PT2908626T

PT2908626T - Animais com il-15 humanizada

Info

Publication number: PT2908626T
Application number: PT147904528T
Authority: PT
Inventors: F Rojas Jose; Venus Lai Ka-Man; J Murphy Andrew
Original assignee: Regeneron Pharma
Priority date: 2013-10-15
Filing date: 2014-10-15
Publication date: 2017-01-09
Also published as: AU2014337526B2; AU2014337526A1; CN105744829B; AU2020286186A1; MX2016004781A; SMT201700024B; RS55472B1; AU2020286186B2; TR201904342T4; RS58465B1; CA2926090C; SG10201607768YA; HRP20190542T1; CN109090037A; SG11201601828XA; PL2908626T3; HUE033272T2; DK2908626T3; US20230189772A1; US20200178508A1

Description

"Animais com il-15 humanizada"

CAMPO

Animais não humanos compreendendo, na sua linhagem germinativa, um locus da IL-15 não humana endógena humanizada. Animais não humanos compreendendo, na sua linhagem germinativa, uma sequência codificante da IL-15 humanizada sob o controlo de elementos reguladores não humanos endógenos. Animais não humanos (por exemplo, mamíferos, por exemplo, roedores, tais como ratinhos, ratos e hamsters) que compreendem uma modificação genética compreendendo uma substituição, e um locus endógeno, de uma sequência génica da IL-15 não humana por uma sequência génica da IL-15 humana ou humanizada. Roedores e outros animais não humanos que expressam a IL-15 humana ou humanizada a partir de um locus da IL-15 não humana endógena modificada. Animais não humanos que expressam a IL-15 humana ou humanizada sob o controlo de um promotor e/ou sequências reguladoras da IL-15 não humana.

FUNDAMENTOS

Ratinhos transgénicos com transgenes inseridos aleatoriamente que contêm uma sequência da IL-15 humana são conhecidos na técnica. No entanto, os ratinhos transgénicos que expressam a IL-15 humana a partir de transgenes integrados aleatoriamente não são ideais em um ou outro aspeto. Por exemplo, a maioria dos ratinhos transgénicos para a IL-15 humana exibem níveis e/ou razões anormais de certas células, incluindo linfócitos (por exemplo, células T), que são provavelmente devido a uma desregulação da função das células imunes. Esses ratinhos também exibem uma panóplia de patologias, presumivelmente devido, finalmente, à desregulação da IL-15 transgénica. Essa desregulação pode resultar, por exemplo, da ausência de elementos de controlo endógenos, e/ou da colocação da sequência da IL-15 humana longe do locus da IL-15 endógena.

Permanece uma necessidade na técnica de animais não humanos que compreendam sequências codificantes da IL-15 humana, em que as sequências codificantes da IL-15 humana estão num locus da IL-15 não humana endógena, e/ou estão sob o controlo regulador de elementos da IL-15 não humana endógena (por exemplo, regiões não codificantes a montante e/ou a jusante). Há uma necessidade na técnica de animais não humanos que expressem a IL-15 humana sob o controlo de elementos reguladores não humanos endógenos. Há uma necessidade na técnica de animais não humanos que expressem a IL-15 humana de uma forma que seja fisiologicamente relevante no animal não humano. Há uma necessidade na técnica de animais não humanos que expressem uma IL-15 humana, em que os animais não humanos careçam de uma anormalidade significativa nas populações de linfócitos, por exemplo, populações de células T. Há também uma necessidade na técnica de animais não humanos que expressem IL-15 humana ou humanizada, e a falta de uma ou mais das patologias exibidas por animais não humanos que sejam transgénicos para a IL-15 humana. Ohta et al (J. Immunol, 169: pp 460-468 (2002) descreve células T CD8+NK1.1+ do tipo Thl resistentes à morte celular induzida por ativação dependente da IL-15 para o desenvolvimento de uma pequena inflamação intestinal. Marks-Konczalik et al (PNAS, 97: pp 11445-11450 (2000)) descreve que a morte celular induzida por ativação induzida pela IL-2 é inibida em ratinhos transgénicos para a IL-15. W001/58914 descreve haplótipos do gene da IL-5. Fehniger et al (Blood Cells, Molecules and Diseases, 27: pp 223-230 (2001)) descreve a leucemia fatal em ratinhos trangénicos para a interleucina-15. W02003/063556 descreve a IL-6 e o recetor da IL-6 humanizados. Devoy et al (Nat. Rev. Genetics, 13: pp 14-20 (2012)) descreve ratinhos genomicamente humanizados. Steel et al (Trends in Pharmacological Sciences, 33: pp 35-41 (2011)) descreve a biologia da IL-15 e implicações terapêuticas no cancro.

SUMÁRIO A invenção fornece um ratinho geneticamente modificado, cujo genoma compreende uma substituição num locus da IL-15 endógena de ratinho, de um fragmento genómico de ratinho que codifica um polipeptideo de IL-15 madura de ratinho, por um segmento genómico humano que codifica um polipeptideo de IL-15 madura humana, em que os éxons da IL-15 humana no referido segmentos genómico humano consistem nos éxons 3, 4, 5 e 6 codificantes da proteína IL-15 humana para formar um gene da IL-15 humanizada, em que os éxons da IL-15 são numerados com o primeiro éxon codificante como éxon 1, e em que o gene da IL-15 humanizada está sob o controlo de todos os elementos reguladores a montante da IL-15 endógena de ratinho no locus da IL-15 endógena de ratinho. A invenção fornece ainda um método de produção de um ratinho geneticamente modificado que compreende a modificação do genoma de um ratinho através da substituição de um fragmento genómico de ratinho que codifica um polipeptideo de IL-15 madura de ratinho, no locus da IL-15 endógena de ratinho, por um segmento genómico humano que codifica um polipeptideo de IL-15 humana madura, em que os éxons da IL-15 humana no referido segmento genómico humano consistem nos éxons 3, 4, 5 e 6 codificantes da proteína IL-15 humana para formar um gene da IL-15 humanizada, em que os éxons da IL-15 são numerados com o primeiro éxon codificante como éxon 1, e em que o gene da IL-15 humanizada está sob o controlo de todos os elementos reguladores a montante da IL-15 endógena de ratinho no locus da IL-15 endógena de ratinho. A invenção fornece adicionalmente um ratinho geneticamente modificado, cujo genoma compreende um gene da IL-15 humanizada, em que o referido gene da IL-15 humanizada compreende os éxons 1 e 2 codificantes da proteína IL-15 de ratinho e um segmento genómico humano, em que os éxons da IL-15 humana no referido segmento genómico humano consistem nos éxons 3, 4, 5 e 6 codificantes da proteína IL-15 humana, em que os éxons da IL-15 são numerados com 0 primeiro éxon codificante como éxon 1, e em que o gene da IL-15 humanizada está sob o controlo de todos os elementos reguladores a montante da IL-15 de ratinho de um locus da IL-15 endógena de ratinho, e o referido gene da IL-15 humanizada codifica uma proteína que compreende uma sequência polipeptídica de IL-15 humana madura. A invenção também fornece um método de produção de um ratinho geneticamente modificado, compreendendo a introdução, no genoma de um ratinho, de um gene da IL-15 humanizada que compreende os éxons 1 e 2 codificantes da proteína IL-15 de ratinho e um segmento genómico humano, em que os éxons da IL-15 humana no referido segmento genómico humano consistem nos éxons 3, 4, 5 e 6 codificantes da proteína IL-15 humana, em que os éxons da IL-15 são numerados com o primeiro éxon codificante como éxon 1, e em que o gene da IL-15 humanizada está sob o controlo de todos os elementos reguladores a montante da IL-15 de ratinho de um locus da IL-15 endógena de ratinho, e o referido gene da IL-15 humanizada codifica uma proteína que compreende uma sequência polipeptídica de IL-15 humana madura. São descritos organismos não humanos geneticamente modificados que compreendem um locus da IL-15 humanizada. São descritos organismos não humanos que compreendem um gene da IL-15 humanizada, em que o gene da IL-15 humanizada está sob o controlo de um ou mais elementos reguladores endógenos não humanos. São descritos organismos não humanos que compreendem um gene da IL-15 humanizada em um locus da IL-15 endógena não humana. São descritos organismos não humanos que compreendem um locus da IL-15 endógena humanizada que seja capaz de ser passado através da linhagem germinativa dos organismos. São descritos animais não humanos, por exemplo, mamíferos (por exemplo, roedores, por exemplo, ratinhos ou ratos) que expressam a IL-15 humana a partir de um locus da IL-15 endógena modificada, em que a IL-15 expressa é total ou parcialmente humana. São descritos animais não humanos geneticamente modificados, embriões, células, tecidos e ácidos nucleicos que compreendem uma sequência genómica da IL-15 humana regulada por controlo regulador da IL-15 não humana. Os animais não humanos expressam uma proteína IL-15 humanizada, ou proteína IL-15 totalmente humana (por exemplo, uma proteína IL-15 madura totalmente humana), e não exibem uma ou mais das patologias dos animais não humanos com IL-15 humana trangénicos conhecidos na técnica. Os animais não animais podem ser mamíferos, por exemplo, roedores, por exemplo, ratinhos, ratos, hamsters, etc. 0 mamífero pode ser um roedor; o roedor pode ser um ratinho ou rato. São descritos animais não humanos geneticamente modificados, embriões, células, tecidos e ácidos nucleicos que compreendem uma sequência genómica da IL-15 humana num locus da IL-15 não humana. Os animais não humanos expressam uma proteína IL-15 humanizada, ou proteína IL-15 totalmente humana (por exemplo, uma proteína IL-15 madura totalmente humana), de um locus não humano endógeno modificado regulado por uma ou mais sequências reguladoras não humanas endógenas do locus da IL-15 endógena modificada, e não exibem uma ou mais das patologias de animais não humanos com IL-15 humana transgénicos conhecidos na técnica. Os animais não animais podem ser mamíferos, por exemplo, roedores, por exemplo, ratinhos, ratos, hamsters, etc. 0 mamífero pode ser um roedor; o roedor pode ser um ratinho ou rato.

