PT673390E - Genes semelhantes a delta expressos em tumores neuroendocrinos - Google Patents

Description

DESCRIÇAΟ

"GENES SEMELHANTES A DELTA EXPRESSOS EM TUMORES NEUROENDOCRINOS"

Antecedentes da invenção A expressão dos genes durante o desenvolvimento de uma célula pluripotente ou progenitora numa célula madura diferenciada pode providenciar um contexto para o estudo de células tumorigénicas cuja origem é derivada de tais células progenitoras. Em certos tumores hematopoiéticos ou epiteliais, a expressão do gene maligno correlaciona-se substancialmente com a expressão observada durante o desenvolvimento normal do tecido a partir do qual se origina o tumor, Gordon e outros, J. Cell. Biol. 108: 1187 (1989); Godal e outros, Adv. Gancer Res. 36: 211 (1982). De facto, muitas actividades biológicas de células progenitoras, incluindo migração celular e remodelação dos tecidos, assemelham-se às actividades patológicas das células de cancro, tal como metásteses e invasão tumoral. O neuroblastoma, um tumor na glândula adrenal o qual afecta pessoas durante a infância precoce, é outro sistema no qual o tumor se correlaciona biologicamente com aquele da diferenciação normal e morfogénese das suas células progenitoras (neurobiasto). O neuroblastoma é um tumor embrionário que exibe uma histopatologia quer indiferenciada quer diferenciada. O desenvolvimento de tumores neuroblastomas apresenta fases identificáveis durante a histogénese do seu tecido de origem, a medula adrenal. Cooper e outros, Cell Growth ADN Diff. 1: 149 (1989).

Durante o desenvolvimento dos neuroblastos da medula adrenal humana em células de cromafma maduras, quatro genes individuais são expressos numa sequência padrão. Uma vez o neurobiasto induzido diferencia-se ao longo da via neuroendocrina, os estados progressivos da maturação da cromafma são marcados por uma expressão temporal dos genes indicados TH, CGA, pG2 e B2M (Cooper, supra na página 153). 2

Cooper descobriu que a expressão dos genes padrão destes quatro marcadores nas células de neuroblastoma imita o do neuroblasto adrenal normal aprisionado durante três fases diferentes do desenvolvimento.

Um destes genes marcadores, pG2, foi primeiro identificado num feocromocitoma, um tumor da medula adrenal adulta (Helman e outros, PNAS USA 84: 2336 (1987)). Helman relatou que o pG2 também é altamente expresso nas células adrenais humanas normais.

Helman isolou um cADN com o comprimento completo de uma biblioteca de cADN adrenal humano, e identificou a proteína pG2 correspondente contendo 286 aminoácidos, tendo um peso molecular previsto de 30,6 kilodaltons (kDa) (Helman e outros, Nucleic Acids Res. 18 (3) : 685 (1990)).

Um gene tendo expressão reguladora do desenvolvimento, paralelamente à da pG2, será útil para a detecção do feocromocitoma ou neuroblastoma por métodos genéticos, especialmente desde que a expressão de pG2 é restrita à glândula adrenal do tecido não maligno.

Sumário da invenção É por conseguinte um objectivo da presente invenção providenciar uma molécula polinucleótida recentemente isolada, dlk, a qual pode ser empregue em ensaios genéticos para providenciar um método para a detecção de um feocromocitona ou neuroblastoma primário, ou secundário, ou identificação de uma fase destes tumores. É também um objectivo da presente invenção providenciar um método para a detecção primária ou secundariamente de pequenas células de carcinoma no pulmão (a seguir, SCLC) ou para fasear a progressão do tumor de SCLC, a qual emprega moléculas polinucleótidas dlk em ensaios genéticos. É um outro objectivo providenciar uma molécula polinucleótida, designada dlk, a qual codifica um polipéptido Dlk correspondente. Os polipéptidos Dlk são úteis para 3

gerarem anticorpos monoclonais ou policlonais tendo especificidade para um epitope de um polipéptido Dlk.

Anticorpos específicos Dlk, e em particular anticorpos específicos Dlk monoclonais marcados, são úteis para a detecção de tumores neuroendocrinos primários ou secundários. De acordo com a presente invenção, anticorpos monoclonais específicos Dlk conjugados com uma toxina são também úteis para o tratamento de tumores neuroendocrinos primários ou secundários.

Para a realização destes e de outros objectivos da invenção, foi providenciado, de acordo com um aspecto da presente invenção, uma molécula polinucleótida isolada compreendendo uma sequência de ADN codificando um polipéptido Dlk.

Um objectivo da presente invenção é providenciar um polipéptido Dlk isolado constituído essencialmente por uma sequência de aminoácidos demonstrada na Figura 1B, ou na Figura 1 A.

Outro objectivo da presente invenção é providenciar uma molécula polinucleótida isolada a qual codifica um polipéptido Dlk humano ou de murganho constituído essencialmente pela sequência de aminoácidos demonstrada na figura 1B ou 1 A, respectivamente.

Um outro objectivo da invenção é providenciar um método para a detecção de um tumor o qual expressa dlk, incluindo os passos de contacto do ARN a partir de uma amostra com suspeita de ser tumorigénica com uma molécula polinucleótida dlk, sob condições que permitam a hibridização entre a molécula polinucleótida dlk e a amostra, e detecção da hibridização entre a molécula polinucleótida e a amostra. E ainda um outro objectivo da invenção providenciar um método para detecção de uma pequena célula de carcinoma do pulmão, incluindo os passos de contacto do ARN de uma amostra de células epiteliais bronquicas suspeitas de serem tumorigénicas com moléculas polinucleótidas dlk, sob condições que permitam a hibridização entre

moléculas polinucleótidas dlk e a amostra, e detecção da hibridizaçâo entre as moléculas polinucleótidas e a amostra.

