PT773956E

PT773956E - Forma purificada de estreptograminas, sua preparacao e composicoes farmaceuticas que a contem

Info

Publication number: PT773956E
Application number: PT95926996T
Authority: PT
Inventors: Denis Thibaut; Pascal Anger; Jean-Claude Barriere; Bertrand Bonnavaud; Patrick Lefevre; Jean-Marc Paris
Original assignee: Aventis Pharma Sa
Priority date: 1994-08-02
Filing date: 1995-07-31
Publication date: 2001-11-30
Also published as: DE69521615T2; FR2723373A1; CA2196450A1; WO1996004298A1; DK0773956T3; JPH10503511A; FR2723373B1; US6384014B1; AU3117495A; DE69521615D1; ES2160171T3; GR3036173T3; EP0773956A1; ATE202784T1; EP0773956B1

Description

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EP Ο 773 956 /PT K

DESCRIÇÃO ‘‘Forma purificada de estreptograminas, sua preparação e composições farmacêuticas que a contêm” A presente invenção refere-se a uma forma purificada de estreptograminas compreendendo pelo menos um componente do grupo B das estreptograminas. definido em seguida pela fórmula geral (I), co-cristalizado com pelo menos um componente “minoritário” do grupo A, definido em seguida pela fórmula geral (II).

De entre as estreptograminas conhecidas, a pristinamicina (RP 7293), antibacteriano de origem natural produzido por Streptomyces pristinaes-piralis, foi isolada pela primeira vez em 1955. A pristinamicina comercializada sob o nome de Pyostacine5 é constituída principalmente por pristinamicina IA e por pristinamicina IIA.

Um outro antibacteriano da classe das estreptograminas: a virginiamicina, foi preparado a partir de Streptomyces virginae, ATCC 13161 [Antibiotics and Chemotherapv, 5, 632 (1955)]. A virginiamicina (Staphylomicine®) é constituída principalmente por factor S e por factor Mi.

Na patente US 3325359 foram descritas composições farmacêuticas compreendendo substâncias antibióticas que constituem o antibiótico 899: factor S e por factor Mj.

Os antibacterianos de origem natural, da classe das estreptograminas, são constituídos pela mistura de 2 grupos de compostos: compostos do grupo B e compostos do grupo A, possuindo cada grupo uma actividade antibacteriana própria. Foi demonstrado que a associação formada pelos 2 grupos de componentes provoca uma acção de sinergia que resulta numa actividade bacteriostática e bactericida intensificada e no alargamento do espectro de actividade.

Em “Streptogramine ais Modelsysteme fur den Kationentransport durch Menbranen, Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Facultát der Georg-August Universitãt zu Gõttingen”, Gõttingen 1979, em Antibiotics III, 521 (1975) e em “Antibiotics of the virginiamycin family, Inhibitors which contain synergistic components”, C. Cocito, Microbiological Reviews 145-98 (1979), foram descritos compostos dos grupos A e B das estreptograminas. J. Preud’Homme, P. Tarridec e A. Belloc, Buli. Soc. Chim. Fr.. 2, 585 (1968,) descreveram igualmente a pristinamicina natural, bem como os diferentes components que a constituem.

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No que se refere à preparação industrial de produtos desta classe, até ao presente, as técnicas disponíveis não permitiam obter, à escala preparativa, uma forma suficientemente purificada e a produção de lotes de qualidade suficientemente constante e reprodutível, para responder às exigências das legislações de certos países em matéria de registo.

No domínio dos antibacterianos, é bem conhecido dos peritos que se podem desenvolver alergias ou resistências após administração de certas classes de antibióticos [The New England Journal of Medicine. 324 (9), 601 (1991)]. Em meio hospitalar são conhecidas, designadamente, diversas estirpes resistentes de Staphylococcus aureus. Por este motivo, é extremamente útil para o médico ter à sua disposição um largo espectro de classes quimicamente diferentes, de maneira a poder adaptar o tratamento ao caso particular do doente a tratar. A consequência da ausência de comercialização de uma determinada classe pode ser muito grave, mesmo dramática, uma vez que pode resultar na privação de tratamento em doentes que não toleram as outras classes de antibióticos.

Assim, os ensaios de purificação realizados tiveram sempre por finalidade eliminar os componentes minoritários das estreptograminas, sendo estes consideradas como não indispensáveis, e antes mesmo como impurezas.

De entre os componentes do grupo A das estreptograminas naturais, a pristínamicina IIB (PIIB) é um componente minoritário, cuja proporção em peso é inferior a 10% na pristinamicina natural e, mais frequentemente da ordem de 8% ou mesmo da ordem de 6% na virginiamicina.

Verificou-se agora, e é isto que constitui o objecto da presente invenção, que a associação constituída por um ou vários componentes do grupo B, de fórmula geral:

(D

86 242 ΕΡ Ο 773 956 / ΡΤ Λ na qual - ο símbolo Ri representa um radical metilo ou etilo, - o símbolo R? representa um átomo de hidrogénio ou um radical hidroxi, e - o símbolo R3 representa um radical benzilo substituído de fórmula geral R'

(III) na qual 1) na condição de R2 ser simultaneamente hidrogénio, R representa NR4R5 para o qual os símbolos R4 e R5 são, um um átomo de hidrogénio ou um radical metilo e o outro um radical metilo e R’ é um átomo de cloro ou de bromo ou representa um radical alcenilo contendo 3 a 5 átomos de carbono, se R4 e R5 forem radicais metilo, ou então 2) R é um átomo de hidrogénio e R’ representa um átomo de halogéneo, um radical alquilamino ou dialquilamino, 0 resto de um éter-óxido, um radical alquiltio, alquilo contendo 1 a 3 átomos de carbono em cadeia linear ou ramificada ou tri-halogenometilo, ou então R é um átomo de halogéneo, um radical alquilamino contendo 2 a 4 átomos de carbono em cadeia linear ou ramificada, dialquilamino cujas partes alquilo são idênticas ou diferentes e contêm 2 a 4 átomos de carbono em cadeia linear ou ramificada ou metiletilamino, um radical pirrolidino, um radical alcenilalquilamino cuja parte alcenilo contém 3 ou 4 átomos de carbono e a parte alquilo é definida como acima, um radical dialcenilamino cujas partes alcenilo são definidas como acima, um radical alquil-cicloalquilmetilamino cuja parte alquilo é definida como acima e a parte cicloalquilo contém 3 ou 4 átomos de carbono, o resto de um éter-óxido, um radical alquiltio, um radical alquiltiometilo, alquilo contendo 1 a ó átomos de carbono em cadeia linear ou ramificada, arilo ou tri-halogenometilo eR’é um átomo de hidrogénio, ou então R é um átomo de halogéneo, um radical amino, alquilamino ou dialquilamino, 0 resto de um éter-óxido, um radical alquiltio, alquilo contendo 1 a 6 átomos de carbono em cadeia linear ou ramificada ou tri-halogenometilo e R’ representa um átomo de halogéneo, um radical

86 242 EP 0 773 956 / PT 4 alquilamíno ou dialquilamino, o resto de um éter-óxido ou um radical alquiltio ou alquilo contendo 1 a 3 átomos de carbono em cadeia linear ou ramificada, e por um ou vários componentes “minoritários” do grupo A das estreptograminas de fórmula geral:

O

na qual R” é um átomo de hidrogénio ou um radical metilo ou etilo, é particularmente interessante devido à sua actividade biológica in vivo.

Na fórmula geral (I), quando R ou R’ (em R3) representam um átomo de halogéneo, trata-se de preferência de um átomo de flúor, excepto quando R’ é o átomo de hidrogénio, neste caso R é indiferentemente cloro, bromo, flúor ou iodo; quando R’ representa um radical alquilamino ou dialquilamino, os radicais alquilo são de preferência seleccionados de entre metilo ou etilo; quando R ou R’ representam o resto de um éter-óxido, este pode ser representado por um resto OR° para o qual R° é seleccionado de preferência de entre os grupos metilo, etilo eventualmente substituído com um átomo de cloro, alilo ou trifluorometilo; Quando R ou R’ representam um radical alquiltio trata-se de preferência do radical metiltio; quando R representa um radical alquilo contendo 1 a 6 átomos de carbono, representa de preferência metilo, isopropilo, ou terc-butilo; quando R representa um radical arilo trata-se de preferência de um radical fenilo; quando R ou R’ representam um radical tri-halogenometilo trata-se de preferência do radical trifluorometilo. Por outro lado, entende-se que, salvo menção especial, os radicais alquilo são lineares ou ramificados e contêm 1 a 4 átomos de carbono. O produto de fórmula geral (II) para o qual R” é um radical etilo. em seguida denominado pristinamicina IIF (PIIF) e o produto de fórmula geral (II) para o qual R” é um átomo de hidrogénio, em seguida denominado pristinamicina IIG (PIIG), são produtos que em peso é constituem componentes muito minoritários das estreptograminas, cuja proporção inferior a 0,5% nos lotes de produto natural. A co-cristalização efectua-se na estequiometria constante de 1 mole de componente(s) de fórmula geral (I) com 2 moles de componente(s) do grupo A de fórmula geral (II) [esta estequiometria correspondendo à proporção relativa de cerca de 43-49/57-51 em peso].

De acordo com a invenção, as associações co-cristalizadas são preparadas da seguinte maneira: uma mistura bruta contendo pelo menos 30% de um componente minoritário do grupo A respondendo à fórmula geral (II) posto em solução num solvente orgânico, tal como uma cetona (acetona, metiletilcetona, metilisobutilcetona, por exemplo) um éster (acetato de etilo, acetato de isopropilo, acetato de butilo, acetato de isobutilo, por exemplo), um solvente clorado (cloreto de metileno, clorofórmio, 1,2-dicloroetano, por exemplo) ou um nitrilo (acetonitrilo, por exemplo), é adicionado de um componente do grupo B definido pela fórmula geral (I) para dar um composto co-cristalizado nas proporções definidas acima. Entende-se que a quantidade de composto de fórmula geral (I) introduzida é seleccionada convenientemente de forma que a concentração residual deste produto (após a co-cristalização) seja inferior à sua solubilidade no meio. Entende-se igualmente que variações nos teores respectivos do meio inicial, em produto de fórmula geral (II) e em produto de fórmula geral (I) não implicam modificação do composto co-cristalizado obtido.

Esta associação co-cristalizada apresenta a vantagem de uma muito boa estabilidade e de uma pureza elevada. A preparação dos componentes do grupo B das estreptograminas definidas pela fórmula geral (I) pode ser efectuada da seguinte maneira:

Quando R3 representa um radical de fórmula geral (III) para 0 qual R e R’ são definidos como em 1), se R’ for um átomo de cloro ou de bromo, os produtos de fórmula geral (I) podem ser obtidos por acção do derivado N-halogenosuccinimida correspondente sobre a pristinamicina I para a qual R’ é um átomo de hidrogénio. A reacção efectua-se por meio de N-cloro ou de N-bromo-succinimida num solvente orgânico, como por exemplo um solvente clorado (diclorometano, dicloroetano, clorofórmio) ou um nitrilo (acetonitrilo), a uma temperatura compreendida entre 20 e 80°C. 6 86 242 ΕΡ Ο 773 956 / ΡΤ

Quando R3 representa um radical de fórmula geral (III), para o qual R e R’ são definidos como em 1), se R’ for um radical alcenilo contendo 3 a 5 átomos de carbono os produtos de fórmula geral (I) podem ser obtidos por rearranjo, em meio ligeiramente básico, de um sal derivado de 4-N-alcenilamónio pristinamicina IA de fórmula geral:

na qual Ri é definido como acima, R(„ R?, Rh e Rq são um átomo de hidrogénio ou um radical metilo, desde que 2 de entre eles, pelo menos, sejam átomos de hidrogénio e Xa represente um anião, para dar o derivado de fórmula geral:

para o qual Ri, R«, R7, e rC) sào definidos como acima. 7 86 242 ΕΡ Ο 773 956 / ΡΤ A reacção efectua-se por aquecimento a uma temperatura compreendida entre 80 e 100°C em meio aquoso ou bifásico (por exemplo em meio de acetato de etilo/água), em presença de acetato de sódio ou de bicarbonato de sódio ou de potássio. Utiliza-se vantajosamente um halogeneto de 4-N-alcenilamónio pristinamicina IA. O halogeneto de 4-N-alcenilamónio pristinamicina ÍA pode ser obtido por acção de um halogeneto de alcenilo de fórmula geral:

Hal para o qual R6, R7, Rg e R9 são definidos como acima e Hal representa um átomo de halogéneo, sobre um derivado da pristinamicina de fórmula geral:

na qual Ri é definido como anteriormente. A reacção efectua-se vantajosamente num solvente orgânico, tal como um solvente clorado (diclorometano, dicloroetano, clorofórmio, por exemplo) ou um álcool (etanol por exemplo) ou numa mistura, a uma temperatura compreendida entre 20°C e a temperatura de refluxo da mistura reaccional. De preferência, faz-se reagir um produto de para o qual Hal é um átomo de cloro ou de bromo. fórmula gefàl

Quando R3 representa um radical de fórmula geral (III) para o qual R e R’ são definidos como em 2), os produtos de fórmula geral (I) podem ser obtidos como descrito em seguida nos exemplos, a partir de uma estirpe de um microrganismo produtor de estreptograminas, possuindo pelo menos uma modificação genética afectando a biossíntese de um precursor de estreptograminas do grupo B, a dita estirpe mutante cultivada num meio de cultura adequado, complementado com pelo menos um precursor original, diferente daquele cuja biossíntese está alterada (e correspondendo à estrutura desejada), produz os derivados de estreptograminas esperados.

As estirpes utilizadas no âmbito da presente invenção são portanto estirpes produtoras de estreptograminas naturais (pristinamicina IA, pristinamicina IB, virginiamicina S), mutadas. A/as referidas modificações genéticas podem ser localizadas quer ao nível de um dos genes implicados na biossíntese dos referidos precursores quer fora da região codificante, por exemplo nas regiões responsáveis pela expressão e/ou a regulação da transcrição ou pós-transcrição dos referidos genes ou numa região pertencente ao transcrito contendo os referidos genes.

Designadamente, as estirpes mutantes possuem uma ou várias modificações genéticas ao nível de, pelo menos, um dos seus genes implicados na biossíntese de precursores das estreptograminas do grupo B. Esta ou estas modificações genéticas alteram a expressão do referido gene, isto é, tomam este gene. e se for o caso, outro dos genes implicados na biossíntese dos precursores, parcialmente ou totalmente incapaz de codificar para a enzima natural implicada na biossíntese de pelo menos um precursor.

Os genes susceptíveis de serem mutados são de preferência os genes implicados na biossíntese do precursor 4-dimetilamino-L-fenilalanina (DMPAPA). Trata-se muito preferencialmente dos genes papA. papM. papB (SEQ ID N°3), papC (SEQ ID N°2). Os genes papA e papM foram já descritos no pedido de patente PCT/FR93/0923. A complementação do meio de cultura de estirpes mutantes, de acordo com a invenção, com pelo menos um precursor original, toma possível orientar a biossíntese para novas estreptograminas de fórmula geral (I).

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Os precursores utilizados no âmbito da presente invenção são derivados da fenilalanina bem como derivados de ácidos α-cetocarboxílicos que podem ser representados pela fórmula geral: R'

R

HCCC na qual ReR’ são definidos como anteriormente em 2) e Rio é um átomo de hidrogénio e Ri i é um radical amino ou então Rio e Rn formam em conjunto um radical oxo. A título de precursores que convêm à invenção podem-se citar, designadamente, os seguintes: 4-dietilaminofenilalanina. 4-etilaminofenilalanina, 4-metiltiofenilalanina, 4-metilfenilalanina, 4-metoxifenilalanina, 4-trifluorometoxifenilalanina, 4-clorofenilalanina, 4-bromofenilalanina, 4-iodofenilalanina, 4-trifluorometilfenilalanina, 4-terc-butilfenilalanina, 4-isopropilfenilalanina, 3-metilaminofenilalanina, 3-metoxifenilalanina, 3- metiltiofemlalanina, 3-fluorofenilalanina, ácido 4-terc-butilfenilpirúvico, 4- fluo ro fenilalanina, 3-etoxifenilalanina, 3,4-dimetilfenilalanina, 3-metilfenilalanina, 4-butilfenilalanina, 3-trifluorometilfenilalanina e 3-etilaminofenilalanina, 4-aminometilfenilalanina. A preparação e a separação dos componentes das estreptograminas naturais dos grupos A [estreptograminas de fórmula geral (II)] e B [e designadamente os produtos de fórmula geral (VII)] é efectuada por fermentação e isolamento dos constituintes a partir do mosto de fermentação, de acordo, ou por analogia, com o método descrito por J. Preud’homme et al., Buli. Chem. Chim. Frvol. 2, 585 (1968), em Antibiot. & Chemother., 5, 632 (1955) ou 7, 606 (1957), em Cromatog. Sym., 2o Bruxelles, 181 (1962), em Antibiot. Ann., 728 784 (1954-55), na patente US 3299047 ou em “Streptogramine ais Modelsysteme fur den Kationentransport durch Menbranen, Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Facultát der Georg-August Universitãt zu Gõttingen”, Gõttingen, 1979 ou como aqui descrito, em seguida, nos exemplos. Designadamente, no caso das pristinamicinas. a separação dos componentes dos grupos A e B é efectuada colocando em suspensão a estreptogramina bruta num solvente orgânico como um acetato (acetato de etilo por exemplo), seguida da filtração ou da centrifugação do componente bruto do grupo A e da extracção do componente do grupo B em meio ácido

86 242 ΕΡ Ο 773 956 / ΡΤ 10 aquoso, seguida de uma re-extracção em meio clorometilénico. A separação dos componentes dos grupos A e B pode igualmente ser efectuada por extracção ácida de uma solução de estreptogramina bruta em metilisobutilcetona, seguida de isolamento por extracção do componente do grupo B a partir da fase aquosa e isolamento do componente do grupo A, por precipitação a partir da fase orgânica.

Após separação, a purificação dos componentes do grupo B das estreptograminas pode ser realizada por cristalização num álcool tal como o etanol, o metanol ou o isopropanol, num acetato (acetato de isopropilo ou acetato de butilo, por exemplo), numa cetona (metiletilcetona, por exemplo) ou em acetonitrilo ou por cromatografía. A purificação dos componentes do grupo A de fórmula geral (II) pode ser efectuada por cromatografía, eluindo com uma mistura acetonitrilo-água.

Em alternativa, a preparação dos componentes naturais dos grupos A e B, respectivamente de fórmula geral (II) e designadamente de fórmula geral (VII), é efectuada como descrito no pedido de patente francesa 2689518, por fermentação separada.

Assim, de acordo com a invenção, é agora possível a obtenção de uma nova forma purificada e cristalizada de estreptogramina, cuja taxa de impurezas, a definição e a estabilidade da composição são melhoradas e que possui acima de tudo uma actividade in vivo melhorada, bem como uma fraca toxicidade. A nova associação co-cristalizada poderá assim ser um paliativo para a ausência de tratamento por um antibacteriano desta classe em numerosos países.

As associações de acordo com a invenção manifestam uma acção biológica in vivo superior à das associações de estreptograminas conhecidas até ao presente, sob a forma de mistura de pós. A nova associação co-cristalinizada de um componente do grupo B das estreptograminas de fórmula geral (I) e de um componente do grupo A das estreptograminas de fórmula geral (II) apresenta uma actividade in vivo particularmente interessante, nomeadamente sobre os germes Gram-positivos. In vivo, no ratinho, esta associação revelou-se activa sobre Staphylococcus aureus IP 8203, em doses de 25 a 50 mg/kg por via oral.

Adicionalmente, a nova associação não apresenta toxicidade: não se manifesta nenhum sinal de toxicidade no ratinho na dose de 150 mg/kg por via oral (2 administrações).

86 242 ΕΡ Ο 773 956 / ΡΤ 11 A associação co-cristalinizada de acordo com a invenção pode ser igualmente utilizada como meio de purificação de um componente minoritário das estreptograminas que respondem à fórmula geral (II).

Com efeito, não foi nunca possível purificar um componente do grupo A de fórmula geral (II) por cristalização.

Foi agora demonstrado que o componente do grupo A de fórmula geral (II) pode ser obtido no estado puro, passando pelo intermediário da associação co-cristalinizada definida acima.

De acordo com a invenção, quando a associação co-cristalinizada é utilizada como meio de purificação do componente de fórmula geral (II), este pode ser obtido por extracção ácida de uma solução do composto co-cristalinizado numa cetona (metilisobutilcetona, por exemplo), seguida de isolamento do componente do grupo A por precipitação a partir da fase orgânica, quando R ou R’ representam alquilamino ou dialalquilamino; ou em alternativa, por cromatografia líquida de alta eficiência.