Os animais não humanos podem compreender um locus da IL-15 modificada no genoma do animal não humano tal que o locus da IL-15 modificada é capaz de ser passado através da linhagem germinativa, em que o locus da IL-15 endógena modificada compreende uma humanização de pelo menos uma porção codificante de proteína madura do locus da IL-15 endógena. Os animais não humanos podem ser mamíferos. Os mamíferos podem ser roedores, e os roedores são heterozigotos ou homozigotos em relação ao locus da IL-15 modificada. Os roedores podem ser selecionados dentre ratinhos e ratos. Os ratinhos e ratos podem ser homozigotos para o locus da IL-15 modificada, e são incapazes de expressar uma proteína IL-15 endógena totalmente de ratinho ou totalmente de rato, e o ratinho e rato expressam uma proteína IL-15 humana madura. É descrito um animal não humano que compreende um primeiro alelo da IL-15 endógena do tipo selvagem, e uma humanização de um segundo alelo da IL-15 endógena. É descrito um animal não humano que compreende a falta de um primeiro alelo da IL-15 endógena e uma humanização de um segundo alelo da IL-15 endógena. É descrito um animal não humano que compreende a falta de um alelo da IL-15 endógena funcional, e compreende pelo menos uma cópia de um alelo da IL-15 humanizada sob o controlo de elementos reguladores não humanos endógenos. Pelo menos, uma cópia de um alelo da IL-15 humanizada pode estar num locus da IL-15 endógena. A humanização pode ser de um ou mais éxons e/ou íntrons no locus da IL-15 endógena não humana. São descritos animais não humanos tendo um locus da IL-15 modificada em que uma região não traduzida 5' não humana endógena e/ou uma região não traduzida 3' não humana endógena são mantidas no animal não humano modificado. A humanização do locus da IL-15 endógena não humana pode ser com uma região codificante (ou fragmento da mesma) que seja um fragmento genómico de um locus da IL-15 humana que compreenda pelo menos um éxon codificante da proteína IL-15 humana. A humanização do locus da IL-15 endógena não humana pode ser com uma região codificante que é um fragmento genómico de um locus da IL-15 humana que compreenda cada éxon codificante da proteína IL-15 humana, mas que não compreenda um éxon codificante da proteína IL-15 não humana. 0 locus da IL-15 que compreende o fragmento genómico humano pode resultar na expressão de uma proteína IL-15 que, quando madura, é totalmente humana. A humanização do locus da IL-15 endógena não humana pode ser com um cADN que codifica uma proteína IL-15 humana tal que, após o processamento no animal não humano, a proteína IL-15 madura produzida pelo locus humanizado é totalmente humana. É descrito um animal não humano geneticamente modificado que compreende um locus da IL-15 endógena que é humanizada no todo ou em parte, em que o locus da IL-15 humanizada compreende um gene codificante da IL-15 humanizada que está sob o controlo de elementos reguladores não humanos endógenos. Os elementos reguladores não humanos endógenos podem compreender todos os elementos reguladores da IL-15 endógena a montante (em respeito ao sentido transcricional do gene da IL-15) da primeira região ou éxon codificante de proteína do gene da IL-15 humanizada. Os elementos reguladores não humanos endógenos podem compreender todos os elementos reguladores da IL-15 endógena a jusante (em respeito ao sentido transcricional do gene da IL-15) da última região ou éxon codificante de proteína no gene da IL-15 humanizada. 0 gene codificante da IL-15 humanizada pode compreender uma 3'UTR humana. É descrito um roedor geneticamente modificado que compreende uma substituição, num locus da IL-15 endógena de roedor, de uma sequência genómica da IL-15 endógena de roedor por uma sequência genómica da IL-15 humana. A modificação genética pode estar na linhagem germinativa do animal não humano. 0 roedor geneticamente modificado pode compreender uma primeira sequência reguladora a montante (em respeito ao sentido da transcrição do gene da IL-15) da sequência genómica da IL-15 humana e uma segunda sequência reguladora de roedor a jusante da sequência genómica da IL-15 humana. A primeira sequência reguladora de roedor pode compreender um promotor e/ou potenciador de roedor, e a segunda sequência reguladora de roedor compreende uma 3'-UTR. É descrito um animal não humano geneticamente modificado que expressa uma proteina IL-15 humana ou humanizada. É descrito um ratinho geneticamente modificado que compreende uma substituição, num locus da IL-15 endógena de ratinho, de uma sequência genómica da IL-15 endógena de ratinho (ou fragmento da mesma) por uma sequência genómica da IL-15 humana (ou fragmento da mesma) para formar um locus modificado, em que a sequência genómica da IL-15 humana compreende pelo menos um éxon codificante de proteina humana.

A substituição pode compreender um fragmento genómico humano compreendendo pelo menos dois éxons codificantes de proteina da IL-15 humana. A substituição pode compreender um fragmento genómico humano que compreende pelo menos três éxons codificantes de proteina da IL-15 humana. A substituição pode compreender um fragmento genómico humano que compreende pelo menos quatro éxons codificantes de proteina da IL-15 humana. A substituição pode compreender um fragmento genómico humano que compreende os éxons 3, 4, 5 e 6 codificantes de proteina da IL-15 humana. A substituição pode compreender menos que todos os éxons da IL-15 humana, em que os éxons humanos da substituição consistem nos quatro éxons codificantes de proteina mars a jusante (em respeito ao sentido da transcrição do gene da IL-15) do gene da IL-15 humana. A substituição pode consistir essencialmente num fragmento genómico humano que contém não mais que quatro éxons codificantes de proteína da IL-15 humana. A substituição pode consistir ainda essencialmente numa sequência intrónica humana a montante do éxon humano mais próximo de 5' e numa sequência não codificante de proteina humana a jusante do códon de parada humano e a jusante da 3' UTR humana. É descrito um ratinho geneticamente modificado que compreende um locus da IL-15 humanizada, em que o locus da IL-15 humanizada compreende éxons de ratinho não codificantes de proteina, em que cada éxon de ratinho codificante de proteína (madura) é substituído por éxons humanos codificantes de proteína (madura). 0 locus da IL-15 humanizada pode compreender uma substituição de um fragmento genómico de ratinho que codifica sequências da proteina IL-15 madura de ratinho (isto é, não pré-proteína) por um fragmento genómico humano que codifica sequências da proteína IL-15 madura humana (isto é, não pré-proteína). É descrito um ratinho geneticamente modificado que compreende uma sequência que seja pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica, ou que seja idêntica, à SEQ ID N0:5. É descrito um ratinho geneticamente modificado que compreende uma sequência que seja pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica, ou que seja idêntica, à SEQ ID NO: 5; em que o ratinho carece de uma sequência endógena que codifica os éxons 3 até o 6 de uma proteína IL-15 de ratinho, conforme representado neste documento, e o ratinho compreende uma sequência de ácido nucleico num locus da IL-15 endógena de ratinho, em que a sequência de ácido nucleico codifica os éxons 3, 4, 5 e 6 da IL-15 humana, conforme representado neste documento. É descrito um roedor geneticamente modificado que expressa uma proteína IL-15 humana ou humanizada de um locus da IL-15 endógena de ratinho que é modificado para compreender, pelo menos, um éxon da IL-15 humana que codifica aminoácidos numa proteína da IL-15 humana madura. Em uma modalidade, o locus da IL-15 endógena de roedor compreende pelo menos dois éxons da IL-15 humana que codificam aminoácidos numa proteína IL-15 humana madura. 0 locus da IL-15 endógena de roedor pode compreender pelo menos três éxons da IL-15 humana que codificam aminoácidos numa proteína IL-15 humana madura. 0 locus da IL-15 endógena de roedor pode compreender pelo menos quatro éxons da IL-15 humana que codificam aminoácidos numa proteína IL-15 humana madura. 0 roedor endógeno compreende os éxons 3, 4, 5 e 6 da IL-15 humana que codificam aminoácidos numa proteína IL-15 humana madura. 0 locus da IL-15 endógena de roedor pode compreender toda a sequência de ácido nucleico humano que codifica aminoácidos em uma proteína IL-15 humana madura. A humanização pode compreender uma 3'UTR da IL-15 humana. 0 locus de roedor pode compreender pelo menos um éxon que não codifica aminoácidos de uma proteína IL-15 madura ou pelo menos um éxon que inclui uma sequência nucleotídica que não codifica aminoácidos de uma proteína IL-15 madura. 0 locus de roedor pode compreender pelo menos dois éxons que não codificam aminoácidos de uma proteína IL-15 madura. 0 locus de roedor pode compreender pelo menos três éxons que não codificam aminoácidos de uma proteína IL-15 madura. 0 locus de roedor pode compreender quatro éxons que não codificam aminoácidos de uma proteína IL-15 madura. É descrito um roedor geneticamente modificado que expressa uma proteína IL-15 humanizada, em que a população de linfócitos do roedor é caracterizada por sua população de células T que tem cerca do mesmo número que uma população de células T num ratinho do tipo selvagem pareado por idade. 0 roedor modificado pode ser caracterizado por uma população de células T maduras que tem cerca do mesmo número que uma população de células T maduras em um ratinho do tipo selvagem pareado por idade. É descrito um roedor geneticamente modificado que expressa uma proteína IL-15 humanizada, em que a população de linfócitos do roedor é caracterizada por uma população de células T que tem cerca do mesmo número que uma população de células T num ratinho do tipo selvagem pareado por idade. 0 roedor modificado pode exibir uma população de células T maduras que tem cerca do mesmo número que uma população de células T maduras num ratinho do tipo selvagem pareado por idade. 0 roedor modificado pode exibir uma população de células T periféricas que tem cerca do mesmo número que a população de células T periféricas num ratinho do tipo selvagem pareado por idade. A proteína IL-15 humanizada madura pode ser idêntica a uma proteína IL-15 humana madura. É descrito um roedor geneticamente modificado que expressa uma proteína IL-15 humanizada, em que a população de linfócitos do roedor é caracterizada por uma população de células T que exibe uma razão de CD4:CD8 que seja aproximadamente igual à razão de CD4:CD8 na população de células T de um ratinho do tipo selvagem pareado por idade. A proteína IL-15 humanizada pode ser idêntica a uma proteína IL-15 humana.

