PT78770B

PT78770B - Process for the preparation of fructosyl disaccharides

Info

Publication number: PT78770B
Application number: PT78770A
Authority: PT
Original assignee: Tate & Lyle Plc
Priority date: 1983-06-21
Filing date: 1984-06-20
Publication date: 1986-06-26
Also published as: SU1630617A3; FI842513A7; AU578418B2; GB2145080A; PT78770A; NO842496L; FI842513A0; ZA844655B; MX7714E; DK297784A; FI85160B; ATE50774T1; US4617269A; IL72176A; NO162080C; CA1225348A; EP0130054A3; FI85160C; ES533607A0; GB8316790D0

Description

Descrição do objecto do invento que

TATE & LYLE PUBLIC LIMITED COMPANY, britânica, industrial,co» sede en Sugar Quay, Lover Thames Street, London, EC3R 6DQ,In glaterra, pretende obter em Por tugal, para: "PROCESSO PARÁ À PREPARAÇÃO DE DISSACÁRIDOS DE FRUTOSILO".

0 presente invento refere-se à preparação de dissaeáridos de frutosilo, e, especialmente, a adoçantes de halosacarose, em particular a 4,1».6¹-trideoxi-galacto saca rose (conhecida como TGS), por meio de uma reacção enximática,

A 4,1’,6’-trioloro-4,l·,6¹-trideoxi-galaotosacarose · ua adoçante potente descrito e reivindicado,jun tamente com outros derivados de cloro sacarose, na Patente Bri, tânica Ní 1543167. Compostos análogos, nos quais o grupo 6r

-hidroxi é eterificado ou não está presente são descritos na Patente Europeia O1O3479A e Patente Britânica 2127806A, Compostos análogos contendo outros substituintes de halo são dej» critos na Patente Britânica 21O4O63A. Um processo para a preparação de TGS á descrito e reivindicado nas Patentes Britâni cas 2O79749A e Norte Americana 4 3θθ 476. Estef método envolve a preparação de um 6-éster de sacarose, ou uma mistura contendo, predominantemente, 6-éster de sacarose, e, em seguida, a cloração selectiva deste material substituído na posição 6. Uaa subsequente desesterificação na posição 6 produas TGS. Na prática, é difícil obter-se uma boa produção de 6-éster de sa carose, de uma maneira específica, quando se utilizarem meios químicos. Verificou-se agora qus a preparação de TGS a partir

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d· um derivado de sacarose substituído na posiç&o 6 pode ser alcançada sem dificuldade, mediante a utilizaç&o de uma reaoÇ&o oom base em enzimas inioiando-se a partir de glucose subs tituida na posiç&o 6 correspondente e um açúoar de frutosido, para se produzir uma sacarose substituída na posiçSo 6 isenta de quaisquer outros derivados de sacarose substituídos noutras posiç&es, e facilmente separáveis de outros materiais de partida, e glucose.

A enzima em questSo é uma frutoeil-transfe rase. As frutosil-transferases s&o bem conhecidas em enzimolo gia. Uma enzima representativa é a assim designada levansacarose responsável pela produç&o de levan, um derivado de polifrutose, na decomposiç&o de sacarose ou de rafinose. No seu modo normal de acç&o, a levansacarose cinde a ligaç&o glucose -frutose em sacarose e transfere a frutose para um açúcar acei tante, por exemplo, a própria sacarose. Repete-se este proces^ so para se desenvolverem as cadeias de frutose. Se, além da sacarose, está presente um outro açúcar, por exemplo, D-xilose, a formaç&o de levan é inibida, ou pelo menos reduzida, e a frutose é transferida antes para o outro açúcar ooncorrente que aotua como aceitante para produzir um novo frutosido. 0 novo frutosido actuará também como dacor, por isso, na prática, tem-se utilizado um largo excedente de dador afim de empe, lir o equilíbrio na direcç&o desejada.

Hestrin e Avigad, em Biochem. J. 69 (195®) 388-39θ» mostraram que uma gama de açúcares actuava como bons aceitantes de frutose e tendiam, assim, a inibir a formaç&o de levan} outros eram aceitantes pobres; enquanto uma teroeira classe era?aparentemente Inerte e n&o conseguia inibir a formaç&o de levan. Nesta última categoria encontrava-se 6-fosfato de D-glucose. Todos os outros açúcares referidos no resumo eram açúcares que n&o puderam ser obtidos eomo derivados. Contudo, a reacç&o de 6—fosfato de glucose com sacarose na presença de uma enzima derivada de um mutante da estirpe Bacillus subatilis Marburg 168, é descrita por Kunst e outros em Eur. J. Biochem. 42, 611-620 (1974). Estes s outros

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autores (por exemplo, Dedonder, Methods Enzymol., 8, 5OO-5O5) utilizaram sempre um racio elevado de dador de frutose (por e xemplo, sacarose) em relação ao aceitante, por exemplo, de 5*1 a 10*1, e uma baixa concentração que nâo seria praticável a uma escala industrial. Uma reacção semelhante é descrita no Pedido de Patente Britânica 2O4675A, na qual se faz reagir uma variedade de materiaie de partida de aldose com sacarose ou rafinose, na presença de uma levansacarose derivada de uma gama de micro-organismos incluindo Actlnomycea viacosus e Bi subtllls (Estirpe ATCC 6051, isto é, a estirpe Marburg). No pedido de patente, contudo, a aldose e sempre um açúcar não o. btido por derivação e o racio molecular do dador em relação ao aceitante utilizado, é de 1*5, provavelmente para minimizar as reacções susceptíveis de formar cadeias.

Verificou-se agora que os derivados de sacarose obtida por derivação na posição 6 podem ser preparados mediante a reacção das correspondentes glucose ou galactose <0 btldas por derivação na posição 6 com uma frutosil-transferase na presença de sacarose ou rafinose ou estaquiose, 0 produ to pode então ser halogenado nas posições 4,1* e 6' e, se se desejar, 0 grupo derivante na posição 6 pode ser retirado para produzir o haloaçúcar necessário. A reacção inicial continua com um bom rendimento na ausência da produção de qualquer levan»

De acordo com o presente invento, proporciona-se um processo para a preparação de um derivado de saca rose ou galaetosacarose de halodeoxi da fórmula geral

em que A representa um átomo de hidrogénio ou o grupo C

(X)

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que X representa um átomo de hidrogénio, ou um grupo hidroxi ou alcoxi e Y representa um átomo de halogénio, compreendendo a reacção de uma aldoee da fórmula geral

(II)

em que A representa um átomo de hidrogénio ou o grupo ^C^₂ ^X» em que X representa um átomo de hidrogénio ou um grupo alcoxi ou um grupo hidroxi protegido, com um di- ou oligo-sacárido de frutosilo na presença de uma frutosil-tranferase, para se obter um composto da fórmula geral

em que A tem a definição indicada para a fórmula II; a separa ção do composto da fórmula III{ a halogenação do composto da fórmula III e, para um composto da fórmula 1 era que A representa CHgX e X representa um grupo hidroxi, a desprotecção do grupo hidroxi protegido.