Breve Descrição dos Desenhos A Figura 1 mostra um alinhamento das sequências de aminoácidos Dlk de murganho (Figura IA) e humano (Figura 1B). Aminoácidos idênticos são representados pelo símbolo (: ). Aminoácidos semelhantes são indicados por (Λ) e classificados nos seguintes grupos: A, S&T; D&E; N&Q; R&K; I, L, M&V; e F, Y&W. Potenciais locais biologicamente significativos encontrados na base de dados PROSITE (acessível comercialmente através da Intelligenetics Inc.(Mountain View, CA)), são indicados pelos números : 1. local da N-glicosilação; 2. local da fosforilação da proteína Quinase C; 3. local da N-miristilação; 4. local da hidroxilação do ácido aspártico e asparagina. Potenciais locais de clivagem no péptido assinalado são indicados por (*). A Figura 2 mostra uma sequência de ADN dlk humano. A Figura 3 mostra a sequência de ADN dlk de murganho. A Figura 4 mostra um alinhamento de uma sequência consensual de repetições semelhantes a de dlk repetição EGF encontradas em vários genes homeóticos de invertebrados. Como descrito no Exemplo 4, uma sequência consensual de repetições do tipo EGF de dlk foi obtida por alinhamento de doze repetições do tipo EGF de dlk quer de humano quer de murganho. Esta sequência consensual foi então alinhada com as sequências consensuais de vários genes homeóticos de invertebrados (obtidos de modo semelhante) e EGF de murganho.

Descrição Detalhada das Formas de Realização Preferidas

Uma molécula polinucleótida humana, dlk, e um polipéptido humano correspondente Dlk, codificados por dlk, foram descobertas, isolados e caracterizados. Descobriu-se que a molécula polinucleótida dlk humana era expressa no feocromocitoma, neuroblastoma, e tumores SCLC. A proteína Dlk tem cerca de 383 aminoácidos de comprimento e tem um peso molecular de cerca de 42 kDa. Para além da dlk humana, outras moléculas polinucleótidas pertencendo à família dlk são providenciadas de acordo com a invenção, incluindo dlk 0

IS de murino (Figura 3) e uma variante de dlk humana, isolada a partir da placenta como aqui descrito.

De acordo com a presente invenção, moléculas polinucleótidas isoladas ou fragmentos das mesmas pertencendo à família dlk são úteis na detecção de cancros SCLC e neuroendocrinos. A expressão de padrões de dlk pode ser explorada quer para (1) detectar células tumorais primárias ou secundárias pela presença de dlk e (2) para diagnosticar o grau de um tumor que expressa dlk, pela medição do nível da expressão de dlk. A dlk é uma proteína transmembranar tendo uma expressão padrão, em tecidos normais não fetais, o qual é restrita à glândula adrenal. Como uma consequência disto, a Dlk é um alvo prontamente acessível para a visualização do anticorpo e para terapêutica de tumores SCLC, feocromocitoma e neuroblastoma. De acordo com a presente invenção, anticorpos com especificidade para a proteína Dlk são feitos e empregues para detectar ou tratar células que produzem a proteína Dlk. O cADN de dlk humano compreende uma molécula polinucleótida com a sequência representada na Figura 2, como determinado por análise da sequência nucleótida. A grelha de leitura aberta, 174 (ATG) - 1322 (TAA) nucleótidos, tem 1 149 nucleótidos de comprimento. A molécula polinucleótida dlk de murganho compreende uma sequência dé ADN com uma grelha de leitura aberta, 134 (ATG) - 1288 (TAA) nucleótidos, de 1 155 nucleótidos, como demonstrado na Figura 3. A proteína Dlk de murino tem cerca de 385 aminoácidos e tem um peso molecular de cerca de 42 kDa.

De acordo com a presente invenção é identificada, uma variante de Dlk humana na qual um aminoácido é eliminado. Um cADN codificando “a variante Dlk” no qual o aminoácido número 347 da sequência de aminoácidos representada na Figura 1 (B) é eliminado, foi isolado a partir de uma biblioteca de cADN humano placentário total. O aminoácido na posição 347 ocorre num domínio intracelular da proteína. A biblioteca placentária contendo a variante dlk também contém quantidades substanciais da forma não variante, isto é, da molécula polinucleótida dlk apresentada na Figura 1 B. 6

A molécula polinucleótida dlk foi identificada por análise de produtos com expressão cADN de linhas SCLC humanas (hSCLC) os quais foram responsáveis pela estimulação com o ligante, péptido libertador de gastrina (GRP), um neuropéptido implicado na libertação de gastrina através da sua interacção com proteína G acoplada ao receptor, receptor GRP. O GRP (péptido) é um mitogene quer para células epiteliais normais do pulmão quer para células SCLC e para fibroblastos de murino Swiss 3T3.

As linhas hSCLC correspondentes ao GRP foram comparadas com linhas de células de fibroblasto de murino que eram correspondentes de modo diferencial a GRP. Esta aproximação, como detalhado no Exemplo 1, produziu uma molécula de cADN com comprimento parcial que hibridizou um mARN de 1,6 kb ambos expressos nos fibroblastos correspondentes e linhas SCLC correspondentes. Uma biblioteca de cADN de fibroblasto Swiss 3T3 disponível comercialmente foi varrida com o cADN de comprimento parcial, o qual produziu vários clones com inserções de 1,6 kb, que foram então sequenciadas.