É descrito um roedor geneticamente modificado que expressa uma proteína IL-15 humanizada, em que a população de linfócitos do roedor é caracterizada por uma população de células natural killer (NK) que tem cerca do mesmo tamanho de uma população de células NK em um ratinho do tipo selvagem pareado por idade. A proteína IL-15 humanizada pode ser idêntica a uma proteína IL-15 humana. É descrito um roedor geneticamente modificado que expressa uma proteína IL-15 humana ou humanizada, em que a população de linfócitos do roedor é caracterizada por uma população de células T e uma população de células NK que tem, cada uma, cerca do mesmo tamanho de uma população de células T e de uma população de células NK num ratinho do tipo selvagem pareado por idade. É descrito um roedor geneticamente modificado que expressa uma proteína IL-15 humanizada, em que o roedor não desenvolve inflamação intestinal espontânea. 0 roedor pode não apresentar uma propensão a desenvolver a inflamação intestinal mais do que um roedor do tipo selvagem pareado por idade. É descrito um roedor geneticamente modificado que expressa uma proteína IL-15 humanizada, em que o roedor não desenvolve inflamação espontânea na área duodeno-jejunal. 0 roedor pode não apresentar uma propensão a desenvolver a inflamação na área duodeno-jejunal mais do que um roedor do tipo selvagem pareado por idade. É descrito um roedor geneticamente modificado que expressa uma proteína IL-15 humanizada, em que o roedor não exibe a destruição do epitélio intestinal mais do que um roedor do tipo selvagem pareado por idade. É descrito um roedor geneticamente modificado que expressa uma proteína IL-15 humanizada, em que o roedor não exibe doença celíaca numa taxa ou frequência mais alta do que um roedor do tipo selvagem pareado por idade. É descrito um roedor geneticamente modificado que expressa uma proteina IL-15 humanizada, em que o roedor não exibe uma resistência mais alta à adiposidade induzida pela dieta, e não exibe uma sensibilidade mais alta à insulina, do que um roedor do tipo selvagem pareado por idade. É descrito um roedor geneticamente modificado que expressa uma proteina IL-15 humanizada, em que o roedor, após a infeção com um patógeno, não é mais suscetível à lesão hepática letal induzida por lipopolissacarideos do que um roedor do tipo selvagem pareado por idade. É descrito um roedor geneticamente modificado que expressa uma proteina IL-15 humanizada, em que o roedor não desenvolve lesões psoriáticas numa taxa ou frequência mais alta do que um roedor do tipo selvagem pareado por idade. É descrito um roedor geneticamente modificado que expressa uma proteina IL-15 humanizada, em que o roedor não desenvolve artrite numa taxa ou frequência mais alta do que um roedor do tipo selvagem pareado por idade. É descrito um roedor geneticamente modificado que expressa uma proteina IL-15 humanizada, em que o roedor não desenvolve infiltração linfocitica das articulações numa taxa ou frequência mais alta do que um roedor do tipo selvagem pareado por idade. É descrito um roedor geneticamente modificado que expressa uma proteina IL-15 humanizada, em que o roedor não desenvolve sinovite inflamatória numa taxa mais alta do que um roedor de controlo do tipo selvagem pareado por idade. É descrito um roedor geneticamente modificado que expressa uma proteína IL-15 humana ou humanizada, em que o roedor não desenvolve uma ou mais patologias numa taxa ou frequência mais alta do que a de um roedor do tipo selvagem pareado por idade, em que a uma ou mais patologias são selecionadas do grupo consistindo em artrite, infiltração linfocítica das articulações, sinovite inflamatória, lesões psoriáticas, lesão hepática letal induzida por lipopolissacarideos relacionada a patógeno, uma resistência à insulina, uma resistência à adiposidade induzida pela dieta, inflamação intestinal espontânea, inflamação espontânea na área duodeno-jejunal, destruição do epitélio intestinal, doença celíaca, e uma combinação dos mesmos. É descrito um roedor geneticamente modificado que expressa uma proteína IL-15 humana ou humanizada, em que o roedor não desenvolve duas ou mais patologias numa taxa ou frequência mais alta do que um roedor do tipo selvagem pareado por idade, em que as duas ou mais patologias são selecionadas do grupo consistindo em artrite, infiltração linfocítica das articulações, sinovite inflamatória, lesões psoriáticas, lesão hepática letal induzida por lipopolissacarídeo relacionada a patógeno, uma resistência à insulina, uma resistência à adiposidade induzida pela dieta, inflamação intestinal espontânea, inflamação espontânea na área duodeno-jejunal, destruição do epitélio intestinal, e doença celíaca. É descrito um roedor geneticamente modificado que expressa uma proteína IL-15 humana ou humanizada, em que o roedor não desenvolve três ou mais patologias numa taxa ou frequência mais alta do que a de um roedor do tipo selvagem pareado por idade, em que as três ou mais patologias são selecionadas do grupo consistindo em artrite, infiltração linfocítica das articulações, sinovite inflamatória, lesões psoriáticas, lesão hepática letal induzida por lipopolissacarideos relacionada a patógeno, uma resistência à insulina, uma resistência à adiposidade induzida pela dieta, inflamação intestinal espontânea, inflamação espontânea na área duodeno-jejunal, destruição do epitélio intestinal, e doença celíaca. É descrito um roedor geneticamente modificado que expressa uma proteína IL-15 humana ou humanizada, em que o roedor não desenvolve quatro ou mais patologias numa taxa ou frequência mais alta do que um roedor do tipo selvagem pareado por idade, em que as quatro ou mais patologias são selecionadas do grupo consistindo em artrite, infiltração linfocítica das articulações, sinovite inflamatória, lesões psoriáticas, lesão hepática letal induzida por lipopolissacarídeo relacionada a patógeno, uma resistência à insulina, uma resistência à adiposidade induzida pela dieta, inflamação intestinal espontânea, inflamação espontânea na área duodeno-jejunal, destruição do epitélio intestinal, e doença celíaca. É descrito um roedor geneticamente modificado que expressa uma proteína IL-15 humana ou humanizada, em que o roedor não desenvolve cinco ou mais patologias numa taxa ou frequência mais alta do que um roedor do tipo selvagem pareado por idade, em que as cinco ou mais patologias são selecionadas do grupo consistindo em artrite, infiltração linfocítica das articulações, sinovite inflamatória, lesões psoriáticas, lesão hepática letal induzida por lipopolissacarídeo relacionada a patógeno, uma resistência à insulina, uma resistência à adiposidade induzida pela dieta, inflamação intestinal espontânea, inflamação espontânea na área duodeno-jejunal, destruição do epitélio intestinal, e doença celíaca. É descrito um roedor geneticamente modificado que expressa uma proteína IL-15 humana ou humanizada, em que o roedor não desenvolve seis ou mais patologias numa taxa ou frequência mais alta do que um roedor do tipo selvagem pareado por idade, em que as seis ou mais patologias são selecionadas do grupo consistindo em artrite, infiltração linfocitica das articulações, sinovite inflamatória, lesões psoriáticas, lesão hepática letal induzida por lipopolissacarideo relacionada a patógeno, uma resistência à insulina, uma resistência à adiposidade induzida pela dieta, inflamação intestinal espontânea, inflamação espontânea na área duodeno-jejunal, destruição do epitélio intestinal, e doença celiaca. É descrito um animal geneticamente modificado que compreende uma humanização de um locus da IL-15 endógena, em que o animal expressa uma proteína IL-15 madura parcial ou totalmente humana, e em que a proteína IL-15 madura parcial ou totalmente humana é expressa em níveis comparáveis e nos mesmos tecidos como uma proteína IL-15 endógena em um animal do tipo selvagem pareado por idade. É descrito um grande vetor de direcionamento (LTVEC) que compreende braços de homologia num locus da IL-15 endógena não humana, em que o LTVEC compreende, disposto entre os referidos braços de homologia, um fragmento genómico humano contíguo compreendendo éxons codificantes de proteína de um gene da IL-15 humana. 0 fragmento genómico humano contíguo pode não compreender éxons não codificantes de proteína de um locus da IL-15 humana. 0 fragmento genómico humano contíguo pode compreender ainda uma 3'UTR humana de um gene da IL-15. É descrito um constructo de ácido nucleico (por exemplo, ADN) que compreende, de 5' para 3', em respeito ao sentido da transcrição, uma sequência de ácido nucleico homólogo a uma sequência não codificante em 5' da IL-15 de ratinho, um fragmento genómico humano compreendendo éxons codificantes da proteína IL-15 humana, mas que não compreendem uma sequência reguladora humana a montante em relação à sequência codificante da proteína IL-15 humana, e uma sequência de ácido nucleico homólogo a uma sequência não codificante em 3' da IL-15 de ratinho. 0 fragmento genómico humano pode compreender ainda uma 3'UTR da IL-15 humana. É descrito um constructo de ácido nucleico (por exemplo, ADN) que compreende, de 5' para 3', em respeito ao sentido da transcrição, uma sequência de ácido nucleico que compreende uma região de homologia nas sequências do gene da IL-15 de ratinho a montante do primeiro éxon codificante da proteína IL-15 de ratinho, um fragmento genómico humano que codifica uma proteína IL-15 humana, mas que não compreendem uma sequência reguladora humana a montante da sequência que codifica a proteína IL-15 humana, e uma sequência de ácido nucleico homólogo a uma sequência não codificante em 3' da IL-15 de ratinho. 0 fragmento genómico humano pode compreender ainda uma 3'UTR da IL-15 humana. É descrito uma célula não humana geneticamente modificada, em que a célula não humana compreende uma substituição, em um locus da IL-15 endógena não humana, de uma sequência génica que codifica uma IL-15 não humana por uma sequência genómica humana que codifica uma IL-15 humana. A sequência genómica humana pode compreender uma sequência de ácido nucleico humano contíguo que abrange todos os éxons codificantes de proteína do gene da IL-15 humana. 0 roedor geneticamente modificado pode compreende um promotor da IL-15 não humana no locus da IL-15 endógena não humana. 0 animal não humano geneticamente modificado pode compreender todos os éxons não codificantes de roedor e regiões reguladoras a montante do primeiro éxon codificante de proteína do gene da IL-15 de roedor. A célula pode ser selecionada dentre uma célula pluripotente, uma célula pluripotente induzida, uma célula totipotente, uma célula ES, uma célula somática, e um óvulo. A célula pode expressar a proteína IL-15 humana.

Os animais não humanos podem ser um mamífero. 0 mamífero pode ser um roedor. 0 roedor pode ser selecionado dentre um ratinho e um rato. É descrito um embrião não humano, em que o embrião compreende pelo menos uma célula doadora não humana (por exemplo, uma célula ES, uma célula pluripotente, uma célula totipotente, etc.) compreendendo uma substituição de uma sequência de ácido nucleico codificante da IL-15 endógena não humana por uma sequência de ácido nucleico codificante da IL-15 humana em um locus da IL-15 endógena não humana. A célula doadora pode ser uma célula ES não humana e o embrião é um embrião animal não humano hospedeiro que é uma pré-mórula, uma mórula, ou um blastocisto. 0 embrião não humano pode ser um embrião de rato, e a pelo menos uma célula doadora não humana é uma célula de rato. A célula ES não humana pode ser uma célula ES de rato e o embrião hospedeiro é um embrião de rato. 0 embrião não humano pode ser um embrião de ratinho, e a, pelo menos, uma célula doadora não humana é uma célula de ratinho. A célula ES não humana pode ser uma célula ES de ratinho e o embrião hospedeiro é um embrião de ratinho. É descrito um tecido de roedor que compreende um gene da IL-15 humanizada em um locus da IL-15 endógena de roedor. 0 tecido pode ser selecionado dentre tecido epitelial, tecido de pele, e tecido muscular. É descrito um roedor geneticamente modificado que compreende uma sequência de ácido nucleico (por exemplo, ADN) que codifica uma proteína IL-15 humana, em que o roedor não expressa uma IL-15 de roedor, e em que o roedor exibe uma população de células NK que tem aproximadamente o mesmo tamanho que uma população de células NK de um roedor do tipo selvagem. 0 roedor pode ser um rato. 0 roedor pode ser um ratinho. 0 roedor pode exibir uma população de células T periféricas que tem aproximadamente o mesmo tamanho que uma população de células T periféricas de um roedor do tipo selvagem pareado por idade. É descrito um método para produzir um animal não humano que expressa uma proteína IL-15 humana ou humanizada, compreendendo a modificação genética de um animal não humano, conforme descrito neste documento, para formar uma sequência de ácido nucleico no animal não humano que compreenda uma sequência de ácido nucleico (por exemplo, ADN) que codifica uma proteína IL-15 humana ou humanizada, em que a sequência de ácido nucleico está sob o controlo de elementos reguladores a montante e a jusante endógenos não humanos.