A frutosil-transferase utilizada na reacção de acordo com o presente invento deriva, de preferência, de B. substilis ou Brvinia so, (anteriormente conhecida como Aerobacter levanicum). A B, subtilis é uma fonte particularmente preferida, algumas estirpes desenvolvem-se muito facilmente a uma larga escala numa fermentação convencional em lar ga escala e são bem aceites como fontes de enzimas industriais (por exemplo, <V-amilases e ^-lactamases). Além disso, a

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frutosil-transferase é uma enzima predominantemente exocelular · pode assim ser obtida · purificada mais facilmente. Ϊ importante que a enzima utilizada esteja isenta de actividade invertase. Deve utilizar-se, ee necessário, um inibidor de in vertaee selectivo tal como £-hidroximercuribenzoato. A enzima B, subtilia pode eer colhida de uma cultura líquida de Β.aubtilis. por meio de precipitação eelectiva ou outras técnicas convenientes» Por exemplo, a cultura pode eer centrifugada pa ra remoção de células e detritos; levada a uma saturação de cerca de 65 % com sulfato de amónio; re-centrifugada para se retirar <.á invertase e outros contaminantes de proteinas e, da pois, levada a uma saturação ds cerca de 95 % com sulfato de amónio» Precipita-se então levan-sacarose em bruto, a qual po de eer depois purificada mediante nova dissolução num tampão de fosfato e sujeita a diálise.

A enzima preferida é frutosil-transferase obtida a partir de B.substilis NCIB 11871, embora ae estirpes NCIB H872 e H873 sejam também de interesse. A enzima obtida a partir destas estirpes possui também uma especificidade mais ampla e pode ser, assim, mais facilmente utilizada com u ma gama de derivados substituídos na posiçSo 6.

Ds acordo com uma outra caracteristica do presente invento, proporciona-se uma frutosil-transferase po,s eulndo uma K& em relação à sacarose de, pelo menos, 0,1 M na ausência de uma aldose aceitante; não formando quantidades si gnificativas de material preoipitável em álcool a partir de um dador de frutose na ausência de uma aldose aceitante; e não sendo afectado pela presença de agentes tensio-activos, tendo uma actividade óptima a cerca de 30°C e sendo activo du rante, pelo menos, 20 minutos até 45°C.

As duas constantes (K) citadas sm relação a estas enzimas são K , a constante Michaelis-Menton, que é a concentração do substrato em que ocorre metade do raoio máximo de reacção enzimática (para produzir levan, etc·); e

a constante inibidora, que é a concentração de inibidor que produz metade da inibição máxima observável da actividade en- 5 55.560

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zimática (para produzir levanj.

A K_ro em relação à enzima da estirpe NCIB H87I é de cerca de 0,2 M quanto â sacarose na ausência de um

aceitante, enquanto que a K referida quanto a sacarose de le m —

van Deodender obtida a partir de "B, subtilia BS5". (um clone a partir de B, subtilis variante nigra) foi de apenas 0,02 M.

A subtilis NCIB 11871, e também as estirpes NCIB H872 e H873, são estirpes atípicas de B, subtllis. Quer dizer, que satisfazem quase todos os requisitos da identificação das espécies, quer em testes clássicos Berkley e Goodfellow, "The Aerobic Endospore-forming Bactéria: Classi, fication and Identification" (1981) Academic Press, Londonj Cordon, Haynes e Pang, "The Genus Bacillus". Agriculture Handbook Ní 427 (1973) U.S. Dept, of Agriculture (Ministério N, Americano de Agricultura), Washington D.C.) quer nos siste, mas API 5θ ChB β API 20E (sistema API S.A., La Balme les Gro,l tes - 3839O Montalieu Vercieu, França e ver Log9.11 e outros J, Appl. Bact. 1978, pp. 28^.29). Nestes testes, a principal dif> rença significativa da maioria das estirpes de B, subtilis é que a estirpe NCIB 11871 é uma estirpe negativa com lactose apresentando uma produção de ácido variável a partir de xilo. se. À estirpe NCIB 11872 é negativa com lactose e proporciona também resultados negativos cora D-manose, melibiose e trehalo se e na reacção ONPG. A estirpe NCIB 11873 « positiva com lactose proporcionando resultados negativos com D-manose e inulina.

Em geral, considera-se que as frutosil-transferases derivadas de muitas estirpes de B. subtilis e de Ervinia sp são levansacaroses: quer isto dizer que, na pre sença de sacarose, provocam a produção de levan, um material de polifrutose precipitável em álcool. Quando utilizadas na produção de disacáridoe de frutose, deve suprimir-se a reacção concorrente para a produção de levan, ae se pretende obter qualquer produto útil, daí a limitação destas enzimas na Patente Britânica 204675A para as misturas de reacção contendo elevadas proporções de molécula aceitante. As enzimas de

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.....subtilis NCIB 11871, II872 e 11873 aqui utilizadas são,con

tudo, muito menos susceptíveis de produzir levan, A K para a vn

sacarose em relaçSo à produção de "levan" é de cerca de 0,2 H, Isto é comparável a uma K_m referida de cerca de 0,02M em rela ção à enzima da estirpe B35 Dedonder (loc. cit). Mesmo quando se utilizam concentrações equivalentes das moléculas a ceitantes a dadoras e quando se utilizam condições que se verificou promoverem a síntese de levan com um elevado peso molecular por meio da enzima B, sub ti lis de Tartaka (isto ó, adi, ção de um primário de levan, utilização de uma solução iómca de baixa potência e reacção a baixas temperaturas (J. Biochem 90, 521, 1981)), a produção de levan com um elevado peso mole^ cular é muito baixa. Apenas depois de se atingir o rendimento máximo de disacárido, se forma um polímero de peso molecular intermédio. Além disso, ao contrário de outras levan-sacaroses verdadeiras, a enzima obtida a partir de B, subtilis NCIB II87I parece não catalisar uma reacção de desproporção, isto é, não transforma oligo-sacáridos de baixo peso molecular em levan de elevado peso molecular. Por exemplo, pode detectar-se triasacárido, que não deverá estar presente se a enzima £ fectuar a reacção de desproporção. Pode fraccionar-se levan padrão obtido a partir de Aerobacter levanicum (Sigma) em doie pontos máximos correspondendo a material de peso molecular elevado e intermédio. A enzima Dedonder (loc. cit.) possui uma constante de equilíbrio (levan e glucose/sacarose) de cerca de 3,6 x 10" a 37 C| havendo formação de levan de DP4o. Em perfeito contraste, as estirpes NCIB 11871, 11872 e 11873 pro, duzem uma enzima que não produz quaLquer quantidade significa

tiva de polisacárido precipitável em álcool obtido a partir de apenas sacarose, e nem mesmo as células em desenvolvimento da estirpe 11871 produzem qualquer levan. Parece assim, que a frutosil-transferase produzida não é, com efeito, de modo algum, uma "sacarose de levan". Nesta descrição, será referida «omo uma frutosil-transferase,

A fonte de frutose para a reacção pode ser qualquer oligo- ou di-sacárido contendo um anel de /3-frutos,! lo, de preferência não substituído, ligado ao carbono anuméri

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co de um aldose por meio ds uma ligação (1—> 2) tal como na sacarose ( ^-D-frutofuranosilo -D-glucopiranosido) ral* Ino se

0-c<-D-galactopiranoeil-(l-> 6)-0-o<-D-glucopiranoeil-(l—>2)

^-D-frutofuranosido) ou estaquiose.

