PT86465B - Processo para a preparacao de novos polipeptidios com uma sequencia de amino-acidos derivada da sequencia de amino-acidos do polipeptidio do factor de estimulacao da colonia de granulocitos humanos (hg-csf) - Google Patents

Description

A presente invenção refere-se a novos derivados polipeja tídicos do factor estimulante de colónias de granulócitos humanos (hG-CSF), plasmídeos recombinantes com um DNA que codifica qualqper dos derivados polipeptídicos ali inseridos, microroganismos portadores dos referidos plasmídeos, e a um método para a produção dos novos derivados polipeptídicos referidos, hG-CSF.

Antecedentes da Invenção factor estimulante das colónias de granulócitos humanos (hG-CSF) é uma espécie de polipéptiio que é essencial na formação de diversas células sanguíneas como um resultado da proliferação e diferenciação das células do sistema hematopoiético. 0 seu principal efeito é promover o aumento do número de granulócitos, particularmente neútrófilos. Os neutrófilos desempenham uma função importante na protecção do corpo humano contra a infecção.

No entanto, o seu tempo de vida é curto e, por consequên cia, é necessário um constante suplemento para a proliferação e diferenciação das células precursorag. A terapia amplamente uti lizada nos últimos aros para ^os tumores proliferativos inibe,

simultaneamente, o desenvolvimento dos precursores neutrófilos e, por esse motivo provoca efeitos secundários graves, nomeadamente uma redução da protecção neutrofílica nos pacientes porta dores de cancro, tornando-os mais susceptíveis à infecção. Espe ra-se que o hG-CSF seja eficaz no alívio deste efeito secundário indesejável através da promoção do aumento do número de neutrófilos por um lado e, por outro, na prevenção e tratamento das do enças infecciosas. Além disso o hG-CSF actua provocando a diferenciação de linhas de células leucémicas in vitro e, por isso, pode, possivelmente, ser útil como um agente terapêutico para a leucemia. Os derivados polipeptídicos, de acordo com a presente invenção, são superiores em actividade hG-CSF ao hG-CSF conhecido e, espera-se que sejam úteis como fármacos.

Com o recente e rápido progresso da tecnologia do DNA recombinante, isolaram-se sucessivamente os genes para as proteínas envolvidas na proliferação e diferenciação das células sanguíneas. Estas proteínas estão a ser produzidas por técnicas de engenharia genética utilizando microrganismos ou células animais.

Isolou-se um cDNA para hG-CSF a partir de uma linha de cé lulas CHU-II do carcinoma humano de células escamosas, determinou-se a sua sequência de bases e a sua expressão nas células COS referenciadas por Nagata e outros Zl<agata e outros: Natura, 119. 415 (1986) J. Souza e outros também isolaram um cDNA a partir de uma linha de células 5^37 de cancro humano da bexiga, determinaram a sua sequência de bases e descreveram a sua expressão em Escherichig Coli” (E. coli) /“Souza e outros: Science, 232, 61 (1986)J.

A sequência de aminoácidos da proteína codificada pelos dois cDNAs referidos antes está em concordância com a sequência

de aminoácidos (tateia 1) da proteína codificada pelo cDNA isola do a partir dos macrófagos do sangue periférico humano normal, pelos presentes inventores.

Quadro 1

10 20 30 4050

ACCCCCCTGGGCCCTGCCAGCTCCCTGCCCCAGAGCTTCCTGCTCAAGTGCTTAGAG ThrProLeuGIyProAlaSerSerLeuProGlnSerPheLeuLeuLysCysLeuGlu

70 80 90 100110

CAAGTGAGGAAGATCCAGGGCGATGGCGCAGCGCTCCAGGAGAAGCTGTGTGCCACC GlnValArgLysIleGlnGlyAspGIyAlaAlaLeuGlnGluLysLeuCysAlaThr

120 130 140 150 160170

TACAAGCTGTGCCACCCCGAGGAGCTGGTGCTGCTCGGACACTCTCTGGGCATCCCC TyrLysLeuCysHisProGluGluLeuValleuLeuGIyH isSerLeuGIyllePro

180 190 200 210220

TGGGCTCCCCTGAGCAGCTGCCCCAGCCAGGCCCTGCAGCTGGCAGGCTGCTTG TrpAIaProLeuSerSerCysProSerGInAlaleuGlnLeuAlaGlyCysLeu

230 240 250 260 270280

AGCCAACTCCATAGCGGCCTTTTCCTCTACCAGGGGCTCCTGCAGGCCCTGGAAGGG SerGlnLeuHisSerGlyLeuPheLeuTyrGlnGlyleuLeuGlnAlaLeuGluGly

290 300 310 320330

ATCTCCCCCGAGTTGGGTCCCACCTTGGACACACTGCAGCTGGACGTCGCCGAC IleSerProGluLeuGlyProThrLeuAspThrLeuGlnLeuAspValAlaAsp

340 350 360 370 380390

TTTGCCACCACCATCTGGCAGCAGATGGAAGAACTGGGAATGGCCCCTGCCCTGCAG PheAlaThrThrlleTrpGlnGlnMetGluGluLeuGlyMetAlaProAlaLeuGln

400 410 420 430 440450

CCCACCCAGGGTGCCATGCCGGCCTTCGCCTCTGCTTTCCAGCGCCGGGCAGGAGGG ProThrGlnGlyAlaMetProAlaPheAlaSerAlaPheGlnArgArgAlaGlyGly

460 470 480 490500

GTCCTAGTTGCCTCCCATCTGCAGAGCTTCCTGGAGGTGTCGTACCGCGTTCTACGC ValLeuValAlaSerH isLeuGlnSerPheLeuGluValSerTyrArgValLeuArg

510520

CACCTTGCCCAGCCCTGA

HisLeuAlaGlnPro*»*

174

Resumo da Invenção:

E um dos objectivos destg invenção fornecer os meios pare a produção, a baixo custo e em grandes quantidades de deri vados polipeptídicos de hG-CSF possuindo elevada actividade específica e elevada estabilidade no sangue.

