PT637335E - Mutantes recombinantes para induzir respostas imunitárias específicas - Google Patents

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Daniel Ladant
Peter Sebo
Agnes Ullman
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Pasteur Institut
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Description

ΕΡ Ο 637 335/ΡΤ
DESCRIÇÃO "Mutantes recombinantes para induzir respostas imunitárias especificas"
ANTECEDENTES DO INVENTO O invento refere-se a uma composição para induzir resposta imunitária em que a referida composição inclui uma adenilato-ciclase recombinante obtida por expressão do gene cyaC da espécie Bordetella ligado operativamente a uma sequência de controlo da expressão e de um gene cyaA recombinante da espécie Bordetella que codifica uma adenilato-ciclase ligada operativamente a uma sequência de controlo da expressão, em que o referido gene cyaA contém pelo menos uma inserção de uma sequência de ADN heterólogo em pelo menos um local permissivo e em que a adenilato-ciclase está desprovida de actividade catalítica; e em que adicionalmente a referida expressão é efectuada numa célula hospedeira seleccionada do grupo de bactérias, células eucarióticas e leveduras. 0 presente pedido descreve uma molécula de ADN recombinante incluindo o gene de toxina de adenilato-ciclase (cyaA) ou um seu fragmento contendo uma inserção de uma sequência de ADN heterólogo num local permissivo, em que o fragmento codifica um polipéptido apresentando as mesmas propriedades imunológicas que o produto do gene CyaA. Em concretizações especificas do presente invento a sequência de ADN heterólogo codifica um epitopo imunológico. 0 CyaA pode ser obtido de qualquer microorganismo ou de outro modo. 0 presente pedido também descreve uma adenilato-ciclase recombinante incluindo um epitopo heterólogo num local permissivo. Em concretizações especificas do presente invento o epitopo heterólogo é inserido no domínio catalítico N-terminal da adenilato-ciclase recombinante e pode ser apresentado ao sistema imunitário em associação com o complexo de histocompatibilidade principal (MHC) de classe I. Noutras concretizações do presente invento o epitopo heterólogo é inserido no domínio catalítico C-terminal e pode ser apresentado ao sistema imunitário em associação com o MHC de classe II. 2 ΕΡ Ο 637 335/ΡΤ
Revelam-se igualmente métodos para induzir respostas imunitárias especificas em animais imunizados com composições imunológicas incluindo adenilato-ciclases recombinantes. Em concretizações especificas do presente invento são especificamente induzidas respostas de células B, de CD4+ e de células T citotóxicas. Com o advento de técnicas de ADN recombinante para modificar sequências de proteínas, tem-se dedicado uma quantidade considerável de trabalho à alteração ou melhoria específicas de proteínas existentes. A modificação de aminoácidos específicos de enzimas de estrutura conhecida para alterar a especificidade tem sido conseguida por mutagénese dirigida ao local. Apesar do conhecimento da estrutura tridimensional estar restrito a um número limitado de proteínas, as comparações de sequências entre membros de famílias de proteínas homólogas assim como previsões cada vez mais exactas de estruturas secundárias e terciárias, oferecem uma base útil para redesenhar a função enzimática.
Outra abordagem com grande interesse potencial é a inserção de novas sequências peptídicas no interior de uma determinada proteína. A mutagénese por inserção tem sido utilizada eficazmente para estudar a topologia de proteínas de membrana (Charbit et al., 1986, 1991) e no caso de proteínas solúveis para determinar regiões de flexibilidade natural (Barany, 1985a, 1985b; Freimuth e Ginseberg, 1986; Starzyk et al., 1989; Freimuth et al., 1990; Kumar e Black, 1991). Além disso, a inserção de um péptido exógeno específico no interior de uma enzima pode alterar as suas propriedades catalíticas ou de regulação, proporcionando assim uma base racional para engenharia de proteínas. Adicionalmente, pode utilizar-se a engenharia de proteínas para alterar ou dirigir especificamente a resposta imunitária para um epítopo definido por alteração do ambiente do epítopo. A resposta imunitária pode ser dividida em dois sistemas distintos, imunidade celular e imunidade humoral. A imunidade humoral é mediada por moléculas solúveis, principalmente anticorpos. Contrariamente, a imunidade celular é mediada por células intactas, maioritariamente linfócitos T. A resposta imunitária exacta gerada por um antigénio heterólogo depende da natureza do antigénio e do ambiente no qual o antigénio ou um epítopo do antigénio se apresentam ao sistema imunitário. 3 ΕΡ Ο 637 335/ΡΤ Ο evento de iniciação numa resposta imunitária humoral é a ligação de um epitopo B a uma imunoglobulina (Ig) associada à membrana num subconjunto especifico de células B. Esta ligação estimula a entrada das células B no ciclo celular, resultando eventualmente na produção de anticorpos que reconhecem especificamente o epitopo B. A resposta de anticorpos desencadeada por um epitopo B pode ser dependente de células T ou independente de células T. As respostas dependentes de células T caracterizam-se por uma resposta primária muito baixa seguida por uma resposta de memória de IgG. A resposta independente de células T, por outro lado, caracteriza-se por uma resposta de anticorpos igM rápida, intensa e prolongada. A resposta imunitária mediada por células é activada por epitopos T. Os epitopos T dividem-se de um modo geral em duas categorias. Muitos epitopos podem activar tanto células T como células B e são por isso tanto epitopos T como epitopos B. Outros epitopos T são formas desnaturadas de determinantes antigénicos nativos e não podem activar uma resposta imunitária humoral mediada por células B.
Para activar uma resposta imunitária mediada por células o epitopo T tem que se associar a moléculas do complexo de histocompatibilidade principal (MHC). 0 MHC é uma região de genes altamente polimórficos cujos produtos são expressos à superfície de diferentes células. Existem dois grupos principais de MHC. 0 MHC de classe I é uma proteína transmembranar formada por duas cadeias polipeptídicas. A molécula contém uma região de ligação a péptidos extracelulares que é polimórfica no local de ligação ao péptido, uma região do tipo imunoglobulina, uma região transmembranar e um domínio citoplasmático que contém locais de fosforilação para uma proteína-quinase dependente de AMPc.
Encontra-se o MHC de classe I em virtualmente todas as células nucleadas. 0 MHC de classe I está geralmente associado a epitopos τ sintetizados endogenamente para apresentação ao sistema imunitário mediado por células. Dado que esta associação de MHC de classe I a antigénios específicos ocorre no retículo endoplasmático, os antigénios que são
internalizados por uma célula apresentadora de antigénios através da via endocitótica não se associam geralmente ao MHC 4 ΕΡ Ο 637 335/ΡΤ de classe I. A associação de um epítopo T específico ao mhc de classe I e a incorporação do complexo antigénio-MHC de
classe I na superfície de uma célula estimulam linfócitos T citotóxicos (CTL) específicos. Os linfócitos T citotóxicos estimulados podem então matar a célula que expressa o complexo antigénio-MHC por exocitose de grânulos de uma proteína formadora de poros de membrana que causa lise celular e excreção de uma toxina celular que activa enzimas de degradação de adn. Contudo, a activação das células CTL também requer, em certos casos, a activação de células T auxiliadoras. A outra classe principal de proteínas MHC é o MHC de classe II. As MHC de classe II são também proteínas transmembranares. Tal como o MHC de classe I, o MHC de classe II inclui duas cadeias polipeptídicas e inclui uma região de ligação a péptidos polimórfica, uma região do tipo imunoglobulina, uma região transmembranar e um domínio citoplasmático. Contudo, contrariamente ao MHC de classe I, as moléculas de classe II são apenas expressas em "células apresentadoras de antigénio" tais como linfócitos B, macrófagos, células dendríticas, células endoteliais e algumas outras. Os epítopos T associam-se ao MHC de classe II quando um antigénio incluindo o epítopo T se liga à superfície de uma célula apresentadora de antigénio. 0 antigénio entra na célula através de fagocitose ou por endocitose mediada por receptores em vesículas revestidas de clatrina. Alternativamente, os antigénios solúveis podem ser internalizados por pinocitose de fase fluida. Após internalização do antigénio, este é processado por proteases celulares em vesículas ácidas resultando em péptidos com 10-20 aminoácidos de comprimento. Estes epítopos ligam moléculas de MHC de classe II em
vesículas intracelulares e o complexo é transportado para a superfície celular. A presença do complexo MHC de classe II-antigénio à superfície de células apresentadoras de antigénios resulta no estímulo de subpopulações de células T auxiliadoras. Estas células auxiliam a função das CTL assim como respostas de células B. Adicionalmente, as células T auxiliadoras podem mediar respostas inflamatórias.