0 material de partida da aldose substituída na posição 6 da fórmula II pode transportar, como grupo hi droxi protegido, qualquer substituinte da posição 6 que seja re eistente à subsequente reacção de cloração e que possa ser facilmente removida para libertar um grupo 6-hidroxi. Preferem-se ésteres 6-carboxílicos, por exemplo, 6-acetato ou benzoato. Pode preparar-se facilmente 6-acetato de glucose por meio de uma variedade de processos (por exemplo, Duff, J.^hem. Soc. pp 4730-4, 1957í Reev e outros, J. Amer. Chem. Soc. 79, 6θ4ΐ-3$ Frohvein e outros, Nature, p. 153, 1960$ Duff e outros, Nature, p. 103, 1957$ ibid. Biochem J. 515-520, 70, 1958).

0 substituinte na posição 6 do material de partida da aldose de fórmula II pode ser também um éter, tal como éter benzilico, que pode ser facilmente removido por mele de hidrogenação, ou um éter alifático que pode continuar para proporcionar um 6-éter clorado, tal como ee descreve na Paten te Britânica 2127806A. 0 material de partida pode também con

ter, por exemplo, um substituinte de 4-cloro, para proporcionar um dissacárido Já parcialmente clorado, por exemplo, 6-acn tato de 4-cloro-4-deoxi-galactoee.

A reacção entre o dador de frutose e o aceitante de frutose deverá ser efectuada num melo aquoso, ds preferência tamponado a um pH óptimo da enzima, isto é, a um pH de 5,4 - 6,0 à temperatura óptima de cerca de 30°θ· Os dois reagentes são geralmente solúveis em água e a enzima pode eer dispersa na solução mútua ou, de preferência, imobilizada num suporte insolúvel. A imobilização pode ser efectuada, por exemplo, mediante a utilização de uma resina permutadora de iões, tal como celulose DEAE, para a qual a enzima é forte, mente absorvida. Podem utilizar-ββ muitos outros suportes de imobilização, como por exemplo carvão animal, tal como o dea55.560

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crito na Patente N. Americana 4421850.

0 racio do dador de frutose em relação ao aceitante de frutose, na mistura de reacção, é importante; se for demasiado baixo, reduz-se o rendimento; se fôr elevado, qualquer reacção possível de levan não poderá ser suprimida, em particular se se utilizar um substrato de elevado teor de sólidos· Verifica-se, em geral, que um racio molar (dador-aceitante) de cerca de 2:1 é óptimo. Pode efectuar-se a reacção a uma concentração razoavelmente elevada, visto não haver qualquer problema de solubilidade ou de viscosidade. Tipicamente, uma concentração de reagentes de cerca de 40 % em peso é bem sucedida, embora se possam utilizar concentrações mais elevadas, dependendo da solubilidade dos reagentes, por exemplo, ató oerca de 75 % cm relação ao 6-acetato de glucose. A concentração de enzima deve, naturalmente, depender da activi dade, mas níveis de cerca de 5 ml/litro foram bem sucedidos ao utilizar-se uma solução aquosa contendo a enzima derivada de 33 ml de tuna cultura de B» subtilis NCIB 11871 por ml de solução.

Pode efectuar-se a subsequente cloração de um composto de fórmula 111 mediante a utilização de qualquer reagente susceptível de deslocar hidroxi por meio de cloro, selectivamente nas posições 4,1' e 6*. Um reagente preferido é o reagente Vilsmeier, obtido mediante a reacção de uma dialquilamida com um reagente de cloração, por exemplo, dimetilformamida com pentacloreto de fósforo, fosgénlo ou cloreto de tionilo. Uma descrição pormenorizada da cloração dos 6-ésteres de sacarose é proporcionada pela Patente Britânica 2O79749A e Patente N.Americana 4 380 476. A desprotecção de um 6-éster é igualmente descrita na mesma publicação, mediante, por exemplo, metóxido de sódio em metanol. Pode rcmovcr—se um éter 6-benzílico por hidrogenação.

Proporciona-se ainda um método para a preparação de um frutosido mediante a reacção de um álcool aceitante de frutose (especialmente uma aldose) com um di- ou oli go-sacárido de frutosilo na presença de uma frutosil-transfe9

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rase possuindo uma em relação a sacarose de, pelo menos,

0,1 M, na ausência de uma aldose aceitante; não forma quanti dades significativas de material precipitável em álcool obtido a partir de um dador de frutose na ausência de uma aldose aceitante;e não á afectada pela presença de agentes tensio-activos, tendo uma actividade óptima a cerca de 30°C e sendo a ctivo durante, pelo menos, 20 minutos até 45°C. 0 aceitante

de frutose pode ser, em geral, qualquer açúcar de piranose ou de furanose ou um açúcar substituído, que se deseja incorporar num di-sacárido de frutosilo· Exemplos incluem derivados de glucose substituídos na posição 6, tais como 6-ésteres e jé teres de 6-glucose e 6-deoxi-D-glucose, (na preparação ds TGS e seus análogos adoçantes), ou qualquer um dos materiais que o Pedido de Patente Britânico 2O46757A sugere que se utilizem |com levansucarose (mas ver adiante)· 0 di- ou oligo-sacárido de frutosilo pode compreender sacarose, rafinose ou estaquiose.

A especificidade do substrato da enzima βλ sim obtida a partir de B, aubtilla 11871 é agora descrita com mais pormenor» Estudos anteriores demonstraram que a ac ti vida, de da frutoeil-transfer&se de B. subtilis (Marburg) não é prje judicada pelas alterações a C-6 da aldose, a menos que um gru po polar, tal como fosfato, ou um grupo de ácido carboxílico, seja substituído nessa posição. Referiu-se, em particular,que as seguintes alterações na posição C-6 do aceitante não inibem a levansacarose: redução L-galactose em L-fucose); substituição de OH por 0-glucosllo (D-glucose em isomaltose)} e hidroxialquilo para H em C (D-galactose em D-glicero-D-galactoheptose)(Hestrin e outros, 1958). Somente as moléculas pojs suindo um grupo de frutose não substituído ligado a um grupo alcoxilo mediante a mesma ligação glicosídica, tal como na sa carose, podem aetuar como dadores, o 6-acetato de sacarose po, dendo aetuar, assim, como dador ds frutose em vez de sacarose ou rafinose.