Uma pesquisa por computador efectuada às bases de dados “Swiss-prot” e “NBRF Protein” descrita por Devereux e outros, Nuc. Acids Res. 12(1) : 387 (1984), indicou um elevado grau de homologia entre Dlk e proteínas codificadas por vários genes homeóticos, identificados no Exemplo 3. Os genes homeóticos são genes reguladores do controlo do desenvolvimento que dão identidade espacial a grupos de células no que respeita às suas características morfogénicas. Em organismos segmentados, por exemplo, são requeridos genes homeóticos para a morfogénese adequada de uma região distinta (tal como uma perna, ou antena) e agem através do controlo das actividades de outros genes durante o desenvolvimento. A proteína Dlk da presente invenção exibiu maior homologia com a proteína Delta, um lugar geométrico neurogénico envolvido na diferenciação neural normal na Drosophila. Assim, a presente proteína foi designada “Dlk” por ser “semelhante a delta”.

As sequências da proteína Dlk de murganho e humana partilham 86,2 % de identidade bem como muitos locais potenciais de importância biológica, incluindo 6 factores de crescimento epidérmicos repetições do tipo EGF, um domínio transmembranar e um 7

domínio péptido assinalado na terminação amino. Baseado nesta características estruturais, a dlk parece ser um novo membro da família de genes neurogénicos do tipo EGF da Drosophila, que estão envolvidos nas decisões de desenvolvimento da ectoderme embrionária para se diferenciar em células epidérmicas ou neuronais. A expressão padrão de dlk e a sua sequência homóloga com proteínas homeóticas tem implícito que a noção que a dlk funciona ao longo da diferenciação para células da linhagem de cromafina. Como explicado detalhadamente no Exemplo 2, dlk é expresso nas células de feocromacitoma primário e secundário e neuroblastoma, e na medula adrenal humana normal (não histopatológica) e células placentárias. De acordo com a presente invenção, o SCLC e neuroblastoma são os únicos tumores conhecidos por expressarem dlk como uma função da diferenciação.

Uma dlk isolada, variante dlk, e dlk polinucleótida de murino e produtos proteicos são empregues em métodos diagnósticos (aqui descritos a seguir) e são feitos de acordo com a descrição que se segue. As técnicas e aplicações aqui descritas a seguir para a molécula polinucleótida de dlk (ADN, ARN) e proteínas Dlk tencionam ser úteis para ADN, ARN e proteína de murino, e também para a variante - dlk.

Um polipéptido dlk, de acordo com a presente invenção, é produzido por técnicas de ADN recombinante, tais como aquelas descritas por Maniatis e outros, MOLECULAR CLONING - A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory (1982). Métodos aplicáveis especifícamente para clonar a molécula polinucleótida dlk são descritos no Exemplo 1. A molécula polinucleótida dlk da Figura 1B pode ser clonada em vectores de expressão aceitáveis e expressa em sistemas de expressão procarioticos, insectos e eucarióticos, incluindo Baculovirus ou E. coli (Boehringer Manheim). Usando técnicas convencionais, pode por conseguinte ser obtida uma sequência polinucleótida codificando uma proteína Dlk, como um cADN a partir de mARN de uma medula adrenal comercial ou de uma biblioteca de fibroblasto 3T3Swiss, ou de linhas de células de SCLC, de neuroblastoma ou de feocromocitoma. O mARN pode ser convertido em 8

ADN duplamente torcido usando técnicas de clonagem bem conhecidas na técnica, incluindo técnicas baseadas em PCR. Podem ser adicionados ligantes ou caudas nas extremidades por ADN duplamente torcido para providenciar locais de restrição convenientes. Após a digestão por enzima de restrição, o ADN pode ser introduzido num vector de clonagem, tal como um plasmideo, que foi digerido com uma enzima de restrição que gera extremidades compatíveis apropriadas. Um vector plasmideo aceitável neste contexto é pGEX- λ (Phamarcia). Na seguinte ligação, por meio das técnicas padrão, o ADN é introduzido na célula, onde a sua expressão produz a proteína desejada.

Alternativamente é produzida um polipéptido Dlk usando um “kit” de translação in vitro disponível comercialmente a partir de NEN (Boston, MA), como detalhado no Exemplo 1. Este “kit” emprega um sistema de translação (incluindo ribossomas, polimerases, aminoácidos, etc.) derivados de lisados de reticulocitos do coelho. O termo “isolado”, no que respeita à molécula polinucleótido dlk indica que tal molécula é livre de proteínas com as quais está normalmente associada, tal como histonas. Uma forma isolada da dlk está substancialmente livre de outro ADN que não funciona para regular, promover, aumentar ou por outro lado modular a sua expressão. O termo “isolado” no que diz respeito à proteína Dlk, conota um polipéptido que é livre de outras proteínas com as quais está normalmente associado.