Dois factores importantes na determinação do carácter de uma resposta imunitária são a natureza do antigénio que é 5 ΕΡ Ο 637 335/ΡΤ reconhecido e ο atingimento intracelular ou extracelular do antigénio. Assim, um epitopo de célula T que possa direccionado para entrar numa célula apresentadora de antigénios de um modo dependente de endocitose mediada por receptores, ficará associado com o MHC de classe II e activará células T auxiliadoras mas não células CTL. Além disso, se um epitopo de célula T estranho puder ser direccionado para o citoplasma de uma célula alvo de um modo independente de endocitose mediada por receptores e, o epitopo ficará associado ao MHC de classe I e permitirá a activação de células CTL. Consequentemente, existe uma necessidade na arte de direccionar especificamente epitopos de modo a activar selectivamente uma resposta imunitária mediada por células ou humoral.
SUMÁRIO DO INVENTO 0 invento refere-se a uma composição para induzir uma resposta imunitária, em que a referida composição inclui uma adenilato-ciclase recombinante obtida por expressão do gene cyaC da espécie Bordetella ligado operativamente a uma sequência de controlo da expressão e de um gene cyaA recombinante da espécie Bordetella que codifica uma adenilato-ciclase ligada operativamente a uma sequência de controlo da expressão, em que o referido gene cyaA contém pelo menos uma inserção de uma sequência de ADN heterólogo em pelo menos um local permissivo e em que a adenilato-ciclase está desprovida de actividade catalítica; e em que adicionalmente a referida expressão é efectuada numa célula hospedeira seleccionada do grupo de bactérias, células eucarióticas e leveduras.
Revela-se um plasmideo recombinante útil para expressar adenilato-ciclase, em que o plasmideo inclui os genes cyaA e cyaC da adenilato-ciclase de espécie Bordetella, ou seus homólogos, ligados operativamente a uma sequência de controlo da expressão, em que o plasmideo recombinante dirige a expressão da adenilato-ciclase da espécie Bordetella numa célula hospedeira transformada seleccionada do grupo que consiste em bactérias, células eucarióticas e leveduras. Numa concretização especifica do presente invento, o gene cyaA e o gene cyaC são o gene cyaA e o gene cyaC de Bordetella pertussis. Noutras concretizações especificas do presente 6 ΕΡ Ο 637 335/ΡΤ invento, a célula hospedeira é E. coli, a sequência de controlo da expressão inclui o promotor lac ou o gene cyaA inclui ADN que codifica um epitopo heterólogo. Numa concretização especifica o plasmideo recombinante é pCACT3. 0 presente pedido também descreve uma molécula de ADN recombinante incluindo o gene cyaA de adenilato-ciclase da espécie Bordetella ou seus homólogos, em que o gene cyaA contém pelo menos uma inserção de uma sequência de ADN heterólogo em pelo menos um local permissivo. Em concretizações do presente invento a sequência de ADN heterólogo codifica menos de 25 aminoácidos, entre 10-20 aminoácidos e 16 aminoácidos. Em concretizações especificas do presente invento, a sequência de ADN heterólogo é um epitopo de poliovirus, virus VIH, virus influenza ou virus da coriomeningite linfocitica e é inserido no dominio catalítico N-terminal ou no dominio C-terminal. O presente pedido revela adicionalmente uma adenilato-ciclase recombinante de Bordetella pertussis incluindo um epitopo heterólogo num local permissivo. Numa concretização do presente invento a adenilato-ciclase está na forma desintoxicada. Em concretizações especificas do presente invento o epitopo heterólogo é inserido no dominio catalítico N-terminal e o epitopo heterólogo é apresentado a linfócitos T CD8+ em associação com moléculas do complexo de histocompatibilidade principal de classe I. Noutras concretizações específicas do presente invento o epitopo heterólogo é inserido no domínio C-terminal e é apresentado a linfócitos T CD4+ em associação com moléculas do complexo de histocompatibilidade principal de classe II.
Numa concretização específica do presente invento, o local permissivo da adenilato-ciclase de Bordetella pertussis é seleccionado do grupo que consiste nos resíduos 137-138, resíduos 224-225, resíduos 228-229, resíduos 235-236 e resíduos 317-318. Noutras concretizações específicas do presente invento o epitopo heterólogo da adenilato-ciclase recombinante de Bordetella pertussis é o epitopo 118-132 da nucleoproteína do vírus da coriomeningite linfocitica, um epitopo do virus VIH, nomeadamente o epitopo incluído na 7 ΕΡ Ο 637 335/ΡΤ ansa V3, um epítopo do vírus influenza ou um epítopo de poliovírus, nomeadamente epítopo 103-116 de poliovírus.
Além disso, este pedido descreve um método para induzir a resposta imunitária de células B incluindo imunização de animais com bactérias vivas que expressam uma adenilato-ciclase recombinante ou uma composição imunológica incluindo uma adenilato-ciclase recombinante ou um fragmento de AC, em que a adenilato-ciclase recombinante inclui um epítopo B heterólogo.
Em concretizações específicas do presente invento, as bactérias utilizadas no método para induzir resposta imunitária de células B são E. coli. Numa concretização adicional, os animais imunizados com a composição imunológica ou bactérias são seres humanos. Em concretizações específicas, o epítopo B heterólogo é um epítopo B de poliovírus B, um epítopo B de VIH, um epítopo B de vírus da coriomeningite linfocítica ou um epítopo B de vírus influenza.
Descreve-se igualmente um método para induzir uma resposta imunitária de células T CD4+, em que o método inclui imunização de animais com uma composição imunológica incluindo uma adenilato-ciclase recombinante, em que a referida adenilato-ciclase recombinante inclui um epítopo T heterólogo num local permissivo no domínio terminal C da referida adenilato-ciclase recombinante.
Numa concretização específica do presente invento, a composição imunológica inclui adicionalmente um adjuvante adequado. Numa concretização adicional, o epítopo T heterólogo é um epítopo T de poliovírus, VIH, vírus influenza ou vírus da coriomeningite linfocítica. 0 presente pedido revela adicionalmente um método para induzir resposta imunitária de células T CD8+, em que o método inclui imunização de animais com uma composição imunológica incluindo uma adenilato-ciclase recombinante, em que a adenilato-ciclase recombinante inclui pelo menos um epítopo CTL heterólogo em pelo menos um local permissivo no domínio catalítico N-terminal da adenilato-ciclase recombinante. 8 ΕΡ Ο 637 335/ΡΤ
Numa concretização específica do presente invento, a composição imunológica inclui adicionalmente um adjuvante adequado tal como hidróxido de alumínio. Numa concretização adicional, o epítopo T heterólogo é um epítopo T de poliovírus, VIH, vírus da coriomeningite, nomeadamente o epítopo 118-132 da nucleoproteína do vírus da coriomeningite ou vírus influenza.
DESCRIÇÃO SUCINTA DA FIGURA A figura representa esquematicamente um método para construir o plasmídeo pCACT3.