Contudo, no caso da nova enzima de acordo com o presente invento, uma larga gama de açúcares actuam,até

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diversos graus, como aceitantes en relação a frutose obtida a partir de sacarose ou de rafinose. A maioria doe aeeitantes eSo hexoses ou pentoses, tais como, ribose, eorboee, lixoee a rabinoee e xilose. Á única pontose conhecida que não reage é a xilulose, A maioria dos aceitantes reactivos podem adaptar uma configurarão de anel de piranose, embora o xilitol e o ácido gluoónico pareçam também reagir. Quando se encontra presente uma estrutura em anel, esta tem de conter oxigénio ou enxofre, não reagindo, assim, o inosital mas reagindo a 5-tioglucose.

Nenhuma das variações na estrutura nos car bonoe 3 · 4, por exemplo, galactose, 3-0-metilglucoee, 4-clorogalaotose e D-arabinose em vez de glucose, afecta a reactividade qualitativa. Os substituintes no carbono 1, tais como em -D-gluoopiranosilo de metilo, 1-tioglucoee e eorbose,per mltem a reacção. No carbono 2, tolera-se uma variedade de alterações, por exemplo, tal como na manosé,^ mas a 2-deoxigluco se e a glucosamina não aão reactivaa, No\cmfbono 6, tolera-se a maioria dae variações estruturais, taisvfcemo, 6-fosfato,cio reto acetato, 6-deoxiglucoae, é-O-metilglw&se e 6-0-metilgalactoae e o 6-H, tal oomo na ramnose, mas o grupo CH^OH. CHOH de glucoheptose impede a reactividade.

Muitoe dos dissacárldos, incluindo melibio se, lactose, isomaltose e celobiose, são aceitantes reactivos, embora haja certos dlsacáridos, tais como lactulose e isomaltulose, que não são reactivos. Quando se utilizam aceitantes de oligosacárido, a actividade do aceitante diminui com o aumento da dimensão, tal como nas séries hamólogas de maltose, maltotriose, maltotetraose, etc.

Por último, em muitos casos, as alterações estruturais (da glucose), em mais do que um átomo de carbono, não impedem a reacção, por exemplo, 6-acetato de galactose} e quando ee utilizam misturas de moléculas aceitantes reactivas, por exemplo, em soro de leite coalhado hidrolizado, formam-se misturas de dissacárldos frutosllados.

Verificou-se que os açúcares a seguir men- 11

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cionadoa actuam como aceitantes· D-arabinoae, fucose, 6—deoxiglucose, 6-0-metilgalactose, lactose, 6-acetato de galactose, manose, 5-tio-D-glucoae, maltose, 1-tio-glucose, maltotri ose, ct -D-glucose de 3-0-metilo, maltopentaose, D(-)arabinoae matohexose, 6-deoxiglucose de 6-cloro, melibiose, galactose, xiloee, iaomaltose, L-arabinose, permeato de soro de leite coalhado (lactose), 4-clorogalactose, ribose, lixose, 6-acetato de glucose, ácido gluoónico, 6-fosfato de gluoose, L-ram noae, 6-0-metilglucose, metil-D-glucósido, xilitol, glicerol e etanol·

Um aceitante particularmente interessante

4 xiloee conduzindo à produção de -D-frutofuranosilo (2—>1’ -D-xilpiranóaido, conhecida como xilsacaroee· Um outro acei

tante interessante 4 a gelatose, levando à produção de *£> -D-frutofuranosil (2->l)-D-galactopiranosido (galactosacarose)» Os produtos deste tipo eão fracos em cariogenicidade e/ot doçura, tornando-os interessantes, tal como as substituiçSss ds sacarose em áreas em que o excesao de doçura é um problema. À galactosacarose 4 interessante, particularmente porque pode ser produzida a partir de, digamos, melaços e de permeato de soro de lsite coalhado hidrolizado, sendo ambos os materiais fáceis de obter. Possui apenas um vestígio de doçura (ca. 10-15 % de sacarose).

Em relação a especifioidade do dador, os a

[çúcares com base em sacarose tendo uma ligarão (1->2) como requisito absoluto, são reactivos, diminuindo a sua activi dade com a dimensão da molécula. Os novos disacárido» formados pala acção da enzima actuam também como dadores, por exem pio xilsacarose.

I Pode preparar—se o produto da reacção oatç

lixada de enzima a partir de sub-produtos e materiais de partida, por meioa fiaioquímlcos convencionais, tais como cromatografia, em especial cromatografia líquida a alta pressão

j CLAP e cromatografia em resina permutadora de iães. Em particular, os produtos não possuindo qualquer grupo 6-hidroxi no anel de aldose, por exemplo, 6-ésteres de sacarose e éteres,

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produtos derivados de xilose e sacarose de 6-deoxi, possuem u ma polaridade surpreendentemente baixa que torna a cromatogra fia em resina permutadora de iSes um método de eeparaç&o fácil e eficaz. Resinas de poli-estireno, reticuladas com benz£ no divinilo, por exemplo, as resinas Amberlite XAD, s&o parti oularmente apropriados. Esta separação é muito mais fáoil que a separaçSo de derivados de sacarose substituídos de diversas maneiras, necessária quando o derivado de sacarose na posiç&o 6 é preparado por um processo químico,

0 aub-produto da reacç&o de transferência de frutose mediante a utilizaç&o de frutosido de glucosilo, ta] como sacarose, é a própria glucose. A glucose é, claro está, um aceitante potente, e concorre com o aceitante desejado, le> vando a uma nova formaç&o do material de partida. A remoç&o da glucose mediante convers&o em frutose, pode assim ser dese^ jável. Isto pode ser conseguido mediante a adiç&o de isotneraee de glucose.

Os exemplos que se seguem ilustrar&o melhor o presente invento:Exemplo 1 PreparacSo de TGS

a) Preparaç&o de enzima

Obteve-se -frutosil-transferaee a partir da estirpe Bacillus subtllis NCIB 11871. ^A enzima foi induzi da, por meio de sacarose durante o crescimento dae células,em balSes de agitaç&o (capacidade de 250 ml, 4 balSes) contendo um meio mínimo de sacarose (100 ml por balSo), A cultura foi incubada até à última fase exponencial, agitada a 30°C, e os conteúdos dos quatro balSes de agitaç&o foram ent&o combinados e o meio de crescimento separado das células por centrifu gaçfio (5,000 g durante 15 minutos). 20-30 % da enzima total w manescente permaneceu associada às células. O produto sobrena dante que resultou foi levado até uma saturaç&o de sessenta e cinco por cento mediante a adiç&o de sulfato de amónio sólido e deixado repousar durante 45 minutos a 0°C. Este processo provocou a precipitaç&o da maioria da invertase n&o desejada

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• de outros coiítaminantes proteicos mas deixou a maior parte da enzima em solução. A amostra foi então re-oentrifugada

£0,000 g durante 30 minutos) e o precipitado contendo aetivi dade de invertase foi posto de parte. Adloionou-se mais sulf a to ds amónio à solução para se levar a solução a uma saturação de 95 9» · deixou-se repousar durante mais quarenta e cinco minutos a 0°C. Formou-se um segundo precipitado constituído principalmente por frutosil-transferase e recolheu-se por centrifugação (40,000 g durante 45 minutos) e tornou a dissoJL ver-se num tampão de fosfato 50 mM, de 12 ml, pH de 6,0. 0 e feito líquido das duas precipitaçães e da re-solubilização do segundo precipitado foi uma purificação substancial e uma con oentração da enzima, de tal modo que só uma banda de proteína podia ser detectada mediante electroforese num gel de poliaerilamida. Einalmente, retirou-se o sulfato de amónio residual da preparação de enzima mediante dialise (0°C durante 4 ho ras) em relação ao tampão de fosfato 5θ «M.