De interesse particular são as associações co-cristalinizadas que compreendem pelo menos um componente do grupo B das estreptograminas definido pela fórmula geral (I), na qual os símbolos R| e R2 são definidos como anteriormente e o símbolo R3 representa um radical benzilo substituído de fórmula geral (III) 11a qual 1) na condição de que R2 seja simultaneamente hidrogénio. R representa NR4R5 para 0 qual os símbolos R4 e R5 são, um um átomo de hidrogénio ou um radical metilo e o outro um radical metilo e R’ é um átomo de cloro ou de bromo, ou representa um radical alcenilo contendo 3 a 5 átomos de carbono, se R4 e R5 forem radicais metilo, ou então 2) R é um átomo de hidrogénio e R’ representa um radical alquilamino ou dialquilamino, 0 resto de um éter-óxido ou um radical alquiltio, ou então R é um radical alquilamino contendo 2 a 4 átomos de carbono em cadeia linear ou ramificada, dialquilamino cujas partes alquilo são idênticas ou diferentes e contêm 2 a 4 átomos de carbono em cadeia linear ou ramificada ou metiletilamino, um radical pirrolidino, um radical alcenilaquilamino cuja parte alcenilo contém 3 ou 4 átomos de carbono e a parte alquilo é definida como acima, 0 resto de um éter-óxido, um radical alquiltio, alquilo contendo 1 a 6 átomos de carbono em cadeia linear ou ramificada ou tri-halogenometilo e R’ é um átomo de hidrogénio, ou então

86 242 ΕΡ Ο 773 956 / ΡΤ 12 R é um radical alquilo contendo 1 a 6 átomos de carbono em cadeia linear ou ramificada e R’ representa um átomo de halogéneo, co-cristalizada com pelo menos um componente “minoritário” do grupo A das estreptograminas, tal como definido anteriormente, entendendo-se que, salvo menção especial, os radicais alquilo são lineares ou ramificados e contêm 1 a 4 átomos de carbono. E, de entre estes produtos, as associações preferidas são as associações co-cristalinizadas que compreendem pelo menos um componente do grupo B das estreptograminas, definido pela fórmula geral (I), na qual o símbolo R| é um radical etilo, o símbolo R? é um átomo de hidrogénio e o símbolo R3 representa um radical benzilo substituído de fórmula geral (III) na qual: 1) na condição de que R2 seja simultaneamente hidrogénio, R representa NR4R5 para o qual os símbolos R4 e R5 são, um um átomo de hidrogénio ou um radical metilo e 0 outro um radical metilo e R’ é um átomo de cloro ou de bromo, ou representa um radical alilo se R4 e R5 forem radicais metilo, ou então 2) R é um átomo de hidrogénio e R’ representa um radical alquilamino ou dialquilamino, um radical metoxi, etoxi, aliloxi ou trifluorometoxi ou um radical alquiltio, ou então R é um radical alquilamino contendo 2 a 4 átomos de carbono em cadeia linear ou ramificada, dialquilamino cujas partes alquilo são idênticas ou diferentes e contêm 2 a 4 átomos de carbono em cadeia linear ou ramificada ou metiletilamino, um radical pirrolidino, um radical alilaquilamino cuja parte alquilo é definida como acima, um radical metoxi, etoxi, aliloxi ou trifluorometoxi, um radical alquiltio. alquilo contendo 1 a 6 átomos de carbono em cadeia linear ou ramificada ou trifluorometilo e R’ é um átomo de hidrogénio, ou então R é um radical alquilo contendo 1 a 6 átomos de carbono em cadeia linear ou ramificada e R’ representa um átomo de halogéneo, co-cristalizada com pelo menos um componente '‘minoritário” do grupo A das estreptograminas tal como definido anteriormente, entendendo-se que, salvo menção especial, os radicais alquilo são lineares ou ramificados e contêm 1 a 4 átomos de carbono.

Os exemplos seguintes, dados a título não limitativo, ilustram a presente invenção.

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No exemplos que se seguem entende-se que os títulos são dados em % em peso. As cromatografias analíticas (HPLC) foram realizadas em modo isocrático a 0,8 ml/min com um eluente composto por 40% de acetonitrilo e por 60% de tampão fosfato 0,1M pH = 2,9 sobre uma coluna de Nucléosil 100 C8® em 5μ (4x133 mm, Macherey Nagel). As estreptograminas são detectadas e doseadas a partir da sua absorvância U.V. a 206 nm. Os títulos apresentados foram normalizados a 100%. Os diagramas de difracção X são efectuados num difractómetro Phillips PW1700'® com anticátodo de cobalto. A referência 100 é dada para o raio a 15,8 Â. Os valores relativos são estimados pela medição da altura do raio, deduzido o fundo contínuo. Nos exemplos que se seguem, o espectro de difracção X do produto co-cristalizado é diferente do espectro do componente do grupo B cristalizado sozinho no mesmo solvente, quando esse componente existe sob forma cristalizada.

Preparação de um produto co-cristalizado

Exemplo 1 A uma solução de 784 mg de pristinamicina IIB em 7 cnr de acetona, adicionam-se 672 mg de 4s-bromopristinamicina Ia· Após amomamento, para facilitar a solubilização, seguido de retomo a 20°C, observa-se uma precipitação. Após 20 horas de agitação a 20°C, o produto é filtrado, lavado com acetona e seco até peso constante sob pressão reduzida (135 Pa). Obtêm-se assim 940 mg da associação co-cristalinizada de 2 moléculas de pristinamicina IIB e de uma molécula de 4s-bromopristinamicina IA, sob a forma de cristais brancos que fundem a 188°C, com um título de aproximadamente 53% de pristinamicina IIB e 44% de 4c-bromopristmamicina IA.

Diagrama de difracção X:

No quadro que se segue são apresentadas as intensidades relativas dos raios principais:

Distância interreticular (Â) 15,8 100 | 10,3 36 | 5,9 54 ; 5,2 68 5,0 39 |

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Exemplo 2

Operando como descrito acima no Exemplo 1, mas utilizando 112 mg de pristinamicina IIB e 96 mg de 4e-cloropristinamicina IA em 1 cm3 de acetona, obtêm-se 130 mg da associação co-cristalinizada de 2 moléculas de pristinamicina IIB e de uma molécula de 4s-cloropristinamicina IA, sob a forma de cristais brancos que fundem a 190°C, com um título de aproximadamente 55% de pristinamicina IIB e 45% de 4e-cloropristinamicina ÍA.

Diagrama de difracçào X:

Distância interreticular (Ã) j 15,8 j 100 | 10,3 ; 55 | 5,9 ; 43 | 5,2 71 | 5,0 i 47 ; 1

Exemplo 3

Operando como descrito acima no Exemplo 1, mas utilizando 112 mg de pristinamicina IIB e 96 mg de 4e-alilpristinamicina IA em 1 cm3 de acetona, obtêm-se 160 mg da associação co-cristalinizada de 2 moléculas de pristinamicina IIB e de uma molécula de 4s-alilpristinamicina IA, sob a forma de cristais brancos que fundem a 182°C, com um título de aproximadamente 53% de pristinamicina IIB e 47% de 4e-alilpristinamicina IA.

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Diagrama de difracção X:

Distância interreticular (Â) j 15,8 80 10,6 100 6,6 37 4,6 63

Exemplo 4

Operando como descrito acima no Exemplo 1, mas utilizando 560 mg de pristinamicina IIB e 480 mg de 4s-bromopristinamicina Ib em 5 cmJ de acetona, obtêm-se 730 mg da associação co-cristalinizada de 2 moléculas de pristinamicina IIB e de uma molécula de 4s-bromopristinamicina IB, sob a forma de cristais brancos que fundem a 179°C, com um título de aproximadamente 53% de pristinamicina IIB e 47% de 4s-bromopnstinamicina IB.

Diagrama de difracção X:

Distância interreticular (Á) j 15,8 100 ! 10,3 47 ; 5,9 53 | 5,2 66 5,0 39

Exemplo 5

Operando como descrito acima no Exemplo 1, mas utilizando 784 mg de pristinamicina IIB e 672 mg de 4e-cloropristinamicina Ib em 7 cm' de acetona, obtém-se 1,0 g da associação co-cristalinizada de 2 moléculas de pristinamicina IIB e de uma molécula de

86 242

EPO 773 956 /PT 16 48-cloropristinamicina Íb, sob a forma de cristais brancos que fundem a 178°C, com um título de aproximadamente 57% de pristinamicina IIB e 43% de 4E-cloropristinamicina Ιβ.

Diagrama de difracção X:

Distância interreticular (À) j 15,8 | 1 100 í 1 10,3 j 62 5,9 43 1 ____1 5,2 ; 60 5,0 43 ! 1

Exemplo 6

Operando como descrito acima no Exemplo 1, mas utilizando 425 mg de pristinamicina IIB e 364 mg de des(4N-dimetilamino)-4c-terc-tiobutilpristinamicina IA em 3,8 cmJ de acetona, obtêm-se 305 mg da associação co-cristalinizada de 2 moléculas de pristinamicina IIB e de uma molécula de des(4ç-dimetilamino)^-terc-tiobutilpristinamicina ΙΛ, sob a forma de cristais brancos que fundem a 170°C, com um título de aproximadamente 57% de pristinamicina IIB e 43% de des(4Ç-dimetilamino)-4c-terc-tiobutilpristinamicina IA·

Diagrama de difracção X:

Distância interreticular (Ã) 15,8 j 100 10,3 I 68 5,9 ; 39 5,2 66 5,0 j 46

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Exemplo 7

Operando como descrito acima no Exemplo 1, mas utilizando 168 mg de pristinamicina IIB e 144 mg de des(4q-dimetilamino)-4ç-isopropilpristinamicina IA em 1,5 cm'' de acetona, obtêm-se 270 mg da associação co-cristalinizada de 2 moléculas de pristinamicina IIB e de uma molécula de des(4£-dimetilamino)-4ç-isopropilpristinamicina IA, sob a forma de cristais brancos que fundem a 180°C, com um título de aproximadamente 56% de pristinamicina IIB e 44% de des^-dimetilamino)-4£-isopropilpristinamicina Ia·

Diagrama de difracção X:

Distância interreticular (À) 15,8 | 100 10,3 i 76 5,9 j 65 5,2 81 5,0 | 59

Exemplo 8

Operando como descrito acima no Exemplo 1, mas utilizando 224 mg de pristinamicina IIB e 192 mg de des(4N-dimetilamino)-4£-metoxipristinamicma IA em 2 cm3 de acetona, obtêm-se 320 mg da associação co-cristalinizada de 2 moléculas de pristinamicina IIB e de uma molécula de des(4c-dimetilamino)-4Ç-metoxipristinamicina IA, sob a forma de cristais brancos que fundem a 169°C, com um título de aproximadamente 54% de pristinamicina IIB e 46% de des^-dimetilamino)-4t-metoxipristinarnicina IA.

Diagrama de difracção X:

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1S

Distância interreticular (Ã) 15,8 100 10,3 72 5,9 63 5,2 72 5,0 50

Exemplo 9

Operando como descrito acima no Exemplo 1, mas utilizando 149 mg de pristinamicina IIB e 128 mg de des(4N-dimetilamino)-4ç-metilpristinamicina Ia em 1,3 cm’ de acetona, obtêm-se 205 mg da associação co-cristalinizada de 2 moléculas de pristinamicina IIB e de uma molécula de des(4c-dimetilamino)-4c-metilpristinamicma L\, sob a forma de cristais brancos, com um título de aproximadamente 56% de pristinamicina IIB e 44% de des^-dimetilamino)-4g-metilpristinamicina IA.

Exemplo 10 A uma solução de 1,94 g de pristinamicina IIB em 6 cm'’ de acetona adiciona-se uma solução de 1,6 g de des(4c-dimetilamino)-4£-metiltiopristinamicina IA em 7 cm' de acetona. A mistura é agitada durante 30 minutos e depois filtrada. Os cristais obtidos são passados por 5 vezes com 1 cm'’ de acetona , depois por 3 vezes com 10 cm3 de pentano e depois secos até peso constante sob pressão reduzida (2,7 kPa). Obtèm-se assim 2,3 g da associação co-cristalinizada de 2 moléculas de pristinamicina IIB e de uma molécula de des(^-dimetilamino)^-metiltiopristinamicina IA, sob a forma de cristais brancos que fundem a 183°C, com um título de aproximadamente 51% de pristinamicina IIB e 49% de des(4c-dimetilamino)-4£-metiltiopristinamicina IA.

Diagrama de diffacção X:

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Distância interreticular (À) 15,8 100 10,3 47 5,9 61 5,2 84 5,0 59

Exemplo 11

Operando como no Exemplo 10, mas a partir de 106 mg de pristinamicina IIB e de 86 mg de des^-dimetilamino)-4c-metilaminopristinamicina IA e após 18 horas de agitação, obtêm-se 41 mg da associação co-cristalinizada de 2 moléculas de pristinamicina IIB e de uma molécula de des^-dimetilamino)-4s-metilaminopristinamicina IA, sob a forma de cristais brancos, com um título de aproximadamente 53% de pristinamicina IIB e 47% de des(4ê-dimetilamino)-4s-metilaminopristinamicina IA.

Diagrama de difracção X:

Distância interreticular (Á) 15,8 100 10,3 31 5,9 31 5,2 41 5,0 30

Exemplo 12

Operando como no Exemplo 10, mas a partir de 57 mg de pristinamicina IIB e de 48 mg de des^-dimetilamino)^-trifluorometilpristinamicina IA e após 17 horas de agitação, obtêm-se 62 mg da associação co-cristalinizada de 2 moléculas de pristinamicina IIB e de uma molécula de des^-dimetilamino)^-trifluorometilpristinamicina IA, sob a forma de cristais brancos que fundem a 183°C, com um título de aproximadamente 55% de pristinamicina IIB e 45% de des(4c-dimetilammo)-4£-trifluorometilpristinamicina IA.

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EP 0 773 956 / PT 20

Exemplo 13

Operando como no Exemplo 10, mas a partir de 370 mg de pristinamicina IIB e de 300 mg de des^-dimetilamino)-4s-rnetoxipristinarnicina IA e após 17 horas de agitação, obtêm-se 330 mg da associação co-cristalinizada de 2 moléculas de pristinamicina IIB e de uma molécula de des^-dimetilamino)-4s-metoxipristinamicina IA, sob a forma de cristais brancos que fundem a 180°C, com um título de aproximadamente 48% de pristinamicina IIB e 52% de des^-dimetilamino)-4s-metoxipristinamicina IA.

Diagrama de diíracção X:

Distância interreticular (À) | 15,5 | 52 10,5 62 9,7 : 100 5,2 J 42 4,7 í 52

Exemplo 14

Operando como no Exemplo 10, mas a partir de 70 mg de pristinamicina IIB e de 75 mg de des^-dimetilamino)-48-fluoro^-metilpristinamicina Ia (com um título de 75%) e após 3 horas e 45 minutos de agitação, obtêm-se 57 mg da associação co-cristalinizada de 2 moléculas de pristinamicina ΙΙΒ e de uma molécula de des^-dimetilamino)-4s-fluoro-4ç-metilpristinamicina IA, sob a forma de cristais brancos que fundem a 184°C, com um título de aproximadamente 53% de pristinamicina IIB e 47% de des(4£-dimetilamino)-4s-fluoro-4ç-metilpristinamicina IA.

Diagrama de difracção X:

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Distância interreticular (Â) 15,8 100 10,3 71 5,9 54 5,2 88 5,0 50

Exemplo 15

Operando como descrito acima no Exemplo 1, mas utilizando 61 mg de pristinamicina IIB e 50 mg de 4s-etoxi-des(4c-dimetilamino)pristinamicina IA em 0,6 cmJ de acetona, obtêm-se 30 mg da associação co-cristalinizada de 2 moléculas de pristinamicina IIB e de uma molécula de 4s-etoxi-des(4ê-dimetilamino)pristinamicina IA, sob a forma de cristais brancos que fundem a 182°C, com um título de 59% de pristinamicina IIB e 41% de 4s-etoxi-des^-dimetilamino)pristinamicina IA.

Diagrama de diffacção X:

Distância interreticular (À) 15,5 32 9,9 100 5,3 59 4,7 47 _ 3,5 36

Exemplo 16

Operando como descrito acima no Exemplo 1, mas utilizando 97 mg de pristinamicina IIB e 80 mg de 4ξ-βΐοχί^β5(4ξ^ίηΐ6ίίΐ3ΐηίηο)ρι·Ϊ3ϋη3ππϋϊηη IA em 0,7 cm3 de acetona, obtêm-se 100 mg da associação co-cristalinizada de 2 moléculas de pristinamicina IIB e de uma molécula de 4ξ-εΐοχϊ^ε5(4ξ^Μεΰ^Γηϊηο)ρΓί8ΐΪΜηικΰΜ IA, sob a forma de cristais brancos que fundem a 196°C, com um título de 54.6% de pristinamicina IIB e 45,4% de 4ξ-etoxi-des(4ξ-dimetilamino)pristinamicina IA.

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Exemplo 17

Operando como descrito acima no Exemplo 1, mas utilizando 56 mg de pristinamicina IIB e 47 mg de 44-aliloxi-des(4d-dimetilamino)pristinamicina ΙΛ em 0,5 cm3 de acetona, obtêm-se 67 mg da associação co-cristalinizada de 2 moléculas de pristinamicina IIB e de uma molécula de 44-aliloxi-des(44-dimetilamino)pristinamicina IA, sob a forma de cristais brancos que fundem a 196°C, com um título de 57.1% de pristinamicina IIB e 42,9% de 44-aliloxi-des(44-dimetilamino)pristinamicina ΙΛ.

Exemplo 18

Operando como descrito acima no Exemplo 1, mas utilizando 62 mg de pristinamicina IIB e 53 mg de 4c-etilammo-des(4ç-dimetilamino)pnstinamicina IA em 0,6 cnr de acetona, obtêm-se 47 mg da associação co-cristalinizada de 2 moléculas de pnstinamicina IIB e de uma molécula de 4c-etilamino-des(4c-dimetilamino)pristinamicina IA, sob a forma de cristais brancos que fundem a 188°C, com um título de 55,7% de pristinamicina IIB e 44,3% de 4c-etilammo-des(4c-dimetilamino)pristmamicma IA.

Exemplo 19

Operando como descrito acima no Exemplo 1, mas utilizando 178 mg de pnstinamicina IIB e 153 mg de 4c-trifluorometoxi-des(44-dimetilamino)pristinamicina IA em 1,8 cmJ de acetona, obtêm-se 188 mg da associação co-cristalinizada de 2 moléculas de pristinamicina IIB e de uma molécula de 44-trifluorometoxi-des(44-dimetilamino)~ pristinamicina IA, sob a forma de cristais brancos que fundem a 184°C, com um título de 54,1% de pristinamicina IIB e 45,9% de 44-trifluorometoxi-des(4q-dimetilamino)-pristinamicina IA.

Diagrama de difracçào X:

86 242 ΕΡ Ο 773 956 / ΡΤ 23

Distância interreticular (Â) 15,7 71 5,9 52,4 5,2 100 5 | 73 4,7 j 41,1 - _.)

Exemplo 20

Operando como descrito acima no Exemplo 1, mas utilizando 61 mg de pristinamicina IIB e 50 mg de 4s-metiltio-des(4£-dimetilamino)pristinamicina IA em 0,6 cm3 de acetona, obtêm-se 38 mg da associação co-cristalinizada de 2 moléculas de pristinamicina IIB e de uma molécula de 4c-metiltio-des(4c-dimetilamino)pristinamicina IA, sob a forma de cristais brancos que fundem a 188°C, com um título de 53.1% de pristinamicina IIB e 46,9% de 4s-metiltio-des(4£-dimetilamino)pristinamicina Ia·

Diagrama de diffacção X:

Distância interreticular (A) j 15,8 100 10,4 38 5,9 53 5,2 61 5,0 51

Exemplo 21

Operando como descrito acima no Exemplo 1, mas utilizando 35 mg de pristinamicina IIB e 30 mg de 4£-(aliletilamino)-des(4c-dimetilamino)pristinamicina IA em 0,3 cmJ de acetona, obtêm-se 30 mg da associação co-cristalinizada de 2 moléculas de pristinamicina IIB e de uma molécula de 4c-(aliletilamino)-des(4£-dimetilamino)-pristinamicina IA, sob a forma de cristais brancos que fundem a 174°C, com um título de 52,3% de pristinamicina IIB e 47,7% de 4ç-(aliletilamino)-des(4£-dimetilamino)-pristinamicina IA.

86 242 ΕΡ Ο 773 956 / ΡΤ

Exemplo 22

Operando como descrito acima no Exemplo 1, mas utilizando 42 mg de pristinamicina IIB e 36 mg de 4c-(etilpropilamino)-des(4ç-dimetilamino)pristinamicina Ia em 0,5 cm3 de acetona, obtêm-se 16 mg da associação co-cristalinizada de 2 moléculas de pristinamicina IIB e de uma molécula de 4ξ-(6ΡΐρΓορϊ1ηηιϊηο)Ηΐβ5(4ς^ίηιβΐϊΐ3ΐηΐηο)-pristinamicina Ia, sob a forma de cristais brancos que fundem a 193°C, com um título de 51% de pristinamicina IIB e 49% de 4ξ-(είί1ρΓορί lamino )-des^-dimetilamino)-pristinamicina Ia-

Preparação dos componentes do Grupo B:

Exemplo A 4s-cloropristinamicina Ia

Colocam-se num balão 8 g de pristinamicina IA em 80 cm'’ de acetonitrilo e depois adicionam-se 1,39 g de N-clorosuccinimida. A mistura é aquecida em refluxo durante 16 horas e 30 minutos e em seguida adicionam-se 0,12 g de N-clorosuccinimida e prossegue-se o refluxo durante 3 horas. A mistura reaccional é concentrada à secura sob pressão reduzida (2,7 kPa) a 30°C. O sólido obtido é retomado por 50 cnr de diclorometano e 60 cm3 de água destilada adicionada de cloreto de sódio, a fase aquosa é decantada e depois a fase orgânica é lavada com 50 cm3 de água destilada saturada em cloreto de sódio. A fase orgânica é decantada, seca sobre sulfato de magnésio, filtrada e em seguida concentrada à secura sob pressão reduzida (2,7 kPa) a 30°C, para dar um sólido amarelo que é recristalizado em 100 cm" de 1-propanol em refluxo e depois uma segunda vez em 50 cm3 de 1-propanol em refluxo. Após arrefecimento, filtração dos cristais e secagem sob pressão reduzida (135 Pa) a 50°C, obtêm-se 3 g de 48-cloropristinamicina IA sob a forma de cristais bege claro que fundem a 220°C.