DESCRIÇÃO DETALHADA DAS CONCRETIZAÇÕES PREFERIDAS 0 invento refere-se a uma composição para induzir uma resposta imunitária, em que a referida composição inclui uma adenilato-ciclase recombinante obtida por expressão do gene cyaC da espécie Bordetella ligado operativamente a uma sequência de controlo da expressão e de um gene cyaA recombinante da espécie Bordetella que codifica uma adenilato-ciclase ligado operativamente a uma sequência de controlo da expressão, em que o referido gene cyaA contém pelo menos uma inserção de uma sequência de ADN heterólogo em pelo menos um local permissivo e em que a adenilato-ciclase está desprovida de actividade catalítica; e em que adicionalmente a referida expressão é efectuada numa célula hospedeira seleccionada do grupo de bactérias, células eucarióticas e leveduras. 0 presente pedido revela moléculas de ADN recombinantes incluindo o gene cyaA de Bordetella pertussis, em que o gene cyaA contém uma inserção de uma sequência de ADN heterólogo num local permissivo. 0 presente invento também se refere a uma adenilato-ciclase recombinante de Bordetella pertussis incluindo um epítopo heterólogo num local permissivo.
Descreve-se igualmente um método para induzir uma resposta imunitária de células T CD4+ incluindo imunização de animais com uma composição imunológica, em que a composição imunológica inclui uma adenilato-ciclase recombinante de Bordetella pertussis com um epítopo T heterólogo num local permissivo no interior do domínio C-terminal. Também se revela 9 ΕΡ Ο 637 335/ΡΤ um método para induzir resposta imunitária de células T CD8+ incluindo imunização de animais com uma composição imunológica em que a composição imunológica inclui a adenilato-ciclase recombinante de Bordetella pertussis com um epitopo T heterólogo num local permissivo no interior do domínio catalítico N-terminal.
Tal como aqui utilizada, a expressão "sequência de controlo da expressão" refere-se a uma sequência de ácido nucleico que regula a transcrição e/ou a tradução de um gene estrutural. Esta regulação pode ser directa ou indirecta. Assim, constituem exemplos de sequências de controlo da expressão, entre outras, promotores, operadores, locais de ligação ao ribossoma e ADN que codifica locais de ligação ao ribossoma.
Tal como aqui utilizada, a expressão "sequência de ADN heterólogo" refere-se a uma sequência de ADN derivada do ADN de uma espécie diferente do ADN da porção remanescente da molécula ou gene na/no qual se localiza a sequência heteróloga. A sequência de ADN heterólogo pode ser sintetizada enzimática ou quimicamente. Alternativamente, a sequência de ADN heterólogo pode ser directamente isolada a partir de um organismo de origem.
Tal como aqui utilizada em referência a uma proteína, a expressão "local permissivo" refere-se a um local no interior da molécula da proteína ao qual se podem adicionar aminoácidos exógenos sem afectar apreciavelmente as propriedades funcionais da proteína.
Tal como aqui utilizada em referência a um ácido nucleico, a expressão "local permissivo" refere-se a um local no interior do ácido nucleico ao qual se podem adicionar nucleótidos exógenos mantendo o quadro de leitura sem afectar apreciavelmente as propriedades funcionais de uma proteína expressa a partir do ácido nucleico.
Tal como aqui utilizado, o termo "epitopo" refere-se a uma sequência de aminoácidos ou outra molécula ou seu fragmento, que pode induzir uma resposta imunitária. 10 ΕΡ Ο 637 335/ΡΤ
Tal como aqui utilizada, a expressão "epítopo B" refere-se a uma sequência de aminoácidos ou outra molécula ou seu fragmento, que pode induzir uma resposta imunitária envolvendo linfócitos B.
Tal como aqui utilizada, a expressão "epitopo heterólogo" refere-se a um epitopo que pode ser inserido numa proteína por técnicas recombinantes em que o epitopo inserido não se encontra naturalmente nessa proteina.
Depositou-se a estirpe XL-1 de E. coli contendo pCACT3 na "Collection Nationale de Cultures de Micro-organisms" do Institut Pasteur, 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris, Cedex 15, França, com o número de acesso 1-1201 a 8 de Abril de 1992 .
Os mecanismos pelos quais se controla a imunogenicidade de epitopos peptidicos definidos envolvem tanto as caracteristicas intrínsecas de um determinado epítopo como factores ambientais. Estes factores ambientais dependem da exposição do epitopo como parte de estruturas complexas e organizadas tais como parasitas ou bactérias. Por expressão de determinado epitopo peptidico em diferentes locais permissivos de diferentes proteínas bacterianas, é possivel alterar os factores ambientais e assim modificar especificamente a imunogenicidade do epitopo peptidico. A adenilato-ciclase de Bordetella pertussis representa um veiculo adequado para especificar a resposta imunogénica de um epitopo peptidico heterólogo em concretizações do presente invento. A adenilato-ciclase de Bordetella pertussis constitui uma das toxinas essenciais deste organismo que é o agente causador da tosse convulsa. A adenilato-ciclase é excretada por Bordetella pertussis e apresenta a capacidade de entrar em células eucarióticas alvo onde, activada pela calmodulina (CaM), catalisa a sintese de AMP ciclico (AMPc) impedindo assim o metabolismo celular. A adenilato-ciclase (AC) é sintetizada e excretada na forma de um polipéptido de 1706 aminoácidos: a actividade catalítica dependente da calmodulina localiza-se nos primeiros 400 aminoácidos. A porção C-terminal com aproximadamente 1300 resíduos é responsável pela ligação às células alvo e pela translocação 11 ΕΡ Ο 637 335/ΡΤ do domínio catalítico N-terminal através da membrana citoplasmática destas células. Adicionalmente, esta porção C-terminal apresenta uma actividade hemolítica fraca. Várias características da AC de Bordetella pertussis indicam que esta toxina pode ser utilizada como um veículo para induzir uma resposta imunogénica específica: 1) esta adenilato-ciclase é capaz de entrar em várias células diferentes, nomeadamente diferentes tipos de células associadas com o sistema imunitário; 2) a adenilato-ciclase pode ser internalizada pelas células alvo independentemente de um processo de endocitose mediado por receptor, o que sugere que o domínio catalítico da toxina é capaz de penetrar directamente através da membrana citoplasmática das células alvo; 3) o domínio catalítico N-terminal sofre proteólise rápida no interior das células alvo, o que permite que epítopos associados a este domínio entrem na via do MHC de classe I de apresentação de antigénios; e 4) foram identificados vários aminoácidos envolvidos na actividade catalítica da AC, permitindo a construção de toxinas AC modificadas que estão desprovidas de actividade enzimática e portanto já não são citotóxicas. Consultar Sakamoto, H., Sebo, P., Ladant., J. Biol. Chem., 267:13598-13602 (1992). O locus genético (cya) de codificação da toxina adenilato-ciclase (Cya) de Bordetella pertussis é composto por cinco genes (cyaA-E). O gene cyaA codifica a adenilato-ciclase. A expressão do gene cyaA em E. coli leva à produção de um produto génico de 200 kDa apresentando actividade catalítica, mas isento de actividades invasiva e hemolítica. Contudo, a co-expressão do produto génico de cyaC torna a holotoxina cyaA invasiva e hemolítica numa sistema de expressão reconstituído em E. coli. A co-expressão dos genes cyaB, D e E em trans relativamente a cyaA não confere capacidade invasiva e actividade hemolítica à holotoxina nem potência as actividades apresentadas pelo produto génico cyaC.
Pensa-se que a activação de CyaA mediada por CyaC resulta de uma modificação pós-tradução. Esta modificação não é 12 ΕΡ Ο 637 335/ΡΤ perdida durante a purificação da toxina a partir de B. pertussis por um procedimento incluindo extracção com ureia 8 M ou separação por SDS-PAGE (Hewlett et al., 1989). Esta revelação indica que a modificação é covalente.