Uma molécula polinucleótida dlk isolada é útil para a detecção de SCLC primário e expansão metastasica do SCLC e outros cancros neuroendocrinos. Mais especificamente, a presente invenção providencia um método de detecção do tumor que inclui os passos de contacto de uma amostra suspeita de conter um tumor com uma molécula polinucleótida dlk, e detecção da expressão de produtos polinucleótidos dlk (ADN, ARN, mARN) em células não adrenais. Detecção de um produto polinucleótido dlk identifica as células como células metastásicas (tumor secundário) de neuroblastoma, feocromocitoma ou SCLC, ou como um tumor primário de SCLC. A capacidade para detectar células expressando dlk é útil quer para a detecção de tumores quer para identificação de tumores. Após detecção da expressão de dlk, um tipo de tumor é determinado pela detecção quer de um marcador especifico do tumor, morfologia especifica do tumor, quer pela apresentação pelo paciente de uma patologia clinica que é distintamente associada com qualquer dos tumores seleccionados do grupo incluindo neuroblastoma, feocromocitoma ou SCLC. Por exemplo é reconhecida uma informação, tal como a identificação de um marcador celular, característica histológica ou sintoma de doença que é especifico para um dos tumores de neuroblastoma, feocromocitoma ou SCLC.

Se a expressão de dlk é detectada nas células de uma amostra retirada de tecido epitelial bronquico ou tecido removido do pulmão, a observação identifica um SCLC primário. E preferível que um segundo passo de confirmação da origem das células tumorais expressando dlk detectadas como SCLC seja realizado por detecção de um marcador, característica histológica, ou apresentação de um sintoma distinto associado com este tumor. Por exemplo é detectada, a histologia de uma célula “oat” vulgarmente associada com SCLC para confirmar a presença do SCLC. A expressão de dlk é detectada por hibridização com um polinucleótido dlk explanador. Este método inclui os passos de contacto da amostra suspeita de tumor com uma molécula polinucleótida dlk, detecção da hibridização entre a molécula polinucleótida e a amostra. Um sinal de hibridização positivo indica que a amostra é de origem tumoral.

Uma molécula polinucleótida ou “exploradora dlk” usado para detectar a expressão dlk é um fragmento marcado de dlk, ou preferencialmente uma molécula de ADN dlk de comprimento completo que hibridizará com mARN ou ADN' a partir de células tumorais neuroendocrinas e adrenais normais. São preparados exploradores complementarmente a dlk por métodos convencionais, e é permitido preferencialmente que hibridizem com ARNm ou ADN, usando técnicas de hibridização uin situ” convencionais. O explorador não hibridizado é removido por digestão da nuclease.

As técnicas de hibridização “in situ” que são conhecidas na técnica poderrr empregar o uso de marcadores por fluorescência e radiomarcadores que podem facilmente ser quantificados por microscopia de fluorescência ou auto-radiografia, respectivamente. Geralmente são preferidos os marcadores por fluorescência. Outra técnica de marcação pode empregar terminações enzimáticas que originam sinais clorimétricos ou de quimiluminiscência facilmente quantificáveis. A intensidade de hibridização detectada nestes processos reflecte a quantidade de dlk dentro da amostra biológica. O polinucleótido dlk da invenção pode ser empregue como um explorador nos processos de manchas (“Northern”) do ARN. De acordo com este método, o ARN é primeiro isolado do tecido por qualquer um dos procedimentos padrão (Lehrach. H., Biochemistry, 16 : 4 734 (1975)). A amostra de ARN é então sujeita a desnaturação por electroforese em gel e é transferido para uma membrana de nitrocelulose ou outra matriz de suporte sólida. O mARN da dlk pode ser detectado por hibridização ou marcação radioactiva ou não radioactiva da dlk, ou fragmentos de dlk, preferencialmente sob condições de elevada pressão como será familiar para aqueles vulgarmente peritos na técnica. A quantidade de hibridização pode ser quantificada por densiometria. E ainda, numa outra forma de realização da presente invenção, a reacção em cadeia da polimerase (“PCR”) é usada para detectar ADN dlk e mARN numa amostra. Para realizar a PCR, é empregue um par de polinucleótidos primários específicos da sequência dlk* que hibridizam em cordões opostos ao gene dlk nas posições que se repelem na dupla hélice. Tais primários, retirados das sequências polinucleótidas de dlk providenciam de acordo com a invenção, fragmentos representativos que são preferencialmente únicos para dlk, por exemplo, sequências com baixa homologia com outras proteínas para além de Dlk. Dois exemplos de sequências primárias especificas dlk úteis neste contexto incluem as seguintes sequências, que codificam uma porção da região intra-celular de Dlk: 5'- CAA GCC CGA GTT CAC AGG TC - 3' 5'- TCG GGG AAG ATG TTG AC-3' 11

outros pares de primários também podem ser seleccionados e utilizados.

Os primários providenciam pontos de iniciação para a síntese de ADN. Na presença de polimerase do ADN, dos quatro trifosfatos desoxinucleótidos (“dNTPs”) e de outros co-factores necessários, todos bem conhecidos na técnica são sintetizadas novos cordões de ADN complementarmente com os moldes que hibridizaram com os primários. São levadas a cabo várias sequências de síntese, com permissão para a desnaturação dos produtos com duplo enrolamento entre as sequências. Preferencialmente, é utilizada uma polimerase do ADN termicamente estável de modo que não é necessário adicionar mais enzima por cada sequência de síntese. A PCR produz um produto de amplificação do duplo enrolamento de ADN que tem a mesma sequência que o cordão original do ADN de dlk definido pelas extremidades das sequências de pares de primários. A quantidade de produto PCR indica a quantidade de ÀDN dlk ou mARN dlk na amostra. O produto pode ser detectado por uma variedade de métodos bem conhecidos na técnica. Os produtos PCR podem ser resolvidos por agarose ou electroforese em poliacrilamida e detectados por corante fluorescente, tal como brometo de etidium. De modo alternativo, um dos dNTP(s) pode ser marcado e os produtos PCR podem ser determinados medindo a incorporação do dNTP marcado. Uma variedade de outros métodos para resolver, detectar e quantificar produtos PCR são bem conhecidos por aqueles vulgarmente peritos na técnica. O PCR pode ser tornado especifico quer para ADN dlk ou mARN dlk. Por exemplo, pode ser usada ARNase, ou ADNase para remover um molde ou a outra forma da amostra, e o uso dos primários que distingue entre o gene e a mensagem, por exemplo, um primário que hibridiza com uma sequência na região não transcrita do promotor será especifico para o gene dlk, e não para o mARN dlk.