Espectro de R.M.N. do protão (300 MHz, CDCh, ó em ppm): 0,58 (dd, J = 16 e 6 Hz, 1H, 5 β2), 0,91 (t, J = 7,5 Hz, 3H: CH3 2 γ), de 1,05 a 1,35 (mt, 2H: 3 β2 e 3 γ2), 1,32 (d, J = 7,5 Hz, 3H: CH3 1 γ), de 1,50 a 1,85 (mt, 3H: 3 y, e CH2 2 β), 2,03 (mt, 1H, 3 β,), 2,17 (mt, 1H, 5 δ2), 2,39 (d largo, J = 16 Hz, 1H: 5 δ,), 2.44 (d, J = 16 Hz, 1H: 5 β,), 2,77 (s. 6H: N(CH3)2 4), 2,85 (dt, J = 13,5 e 4,5 Hz, 1H: 5 ε2), 2,97 (dd, J - 12 e 5 Hz, 1H: 4 β2), 3,23 (s, 3H: NCH3 4), 3,35 (t, J = 12 Hz, 1H: 4 β,), 3,30 e 3,58 (2 mts, 1H cada um: CH2 3 δ), 4,57 (dd, J = 8 e 7,5 Hz, 1H, 3 a), 4,76 (dd largo, J = 13,5 e 8 Hz, 1H: 5 ε2), 4,85 86 242 ΕΡ Ο 773 956 / ΡΤ 75

(d largo, J = 6 Hz, 1H: 5 α), 5,86 (d, J = 9,5 Hz, 1H: 6 a), 5,90 (mt, 1H: 1 β), 6,50 (d, J = 10 Hz, 1H: NH 2), 6,97 (d, J = 8 Hz. 1H: H 5 do aromático em 4), 7,08 (dd, J = 8 e 2 Hz, 1H: H 6 do aromático em 4), 7,43 (dd, J = 8,5 e 2 Hz, 1 Η: Γ H4). 7,52 (dd, J = 8,5 e 4,5 Hz, 1H: Γ Hs), 7.83 (dd, J = 4,5 e 2 Hz, 1H: 1’ Hft), 8,38 (d, J = 10 Hz, 1H: NH 1), 8,73 (d, J = 9,5 Hz, 1H: NH 6), 11,65 (s, 1H: OH).

Exemplo B

4s-bromopristinamicina IA

Colocam-se num balão 30 g de pristinamicina IA em 300 cmJ de diclorometano e depois adicionam-se 6,85 g de N-bromosuccinimida. A mistura é agitada à temperatura ambiente durante 29 horas e depois concentrada à secura sob pressão reduzida. O sólido obtido é agitado em 400 cm’' de éter dietílico, filtrado e em seguida lavado por 2 vezes com 100 cm’’ de éter dietílico. Após filtração o sólido é triturado durante 45 minutos em 400 cm3 de água destilada, filtrado e em seguida lavado por 2 vezes com 150 cmJ de água. O sólido obtido é seco e em seguida recristalizado em 1600 cm' de etanol em refluxo. Após arrefecimento, filtração dos cristais e secagem sob pressão reduzida (135 Pa) a 50°C, obtêm-se 23,2 g de 4a-bromopristinamicina IA sob a fomia de cristais brancos que fundem a 220°C.

Espectro de R.M.N. do protão (300 MHz, CDCE. ô em ppm): 0,58 (dd, J = 16 e 6 Hz. 1H, 5 β2), 0,91 (t, J = 7,5 Hz. 3H: CH? 2 y), de 1,10 a 1.40 (mt, 2H: 3 β: e 3 y2), 1,32 (d. J = 7,5 Hz, 3H: CH3 1 γ), de 1.50 a 1,85 (mt, 3H: 3 y, e CH2 2 β), 2,03 (mt, 1H, 3 β,), 2.19 (mt, 1H, 5 δ2), 2,39 (d largo. J = 16 Hz. 1H: 5 δ,), 2.44 (d, J = 16 Hz, 1H: 5 β,), 2,76 (s. 6H: N(CH3)2 4), 2,83 (dt. J = 13.5 e 4 Hz. 1H: 5 ε2), 2.97 (dd, J - 12,5 e 4,5 Hz, 1H: 4 β2), 3,23 (s, 3H: NCH3 4), 3,30 e 3.57 (2 mts, 1H cada um: CH2 3 5), 3,33 (t, J = 12,5 Hz, 1H: 4 β,), 4,55 (dd, J = 8 e 7,5 Hz. 1H, 3 a). 4,74 (dd largo, J = 13,5 e 8 Hz, 1H: 5 ε,), 4,84 (mt, 1H: 2a), 4,92 (dd, J = 10 e 2 Hz, 1H: 1 a), 5,27 (dd. J = 12,5 e 4,5 Hz, 1H: 4 a), 5,33 (d largo, J = 6 Hz, 1H: 5 a), 5,88 (d. J = 9,5 Hz, 1H: 6 a), 5,90 (mt, 1H: 1 β), 6,53 (d, J = 10 Hz, 1H: NH 2), 7,00 (d, J = 8 Hz. 1H: H 5 do aromático em 4), 7,12 (dd, J = 8 e 2 Hz, 1H: H 6 do aromático em 4), de 7,15 a 7.40 (mt, 5H: H aromáticos 6), 7,43 (dd, J = 8,5 e 2 Hz, 1H: 1' Ri), 7,46 (d, J = 2 Hz, 1H: H 2 do aromático em 4), 7.52 (dd, J = 8,5 e 4,5 Hz, 1H: 1 ’ H5), 7.87 (dd, J = 4,5 e 2 Hz, 1H: 1’ H(,), 8.41 (d. J = 10 Hz. 1H: NH 1), 8,74 (d, J = 9.5 Hz, 1H: NH 6), 11,65 (s, 1H: OH).

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Exemplo C 46-cloropristinamicina Ιβ

Operando como no Exemplo A, mas a partir de 1.7 g de pristinamicina IB, de 320 mg de N-clorosuccinimida em 17 cm3 de acetonitrilo, obtêm-se após 1 hora e 30 minutos de refluxo, seguido de concentração à secura da mistura reaccional, 1,8 g de um sólido bege que é purificado por cromatografia instantânea (eluente diclorometano-metanol, 98/2), para dar 1,2 g de 4s-cloropristinamicina IB sob a forma de um sólido amarelo pálido que funde a 198°C.

Espectro de R.M.N. do protão (400 MHz, CDC1;„ ò em ppm): 0,79 (dd, J = ló e 5,5 Hz. 1H, 5 β2), 0,91 (t, J = 7,5 Hz, 3H: CH3 2 y), 1,15 (mt, 1H: 3 β2), de 1,25 a 1,40 (mt, 1H: 3 y2), 1,34 (d, J = 7,5 Hz, 3H: CH3 1 y), de 1,50 a 1,85 (mt, 3H: 3 γι e CH: 2 β), 2,03 (mt, 1H, 3 β,), 2,23 (mt, 1H, 5 Ô2), 2,40 (d largo, J = 16 Hz, 1H: 5 Ô,), 2,47 (d. J - 16 Hz, 1H: 5 β,), 2.85 (dt, J = 13 e 4 Hz, 1H: 5 ε:). de 2,85 a 2.90 (mt, 1H: 4 β2), 2,88 (s, 3H: A1-NCH3 4), 3,25 (s, 3H: NCH3 4), 3.28 e 3,58 (2 mts, IH cada um: CH2 3 δ), 3,31 (t, J = 12 Hz, 1H: 4 β,), 4,40 (mf. 1H: ArNH), 4,57 (t. J = 7.5 Hz. 1H, 3 a), 4,78 (dd largo, J = 13 e 8 Hz, 1H: 5 ει), 4,84 (mt. 1H: 2a), 4,91 (d largo. J = 10 Hz. 1H: 1 a), 5,23 (dd, J = 12 e 5 Hz, 1H: 4 a), 5,36 (d largo, J = 5,5 Hz. 1H: 5 a), 5,89 (d, J = 9,5 Hz, 1H: 6 a), 5,90 (mt, 1H: 1 β), 6,51 (d. J = 10 Hz. 1H: NH 2), 6,55 (d. J = 8 Hz, 1H: H 5 do aromático em 4), 7,02 (dd, J = 8 e 2 Hz, 1H: H 6 do aromático em 4), 7,15 a 7.40 (mt, 5H: H Aromáticos 6), 7,43 (d largo, J = 8,5 e 2 Hz, 1H: Γ H4). 7,52 (dd. J = 8,5 e 4.5 Hz, 1H: Γ Hj), 7.79 (d largo, J - 4,5 e 2 Hz, 1H: Γ H6), 8,40 (d. J = 10 Hz. 1H: NH 1), 8,75 (d, J = 9,5 Hz, 1H: NH 6), 11,63 (s, 1H: OH).

Exemplo D

4e-bromopristinamicina IB

Operando como no Exemplo B, mas a partir de 2 g de pristinamicina Ib, de 420 mg de N-bromosuccinimida em 30 cm'’ de diclorometano. obtêm-se após 1 hora e 30 minutos de agitação à temperatura ambiente, seguida de concentração à secura da mistura reaccional, 2,1 g de um sólido bege que é purificado por cromatografia instantânea (eluente diclorometano-metanol. 98/2), para dar 1,7 g de 4s-bromopristinamicina Ib sob a forma de um sólido branco pálido que funde a 220°C.

86 242 £L

EP 0 773 956 / PT e’^ 27

Espectro de R.M.N. do protão (400 MHz, CDCh, ô em ppm): 0,80 (dd, J = 16 e 5,5 Hz, 1H, 5 β2), 0,90 (t, J = 7,5 Hz, 3H: CH3 2 γ), 1,13 (mt, IH: 3 β2), de 1,20 a 1,40 (mt, 1H: 3 y2), 1,33 (d, J = 7,5 Hz, 3H: CH3 1 γ), de 1,50 a 1,85 (mt, 3H: 3 γ, e CH2 2 β), 2,03 (mt, 1H, 3 β,), 2,28 (mt, IH, 5 δ2), 2,40 (d largo, J = 16 Hz, IH: 5 δ,), 2,46 (d, J = 16 Hz, 1H: 5 β,), 2,85 (dt, J = 13 e 5 Hz, IH: 5 s2), 2,88 (d. J = 5,5 Hz, 3H: ArNCH3 4), 2,90 (dd, J = 12 e 4 Hz, IH: 4 β2), 3,24 (s, 3H: NCH3 4), 3,30 e 3,58 (2 mts, IH cada um: CH2 3 δ), 3,31 (t, J = 12 Hz, IH: 4 β,), 4,41 (q, J = 5,5 Hz, IH: ArNH), 4,57 (t, J = 7,5 Hz, IH, 3 a), 4,78 (dd largo, J = 13 e 8 Hz, IH: 5 ε,), 4,85 (mt, IH: 2a), 4,91 (d largo, J = 10 Hz, IH: 1 a), 5,24 (dd, J = 12 e 4 Hz, IH: 4 a), 5,37 (d largo, J = 5,5 Hz. IH: 5 a), 5,89 (d, J = 9,5 Hz, IH: 6 a), 5,90 (mt, IH: 1 β), 6,51 (d, J = 10 Hz. IH: NH 2), 6,53 (d, J = 8 Hz, IH: H 5 do aromático em 4), 7,05 (dd, J = 8 e 2 Hz, IH: H 6 do aromático em 4), de 7,15 a 7,40 (mt, 6H: H Aromáticos 6 e H 2 do aromático em 4), 7,43 (d largo, J = 8,5 Hz, IH: Γ H4), 7,48 (dd, J = 8,5 e 5 Hz, IH: 1 ’ H5), 7,79 (d largo, J = 5 Hz, IH: Γ H6), 8,40 (d, J = 10 Hz, IH: NH 1), 8,76 (d, J = 9,5 Hz, IH: NH 6), 11,63 (s, IH: OH).

Exemplo E 48-alilpristinamícína Ia

Colocam-se num balão de três tubuladuras mantido sob atmosfera de azoto, 7,07 g de acetato de sódio em 100 cm' de água destilada. A solução é levada a refluxo, em seguida adiciona-se por meio de um ampola de adição uma solução de 15,5 g de brometo de 4-N-alilamóniopristinamicina IA em 100 cm' de água destilada. Após 2 horas de reacção, adiciona-se 1 g de acetato de sódio e a mistura é agitada 22 horas em refluxo. Adiciona-se uma nova porção de 5 g de acetato de sódio e a reacção prossegue durante 20 horas. O precipitado formado é filtrado a quente, lavado por 2 vezes com 50 cmJ de água destilada e depois seco sob pressão reduzida (2,75 kPa) para dar 7 g de um sólido branco que é purificado por cromatografia instantânea (eluente: tolueno. acetona 70/30), para dar 4,6 g de 4s-alilpristinamicina IA sob a forma de um sólido branco que funde a 160°C.

Espectro de R.M.N. do protão (400 MHz, CDC13, δ em ppm): 0,42 (dd, J = 16 e 5,5 Hz, IH, 5 β2), 0,92 (t, J = 7,5 Hz, 3H: CH3 2 γ), de 1,15 a 1,40 (mt, 2H: 3 β2 e 3 γ2), 1,33 (d, J = 7,5 Hz, 3H: CH3 1 γ), de 1,55 a 1,80 (mt, 3H: 3 γ, e CH2 2 β), 2,00 a 2,15 (mt, 2H, 3 β, e 5 δ2), 2,30 (d largo, J = 16 Hz, IH: 5 Ô,), 2,33 (d, J = 16 Hz, IH: 5 β,), 2,63 (s, 6H: N(CH3)2 4), 2,76 (dt, J = 13,5 e 4,5 Hz, IH: 5 ε2), 2,98 (dd, J = 12 e 4,5 Hz, IH: 4 β2), de 3,20 a 3,40 (mt, 3H: 4 β, - 3 Ô, e IH do ArCH2 alilo), 3,25 (s, 3H: NCH3 4), 3,48 (dd, J = 16 e 6,5 Hz, IH: 0 outro H do ArCH? alilo), 3,56 (mt, IH: 3 ô2), 4,57 (dd, J = 6,5 e 7,5 Hz, IH,

86 242 ΕΡ Ο 773 956 / ΡΤ 28 3 α), 4,68 (dd largo, J = 13,5 e 7,5 Hz, 1H: 5 ε,), 4,84 (mt, 1H: 2a), 4,90 (d largo, J = 10 Hz, 1H: 1 a), de 5,00 a 5,15 (mt, 2H: - CH2), 5,23 (d largo, J = 5,5 Hz, 1H: 5 a), 5,28 (dd, J = 12 e 4,5 Hz, 1H: 4 a), de 5,80 a 5,95 (mt, 3H: 6 α - 1β e CH. alilo), 6,53 (d, J = 10 Hz, 1H: NH 2), 7,04 (mt, 3H: H Aromáticos em 4), de 7,15 a 7.40 (mt, 5H: H Aromáticos 6), 7,45 (dd, J = 8,5 e 2 Hz, 1H: Γ H4), 7.48 (dd, J = 8,5 e 4 Hz. 1H: Γ H5), 7,88 (dd, J - 4 e 2 Hz, 1H: Γ H(,), 8,45 (d, J = 10 Hz, 1H: NH 1), 8,76 (d, J = 9,5 Hz, 1H: NH 6), 11,64 (s, 1H: OH). O brometo de 4-N-alilamómo-pristinamicina IA pode ser preparado da seguinte maneira:

Colocam-se num balão de três tubuladuras mantido sob atmosfera de azoto, 10 g de pristinamicina IA em solução em 25 cm'’ de 1,2-dicloroetano e em seguida 2,5 cmJ de brometo de alilo. A mistura é aquecida durante 7 horas a 40°C e depois é agitada à temperatura ambiente durante 14 horas. Adicionam-se então, sob agitação em 10 minutos, 200 cmJ de tolueno e a mistura é agitada 30 minutos. O precipitado formado é filtrado, lavado com 50 cm3 de tolueno e depois seco sob pressão reduzida (135 Pa) a 45°C para dar 10,5 g de um sólido que é triturado em 200 cm' de acetato de etilo a 40°C e depois à temperatura ambiente durante 1 hora. O sólido é filtrado, em seguida seco a 45°C sob pressão reduzida (135 Pa) para dar 10 g de brometo de 4-N-alilamónio-pristinamicina IA sob a forma de um sólido branco que funde a cerca de 210°C.

Espectro de R.M.N. do protão (400 MHz, CDCF com adição de algumas gotas de CD3 OD d4, Ô em ppm): 0,75 (t, J = 7,5 Hz, 3H: CH3 2 γ), de 1,00 a 1,35 (mt, 3H: 3 β2 - 3 γ2 e 5 β2), 1,18 (d, J = 7,5 Hz, 3H: CH? 1 γ), de 1,45 a 1,65 (mt, 3H: 3 v, e CH2 2 β), 1,95 (mt, 1H, 3 βι), 2,15 (mt, 1H: 5 δ2), 2.28 (d largo, J = 16 Hz, 1H: 5 õ,), 2,55 (d, J = 16 Hz, 1H: 5 βι), 2,72 (dt, J = 13,5 e 4,5 Hz, 1H: 5 ε2), 2,95 (s, 3H: NCH:, 4), de 3,10 a 3,50 (mt, 4H: CH2 4 β e CH2 3 δ), 3,40 e 3.48 (2s. 6H na totalidade: N(CH:,)2 4), 4,35 (t, J = 7,5 Hz, 1H, 3 a), de 4,40 a 4,60 (mt, 3H: NCH2 alilo e 5 ει), 4.60 (mt. 1H: 2a), 4,93 (s largo, 1H: 1 a), de 5,30 a 5,75 (mt, 7H:= CH2 alilo - 5α-4α-6α-IpeCH. alilo), 6,88 (d, J = 10 Hz, 1H: NH 2), 7,05 a 7,25 (mt, 8H: H Aromáticos 6 - Γ H4 e 4 ò), 7,35 (dd, J = 8 e 4 Hz, 1H: 1’ H5), 7,60 (d, J = 8,5 Hz, 2H: 4 ε), 7,65 (mt, 1H: F H6), 8.58 (d, J = 9,5 Hz, 1H: NH 6).

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Exemplo F

Preparação da 4Ç-terc-butil-des(4ê-dimetilamino)pristinamicina I.,\

Realiza-se à escala de 60 erlenmeyers uma cultura da estirpe SP92::pVRC508 em meio de produção com adição, ao fim de 16 horas, de 1 mi de uma solução a 5 g/1 em soda 0,1N de 4-terc-butilfenilalanina(R,S). Ao fim de 40 horas de cultura, os 1,8 litros de mosto obtidos em 60 erlenmeyers são extractados por 2 volumes de uma mistura de 66% de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 e 34% de acetonitrilo e depois centrifugados. O sobrenadante é extractado por 2 vezes com 0,5 volumes de diclorometano. As fases clorometilénicas são lavadas com água, depois combinadas, secas sobre sulfato de sódio e evaporadas. O extracto seco é retomado por 20 ml de diclorometano e injectado sobre uma coluna de sílica (30 g) montada em diclorometano e eluída sucessivamente por gradientes de 0 a 10% de metanol em diclorometano. As fracções contendo o novo derivado de pristinamicina Ia são reagrupadas e evaporadas. O resíduo seco é retomado por 7 ml de uma mistura de 60% de água e 40% de acetonitrilo e injectado em 2 vezes sobre uma coluna semi-preparativa Nucléosil 7μ C8 10x250 mm (Macherey Nagel) eluída com uma mistura de 55% de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 e 45% de acetonitrilo. As fracções contendo a nova pristinamicina são reagrupadas e extractadas por um volume de diclorometano. A fase orgânica é lavada com água, seca sobre sulfato de sódio e em seguida evaporada. Obtêm-se 30 mg de 4£-terc-butil-des(4c-dimetilamino)pristinamicina ÍA.

Espectro de R.M.N. do protão (400 MHz, CDCh. ò em ppm, ref. TMS): 0,21 (dd, J = 16 e 5,5 Hz, 1H, 5 β2), 0,91 (t. J = 7,5 Hz, 3H: OH 2 y), 1,17 (mt, 1H: 3 β2) de 1,20 a 1,40 (mt, 1H: 3 y2), 1,33 (s, 9H: CHj do terc-butilo), 1.35 (d, J = 7,5 Hz, 3H: CH3 1 γ), de 1,50 a 1,85 (mt, 3H: 3 y, e CH2 2 β), 2,04 (mt. 1H, 3 β,). 2,13 (mt, 1H. 5 Õ2), 2,30 (mt, 2H: 5 õi e 5 β0, 2,80 (dt, J = 13 e 4 Hz, 1H: 5 ε2), 3,00 (dd, J = 12 e 4 Hz. IH: 4 β2), 3,29 (s, 3H: NCH-s 4), 3,31 e 3,59 (2 mts, 1H cada um: CH2 3 δ), 3,40 (t. J = 12 Hz, 1H: 4 β,), 4,57 (t, J = 7,5 Hz, 1H, 3 a), 4,74 (dd largo, J = 13 e 7 Hz. 1H: 5 ε,), 4,85 (mt, 1H: 2a), 4,90 (d largo, J = 10 Hz, 1H: 1 a), 5,21 (d largo, J = 5,5 Hz, IH: 5 a), 5,25 (dd, J = 12 e 4 Hz, 1H: 4 a), 5,87 (d, J = 9 Hz, IH: 6 a), 5,92 (q largo, J = 7.5 Hz, 1H: 1β), 6,56 (d, J = 9,5 Hz, 1H: NH 2), de 7,10 a 7,30 (mt, 5H: H Aromáticos 6), 7,28 (dd, J = 7,5 Hz, 2H: 4δ), 7,38 (d, J = 7,5 Hz, 2H: 4ε), 7,49 (d largo, J = 8,5 Hz, IH: Γ HL·), 7.53 (dd, J = 8,5 e 4 Hz, IH: 1’ Hs), 7,86 (dd, J = 4 Hz, IH: Γ H(l), 8,45 (d, J = 10 Hz, IH: NH 1), 8.74 (d, J = 9Hz, IH: NH 6), 11,65 (s. IH: OH).