Compararam-se as actividades invasiva e hemolitica das toxinas CyaA produzidas de forma recombinante em E. coli ou de forma natural em B. pertussis. Os resultados indicam que as proteínas activadas por cyac produzidas em E. coli apresentam 5 vezes menos actividade hemolitica do que a toxina produzida em B. pertussis. A razão entre a actividade invasiva e a actividade hemolitica não se alterou significativamente com a purificação das proteínas indicando que a diminuição da actividade hemolitica não se deve a qualquer factor de inibição presente nos extractos de E. coli, mas pelo contrário reflecte um propriedade intrínseca das toxinas produzidas em E. coli. Dois argumentos adicionais apoiam esta interpretação. Primeiro, o desenrolar temporal da hemólise é praticamente linear independentemente da fonte das toxinas o que indica que a estabilidade das proteínas purificadas de E. coli e B. pertussis é semelhante. Em segundo lugar, podem excluir-se possíveis diferenças na conformação inicial das toxinas produzidas nos dois organismos dado que os procedimentos de purificação envolvem desnaturação completa em ureia 8 M.
Estes dados indicam que as actividades invasiva e hemolitica da toxina CyaA podem ser separadas. Tal sugere o envolvimento nas actividades invasiva e hemolitica de diferentes determinantes estruturais do interior da toxina CyaA. A diminuição da actividade hemolitica da toxina produzida em E. coli poderia também ser explicada por uma diferença na natureza das modificações pós-tradução que ocorrem em ambos os organismos ou pela presença de um factor adicional presente em B. pertussis que é necessário para conferir actividade hemolitica completa à toxina.
Construíram-se vectores de expressão que dirigem a expressão tanto do gene cyaA como do gene cyaC (Sebo et al., 1991). Adicionalmente, construiu-se outro vector de expressão de plasmídeo, pCACT3, que contém ambos os genes cyaA e cyaC. Este vector de expressão permite um segundo plasmídeo compatível transportando genes necessários para a excreção da 13 ΕΡ Ο 637 335/ΡΤ AC citotóxica em Ε. coli, tal como hlyB e hlyD tal como descrito em Meckman et al., 1985. O plasmídeo pCACT3 foi construído em várias etapas (consultar a figura 1): 1) construiu-se o plasmídeo pAHLl por inserção, entre os locais únicos PstI e EcoRI do plasmídeo pACM384, do oligonucleótido 5'CTG CAGG TCG ACT CTA GAG GAT CCC CGG GTA CCT AAG TAAC TAA GAA TTC3'; 2) subclonou-se o fragmento PvuII-EcoRI de 1,4 kb de pAHLl no local de clonagem múltipla do fagemídeo pTZ19R (Pharmacia) entre o local PstI (convertido para extremidades lisas com polimerase de T4) e o local EcoRI. O plasmídeo resultante é PACDL21; 3) inseriu-se um fragmento SclI-Scal de 5,4 kb originário do plasmídeo pACT7 (Sebo et al., 1991) entre os locais únicos Ecll-Scal de pACDL21 para originar o plasmídeo pDLACTl; 4) subclonou-se um fragmento Nael-Ddel de 0,636 kb do plasmídeo pDlA4 (Glaser et al., 1988) contendo o gene cyaC no local Smal do vector pTZl8R (Pharmacia) para originar o plasmídeo pCYACl no qual o gene cyaC está sob o controlo do promotor lac; 5) subclonou-se o fragmento HindIII-Scal de pDLACTl contendo o gene cyaA (6,2 kb) entre os locais HindIII e Seal de pCYACl para originar o plasmídeo pCACT3.
Assim, a toxina AC pode ser expressa em E. coli e/ou excretada por esta bactéria em grandes quantidades e é facilmente purificada (cromatografia de afinidade em resina CaM Affi-Gel).
Desenvolvemos uma metodologia que torna possível identificar rapidamente, utilizando uma selecção dupla (resistência a um antibiótico e ensaio calorimétrico em placas por complementação a) a inserção de oligonucleótidos (que mantêm o quadro de leitura) na porção do gene que codifica o domínio catalítico N-terminal da toxina. As consequências
funcionais destas mutações sobre a actividade catalítica da toxina podem ser facilmente analisadas genética (complementação funcional de uma estirpe cya- de E. coli) e bioquimicamente (caracterização da estabilidade das AC 14 ΕΡ Ο 637 335/ΡΤ modificadas, da sua actividade enzimática, da sua interacção com CaM, etc.)· Esta metodologia permitiu o rastreio de um elevado número de mutações de modo a identificar os locais que são potencialmente vantajosos para a inserção de determinantes antigénicos. Os plasmideos que foram utilizados para esta identificação foram derivados de pDIA5240 (P. Sebo, P. Glaser, H. Sakamoto e A. Ullman, Gene 1991, 104, 19-24, cujo conteúdo é aqui incorporado por referência) contendo os primeiros 459 codões do gene cyaA e que expressaram a porção N-terminal da AC (399 aminoácidos) desprovida de quaisquer actividades invasiva ou citotóxica.
Especificamente, ligou-se um fragmento PvuII-Bst de pDIA5240 incluindo 373 pb de codões de CyaA à porção do 3'-terminal do gene (3999 pares de bases - 1333 codões). A proteina resultante torna assim a adquirir, na presença do produto do gene cyac, o seu poder invasivo. Inseriram-se então sequências peptidicas adicionais de 10 a 20 aminoácidos nos locais previamente identificados de modo a analisar a citotoxicidade das toxinas recombinantes. Em concretizações especificas do presente invento esta inserção está em locais de restrição do gene cyaA. As toxinas modificadas que mantêm a sua citotoxicidade (ou seja, cujo domínio catalítico N-terminal é normalmente transportado para o citoplasma das células alvo) podem ser utilizadas como um veículo para apresentação de determinantes antigénicos. Consultar Ladant et al., 1992, cujos conteúdos são aqui incorporados por referência. Definimos deste modo cinco locais permissivos na porção N-terminal da AC (inserção entre os aminoácidos 137-138, 224-225, 228-236, 228-229, 235-236 e 317-318). Um mapeamento mais exaustivo permitirá que o perito na especialidade localize outros locais permissivos utilizando os métodos aqui descritos.
Desenvolvemos uma segunda metodologia (resistência a um antibiótico e ensaio de hemólise em placas de Petri contendo sangue) que permite inserções de oligonucleótidos em quadro de leitura na porção do gene que codifica para a porção C-terminal hemolítica da toxina a identificar. Estas inserções são efectuadas num plasmídeo que permite a co-expressão de ambos os genes cyaA e cyaC, tal como pCACT3. Consultar acima. A vantagem de caracterizar locais "permissivos" para a 15 ΕΡ Ο 637 335/ΡΤ inserção de sequências peptídicas adicionais na porção carboxilo-terminal da toxina reside no facto de, contrariamente ao domínio N-terminal, este domínio permanecer associado com a superfície exterior da membrana citoplasmática. Assim, epítopos inseridos nesta região da toxina podem ser dirigidos para a via de apresentação de antigénios específica para o MHC de classe II. Assim, podem construir-se toxinas que são duplamente modificadas - no domínio catalítico N-terminal e no domínio C-terminal - e capazes de apresentar tanto epítopos dirigidos contra o MHC de classe I como outros epítopos dirigidos contra o MHC de classe li.
A/ ADENILATO-CICLASES RECOMBINANTES QUE EXPRESSAM EPÍTOPOS HETERÓLOGOS: APLICAÇÕES EM VACINAS 1. Inserção de epítopos B ou T.