Outras técnicas aceitáveis para os métodos reivindicados são facilmente evidentes para os peritos na técnica e podem incluir Ensaios de Protecção da Nuclease, ELISA e manchas Western. Várias técnicas de ensaios que são baseadas em reacções imunológicas entre antigenes e anticorpos estão contemplados pela invenção. Em particular, ensaios que usam anticorpos com especificidade para proteína Dlk são úteis para detectar células que produzem proteínas Dlk. i

Anticorpos com especificidade para células expressando Dlk são obtidos imunizando um animal com a proteína Dlk. Neste contexto, o termo “anticorpo” engloba ambos os anticorpos monoclonais e policlonais. Um tal anticorpo pode pertencer a qualquer classe de anticorpos (IgG, IgM, IgA, etc.). De acordo com a presente invenção um polipéptido Dlk inteiro é injectado num animal com o propósito de obtenção de anticorpos policlonais ou para obtenção de linfócitos ou células do baço para produção de anticorpos monoclonais.

As técnicas gerais de produção de anticorpos monoclonais (Mab), tal como aquelas descritas por Kohler e Milstein, Nature 256 : 495 (1975), são aplicadas para produzir um anticorpo monoclonal com especificidade para a proteína Dlk. Este procedimento inclui os passos de isolamento dos linfócitos de um animal que foi sensibilizado ou injectado com polipéptido Dlk, fundindo-os com um parceiro mielona para produzir hibridomas, varrendo então os hibridomas para a produção de “anticorpos anti-Dlk” que exibem especificidade de ligação para um polipéptido Dlk. O termo “anticorpo” também engloba fragmentos, como Fab e F(Ab')2, de anticorpos anti-Dlk, e conjugações de tais fragmentos, e as também chamadas “proteínas de ligação a anti-genes” (anticorpos de cadeia simples) que são baseados em anticorpos anti-Dlk, de acordo, por exemplo, com a patente dos Estados Unidos n0 4 704 692 o conteúdo da qual é aqui incluído Como referência. De modo alternativo, Mabs ou fragmentos do mesmo podem ser produzidos através da expressão de genes que codificam várias regiões de um tal MAb em células hospedeiras tais como E. Coli, ver por exemplo, Ward e outros , Nature 341 : 544-546 (1989) ou células de mieloma de murino transfectadas. Ver Verhoyen e outros, BioAssays 8 : 74 (1988); Gillies e outros, Biotechnol. 7 : 799-804 (1989); Nakatani e outros; Biotechnol. 7 : 805-10 (1989).

Ensaios nos quais são empregues os anticorpos acima podem incluir ensaios imunoabsorventes ligados a enzima (ELISAs), rádio-imuno-ensaios, 13 Π imunoelectroforose, e semelhante. Também útil para diagnóstico são técnicas imunohistoquímicos que empregam anticorpos monoclonais de reactividade conhecida.

De acordo com este aspecto da presente invenção, a amostra é obtida de uma pessoa para detectar: (1) uma pequena célula de carcinoma no pulmão, removendoo fluido orgânico ou tecido suspeito de conter um tumor, tal como células epiteliais alveolares, bronquicas ou respiratórias obtidas de uma lavagem bronquica, aspirados nasofaringeos, exffegado da garganta e semelhante; (2) um tumor neuro-endocrino metastisado, por biópsia, tirado do tecido, diferente da glândula adrenal (incluindo córtex e medula). Podem ser realizados estudos imunohistoquímicos em tais células usando um anticorpo monoclonal especifico para Dlk.

Aplicações em diagnósticos destes anticorpos são exemplificados, de acordo com a presente invenção, pelo uso de um “kit” contendo um anticorpo anti-Dlk, que conduz uma reacção com uma amostra biológica para detectar a proteína Dlk. Uma tal reacção envolve a ligação do anticorpo anti-Dlk como antigene Dlk, sob condições que permitam a ligação. A observação de um complexo anticorpo-antigene numa amostra biológica indica um resultado positivo. Um “kit” deste tipo pode ser usado para detectar a extensão da expressão de Dlk numa amostra biológica particular de um indivíduo, animal ou linha de células.

Um tal “kit” de imunodiagnóstico pode incluir um anticorpo anti-Dlk e um receptáculo para conter o anticorpo numa forma esterilizada. O “kit” pode incluir além disso um soro de anticorpo anti-isótipo que reconhece o anticorpo anti-Dlk (porção Fc) e o qual é conjugado com um marcador, tal como uma enzima ou metade fluorescente.