A enzima sujeita a dialise foi testada antes e depois da adição de £-hidroximercuribenzoato que inibe a invertase, mas não afecta a actividade da frutosil-transferase. Verificou-se que, por estes meios, as preparações de frutosil-transferaee eram geralmente isentas de invertase. 0 teor da proteína das preparações foi calculado em 0,45 mg/ml, mediante medição da sua absorção a 280 nm. Um pigmento preto está frequentemente presente, mesmo nas preparações da enzima purificada, mas não afecta a actividade das preparações.

b) 6-Acetato de sacarose

Dissolveram-se 6-acetato de glucose (80 g, seco em vácuo até atingir um peso constante) e sacarose granu lada (l60 g) a temperatura ambiente em 100 ml de tampão Mclll vaine a um pH de 5,4 e dilui-se até atingirem 600 ml (isto é, 40 % p/v) com água desienizada. Esta solução foi então extensivamente filtrada e adicionaram-se 28 ml da solução de enzima. A mistura de reacção foi então incubada a 30 C e ensaiada a intervalos de tempo até a análise CLAP deixar de revelar formação de mais 6-acetato de sacarose, sendo a concentração

- 14 55.5^0

LHG/579^^^929

máxima d· 6-acetato de sacarose atingida de cerca de 120 gl”¹Retirou-se a enzima por filtração da mistura de reacção através de uma coluna de celulose DEAE que adsorve a enzima. Como variante, podia ser desnaturada por aquecimento a 65°C durante 1 hora, Á remoção da enzima é importante visco que pode também catalisar a hidrólise lenta do 6-acetato de sacarose para libertar frutose.

0 produto foi então isolado mediante CLAP preparatório para proporcionar 6-acetato de sacarose com uma pureza de, pelo menos, 85 com um rendimento global de cerca de 50 %· 0 cálculo inicial da reacção de enzima apontada para uma produção de 244,5 mg de 6-acetato de sacarose por mg de enzima por hora. 0 rendimento da fase enzimática foi de 58 % com base no consumo de 6-acetato de glucose ou de 48 com ba se na formação de 6-acetato de sacarose.

c) Cloração de 6-acetato de sacarose

(i) Preparação do reagente Vilsmeier

Adicionou-se pentacloreto de fósforo (140

g) a dimetilformamida seca (250 ml) numa proveta, agitando-se vigorosamente, mantendo-se a temperatura a 7O-bO°C. Continuou -se a agitar durante 1 hora e arrefeceu-se então a reacção e filtrou-se. Lavou-se o produto cristalino com dmf (2 x 20 ml) e éter dietílico, (40 ml) e secou-se num secador para proporcionar o reagente Vilsmeier na forma de cristais brancos (93 «)·

(li) Preparação da solução de 6-acetato de sacarose>

Dissolveu—se xarope de 6—acetato de sacaro. se (4l g, teor real de 6-acetato de sacarose 28 g) em dmf e diluiu-se até atingir 86 ml), Secou-se a solução sobre um cri vo molácular e filtrou-se,

(iii) Cloração

Adicionou-se reagente Vilsmeier (31 g) a dmf (80 ml) e arrefeceu-se a mistura até 0°C. Adicionou-se lentamente uma solução de 6-acetato de sacarose (21 ml, 7 g

- 15

de 6-acetato de sacarose), mantendo-se a temperatura abaixo dos 20°C. Agitou-se a reacção a 0°C durante 15 minutos e transferiu-se depois para um banho de óleo a 60°C durante 30 minutos. Aqueceu-se o banho até 120°C durante 30 minutos e manteve-se esta temperatura durante 2 horas. Arrefeceu-se então a reacção até 20°C e neutralizou-se mediante a adição de metanol — amónia 880 (2:1, 80 ml), mantendo—se a temperatura abaixo dos 50°C. Concentrou-se a reacção até à formação de um xarope e acetilou-se mediante a adição de piridina (100 ndj e anidrido acético (100 ml). Depois de agitada a 50°C durante 2 horas, a mistura em reacção foi arrefecida até 20°C e adiei onou-se metanol (80 ml) enquanto se mantinha a temperatura abaixo dos 60°C, Evaporou-se então a produção da reacção até haver formação de um xarope e extraiu-se cora tolueno quente (60°) (4 x 100 ml). Concentraram-se os extractos de tolueno a té haver formação de um xarope e dissolveram-se em acetato de etilo (100 ml). Lavou-se a solução de acetato de etilo com água (3 x 100 ml) e extraiu-se outra vez a água com acetato de etilo (2 x 50 ml). Secaram-se os extractos combinados de acetato de etilo sobre sulfato de magnésio, descoraram-se com carvão vegetal activado e ooncentraram-se até haver formação de um xarope que cristalizou a partir de uma essência metilada industrial para proporcionarem penta-acetato de 4,1’,6’-tricloro-4,1’,6’-trideoxigalactosacarose (4,4 g, 39 .

(iv) Desesterificação

Dissolveu-se penta-acetato em metanol seco e tratou-se com uma quantidade catalítica de metóxido de sódio durante 5 horas â temperatura ambiente. A solução foi então desionizada e evaporada para produzir 4,1’,6*-tricloro-4,1·,6·-trideoxigalactosacarose (90 %) ·

Exemplo 2 Preparação de

4.1' ,6^t-tt^,iclorc-4.6tl* _.6*-tetradeoxigal a c t o sacarose (6-deoxi-TGS) (um análogo de TGS possuindo um grau de doçura

semelhante)

- 16 (l) 6-Deoxisacarose

Isolamento, purificação e cristalização.