86 242 ΕΡ Ο 773 956 / ΡΤ 30 Ο cloridrato de 4-terc-butilfenilalanina (R,S) pode ser preparado da seguinte maneira:

Para um balão de três tubuladuras equipado com refrigerante adicionam-se 25 g de 4-(terc-butil)benzilacetamidomalonato de dietilo e 250 ml de ácido clorídrico a 37%. A mistura é agitada e aquecida em refluxo até que não haja mais despreendimento gasoso. Após arrefecimento da mistura reaccional o precipitado obtido é filtrado e depois recristalizado em acetonitrilo para dar 25.6 g de cloridrato de 4-terc-butilfenilalanina (R,S) sob a forma de um sólido branco que funde a 234°C. O 4-(terc-butil)benzilacetamidomalonato de dietilo pode ser preparado da seguinte maneira:

Para um balão de três tubuladuras equipado com refrigerante adicionam-se sob atmosfera de azoto, 25 g de brometo de 4-terc-butilbenzilo. 50 ml de tolueno anidro e 3,1 g de hidreto de sódio em suspensão em óleo a 80% e em seguida 21,8 g de acetamidomalonato de dietilo. A mistura é aquecida a 110°C durante 17 horas. Após arrefecimento, adiciona-se lentamente com o auxílio de uma ampola de adição, 15 ml de etanol absoluto, depois 15 ml de etanol a 50% e depois 50 ml de água. A fase orgânica é decantada e a fase aquosa é lavada por 3 vezes com 50 ml de éter dietílico. As fases orgânicas são reunidas, lavadas com água e depois secas sobre sulfato de sódio. Após filtração e concentração sob pressão reduzida, o produto é cristalinizado em éter de petróleo para dar 25 g de 4-(terc-butil)benzilacetamidomalonato de dietilo sob a forma de um sólido branco que funde a 80°C. O mutante SP92::pVRC508 foi cultivado em meio de produção líquido. A fermentação foi realizada como se segue: 0.5 ml de uma suspensão de esporos da estirpe anteriormente citada são adicionados em condições estéreis a 40 ml de meio de inoculação num erlenmeyer com chicanas, de 300 ml. O meio de inoculação é constituído por 10 g/1 de “Com Steep”, 15 g/1 de sacarose. 10 g/1 de (NH4)2S04. 1 g/1 de K2HPO4, 3 g/1 de NaCl, 0,2 g/1 de MgS04-7H20 e 1.25 g/1 de CaCO?. O pH é ajustado a 6,9 por meio de soda antes da introdução do carbonato de cálcio. Os erlenmeyers são agitados durante 44 horas a 27°C num agitador rotativo à velocidade de 325 rpm. 2,5 ml da cultura precedente com a idade de 44 horas são adicionados de forma estéril a 30 ml de meio de produção num erlenmeyer de 300 ml. O meio de produção é constituído por 25 g/1 de farinha de soja, 7,5 g/1 de amido, 22,5 g/1 de glucose, 3,5 g/1 de levedura de forragem, 0.5 g/1 de sulfato de zinco e 6 g/1 de carbonato de cálcio. O pH é ajustado a 6,0 por meio de ácido clorídrico, antes da introdução do carbonato de cálcio. Os erlenmeyers são agitados a 27°C num agitador rotativo à velocidade de 325 rpm. Ao fim de 16 horas. 1 ml de uma solução de um dos precursores

86 242 ΕΡ Ο 773 956 /ΡΤ listados na tabela 3 (geralmente 5 ou 10 g/1) é adicionado à cultura. Esta é terminada 8 ou 24 horas mais tarde. De imediato o volume de mosto é determinado e adicionam-se-lhe 2 volumes de fase móvel composta por 34% de acetonitrilo e 66% de uma solução de 0,1M de KH2PO4 (ajustada a pH 2,9 por H3PO4 concentrado) que permite a extracção das pristinamicinas. Após agitação, 0 todo é centrifugado e as pristinamicinas contidas no sobrenadante são extractadas e purificadas. São igualmente doseadas por HPLC injectando 150 μΐ do sobrenadante de centrifugação sobre uma coluna Nucléosil 5-C8 de 4,6 x 150 mm, eluída por uma mistura de 40% de acetonitrilo e de 60% de tampão fosfato 0,1M pH 2,9.

Exemplo G

Preparação da 4ξ-Ϊ3ορΓορϊΜβ5(4ξ-4ίΓηεύΐ3ΐτπηο)ρπ5ΐ^ηιίοίηη IA

Realiza-se à escala de 60 erlenmeyers uma cultura da estirpe SP92::pVRC508 em meio de produção com adição, ao fim de 16 horas, de 1 ml de uma solução a 10 g/1 em soda 0,1N de 4-isopropilfenilalanina (R,S). Ao fim de 40 horas de cultura, os 1,8 litros de mosto obtidos em 60 erlenmeyers são extractados por 2 volumes de uma mistura de 66% de tampão fosfato 100 miM pH 2,9 e 34% de acetonitrilo e depois centrifugados. O sobrenadante é extractado por 2 vezes com 0,5 volumes de diclorometano. As fases clorometilénicas são lavadas com água, depois combinadas, secas sobre sulfato de sódio e evaporadas. O extracto seco é retomado por 20 ml de diclorometano e injectado sobre uma coluna de sílica (30 g) montada em diclorometano e eluída sucessivamente por gradientes de 0 a 10% de metanol em diclorometano. As fracções contendo 0 novo derivado de pristinamicina IA são reagrupadas e evaporadas. Obtêm-se 61 mg de resíduo seco. Este é retomado por 9 ml de uma mistura de 60% de água e 40% de acetonitrilo e injectado em 3 vezes sobre uma coluna semi-preparativa Nucléosil 7μ C8 10x250 mm (Macherev Nagel) eluída com uma mistura de 55% de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 e 45% de acetonitrilo. As fracções contendo a nova pristinamicina são reagrupadas e extractadas por um volume de diclorometano. A fase orgânica é lavada com água, seca sobre sulfato de sódio e em seguida evaporada. Obtêm-se 51 mg de 4ξ-ί3ορΓορϊ1^68(4ξ^™εή1ηιηίηο)ρη5ΐ^πύαΜ ΙΛ.

Espectro de R.M.N. 'H (250 MHz, CDC1?. δ em ppm, ref. TMS): 0,31 (dd, J = 16 e 5.5 Hz, 1H, 5 β2), 0,91 (t, J - 7,5 Hz, 3H: CH:, 2 y). de 1,00 a 1,45 (mt, 2H: 3 β2 e 3 y2), 1,25 (d. J = 7,5 Hz, 6H: CH3 do isopropilo), 1,35 (d, J = 7,5 Hz. 3H: CH3 1 y), de 1,50 a 1,85 (mt, 3H: 3 y, e CH2 2 β), de 1,95 a 2,20 (mt, 2H. 3 β, e 5 ò2), 2,30 (mt, 2H: 5 Ó, e 5 β,), 2,80 (dt, J = 13 e 4 Hz, 1H: 5 ε2), 2,88 (mt, 1H: CH do isopropilo), 2,98 (dd, J = 12 e 4 Hz, 1H: 4 β2), 3,30 (s, 3H: NCH3 4), 3,32 e 3.55 (2 mts, IH cada um: CH2 3 δ), 3,38 (t, J = 12 Hz, 1H: 4 βi), 4,55 (t, J = 7,5 Hz, 1H, 3 a), 4,72 (dd largo. J = 13 e 7 Hz, 1H: 5 S|), 4,85 (mt, 1H:

86 242 ΕΡ Ο 773 956 / ΡΤ 2α), 4,88 (d largo, J = 10 Hz, IH: 1 α), 5,21 (d largo, J = 5.5 Hz, 1H: 5 a), 5,25 (dd, J = 12 e 4 Hz, 1H: 4 a), 5,87 (d, J = 9 Hz. 1H: 6 a), 5,90 (q largo, J = 7,5 Hz, 1H: Ιβ), 6,50 (d, J = 9,5 Hz, 1H: NH 2), de 7,05 a 7,35 (mt, 9H: H Aromáticos 6 - 4ε e 4Ô), 7.50 (mt, 2H: Γ Hs e Γ H4), 7,86 (dd, J = 4 e 1,5 Hz, 1H: Γ H(l), 8,40 (d. J = 10 Hz. 1H: NH 1), 8,72 (d, J = 9 Hz, 1H: NH 6), 11,60 (s, 1H: OH). A 4-isopropilfenilalanina (R.S) pode ser preparada da seguinte maneira:

Colocam-se num balão de três tubuladuras 7 g de fósforo vermelho e 8 g de 4-(isopropilbenzilideno)-2-metil-5-oxazolona em 45 ml de anidrido acético e em seguida adiciona-se lentamente sob agitação, com o auxílio de uma ampola de adição 35 ml de ácido iodídrico a 57%. No final da adição a mistura é aquecida durante 3 horas e 30 minutos em refluxo e depois deixada 3 dias à temperatura ambiente. A mistura reaccional é filtrada, o sólido obtido é lavado por 2 vezes com 10 ml de ácido acético e em seguida o filtrado é concentrado à secura sob pressão reduzida. O resíduo obtido é retomado por 100 ml de água destilada, concentrado à secura sob pressão reduzida para dar um sólido, o qual é retomado em 50 ml de água destilada e depois extractado por 3 vezes com 50 ml de éter dietílico, após adição de 0,5 g de sulfito de sódio. O éter é decantado e a fase aquosa é colocada sob pressão reduzida para eliminar os traços de éter dietílico. Adiciona-se à fase aquosa 2 g de negro animal, aquece-se a 40-50°C, filtra-se sobre Clareei e lava-se com um mínimo de água. O pH é ajustado a 5 por adição, a 4°C, de amoníaco a 32%. O precipitado obtido é filtrado a frio, lavado por 2 vezes com 10 ml de água, 10 ml de etanol e depois por 2 vezes com 10 ml de éter para dar, após secagem sob pressão reduzida a 20°C. 3,97 g de 4-isopropilfenilalanina (R,S) sob a forma de um sólido branco que funde a uma temperatura superior a 260°C. A 4-(isopropilbenzilideno)-2-metil-5-oxazolona pode ser preparada da seguinte maneira:

Colocam-se num balão equipado com refrigerante, 18,52 g de N-acetilglicina, 10,6 g de acetato de sódio, 20 ml de 4-isopropiIbenzaldeído e 57 ml de anidrido acético. Agita-se durante 30 minutos e em seguida a mistura é agitada 1 hora a 110°C e depois 15 horas à temperatura ambiente. A mistura reaccional é vertida sobre 600 ml de água e 400 ml de éter de petróleo previamente aquecido a 50°C. A fase orgânica é decantada e a fase aquosa é lavada por 2 vezes com 150 ml de éter de petróleo.

As fases orgânicas são reunidas, secas sobre sulfato de magnésio, filtradas e concentradas sob pressão reduzida até 100 ml e obtenção de um precipitado. Este é filtrado, 86 242 ΕΡ Ο 773 956 / ΡΤ -I 33

lavado por 2 vezes com 50 ml de pentano para dar 8,2 g de 4-(isopropilbenzilideno)-2-metil-5-oxazolona sob a forma de um sólido amarelo que funde a 77°C.

Exemplo H

Preparação da 4ç-metoxi-des(4c-dimetilamino)pristinamicina IA

Realiza-se à escala de 12 erlenmeyers uma cultura da estirpe SP92::pVRC508 em meio de produção com adição, ao fim de 16 horas, de 1 ml de uma solução a 5 g/1 em soda 0,1N de 4-metoxifenilalanina (R,S). Ao fim de 40 horas de cultura, os 0,35 litros de mosto obtidos em 12 erlenmeyers são extractados por 2 volumes de uma mistura de 66% de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 e 34% de acetonitrilo e depois centrifugados. O sobrenadante é extractado por 2 vezes com 0,5 volumes de diclorometano. As fases clorometilénicas são lavadas com água, depois combinadas, secas sobre sulfato de sódio e evaporadas. O extracto seco é retomado por 20 ml de diclorometano e injectado sobre uma coluna de sílica (30 g) montada em diclorometano e eluída sucessivamente por gradientes de 0 a 10% de metanol em diclorometano. As fracções contendo o novo derivado de pristinamicina IA são reagrupadas e evaporadas. Obtêm-se 14 mg de resíduo seco. Este é retomado por 3 ml de uma mistura de 60% de água e 40% de acetonitrilo e injectado sobre uma coluna semi-preparativa Nucléosil 7μ C8 10x250 mm (Macherev Nagel) eluída com uma mistura de 60% de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 e 40% de acetonitrilo. As fracções contendo a nova pristinamicina são reagrupadas e extractadas por um volume de diclorometano. A fase orgânica é lavada com água, seca sobre sulfato de sódio e em seguida evaporada. Obtêm-se 12 mg de 4ξ-metoxi-des(4ξ-dimetilamino)pristinamicina IA.

Espectro de R.M.N. !H (400 MHz, CDCh. 6 em ppm. ref. TMS): 0,63 (dd, J = 16 e 5.5 Hz, 1H, 5 β2), 0,96 (t, J = 7,5 Hz, 3H: CH2 2 y), 1.17 (mt, 2H: 3 β2), de 1,30 a 1,45 (mt, 1H: 3 y2), 1,38 (d, J = 7.5 Hz, 3H: CH3 1 y), de 1.55 a 1,85 (mt, 3H: 3 y, e CH2 2 β), 2.05 (mt, 1H, 3 β,), 2,20 (mt, 1H, 5 δ2), 2,40 (d largo, J = 16 Hz, 1H: 5 Ô,), 2.47 (d, J = 16 Hz, 1H: 5 βι), 2,88 (dt, J = 13 e 4 Hz, 1H: 5 ε2), 2,99 (dd, J = 12,5 e 5 Hz, 1H: 4 β2), 3,30 (s, 3H: NCH3 4), 3,32 e 3,60 (2 mts, 1H cada um: CH2 3 ô), 3,40 (t, J = 12,5 Hz, 1H: 4 βι), 3.80 (s, 3H: OCH3), 4,60 (t, J = 7,5 Hz, 1H, 3 a), 4,80 (dd largo, J - 13 e 8,5 Hz, 1H: 5 ε,), 4.88 (mt, 1H: 2a), 4,92 (d largo, J = 10 Hz, 1H: 1 a), 5.31 (dd. J = 12,5 e 5 Hz. 1H: 4 a), 5,34 (dd, J - 5,5 Hz, 1H: 5 a), 5,90 (d, J = 9 Hz. IH: 6 a). 5.93 (q largo, J = 7,5 Hz, 1H: 1 β), 6,54 (d, J = 9 Hz, 1H: NH 2), 6,87 (d, J = 8 Hz, 2H: 4ε), 7.16 (d. J = 8 Hz, 2H: 4δ), de 7,15 a 7,40 (mt, 5H: H Aromáticos 6), 7,50 (mt, 2H: Γ H5 e 1’ H4), 7,80 (dd, J = 4 e 2.5 Hz, 1H: 1’ H6), 8,43 (d, J = 10 Hz, 1H: NH 1), 8,78 (d, J = 9 Hz. 1H: NH 6), 11.65 (s, 1H: OH).

86 242 ΕΡ Ο 773 956 / ΡΤ

Exemplo I

Preparação da4ξ-metil-des(4c-dimetilamino)ρristinamicina ΙΑ

Realiza-se à escala de 60 erlenmeyers uma cultura da estirpe SP92::pVRC508 em meio de produção com adição, ao fim de 16 horas, de 1 ml de uma solução a 5 g/1 em soda 0,1N de 4-metilfeniIaIanina (R,S). Ao fim de 40 horas de cultura, os 1,8 litros de mosto obtidos em 60 erlenmeyers são extractados por 2 volumes de uma mistura de 66% de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 e 34% de acetomtrilo e depois centrifugados. O sobrenadante é extractado por 2 vezes com 0,5 volumes de diclorometano. As fases clorometilénicas são lavadas com água, depois combinadas, secas sobre sulfato de sódio e evaporadas. O extracto seco é retomado por 20 ml de diclorometano e injectado sobre uma coluna de sílica (30 g) montada em diclorometano e eluída sucessivamente por gradientes de 0 a 10% de metanol em diclorometano. As fracções contendo o novo derivado de pristinamicina IA são reagrupadas e evaporadas. Obtêm-se 49 mg de resíduo seco. Este é retomado por 6 ml de uma mistura de 60% de água e 40% de acetonitrilo e injectado em 2 vezes sobre uma coluna semi-preparativa Nucléosil 7μ C8 10x250 mm (Macherey Nagel) eluída com uma mistura de 55% de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 e 45% de acetonitrilo. As fracções contendo a nova pristinamicina são reagrupadas e extractadas por um volume de diclorometano. A fase orgânica é lavada com água, seca sobre sulfato de sódio e em seguida evaporada. Obtêm-se 44 mg de 4ç-metil-des^-dimetilamino)pristinamicina 1Λ.

Espectro de R.M.N. 'H (400 MHz, CDCh, ô em ppm, ref. TMS): 0,52 (dd, J = 16 e 6 Hz, 1H, 5 β2), 0,93 (t, J = 7,5 Hz, 3H: CH3 2 γ), 1,15 (mt, 2H: 3 β2), de 1,20 a 1,40 (mt, 1H: 3 v2), 1,35 (d, J = 7,5 Hz, 3H: CH? 1 γ), de 1,50 a 1,85 (mt, 3H: 3 γ, e CH2 2 β), 2,04 (mt, 1H, 3 β,), 2,18 (mt, 1H, 5 Ô2), de 2,25 a 2,45 (mt, 2H: 5 ó, e 5 β,), 2,36 (s, 3H: ArCH3), 2,S3 (dt, J = 13 e 4 Hz, 1H: 5 ε2), 2,99 (dd, J = 13 e 4 Hz, 1H: 4 β2), 3,28 (s, 3H: NCH3 4), 3,31 e 3,59 (2 mts, 1H cada um: CH2 3 δ), 3,40 (t, J = 13 Hz, 1H: 4 β,), 4,59 (t, J = 7,5 Hz, 1H. 3 a), 4,74 (dd largo, J = 13 e 7 Hz, 1H: 5 s,), 4,85 (mt, 1H: 2a), 4,89 (d largo, J = 10 Hz, 1H: 1 a), de 5,25 a 5,35 (mt, 2H: 5 α e 4 a), de 5.85 a 5,95 (mt, 2H: 6 α e 1 β), 6,52 (d, J = 9,5 Hz, 1H: NH 2), 7,14 (AB limite, J = 9 Hz, 4H: 4Ô e 4ε), de 7,15 a 7,35 (mt, 5H: H Aromáticos 6), 7,50 (mt, 2H: Γ H4 e Γ H5), 7,81 (dd, J = 4 e 2 Hz, 1H: Γ H6), 8,41 (d. J = 10 Hz, 1H: NH 1), 8,74 (d, J = 9 Hz, 1H: NH 6), 11.63 (s, 1H: OH).

86 242 ΕΡ Ο 773 956 / ΡΤ

Exemplo .1

Preparação da 4c-metiltio-des(44-dimetilamino)pristinamicina IA

Realiza-se à escala de 60 erlenmeyers uma cultura da estirpe SP92::pVRC508 em meio de produção com adição, ao fim de 16 horas, de 1 ml de uma solução a 10 g/1 em soda 0,1N de 4-metiltiofenilalanina (R,S). Ao fim de 40 horas de cultura, os 1,8 litros de mosto obtidos em 60 erlenmeyers são extractados por 2 volumes de uma mistura de 66% de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 e 34% de acetomtrilo e depois centrifugados. O sobrenadante é extractado por 2 vezes com 0,5 volumes de diclorometano. As fases clorometilénicas são lavadas com água, depois combinadas, secas sobre sulfato de sódio e evaporadas. O extracto seco é retomado por 20 ml de diclorometano e injectado sobre uma coluna de sílica (30 g) montada em diclorometano e eluída sucessivamente por gradientes de 0 a 10% de metanol em diclorometano. As fracções contendo o novo derivado de pristinamicina IA são reagrupadas e evaporadas. Obtêm-se 65 mg de resíduo seco. Este é retomado por 6 ml de uma mistura de 60% de água e 40% de acetonitrilo e injectado em 2 vezes sobre uma coluna semi-preparativa Nucléosil 7μ C8 10x250 mm (Macherey Nagel) eluída com uma mistura de 55% de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 e 45% de acetonitrilo. As fracções contendo a nova pristinamicina são reagrupadas e extractadas por um volume de diclorometano. A fase orgânica é lavada com água, seca sobre sulfato de sódio e em seguida evaporada. Obtêm-se 45 mg de 4c-metiltio-des(4£-dimetilamino)pnstinamicina IA.

Espectro de R.M.N. 'H (400 MHz, CDCh, õ em ppm, ref. TMS): 0,68 (dd, J - 16 e 5.5 Hz, 1H. 5 β2), 0,93 (t, J = 7,5 Hz, 3H: CH:, 2 γ), 1,13 (mt, 1H: 3 β2), de 1,25 a 1,40 (mt, 1H: 3 y2), 1,33 (d, J = 7,5 Hz. 3H: CH? 1 y), de 1,55 a 1,85 (mt, 3H: 3 y, e CH2 2 β), 2.02 (mt, 1H, 3 β,), 2,18 (mt, 1H. 5 Ô2), 2,38 (d largo, J = 16,5 Hz, 1H: 5 δ,), 2,45 (s, 3H: SCH3), 2,48 (d, J = 16 Hz, 1H: 5 β,), 2,85 (dt. J = 13,5 e 4 Hz, 1H: 5 ε2), 3,00 (dd, J = 12 e 5 Hz, 1H: 4 β2), 3,23 (s. 3H: NCH; 4), 3,37 (t, J = 12 Hz, 1H: 4 β,), 3,37 e 3,58 (2 mts, 1H cada um: CH2 3 ô), 4.55 (t, J = 7,5 Hz, 1H, 3 a), 4,77 (dd largo, J = 13,5 e 8 Hz, 1H: 5 ε0, 4,86 (mt, 1H: 2a), 4,89 (dd, J = 10 e 1,5 Hz. 1H: 1 a), 5,30 (d largo, J = 5,5 Hz, 1H: 5 a), 5.32 (dd, J = 12 e 5 Hz, 1H: 4 a), 5,90 (d, J = 9,5 Hz, 1H: 6 a), 5,92 (dq, J = 7,5 e 1,5 Hz, 1H: 1 β), 6,55 (d, J = 9,5 Hz, 1H: NH 2), 7,13 (d, J = 8 Hz, 2H: 4Ô), de 7,15 a 7,35 (mt, 5H: H Aromáticos 6), 7,19 (d, J = 8 Hz. 2H: 4 ε2). 7.45 (mt, 2H: Γ H4 e Γ H5), 7,76 (t, J = 5 Hz, 1H: Γ H6), 8,42 (d, J = 10 Hz. 1H: NH 1), 8,76 (d, J = 9,5 Hz, 1H: NH 6), 11,65 (s, 1H: OH). 86 242 ΕΡ Ο 773 956 / ΡΤ 36

A 4-metiltiofenilalanina (R,S) pode ser preparada de acordo com o método descrito por R. L. Colescott, R. R. Herr, J. P. Dailey, J. Am. Chem. Soc. 1957, 79,4232-4235.

