sepharose Fast Flow Dimensões de coluna diâmetro interno de 1,6 cm x altura de fundo de 15 cm Volume de coluna 30 mL Preparação de coluna Empacotamento em Hidróxido de Sódio a 0,1 M a 225 cm/hr Velocidade de fluxo operacional 150 cm/hr (5,0 mL/rnin) Limpeza Hidróxido de Sódio a 0,1M (2 volumes de coluna) Capacidade de aplicação matriz de 40 mg/ml Equilíbrio Tris a 20mM pH 8,0 (8 volumes de coluna) Lavagem pós-aplicação Tris a 20mM pH 8,0 (5 volumes de coluna) 50 (continuação)

Cromatografia em Q-Sepharose

Tampão de lavagem Tris a 20mM pH 8,0/ NaCl a 2M (2 volumes de coluna)

Lavagem Hidróxido de Sódio a 0,1 M (2 volumes de coluna)

Foram aplicados 40ml de eluato de Proteina A MabSelect concentrado/diafiltrado numa coluna de Q-Sepharose a uma capacidade de aplicação de matriz a 40mg/ml. A coluna foi operada num modo de não-ligação e a fracção não ligada contendo o anticorpo foi recolhida. A recuperação neste passo foi 69% através de A28o- Esta é ligeiramente menor do que a obtida sob estas condições para este anticorpo e pode ser devida a estimativa não precisa do volume de aplicação devido a retenção do volume na bomba de amostra FPLC. A seguir à cromatografia em Q-Sepharose, a fracção não ligada foi concentrada até 13,98 mg/ml e diafiltrada em tampão de equilíbrio SP-Sepharose (Acetato de sódio a 25mM pH 5,0/ NaCl a 25mM) utilizando um agitador celular Amicon equipado com membrana Millipore Ultrafilteration de 10 kDa.

Cromatografia em SP-Sepharose

Matriz em coluna Q-Sepharose Fast Flow

Dimensões de coluna diâmetro interno de 1,6 cm x altura de fundo de 15 cm

Volume de coluna 30 mL

Preparação de coluna Empacotada em Hidróxido de Sódio a 0,1 M a 150 cm/hr

Velocidade de fluxo 100 cm/hr (3,35 mL/min) operacional 51 (continuação)

Cromatografia em SP-Sepharose

Limpeza Capacidade de aplicação Equilíbrio Lavagem pós- aplicação Eluição

Tampão de lavagem

Lavagem

Hidróxido de Sódio a 0,1M (2 volumes de coluna) matriz de 10 mg/ml Acetato de sódio a 25mM pH 5,00/ NaCl a 25mM (8 volumes de coluna) Acetato de sódio a 25mM pH 5,00/ NaCl a 25mM (6 volumes de coluna) Acetato de sódio a 25mM pH 5,00/ NaCl a 186mM (25 volumes de coluna) Acetato de sódio a 25mM pH 5,00/ NaCl a 2 M (2 volumes de coluna) Hidróxido de Sódio a 0,1 M (2 volumes de coluna)

Foram aplicados 24ml de eluato de Q-Sepharose alterado com tampão numa coluna de SP-Sepharose a uma capacidade de aplicação de matriz a lOmg/ml. A coluna foi operada num modo de ligação; o eluato foi recolhido como fracções. As fracções ao longo do perfil de eluição foram analisadas através de GP-HPLC para determinar resultados de níveis de agregados e estão apresentadas na Tabela 8. As amostras a seguir a cada passo de cromatografia foram recolhidas e analisadas quanto a resíduos de rProteína A, os resultados estão apresentados na Tabela 9. 52

Tabela 8: Resultados de ELISA de rProteina A após cada passo de cromatografia ID de amostra Níveis A de rProteina (ng/mg) Concentração de anticorpo (mg/ml) Eluato de Proteína A MabSelect (após conc/diaf) 2, 64 46,7 Eluato de Q-Sepharose < 4 8,10 Acumulado de eluato de SP-Sepharose F(1-16) < 4 1,79

Tabela 9: Análise por GP-HPLC de fracções de SP-Sepharose ID de amostra % de Agregados Absorvância (A28o) Acumulado de eluato de SP F (1-3) 0,57 11,2 Acumulado de eluato de SP F (4-6) O «—1 «—1 2,7 Acumulado de eluato de SP F (7-9) 2,07 0, 655 Acumulado de eluato de SP F (10-12) 2,12 0,351 Acumulado de eluato de SP F (13-15) 2,56 0,208

Conclusão: 0 fraccionamento de agregados foi observado durante o passo de eluição do pico de anticorpo; ver Tabela 4. Com as fracções enriquecidas em agregados sendo eluidas depois (na extremidada a jusante do pico de eluição) quando comparadas com fracções não contendo agregados. As fracções a jusante podem ser omitidas a partir do acumulado principal para obter acumulado monomérico a 99% e ter ainda elevada recuperação (> 95%). 53

Tabela 4 Fraccionamento de agregados ao longo do pico de eluição de SP-Sepharose para anticorpo de pi elevado