Numa forma- de realização preferida, é providenciado um anticorpo anti-Dlk radiomarcado. Um tal anticorpo, preferencialmente um anticorpo monoclonal, é administrado a um animal ou pessoa com o objectivo de visualização. Após um período de tempo aceitável para os anticorpos administrados se ligarem às células expressando Dlk, é aplicada uma máquina câmara gama para detectar a presença de anticorpos marcados dentro do organismo. Um tal procedimento providencia informações como onde no organismo está localizado um tumor neuro-endocrino expressando Dlk primáriO ou secundário.

Uma aplicação terapêutica de anticorpos monoclonais anti-Dlk inclui a administração de imuno-toxinas anti-Dlk. A conjugação de um anticorpo monoclonal anti-Dlk com uma toxina, tal como a exotoxina da Pseudomonas ou outras toxinas vulgarmente conjugadas com um anticorpo através de uma ligação convencional anticorpo-toxina, Hertler e outros, J. Clin. Oncol. 7 (12) : 1932 (1989) descreveu metodologias para a criação de uma ligação anticorpo-toxina, e é aqui incorporada por referência. Assim o anticorpo monoclonal anti-Dlk-toxina conjugados descritos são administrados a um indivíduo para atingir e matar selectivamente células expressando Dlk presentes em tumores neuro-endocrinos.

De modo similar, é providenciado um kit que contem imuno-toxinas anti-Dlk num receptáculo. Um kit pode incluir as imunotoxinas anti-Dlk e um excipiente farmacêutico num receptáculo. A presente invenção é posteriormente descrita com referência aos seguintes exemplos ilustrativos. A não ser que seja definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado como vulgarmente entendido pelos peritos na técnica da invenção. Embora qualquer método e materiais similares ou equivalentes aqueles aqui descritos possam ser utilizados na prática da invenção, o s métodos e materiais preferidos foram descritos. A não ser que seja mencionado de outro modo, as técnicas, aqui empregues ou contempladas são metodologias padrão conhecidas na técnica. Os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não limitativos.

Exemplo 1: IDENTIFICAÇÃO DE MOLÉCULAS POLINUCLEÓTIDAS dlk E POLIPÉPTIDO 15

Identificação de dlk

Nas investigação de moléculas associadas com o péptido libertador da gastrina (GRP), correspondentes ao fenótipo foram identificados genes que ambos tinham : (1) expresso diferencialmente entre a correspondente murino Swiss e os não correspondentes fibroblastos Balb/c 3T3 de murino, e (2) expresso no GRP humano correspondente às linhas de células SCLC. O raciocínio para esta aproximação foi o facto de que os produtos dos genes que se correlacionam com um fenótipo correspondente a GRP faltarão a partir do Balb / c e linhas de células SCLC não correspondentes, mas estarão presentes nos fibroblastos Swiss 3T3 e linhas de células.

Uma biblioteca diferencial de cADN foi construída e foi enriquecida por clones expressos em fibroblastos Swiss 3T3 mas não em fibroblastos Balb /c 3T3. A biblioteca diferencial de fibroblastos Swiss 3T3 comparada com a de fibroblastos Balb /c 3T3 foi construída como explicado detalhadamente no Timblin e outros., Nucleic Acids Res. 18 : 1 587 (1990). O isolamento de ARN, electroforese, manchas Northern, e técnicas de hibridização foram realizadas como descrito em Davis e outros BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Elsevier, New York, (1986). Os ácidos nucleícos exploradores foram marcados com 32p dCTP (Amersham, Arlington Heihgts, ÍL) por preparação ao acaso como descrito em Ausubel e outros, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley e Sons, New York 3.5.9-3.5.10 (1991).

Um clone de comprimento parcial (150 nucleótidos de comprimento) isolado desta biblioteca diferencial hibridizou com um mARN 1,6 kilobase que exibiu uma expressão padrão consistente com os dois requerimentos apresentados. Este clone de comprimento parcial foi então usado para varrer uma biblioteca de cADN preparado com oligo dT de fibroblastos Swiss 3T3 no vector λ ZAPII disponível comercialmente (Stratagene (La Jolla, CA)) para obter um clone com o comprimento completo.

Procedimentos de varrimento e salvamento de plasmideos de clones λ ZAPII positivo foram realizadas seguindo os protocolos de fabricação (Stratagene), como descrito por Short e outros Nuc. Acids Res. 16 : 7 583 (1988). Vários clones com inserções de 16 ê aproximadamente 1,6 kilobase de pares em comprimento foram obtidos a partir deste procedimento de varrimento.

Sequência de ADN

Os plasmideos salvos foram sequenciados com sequenase (USB, Cleveland, OH) pelo método da terminação da cadeia dideoxi, de acordo com o protocolo de fabricação descrito por Tabor e outros, J. Biol. Chem. 214 : 6 447 (1989). A análise da sequência de nucleótidos definiu uma grelha de leitura aberta de 1 115 nucleótidos, codificando uma proteína putativa (Dlk) de 385 aminoácidos com um peso molecular de 41, 320 daltons. Esta grelha de leitura aberta foi classificada como um código por ambos os métodos Ficketfs e Shepherd's. Fickett e outros, Nucleic Acids Res. 10 : 5 303 (1982), Shepherd e outros, Meth. Enzymol. 188 : 180 (1990). As grelhas de leitura aberta foram identificadas por programas de software implementando este métodos, (bagagem de software PC/Gene, Intelligenetics Inc. (Mountain View, CA); A. Bairoch, Ph. D Thesis, University of Geneva (1990)).