Exemplo K

Preparação da 48-metilamino-des(4c-dimetilamino)pristinamicina IA

Realiza-se à escala de 60 erlenmeyers uma cultura da estirpe SP92::pVRC508 em meio de produção com adição, ao fim de 16 horas, de 1 ml de uma solução a 10 g/1 em água de 3-metilaminofenilalanina (R,S). Ao fim de 40 horas de cultura, os 1,8 litros de mosto obtidos em 60 erlenmeyers são extractados por 2 volumes de uma mistura de 66% de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 e 34% de acetonitrilo e depois centrifugados. O sobrenadante é extractado por 2 vezes com 0,5 volumes de diclorometano. As fases clorometilénicas são lavadas com água, depois combinadas, secas sobre sulfato de sódio e evaporadas. O extracto seco é retomado por 20 ml de diclorometano e injectado sobre uma coluna de sílica (30 g) montada em diclorometano e eluída sucessivamente por gradientes de 0 a 10% de metanol em diclorometano. As fracções contendo o novo derivado de pristinamicina IA são reagrupadas e evaporadas. Obtêm-se 19 mg de resíduo seco. Este é retomado por 3 ml de uma mistura de 60% de água e 40% de acetonitrilo e injectado em 3 vezes sobre uma coluna semi-preparativa Nucléosil 7μ C8 10x250 mm (Macherey Nagel) eluída com uma mistura de 55% de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 e 45% de acetonitrilo. As fracções contendo a nova pristinamicina são reagrupadas e extractadas por um volume de diclorometano. A fase orgânica é lavada com água, seca sobre sulfato de sódio e em seguida evaporada. Obtêm-se 8 mg de 48-metilamino-des(4£-dimetilamino)pristinamicina IA.

Espectro de R.M.N. ‘H (400 MHz, CDCU, Ô em ppm, ref. TMS): 0,93 (t. J = 7,5 Hz, 3H: CHj 2 y), 1,00 (dd, J = 16 e 6 Hz. 1H, 5 β;), 1,17 (mt. 1H: 3 β2), de 1,25 a 1.40 (mt, 2H: 3 */:), 1.35 (d, J = 7,5 Hz, 3H: CH:. 1 y), de 1,55 a 1.80 (mt. 3H: 3 y, e CH: 2 β), 2,03 (mt, 1H, 3 β,), 2,23 (mt, 1H, 5 ô2). 2,39 (d largo, J = 16 Hz, 1H: 5 δ,), 2,52 (d. J = 16 Hz, 1H: 5 β,), 2,78 (s, 3H: ArNCH3 4), 2,85 (dt, J = 13 e 4 Hz. 1H: 5 ε2), 2,99 (dd, J = 13 e 4,5 Hz, 1H: 4 β2), 3,23 (s, 3H: NCH3 4), 3,25 (t. J = 13 Hz, 1H: 4 β,), 3,38 e 3,58 (2 mts, 1H cada um: CH2 3 δ), 4,05 (mf, 1H: ArNH), 4,58 (dd, J = 6,5 e 7,5 Hz, 1H. 3 a), 4,76 (dd largo, J = 13 e 8 Hz, 1H: 5 Si). 4,85 (mt, 1H: 2a), 4,87 (d largo, J = 10 Hz. 1H: 1 a), 5.35 (dd, J = 13 e 4,5 Hz, 1H: 4 a), 5,38 (d largo, J = 6 Hz. 1H: 5 a), 5,90 (d, J = 9,5 Hz, 1H: 6 a), 5,91 (mt, 1H: 1 β), 6,36 (s largo, 1H: H 2 do aromático em 4), de 6,45 a 6,55 (mt, 2H: H 4 e H 6 do aromático em 4), 6,53 (d, J = 10 Hz, 1H: NH 2), 7,12 (t, J = 8 Hz, 1H: H 5 do aromático em 4), de 7,15 a 7,45 (mt. 5H: H Aromáticos 6), 7,35 (mt, 2H: Γ H4 e Γ H5), 7,75

86 242 ΕΡ Ο 773 956 / ΡΤ 37 (t,J = 3 Hz, 1Η: Γ Η6), 8,40 (d, J = 10 Hz, 1Η: ΝΗ 1), 8,78 (d, J = 9,5 Ηζ, 1Η:ΝΗ6), 11,60 (s, 1Η: ΟΗ). Ο dicloridrato de 3-metilaminofenilalanina (R,S) pode ser preparado da seguinte maneira:

Operando tal como no exemplo F, mas a partir de 1,17 g de 3-metilaminobenzilacetamidomalonato de dietílo e de 20 ml de ácido clorídrico 12 N, obtêm-se 1,03 g de um sólido bege amarelado. Este é dissolvido em 20 ml de etanol absoluto e adicionado de 0,4 g de negro animal. A solução é filtrada sobre Clareei, depois filtrada e concentrada sob pressão reduzida (50 kPa). A mesma operação é recomeçada com 1 g de negro animal e o sólido obtido é triturado em 20 ml de éter. Após filtração e secagem sob pressão reduzida (2,7 kPa) a 50°C, obtêm-se 0,65 g de dicloridrato de 3-metilaminofenilalanina (R,S) sob a forma de um pó branco que funde a cerca de 135°C (decomposição). O 3-metilaminobenzilacetamidomalonato de dietilo pode ser preparado da seguinte maneira:

Coloca-se num balão de três tubuladuras mantido sob atmosfera de azoto 3,11 ml de anidrido acético. Adicionam-se em seguida em 3 minutos a 0°C, 1,51 ml de ácido fórmico e em seguida aquece-se a 50°C durante 2 horas. Deixa-se a mistura retomar à temperatura ambiente agitando durante 3 horas e 20 minutos e adicionam-se 4 ml de THF anidro sob azoto e arrefece-se a -20°C. Adiciona-se em 10 minutos, uma solução de 4 g de 3-aminobenzilacetamidomalonato de dietilo numa mistura de 15 ml de THF anidro e de 15 ml de diclorometano anidro. A agitação é prosseguida durante 1 hora e 10 minutos a -20°C e depois a 20°C durante 16 horas. A mistura reaccional é concentrada à secura sob pressão reduzida (50 kPa) a 30°C, depois co-evaporada com 30 ml de tolueno anidro para dar um sólido branco que é dissolvido numa mistura de 10 ml de THF anidro e de 20 ml de 1,2-dicloroetano anidro e depois colocado num balão de três tubuladuras sob azoto. A mistura é arrefecida a -5°C e em seguida adiciona-se 1,55 ml de complexo borano-dimetilenxofre (solução 2 M em THF), em 10 minutos. Deixa-se a mistura retomar à temperatura ambiente e a solução é aquecida 3 horas em refluxo e depois agitada durante 15 horas à temperatura ambiente. A mistura reaccional é arrefecida a 0°C e depois adiciona-se em 25 minutos 10 ml de MeOH. Agita-se durante 45 minutos a 0°C e depois 30 minutos à temperatura ambiente. .Arrefece-se a 0°C e depois faz-se borbulhar HC1 gasoso até pH 2. Aquece-se 1 hora em refluxo e em seguida a mistura é concentrada à secura sob pressão

86 242 ΕΡ Ο 773 956 / ΡΤ 38 reduzida a 30°C para dar 5 g de um produto que é retomado por 30 ml de uma solução aquosa de NaHC03 e de 30 ml de CH?Ck A fase orgânica é decantada e a fase aquosa é lavada com 20 ml de água. As fases orgânicas são reunidas, secas sobre sulfato de magnésio, filtradas e depois concentradas à secura sob pressão reduzida (2,6 kPa) para dar 3,43 g de um óleo amarelo que é purificado por cromatografia instantânea (eluente AcOEt-ciclo-hexano 50/50). Obtêm-se assim, após secagem sob pressão reduzida (2,7 kPa) a 20°C, 1,18 g de 3-metilaminobenzilacetamidomalonato de dietilo sob a forma de um sólido bege claro que funde a 122°C. O 3-aminobenzilacetamidomalonato de dietilo pode ser preparado como descrito por T. S. Osdene, D. N. Ward, W. H. Chapman e H. Rakoff, J. Am. Chem. Soc.. 81, 1959, 3100-3102.

Exemplo L

Preparação da 4ξ-ΐrifluorometil-des(4·ς-dimetilamino)pristinamicina ΙΛ

Realiza-se à escala de 60 erlenmeyers uma cultura da estirpe SP92::pVRC508 em meio de produção com adição, ao fim de 16 horas, de 1 ml de uma solução a 5 g/1 em soda 0,1N de 4-trifluorometilfenilalanina (S). Ao fim de 40 horas de cultura, os 1,8 litros de mosto obtidos em 60 erlenmeyers são extractados por 2 volumes de uma mistura de 66% de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 e 34% de acetonitrilo e depois centrifugados. O sobrenadante é extractado por 2 vezes com 0,5 volumes de diclorometano. As fases clorometilénicas são lavadas com água, depois combinadas, secas sobre sulfato de sódio e evaporadas. O extracto seco é retomado por 20 ml de diclorometano e injectado sobre uma coluna de sílica (30 g) montada em diclorometano e eluída sucessivamente por gradientes de 0 a 10% de metanol em diclorometano. As fracções contendo o novo derivado de pristinamicina IA são reagrupadas e evaporadas. O resíduo seco é retomado por 3 ml de uma mistura de 60% de água e 40% de acetonitrilo e injectado sobre uma coluna semi-preparativa Nucléosil 7μ C8 10x250 mm (Macherey Nagel) eluída com uma mistura de 55% de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 e 45% de acetonitrilo. As fracções contendo a nova pristinamicina são reagrupadas e extractadas por um volume de diclorometano. A fase orgânica é lavada com água, seca sobre sulfato de sódio e em seguida evaporada. Obtêm-se 5 mg de 4d-trifluorometil-des^-dimetilamino)pristinamicina IA.

Espectro de R.M.N. 'H (400 MHz, CDC13, ó em ppm, ref. TMS): 0,86 (dd, J = 16 e 5,5 Hz, 1H, 5 β2), 0,91 (t, J = 7,5 Hz, 3H: CH3 2 γ), 1,13 (mt, 1H: 3 β2), 1,31 (d, J = 7,5 Hz, 3H: CH3 1 γ), 1,42 (mt, 1H: 3 γ2), de 1,55 a 1,80 (mt, 3H: 3 y, e CH2 2 β), 2,02 (mt, 1H, 3

86 242 ΕΡ Ο 773 956 / ΡΤ 39 β,), 2,15 (mt, 1 Η, 5 δ2), 2,40 (d largo, J = 16,5 Hz, 1H: 5 Ô,), 2,55 (d, J = 16 Hz, 1H: 5 β,), 2,88 (dt, J = 14 e 4 Hz, 1H: 5 ε2), 3,18 (s, 3H: NCHj 4), 3,20 e 3,31 (2 dd, respectivamente J = 13 e 6 Hz e J = 13 e 10 Hz, 1H cada um: 4 β2 e 4 βι), 3,42 e 3,60 (2 mts, 1H cada um: CH2 3 5), 4,50 (t, J = 7,5 Hz, 1H, 3 a), 4,73 (dd largo. J = 14 e 7,5 Hz, 1H: 5 ε,), 4,83 (mt, 1H: 2a), 4,91 (d largo, J = 10 Hz, 1H: 1 a), 5,40 (d largo, J = 5,5 Hz, 1H: 5 a), 5,55 (dd, J = 10 e 6 Hz, 1H: 4 a), 5,87 (d, J = 9,5 Hz, 1H: 6 a), 5,90 (q largo, J = 7,5 Hz, 1H: 1 β), 6,68 (d, J = 9,5 Hz, 1H: NH 2), de 7,15 a 7,40 (mt, 9H: 4 δ - H Aromáticos 6 - Γ H5 e Γ H4), 7,52 (d, J = 8 Hz, 2H: 4 ε), 7,68 (d, J = 4 e 1,5 Hz, 1H: Γ H(,), 8,43 (d, J = 10 Hz, IH: NH 1), 8,76 (d, J = 9,5 Hz, 1 Η: NH 6), 11,70 (s, 1H: OH).

Exemplo M

Preparação da 4s-metoxi-des(4£-dimetilamino)pristinamicina IA

Realiza-se à escala de 60 erlenmeyers uma cultura da estirpe SP92::pVRC508 em meio de produção com adição, ao fim de 16 horas, de 1 ml de uma solução a 5 g/1 em soda 0,1N de 3-metoxifenilalanina (S). Ao fim de 40 horas de cultura, os 1,8 litros de mosto obtidos em 60 erlenmeyers são extractados por 2 volumes de uma mistura de 66% de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 e 34% de acetonitrilo e depois centrifugados. O sobrenadante é extractado por 2 vezes com 0,5 volumes de diclorometano. As fases clorometilénicas são lavadas com água, depois combinadas, secas sobre sulfato de sódio e evaporadas. O extracto seco é retomado por 20 ml de diclorometano e injectado sobre uma coluna de sílica (30 g) montada em diclorometano e eluída sucessivamente por gradientes de 0 a 10% de metanol em diclorometano. As fracções contendo o novo derivado de pristinamicina IA são reagrupadas e evaporadas. Obtêm-se 41 mg de resíduo seco. Este é retomado por 6 ml de uma mistura de 60% de água e 40% de acetonitrilo e injectado em 2 vezes sobre uma coluna semi-preparativa Nucléosil 7μ C8 10x250 mm (Macherev Nagel) eluída com uma mistura de 55% de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 e 45% de acetonitrilo. As fracções contendo a nova pristinamicina são reagrupadas e extractadas por um volume de diclorometano. A fase orgânica é lavada com água, seca sobre sulfato de sódio e em seguida evaporada. Obtêm-se 28 mg de 4e-metoxi-des(4£-dimetilamino)pristinamicina IA.

Espectro de R.M.N. 'H (400 MHz, CDCb, ô em ppm, ref. TMS): 0,52 (dd, J = 16 e 5,5 Hz, 1H, 5 β2), 0,90 (t, J = 7.5 Hz, 3H: CH:, 2 y), de 1.10 a 1,34 (mt, 2H: 3 β2 e 3 y2), 1,34 (d, J = 7,5 Hz, 3H: CH3 1 γ), de 1,50 a 1,80 (mt, 3H: 3 y, e CH2 2 β), 2,04 (mt, 1H, 3 β,), 2,20 (mt, 1H, 5 δ2), 2,35 (d largo, J = 16 Hz, 1H: 5 δ,), 2,38 (d, J = 16 Hz, 1H: 5 βι), 2,83 (dt, J = 13 e 4 Hz, 1H: 5 ε2), 2,97 (dd, J = 12 e 4 Hz, 1H: 4 β2), 3,28 (s, 3H: NCH3 4), 3,28 e

86 242 ΕΡ Ο 773 956 / ΡΤ 40 3,56 (2 mts, 1Η cada um: CH2 3 δ), 3,40 (t, J = 12 Hz, 1H: 4 β,), 3,80 (s, 3H, (t, J = 7,5 Hz, 1H, 3 a), 4,76 (dd largo, J = 13 e 8 Hz, 1H: 5 εi), 4,85 (mt, 1H: 2a), 4,90 (d largo, J = 10 Hz, 1H: 1 a), 5,27 (dd, J = 12 e 4 Hz, 1H: 4 a), 5,30 (d largo. J = 5,5 Hz, ÍH: 5 a), 5,89 (d, J = 9.5 Hz, 1H: 6 a), 5,91 (q largo, J = 7,5 Hz, 1H: 1 β), 6,51 (d, J = 10 Hz. 1H: NH 2), de 6,80 a 6,90 (mt, 3H: H2-H4eH6do aromático em 4), de 7,15 a 7,40 (mt, 6H: H 5 do aromático em 4 e H Aromáticos 6), 7,45 (d largo, .1 = 9 Hz, 1H: Γ H4), 7,50 (dd, J = 9 e 4 Hz, 1H: Γ H5), 7,80 (d largo, J = 4 Hz. 1H: Γ H(,), 8,40 (d, J = 10 Hz, 1H: NH 1), 8,73 (d, J = 9,5 Hz, 1H:NH6), 11,62 (s, 1H: OH).

Exemplo N

Preparação da 48~fluoro^-metil-des(4ç-dimetilamino)pristinamicina IA

Realiza-se à escala de 60 erlenmeyers uma cultura da estirpe SP92::pVRC508 em meio de produção com adição, ao fim de 16 horas, de 1 ml de uma solução a 10 g/1 em soda 0,1N de 3-tluoro-4-metilfenilalanina (R,S). Ao fim de 40 horas de cultura, os 1.8 litros de mosto obtidos em 60 erlenmeyers são extractados por 2 volumes de uma mistura de 66% de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 e 34% de acetonitrilo e depois centrifugados. O sobrenadante é extractado por 2 vezes com 0,5 volumes de diclorometano. As fases clorometilénicas são lavadas com água, depois combinadas, secas sobre sulfato de sódio e evaporadas. O extracto seco é retomado por 20 ml de diclorometano e injectado sobre uma coluna de sílica (30 g) montada em diclorometano e eluída sucessivamente por gradientes de 0 a 10% de metanol em diclorometano. As fracções contendo o novo derivado de pristinamicina IA são reagrupadas e evaporadas. Obtêm-se 15 mg de resíduo seco. Este é retomado por 3 ml de uma mistura de 60% de água e 40% de acetonitrilo e injectado sobre uma coluna semi-preparativa Nucléosil 7μ C8 10x250 mm (Macherey Nagel) eluída com uma mistura de 55% de tampão fosfato 100 mM pH 2.9 e 45% de acetonitrilo. As fracções contendo a nova pristinamicina são reagrupadas e extractadas por um volume de diclorometano. A fase orgânica é lavada com água, seca sobre sulfato de sódio e em seguida evaporada. Obtêm-se 9 mg de 4e-fluoro^-metil-des(4c-dimetilamino)pristinamicina 1A.

Espectro de R.M.N. 'H (400 MHz, CDCI3, Ô em ppm, ref. TMS): 0,60 (dd, J = 16 e 5,5 Hz, 1H, 5 β2), 0,91 (t, J = 7,5 Hz, 3H: CH3 2 γ), 1.12 (mt, 2H: 3 β2), de 1,12 a 1,35 (mt, 1H: 3 y2), 1,33 (d, J = 7,5 Hz, 3H: CH3 1 7), de 1.50 a 1,85 (mt, 3H: 3 γ, e CH, 2 β), 2.02 (mt, 1H, 3 β,), 2,13 (mt, 1H, 5 ò2), 2,27 (s, 3H: ArCH3), 2,36 (d largo, J = 16 Hz, 1H: 5 Ô,), 2,45 (d, J = 16 Hz, 1H: 5 β,), 2.85 (dt, J = 13 e 4,5 Hz. 1H: 5 ε2), 2,97 (dd, J = 12,5 e 4,5 Hz, 1H: 4 β2), 3,23 (s, 3H: NCH? 4), 3,30 e 3,56 (2 mts, 1H cada um: CH2 3 Ô), 3,37 (t,

86 242 ΕΡ Ο 773 956 / ΡΤ 41 J = 12,5 Hz, 1Η: 4 β,), 4,55 (t, J = 7,5 Hz, 1Η, 3 α), 4,75 (dd largo, J = 13 e 8 Hz, 1H: 5 εΟ, 4,83 (mt, 1H: 2a), 4,89 (d largo, J = 10 Hz, 1H: 1 a), 5,29 (dd, J = 12,5 e 4,5 Hz, 1H: 4 a), 5,32 (d largo, J = 5,5 Hz, 1H: 5 a), 5,89 (d, J = 9,5 Hz, 1H: 6 a), 5,92 (mt, 1H: 1 β), 6,49 (d, J = 10 Hz, 1H: NH 2), 6,90 (mt, 2H: H 2 e H 6 do aromático em 4), 7,11 (t, J = 8 Hz, 1H: H 5 do aromático em 4), de 7,10 a 7,30 (mt, 5H: H Aromáticos 6), 7,43 (dd, J = 8,5 e 1 Hz, IH: Γ H4), 7,49 (dd, J = 8,5 e 4,5 Hz, 1H: ΓΗ5), 7,75 (dd, J = 4,5 e 1 Hz, 1H: Γ Hó), 8,48 (d,J = 10 Hz, 1H: NH 1), 8,70 (d, J = 9,5 Hz, 1H: NH 6). 11,60 (s, 1H: OH). O cloridrato de 3-fluoro-4-metilfenilaIanina (R.S) pode ser preparado da seguinte maneira: A 1,6 g de N-acetil-(3-fluoro-4-metil)fenilalaninato de metilo adiciona-se ácido clorídrico 12 N e a mistura é aquecida em refluxo sob agitação durante 8 horas. Após uma noite à temperatura ambiente, a mistura reaccional é concentrada à secura sob pressão reduzida (50 kPa), retomada por uma mistura 50/50 em volume de tolueno e de etanol e depois novamente concentrada à secura. Após secagem sob pressão reduzida (2,6 kPa) obtêm-se 0,6 g de cloridrato de 3-fluoro-4-metilfenilalanina (R,S) sob a forma de cristais brancos que fundem a uma temperatura superior a 260°C. O N-acetil-(3-fluoro-4-metil)feniIalaninato de metilo (R,S) pode ser preparado da seguinte maneira: A 1,9 g de (4-metil-3-fluoro)-2-acetamidocinamato de metilo colocados sob atmosfera de azoto num autoclave, adicionam-se 0,2 g de paládio sobre carvão a 10% em 230 ml de etanol absoluto. A mistura é colocada sob uma pressão de 5,5 bar de hidrogénio e aquecida durante 15 horas a 50°C sob agitação. Após estabilização da temperatura a 26°C e reposição à pressão atmosférica, a mistura reaccional é filtrada sobre Clareei®, lavada com etanol e depois concentrada à secura sob pressão reduzida (2,6 kPa). Obtêm-se 1,6 g de N-acetil-(3-fluoro-4-metil)fenilalaninato de metilo sob a forma de um óleo incolor (Silice Merck 5719, Rf= 0,46; eluente CH2Cl2/AcOEt 50/50). O (3-fluoro-4-metil)-2-acetamidocinamato de metilo pode ser preparado da seguinte maneira:

Num balão de três tubuladuras colocado sob azoto adicionam-se 3,6 g de 2-acetamidoacrilato de metilo, 0,12 g de acetato de paládio. 5,2 g de cloreto de tetrabutilamónio e 3,8 g de hidrogenocarbonato de sódio e em seguida adicionam-se a esta mistura 4 g de 2-fluoro-4-bromotolueno em solução em 120 ml de DMF anidro. A mistura é

86 242 ΕΡ Ο 773 956 / ΡΤ aquecida durante 16 horas e 30 minutos a 82°C e depois, após arrefecimento, é vertida sobre 1000 ml de água destilada. A mistura é retomada por 250 ml de CH2C12, a fase orgânica é decantada e a fase aquosa é lavada por 2 vezes com 250 ml de CH2CI2. As fases orgânicas são reunidas, secas sobre sulfato de sódio, filtradas e concentradas sob pressão reduzida (50 kPa) a 70°C, para dar um óleo castanho que é purificado por cromatografia instantânea (eluente AcOEt/ciclo-hexano, depois AcOEt puro). Obtêm-se 2,ó g de (3-fluoro-4-metil)-2-acetamidocinamato de metilo sob a forma de um sólido branco que funde a 163°C.