0 animal não humano pode ser geneticamente modificado através da substituição de uma sequência genómica da IL-15 endógena (ou fragmento da mesma), num locus da IL-15 endógena, por uma sequência genómica da IL-15 humana (ou fragmento da mesma) para formar um locus modificado, em que a sequência genómica da IL-15 humana compreende pelo menos um éxon codificante de proteína humana. A substituição pode compreender um fragmento genómico humano compreendendo pelo menos dois éxons codificantes de proteína da IL-15 humana. A substituição pode compreender um fragmento genómico humano gue compreende pelo menos três éxons codificantes de proteína da IL-15 humana. A substituição pode compreender um fragmento genómico humano que compreende pelo menos quatro éxons codificantes de proteína da IL-15 humana. Em uma modalidade específica, a substituição compreende um fragmento genómico humano que compreende os éxons 3, 4, 5 e 6 codificantes de proteína da IL-15 humana. A substituição pode compreender ainda uma sequência não codificante de proteína humana a jusante do códon de parada humano (por exemplo, a 3'UTR humana). 0 animal não humano pode ser produzido a partir de uma célula pluripotente ou totipotente (por exemplo, uma célula ES). 0 animal não humano pode ser produzido através da utilização de uma etapa de injeção nuclear, em que um constructo de ácido nucleico compreendendo o gene da IL-15 humanizada (opcionalmente com sequências reguladoras não humanas endógenas a montante e/ou a jusante) é introduzido por injeção pró-nuclear. 0 constructo de ácido nucleico pode compreender um fragmento genómico humano que compreende os éxons 3, 4, 5 e 6 codificantes de proteína da IL-15 humana. 0 constructo de ácido nucleico pode compreender ainda uma sequência não codificante de proteína humana a jusante do códon de parada humano (por exemplo, a 3'UTR humana). 0 animal não humano pode ser produzido empregando-se um fibroblasto não humano que seja geneticamente modificado com um gene da IL-15 humana ou humanizada e (opcionalmente) elementos reguladores da IL-15 não humana a montante e/ou a jusante. É descrito um método para identificar um agente que seja um antagonista da IL-15 humana, compreendendo uma etapa de administração de um agente a um roedor geneticamente modificado, conforme descrito neste documento, a determinação de um efeito do agente sobre uma função mediada pela IL-15 humana no roedor, e a identificação do agente como um antagonista da IL-15 se este antagonizar a função da IL-15 humana no roedor geneticamente modificado. 0 agente pode compreender um domínio variável de imunoglobulina que se liga à IL-15. 0 agente pode especificamente se ligar a IL-15 humana, mas não à IL-15 de roedor. 0 agente pode ser um anticorpo. É descrito um método para determinar se um agente reduz o desenvolvimento de linfócitos mediado pela IL-15, compreendendo uma etapa de administração a um roedor geneticamente modificado, conforme descrito neste documento, de um antagonista da IL-15 por um período de tempo, a medição de um número de linfócitos do roedor em um ou mais momentos após a administração, e a determinação de se o antagonista da IL-15 reduz a população de linfócitos. É descrito um método para determinar se um agente reduz a infiltração linfocítica mediada pela IL-15 de um tecido ou de uma junta, compreendendo uma etapa de administração a um roedor geneticamente modificado, conforme descrito neste documento, de um antagonista da IL-15 por um período de tempo, a medição da infiltração linfocítica do tecido ou da articulação em um ou mais momentos após a administração, e a determinação de se o antagonista da IL-15 reduz a infiltração linfocítica do tecido ou da articulação. É descrito um método para determinar se um agente reduz a progressão artrítica mediada pela IL-15, compreendendo uma etapa de administração a um roedor geneticamente modificado, conforme descrito neste documento, e compreendendo ainda uma artrite induzida, um antagonista da IL-15 por um período de tempo, a medição da progressão artrítica, e a determinação de se o antagonista da IL-15 afeta a progressão artrítica no roedor.

Salvo indicação em contrário, ou evidente pelo contexto, dois ou mais aspetos e/ou modalidades podem ser combinados.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A FIG. 1 representa (sem escala) um esquema de um locus (superior) do gene da IL-15 de ratinho do tipo selvagem e um locus (inferior) da IL-15 endógena humanizada de ratinho. Símbolos abertos indicam uma sequência humana; símbolos fechados indicam uma sequência de ratinho; itens pontilhados indicam regiões não traduzidas. Os éxons não codificantes a montante (da esquerda para a direita na figura) do gene da IL-15 de ratinho não são mostrados (e não foram humanizados). 0 constructo inferior representa uma modalidade de um gene da IL-15 humanizada que compreende uma 3'UTR humanizada (pontilhada) e uma cassete de seleção de droga removível, que é opcionalmente removível no animal humanizado. A FIG. 2 é uma sequência de ácido nucleico (SEQ ID N0:1) que representa a junção a montante (em respeito ao sentido da transcrição do gene da IL-15) entre a sequência de ratinho e a sequência humana; a sequência mostrada começa com a sequência de ratinho em letras maiúsculas, seguida por um sítio de restrição de Asisl em letras minúsculas, seguido pela sequência de ácido nucleico da IL-15 humana em letras maiúsculas. As reticências indicam que a sequência continua a montante e a jusante da sequência mostrada. A FIG. 3 é uma modalidade de uma sequência de ácido nucleico (SEQ ID N0:2) que indica uma sequência codificante e não codificante da IL-15 humana a jusante em letras maiúsculas 3'UTR humana sublinhada), seguida por um sítio Xhol em letras minúsculas, seguido por um sítio lox (em letras maiúsculas, sublinhado), seguido pela sequência da cassete de seleção neo a jusante (em letras maiúsculas), que se estende 2,6 kb a jusante. A FIG. 4 é uma sequência de ácido nucleico (SEQ ID NO: 3) que representa a junção entre a porção a jusante da cassete de seleção neo (em letras maiúsculas), com sítio lox (em letras maiúsculas e sublinhado), seguido por um sítio Nhel (em letras minúsculas), que é seguido pela sequência de ratinho a jusante da humanização (em letras maiúsculas); os 2,6 kb indicam que a cassete de seleção se estende ainda mais a montante; as reticências indicam que a sequência continua. A FIG. 5 representa um alinhamento das sequências de proteína para a proteína precursora IL-15 de ratinho (superior, "mILl5 precursor," SEQ ID N0:4); a proteína precursora IL-15 de ratinho/humana híbrida (meio, "Regn_Hybrid_m/h," SEQ ID N0:5) produzida por uma humanização do locus representado na FIG. 1; e a pré-proteína da isoforma 1 da IL-15 humana conhecida (inferior, "hILl5 isoforma 1," SEQ ID NO:6); a junção resultante da humanização, conforme representado na FIG. 1 é indicada por uma seta vertical que indica C como o primeiro aminoácido da substituição; o início da proteína hIL-15 madura é indicado pela seta curva no primeiro aminoácido N. A FIG. 6 representa a IL-15 detetada no soro de ratinhos com hlL-15 heterozigotos injetados com poli I:C. 0 controlo indica que nenhuma hl L-15 foi detetada nos esplenócitos em cultura de ratinhos do tipo selvagem injetados com poli I:C. A FIG. 7 representa que a IL-15 humana não reage com a IL-15 de ratinho nem com poli I:C num ensaio ELISA. A IL-15 de ratinho estava em 1000 pg/mL. A FIG. 8 representa BM-DCs de ratinhos heterozigotos para a IL-15 humana, usando sobrenadantes de BM-DC concentrados 7 vezes para ratinhos não tratados, ratinhos tratados com poli I:C, e ratinhos tratados com LPS. A FIG. 9 representa que BM-DCs de ratinhos heterozigotos para a IL-15 humana produzem o transcrito da IL-15 humana (dados de RT-PCR). Faixa 1: ratinhos não tratados; Faixa 2: ratinhos tratados com poli I:C; Faixa 3: apenas com LPS; Faixa 4: ratinhos do tipo selvagem não tratados; Faixa 5: ratinhos do tipo selvagem tratados com poli I:C; Faixa 6: ratinhos do tipo selvagem tratados com LPS; Faixa 7: nenhum controlo de cADN (apenas água). A FIG.10 representa que ratinhos het MAID 5218 produziram a IL-15 humana após a injeção de poli I:C em um nivel comparável aos ratinhos het MAID 5217.

DESCRIÇÃO DETALHADA São descritos organismos não humanos geneticamente modificados que compreendem um locus da IL-15 endógena modificada que compreende uma sequência humana, por exemplo, uma substituição de uma ou mais sequências não humanas por uma ou mais sequências humanas. Os organismos são geralmente capazes de passar a modificação para a progénie, isto é, através da transmissão pela linhagem germinativa. Em particular, são descritos animais não humanos geneticamente modificados.

Os animais não humanos geneticamente modificados podem ser selecionados a partir de um grupo consistindo num ratinho, rato, coelho, porco, bovino (por exemplo, vaca, touro, búfalo), cervo, ovelha, cabra, galinha, gato, furão, primatas (por exemplo, sagui, macaco rhesus). Para os animais não humanos em que as células ES geneticamente modificáveis adequadas não estão prontamente disponíveis, outros métodos são empregados para produzir um animal não humano compreendendo a modificação genética. Esses métodos incluem, por exemplo, modificação de um genoma de célula não ES (por exemplo, um fibroblasto ou uma célula pluripotente induzida) e emprego de transferência nuclear para transferir o genoma modificado para uma célula adequada, por exemplo, um oócito, e gestação da célula modificada (por exemplo, o oócito modificado) em um animal não humano sob condições adequadas para formar um embrião.

Os animais não humanos podem ser um mamífero. 0 animal não humano pode ser um mamífero pequeno, por exemplo, da superfamília Dipodoidea ou Muroidea. Em uma modalidade, o animal geneticamente modificado é um roedor. 0 roedor pode ser selecionado dentre um ratinho, um rato e um hamster. 0 roedor pode ser selecionado da superfamília Muroidea. 0 animal geneticamente modificado pode ser de uma família selecionada dentre Calomyscidae (por exemplo, hamsters semelhantes a ratinho), Cricetidae (por exemplo, hamster, ratos e ratinhos do Novo Mundo, ratos silvestres), Muridae (ratinhos e ratos verdadeiros, gerbos, ratinhos espinhosos, ratos-de-crista) , Nesomyidae (ratinhos de escalada, ratinhos de rochas, ratos com causa, ratos e ratinhos Malagasy), Platacanthomyidae (por exemplo, arganaz espinhoso), e Spalacidae (por exemplo, ratos-toupeira, ratos de bambu e zokors). 0 roedor geneticamente modificado pode ser selecionado dentre um ratinho ou rato verdadeiro (familia Muridae), um gerbo, um ratinho espinhoso, e um rato-de-crista. 0 ratinho geneticamente modificado pode ser um de um membro da família Muridae. 0 animal pode ser um roedor. 0 roedor pode ser selecionado dentre um ratinho e um rato. 0 animal não humano pode ser um ratinho.