Translação de Polipéptido Dlk in vitro

Ensaios de translação in vitro a partir de mARN dlk de murganho foram realizadas usando um sistema de lisado de reticulócito de coelho a partir de NEN (Boston, MA), de acordo com o protocolo dos fabricantes, como descrito por Lockhard e outros, Biochem. Biophys. Res. Comm. 37 : 204 (1969). O mARN dlk foi seleccionado por hibridização de poli A + ARN a partir dos fibroblastos Swiss 3T3 com dlk de comprimento completo desnaturado imobilizado em filtros de nitrocelulose (mARN dlk foi seleccionado por hibridização de 2pg de poli A + Swiss 3T3 ARN com 5 pg de dlk desnaturada imobilizada em nitrocelulose). A ligação ARN foi eluida por fervura. O mARN dlk de murganho foi também preparado in vitro usando dois cADNs dlk diferentes e de comprimento completo clonado em pGEM4Z (Promega). Estes três mARNs foram usados como moldes para translação in vitro.

As proteínas marcadas foram analisadas num gel de poliacrilamina a 12 % seguido de um fluorográfico. Uma banda de proteína com aproximadamente 42 kilodaltons estava presente nas três amostras, de acordo com o peso molecular previsto para o polipéptido Dlk.

Uma Comparação entre murganhos e humanos

As sequências polinucleótidas dlk dos murganhos e humanos são idênticas em 86,2 % e a sua sequência aminoácida tem uma similaridade de 90,1 %. Eles partilham muitos locais de potencial de actividade biológica, incluindo 6 repetições do tipo EGF (altamente homólogas com aquelas encontradas nas proteínas neurogénicas dos invertebrados) um domínio transmembranar integral e um domínio péptido assinalado.

As características estruturais de dlk foram analisadas com o programa PC/Gene (Intelligenetics Inc. (Mountain View, CA), A. Bairoch, Ph. D thesis, University of Geneva (1990)). O domínio transmembranar foi identificado usando o programa RAOARGOS, implementando o método de Rao e Argos, Biochem. Biophy. Acla. 869 : 197 (1986). O péptido assinalado foi analisado com o programa PSIGNAL, de acordo com o método de Von Heijne, Nucleic Acids Res. 14 : 4683 (1986).

Exemplo 2. UMA COMPARAÇÃO ENTRE pPG2 e EXPRESSÃO DO GENE dlk EM MURGANHOS, & EXPRESSÃO DO GENE dlk EM HUMANOS

Em tecidos normais de origem humana, de murganhos e de hamsters, foi detectada a expressão dlk de acordo com a presente invenção, apenas no tecido adrenal e placentário. De modo semelhante, foi conhecida a expressão pG2 por ser restrita às glândulas adrenais nos tecidos humanos normais. O mARN dlk foi detectado por análise Northern em linhas de células de feocromocitoma de humanos e ratos (PC12). Foi identificado pG2 em linhas de células de feocromocitoma por Helman e outros, PNAS USA 84 : 2336 (1987).

De acordo com a presente invenção, foi detectado dlk nas células de neuroblastoma (SK-N-SH). A expressão de pG2 nas linhas de células de neuroblastoma foi detectada /Ο /Ο 6 18 em células diferenciadas, mas estava ausente nas linhas de células de neuroblastoma não diferenciadas. Cooper e outros, Cell Growth ADN Diff. 1 : 149 (1989).

Além disso, outras células as quais expressam dlk identificadas pela presente invenção incluem certas linhas de células SCLC. Também foram encontrados fibroblastos Swiss 3T3 de murino por expressarem dlk usando um explorador dlk humano sob condições de elevada pressão. Foram encontrados fibroblastos Balb/c3T3 por expressarem dlk usando um explorador dlk humano sob condições de elevada pressão. O ARN dos fibroblastos Balb/c3T3 foi negativo para a expressão dlk sob estas condições.

Para explorar o relacionamento entre o dlk de murganho e o pG2 humano foram isolados clones de cADN de uma biblioteca da glândula adrenal humana Agtl 0 (Clontech, Paio Alto, CA) usando dlk de murganho como um explorador de hibridização. Mesmo sobre condições de baixa pressão, não foram isolados clones que codificavam proteínas tendo características estruturais semelhantes aqueles representados por pG2. As inserções de cADN a partir de clones λ positivos foram subclonadas em pGEM4Z (Promega, Madison WI) e sequenciadas de acordo com o método de Exemplo 1. Os dados da sequência de polinucleótidos a partir de vários clones de comprimento completo indicaram que estes cADNs mostravam uma sequência idêntica em 82,1 % com o dlk de murganho e codificavam o homólogo humano da proteína dlk de murganho (Fig. .1). A caracterização estrutural de dlks é muito diferente daquela prevista para a proteína pG2 (Helman e outros, supra. (1987). A proteína padrão é constituída por uma sequência de 286 aminoácidos (cerca de 30 kDa), não contem repetições do tipo EGF nem péptido assinalado ou domínios transmembranares. Isto apesar de se encontrar uma semelhança na sequência nucleótida de 81,2 % de dlk com pG2 e está identificada correctamente como a molécula polinucleótida dlk representada na Figura 1.