Exemplo O

Preparação da 4e-etoxi-des(4£-dimetilamino)pristinamicina I,\

Realiza-se à escala de 60 erlenmeyers, como descrito no Exemplo F, uma cultura da estirpe SP92::pVRC508 em meio de produção com adição, ao fim de 16 horas, de 1 ml de uma solução a 20 g/1 em soda 0,2N de cloridrato de 3-O-etiltirosina (R,S). Ao fim de 40 horas de cultura, os 1.8 litros de mosto obtidos em 60 erlenmeyers são extractados por 2 volumes de uma mistura de 66% de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 e 34% de acetonitrilo e depois centrifugados. O sobrenadante é extractado por 2 vezes com 0,5 volumes de diclorometano. As fases clorometilénicas são lavadas com água, depois combinadas, secas sobre sulfato de sódio e evaporadas. O extracto seco é retomado por 20 ml de diclorometano e injectado sobre uma coluna de sílica (30 g) montada em diclorometano e eluída sucessivamente por gradientes de 0 a 10% de metanol em diclorometano. As fracções contendo 0 novo derivado de pristinamicina ΙΛ são reagrupadas e evaporadas. Obtêm-se 19 mg de resíduo seco. Este é retomado por 3 ml de uma mistura de 60% de água e 40% de acetonitrilo e injectado sobre uma coluna semi-preparativa Nucléosil 7μ C8 10x250 mm (Macherey Nagel) eluída com uma mistura de 60% de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 e 40% de acetonitrilo. As fracções contendo a nova pristinamicina são reagrupadas e extractadas por um volume de diclorometano. A fase orgânica é lavada com água, seca sobre sulfato de sódio e em seguida evaporada. Obtêm-se 15.8 mg de 4e-0-etoxi-des^-dimetilamino)-pristinamicina IA.

Espectro de R.M.N. 'H (400 MHz, CDCh, δ em ppm, ref. TMS): 0,55 (dd, J = 16 e 5.5 Hz, 1H: 1H do CH2 em 5 β), 0,90 (t, J = 7.5 Hz, 3H: CH:, em 2 7), 1,12 (mt, 1H: 1H do CH2 em 3 β), 1,20 (mt, 1H: 1H do CH2 em 3 7), 1,31 (d. J = 6,5 Hz, 3H: CH3 em 1 γ), 1,49 (t. J = 7 Hz, 3H: CH;, do etilo), 1,54 (mt, 1H: o outro H do CH? em 3 γ), 1,63 e 1,73 (2 mts. 1H cada um: CH2 em 2 β), 2,02 (mt, 1H, 0 outro H do CH2 em 3 β), 2,22 e 2,33 (respectivamente mt e d largo, J = 16,5 Hz, 1H cada um: CH2 em 5 δ), 2,46 (d, J = 16 Hz, 1H: 0 outro H do CH2 em 5 β), 2,83 (dt, J = 13 e 4 Hz, 1H: 1H do CH2 em 5 ε), 2,95 (dd,

86 242 ΕΡ Ο 773 956 / ΡΤ J = 12 e 4 Ηζ, 1Η: 1Η do CH2 em 4 β), 3,22 (mt, 1Η: 1H do CH2 em 3 δ), 3,27 (s, 3H: NCH3), 3,39 (t, J = 12 Hz, 1H: o outro H do CH2 em 4 β), 3,53 (mt, 1 Η: o outro H do CH2 em 3 δ), 3,93 e 4,03 (2 mts, IH cada um: OCH? do etilo), 4,56 (dd, J = 7 e 5,5 Hz, 1H: 3 a), 4,75 (dd largo, J = 13 e 8 Hz, 1H: 0 outro H do CH2 em 5 ε), 4,82 (mt, 1H: 2a), 4,88 (dd, J * 10 e 1 Hz, 1H: 1 a), 5,23 (dd, J = 12 e 4 Hz, 1H: 4 a), 5,23 (d largo, J = 5,5 Hz, 1H: 5 a), 5,87 (d, J = 9,5 Hz, 1H: 6 a), 5,92 (mt, 1H: 1 β). 6.47 (d, J = 10 Hz, 1H: NH em 2), 6,80 (mt, 3H: H Aromáticos em orto e em para do etoxi), de 7,10 a 7,35 (mt, 6H: H Aromáticos em 6 e H Aromáticos em meta do etoxi), 7,43 (dd, J = 8 e 1 Hz, 1H: Γ H4), 7,50 (dd, J = 8 e 4 Hz, 1H: Γ H5), 7,77 (dd, J = 4e 1 Hz. 1H: 1' H6), 8,38 (d, J = 10 Hz, 1H: NH em 1), 8,70 (d, J = 9,5 Hz, 1H: NH em 6), 11.60 (s. 1H: OH). O cloridrato de 3-O-etiltirosina (R,S) pode ser preparado da seguinte maneira:

Coloca-se num balão 1 g de N-terc-butoxicarbonil-3-etoxifenilalanina (R,S) em solução em 3,6 ml de dioxano clorídrico e depois a mistura é agitada durante 5 horas à temperatura ambiente. O precipitado formado é filtrado, lavado com dioxano, depois com éter e em seguida seco sob pressão reduzida (2,7 kPa) a 40°C, para dar 0,65 g de cloridrato de 3-O-etiltirosina (R,S) sob a forma de um sólido branco que funde a 200°C. A N-terc-butoxicarbonil-3-etoxifenilalanina (R,S) pode ser preparada da seguinte maneira:

Coloca-se num balão 1,33 g de N-terc-butoxicarbonil-3-etoxifenilalaninato de etilo (R,S) em solução em 8 ml de metanol e depois adicionam-se 8 ml de soda IN. Após 18 horas de agitação à temperatura ambiente, a mistura é evaporada sob pressão reduzida e depois acidificada por 8,56 ml de ácido clorídrico IN. O produto é extractado por 2 vezes com 10 ml de acetato de etilo, as fases orgânicas são reunidas, lavadas por 2 vezes com 10 ml de água, secas, filtradas e depois concentradas à secura sob pressão reduzida para dar 1 g de N-terc-butoxicarbonil-3-etoxifenilalanina (R,S) sob a forma de um óleo amarelo (Silice Merck 5719, Rf= 0,7; eluente tolueno 80/ MeOH 10 / dietilamina 10). O N-terc-butoxicarbonil-3-etoxifenilalaninato de etilo (R,S) pode ser preparado da seguinte maneira:

Coloca-se num balão de três tubuladuras sob atmosfera de azoto, 1,5 g de N-terc-butoxicarbonil-3-tirosina (R,S) em solução em 7,5 ml de dimetilformamida seca e depois adicionam-se 0,508 g de hidreto de sódio a 50% em óleo. Após 2 horas de agitação à temperatura ambiente, adicionam-se 0,86 ml de iodoetano e depois a mistura é agitada 4

86 242 ΕΡ Ο 773 956 / ΡΤ horas à temperatura ambiente. O meio é filtrado, o sólido resultante é lavado por 3 vezes com 10 ml de água e depois 2 vezes com 10 ml de éter de petróleo para dar após secagem sob pressão reduzida (2,7 kPa) a 30°C, 1,33 g de N-terc-butoxicarboníl-3-etoxifenilalaninato de etilo (R,S) sob a forma de um sólido branco. A N-terc-butoxicarbonil-3-tirosina (R.S) pode ser preparada da seguinte maneira:

Coloca-se sob agitação num balão de três tubuladuras, 18 g de 3-tirosina (R,S) em solução em 180 ml de dioxano e depois adicionam-se 99 ml de soda 1 N e depois 26 g de dicarbonato de di-terc-butilo em solução em 160 ml de dioxano. Após 36 horas de agitação, o meio é concentrado sob pressão reduzida a 30°C. retomado com 100 ml de água destilada, acidificado com ácido clorídrico IN até pH 5 e depois extractado por 2 vezes com 200 ml de acetato de etilo. A fase orgânica é seca sobre sulfato de magnésio, filtrada e depois concentrada à secura sob pressão reduzida a 30°C, para dar 30 g de N-terc-butoxicarbonil-3-tirosina (R,S) sob a forma de um sólido branco (Sílice Merck 5719, Rf= 0,25; eluente tolueno 80 / MeOH 10 / dietilamina 10).

Exemplo P

Preparação da 4£-etoxi-des(44-dimetilamino)pristinamicina Ia

Realiza-se à escala de 90 erlenmeyers, como descrito no exemplo F, uma cultura da estirpe SP92::pVRC508 em meio de produção com adição, ao fim de 16 horas, de 1 ml de uma solução a 20 g/1 em ácido clorídrico 0,1N de cloridrato de 4-O-etiltirosina (S). Ao fim de 40 horas de cultura, os 2,7 litros de mosto obtidos em 90 erlenmeyers são extractados por 2 volumes de uma mistura de 66% de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 e 34% de acetonitrilo e depois centrifugados. O sobrenadante é extractado por 2 vezes com 0,5 volumes de diclorometano. As fases clorometilénicas são lavadas com água, depois combinadas, secas sobre sulfato de sódio e evaporadas. O extracto seco é retomado por 20 ml de diclorometano e injectado sobre uma coluna de sílica (30 g) montada em diclorometano e eluída sucessivamente por gradientes de 0 a 10% de metanol em diclorometano. As fracções contendo a 4£-etoxi-des^-dimetilamino)pristinamicina IA são reagrupadas e evaporadas. O resíduo seco é retomado por 7 ml de uma mistura de 60% de água e 40% de acetonitrilo e injectado sobre uma coluna semi-preparativa Nucléosil 7μ C8 10x250 mm (Macherey Nagel) eluída com uma mistura de 52% de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 e 48% de acetonitrilo. As fracções contendo a 4ξ-6ΐοχί-ό65(4ξ^ίπΐ6ίϊ1ηιηιηο)ρπ5ΰηηιηίαη3 IA são reagrupadas e extractadas por um volume de diclorometano. A fase orgânica é lavada com

8ό 242 ΕΡ Ο 773 956 / ΡΤ 45 água, seca sobre sulfato de sódio e em seguida evaporada. Obtêm-se 29 mg de 4ξ-είοχί-des(4£-dimetilamino)pristinamicina IA.

Espectro de R.M.N. *H (400 MHz, CDCI3, ô em ppm, ref. TMS): 0,64 (dd, J = 16 e 5,5 Hz, 1H: 1H do CH2 em 5 β), 0,90 (t, J = 7,5 Hz, 3H: CH3 em 2 7), 1,12 (mt, 1H: 1H do CH2 em 3 β), 1,25 (mt, 1H: 1H do CH2 em 3 y), 1,33 (d, J = 7 Hz, 3H: CH:, em 1 γ), 1,42 (t, J = 7 Hz, 3H: CH3 do etilo), 1,57 (mt, 1H: 0 outro H do CH2 em 3 γ), 1,63 e 1,74 (2 mts, 1H cada um: CH2 em 2 β), 2,02 (mt, 1H, 0 outro H do CH2 em 3 β), 2,16 e 2,35 (respectivamente mt e d largo, J = 16,5 Hz, 1H cada um: CH2 em 5 δ), 2,43 (d, J = 16 Hz, 1H: o outro H do CH2 em 5 β), 2,83 (dt, J = 13 e 4 Hz. 1H: 1H do CH2 em 5 ε), 2,93 (dd, J = 12 e 4 Hz, 1H: 1H do CH2 em 4 β), de 3,15 a 3,30 (mt, 1H: 1H do CH2 em 3 δ), 3,24 (s, 3H: NCH3), 3,35 (t, J = 12 Hz, 1H: o outro H do CH2 em 4 β), 3,55 (mt, 1H: 0 outro H do CH2 em 3 δ), 3,95 (AB limite, 2H: OCH2 do etilo), 4,56 (dd, J = 7 e 6 Hz, 1H: 3 a), 4,75 (dd largo, J = 13 e 8 Hz, 1H: o outro H do CH2 em 5 ε), 4,84 (mt, 1H: 2a), 4,87 (dd, J = 10 e 1 Hz, ÍH: 1 a), 5,26 (dd, J = 12 e 4 Hz, 1H: 4 a), 5, 32 (d largo, J = 5,5 Hz, 1H: 5 a), 5,88 (d. J = 10 Hz, 1H: 6 a), 5,92 (mt. 1H: 1 β), 6,48 (d. J = 10 Hz. 1H: NH em 2), 6,83 (d, J = 8 Hz, 2H: H Aromáticos em 4 ε), 7,10 (d, J = 8 Hz. 2H: H Aromáticos em 4 δ), de 7.10 a 7,35 (mt, 5H: H Aromáticos em 6), 7,44 (dd, J = 8,5 e 1,5 Hz, 1H: Γ H4), 7,57 (dd, J = 8,5 e 4,5 Hz, 1H: Γ H5), 7.77 (dd, J = 4,5 e 1,5 Hz, 1H: Γ H6), 8,38 (d, J = 10 Hz, 1H: NH em 1), 8,75 (d, J = 10 Hz, 1H: NH em 6), 11,60 (s. 1H: OH). O cloridrato de 4-O-etiltirosina (S) pode ser sintetizado como descrito por Y. Sasaki et al., Chem. Pharm. Buli, 30, 4435 (1982).

Exemplo 0

Preparação da 4£-aliloxi-des(4£-dimetilamino)pristinamicina IA

Realiza-se à escala de 90 erlenmeyers. como descrito no Exemplo F, uma cultura da estirpe SP92::pVRC508 em meio de produção com adição, ao fim de 16 horas, de 1 ml de uma solução a 20 g/1 em ácido clorídrico 0,1N de cloridrato de 4-O-aliltirosina (S). Ao fim de 40 horas de cultura, os 2,7 litros de mosto obtidos em 90 erlenmeyers são extractados por 2 volumes de uma mistura de 66% de tampão fosfato 100 miM pH 2,9 e 34% de acetonitrilo e depois centrifugados. O sobrenadante é extractado por 2 vezes com 0,5 volumes de diclorometano. As fases clorometilénicas são lavadas com água, depois combinadas, secas sobre sulfato de sódio e evaporadas. O extracto seco é retomado por 20 ml de diclorometano e injectado sobre uma coluna de sílica (30 g) montada em diclorometano e eluída

86 242 ΕΡ Ο 773 956 / ΡΤ 46 sucessivamente por gradientes de 0 a 10% de metanol em diclorometano. As fracções contendo a 4£-aliloxi-des(4£-dimetilamino)pristinamicina ΙΛ são reagrupadas e evaporadas. O resíduo seco é retomado por 7 ml de uma mistura de 60% de água e 40% de acetonitrilo e injectado sobre uma coluna semi-preparativa Nucléosil 7μ CS 10x250 mm (Macherey Nagel) eluída com uma mistura de 52% de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 e 48% de acetonitrilo. As fracções contendo a 4ç-aliloxi-des(4c-dimetilamino)pristinamicina IA são reagrupadas e extractadas por um volume de diclorometano. A fase orgânica é lavada com água, seca sobre sulfato de sódio e em seguida evaporada. Obtêm-se 29 mg de 44-aliloxi-des(4ç-dimetilamino)pristinamicina ΙΛ.

Espectro de R.M.N. 'H (400 MHz, CDC1;„ Ô em ppm, ref. TMS): 0,63 (dd. J = 16 e 6 Hz, 1H: 1H do CH2 em 5 β), 0,91 (t, J = 7,5 Hz, 3H: CH? em 2 γ), 1,13 (mt, 1H: 1H do CH2 em 3 β), 1,29 (mt, 1H: 1H do CH2 em 3 γ), 1,33 (d, .1 = 6,5 Hz, 3H: CH3 em 1 γ), 1,57 (mt, 1H: o outro H do CH2 em 3 γ), 1,65 e 1,74 (2 mts. 1H cada um: 0¾ em 2 β), 2,02 (mt, 1H, o outro H do CH2 em 3 β), 2,14 e 2,34 (respectivamente mt e d largo, J = 16,5 Hz, 1H cada um: CH2 em 5 õ), 2,43 (d, J = 16 Hz. 1H: o outro H do CH2 em 5 β), 2.85 (dt, J = 13 e 4 Hz, 1H: lHdo CH2em5c), 2,95 (dd, J = 12 e 4 Hz, 1H: 1H do CH2em 4 β), 3,25 (s, 3H: NCH3), 3,33 (mt, 1H: 1H do CH2 em 3 δ), 3.36 (t, J = 12 Hz, 1H: o outro H do CH2 em 4 β), 3,56 (mt, 1H: o outro H do CH2 em 3 δ), 4,51 (AB limite, 2H: OCH2 do alilo), 4,56 (t. J = 7,5 Hz, 1H: 3 a), 4,75 (dd largo, J = 13 e 8 Hz, 1H: o outro H do CH2 em 5 ε), 4,84 (mt, 1H: 2a), 4,88 (dd, J = 10 e 1 Hz, 1H: 1 a), 5,27 (dd. J = 12 e 4 Hz, 1H: 4 a). 5,30 e 5,40 (respectivamente mt e dd, J = 17 e 1,5 Hz, 1H cada um: = CH2 do alilo), 5,89 (d. J = 9,5 Hz, 1H: 6 a), 5,91 (mt, 1H: 1 β), 6,02 (mt, 1H: CH= do alilo). 6,50 (d, J = 10 Hz, 1H: NH em 2), 6,85 (d, J = 8 Hz, 2H: H Aromáticos em 4 ε), 7,12 (d, J = 8 Hz, 2H: H Aromáticos em 4 Ô), de 7,10 a 7,35 (mt, 5H: H Aromáticos em 6), 7,45 (dd, J = 8,5 e 1,5 Hz, IH: Γ H4), 7,57 (dd, J = 8,5 e 4 Hz, 1H: Γ H5), 7.77 (dd, J = 4 e 1.5 Hz, 1H: Γ H6), 8,41 (d, J = 10 Hz, 1H: NH em 1), 8,74 (d, J = 9,5 Hz, 1H: NH em 6). 11.63 (s, 1H: OH). O cloridrato de 4-O-aliltirosina (S) pode ser sintetizado como descrito por A. Loffet, H. Zang, Inl. J. Pept. Protein Res.. 42, 346 (1993).

Exemplo R

Preparação da 4£-etilamino-des(4£-dimetilammo)pristmamicina IA

Realiza-se à escala de 50 erlenmeyers, como descrito no Exemplo F, uma cultura da estirpe SP92::pVRC508 em meio de produção com adição, ao fim de 16 horas, de 1 ml de

86 242 ΕΡ Ο 773 956 / ΡΤ 47 uma solução a 20 g/1 em soda 0,1N de dicloridrato de 4-etilaminofenilalanina (R,S). Ao fim de 40 horas de cultura, os 1,5 litros de mosto obtidos em 50 erlenmeyers são extractados por 2 volumes de uma mistura de 66% de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 e 34% de acetonitrilo e depois centrifugados. O sobrenadante é extractado por 2 vezes com 0,5 volumes de diclorometano. As fases clorometilénicas são lavadas com água, depois combinadas, secas sobre sulfato de sódio e evaporadas. O extracto seco é retomado por 20 ml de diclorometano e injectado sobre uma coluna de sílica (30 g) montada em diclorometano e eluída sucessivamente por gradientes de 0 a 10% de metanol em diclorometano. As fracções contendo a 4ξ-βΐί^ιηιηο^65(4ς^ϊηΐ6ύΐ4ηιίηο)ρπ5ίίι·^ηιίοιηη ΙΛ são reagrupadas e evaporadas. O resíduo seco é retomado por 7 mi de uma mistura de 65% de água e 35% de acetonitrilo e injectado sobre uma coluna semi-preparativa Nucléosil 7μ C8 10x250 mm (Macherey Nagel) eluída com uma mistura de 60% de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 e 40% de acetonitrilo. As fracções contendo a 4£-etilamino-des^-dimetilamino)pristinamicina IA são reagrupadas e extractadas por um volume de diclorometano. A fase orgânica é lavada com água, seca sobre sulfato de sódio e em seguida evaporada. Obtêm-se 10 mg de 4c-etilamino-des^-dimetilamino)pristinamicina IA.