Em uma modalidade específica, o ratinho é de uma raça C57BL selecionada dentre C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/1OScSn, C57BL/10Cr, e C57BL/01a. Em outra modalidade, o ratinho é uma raça 129 selecionada do grupo consistindo numa raça que seja 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1 (por exemplo, 129S1/SV, 129Sl/SvIm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2 (ver, por exemplo, Festing et al. (1999) Revised nomenclature for strain 129 mice, Mammalian Genome 10:836, ver também, Auerbach et al. (2000) Establishment and Chimera Analysis of 129/SvEv- and C57BL/6-Derived Mouse Embryonic Stem Cell Lines). Em uma modalidade específica, o ratinho geneticamente modificado é uma mistura de uma raça 129 mencionada anteriormente e de uma raça C57BL/6 mencionada anteriormente. Em outra modalidade específica, o ratinho é uma mistura de uma raça 129 mencionada anteriormente, ou uma mistura de uma raça BL/6 mencionada anteriormente. Em uma modalidade específica, a raça 129 da mistura é raça 12 9S6 (129/SvEvTac) . Em outra modalidade, o ratinho é uma raça BALB, por exemplo, raça BALB/c. Em ainda outra modalidade, o ratinho é uma mistura de uma raça BALB e de outra raça mencionada anteriormente. Em ainda outra modalidade, a ratinho é de uma linhagem híbrida (por exemplo, 50% BALB/c — 50% 129S4/Sv; ou 50% C57BL/6 — 50% 129; por exemplo, células F1H4, ver, por exemplo, Auerbach et al. (2000)). 0 animal não humano pode ser um rato. 0 rato pode ser selecionado dentre um rato Wistar, uma raça LEA, uma raça Sprague Dawley, uma raça Fischer, F344, F6, e Dark Agouti. A raça de rato pode ser uma mistura de duas ou mais raças selecionadas do grupo consistindo em Wistar, LEA, Sprague Dawley, Fischer, F344, F6, e Dark Agouti. O animal não humano pode ter uma ou mais outras modificações genéticas, e/ou outras modificações, que são adequadas para a finalidade especifica para a qual o ratinho com IL-15 humanizada é feito. Por exemplo, ratinhos adequados para manter um xenoenxerto (por exemplo, um cancro ou tumor humano) podem compreender uma ou mais modificações que comprometem, inativam ou destroem o sistema imune do animal não humano no todo ou em parte. O comprometimento, inativação ou destruição do sistema imune do animal não humano pode incluir, por exemplo, a destruição de células hematopoiéticas e/ou células imunes por meios químicos (por exemplo, administração de uma toxina), meios físicos (por exemplo, radiação do animal), e/ou modificação genética (por exemplo, nocaute para um ou mais genes) . Exemplos não limitantes desses ratinhos podem incluir, por exemplo, ratinhos NOD, ratinhos SCID, ratinhos NON/SCID, ratinhos nocaute para IL2Ry, ratinhos NOD/SCID/Ycnu11 (ver, por exemplo, Ito, M. et al. (2002) NOD/SCID/Ycnu11 mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells, Blood 100(9):3175-3182), ratinhos nude, e ratinhos nocaute para Ragl e/ou Rag2. Esses ratinhos podem opcionalmente sofrer radiação, ou ser tratados de outra forma para destruir um ou mais tipos de células imunes. Assim, é descrito um ratinho geneticamente modificado que compreende uma humanização de pelo menos uma porção de um locus da IL-15 endógena não humana, e compreende ainda uma modificação que compromete, inativa ou destrói o sistema imune (ou um ou mais tipos celulares do sistema imune) do animal não humano no todo ou em parte. A modificação é, por exemplo, selecionada do grupo consistindo em uma modificação que resulta em um ratinho NOD, um ratinho SCID, um ratinho NOD/SCID, um ratinho nocaute para IL-2Ry, um ratinho NOD/SCID/yc1™11, um ratinho nude, um ratinho nocaute para Ragl e/ou Rag2, e uma combinação dos mesmos. O ratinho pode compreender uma substituição de toda a sequência codificante da IL-15 madura por uma sequência codificante da IL-15 humana madura. O ratinho pode compreender uma substituição de toda a sequência codificante da IL-15 madura por uma sequência codificante da IL-15 humana madura, e o ratinho é um ratinho NOD. O ratinho pode compreender uma substituição de toda a sequência codificante da IL-15 madura por uma sequência codificante da IL-15 humana madura, e o ratinho é um ratinho SCID. O ratinho pode compreender uma substituição de toda a sequência codificante da IL-15 madura por uma sequência codificante da IL-15 humana madura, e o ratinho é um ratinho NOD/SCID. O ratinho pode compreender uma substituição de toda a sequência codificante da IL-15 madura por uma sequência codificante da IL-15 humana madura, e o ratinho compreende um nocaute para IL-2Ry. 0 ratinho pode compreender uma substituição de toda a sequência codificante da IL-15 madura por uma sequência codificante da IL-15 humana madura, e o ratinho é um ratinho NOD/SCID/Ycnu11. O ratinho pode compreender uma substituição de toda a sequência codificante da IL-15 madura por uma sequência codificante da IL-15 humana madura, e o ratinho é um ratinho nude. 0 ratinho pode compreender uma substituição de toda a sequência codificante da IL-15 madura por uma sequência codificante da IL-15 humana madura, e o ratinho compreende um nocaute para Ragl e/ou Rag2. São descritos animais não humanos geneticamente modificados que compreendem uma modificação de um locus da IL-15 endógena não humana, em que a modificação compreende uma sequência de ácido nucleico humano que codifica pelo menos uma porção de uma proteína IL-15 madura. Apesar de também serem descritas células geneticamente modificadas que compreendem as modificações descritas neste documento (por exemplo, células ES, células somáticas), os animais não humanos geneticamente modificados podem compreender a modificação do locus da IL-15 endógena na linhagem germinativa do animal. São descritos animais não humanos geneticamente modificados que compreendem uma substituição de uma sequência génica da IL-15 não humana por uma sequência génica da IL-15 humana. Um locus da IL-15 endógena não humana pode ser modificado no todo ou em parte para compreender uma sequência de ácido nucleico humano que codifica pelo menos um éxon codificante de proteína de uma proteína IL-15 madura. A sequência humana pode ser uma sequência genómica humana, por exemplo, uma sequência genómica humana contígua compreendendo um ou mais éxons que codificam uma porção de uma proteína IL-15 madura, ou, por exemplo, um cADN que codifica pelo menos um ou mais éxons que codificam uma porção de uma proteína IL-15 madura. Todos os éxons codificantes da proteína IL-15 que codificam sequência proteicas que aparecem em uma proteína IL-15 humana madura podem ser humanizados. 0 locus da IL-15 humanizada pode estar sob o controlo de sequências reguladoras a montante (por exemplo, todas as sequências endógenas a montante da humanização). A humanização pode compreender uma 3'UTR humana.

Os animais não humanos podem ser mamíferos. Os mamíferos podem ser roedores. São descritos roedores que compreendem uma humanização de um gene da IL-15 em um locus da IL-15 endógena de roedor. São descritos métodos para produzir roedores, por exemplo, ratinhos que compreendem uma substituição de um gene da IL-15 endógena ou de um fragmento do mesmo (por exemplo, um fragmento compreendendo um ou mais éxons) por um gene da IL-15 humanizada, ou um fragmento do mesmo (por exemplo, um fragmento compreendendo um ou mais éxons), no locus da IL-15 endógena. São descritos células, tecidos e ratinhos que compreendem o gene humanizado, bem como células, tecidos e ratinhos que expressam a IL-15 humanizada de um locus da IL-15 endógena não humana. Também são descritos roedores que expressam uma proteína IL-15 humana sob o controlo de um promotor endógeno de roedor. A IL-15 foi descoberta como um fator de crescimento de células T independente de IL-2 que estimula a proliferação de células T e suporta o desenvolvimento tímico e o desenvolvimento de células natural killer (NK) (Burton, J.D. tal. (1994) A lymphokine, provisionally designated interleukin T and produced by a human adult T-cell leukemia line, stimulates T-cell proliferation and the induction of lymphokine-activated killer cells, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 91:4935-4939; Grabstein, K.H. et al. (1994) Cloning of a T Cell Growth Factor That Interacts with the β Chain of the Interleukin-2 Receptor, Science 264:965-968). A IL-2 e IL-15 compartilham subunidades de recetor. No entanto, a importância independente da IL-15 na manutenção de populações de células imunes não é disputada; ratinhos nocaute para IL-15/IL-15R exibem poucas células T CD8+, poucas células T CD8+ de memória, e poucas NK, bem como outros tipos de células (revisado em Steel, J.C. et al. (2012) Interleukin-15 biology and its therapeutic implications in cancer, Trends in Pharmacological Sciences, 33(1):35-41). A IL-15 é conhecida por ser expressa em células endoteliais; a IL-15 derivada de células endoteliais estimula a migração transendotelial de células T (ver, Oppenheimer-Marks, N. (1998) Interleukin 15 is Produced by Endothelial Cells and Increases the Transendothelial Migration of T Cells in Vitro and in the SCID Mouse-Human Rheumatoid Arthritis Model In Vivo, J. Clin. Invest. 101(6):1261-1272). Assim, um trabalho inicial estabeleceu uma probabilidade de que o recrutamento de células T para sítios inflamatórios seja mediado pela IL-15 (Id.). Este facto é significativo porque a superexpressão ou expressão imprópria da IL-15 pode prontamente levar a um fenótipo patológico - uma situação enfrentada com animais não humanos transgénicos que expressam a IL-15 desregulada. A regulação adequada da IL-15 é importante porque se acredita que a IL-15 seja uma citoquina pró-inflamatória que esteja no ápice de uma cascata de citoquinas pró-inflamatórias, precedendo a expressão de muitos mediadores da inflamação (Mclnnes, I.B. et al. (1997) interieukin-15 mediates T cell-dependent regulation of tumor necrosis factor-α production in rheumatoid arthritis, Nature Med. 3:189-195, citado em Waldmann, T. A. (2006) The biology of interleukin-2 and interleukin-15: implications for cancer therapy and vaccine design, Nature Rev. immunol. 6:595-601).

Ratinhos transgénicos que expressam a IL-15 humana sob o controlo de um promotor específico de enterócitos (promotor T3b) para expressar a IL-15 humana em células epiteliais intestinais desenvolvem inflamação espontânea na área duodeno-jejunal (Yokoyama, S. et al. (2008) Antibody-mediated blockade of IL-15 reverses the autoimmune intestinal damage in transgenic mice that overexpress IL-15 in enterocytes, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 106(37)15849-15854; Ohta, N. et al. (2002) IL-15-dependent activation-induced cell death-resistant Thl type CD8 alpha beta + NK1.1+ T cells for the development of small intestinal inflammation, J. immunol. 169:460-468). Ver, também, Nishimura, H. et al. (2005) A novel autoregulatory mechanism for transcriptional activation of the IL-15 gene by nonsecretable isoform of IL-15 generated by alternative splicing, FASEB J. 19:19-28 (ratinhos transgénicos com uma variante do gene da mIL-15 inserido aleatoriamente).

Ratinhos transgénicos para uma isoforma secretável da IL-15 sob o controlo de um promotor de MHC de classe 1 foram preparados, mas eles superexpressam a IL-15 (Yajima, T. et al. (2001) Memory phenotype CD8(+) T cells in IL-15 transgenic mice are involved in early protection against a primary infection with Listeria monocytogenes, Eur.J. Immunol. 31(3):757-766). A superexpressão da IL-15 está correlacionada com a destruição do epitélio intestinal por linfócitos T citotóxicos ativados pela IL-15 na doença celíaca (Yokoyama, S. et al. (2011) Transgenic Mice that Overexpress Human IL-15 in Enterocytes Recapitulate Both B and T Cell-Mediated Pathologic Manifestations of Celiac Disease, J. Clin. Immunol. 31:1038-1044), presumivelmente devido à promoção da proliferação de células T CD8+ que visam enterócitos através do processo mediado por NKG2D (grupo 2 de natural killer, membro D) que inclui recetores cognatos, tais como MICA/B (Id., em 1039). Parece claro agora que a IL-15 expressa localmente causa danos teciduais mediados por células T no intestino na doença celíaca (Id.).

Pelo menos um estudo de ratinhos transgénicos que são projetados para superexpressar a IL-15 no tecido muscular e na circulação (empregando um promotor de músculo esquelético) estabelece que a superexpressão da IL-15 afeta o metabolismo; esses ratinhos parecem empregar a IL-15 como uma miocina que reduz a gordura corporal e proporciona resistência à adiposidade induzida pela dieta (Quinn, L.S. et al. (2009) Oversecretion of interleukin-15 from skeletal muscle reduces adiposity, Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 296:E191-E202).

Também pensa-se que a IL-15 esteja implicada na artrite reumatoide, talvez através da infiltração anormal de células T nas articulações (revisado, por exemplo, em Fehninger T.A. e Caligiuri, M.A. (2001) Interleukin 15: biology and relevance to human disease, Blood 97(1):14-32). Pacientes com sarcoidose também produzem macrófagos alveolares que expressam a IL-15, que pode mediar a proliferação de células T no pulmão (Id., em 23). A IL-15 também pode mediar a rejeição de órgãos em aloenxertos através da proliferação de células T (Id., em 24). A IL-15 também pode estar implicada na leucemia de células T de adulto (por exemplo, mediada por HTLV-1) com base, pelo menos em parte, na ativação de vias mediadas pela IL-15 em pacientes com leucemia de células T de adulto (Id.). Trabalhos in vitro sugerem que a IL-15 ativa a replicação do HIV, o que também pode ser o caso em humanos (Id., em 25).