Utiliza-se a toxina AC de B. pertussis para apresentar epítopos com importância de vacinas ao sistema imunitário. Esta toxina recombinante pode ser utilizada como uma componente da vacina, sozinha ou na presença de outra(s) preparação(ões) antigénica(s). Pode ser utilizada na forma tóxica ou na forma desintoxicada. A forma desintoxicada pode obter-se por mutagénese dirigida. Por exemplo, por substituição de Lys58 ou Lys65 (Glaser et al., 1989, cujo conteúdo é aqui incorporado por referência) por um resíduo Gin. Alternativamente, a forma desintoxicada pode ser obtida por inserção do oligonucleótido CTG CAG no local EcoRV na posição 564 da fase de codificação do gene cyaA. Consultar Ladant et al., 1992.
Pode obter-se ADN que codifica o derivado de adenilato-ciclase de B. pertussis do invento, por exemplo, do seguinte modo.
Lineariza-se o plasmídeo pDIA5240 num local de restrição em que o ADN que codifica um epítopo heterólogo vai ser inserido. Em concretizações específicas do presente invento, o local de restrição é NruI quando o local permissivo é nos resíduos 137-138 ou nos resíduos 235-236. Noutras concretizações o local de restrição é HindIII quando o local permissivo está nos resíduos 224-225, nos resíduos 228-229 ou 16 ΕΡ Ο 637 335/ΡΤ nos resíduos 317-318. Ο derivado de pDIA5240 resultante contendo epítopo(s) heterólogo(s) num local permissivo é restringido com PvuII e BstBI. Isola-se um fragmento de 1,4 Kb contendo a porção do gene da adenilato-ciclase que codifica o domínio catalítico N-terminal e incluindo um epítopo heterólogo. 0 fragmento de restrição é então fundido ao remanescente do gene cyaA por inserção entre o local Hindlll (ligado a uma extremidade lisa por ADN-polimerase de T4) e o local BstBI de pCACT3. 0 epítopo heterólogo pode ser inserido em pDIA5240 como parte de um ligante que é compatível com um local permissivo apropriado. Em concretizações específicas do presente invento o ligante codifica cerca de 16 aminoácidos.
Qualquer epítopo reconhecido pelas células do sistema imunitário, linfócitos B ou T, pode ser introduzido nos locais permissivos da AC. Cada molécula de toxina pode incluir uma ou mais cópias do mesmo epítopo ou uma combinação de diferentes epítopos, B ou T, localizados em diferentes locais da toxina. 1.1 Epítopos B:
Qualquer epítopo reconhecido por linfócitos B e capaz de induzir anticorpos apresentando actividade biológica pode ser introduzido na toxina. Assim, por exemplo, o epítopo C3 de poliovírus ou o epítopo V3 do vírus VIH, que são capazes de induzir anticorpos neutralizantes desses vírus, serão introduzidos na toxina. Numa concretização preferida do presente invento, o epítopo V3 do vírus VIH a ser inserido é RIQRGPGRAFVTIGK (resíduos 315-329). No caso do epítopo V3, podem ser introduzidos em diferentes locais da toxina epítopos V3 correspondentes aos diferentes isolados do vírus.
De modo semelhante, podem preparar-se toxinas recombinantes apresentando outros epítopos do vírus VIH (e nomeadamente epítopos conservados). Cada molécula de toxina pode então apresentar epítopos B diferentes, na presença ou ausência de outros epítopos (e nomeadamente de epítopos T) . As preparações para vacinas podem incluir moléculas de toxina recombinante apresentando diferentes epítopos.
Alternativamente, estes epítopos podem ser expressos no interior de outras proteínas vector. Por exemplo, podem utilizar-se as duas proteínas de envelope de E. coli LamB e 17 ΕΡ Ο 637 335/ΡΤ
MalE. Quando ο epítopo é expresso à superfície de bactérias transformadas como parte da proteína da membrana externa LamB, é induzida uma resposta de anticorpos independente de células T caracterizada por uma indução rápida de anticorpos IgM e IgG. Contrariamente, quando o epítopo é expresso como parte da proteína periplasmática MalE, é induzida uma resposta de anticorpos dependente de células T pertencente à classe IgG. A imunização com as moléculas de toxina recombinantes e detecção de anticorpos é efectuada tal como descrito em Leclerc et al., 1991, que é aqui incorporado por referência. 1.2 Epítopos T auxiliadores (CD4+) :
As moléculas de toxina recombinante podem também ser utilizadas para apresentar epítopos reconhecidos por linfócitos T CD4+. Estes epítopos serão inseridos quer sozinhos quer em combinação com outros epítopos T ou B. Podem então inserir-se os epítopos T 103-116 de poliovírus, sozinhos ou em continuidade com o epítopo B 93-103, epítopos T do vírus VIH e nomeadamente o epítopo T incluído na ansa V3 ou o epítopo T do vírus da coriomeningite linfocítica incluído na região 118-132 da nucleoproteína. A sequência da região 118-132 da nucleoproteína do vírus da coriomeningite linfocítica é RPQASGVYMGNLTAQ.
A sequência do epítopo B 93-103 de poliovírus (epítopo C3) é: DNPASTTNKDK A sequência do epítopo T é: KLFAVWKITYKDT.
Para a geração de respostas T CD4+ auxiliadoras, os epítopos T serão preferencialmente inseridos na região C-terminal da toxina capaz de entrar na célula apresentadora por uma via de endocitose. Podem utilizar-se moléculas de toxina apresentando actividade de AC ou mutadas para perderem esta actividade, dependendo do tipo de resposta CD4+ pretendida. A molécula recombinante pode consistir num fragmento ou na proteína adenilato-ciclase completa que expresse epítopo(s) heterólogo(s). 18 ΕΡ Ο 637 335/ΡΤ 1.3 Detecção de respostas CD4+ após imunização com moléculas de adenilato-ciclase apresentando um ou mais epítopos T reconhecidos por linfócitos CD4+: imunizam-se animais, tais como ratinhos de diferentes estirpes, com as moléculas de toxina recombinante na presença de um adjuvante adequado tal como adjuvante completo de Freund, adjuvante incompleto de Freund ou hidróxido de alumínio. Duas semanas mais tarde, as respostas T CD4+ são determinadas pela proliferação de linfócitos (baço ou gânglios linfáticos de drenagem) cultivados com o péptido correspondente ao epítopo T inserido tal como descrito anteriormente. Consultar Fayolle, et al., 1991. Contrariamente, o reconhecimento por linfócitos de ratinhos imunizados com péptidos de moléculas de toxina recombinante in vitro é determinado por incorporação de timidina. Consultar Leclerc, et al. 1991. 1.4 Inserção de epítopos T reconhecidos por linfócitos T citotóxicos: A toxina AC apresenta a capacidade de entrar no citoplasma de células alvo. Tal torna possível entregar epítopos T reconhecidos por linfócitos T CD8+ ao citoplasma dessas células e permite a associação desses epítopos com moléculas do MHC de classe I. Constituem fontes de AC a espécie Bordetella, suas homólogas ou outros organismos que expressam AC. Em concretizações do presente invento, a adenilato-ciclase é uma AC dependente de calmodulina. Em concretizações específicas, a AC é AC de Bordetella pertussis. 1.5 Indução de células T citotóxicas:
Podem obter-se respostas T citotóxicas por imunização com toxina recombinante, sozinha ou na presença de um adjuvante tal como hidróxido de alumínio. As vias podem ser a via oral, a via subcutânea ou a via intramuscular. A toxina recombinante expressa um ou mais epítopos reconhecidos por células τ citotóxicas. Podem inserir-se na mesma molécula de toxina outros epítopos, nomeadamente epítopos reconhecidos por linfócitos T auxiliadores CD4+. A identificação de um epítopo como um epítopo CTL ou um epítopo T auxiliador é determinada experimentalmente. 19 ΕΡ Ο 637 335/ΡΤ
Como exemplo, inserimos no interior da toxina o epítopo 118-132 da nucleoproteína do vírus da coriomeningite linfocítica (Aichele, et al. 1990), que é simultaneamente um epítopo CTL e um epítopo τ auxiliador. A sequência de aminoácidos deste epítopo é: RPQASGVYMGNLTAQ. Podem inserir-se epítopos de outros agentes patogénicos e nomeadamente de VIH (epítopos CTL das proteínas env, gag, nef, etc.). Descrevem-se exemplos de epítopos adequados em Nixon et al., 1992, que é aqui expressamente incorporado por referência. Podem introduzir-se na mesma molécula de toxina vários epítopos que representam as sequências de diferentes isolados do vírus VIH. De igual modo, é possível utilizar uma mistura de moléculas de toxina recombinante apresentando cada uma um epítopo CTL correspondente a um determinado isolado do vírus VIH. 1.6 Detecção de respostas T citotóxicas:
Estimulam-se linfócitos obtidos de animais imunizados com a toxina recombinante durante 5 dias, com células singénicas revestidas com o péptido correspondente ao epítopo inserido ou na presença de uma toxina recombinante. A detecção de efectores T citotóxicos é efectuada tal como previamente descrito (Fayolle et al., 1991). As células alvo, marcadas com crómio 51 ( [51Cr]) e apresentado as moléculas de classe I compatíveis com as células efectoras, são primeiramente incubadas com o péptido correspondente ao epítopo CTL inserido na toxina recombinante. A resposta T citotóxica é estimada por libertação de [51Cr] pelas células alvo lisadas.