Submeteram-se 6-deoxi-D-glucose (D-quinovose, 20 g) e sacarose a uma reacção semelhante à do Exemplo 1, proporcionando uma mistura de 6-deoxisacarose, D-quinovose,sa carose e glucose, num volume global de 140 ml. Separou-se 6-deoxisacarose da mistura por melo de clap. preparatório, mediante a utilização de uma coluna de inversão de fase com Vaters Prepak 5OO-CI8 e de água como eluente. Observou-se uma diferença surpreendentemente grande no tempo de retenção entre esta 6-deoxisacarose e as dos outros componentes presentes na mistura, Eluiram-se D-quinovose, sacarose e D-glucose,

4-9 minutos após a injecção e eluiu-se 6-deoxisacarose apenas após 29 minutos (altura do ponto máximo). A grande separação permite uma maior separação de material por injecção do que a que seria possível de outro modo. Evaporou-se o eluente contendo 6-deoxlsacaroee atá à secura sob pressão reduzida (temperatura do banho de 50°C) para produzir um xarope límpido (l6,7 g, 42 %) que cristalizou quando em repouso a temperatura ambiente. 0 produto recristalizou a partir de etanol e tinha um p.f. de l80-l8l°C, Ac7n ⁺ 57,6° (jç 2,5, água); espe ctro de massa, m/e 293 (M - CH^ - HgO); ^JC-espectro de RNM (solução de DgO, relativa ao DSS interno a 0 ppm):

Átomo de carbono

Deslocação química, ppm

2»

1

5*

3’

5

4»

3

2

4

6'

1»

6

106,32

94,70

84,01

79,04

77,74

76,73

74,93

73,95

71,09

65,02

63,77

19,36

17

Cloração selectiva de 6-deoxisacarose

\ 55.5ÓO íLHG/579?44929

(2)

Dissolveu-se 6-deoxisacarose (2,8 g) em DMF (10 ml) e adicionou-se a soluç&o a uma suspensão de reagente Vilsmeier (15 g) em DMF (30 ml), mantendo-se a temperatura abaixo dos 10°C. Agitou-se a mistura à temperatura ambiente durante 10 minutos e depois aqueceu-se até 120°C durante 2 horas com agitação. Arrefeceu-se a reacção até a temperatura ambiente e adicionou-se uma solução de metanol-hidróxido de amónio (1*1, 20 ml). Concentrou-se a mistura a 70°C e evaporou-se tolueno (2 x 20 ml) a partir do resíduo que foi depois acetilado com anidrido acético (30 «1) em piridina (30 ml), a 60°C durante 3 horas. Adicionou-se metanol (50 nl) e e. vaporou-se, então, a mistura até à formação de um resíduo que se extraiu com tolueno a 60°C,, (4 x 50 ml) mediante agitação e decantação. Evaporaram-se os extractos combinados de tolue no até a secura e cromatografou-se o resíduo em sílica gel (é ter de petróleo - éter, 2*1, depois 1*1 como eluente) para produzir o tetraacetato de 4,1’,6’-tricloro-4,6,l*,6*-tetrade oxigalactosacarose intermediário, na forma de um xarope amare lo pálido, após evaporação dos solventes (3»1 g, 64 %) j e espectro de masaa, m/e 283,285,287 (9x6*1, resíduo de dicloro-di-O-acetilfrutose) e os pontos máximos correspondendo a sucessivas perdas de 60 (CH^C0₂H), 42 (CH₂«C»0) e 36 (HCl)>249, 251 (3*1 - resíduo de galactose de monocloro-dideoxi-di-O-ace tilo com perda de CH₂) e pontoe máximos correspondendo a sucessivas perdas de 60 e 42.

Dissolveu-se o tetraacetato em metanol (30 ml) e desacetilòu-se com metóxido de sódio (1M, a um pH de 9), à temperatura ambiente. Neutralizou-se a solução com uma resi na permutadora de catiões Amberlyst 15 (H⁺), filtrou-se e eva porou—se até à secura. Obteve—se o produto na forma de um solido branco /*\_7_D + 87,1° (c 1,0» acetona)} ^J‘-’C-espectro de RNM (solução de DgO, relativa ao DSS interno a 0 ppm)*

- 18 JJ·

LKG/579?44929

»* ‘--', ^: ,? V

/ _t /' _x,: . ;

¹ ·· I

ί· ί

►

b·

Ãtomo de carbono Deslocação química, ppm

2«	106,02
1	95,41
5’	83,75
3*	78,89
4»	78,04
5	70,95
4	70,03
2	69,78
3	69,28
1»	47,46
6'	45,99
6	19,61

Verificou-se que 4,1*,6’-tricloro-4,6,l',6’ -tetradeoxigalactosacarose era 400 vezes mais dose que a saca roee (solução a 8 %).

Exemplo 3

Repetiu-se o processo do Exemplo 1, mas mediante utilização de 6-benzoato de glucose em vez de 6-acetato na fase b). Obteve-se um resultado semelhante e efectuou-se a fase c) como anteriormente para produzir TGS com um rendimento análogo.

Exemplo 4

Pode modificar-se o processo do Exemplo 1, mediante a utilização de uma enzim^. derivada da estirpe B, subtilis Marburg 168, estirpe NC^B 11872 ou estirpe NCIB 11873 m fase b), A reacção efectuou-se de modo semelhante, mas a uma cedência de reacção inferior.

Exemplo 5

Imobilização e purificação de frutosil-traneferase obtida a

partir de B, eubtllie NCIB 11871 mediante a utilização de

Celulose Permutadora de Iges DEAE e Preparação de Xilsacarose

Lavou-se exaustivamente celulose permutado^

- 19

LdG/57$P44>’29

ra d· iões DEAE (DE 52) num TampSo Mcllvaine 50 wM, pH da 5,4|

• depois com substrato tamponado (sacarose-xilose 2:1, 40 $ p/^v)» açúcares totais. Depois de filtrada até quase à eecura] num filtro Buchner, a celulose DEAE (10 g) foi misturada com 8 ml de uma preparaç&o de frutosil-transferaee a partir de JBaj cillus subtilis. tal como no Exemplo , durante 15 minutos a 30°C com agitaç&o. Ácomulou-se a mistura resultante de celulol se DEAE e enzima numa coluna revestida de camisa de 10 ml (19| χ 1 cm) e manteve-se a 30°C com um termocireulador Churchill. Deixou-se escoar a celulose DEAE sob gravidade e recolheram-se os produtos escoados. Extraiu-se o extracto da coluna por] meio de uma bomba a uma velocidade de fluxo de cerca de 1,0 ml h mediante a utilizaç&o de uma bomba Vatson-Harlow e re-l colheu-se o eluente com intervalos de tempo e ensaiou-se quan| to à actividade frutosil-transferaee. Mediu-se também a adsorçSo a 280 na (0D₂g_Q). ^ara se ensaiar a amostra, incubou-se uma porç&o de 0,1 ml da amostra líquida ou 0,1 g de enzi-l ma imobilizada (em DE 52) com 2 ml de substrato, a 30°C duranj te 4 horas. Mediante a utilizaç&o de um substrato de xilose/ /sacarose, para a preparaç&o de "xileacarose", compararam-se a ooncentraç&o e a actividade da proteina da solução esgota-I da que restou depois de se ter determinado o processo de imo-| bilizaçSo, com a concentração e a actividade da proteína da preparaçSo original da enzima. Verificou-se que 68,5 $ da enj

zlma origináriamente presente no extracto de célula tinham eil do imobilizados juntamente com 83 $ da proteina origináriamen te presente, A enzima imobilizada tinha uma actividade inici-j al de 80,2 3® da actividade de uma quantidade equivalente de enzima livre; sendo as actividades das duas preparações de, respectivamente, 0,38 g xilsacarose/g de enzima imobilizada/h| e 0,865 S xilsacarose/ml de extracto de enzima/h.