Em ratinhos transgénicos que expressam a IL-15 conduzido por um promotor de MHC de classe I infetados por Mycobacterium bovis Calmette-Guérin, a superprodução da IL-15 tornou os ratinhos suscetíveis à lesão hepática letal induzida por LPS, um efeito que não foi observado quando as células T CD8+ foram destruídas dos ratinhos (Yajima, T. (2004) Overexpression of Interleukin-15 Increases Susceptibility to Lipopolysaccharide-Induced Liver Injury in Mice Primed with Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin, Infection and Immunity 72(7):3855-3862), sugerindo urn efeito mediado pela superprodução da IL-15.

Os ratinhos transgénicos que expressam a IL-15 conduzida por um promotor de músculo esquelético exibiam uma maior sensibilidade à insulina e uma resistência à obesidade induzida pela dieta, e pareceram promover o metabolismo de ácidos gordos (Quinn, L.S. et al. (2011) Overexpression of interleukin-15 in mice promotes resistance to diet-induced obesity, increased insulin sensitivity, and markers of oxidative skeletal muscle metabolism, International Journal of interferon, Cytokine and Mediator Research, 3:29-42). O bloqueio seletivo da IL-15 murina foi estudado, incluindo uma IL-15Ra solúvel, que pode ter beneficio clinico no controlo da artrite reumatoide (Id., at 27). Assim, os animais não humanos que expressam a IL-15 humana ou humanizada, incluindo de uma forma fisiologicamente relevante, são úteis para avaliar ou identificar bloqueadores seletivos da IL-15 humana. De acordo com um revisor, "o desenvolvimento de agentes de bloqueio eficazes da IL-15 humana... com atividade de bloqueio in vivo poderia facilitar a rápida tradução dessas abordagens para a clinica" (Id., em 27). Assim, seriam bem úteis animais não humanos geneticamente modificados, por exemplo, animais não humanos que compreendem um gene da IL-15 humana em sua linhagem germinativa, em que os animais não humanos expressam a IL-15 humana de uma forma fisiologicamente adequada. A IL-15 é uma citoquina pleiotrópica que é necessária para o desenvolvimento e função de células NK e homeostasia de células T. É particularmente importante para o compartimento de células T CD8+ de memória. A IL-15 é produzida primariamente pelas células dendriticas e macrófagos, e é transapresentada através do complexo de IL-15/1L-15R para células NK e células T. A IL-15 também é conhecida por ser uma citoquina pró-inflamatória que induz a produção de outras citoquinas, recrutas e ativa células T e outras células inflamatórias, promove o desenvolvimento e a sobrevivência das células NK e promove a angiogénese; e muitas dessas características são apresentadas em lesões psoriáticas (revisto e relatado em Villadsen, L.S. (2003) Resolution of psoriasis upon blockade of IL-15 biological activityin a xenograft mouse model, J. Clin. Invest. 112(10):1571-1580). Foi proposto que a IL-15 está no ápice da cascata de citoquinas pró-inflamatórias, com várias estratégias para modular a sinalização da IL-15 para o tratamento da doença (revisto em Waldman (2006) The biology of interleukin-2 and interleukin-15: implications for cancer therapy and vaccine design, Nature Reviews immmunology, 6:595-601). Assim, em urn modelo de xenoenxerto de ratinho ratinhos SCID, o bloqueio da IL-15 usando um anticorpo para IL-15R (ou IL-15) resultou na redução da severidade da psoriase (Id.). Assim, os animais não-humanos que expressam IL-15 de forma fisiologicamente relevante são úteis (por exemplo, têm uma utilidade bem estabelecida) em modelos para doenças humanas, incluindo, entre outros, modelos em ratinhos imunocomprometidos como, por exemplo, ratinhos SCID e outros ratinhos imunocomprometidos. Assim, é descrito um roedor (por exemplo, um ratinho), que compreende um gene da IL-15 humana ou humanizada sob controlo dos elementos reguladores endógenos não humanos (por exemplo, uma humanização do gene codificante para a IL-15 em um roedor, por exemplo, um ratinho). 0 gene da IL-15 é encontrado no cromossomo humano 4q31 e no cromossomo 8 do ratinho. O gene humano contém 8 éxons (7 codificantes) e parece existir em duas isoformas em seres humanos e ratinhos (ver, por exemplo, Fehninger T.A. e Caligiuri, M.A. (2001) Interleukin 15: biology and relevance to human disease, Blood 97(1):14-32). 0 mARN para IL-15 é produzido em uma grande variedade de tecidos e tipos de células e a regulação do gene da IL-15 em seres humanos parece ser regulada negativamente por uma região a montante cuja deleção resulta em um aumento dramático na atividade do promotor da IL-15 (Id., em 17). Os ratinhos transgénicos que carecem de controlo pós-transcricional da IL-15 apresentam leucemia linfocitica fatal (Id.). A regulação da expressão da IL-15 parece ser muito justa, mediada pelo menos trios de AUG da região não traduzida 5', elementos reguladores 3' e um sitio regulador da região terminal C putativo (revisto em Mclnnes, I.B. e Gracie, J.A. (2004) Interleukin-15: a new cytokine target for the treatment of inflammatory diseases, Current Opinion in Pharmacology 4:392-397). 0 gene da IL-15 humana tem nove éxons e oito introns, o qual inclui um éxon 4a que está presente em humanos mas não em ratinhos, embora a proteína IL-15 madura seja codificada apenas por 5 a 8 éxons (revisto em Budagian, V. et al. (2006) IL-15/IL-15 receptor biology: A guided tour through an expanding universe, Cytokine & Growth Factor Reviews 17:259-280). Há dois produtos de mARN que sofreram splice alternativamente que produzem duas isoformas da IL-15, que diferem somente no comprimento do peptídeo de sinal, o que é verdade para as proteínas de ratinho e humanas (ver, por exemplo, Id.). A FIG. 1, que representa uma estratégia de humanização para um locus da IL-15 de ratinho, omite as sequências de ratinho a montante que não foram humanizadas (incluindo éxons que não aparecem na proteína madura) para manter a simplicidade e apresenta um renumeração dos éxons relevantes para a humanização mostrada. A IL-15 é expressa em muitos tipos de células e tecidos, incluindo monócitos, macrófagos, células dendríticas, queratinócitos, células epidérmicas, fibroblastos e células epiteliais do nervo, rim, placenta, pulmão, coração e músculo (Grabstein, KH et al. (1994) Cloning of a T Cell Growth Factor That Interacts with the β Chain of the Interleukin-2 receptor, Science 264:965-968).

As sequências codificantes da IL-15 do ratinho foram humanizadas, conforme representado na FIG. 1, que omite a representação de dois éxons não codificantes (que não foram humanizados) bem a montante dos éxons codificantes. 12299 nucleótidos da sequência de ratinho foram substituídos por 12896 nucleótidos de sequência humana para humanizar o qene da IL-15. 0 locus da IL-15 humanizada não tem 5'UTR da IL-15 humana. 0 locus da IL-15 humanizada pode compreender 5' UTR de roedor. 0 roedor pode ser um ratinho e o locus da IL-15 humanizada compreende a 5'UTR da IL-15 de ratinho.

Os roedores que expressam proteína IL-15 humana ou humanizada, por exemplo, de forma fisiologicamente apropriada, fornecem uma variedade de usos que incluem, entre outros, desenvolvimento de agentes terapêuticos para doenças e distúrbios humanos. Os antagonistas da IL-15 como, por exemplo, formas solúveis ou recetor de IL-15, podem impedir o desenvolvimento de artrite mediada por colagénio em um modelo animal (ver, Ruchatz, H. et al., (1998) Soluble IL-15 receptor α-chain administration prevents murine collagen-induced arthritis: a role for IL-15 in development of antigen-induced immunopathology, J. Immunol. 160:5654-5660;); os anticorpos anti-IL-15 apresentaram eficácia contra uma variedade de doenças, incluindo psoríase e artrite reumatoide; em um modelo animal de artrite, um antagonista do recetor da IL-15 impede o desenvolvimento e a progressão da artrite, bem como reduz a infiltração de linfócitos nas juntas (Ferrari-Lacraz, S. et al. (2004) argeting IL-15 Receptor-Bearing Cells with an Antagonist Mutant IL-15/Fc Protein Prevents Disease Development and Progression in Murine Collagen-induced Arthritis, J.Immunol. 173:5815-5826); a sinalização mediada pela IL-15 implicou também em IBD, SLE, sinovite inflamatória, diabetes melitos e asma (revisto em Budagian, V. et al. (2006) IL-15/IL-15 receptor biology: A guided tour through an expanding universe, Cytokine &

Growth Factor Reviews 17:259-280).

Os estudos com ratinhos nocaute para IL-15 estabelecem que a IL-15 é necessária para o desenvolvimento de certas células imunes, em particular, células NK (revisto em Lodoice, J.P. (2002)

Regulationof lymphoid homeostasis by interieukin-15, Cytokine & Growth Factor Reviews, 13:429-439). Com efeito, os ratinhos nocaute para IL-15 não sobrevivem muito tempo a certos patógenos (por exemplo, virus Vaccinia), presumivelmente devido a falta de células NK e T CD8+ (Id.). Assim, os efeitos dos antagonistas de hIL-15 em função de célula NK humana representam uma aplicação importante de um animal para IL-15 humanizada. São descritos animais geneticamente modificados, os quais expressam IL-15 humana ou humanizada, os quais são úteis para testar antagonistas à IL-15 humana. Os animais geneticamente modificados compreendem ainda um modelo animal de uma doença humana, por exemplo, a doença é geneticamente induzida (knocking ou nocaute) ou de outro modo. Os animais não humanos geneticamente modificados podem compreender ainda um sistema imune comprometido, por exemplo, um animal não humano geneticamente modificado para sustentar ou manter um transplante humano, por exemplo, um tumor sólido humano ou um tumor de células do sangue (por exemplo, um tumor de linfócitos, por exemplo, um tumor de células B ou T).

EXEMPLOS

Exemplo 1: Humanização do Locus da IL-15 de Ratinho

As células ES de ratinho foram modificadas para substituir certas sequências de genes da IL-15 de ratinho com certas sequências de genes da IL-15 humana no locus da IL-15 de ratinho endógena, sob controlo dos elementos reguladores da IL-15 de ratinho, usando tecnologia de engenharia genética VELOCIGENE® para produzir um locus humanizado, como mostrado na FIG. 1. A FIG. 1 não mostra a montante (em relação ao sentido da transcrição do gene da IL-15) os éxons não traduzidos em 5' do gene do ratinho; 0 Exl da FIG. 1 mostra uma pequena região não traduzida (não preenchida) a montante do éxon codificante. Como mostrado, a humanização na parte inferior da FIG. 1, os éxons codificantes do ratinho 1 e 2 foram mantidos, considerando que os 3 a 6 éxons codificantes foram substituídos por 3 a 6 éxons humanos. Na extremidade a jusante, o éxon humano 6 é seguido por um códon de parada e uma 3'-UTR humana e ainda por uma sequência humana encontrada a jusante da 3'UTR humana. Para fins de seleção, uma cassete de seleção (floxado para a remoção por Cre) foi incluído. 0 locus humanizado da FIG. 1 expressa uma proteína IL-15 madura que é totalmente humana.