B/ ADENILATO-CICLASES RECOMBINANTES QUE EXPRESSAM EPÍTOPOS HETERÓLOGOS OU UM LIGANDO PARA UM DETERMINADO RECEPTOR: APLICAÇÕES EM IMUNOTOXINA A toxina AC recombinante pode ser utilizada para ter como alvo antigénios e receptores celulares. Seguidamente apresentam-se exemplos de várias construções que podem ser concretizadas: 1) construção de proteínas de fusão contendo os primeiros 1490 aminoácidos da AC (esta forma truncada da toxina é incapaz de ligação às células alvo e não é portanto tóxica), fundidos com um factor de crescimento tal como TGF-α (no qual o alvo é o receptor EGF), com IL-2, IL-4 ou IL-6 ou qualquer outra linfoquina, com regiões variáveis de anticorpos 20 ΕΡ Ο 637 335/ΡΤ apresentando uma forte afinidade para receptores ou antigénios a serem tomados como alvo, por exemplo, antigénios tumorais; 2) inserção de epitopos B na AC para tomar como alvo células B especificas ou inserção de qualquer outro ligando peptídico que reconhece receptores específicos; 3) construção de uma AC apresentando uma cisteína adicional na extremidade C-terminal da proteína, que permitirá que um polipéptido específico se funda com a AC por acoplamento químico. Deve recordar-se que a AC é uma proteína que não contém cisteína. A importância potencial da toxina AC de B. pertussís comparativamente com outras imunotoxinas reside no facto de que o envenenamento das células alvo pela AC é independente de um processo de endocitose mediado por receptores. Assim, qualquer marcador de superfície específico para uma determinada célula poderia servir como um receptor para ter como alvo a toxina AC recombinante incluindo a toxina AC truncada fundida com um ligando específico.
REFERENCIAS
Aichele, P., H. Hengartner, R.M. Zinkernagel e M. Schultz (1990), J. Exp. Med., 171, 1815-1820.
Barany, F. (1985a) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 82, 4202-4206 .
Barany, F. (1985b) Gene (Amst.) 37, 111-123.
Charbit, A., Ronco, J. Michel, V., Werts, C. e Hofnung, M. (1991) J. Bacteriol. 173, 262-275.
Fayolle, C., Deriaud, E., Leclerc, C. (1991) J. Immunol. 147, 4069-4073.
Freimuth, P.I. e Ginsberg, H.S. (1986) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A 83, 7816-7820.
Freimuth, P.I., Taylor, J.W., e Kaiser E.T. (1990) J. Biol. Chem. 265, 896-901.
Glaser, P., Ladant, D., Sezer, O., Pichot, F., Ullmann, A., e Danchin, A. (1988) Microbiol. 2, 19-30. 21 ΕΡ Ο 637 335/ΡΤ
Glaser,- Ρ., Ladant, D., Sezer, Ο., Pichot, F., Ullmann, A., e Danchin, A. (1989) EMBO J. 8, 967-972.
Glaser, P., Munier, H. Gilles, A.M. Krin, E., Porumb, T., Barzu, 0., Sarfati, R., Pellecuer, C., e Danchin, A. (1991) EMBO J 10, 1683-1688.
Hewlett, E.L., Gordon, V.M., McCaffery, J.D., Sutherland, W.M., e Gray, M.C. (1989) J. Biol. Chem. 264, 19379-19384.
Kumar, G.B., e Black, P.N. (1991) J. Biol. Chem. 266, 1348-1353.
Ladant, D., Glaser, P., Ullmann, A. (1992) J. Biol. Chem. 267, 2244-2250.
Leclerc, C., Charbit, A., Martineau, P., Deriaud, E.,
Hofnung, M. (1991) J. Immunol. 147, 3545-3552.
Meckman, N., Nicaud, J.H., Gray, L. e Holland, I.B. (1985) Mol. Gen. Genet. 201, 282-288.
Nixon, D.F., Broliden, V., Ogg, G. e Biolider, P.A. (1992), Immunology, 76:515-534.
Sebo, P., Glaser, p., Sakamoto, H., e Ullmann, A. (1991) Gene (Amst.) 104, 19-24.
Starzyk, R.M., Burbaum, J.J., e Schimmel, Ρ. (1989) Biochemistry 28, 8479-8484. LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE:
(A) NOME: INSTITUT PASTEUR (B) RUA: 25-28 rue du Dr. Roux (C) CIDADE: PARIS CEDEX 15
(E) PAÍS: FRANÇA (F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): 75724
(ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: MUTANTES RECOMBINANTES PARA INDUÇÃO DE
RESPOSTAS IMUNITÁRIAS ESPECÍFICAS (iii) NUMERO DE SEQUÊNCIAS: 6 22 ΕΡ Ο 637 335/ΡΤ (iv) FORMATO LEGÍVEL EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: Disquete
(B) COMPUTADOR: compatível com PC IBM
(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Version #1.25 (EPO) (v) DADOS DO PRESENTE PEDIDO: NÚMERO DE PEDIDO: PCT/EP93/00977 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 50 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1..6
(D) OUTRA INFORMAÇÃO: /label= PstI (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 7..12 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /label= Sall (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 13..18 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /label= Xbal (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 19..24
(D) OUTRA INFORMAÇÃO: /label= BamHI (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 24..30 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /label= Smal (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 28..33 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /label= Kpnl (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 1: CTGCAGGTCG ACTCTAGAGG ATCCCCGGGT ACCTAAGTAA CTAAGAATTC 50 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 48 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear 23 ΕΡ Ο 637 335/ΡΤ (ix) CARACTERÍSTICA: (Α) ΝΟΜΕ/CHAVE: misc_feature (Β) LOCALIZAÇÃO: 33..35 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /label= Stop (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_ feature (B) LOCALIZAÇÃO: 37..39 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /label= Stop (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_ feature (B) LOCALIZAÇÃO: 41..43 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /label= Stop (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 2: ACGTCCAGCT GAGATCTCCT AGGGGCCCAT GGATTCATTG ATTCTTAA 48 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 15 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 3:
Arg Ile Gin Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Vai Thr Ile Gly Lys 15 10 15 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 15 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 4:
Arg Pro Gin Ala Ser Gly Vai Tyr Met Gly Asn Leu Thr Ala Gin 15 10 15 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 11 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear 24 ΕΡ Ο 637 335/ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 5:
Asp Asn Pro Ala Ser Thr Thr Asn Lys Asp Lys 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 6:
Lys Leu Phe Ala Vai Trp Lys Ile Thr Tyr Lys Asp Thr 15 io
Lisboa,

Claims (24)

  1. ΕΡ Ο 637 335/ΡΤ 1/4 REIVINDICAÇÕES 1. Composição para induzir uma resposta imunitária, em que a referida composição inclui uma adenilato-ciclase recombinante obtida por expressão do gene cyaC da espécie Bordetella ligado operativamente a uma sequência de controlo da expressão e de um gene cyaA recombinante da espécie Bordetella que codifica uma adenilato-ciclase ligado operativamente a uma sequência de controlo da expressão, em que o referido gene cyaA contém pelo menos uma inserção de uma sequência de ADN heterólogo em pelo menos um local permissivo e em que a adenilato-ciclase está desprovida de actividade catalítica; e em que adicionalmente a referida expressão é efectuada numa célula hospedeira seleccionada do grupo de bactérias, células eucarióticas e leveduras.