Espectro de R.M.N. 'H (400 MHz, CDCfi, ó em ppm, ref. TMS): 0,72 (dd, J = 16 e 6 Hz. 1H: 1H do CH2 em 5 β), 0,90 (t. J = 7,5 Hz, 3H: CH3 em 2 γ), 1,15 (mt, 1H: 1H do CH2 em 3 β), de 1,20 a 1,40 (mt, 1H: 1H do CH; em 3 γ), 1,27 (t, J = 7,5 Hz, 3H: CH3 do etilo), 1.33 (d, J = 7 Hz, 3H: CH3 em 1 y). de 1,50 a 1,65 (mt, 1H: o outro H do CH2em 3 γ), 1,60 e 1,74 (2 mts, 1H cada um: CH2 em 2 β), 2,02 (mt, 1H, o outro H do CH2 em 3 β), 2,21 e 2,33 (respectivamente mt e d largo, J = 16,5 Hz. 1H cada um: CH2 em 5 ó), 2,40 (d, J = 16 Hz, 1H: o outro H do CH2 em 5 β), 2,82 (dt, J = 13 e 4,5 Hz, 1H: 1H do CH2 em 5 ε), 2,89 (dd, J = 12 e 4 Hz, 1H: 1H do CH2 em 4 β). 3,10 (mt. 2H: NCH2 do etilo), de 3,20 a 3,35 (mt, 1H: 1H do CH2 em 3 Õ), 3.26 (s, 3H: NCH3), 3,31 (t, J = 12 Hz. 1H: o outro H do CH2 em 4 β), 3,54 (mt, 1H: o outro H do CH? em 3 ô), 3,67 (mf, 1H: NH), 4,56 (dd, J = 6,5 e 7 Hz, 1H: 3 a), 4,75 (dd largo, J = 13 e 8 Hz. 1H: o outro H do CH2 em 5 ε), 4,84 (mt, 1H: 2a), 4,90 (d largo, J = 10 Hz, 1H: 1 a), 5,24 (dd, J = 12 e 4 Hz, 1H: 4 a), 5,32 (d largo, J = 6 Hz, 1H: 5 a), 5,88 (d, J = 9,5 Hz, 1H: 6 a), 5,90 (mt. 1H: 1 β), 6,52 (d, J = 8 Hz, 3H: NH em 2 e H Aromáticos em 4 ε), 7,00 (d, J = 8 Hz, 2H: H Aromáticos em 4 δ), de 7,10 a 7.35 (mt, 5H: H Aromáticos em 6), 7,46 (AB limite, 2H: Γ H*e Γ H5), 7,84 (dd, J = 4 e 1 Hz, 1H: Γ H6), 8,45 (d, J = 10 Hz. 1H: NH em 1), 8,77 (d. J - 9,5 Hz, 1H: NH em 6), 11,65 (s, 1H: OH). O dicloridrato de 4-etilaminofenilalanina (R,S) pode ser preparado de acordo com o método descrito por F. Bergel, J. A. Stock, J. Chem. Soc. 90-97 (1959).

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Exemplo S

Preparação da 4ξ4πΑυοΓθΓηεΐοχί-ά63(4ς-άϊηΐ6ηΐ3Γηίηο)ρπ8ύη3Πΐΐ<ύη3 ΙΛ

Realiza-se à escala de 60 erlenmeyers. como descrito no Exemplo F, uma cultura da estirpe SP92::pVRC508 em meio de produção com adição, ao fim de 16 horas, de 1 ml de uma solução a 20 g/1 em água, de cloridrato de 4-O-trifluorometiltirosina (R,S). Ao fim de 40 horas de cultura, os 1,8 litros de mosto obtidos em 60 erlenmeyers são extractados por 2 volumes de uma mistura de 66% de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 e 34% de acetonitrilo e depois centrifugados. O sobrenadante é extractado por 2 vezes com 0,5 volumes de diclorometano. As fases clorometilénicas são lavadas com água, depois combinadas, secas sobre sulfato de sódio e evaporadas. O extracto seco é retomado por diclorometano e injectado sobre uma coluna de sílica (30 g) montada em diclorometano e eluída sucessivamente por gradientes de 0 a 10% de metanol em diclorometano. As fracções contendo a 4ξ-ΙπΑηθΓοηΊεΐοχϊ-άε8(4ξ-ά™6ΐΐΐ3ηιίηο)ρπ5ΐϊη3ΐηΐαΜ I,\ são reagrupadas e evaporadas. O resíduo seco é retomado por 7 ml de uma mistura de 60% de água e 40% de acetonitrilo e injectado sobre uma coluna semi-preparativa Nucléosil 7μ C8 10x250 mm (Macherey Nagel) eluída com uma mistura de 60% de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 e 40% de acetonitrilo. As fracções contendo a 4£-trifluorometoxi-des(4c-dimetilamino)-pristinamicina ΙΛ são reagrupadas e extractadas por um volume de diclorometano. A fase orgânica é lavada com água, seca sobre sulfato de sódio e em seguida evaporada. Obtêm-se 46.5 mg de 4c-trifluorometoxi-des(4ç-dimetilamino)pristinamicina IA.

Espectro de R.M.N. 'H (400 MHz, CDCh, δ em ppm, ref. TMS): 0,77 (dd, J = 16 e 5.5 Hz, 1H: 1H do CH2 em 5 β), 0,92 (t, J = 7,5 Hz, 3H: CH3 em 2 γ), 1,08 (mt, 1H: 1H do CH2 em 3 β), de 1,30 a 1.40 (mt, 1H: 1H do CH2 em 3 γ). 1,33 (d, J = 7 Hz, 3H: CH3 em 1 γ), de 1,55 a 1,70 (mt, 1H: o outro H do CH2em 3 γ), 1,65 e 1,76 (2 mts, 1H cada um: CH2 em 2 β). 2,02 (mt, 1H, o outro H do CH2 em 3 β), 2,11 e 2.40 (respectivamente mt e d largo, J = 16,5 Hz, IH cada um: CH2 em 5 δ), 2,54 (d, J = 16 Hz, 1H: o outro H do CH2 em 5 β), 2,88 (dt, J = 13 e 4 Hz, 1H: 1H do CH2 em 5 ε), 3,08 (dd, J = 12 e 5 Hz, 1H: 1H do CH2 em 4 β), 3,22 (s, 3H: NCH3), de 3,30 a 3,45 (mt, 1H: 1H do CH2 em 3 δ), 3,39 (t, J = 12 Hz, 1H: o outro H do CH2 em 4 β), 3,59 (mt, 1H: o outro H do CH2 em 3 δ), 4,53 (t, J = 7,5 Hz, 1H: 3 a), 4.75 (dd largo, J = 13 e 8 Hz, 1H: o outro H do CH2 em 5 ε), 4,85 (mt, 1H: 2a), 4,89 (dd. J = 10 e 1,5 Hz, 1H: 1 a), 5,35 (d largo. J = 5.5 Hz. 1H: 5 a), 5,41 (dd, J = 12 e 5 Hz, 1H: 4 a), 5,92 (d, J = 10 Hz, 1H: 6 a), 5,93 (mt, 1H: 1 β), 6,53 (d, .1 = 9,5 Hz, 1H: NH em 2), de 7,15 a 7,35 (mt, 5H: H Aromáticos em 6), 7,16 (d, J = 8 Hz, 2H: H Aromáticos em 4 ε), 7,26 (d. J = 8 Hz, 2H: H Aromáticos em 4 δ), 7,37 (dd, J = 8,5 e 4 Hz, 1H: 1’ H5), 7,42

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(dd. J = 8,5 e 1,5 Hz, 1H: Γ H4), 7,70 (dd, J = 4 e 1,5 Hz, 1H: Γ H6), 8,37 (d, J = 10 Hz, 1H: NH em 1), 8,75 (d, J = 10 Hz, 1H: NH em 6), 11,66 (s, 1H: OH). O cloridrato de 4-O-trifluorometiltirosina (R,S) pode ser preparado da seguinte maneira:

Operando como no exemplo N mas a partir de 3 g de N-acetil-(4-trifiuorometoxi)-fenilalaninato de metilo e de 30 ml de ácido clorídrico 12 N, obtêm-se 1,5 g de cloridrato de 4-O-trifluorometiltirosina (RS) sob a forma de cristais brancos que fundem a 260°C. O N-acetil-(4-trifluorometoxi)fenilalaninato de metilo (R,S) pode ser preparado da seguinte maneira:

Operando como no exemplo N, mas a partir de 3,1 g de (4-trifluorometoxi)-2-acetamidocinamato de metilo, de 0,3 g de paládio sobre carvão a 10% em 50 ml de etanol, obtêm-se 3 g de N-acetil-(4-trifluorometoxi)fenilalaninato de metilo sob a forma de um sólido branco que funde a 80°C. O 4-trifluorometoxi-2-acetamidocinamato de metilo pode ser preparado da seguinte maneira:

Operando como no exemplo N, mas a partir de 4,3 g de 2-acetamidoacrilato de metilo, de 0,14 g de acetato de paládio, de 6.1 g de cloreto de tetrabutilamónio. de 4,6 g de hidrogenocarbonato de sódio e de 5 g de 4-trifluorometoxibromobenzeno, em solução em 150 ml de dimetilformamida anidra. Obtêm-se 3,1 g de (4-trifluorometoxi)-2-acetamidocinamato de metilo sob a forma de um sólido branco que funde a 135°C.

Exemplo T

Preparação da 4s-metiltio-des^-dimetilamino)pristinamicina IA

Realiza-se à escala de 56 erlenmeyers, como descrito no exemplo F, uma cultura da estirpe SP92::pVRC508 em meio de produção com adição, ao fim de 16 horas, de 1 ml de uma solução a 20 g/1 em soda 0,1N, de cloridrato de 3-metiltiofenilalanina (R,S). Ao fim de 40 horas de cultura, os 1,68 litros de mosto obtidos em 56 erlenmeyers são extractados por 2 volumes de uma mistura de 66% de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 e 34% de acetonitrilo e depois centrifugados. O sobrenadante é extractado por 2 vezes com 0,5 volumes de diclorometano. As fases clorometilénicas são lavadas com água, depois combinadas, secas 50 86 242 ΕΡ Ο 773 956 / ΡΤ sobre sulfato de sódio e evaporadas. O extracto seco é retomado por 20 ml de dicloroi^íetSno e injectado sobre uma coluna de sílica (30 g) montada em diclorometano e eluída sucessivamente por gradientes de 0 a 10% de metanol em diclorometano. As fracções contendo o novo derivado de pristinamicina IA sào reagrupadas e evaporadas. O resíduo seco é retomado por 7 ml de uma mistura de 54% de água e 46% de acetonitrilo e injectado sobre uma coluna semi-preparativa Nucléosil 7μ C8 10x250 mm (Macherey Nagel) eluída com uma mistura de 55% de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 e 45% de acetonitrilo. As fracções contendo a nova pristinamicina sào reagrupadas e extractadas por um volume de diclorometano. A fase orgânica é lavada com água, seca sobre sulfato de sódio e em seguida evaporada. Obtêm-se 20 mg de 4E-metiltio-des(4ç-dimetilamino)pristinamicina IA.

Espectro de R.M.N. ‘H (400 MHz, CDCh, Ô em ppm, ref. TMS): 0,56 (dd, J = 16 e 5.5 Hz, 1H: 1H do CH2 em 5 β), 0,90 (t, J = 7,5 Hz, 3H: CH3 em 2 γ), 1,13 (mt. 1H: 1H do CH2 em 3 β), 1,28 (mt, 1H: 1H do CH2 em 3 y), 1,32 (d. J = 6,5 Hz, 3H: CH:, em 1 y), 1,58 (mt, 1H: o outro H do CH2 em 3 y), 1,62 e 1,74 (2 mts, IH cada um: CH2 em 2 β), 2,02 (mt, 1H, o outro H do CH2 em 3 β), 2,25 e 2,35 (respectivamente mt e d largo. J = 16,5 Hz, 1H cada um: CH2 em 5 Õ), 2,39 (d, J = 16 Hz, 1H: o outro H do CH2 em 5 β), 2,43 (s, 3H: SCH3), 2,82 (dt, J = 13 e 4 Hz, 1H: 1H do CH2 em 5 ε), 2.98 (dd, J = 12 e 4,5 Hz. 1H: 1H do CH2 em 4 β), 3,26 (s, 3H: NCH3), 3,30 (t, J = 12 Hz 1H: 1H do CH2 em 3 δ), 3,38 (mt, 1H: o outro H do CH2 em 4 β), 3,57 (mt. 1H: o outro H do CH2 em 3 δ), 4,56 (t, J = 7,5 Hz, 1H: 3 a), 4,74 (dd largo, J = 13 e 8 Hz, 1H: o outro H do CH: em 5 ε), 4,84 (mt, 1H: 2a), 4,89 (dd, J = 10 e 1 Hz, 1H: 1 a), 5,29 (dd, J = 12 e 4,5 Hz. 1H: 4 a), 5,32 (d largo, J = 5,5 Hz, 1H: 5 a), 5,88 (d, J = 9,5 Hz, 1H: 6 a), 5,90 (mt, 1H: 1 β), 6,51 (d, J = 10 Hz. 1H: NH em 2), 6,99 (d largo, J = 8 Hz, 1H: H Aromático em para do metiltio), 7,10 e 7,15 (respectivamente s largo e d largo, J = 8 Hz, 1H cada um: H Aromáticos em orto do metiltio), de 7,15 a 7,35 (mt, 6H: H Aromáticos em 6 e H Aromáticos em meta do metiltio), 7.43 (d largo, J = 8 Hz, 1H: Γ H4), 7,52 (dd, J = 8 e 4 Hz, 1H: Γ H5), 7.79 (d largo, J = 4 Hz, 1H: 1’ Hó), 8,38 (d, J - 10 Hz, 1H: NH em 1). 8,73 (d, J = 9,5 Hz, 1H: NH em 6), 11,62 (s, 1H: OH). O cloridrato de 3-metiltiofenilalanina (R,S) pode ser preparado da seguinte maneira:

Operando como no exemplo N mas a partir de 3,3 g de N-acetil-(3-metiltio)-fenilalaninato de metilo e de 40 ml de ácido clorídrico 12 N, obtêm-se 1,38 g de cloridrato de 3-metiltiofenilalanina (RS) sob a forma de cristais brancos que fundem a 190°C. 51 86 242 ΕΡ Ο 773 956 / ΡΤ Ο N-acetil-3metiltiofenilalaninato de metilo (R,S) pode ser preparado da seguinte maneira:

Colocam-se num balão 3,72 g de 3-metiltio-2-acetamidocinamato de metilo, em solução em 100 ml de metanol e 30 ml de tetra-hidrofurano e em seguida adicionam-se 1,4 g de magnésio. Após 20 minutos de reacção arrefece-se a mistura por meio de um banho de gelo e depois adiciona-se novamente 1,4 g de magnésio. A mistura é agitada à temperatura ambiente durante 18 horas, vertida sobre 1,4 1 de água destilada e 300 ml de CH2CI2 e depois filtrada sobre Clareei®. A fase aquosa é ajustada a pH 6 por adição de ácido clorídrico 12 N, depois decantada e lavada com 100 ml de CH2CI2. As fases orgânicas são reunidas, secas sobre sulfato de magnésio, filtradas e concentradas à secura sob pressão reduzida para dar 3,42 g de N-acetil-3-metiltiofenilalaninato de metilo sob a forma de um óleo incolor (Silice Merck 5719, Rf= 0,5; AcOEt). O 3-metiltio-2-acetamidocinamato de metilo pode ser preparado da seguinte maneira:

Operando como no exemplo N, mas a partir de 5,6 g de 2-acetamidoacrilato de metilo, de 0,18 g de acetato de paládio, de 8,2 g de cloreto de tetrabutilamónio, de 5,86 g de hidrogenocarbonato de sódio e de 6.5 g de 3-iodo-l-metiltiobenzeno, em solução em 160 ml de dimetilformamida anidra, obtêm-se 4,8 g de (3-metiltio)-2-acetamidocinamato de metilo sob a forma de um sólido branco que funde a 139°C.

Exemplo U

Preparação da 4c-(aliletilamino)-des(4c-dimetilamino)pristinamicina IA

Realiza-se à escala de 26 erlenmeyers, como descrito no exemplo F, uma cultura da estirpe SP92::pVRC508 em meio de produção com adição, ao fim de 16 horas, de 1 ml de uma solução a 20 g/1 em soda 0,1N, de dicloridrato de 4-(aliletilamino)fenilalanina (R,S). Ao fim de 40 horas de cultura, os 0,78 litros de mosto obtidos em 26 erlenmeyers são extractados por 2 volumes de uma mistura de 66% de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 e 34% de acetonitrilo e depois centrifugados. O sobrenadante é extractado por 2 vezes com 0,5 volumes de diclorometano. As fases clorometilénicas são lavadas com água, depois combinadas, secas sobre sulfato de sódio e evaporadas. O extracto seco é retomado por 20 ml de diclorometano e injectado sobre uma coluna de sílica (30 g) montada em diclorometano e eluída sucessivamente por gradientes de 0 a 10% de metanol em diclorometano. As fraeções contendo a 4d-(afiletilamino)-des(4£-dimetilamino)-pristinamicina IA são reagrupadas e evaporadas. O resíduo seco é retomado por 7 ml de uma

86 242 ΕΡ Ο 773 956 / ΡΤ 52 mistura de 60% de água e 40% de acetonitrilo e injectado sobre uma coluna semi-preparativa Nucléosil 7μ C8 10x250 mm (Macherey Nagel) eluída com uma mistura de 52% de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 e 48% de acetonitrilo. As fracções contendo a 4ξ-^1ΐ1βίϊΐ3ππηο)-des^-dimetilamino)pristinamicina são reagrupadas e extractadas por um volume de diclorometano. A fase orgânica é lavada com água, seca sobre sulfato de sódio e em seguida evaporada. Obtêm-se 20 mg de 4ç-(aliletilamino)-des(4c-dimetilamino)pristinamicina IA.

Espectro de R.M.N. ’H (400 MHz, CDC1?, Ô em ppm, ref. TMS): 0,58 (dd, J = 16 e 6 Hz, 1H: 1H do CH? em 5 β), 0.91 (t, J = 7,5 Hz, 3H: CH3 em 2 γ), 1,16 (t, J = 7 Hz„ 3H: CH3 do etilo), 1,16 (mt, IH: 1H do CH? em 3 β), 1,25 (mt, 1H: 1H do CH2 em 3 γ), 1,32 (d, J = 6,5 Hz, 3H: CH;, em 1 γ), 1,54 (mt, 1H: 0 outro H do CH? em 3 γ), 1,63 e 1,75 (2 mts, 1H cada um: CH2 em 2 β), 2,02 (mt, 1H, 0 outro H do CH2 em 3 β), 2,23 e 2,31 (respectivamente mt e d largo, J = 16,5 Hz, 1H cada um: CH? em 5 δ), 2,37 (d, J = 16 Hz, 1H: 0 outro H do CH? em 5 β), 2,S0 (dt, J = 13 e 4,5 Hz, 1H: 1H do CH? em 5 ε), 2,87 (dd, J = 12 e 4 Hz, 1H: 1H do CH2 em 4 β), 3,10 (mt, 2H: NCH? do etilo), de 3,15 a 3,30 (mt, 1H: 1H do CH2 em 3 δ), 3,26 (s, 3H: NCH?), 3,30 (t. J = 12 Hz, 1H: o outro H do CH? em 4 β), 3,36 (mt, 2H: NCH2 do etilo), 3,54 (mt, LH: 0 outro H do CH? em 3 δ), 3,90 (AB limite, 2H: NCH2 do alilo), 4,57 (dd. J = 8 e 6 Hz, 1H: 3 a), 4,76 (dd largo, J = 13 e 7,5 Hz, 1H: 0 outro H do CH2 em 5 ε), 4.84 (mt, 1H: 2a), 4,89 (dd. J = 10 e 1 Hz, 1H: 1 a), de 5,05 a 5,20 (mt, 3H: 4 α e = CH? do alilo), 5,27 (d largo, J = 6 Hz, 1H: 5 a), 5,83 (mt, 1H: CH= do alilo), 5,88 (d, J = 9,5 Hz, 1H: 6 a), 5,91 (mt, 1H: 1 β), 6,50 (d, J = 10 Hz, 1H: NH em 2), 6,60 (d, J = 8 Hz, 2H: e H Aromáticos em 4 ε), 7,02 (d, J = 8 Hz, 2H: H Aromáticos em 4 δ), de 7,10 a 7,35 (mt, 5H: H Aromáticos em 6), 7,47 (AB limite, 2H: Γ H4 e Γ H5), 7,88 (dd, J = 4 e 2 Hz, 1H: 1 ’ H6), 8,41 (d, J = 10 Hz, 1H: NH em 1), 8,75 (d, J = 9,5 Hz, 1H: NH em 6), 11,62 (s, 1H: OH). O dicloridrato de 4-(aliletilamino)fenilalanina (R,S) pode ser preparado da seguinte maneira:

Operando tal como no exemplo F mas a partir de 4,54 g de 4-aliletilbenzilacetamidomalonato de dietilo e de 37,9 ml de ácido clorídrico a 10N, obtém-se, após evaporação, um sólido que é seco sob pressão reduzida (2,7 kPa) a 40°C. Obtêm-se 3,67 g de dicloridrato de 4-(aliletilamino)fenilalanina (R,S) sob a forma de um sólido castanho que funde a cerca de 130°C (decomposição). O 4-(aliletilamino)benzilacetamidomalonato de dietilo pode ser preparado da seguinte maneira:

86 242 ΕΡ Ο 773 956 / ΡΤ

Operando tal como no exemplo F mas a partir de 8 g de 4-etilaminobenzilacetamidomalonato de dietilo, de 4 ml de brometo de alilo, de 5,82 ml de l,5-diazabiciclo[4-3-0]non-5-eno, em 50 ml de tetra-hidrofurano, obtém-se após purificação por cromatografia instantânea (eluente CH2Cl2/AcOEt 90-10 em volume), 5,6 g de um sólido que é recristalizado em 35 ml de ciclo-hexano. Obtêm-se assim 5,43 g de 4-(aliletilamino)benzilacetamidomalonato de dietilo sob a forma de um sólido branco que funde a 8ó°C.