Exemplo 3: HOMOLOGIA dlk /DLK COM OUTROS GENES & PROTEÍNAS A sequência de ácidos nucleícos dlk mostra um elevado grau de homologia com genes neurogénicos do tipo EGF da Drosophila que estão envolvidos nas decisões tomadas 19 19 /> pelas células da ectoderme embrionária para se diferenciarem em células epidérmicas ou neuronais. Genes que se descobriu terem elevada homologia com Dlk incluem: Delta, Notch e Serrate de D. melanogaster, lin-12 e glpl de C. elegans e uEGFl do ouriço do mar. Apesar do grau de homologia variado entre as proteínas individuais e Dlk, regiões de homologia máxima exibiram até 33 % de aminoácidos idênticos que aumentaram até cerca de 75 % com permissão para substituições de aminoácidos de conservação. A Figura 4 mostra o alinhamento das sequências repetitivas do tipo EGF dlk de murganho ou humanas com sequências consensuais de repetições da sequência EGF de várias proteínas. O alinhamento das repetições do tipo EGF foi feito usando o programa CLUSTAL, descrito por Higgins e outros, Gene 73 : 237 (1988). Os locais de potencial importância biológica foram analisadas com o programa PROSITE. Resíduos altamente conservados entre os genes homeóticos também estão conservados em dlk. Esta descoberta confirma que dlk é um membro da família dos genes homeóticos do tipo EGF. A sequência de aminoácidos e a estrutura das repetições do tipo EGF, bem como toda a estrutura de dlk estão mais relacionadas com os genes homeóticos invertebrados do que com outras proteínas do tipo EGF não homeóticas de vertebrados, tais como percursor de EGF, TGFa, as cadeias α, βΓ e β2 da laminina, factores de coagulação, ou proteínas complementares que anteriormente se pensava serem o correspondente mamífero do genes homeóticos dos invertebrados. O gene dlk foi detectado em espécies variando desde pássaros a humano incluindo: levedura, Drosophilia Xenopus, murganho, rato, coelho, galinha, cão, vaca, macaco e humano. No entanto, apesar da homologia estrutural com as proteínas dos invertebrados, õ gene dlk está ausente nos invertebrados e vertebrados inferiores. O programa PCOMPARE, descrito por Needleman e outros, Mol. Biol. 48 : 443 (1970) incluído no PC/Gene foi usado para a análise da homologia. Neste método, o resultado do alinhamento óptimo entre duas proteínas fòi comparado com a distribuição estatística de 100 alinhamentos aleatórios. Um resultado do alinhamento de mais de 5 desvios padrões positivos da média de distribuição de alinhamento aleatório foi considerado 20 20

ff significativo, particularmente quando não era conhecido nenhum relacionamento funcional ou estrutural entre as proteínas comparadas. Foram determinados resultados de alinhamentos representativos: Delta, 20,2; Serrate, 19.7; TAN-J, 16.2; Notes. 14.6; Xotch, 13.6; Drosophila Laminin p2, 6.3; Laminin p2 de murganho ,4.1; Factor Vil de coagulação humano, 2.8; e percursor do EGF humano, 0,6.

Exemplo 4: EXPRESSÃO DE dlk: ANÁLISE DE mARN POR MANCHAS NORTHERN A expressão de dlk foi detectada por análise Northern nas linhas SCLC NCI-H510, NCI-H69 e NCI-N592; na linha de neuroblastoma humano SK-N-SH, e na linha de células PC-12 do feocromocitoma de rato. Foram separados vinte pg de ARN total ou 2 pg de poli A+ num gel de agarose a 1 % e foram depois colocadas em manchas num filtro de nitrocelulose (descrito no Exemplo 1).

Uma banda a 1,6Kb correspondente a dlk foi observada apenas nas amostras de ARN das linhas de células SCLC NCI-H592, NCI-H69 e NCI-N510, e nos fibroblastos Swiss 3T3. O ARN do fíbroblasto Swiss 3T3 de murganho também demonstrou um elevado grau de expressão de dlk, mesmo quando a hibridização foi realizada sob condições de elevada pressão usando um dlk humano como explorador. Resultados semelhantes foram obtidos usando um dlk de murganho como explorador. O ARN do fíbroblasto Balb / c 3T3 foi negativo para a expressão de dlk sob estas condições. As linhas de células SK-ES-1, A4573 e TC 106 do sarcoma de Ewing's não expressaram dlk.

Em tecidos normais de murganho, hamster e de origem humana a expressão dlk foi detectada exclusivamente na glândula adrenal.

Lisboa, 1 1 OUT. 2000

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Claims (7)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um polipéptido Dlk isolado constituído essencialmente pela sequência de aminoácidos representada na Figura 1B.

2. Uma molécula polinucleótida isolada a qual codifica um polipéptido Dlk humano de acordo com a reivindicação 1.

3. Uma molécula polinucleótida isolada constituída essencialmente pela sequência polinucleótida representada na Figura 2.

4. Uma molécula polinucleótida isolada a qual codifica um polipéptido Dlk de murino, em que o dito polipéptido Dlk compreende a sequência de aminoácidos representada na Figura 1 A.

5. Um método para detecção de um tumor que expressa dlk, compreendendo os passos de a) Contacto da amostra suspeita de ser tumorigénica com a molécula polinucleótida dlk sob condições que permitam a hibridização entre a molécula polinucleótida dlk e a dita amostra e b) Detecção da presença de hibridização entre a dita molécula polinucleótida e a dita amostra.

6. Um método de acordo com a reivindicação 5, em que a dita molécula polinucleótida dlk é uma molécula polinucleótida isolada de acordo com a reivindicação 3.

7. Um método de acordo com a reivindicação 5 para detecção de um tumor identificado como uma pequena célula de carcinoma no pulmão, em que, no passo a), a dita amostra compreende células epiteliais bronquicas. Lisboa, | | QUI. 20™