  2. 2. Composição tal como reivindicada na reivindicação 1, em que a referida resposta imunitária é uma resposta imunitária de células T e a referida sequência de adn heterólogo é um epitopo T heterólogo.
  3. 3. Composição tal como reivindicada na reivindicação 1 ou na reivindicação 2, em que a referida adenilato-ciclase recombinante é parte de uma proteína de fusão incluindo uma linfoquina, nomeadamente uma linfoquina seleccionada do grupo que consiste em IL-2, IL-4 e IL-6.
  4. 4. Composição tal como reivindicada nas reivindicações 1 a 3, em que a referida célula hospedeira é E. coli.
  5. 5. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que a referida resposta imunitária é uma resposta imunitária de células B e a referida sequência de ADN heterólogo é um epitopo B heterólogo.
  6. 6. Composição da reivindicação 5, em que a referida composição inclui bactérias vivas que expressam o gene cyaC da espécie Bordetella e um gene cyaA recombinante da espécie Bordetella que codifica uma adenilato-ciclase, em que o referido gene cyaA contém pelo menos uma inserção de uma sequência de ADN heterólogo em pelo menos um local permissivo. ΕΡ Ο 637 335/ΡΤ 2/4
  7. 7. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que o gene cyaA é o gene cyaA de Bordetella pertussis.
  8. 8. Composição de acordo com a reivindicação 7, em que o gene cyaC é o gene cyaC de Bordetella pertussis.
  9. 9. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, em que os referidos genes cyaA e cyaC se encontram no plasmideo recombinante pCACT3 depositado na CNCM, com o número de acesso 1-1201 em 8 de Abril de 1992.
  10. 10. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em que a referida sequência de ADN heterólogo codifica menos de 25 aminoácidos.
  11. 11. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, em que o referido local permissivo é seleccionado do grupo que consiste em adn que codifica os resíduos 137-138 do produto génico do referido gene cyaA, ADN que codifica os residuos 224-225 do produto génico do referido gene cyaA, ADN que codifica os residuos 228-229 do produto génico do referido gene cyaA, ADN que codifica os residuos 235-236 do produto génico do referido gene cyaA e ADN que codifica os residuos 317-318 do produto génico do referido gene cyaA.
  12. 12. Composição de acordo com a reivindicação 11, em que o referido local permissivo é ADN que codifica os residuos 235-236 do produto génico do referido gene cyaA.
  13. 13. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, em que a referida sequência de ADN heterólogo codifica o epitopo C3 de poliovirus humano.
  14. 14. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, em que a referida sequência de ADN heterólogo codifica um epitopo de VIH.
  15. 15. Composição de acordo com a reivindicação 14, em que o referido epitopo é o epitopo V3 do vírus VIH. ΕΡ Ο 637 335/ΡΤ 3/4
  16. 16. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, em que a referida sequência de ADN heterólogo são os resíduos 118-132 da nucleoproteína do vírus da coriomeningite linfocítica.
  17. 17. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, em que o referido gene de adenilato-ciclase contém pelo menos uma inserção de uma sequência de ADN heterólogo nos resíduos de codificação do ADN 235-236 do produto génico do referido gene de adenilato-ciclase e em que a referida sequência de ADN heterólogo codifica o epítopo C3 de poliovírus humano ou um epítopo de vírus VIH.
  18. 18. Composição de acordo com a reivindicação 17, em que o referido epítopo é o epítopo V3 de VIH.
  19. 19. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, em que o referido gene de adenilato-ciclase contém pelo menos uma inserção de uma sequência de ADN heterólogo num local permissivo localizado numa sequência de ADN que codifica o domínio N-terminal do produto génico do referido gene cyaA.
  20. 20. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, em que o referido gene de adenilato-ciclase contém pelo menos uma inserção de uma sequência de ADN heterólogo num local permissivo localizado numa sequência de ADN que codifica o domínio C-terminal do produto génico do referido gene cyaA.
  21. 21. Composição tal como reivindicada na reivindicação 20, em que a referida sequência de ADN heterólogo que codifica um epítopo T de poliovírus ou um epítopo T de vírus VIH, nomeadamente um epítopo T auxiliador tal como um epítopo T V3 de vírus VIH ou ainda um epítopo T de vírus influenza.
  22. 22. Composição tal como reivindicada na reivindicação 21, em que o referido gene cyaA recombinante inclui uma segunda sequência de ADN heterólogo que codifica um epítopo seleccionado do grupo que consiste num epítopo de poliovírus, um epítopo de vírus VIH e um epítopo de vírus influenza. ΕΡ Ο 637 335/ΡΤ 4/4
  23. 23. Composição tal como reivindicada na reivindicação 20, em que o referido epitopo T é o epitopo T do virus da coriomeningite linfocitica incluído na região 118-132 da nucleoproteína do referido vírus da coriomeningite.
  24. 24. Composição tal como reivindicada na reivindicação 17, em que o referido gene cyaA inclui adicionalmente uma mutação que elimina a actividade catalítica do produto génico de cyaA. Lisboa,
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Families Citing this family (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7252829B1 (en) 1998-06-17 2007-08-07 Idm Pharma, Inc. HLA binding peptides and their uses
US7611713B2 (en) * 1993-03-05 2009-11-03 Pharmexa Inc. Inducing cellular immune responses to hepatitis B virus using peptide compositions
US20110097352A9 (en) * 1992-01-29 2011-04-28 Pharmexa Inc. Inducing cellular immune responses to hepatitis B virus using peptide and nucleic acid compositions
US9340577B2 (en) * 1992-08-07 2016-05-17 Epimmune Inc. HLA binding motifs and peptides and their uses
CA2685270C (en) * 1998-05-13 2014-07-29 Pharmexa Inc. Expression vectors for stimulating an immune response and methods of using the same
US20070020327A1 (en) * 1998-11-10 2007-01-25 John Fikes Inducing cellular immune responses to prostate cancer antigens using peptide and nucleic acid compositions
EP1200109A4 (en) * 1999-07-19 2005-06-15 Epimmune Inc USE OF PEPTIDE NUCLEIC ACID COMPOUNDS TO TRIGGER CELLULAR IMMUNE RESPONSES TO HEPATITIS C
US8128922B2 (en) * 1999-10-20 2012-03-06 Johns Hopkins University Superior molecular vaccine linking the translocation domain of a bacterial toxin to an antigen
AU1661201A (en) * 1999-11-18 2001-05-30 Epimmune, Inc. Heteroclitic analogs and related methods
US7026443B1 (en) * 1999-12-10 2006-04-11 Epimmune Inc. Inducing cellular immune responses to human Papillomavirus using peptide and nucleic acid compositions
AU2088701A (en) * 1999-12-10 2001-06-18 Epimmune, Inc. Inducing cellular immune responses to p53 using peptide and nucleic acid compositions
US20070098776A1 (en) * 1999-12-13 2007-05-03 Fikes John D HLA class I A2 tumor associated antigen peptides and vaccine compositions
CA2394741A1 (en) * 1999-12-21 2001-06-28 Epimmune Inc. Inducing cellular immune responses to prostate cancer antigens using peptide and nucleic acid compositions
US20040248113A1 (en) * 1999-12-28 2004-12-09 Alessandro Sette Method and system for optimizing multi-epitope nucleic acid constructs and peptides encoded thereby
US7462354B2 (en) * 1999-12-28 2008-12-09 Pharmexa Inc. Method and system for optimizing minigenes and peptides encoded thereby
FR2805544B1 (fr) * 2000-02-28 2004-07-16 Pasteur Institut Adenylcyclase recombinante et procede de tri de molecules a activite proteolytique utilisant cette adenylcyclase
JP2004508320A (ja) * 2000-09-08 2004-03-18 エピミューン　インコーポレイテッド ペプチドおよび核酸組成物を用いるｂ型肝炎ウイルスに対する細胞性免疫応答の誘導
ES2331348T3 (es) * 2000-09-15 2009-12-30 Pasteur Institut Vectores proteinicos para el suministro de moleculas a las celulas que expresan cd11b.