Exemplo V

Preparação da 4ó-(etilpropilamino)-des(4ç-dimetilamino)pristinamicina ΙΛ

Realiza-se à escala de 60 erlenmeyers, como descrito no exemplo F, uma cultura da estirpe SP92::pVRC508 em meio de produção com adição, ao fim de 16 horas, de 1 ml de uma solução a 20 g/1 em soda 0,1N. de dicloridrato de 4-(etilpropilamino)fenilalanina (R,S). Ao fim de 40 horas de cultura, os 1.8 litros de mosto obtidos em 60 erlenmeyers são extractados por 2 volumes de uma mistura de 66% de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 e 34% de acetonitrilo e depois centrifugados. O sobrenadante é extractado por 2 vezes com 0,5 volumes de diclorometano. As fases clorometilénicas são lavadas com água, depois combinadas, secas sobre sulfato de sódio e evaporadas. O extracto seco é retomado por 20 ml de diclorometano e injectado sobre uma coluna de sílica (30 g) montada em diclorometano e eluída sucessivamente por gradientes de 0 a 10% de metanol em diclorometano. As fracções contendo a 4ç-(etilpropilamino)-des(4£-dimetilamino)-pristinamicina IA são reagrupadas e evaporadas. O resíduo seco é retomado por 7 ml de uma mistura de 60% de água e 40% de acetonitrilo e injectado sobre uma coluna semi-preparativa Nucléosil 7μ C8 10x250 mm (Macherey Nagel) eluída com uma mistura de 63% de tampão fosfato 100 mM pH 2,9 e 37% de acetonitrilo. As fracções contendo a 4ó-(etilpropilamino)-des(4c-dimetilamino)pristmamicina são reagrupadas e extractadas por um volume de diclorometano. A fase orgânica é lavada com água, seca sobre sulfato de sódio e em seguida evaporada. Obtêm-se 16 mg de 4£-(etilpropilamino)-des(4c-dimetilamino)pristinamicina IA.

Espectro de R.M.N. 'H (400 MHz, CDCh, δ em ppm, ref. TMS): 0,67 (dd, J = 16 e 6 Hz, 1H: 1H do CH2 em 5 β), 0,91 (t, J = 7,5 Hz, 3H: CH? em 2 y), 0,95 (t, J = 7,5 Hz, 3H: CH3 do propilo), 1,14 (t, J = 7 Hz, 3H: CH3 do etilo), 1,15 (mt, 1H: 3H do CH2 em 3 β), 1,25 (mt, 1H: 1H do CH? em 3 y), 1,33 (d, J = 7 Hz, 3H: CH? em 1 y), de 1,45 a 1,65 (mt, 3H: o outro H do CH2 em 3 y e CH? propilo), 1,63 e 1,75 (2 mts, 1H cada um: CH? em 2 β), 2,02 86 242

EP 0 773 956 / PT r

54 (mt, 1H, o outro H do CH2 em 3 β), 2,23 e 2,33 (respectivamente mt e d largo, J = 16,5 Hz, 1H cada um: CH2 em 5 δ), 2,37 (d, J = 16 Hz, 1H: o outro H do CH2 em 5 β), 2,80 (dt, J = 13 e 5 Hz, 1H: 1H do CH2 em 5 ε), 2.S9 (dd, J = 12 e 4 Hz, 1H: 1H do CH2 em 4 β), de 3,10 a 3,25 (mt, 3H: 1H do CH2 em 3 ò e NCH2 do propilo), 3.26 (s, 3H: NCH.O, de 3,25 a 3,40 (mt, 2H: NCH2 do etilo), 3,34 (t, J = 12 Hz, 1H: o outro H do CH2 em 4 β), 3,54 (mt, 1H: o outro H do CH2 em 3 δ), 4,57 (dd, J = 7,5 e 6 Hz, lH: 3 a), 4,76 (dd largo, J = 13 e 7,5 Hz, 1H: o outro H do CH2 em 5 ε), 4,S4 (mt, 1H: 2a), 4,89 (dd, J = 10 e 1 Hz, 1H: 1 a), 5,21 (dd, J = 12 e 4 Hz, 1H: 4 a), 5,28 (d largo, J = 6 Hz, 1H: 5 a), 5,88 (d, J = 9,5 Hz, 1H: 6 a), 5,91 (mt, 1H: 1 β), 6,48 (d, J = 10 Hz, 1H: NH em 2), 6,60 (d, J = 8 Hz, 2H: e H Aromáticos em 4 ε), 7,03 (d, J = 8 Hz, 2H: H .Aromáticos em 4 δ), de 7.10 a 7,35 (mt, 5H: H Aromáticos em 6), 7,47 (AB limite, 2H: Γ H4 e Γ Hs), 7,89 (mt, 1H: 1’ Hf,), 8,42 (d, J = 10 Hz, 1H: NH em 1), 8,76 (d, J = 9,5 Hz, 1H: NH em 6), 11,62 (s, 1H: OH). O dicloridrato de 4-(etilpropilamino)fenilalanina (R,S) pode ser preparado da seguinte maneira:

Operando como no exemplo F mas a partir de 2,5 g de 4-etilpropilaminobenzilacetamidomalonato de dietilo e de 21 ml de ácido clorídrico a 10N, obtém-se, após evaporação, um sólido que é seco sob pressão reduzida (2,7 kPa) a 40°C. Obtêm-se 2 g (97%) de dicloridrato de 4-(etilpropillamino)fenilalanina (R,S) sob a forma de um sólido branco que funde a cerca de 147°C (decomposição). O 4-(etilpropilamino)benzilacetamidomalonato de dietilo pode ser preparado da seguinte maneira:

Operando tal como no exemplo F mas a partir de 10 g de 4-etilaminobenzilacetamidomalonato de dietilo, de 5,6 ml de 1-iodopropano, de 7,2 ml de l,5-diazabiciclo[4-3-0]non-5-eno, em 70 ml de tetra-hidrofurano, obtém-se após 36 horas de reacção, seguida de purificação por cromatografia instantânea (eluente CH2Cl2/MeOH 97-3 em volume), 2,8 g de um sólido que é recristalizado em 26 ml de ciclo-hexano. Obtêm-se assim 2,9 g de 4-(etilpropilamino)benzilacetamidomalonato de dietilo sob a forma de um sólido branco que funde a 84-86°C. f f

86 242

EP 0 773 956 / PT 55

Separação e purificação de componentes do Grupo B

Exemplo W

Colocam-se em suspensão 30 kg de pristinamicina bruta [pristinamicina IA (PIA): 20,7%, pristinamicina IB (PIB): 3,9%, pristinamicina IC (PIC): 0,6%, pristinamicina ID (PID): 0,3%, pristinamicina IIB (PIIB): 8%, pristinamicina IIA (PIIA): 45%, pristinamicina IIF (PIIF): <0,5% (não doseada), pristinamicina IIG (PIIG): <0,5% (não doseada)], em 210 litros de acetato de etilo e agita-se durante 15 horas à temperatura ambiente. A suspensão é filtrada e o filtrado de acetato de etilo recolhido é extractado por 2 vezes com 20 litros de ácido sulfúrico IN e depois com 20 litros de água destilada. As fases aquosas reunidas são lavadas por 6 vezes com 15 litros de acetato de etilo, depois ajustadas a pH 7 por adição de 30 litros de uma solução a 10% de bicarbonato de sódio e extractadas por 3 vezes com 30 litros de cloreto de metileno. As fases clorometilénicas são reunidas e lavadas por 10 litros de água destilada. O cloreto de metileno é em seguida destilado e substituído por 50 litros de etanol. A mistura é então tratada em refluxo por 0,8 kg de negro L3S durante 30 minutos. Após filtração e lavagem por 2 vezes com 5 litros de etanol, a mistura é arrefecida para 10°C em 15 horas. Após manutenção durante uma hora a 10°C, a suspensão é filtrada e lavada por 3 vezes com 7 litros de etanol. Após secagem do sólido a 40°C sob pressão reduzida, obtêm-se 5,7 kg de pristinamicina I purificada (aqui em seguida denominada PI). Título: 96,8% (PIA: 81,1%, PIB: 12%, PIC: 2,6%. PID: 1,1%);

Rendimento em PIA: 74%.

Retomam-se 1500 g de PI purificada em 9 litros de 1,2-dicloroetano e em seguida adiciona-se 1,5 equivalentes de anidrido succínico e 0.015 equivalentes de dimetilaminopiridina. A solução é mantida durante 1 semana a 20°C e depois é introduzida numa coluna contendo 10 kg de sílica (20-45 pm) [altura da coluna: 1 m; diâmetro: 20 cm]. A eluiçào é efectuada por percolação de uma mistura de l.2-dicloroetano/metanol, com um caudal de 18 litros/hora durante 6 horas; a percentagem de metanol (a 5% de teor em água) é aumentada de 0 a 4% no decurso da cromatografia. São recuperadas 47 fracções de 2,4 litros.

As fracções 5 a 15 são reunidas, o 1,2-dicloroetano é evaporado e substituído por 5 litros de etanol. Após cristalização obtêm-se 365 g de PIA com um título de 99,8%.

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Preparação de componentes brutos do Grupo A

Exemplo X

Colocam-se em suspensão 500 g de pristinamicina bruta [pristinamicina IA (PIA): 20.7%, pristinamicina IB (PIB): 3.9%, pristinamicina IC (PIC): 0,6%, pristinamicina ID (P1D): 0,3%, pristinamicina IIB (PIIB): 8%, pristinamicina IIA (PIIA): 45%], em 50 litros de metilisobutilcetona. Esta solução é extractada 5 vezes por uma fase aquosa composta por 2,5 litros de água e 2,5 litros de ácido sulfúrico IN e depois lavada por 3 vezes com 10 litros de água. A metilisobutilcetona é em seguida tratada por 7,5 litros de uma solução aquosa de hidrogenocarbonato de sódio a 35 g/litro e em seguida lavada com 5 litros de água. De cada vez, a fase aquosa é misturada com a fase orgânica, decantada e separada. A fase orgânica obtida é posta em contacto com 750 g de alumina, filtrada, concentrada até um volume de cerca de 4 litros e retomada por 5 volumes de hexano. O precipitado obtido é filtrado e seco. Obtêm-se 300 g de produto que são postos em suspensão num litro de isopropanol. Após agitação a 55°C durante 45 minutos, filtra-se a 4°C. As águas mãe de filtração são concentradas à secura, retomadas por 500 cm3 de metilisobutilcetona sobre os quais se vertem 5 volumes de hexano. O precipitado é filtrado, lavado com hexano e seco a 40°C sob pressão reduzida. Obtêm-se 69 g de PIIB bruta contendo 36% de PIIB, 6% de PIIA e não contendo já PIA.

Exemplo Y 60 g de PIIB bruta, obtida como anteriormente no exemplo P, são purificados em várias operações, por cromatografia sobre coluna de Nucléosil 5C8® (diâmetro da coluna 5 cm, altura 30 cm), percolada por um eluente de água/acetonitrilo 60/40. Obtêm-se assim 250 mg de pristinamicina IIF (PIIF). A presente invenção refere-se igualmente às composições farmacêuticas utilizáveis em medicina humana ou veterinária que contêm como produto activo a nova associação purificada de estreptogramina, compreendendo pelo menos um componente do grupo B das estreptograminas definido pela fótmula geral (I) co-cristalizado com pelo menos um componente do grupo A de fórmula geral (II), no estado puro ou na presença de um ou vários diluentes ou adjuvantes compatíveis e farmaceuticamente aceitáveis. Estas composições podem ser utilizadas por via oral ou tópica.

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Como composições para administração oral podem ser utilizados comprimidos, gélulas, pílulas, pós de liofilizados ou granulados. Nestas composições, o produto activo de acordo com a invenção pode ser misturado com um ou vários díluentes ou adjuvantes inertes, tais como sacarose, lactose ou amido. Estas composições podem igualmente compreender outras substâncias para além de diluentes, por exemplo um lubrificante, tal como o estearato de magnésio.

As composições para administração tópica podem ser por exemplo cremes, pomadas ou loções.

Em terapêutica humana ou veterinária, as composições de acordo com a invenção são particularmente úteis no tratamento de infecções de origem bacteriana, designadamente de infecções graves por cocci Gram-positivos: infecções por estafilococos (designadamente as infecções por estafilococos resistentes à meticilina), infecções por estreptococos (designadamente os pneumococos resistentes à penicilina e aos macrólidos); as composições são também particularmente úteis no tratamento de infecções por Hemophilus, Moraxella catarrhalis, Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia imchomatis, Mycoplasma hominis, Mycoplasmapneumoniae, Ureaplasma urealyticum.

As composições de acordo com a invenção podem ser empregues designadamente no tratamento de infecções respiratórias altas e baixas (por exemplo tratamento de infecções pulmonares), no tratamento de infecções cutâneas, no tratamento a longo termo de infecções ósseas ou articulares, no tratamento ou na profilaxia de endocardite em cirurgia dentária e urinária, no tratamento das doenças sexualmente transmissíveis, bem como no tratamento de infecções oportunistas, bacterianas e parasitárias, que sobrevêm no SIDA e em profilaxia do risco estafilocócico no imunodeprimido.

De uma maneira geral, o médico determinará a posologia que estima ser a mais apropriada em função da idade, do peso, do grau da infecçâo e de outros factores próprios do sujeito a tratar. Geralmente, as doses estão compreendidas entre 0,4 e 3,5 g de produto activo em 2 ou 3 tomas por dia, por via oral para um adulto.

Os exemplos seguintes, dados a título não limitativo, ilustram composições de acordo com a invenção: 58 86 242 ΕΡ Ο 773 956 / ΡΤ

Exemplo Α

Preparam-se de acordo com as técnicas habituais gélulas opacas doseadas a 250 mg da associação co-cristalizada de 4s-cloropristinamicina IA/pristinamicina IIB.

Exemplo B

Preparam-se de acordo com as técnicas habituais gélulas opacas doseadas a 250 mg da associação co-cristalizada de des(4ç-dimeti lamino )-4e-metoxipristinamicina IA / pristinamicina IIB.

Lisboa, 6. AGO. 2001

Por AVENTIS PH ARMA S.A. - O AGENTE OFICIAL -

| Eng.° ANTÓNIO JOÃO DA CUNHA FERRE1RA Ag. O}. Pr. Ind. Rua das Flores, 74-4.° 1200-195 LISBOA

Claims

REIVINDICAÇÕES 86 242 ΕΡ Ο 773 956 / ΡΤ 1/6 1 - Forma purificada de estreptograminas, caracterizada por compreender pelo menos um componente do grupo B das estreptograminas definido pela fórmula geral:

N

na qual - o símbolo R| representa um radical metilo ou etilo. e 1) ou - o símbolo Ri representa um átomo de hidrogénio e - o símbolo R3 representa um radical benzilo substituído de fórmula geral R'

na qual R representa NR4R5 para o qual os símbolos R4 e R5 são, um um átomo de hidrogénio ou um radical metilo e 0 outro um radical metilo e R’ é um átomo de cloro ou de bromo, ou representa um radical alcenilo contendo 3 a 5 átomos de carbono se R4 e R5 forem radicais metilo, 2) ou - o símbolo R2 representa um átomo de hidrogénio ou um radical hidroxi, e - o símbolo R3 representa um radical de fórmula geral (III) 86 242 ΕΡ Ο 773 956 / ΡΤ 2/6

na qual R é um átomo de hidrogénio e R’ representa um átomo de halogéneo, um radical alquilamino ou dialquilamino, o resto de um éter-óxido, um radical alquiltio, alquilo contendo 1 a 3 átomos de carbono em cadeia linear ou ramificada ou tri-halogenometilo, ou então na qual R é um átomo de halogéneo, um radical alquilamino contendo 2 a 4 átomos de carbono em cadeia linear ou ramificada, dialquilamino cujas partes alquilo são idênticas ou diferentes e contêm 2 a 4 átomos de carbono em cadeia linear ou ramificada ou metiletilamino, um radical pirrolidino, um radical alcenilaquilamino cuja parte alcenilo contém 3 ou 4 átomos de carbono e a parte alquilo é definida como acima, um radical dialcenilamino cujas partes alcenilo são definidas como acima, um radical alquil-cicloalquilmetilamino cuja parte alquilo é definida como acima e a parte cicloalquilo contém 3 ou 4 átomos de carbono, o resto de um éter-óxido, um radical alquiltio, um radical alquiltiometilo, alquilo contendo 1 a 6 átomos de carbono em cadeia linear ou ramificada, arilo ou tri-halogenometilo eR’é um átomo de hidrogénio, ou então na qual R é um átomo de halogéneo, um radical amino, alquilamino ou dialquilamino, o resto de um éter-óxido, um radical alquiltio. alquilo contendo 1 a 6 átomos de carbono em cadeia linear ou ramificada ou tri-halogenometilo e R’ representa um átomo de halogéneo, um radical alquilamino ou dialquilamino, o resto de um éter-óxido ou um radical alquiltio ou alquilo contendo 1 a 3 átomos de carbono em cadeia linear ou ramificada, sendo entendido que, salvo menção especial, os radicais alquilo são lineares ou ramificados e contêm 1 a 4 átomos de carbono, co-cristalizado com peio menos um componente “minoritário'’ do grupo A das estreptograminas de fórmula geral: o

(II)

86 242 ΕΡ Ο 773 956 / ΡΤ 3/6 na qual R” é um átomo de hidrogénio ou um radical metilo ou etilo.
2 - Forma purificada de estreptograminas de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender pelo menos um componente do grupo B das estreptograminas definido pela fórmula geral (I) na reivindicação 1, na qual: o símbolo Ri é definido como na reivindicação 1 e 1) ou - o símbolo R? representa um átomo de hidrogénio e - o símbolo R3 representa um radical benzilo substituído de fórmula geral: R'

) na qual R representa NR4R5 para o qual os símbolos R4 e R5 são, um um átomo de hidrogénio ou um radical metilo e 0 outro um radical metilo e R’ é um átomo de cloro ou de bromo ou representa um radical alcenilo contendo 3 a 5 átomos de carbono se R_t e R5 forem radicais metilo, 2) ou - 0 símbolo R2 representa um átomo de hidrogénio ou um radicai hidroxi, e - o símbolo R3 representa um radical de fórmula geral (III) na qual R é um átomo de hidrogénio e R’ representa um átomo de halogéneo, um radical alquilamino ou dialquilamino, 0 resto de um éter-óxido ou um radical alquiltio, ou então na qual R é um radical alquilamino contendo 2 a 4 átomos de carbono em cadeia linear ou ramificada, dialquilamino cujas partes alquilo são idênticas ou diferentes e contêm 2 a 4 átomos de carbono em cadeia linear ou ramificada ou metiletilamino, um radical pirrolidino, um radical alcenilaquilamino cuja parte alcenilo contém 3 ou 4 átomos de carbono e a parte

86 242 ΕΡ Ο 773 956 / ΡΤ alquilo é definida como acima, o resto de um éter-óxido, um radical alquiltio, alquilo contendo 1 a 6 átomos de carbono em cadeia linear ou ramificada, ou tri-halogenometilo e R’ é um átomo de hidrogénio, ou entào na qual R é um radical alquilo contendo 1 a 6 átomos de carbono em cadeia linear ou ramificada e R’ representa um átomo de halogéneo, sendo entendido que, salvo menção especial, os radicais alquilo são lineares ou ramificados e contêm 1 a 4 átomos de carbono, co-cristalizado com pelo menos um componente "minoritário’' do grupo A das estreptograminas tal como definido na reivindicação 1.
3 - Forma purificada de estreptograminas de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender pelo menos um componente do grupo B das estreptograminas definido pela fórmula geral (I) na reivindicação 1, na qual: o símbolo Ri representa um radical etilo, o símbolo R2 representa um átomo de hidrogénio e 0 símbolo R;, representa um radical benzilo substituído de fórmula geral: R'

na qual 1) R representa NR4R5 para o qual os símbolos R4 e R3- são, um um átomo de hidrogénio ou um radical metilo e 0 outro um radical metilo e R’ é um átomo de cloro ou de bromo ou representa um radical alilo se R4 e R5 forem radicais metilo, ou então 2) R é um átomo de hidrogénio e R’ representa um radical alquilamino ou dialquilamino, um radical metoxi, etoxi, aliloxi ou trifluorometoxi, ou um radical alquiltio, ou então

86 242 ΕΡ Ο 773 956 / ΡΤ 5/6 R é um radical alquilamino contendo 2 a 4 átomos de carbono em cadeia linear ou ramificada, dialquilamino cujas partes alquilo são idênticas ou diferentes e contêm 2 a 4 átomos de carbono em cadeia linear ou ramificada ou metiletilamino, um radical pirrolidino, um radical alilalquilamino cuja parte alquilo é definida como acima, um radical metoxi, etoxi, aliloxi ou trifluorometoxi, um radical alquiltio, alquilo contendo 1 a 6 átomos de carbono em cadeia linear ou ramificada, ou trifluorometilo e R’ é um átomo de hidrogénio, ou então R é um radical alquilo contendo 1 a 6 átomos de carbono em cadeia linear ou ramificada e R’ representa um átomo de halogéneo. sendo entendido que, salvo menção especial, os radicais alquilo são lineares ou ramificados e contêm 1 a 4 átomos de carbono, co-cristalizado com pelo menos um componente "minoritário” do grupo A das estreptograminas tal como definido na reivindicação 1.
4 - Forma purificada de estreptograminas de acordo com uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada por se tratar de um composto co-cristalizado de um ou vários componentes do grupo B das estreptograminas definidas na reivindicação 1 a 3 e de um ou vários componentes minoritários do grupo A das estreptograminas tal como definidas na reivindicação 1, numa proporção molar da ordem de 1/2.
5 - Processo de preparação de uma forma purificada de estreptograminas de acordo com uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por se co-cristalizar o(s) componente(s) do grupo A das estreptograminas com o(s) componente(s) do grupo B das estreptograminas, tais como definidos nas reivindicações 1 a 3.
6 - Componente purificado do grupo A das estreptograminas tal como definido na reivindicação 1, quando é obtido por intermédio de um composto co-cristalizado de acordo com a reivindicação 1 a 4.
7 - Utilização de um ou vários componentes minoritários do grupo A das estreptograminas tal como definidos na reivindicação 1, para a preparação de co-cristalizados com um ou vários componentes do grupo B das estreptograminas definidas na reivindicação 1 a 3. 86 242 ΕΡ Ο 773 956 / ΡΤ 6/6
8 - Composição farmacêutica caracterizada por conter uma forma purificada de estreptograminas de acordo com uma das reivindicações 1 a 4, no estado puro ou na presença de qualquer diluente ou adjuvante compatível e farmaceuticamente aceitável. Llsboa' 16. ASO. 2001 Por AVENTIS PH ARMA S.A. - O AGENTE OFICIAL - O ADJUNTO

Enq.° ANTÓNIO JO&Q O A CUNHA FERRE1RA Ag. Ot Pr. Ind. Rua das Flores 74-4«® 1200495 Um&h