Operou—se uma enzima imobilizada 10 g p/p continuamente, acumulou-se numa coluna a 3°°C, durante oerca de duas semanas sem ocorrer qualquer alteração no pH do elua-] to ou vestígios de contaminação microbiana. Durante os três primeiros dias de operação, desorveu-se pouca proteína e ensil

20

55,550

IAÍG/ 579^44929

na, o equivalente a 24 % da proteina inicialmente adsorvida e a 2,3 % da actividade enzimática inicialmente adeorvida. A actividade da enzima imobilizada decaiu com uma meia-duração £ peracional de 95 horas e apresentou a relação inversa habitual entre o grau de conversão dos substratos em produtos e a velocidade de fluxo ao longo da coluna. Ao utilizar-se uma ve locidade de fluxo mais lenta, 0,086 volumes de coluna vazia (vcv)h”^, alcançou-se uma conversão de 80 % em xilsacarose, contendo ο βluato da coluna 21 g l"¹ de xilsacarose. Este rendimento foi superior a qualquer outro obtido em reacções parcelares, provavelmente porque a cinética de "fluxo-tampão” (plug-flow) da coluna favorece a formação de xilsacarose, uma

vez que os produtos são continuamente retirados da coluna não

1

acumulando^ deste modo, e não provocando a inibição do produto. No tot^l, durante estas operações, formaram-se 20-25 S de xilsacarosé num estado tal em que a xilsacarose pura pode ser facilmente obtida.

Ao contrário da enzima solúvel utilizada inicialmente, a enzima imobilizada conduz à formação de produtos secundários durante a reacção. Formou-se um pouco de fru tose, menos do que a produzida pelo extracto de enzima original utilizado para a imobilização, provavelmente porque a aotividade invertase, que contamina o extracto, só era parcial^ mente adeorvida pela DE52, Observou-se a formação de diversos compostos inferiores, que foram eluídos, muito tarde, a partir da coluna CLAP com tempos de retenção de 13 e 20 minutos, no eluato formado a partir da enzima imobilizada, embora não tivesse sido observado durante a análise das reacções da enzima solúvel. Estes são provavelmente oligo-sacáridos formados a partir dos reagentes habituais por meio da enzima.Pen sa-se que a paragem das moléculas reagentes provocada pela en zima Imobilizada aumenta o seu tempo de contacto com a enzima para que ocorra a possibilidade de polimerização.

Uma vez que o teor da xilose do substrato era de 133 gl*"\ a concentração máxima possível de xilsacarose era de 266 gl”^. A concentração máxima observada, a 0,086

21

ecvh foi de 80 % desta, isto e, 210 gl mas calculada com base na xilose consumida durante a reacção, proporcionou 69,5 de reacção. Os rendimentos são superiores aos das reac çSes parcelares porque a natureza do "fluxo de passagem" do processo faz com que o produto sejn constantemente removido θ porque o produto é relativamente não-polar em comparação com os substratos e, assim, é dividido selectivamente longe do su porte de imobilização carregado positivai iente, tendendo ambos a favorecer a produção de xilsacarose.

Utilizou-se o mesmo método para produzir 6-acetato de sacarose a partir de 6-acetato de glucose, sacaro se de 6-0-metilo a partir de glucose de 6-0-inetilo e 6-0-benzil-sacarose a partir de 6-0-benziIglucose.

Misturou-se a enzima preparada de acordo com o Exemplo 1 (0,1 ml), com 2 ml de uma solução de sacarose e xilose (líl) a 40 > p/v tamponou-se a um pH de 5,5 a 30°C. Calculou-se a xilsacarose por meio de CLAF, Calculou-se a for

mação de levan opticamente. Os resultado3 de uma comparação de várias enzimas, foram os seguintes:
g Ponte d«	de xilsacarose/ml enzima por hora	Formação de levan
NCIB 11871	8,6	0
NCIB 11872	2,9	Detectável
NCIB 11873	1,4	+
NCIB 3610 (Marburg)	0,08	++
PERM 3119/1979
(B. Subt. Var. Saccharo-
lyticus)	0,19	+ +
NCIB 9966 (Erwinia
Herbicoia )	0,87	++
Assim, as	enzimas de acordo	com 0 presente

invento produzem, pelo menos, 10 vezes mais xilsacarose do que a enzima da estirpe Marburgj e, pelo menos, 100 vezes maia no caso da enzima NCIB 11871. A produção concorrente de levan é muito inferior.

ÍÂ

jLKG/579244929

Exemplo 6 Preparação de galactosacarose

Incubaram-se 15 ml de um substrato a 40 $ (p/v) contendo pesos Iguais de sacarose e galactose dissolvidos num tampão de fosfato-citrato (pH 5,9), a 30°C com um pequeno volume de frutosil-tranaferase de Baclllus subtilis NC1B II871 parcialmente purificada pela precipitação da enzima com uma solução de sulfato de amónio saturada a 95 re-dissolução do precipitado e precipitação das impurezas com uma solução saturada de sulfato de amónio a 65 %·

Após 24 horas de incubação, separaram-se os produtos por cromatografia CLAP numa coluna de fase invertida (carbono grafítico poroso, diâmetro de 5 microns: eluente de acetonitrilo aquoso a 5 %). Não se poderia obter mais qualquer aumento no rendimento de galactosacarose noutra incubação ou mediante adição de uma enzima nova. Os rendimentos máximos de galactosacarose foram de cerca de 0,33 g/g de galactose e de cerca de 0,45 g/g de sacarose consumida»

Exemplo 7

4,1* »6^t-Tribromo-4,l^t«6♦-trldeoxigalactosacarose

(a) Preparação do reagente Vilsmeier

Adicionou-se brometo de tionilo (280 ml) a dimetilformamida seca e arrefecida (260 ml) agitando-se vigoroeamente. Agitou-se a mistura durante 30 minutos a 7O-8O°C e depois durante mais uma hora e deixou-se arrefecer até à temperatura ambiente» Filtrou-se a mistura e lavou-se o resíduo com dimetilformamida (2 x 50 ml) e éter dietilico (lOO ml) e secou-se num secador para render 3²θ g de reagente»

(b) Bromação de aoetato de glucose

Preparou-se uma solução de 6-acetato de sacarose (5 g) em dmf (20 ml) de acordo com o descrito no Exemplo 1 e tratou-se com uma suspensão arrefecida do reagente Vilsmeier (25 g) em dmf (5θ ®l) com agitação, mantendo-se a temperatura durante 30 minutos abaixo dos 20°C» Agltou-se en tão a mietura agitada durante 3° minutos à temperatura ambien

— 23 —

. jiõw

LH&/

· depois aqueceu-se até atingir 110°C e agitou-se durante mais 1 hora e 75 minutos. Arrefeoeu-se entSo até 20°C e neutralizou-se mediante a adição de uma mistura de metanol e amó nia concentrada (0,88o) 2:1, mantendo-se a temperatura abaixo doe 40°C. Concentrou-se então a mistura até a formação de xa repe e aoetilou-se com anidrido acético (100 ml) em piridina (lOO ml) a 5θ°0 durante 2 horas. Recuperou-se o produto tal como no Exemplo 1, sendo o pentaacetato de tribromogalactosacarose (4,2 g) idêntico ao descrito na Patente Britânica 2JL01, 389Λ.