AU2007203473B2 (en) * 2000-09-15 2011-04-14 Centre National De La Recherche Scientifique Vectors for Molecule Delivery to CD11b Expressing Cells
US20040121946A9 (en) * 2000-12-11 2004-06-24 John Fikes Inducing cellular immune responses to her2/neu using peptide and nucleic acid compositions
DE10211063A1 (de) * 2002-03-13 2003-10-09 Axaron Bioscience Ag Neue Verfahren zur Detektion und Analyse von Protein-Interaktionen in vivo
US20070054262A1 (en) * 2003-03-28 2007-03-08 Baker Denise M Methods of identifying optimal variants of peptide epitopes
EP1644048B1 (en) 2003-05-05 2015-04-29 Johns Hopkins University Anti-cancer dna vaccine employing plasmids encoding signal sequence, mutant oncoprotein antigen, and heat shock protein
EP1489092A1 (en) * 2003-06-18 2004-12-22 Institut Pasteur Modified Bordetella adenylate cyclase comprising or lacking CD11b/CD18 interaction domain and uses thereof
WO2005035557A2 (en) * 2003-10-14 2005-04-21 The Provost, Fellows And Scholars Of The College Of The Holy And Undivided Trinity Of Queen Elizabeth, Near Dublin Adenylate cyclase in the treatment and/or prophylaxis of immune-medicated disease
US20070026022A1 (en) * 2004-11-19 2007-02-01 Gilles Dadaglio Recombinant adenylate cyclase toxin of Bordetella induces T cell responses against tumoral antigens
EP1716415A1 (en) * 2003-11-21 2006-11-02 Institut Pasteur Recombinant adenylate cyclase of bordetella sp. for diagnostic and immunomonitoring uses, method of diagnosing or immunomonitoring using said recombinant adenylate cyclase, and kit for diagnosing or immunomonitoring comprising said recombinant adenylate cyclase
WO2005053738A1 (en) * 2003-11-21 2005-06-16 Institut Pasteur Recombinant adenylate cyclase toxin of bordetella induces t cell responses against tumoral antigens
PL1576967T3 (pl) 2004-03-18 2008-03-31 Pasteur Institut Rekombinowane białko niosące epitopy ludzkiego wirusa brodawczaka wstawione w białko cyklazy adenylanowej lub jego fragment oraz jego zastosowania terapeutyczne
AU2005250170A1 (en) * 2004-06-01 2005-12-15 Genimmune N.V. Peptides for inducing a CTL and/or HTL response to hepatitis C virus
US20060286613A1 (en) * 2004-11-19 2006-12-21 Claude Leclerc Recombinant adenylate cyclase of Bordetella sp. for diagnostic and immunomonitoring uses, method of diagnosing or immunomonitoring using said recombinant adenylate cyclase, and kit for diagnosing or immunomonitoring comprising said recombinant adenylate cyclase
WO2010002478A2 (en) 2008-07-03 2010-01-07 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Glycopeptide and uses thereof
CA2674269C (en) * 2006-01-03 2018-06-12 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Three component glycolipopeptides
US20100291042A1 (en) 2007-05-03 2010-11-18 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Multipotent stem cells and uses thereof
ES2331271B1 (es) * 2007-06-29 2010-10-14 Universidad Del Pais Vasco Metodo para la internalizacion de bacterias no invasivas en celulas eucariotas.
US20120128684A1 (en) 2008-08-25 2012-05-24 Burnham Institute For Medical Research Conserved Hemagglutinin Epitope, Antibodies to the Epitope and Methods of Use
DK2233569T3 (da) 2009-03-23 2014-10-06 Inst Of Microbiology Of The Ascr V V L Mutante CyaA-polypeptider og polypeptidderivater egnet til at levere immunogene molekyler i en celle
CN102439146A (zh) 2009-03-23 2012-05-02 巴斯德研究院 适合将免疫原性分子递送到细胞中的突变CyaA多肽及多肽衍生物
EP2550362B1 (en) 2010-03-25 2017-01-04 Oregon Health&Science University Cmv glycoproteins and recombinant vectors
EP2478915A1 (en) 2011-01-24 2012-07-25 Genticel CyaA-carried polypeptide(s) and use to induce both therapeutic and prophylactic immune responses
CA2832109C (en) 2011-06-10 2021-07-06 Oregon Health & Science University Cmv glycoproteins and recombinant vectors
EP2568289A3 (en) 2011-09-12 2013-04-03 International AIDS Vaccine Initiative Immunoselection of recombinant vesicular stomatitis virus expressing hiv-1 proteins by broadly neutralizing antibodies
US9402894B2 (en) 2011-10-27 2016-08-02 International Aids Vaccine Initiative Viral particles derived from an enveloped virus
EP2679596B1 (en) 2012-06-27 2017-04-12 International Aids Vaccine Initiative HIV-1 env glycoprotein variant
EP2848937A1 (en) 2013-09-05 2015-03-18 International Aids Vaccine Initiative Methods of identifying novel HIV-1 immunogens
US10058604B2 (en) 2013-10-07 2018-08-28 International Aids Vaccine Initiative Soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers
EP3069730A3 (en) 2015-03-20 2017-03-15 International Aids Vaccine Initiative Soluble hiv-1 envelope glycoprotein trimers
EP3072901A1 (en) 2015-03-23 2016-09-28 International Aids Vaccine Initiative Soluble hiv-1 envelope glycoprotein trimers
EP3323426A1 (en) 2016-11-17 2018-05-23 Ecole Nationale Vétérinaire de Toulouse Immunogenic and vaccine compositions for use against bordetella bronchiseptica infection
WO2018091613A1 (en) 2016-11-17 2018-05-24 Ecole Nationale Vétérinaire de Toulouse Immunogenic and vaccine compositions for use against bordetella bronchiseptica infection

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5182211A (en) * 1987-08-07 1993-01-26 Institut Pasteur Plasmid vectors encoding a protein of a picornavirus
US5312902A (en) * 1988-06-09 1994-05-17 Institut Pasteur Dimer of the precursor of HIV-2 envelope glycoprotein
FR2638169B1 (fr) * 1988-10-25 1991-01-11 Pasteur Institut Derives d'adenyl cyclase et leurs utilisations biologiques
DE69019609T2 (de) * 1989-07-07 1995-11-30 Takeda Chemical Industries Ltd Proteine und deren Herstellung.
NO175188C (no) * 1990-06-27 1994-09-14 Sjur Olsnes Fremgangsmåte for fremstilling av et peptidkonjugat med evne til å trenge inn i cellecytosol

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CA2133999A1 (en) 1993-10-28
EP1715047A2 (en) 2006-10-25

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