Direcionamento do Constructo. A recombinação homóloga bacteriana (BHR) é executada para construir um vetor de direcionamento grande (LTVEC) contendo sequências do gene da IL-15 humana para direcionamento para o locus da IL-15 do ratinho usando técnicas de BHR padrão (ver, por exemplo, Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech. 21(6):652-659) e reparo de gap BHR. Os fragmentos lineares são gerados pela ligação das caixas de homologia geradas por PCR para cassetes clonados seguidos pelo isolamento de gel dos produtos da ligação e eletroporação em bactérias que portam o cromossomo artificial bacteriano alvo (BAC). BAC PRCI23-203P7 de ratinho é usado como a origem da sequência de ratinho; BAC RP11-103B12 humano é usado como origem da sequência do gene da IL-15 humana. Após uma etapa de seleção, os clones recombinados corretamente são identificados por PCR em novas junções e pela análise de restrição. Um vetor de direcionamento grande (LTVEC) contendo braços de homologia e sequências de genes da IL-15 humana foi produzido. As células ES de ratinho foram eletroporadas com constructos de LTVEC, cultivadas em meio de seleção e usadas como células ES doadoras para ratinhos com IL-15 humanizada compreendendo uma substituição no locus da IL-15 de ratinho endógena pela sequência humana, conforme representado na FIG. 1. 0 gene da IL-15 de ratinho (GenelD de ratinho: 103014; RefSeq transcrito: NM 008357.2; elD de conjunto:16168) é modificado pelo uso das coordenadas genómicas para deleção GRCM38: ch 8: 82331173-82343471 (fita minus); coordenadas genómicas para substituição GRCh37: ch4: 142642924-142655819 (fita plus). 12299 nucleótidos da sequência de ratinho foram substituídos por 128996 nucleótidos de sequência humana. A substituição da sequência da IL-15 de ratinho, descrita acima, é apresentada graficamente na FIG. 1. O LTVEC que compreende o gene da IL-15 humanizada tinha cerca de 13 kb de braço de direcionamento de ratinho a montante flanqueado a montante com sítio de Mlul, e um braço de direcionamento de ratinho de 27 kb a jusante flanqueado a jusante por um sítio de Ascl. O LTVEC foi linearizada com Mlul e Ascl para eletroporação.

Após a construção do LTVEC, a sequência de nucleótidos do LTVEC na junção em 5' humana/de ratinho e na junção em 3' humana/de ratinho é mostrada nas FIGs. 2-4.

Após a eletroporação da célula ES, é executado um ensaio da perda de alelo nativo (ver, por exemplo, Valenzuela et al. (2003)) para detetar a perda da sequência da IL-15 endógena devido ao direcionamento.

As células ES corretamente direcionadas (MAID 5217) foram ainda eletroporadas com um vetor de expressão de Cre transitória para remover a cassete de seleção de droga Neo. As células ES apagadas por cassete resultantes foram designadas MAID 5218.

Exemplo 2: Ratinhos com IL-15 Humanizada Geração de ratinhos com IL-15 humanizada.

As células ES de ratinho doadoras que compreendem um locus da IL-15 humanizada (por exemplo, MAID 5217 ou MAID 5218) foram introduzidas em embriões de ratinho no estágio inicial pelo método VELOCIMOUSE® (Poueymirou et ai. (2007) em ratinhos da geração F0 totalmente derivados de células-tronco embrionárias direcionadas por gene que permitem análises fenotípicas imediatas, Nat Biotechnol 25:91-99). Os ratinhos heterozigotos são obtidos, e para obter homozigotos com relação à IL-15 humanizada, os heterozigotos são cruzados.

Exemplo 3: Fenotipagem de Ratinhos com IL-15 Humanizada Ratinhos.

Os ratinhos eram fêmeas Balb/c de 8-10 semanas de tipo selvagem (WT) ou fêmeas MAID 5217 pareadas por idade (heterozigotas para o gene da IL-15 humana). Alternativamente, os ratinhos eram MAID 5217 ou ratinhos MAID 5218 de tipo selvagem (WT) ou pareados por idade (ambos heterozigotos para o gene da IL-15 humana).

Injeção de poli I:C in vivo.

Het Balb/c ou MAID 5217 foram injetados com 50 em poli:C (Invivogen; Cat #tlrl-pic) via veia caudal (injeção IV). Após 24 horas, os ratinhos foram sacrificados e o sangue foi recolhido via punção cardíaca e o soro foi isolado. Os baços também foram recolhidos e os esplenócitos foram preparados por baços rompidos mecanicamente através de um filtro de 70 μΜ mesh por tratamento com tampão de Use ACK (Invitrogen) para lisar células vermelhas do sangue (RBCs). Os esplenócitos isolados foram cultivados por estímulo adicional (ver abaixo). O soro foi analisado pela IL-15 humana usando o kit QUANTIKINETM da IL-15 humana da R&D Systems. Os ratinhos het WT ou MAID 5218 foram injetados com 50 pg de poli I:C (Invivogen; Cat #tlrl-pic) via IP. O sangue dos ratinhos foi recolhido no dia seguinte via punção cardíaca e o soro foi analisado para IL-15 humana por ELISA (kit ELISA QUANTIKINETM da R&D Systems).

Preparação de células dendriticas derivadas da medula óssea (BM- DC) . A medula óssea foi separada da tíbia de ratinhos não injetados e RBCs lisadas com tampão de lise ACK. As células foram lavadas com RPMI completa (com HEPES, Gentamicina, piruvato de sódio, L-glutamina e aminoácidos não-essenciais) + 10% de soro fetal bovino (FBS) e foram contadas. 2 x 106 células foram cultivadas por poço em uma placa de 6 poços com 3 mL/poço de RPMI completa + 10% de FBS + 50 ng/mL de GM-CSF de murino + 50 ng/mL de IL-4 de murino. As células foram cultivadas a 37°C/5% de C02 e foi dado GM-CSF/IL-4 fresco nos dias 2 e 4 da cultura. No dia 5 da cultura, as BM-DCs não aderentes foram recolhidas das culturas e o respetivo meio de cultura foi salvo (meio condicionado).

Cultura de esplenócitos.

Os baços também foram recolhidos dos respetivos ratinhos e os esplenócitos foram preparados por baços rompidos mecanicamente através de um filtro de 7 0 pM mesh por tratamento com tampão de lise ACK (Invitrogen) para lisar RBCs. Os esplenócitos isolados foram cultivados em uma placa de 48 poços em 2 x 106/mL de esplenócitos em lmL de RPMI completa + 10% FBS. As células foram tratadas com 10 pg/mL de poli I:C; 10 pg/mL de PMA ou não foram tratadas. As células foram cultivadas como tal durante a noite e o sobrenadante do dia seguinte foi colhido e concentrado usando 8 vezes filtros Amicon de 2 mL com corte de peso molecular de 3 kd (MWCO). Os sobrenadantes concentrados foram analisados pela IL-15 humana usando o kit QUANTIKINE™ da IL-15 humana da R&D Systems.

Cultura de BM-DC. 2 x 106/mL de BM-DCs foram plaqueadas numa placa de 24 poços em 0,5 mL de RPMI fresca completa + 10% de FBS e 0,5 mL de meio condicionado. As células foram tratadas com 25 pg/mL de poli I:C; 1 pg/mL de LPS ou não foram tratadas. Todas as condições foram realizadas em duplicado. As células foram cultivadas como tal por 36 horas e, em seguida, o sobrenadante foi colhido. Os sobrenadantes foram concentrados 7 vezes usando filtros de 2 mL de Amicon com MWCO de 3 kd. Os niveis da IL-15 humana em sobrenadantes concentrados foram analisados usando o kit QUANTIKINETM da IL-15 humana da R&D Systems. O ARN foi isolado das células via kit de miniprep RNAeasy TM da Qiagen para análise por RT-PCR de niveis de transcrito da IL-15 humana. ELISA. 0 kit QUANTIKINETM da IL-15 humana da R&D systems foi usado para medir a IL-15 humana no soro e os esplenócitos concentrados ou sobrenadantes da BM-DC. O kit foi usado de acordo com as instruções do fabricante. Controlos adicionais foram realizados para validar este kit quanto à especificidade (deteta apenas IL-15 humana e não a de ratinho) e para confirmar que ele não reage com poli I:C. Portanto, 1000 pg/mL da IL-15 de murino foram executados no ELISA (observação: o padrão mais elevado para a IL-15 humana é 250 pg/mL) e poli I:C sozinho em 25 pg/mL e 12,5 pg/mL. Foi constatado que o kit reage especificamente para IL-15 humana (sem deteção da IL-15 de ratinho) e que não reagiu com poli I:C. RT-PCR.

cADN foi preparado a partir de — 200 ng de ARN isolado usando sistema de síntese de primeira fita SUPERSCRIPTTM III para kit de RT-PCR (Invitrogen), de acordo com as instruções do fabricante. O transcrito da IL-15 humana específica foi amplificado usando polimerase de ADN Taqman com os seguintes iniciadores: iniciador Forward hlL-15: gtaaraagtg atttgaaaaa aattgaagat (SEQ ID NO:7); iniciador Reverse hIL-15: tacaaaactc tgcaaaaatt ctttaatat (SEQ ID NO:8). A reação por PCR foi realizada com 40 ciclos do disposto a seguir: desnaturação a 94°C por 15 segundos, recozimento a 60°C por 30 segundos, estendendo-se a 72° C e reação então mantido a 4 °C. O transcrito foi executado em 1% de gel de agarose usando loading dye Promega 6x.

Resultados. A IL-15 humana foi observada no soro de MAID 5217 het injetado com poli I:C, mas não em um ratinho Balb/c pareado por idade/sexo injetado com poli I:C (Figura 6 e Figura 10, painel direito). Da mesma forma, a IL-15 humana foi observada no soro de MAID 5218 het injetado com poli I:C, mas não em um ratinho WT pareado por idade/sexo injetado com poli I:C (Figura 10, painel esquerdo). O nivel de IL-15 produzido em MAID 5218 era comparável com o de MAID 5217 (Figura 10). Os esplenócitos estimulados por PMA de MAID 5217 secretam niveis baixos da IL-15 humana in vitro (não foram observados nos esplenócitos de ratinhos WT).

Além disso, as BM-DCs derivadas de MAID 5217 het demonstram secreção da IL-15 após estimulação in vitro com poli I:C (agonista de TLR3) e LPS (agonista de TLR4), bem como níveis basais significativos. A análise de RT-PCR demonstrou transcrito da IL-15 humana específica apenas em BM-DCs de ratinhos MAID 5217 het.

No geral, os dados indicam que MAID 5217 het e MAID 5218 het expressam IL-15 humana.

Exemplo 4: Ratinho homozlgoto para IL-15 Humana

Os ratinhos heterozigotos são cruzados e, sem seguida, são genotipados, conforme descrito acima. Os ratinhos com hIL-15 homozigotos são mantidos para fins de reprodução.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Rojas, Jose F.