Lisboa, 23 de Agosto de 2007

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Método de purificar um anticorpo que compreende os passos de a. purificar um anticorpo através de cromatografia de afinidade em proteína A, b. aplicar o anticorpo purificado que compreende um contaminante de proteína A, em que o referido contaminante de proteína A é obtido após eluição do anticorpo ligado a partir da coluna de cromatografia de afinidade em proteína A, num material de troca aniónica sob condições que permitem a ligação da proteína A e cujas condições resultam na retenção do anticorpo no fluxo enquanto o contaminante de proteína A está ligado e desse modo é removido pelo anticorpo, e c. recolhendo pelo menos 70% da quantidade de anticorpo aplicado no material de troca aniónica no fluxo do permutador iónico enquanto a proteína A contaminante está ligada ao material de troca iónica.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado no sentido em que o método compreende, após o primeiro passo de permutador aniónico, o passo de purificação adicional do referido anticorpo, permitindo de um modo preferido a remoção de anticorpo agregado.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado no sentido em que o método compreende o passo de purificar adicionalmente o referido anticorpo através de remoção do anticorpo agregado. 2

4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado no sentido em que a proteína A é uma proteína A que compreende pelo menos parte de um domínio funcional de ligação a IgG de proteína A selvagem seleccionado a partir dos domínios naturais E, D, A, B, C ou as suas muteínas modificadas os quais mantiveram a funcionalidade de ligação a IgG, e em que a referida proteína A é caracterizada por uma constante de ligação de pelo menos K = 10“1 M para a porção Fc da IgGl humana ou IgG2a de rato.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado no sentido em que a proteína A é uma proteína A recombinante que compreende uma cisteína nos últimos 30 aminoácidos do C-terminal da sequência de aminoácidos da referida proteína A recombinante e está acoplada ao material de suporte cromatográfico através do átomo de enxofre do referido resíduo de cisteína através de uma ligação tioéter como o único ponto de ligação.

6. Método de acordo com uma das reivindicações anteriores, caracterizado no sentido em que a proteína A ou o contaminante de proteína A está reduzida a uma concentração de IgG a < lng/mg no fluxo do permutador iónico.

7. Método de acordo com uma das reivindicações anteriores, caracterizado no sentido em que o anticorpo tem um pi de pelo menos 6,5 ou acima. 1 Método de acordo com uma das reivindicações anteriores, caracterizado no sentido em que o anticorpo é um anticorpo monoclonal, de um modo preferido um anticorpo 3 IgG em que o anticorpo IgG pode ser quimérico ou anticorpo IgG enxertado com CDR.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado no sentido em que o anticorpo IgG está pelo menos naquelas porções do anticorpo que são relevantes para a ligação a uma proteina A, de um modo preferido na sua porção Fc que é relevante para a ligação à proteina A, de um modo mais preferido na região de interface Cy2-Cy3 de IgG que compreende os locais de ligação para a proteina A, de tal origem de espécies e subclasse de IgG cuja origem permite uma ligação de elevada afinidade para proteina A.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado no sentido em que o anticorpo IgG é seleccionado a partir do grupo que consiste em IgGl, IgG2 e IgG4 humana no que respeita à porção Fc do anticorpo.

11. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado no sentido em que o anticorpo é recolhido a partir de uma cultura celular antes de purificar o anticorpo através de cromatografia de afinidade em proteina A.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado no sentido em que o anticorpo é recolhido a partir de uma cultura celular de mamífero.

13. Método de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracterizado no sentido em que o anticorpo que deve ser purificado através de meios de cromatografia de afinidade em proteína A não é tratado de forma a inactivar proteases, de um modo preferido não se 4 encontra numa mistura com pelo menos com um inibidor de protease.

14. Método de purificar um anticorpo que compreende os passos de: a. Purificar um anticorpo através de meios de cromatografia de afinidade de proteína A, b. aplicar o anticorpo purificado que compreende um contaminante de proteína A, em que o referido contaminante de proteina A é obtido após eluição do anticorpo ligado a partir da referida coluna de cromatografia de afinidade em proteína A, num primeiro material de troca aniónica sob condições que permitem a ligação da proteína A e cujas condições resultam na retenção do anticorpo no fluxo enquanto o contaminante de proteína A está ligado e assim removido do anticorpo, c. Recolha do anticorpo aplicado no material de troca aniónica no fluxo do permutador iónico enquanto a proteína A contaminante está ligada ao material de troca iónica, d. E purificação adicional do anticorpo através de aplicação em, ligação a e eluição deste a partir de um segundo permutador iónico.

15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado no sentido em que pelo menos 70% da quantidade de anticorpo aplicada no primeiro material de troca aniónica são recuperados no fluxo. 5

16. Método de acordo com uma reivindicação 15, caracterizado no sentido em que o anticorpo tem uma quantidade em μΐ de pelo menos 7,5 ou acima.

17. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado no sentido em que o segundo permutador iónico é um permutador catiónico.

18. Método de acordo com as reivindicações 14 ou 17, caracterizado no sentido em que o anticorpo purificado é anticorpo monomérico e que o passo de segunda troca iónica permite a remoção do anticorpo agregado.

19. Método de acordo com uma das reivindicações anteriores, em que o anticorpo é um anticorpo IgG. Lisboa, 23 de Agosto de 2007