Este foi desacetilado com metéxido de sódio (l molar em metanol, a tua pH de 9) durante 5 horas â temperatura ambiente e depois desionizado com tuna resina permutadora de iões Ámberlyst 15 (H⁺). Evaporou-se o produto sobrenadante até à secura para produzir o açúcar de tribromo puro, idên tico ao desorito na Patente Britânica 2IOI989A.

Exemplo 8 Cloração de silsacarose

Dissolveu-se xilsacarose (do Exemplo 5) (3 g) ea dmf (6 ml) a 10°C e adicionou-se, com agitação, a uma suspensão fria de reagente Vilsmeier do Exemplo 1 (13 g) em dmf (25 ml) mantendo-se a temperatura abaixo dos 10°C. Aqueceu-se então a mistura agitada até à temperatura ambiente durante 30 minutos e depois até 120°C e continuou-se a agitar durante 3 horas. Arrefeceu-se então a mistura, neutralizou-se cmÍ metanol/amónia concentrada (0,880) 1:1 e concentrou-se a 7Cfc. Removeu-se a humidade mediante evaporações sucessivas de tolueno e depois acet^Llou-se o resíduo com anidrido acético (30 ml) e piridina (30 ml) a 60°C durante 3 horas. Tratou-se então a mistura com metanol (5θ ml) β evaporou-se até a secura. Extraiu-se o resíduo com tolueno quente (60°C, 4 x 50 ml) e combinaram-se os extractos decantados e evaporaram-se. Cromatografou-se o resíduo em sílica gel (éter de petróleo : éter dietílico 2:1, e depois l:l) para produzir tetraacetato de tricloro arabino sacarose na forma de um xarope (2,6 g).

- 24 35.560

LHG/575^íj44529

Espectro de massa m/e 283,285,287 (9:6:1,

resíduo de frutoso de dicloro-di-O-acetilo)j pontos máximos correspondentes a perdas sucessivas de 60 (CH C0₂H), 42 (CH₂»C»0) e 36 (HCl);

235,237 (3»1), resíduo de arabinosde monocloro-di-O-acetilo e pontos máximos correspondendo a perdas sucessivas de 60 e 42.

Dissolveu-se o tetraacetato em metanol (30 ml) e desacetilou-se com metóxido de sódio 1 molar em metanol a um pH de 9, a temperatura ambiente.

A mistura foi desionizada com resina Amberlyst 15 (H⁺), filtrada e evaporada. Isolou-se o produto a partir de uma espuma sólida /" 7 * 10i,9°C (c 1,1 acetona ; sol;,

çao de espectro .C-RNT) relativa a .DSS inferno a 0 ppm).

Átomo de carbono

Deslocação química, ppm

2'	106,0
1	95,8
5’	83,9
3'	78,8
4’	77,9
2	70,6
3	70,4
5	66,4
4	63,9
1’	47,3
6'	45,9

Verificou-se que o composto era 25 vezes mais doce que a sacarose numa soluçSo a 2

0 depósito do primeiro pedido para o inven. to acima descrito foi efectuado na Grã-Bretanha, em 21 de Ju·

25 LBO/579W929

nho d· 1983, eob o N«83l679O,

-

Claims

REIVINDICAÇÕES1* - Processo para a preparação ▼ado de sacarose ou galactosacaroee de haloleoxi

geral

de um dorida fórmula

om que A representa um átomo de hidrogénio ou o grupo CHgX, em que X representa um átomo de hidrogénio, ou um grupo hidro xi ou alcoxi e Y representa um átomo de halogónio, caracterixado pelo facto de compreender a reacção de uma aldose da fór anil a geral

(II)

em que A representa ura átomo de hidrogénio ou um grupo CH^X, em que X representa um átomo de hidrogénio ou um grupo alcoxi ou uça grupo hidroxi protegido, com um di ou oligo-sacarido de frutosilo na presença de uma frutosiltransferase para se obter um composto da fórmula geral

- 26 -

·« que A tem a definição indicada para a fórmula II, mediante separação dos referidos compostos da fórmula geral III; a halc gdiaçãDdo composto da fórmula III e, para um composto da fórmu la I em que A representa CHgX e X representa um grupo hidroxi mediante deeprotecção do grupo hidroxi protegido.
2* - Processo de acordo com a reivindicação

1, caracterizado pelo facto da frutosiltransferase derivar de B. aubtilla ou Ervinia sp.
3* - Processo de acordo com a reivindicação

2, caracterizado pelo facto da frutosiltransferase derivar de uma estirpe B. subtilis NCIB 11871, NCIB II872 ou NCIB II873.
4* - Processo de acordo com as reivindicaçães 2, 3, ou 4, caracterizado pelo facto da frutosiltransferes·’ possuir um em relação à sacarose de, pelo menos, O,1M na ausência de uma aldose aceitante; não formar quantidades significativas de um material precipitável em álcool a partir de um dador de frutose na ausência de uma aldose aceitante; e não ser afectado pela presença de agentes tensio-activos, posd auir uma actividade óptima a cerca de 30°C e ser activo duran te, pelo menos, 20 minutos até cerca de 45°C.
5* - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto do sacarido de frutosilo ser saca rose, rafinose ou estaquiose.
6* - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto da cloração ser efectuada mediante utilização de um reagente Vilsmeier.

- 27 LHG/579P44929
7- - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto do grupo hidróxi protegido ser um grupo carboniloxi alifático ou aromático e ser desprotegido mediante hidrólise; ou ser ura grupo arilalcoxi e ser desprotjB gido por meio de cisão redutiva.
8* - Processo para a preparação de um frutósido a partir de um álcool caracterizado pelo facto de se

efectuar o tratamento de uma solução aquosa do

álcool e um di- ou oligossacarido de frutosilo, com uma frut<> siltraneferase de acordo com as reivindicações anteriores e •diante a separação do frutosido a partir da mistura de reac Ção,
9* - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou 8, caracterizado pelo facto da enzima ser imobilizada,
10* - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo facto de o álcool ser escolhido entre» D-arabinose, L-fucose, 6-deoxiglucose, 6-0-metilgalacto··, lactose, 6-acetato de galactose, manose, 5-tio-D-glucose, maltose, 1-tlo-glucose, maltotriose, ος-D-glucose de 3-0-meti lo, maltopentaose, D-arabinose, maltohexaose, ó-cloro-6-deoxl^ glucose, melibiose, galactose, xilose, isomaltose, L-arabinose, permeato de soro de leite coalhado (lactose), 4-clorogala Ctose, ribose, lixose, 6-acetato de glucose, ácido gluconico, 6-fosfato de glucose, L-ramnose, 6-0-metilglucose, -D-gluco, sido de metilo, xilitol, glicerol e etanol.
11* - Processo de acordo com as reivindicações 8 ou 10, caracterizado pelo facto do di- ou oligo sacarjL do de frutosilo ser escolhido entre sacarose, rafinose, estaquiose.