Lai, Ka-Man Venus Murphy, Andrew J. <120> Humanized IL-15 Animals <130> 31013 (2200) <150> 61891013 <151> 2013-10-15 <160> 8 <170> Patentln version 3.5

<210> 1 <211> 208 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 1 atccatttag cctttctctg atcactaagt tggacagttg gacagtcttc ctcaaattag 60 cttagactat caaaattata ctgtattttt ggtatttcca gcgatcgctt cagttacaag 120 gctgttgaat gcacagaagc aaggataaca ctgatttttt cactggtcag aataaaaatt 180 attgattgct cttttgctta tagtattc 208 <210> 2 <211> 2029

<212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 2 aatgtaacag aatctggatg caaagaatgt gaggaactgg aggaaaaaaa tattaaagaa 60 tttttgcaga gttttgtaca tattgtccaa atgttcatca acacttcttg attgcaattg 120 attcttttta aagtgtttct gttattaaca aacatcactc tgctgcttag acataacaaa 180 acactcggca tttcaaatgt gctgtcaaaa caagtttttc tgtcaagaag atgatcagac 240 cttggatcag atgaactctt agaaatgaag gcagaaaaat gtcattgagt aatatagtga 300 ctatgaactt ctctcagact tactttactc atttttttaa tttattattg aaattgtaca 360 tatttgtgga ataatgtaaa atgttgaata aaaatatgta caagtgttgt tttttaagtt 420 gcactgatat tttacctctt attgcaaaat agcatttgtt taagggtgat agtcaaatta 480 tgtattggtg gggctgggta ccaatgctgc aggtcaacag ctatgctggt aggctcctgc 540 cagtgtggaa ccactgacta ctggctctca ttgacttcct tactaagcat agcaaacaga 600 ggaagaattt gttatcagta agaaaaagaa gaactatatg tgaatcctct tctttatact 660 gtaatttagt tattgatgta taaagcaact gttatgaaat aaagaaattg caataactgg 720 catataatgt ccatcagtaa atcttggtgg tggtggcaat aataaacttc tactgatagg 780 tagaatggtg tgcaagcttg tccaatcacg gattgcaggc cacatgcggc ccaggacaac 840 tttgaatgtg gcccaacaca aattcataaa ctttcataca tctcgttttt agctcatcag 900 ctatcattag cggtagtgta tttaaagtgt ggcccaagac aattcttctt attccaatgt 960 ggcccaggga aabcaaaaga ttggatgccc ctggtataga aaactaatag tgacagtgtt 1020 catatttcat gctttcccaa atacaggtat tttattttca cattcttttt gccatgttta 1080 tataataata aagaaaaacc ctgttgattt gttggagcca ttgttatctg acagaaaata 1140 attgtttata ttttttgcac tacactgtct aaaattagca agctctcttc taatggaact 1200 gtaagaaaga tgaaatattt ttgttttatt ataaatttat ttcaccttaa ttctggtaat 1260 actcactgag tgactgtggg gtgggaaatg atctcttaag aatttgattt ctttctattc 1320 catagtacaa actcgttctc tgttgaaaca ttcttctatc accccagtgc cctatccatg 1380 tacatgtgtt cttattgctc tagtcaaacg gtgcttataa atatctttca gaaagtttag 1440 gagaaatctg tatcctattt gacttccaat aatcatgtat tggctgtcag cttcttacct 1500 actctcagtc cagagaaata gtatttggca gccactcttt aaagtttatg ggttgtggat 1560 tgtggcggtt gatttatttt ttttatttca attgggatag aattttttaa tatacctgta 1620 tttttgtttt gttttatgta gcttttctat tagggagagt aggaaaagtg caccattttc 1680 ttctctaaat ttccagtcca gtctttaggg gaatgttagt cttcctgaga tgggggaagg 1740 aaaatcataa tgccagtcac tttgcaaata atattttata gtgataaatg gttcattttg 1800 gttacatagg catacaagtg ggcttaaaac ttggaattta ccagggctca aaattaaaat 1860 tcttacatta gttactcgat atggatcgct tcagttgatc ttagaaaact caaggcatag 1920 atctgcaacc tcgagataac ttcgtataat gtatgctata cgaagttata tgcatggcct 1980 ccgcgccggg ttttggcgcc tcccgcgggc gcccccctcc tcacggcga 2029 <210> 3

<211> 200 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 3 cattctcagt attgttttgc caagttctaa ttccatcaga cctcgacctg cagcccctag 60 ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttatgctagc gtgatagtcc ttcacggaaa 120 gtacaagaat acacagaaaa ctgctgttta cattagtctt tcacgttttt attttattct 180 cacaaatttt aatgcaatac 200 <210> 4

<211> 162 <212> PRT <213> Artificial Sequence <22 0> <223> murine IL-15 precursor polypeptide <400> 4

Met Lye lie Leu Lys Pro Tyr Met Arg Asn Thr Ser lie Ser Cys Tyr 15 10 15

Leu Cys Phe Leu Leu Asn Ser His Phe Leu Thr Glu Ala Gly lie His 20 25 30

Val Phe lie Leu Gly Cys Val Ser Val Gly Leu Pro Lys Thr Glu Ala 35 40 45

Asn Trp lie Asp Val Arg Tyr Asp Leu Glu Lys lie Glu Ser Leu lie 50 55 60

Gin Ser He His lie Asp Thr Thr Leu Tyr Thr Asp Ser Asp Phe His 65 70 75 80

Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Asn Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gin 85 90 95

Val lie Leu His Glu Tyr Ser Asn Met Thr Leu Asn Glu Thr Val Arg 100 105 110

Asn Val Leu Tyr Leu Ala Asn Ser Thr Leu Ser Ser Asn Lys Asn Val 115 120 125

Ala Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Thr Phe 130 135 140

Thr Glu Phe Leu Gin Ser Phe lie Arg He Val Gin Met Phe lie Asn 145 150 155 160

Thr Ser <210> 5

<211> 162 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hybrid mouse/human IL-15 precursor polypeptide <400> 5

Met Lys lie Leu Lys Pro Tyr Met Arg Asn Thr Ser lie Ser Cys Tyr 15 10 15

Leu Cys Phe Leu Leu Asn Ser His Phe Leu Thr Glu Ala Gly lie His 20 25 30

Val Phe lie Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu Pro Lys Thr Glu Ala 35 40 45

Asn Trp Val Asn Val lie Ser Asp Leu Lys Lys lie Glu Asp Leu lie 50 55 60

Gin Ser Met His lie Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His 65 70 75 80

Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gin 85 90 95

Val Xle Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser lie His Asp Thr Val Glu 100 105 110

Asn Leu lie lie Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val 115 120 125

Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn lie 130 135 140

Lys Glu Phe Leu Gin Ser Phe Val His lie Val Gin Met Phe lie Asn 145 150 155 160

Thr Ser

<210> 6 <211> 162 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human IL-15 isoform 1 polypeptide <400> 6

Met Arg lie Ser Lys Pro His Leu Arg Ser lie Ser lie Gin Cys Tyr 15 10 15

Leu Cys Leu Leu Leu Asn Ser His Phe Leu Thr Glu Ala Gly lie His 20 25 30

Val Phe lie Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu Pro Lys Thr Glu Ala 35 40 45

Asn Trp Val Asn Val lie Ser Asp Leu Lys Lys lie Glu Asp Leu lie 50 55 60

Gin Ser Met His lie Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His 65 70 75 80

Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gin 85 90 95

Val lie Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser lie His Asp Thr Val Glu 100 105 110

Asn Leu lie lie Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val 115 120 125

Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn He 130 135 140

Lys Glu Phe Leu Gin Ser Phe Val His He Val Gin Met Phe He Asn 145 150 155 160

Thr Ser <210> 7 <211> 30

<212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide: hIL-15 Forward primer <400> 7 gtaaraagtg atttgaaaaa aattgaagat 30 <210> 8 <211> 29

<212> DNA <213> Artificial Sequence <22 0> <223> Synthetic Oligonucleotide: hIL-15 Reverse primer <400> 8 tacaaaactc tgcaaaaatt ctttaatat 29

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Ratinho geneticamente modificado, caracterizado pelo facto de que cujo genoma compreende uma substituição em um locus da IL-15 endógena de ratinho, de um fragmento genómico de ratinho que codifica um polipeptídeo de IL-15 madura de ratinho, por um segmento genómico humano que codifica um polipeptídeo de IL-15 madura humana, em que os éxons da IL-15 humana no referido segmento genómico humano consistem nos éxons 3, 4, 5 e 6 codificantes da proteína IL-15 humana para formar um gene da IL-15 humanizada, em que os éxons da IL-15 são numerados com o primeiro éxon codificante como éxon 1, e em que o gene da IL-15 humanizada está sob o controlo de todos os elementos reguladores a montante da IL-15 endógena de ratinho no locus da IL-15 endógena de ratinho.
2. Ratinho geneticamente modificado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de que o gene codificante da IL-15 humanizada codifica uma proteína que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5.
3. Ratinho geneticamente modificado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de que o segmento genómico humano compreende ainda uma sequência intrónica humana a montante do éxon humano mais próximo de 5' e uma sequência não codificante de proteína humana a jusante do códon de parada humano e a jusante da 3' UTR humana.
4. Método de produção de um ratinho geneticamente modificado, caracterizado pelo facto de que compreende a modificação do genoma de um ratinho através da substituição de um fragmento genómico de ratinho que codifica um polipeptídeo de IL-15 madura de ratinho, no locus da IL-15 endógena de ratinho, por um segmento genómico humano que codifica um polipeptideo de IL-15 humana madura, em que os éxons da IL-15 humana no referido segmento genómico humano consistem nos éxons 3, 4, 5 e 6 codificantes da proteína IL-15 humana para formar um gene da IL-15 humanizada, em que os éxons da IL-15 são numerados com o primeiro éxon codificante como éxon 1, e em que o gene da IL-15 humanizada está sob o controlo de todos os elementos reguladores a montante da IL-15 endógena de ratinho no locus da IL-15 endógena de ratinho.
5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo facto de que o segmento genómico humano compreende ainda uma sequência intrónica humana a montante do éxon humano mais próximo de 5 ' e uma sequência não codificante de proteína humana a jusante do códon de parada humano e a jusante da 3' UTR humana.
6. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo facto de que o gene codificante da IL-15 humanizada codifica uma proteína que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5.
7. Ratinho geneticamente modificado, cujo genoma compreende um gene da IL-15 humanizada, em que o referido gene da IL-15 humanizada compreende os éxons 1 e 2 codificantes da proteína IL-15 de ratinho e um segmento genómico humano, em que os éxons da IL-15 humana no referido segmento genómico humano consistem nos éxons 3, 4, 5 e 6 codificantes da proteína IL-15 humana, em que os éxons da IL-15 são numerados com o primeiro éxon codificante como éxon 1, e em que o gene da IL-15 humanizada está sob o controlo de todos os elementos reguladores a montante da IL-15 de ratinho de um locus da IL-15 endógena de ratinho, e o referido gene da IL-15 humanizada codifica uma proteína que compreende uma sequência polipeptídica de IL-15 humana madura.
8. Ratinho geneticamente modificado, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo facto de que o gene codificante da IL-15 humanizada codifica uma proteína que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5.
9. Ratinho geneticamente modificado, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo facto de que o segmento genómico humano compreende ainda uma sequência intrónica humana a montante do éxon humano mais próximo de 5' e uma sequência não codificante de proteína humana a jusante do códon de parada humano e a jusante da 3' UTR humana.
10. Ratinho geneticamente modificado, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo facto de que o gene da IL-15 humanizada está em uma posição no genoma do ratinho que é diferente do locus da IL-15 endógena.
11. Método de produção de um ratinho geneticamente modificado, caracterizado pelo facto de que compreende a introdução, no genoma de um ratinho, de um gene da IL-15 humanizada que compreende os éxons 1 e 2 codificantes da proteína IL-15 de ratinho e um segmento genómico humano, em que os éxons da IL-15 humana no referido segmento genómico humano consistem nos éxons 3, 4, 5 e 6 da IL-15 humana, em que os éxons da IL-15 são numerados com o primeiro éxon codificante como éxon 1, e em que o gene da IL-15 humanizada está sob o controlo de todos os elementos reguladores a montante da IL-15 de ratinho de um locus da IL-15 endógena de ratinho, e o referido gene da IL-15 humanizada codifica uma proteína que compreende uma sequência polipeptídica de IL-15 humana madura.
12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo facto de que o gene da IL-15 humanizada está integrado no genoma numa posição que é diferente do locus da IL-15 endógena.