Os presentes inventores descobriram que os derivados polipeptídicos possuindo elevada actividade específica podem ser produzidos modificando o cDNí para o hG-CSF apresentado no Quadro 1 e cultivando uma estirpe de E. coli que alberga um pias, mídeo com o cENA modificado incorporado ou por decomposição polipeptídica limitada utilizando uma protease, e completaram agora a presente invenção.

Breve Descrição dos Desenhos:

A fig. 1 apresenta um esquema de construção do plasmídeo pCfTAl.

A fig. 2 apresenta um esquema de construção do plasmídeo pCfTB20.

A fig. 3 apresenta esquemas de construção dos plasmídeos pCfTL23, 38, 35 e 4-1.

A fig. 4- apresenta esquemas de construção dos plasmídeos pCfTE14-, 17 e 133.

A fig 5 apresenta um esquema de construção do plasmídeo pCfWDl.

A fig. 6 apresenta esquemas de construção dos plasmídeos pCfT95E19, pCf/Al e pCfABj.

A fig. 7 apresenta esquemas de construção dos plasmídeos

pCfBA3, pCfBBlOl, pCfEC52, 59, 42B1, 45, 76, 77, 93, 95, 97, pCfBD28, 56 e 82

A fig. 8 apresenta esquemas de construção dos plasmídeos pCfCBlOl, pCfCC52, pCFCD28 e 56.

A fig. 9 (1) e (2) apresenta esquematicamente os processos envolvidos no método Okayama-Berg para a síntese do cDNA e a construção de um plasmídeo recombinante contendo o DNA sintetizado.

* A fig. 10 apresenta um esquema de construção plasmídeo pLAl.

A fig. 11 apresenta um esquema de construção do plasmídeo pCfTNS501.

A fig. 13 apresenta um esquema de construção do plasmídeo pTrS20.

A fig. 14 apresenta esquemas de construção dos plasmídeos pCfTNS7 e pCfTAArg4S.

A fig. 15 apresenta um esquema de construção do plasmídeo ) pCfTN205 e pCfTAArg4.

A fig. 16 apresenta esquemas de construção dos plasmídeos pCfTNS301 e pGfTNS401.

A fig. 17 (1) e -.2) apresenta esquemas de construção dos plasmídeos pCfBD28A17 e pCfBE2ÔT17.

Descrição pormenorizada da invenção:

Os derivados polipeptídicos de hG-GSF de acordo com a presente invenção diferem, em parte, da sequência de aminoácidos dos polipéptidos que possuem a sequência de aminoácidos apresentada

no Quadro 1 como um resultado de substituição e/ou eliminação. 0 aminoácido ou aminoácidos a serem substituídos são aqueles que estão localizados perto/na vizinhança do N-terminal. de preferência, pelo menos um aminoácido de entre o primeiro e o 17^Q aminoácidos a partir do N-terminal deve ser o alvo da substituição. Do mesmo modo, os aminoácidos a serem eliminados são aqueles aminoácidos que se encontram perto da ou na vizinhança do N-terminal. De preferência, pelo menos um aminoácido de entre o is e o li² aminoácidos a partir do N-terminal deve ser eliminado· Os plasmídeos recombinantes, de acordo com esta invenção, obtiveram-se inserindo um fragmento de DNA que codifica qualquer dos derivados polipéptidos referidos antes dentro de um plasmídeo apropriado que possua uma função de expressão DNA.

Os fragmentos de DNA que codificam os derivados polipeptí dicos desta invenção são, de preferência, os que resultam da subs. tituição de pelo menos uma base seleccionada. entre a 1» e a bases da sequência de cases apresentada no Quadro 1 para o DNA que codifica o hG-CSF.

Um cDNA (hG-C8F c-DNA) obtido por transcrição inversa de um RNA mensageiro que codifica o hG-CSF por tecnologia do DNA recombinante ou um DNA que codifica o hG-CSF obtido a partir de DNA cromossomico, por exemplo, pode utilizar-se como o DNA que codifica o hG-CSF apresentado na Fig. 1.

Pode utilizar-se qualquer cDNA a_e hG-CSF desde que codifique hG-CSF. Como exemplo específico, pode utilizar-se pCSFl-2, um plamídeo proporcionado pela presente invenção. Descreve-se no exemplo 1 o processo para a produção de pCSFl-2.

cDNA de hG-CSF contido no pCSFl-2 tem a sequência de confo

rme determinado oelo método de sequenciaçao didesoxi utilizando o e outros pCSFl-2 é um plasmídeo que restrição apresentado na fig. 1 e uma estirpe de E. coli que 0 contém, coli SCCF 1-2 foi depositada no Fermentation Besearch

Institute, Agency of Industrial Science ir anc Technology (FPI) em de Novembro de 19o 6, com o número de

Π de acordo com ο Iratado de Budapeste

Pode utilizar-se qualque plasmídeo para a derivado polipeptídico de hG-CSF que

G codificado por que o referido DNA possa ser na 1. coli

Pode utilizar-se com permita a inserção de um DNA estranho, num sítio a jusante de um promotor adequado, por exemplo, um promotor trp ou lac, e tenha cia entre a sequência Shine-Delgarono (daqui em diante

SD) e o co dão de iniciação (ATG) ajustada para uma distancia adequada, por exemplo, 6-18 pares de bases

Como exemplos apropriados de tal plasmídeo podem referir'·> U O .1.

-se o pKYPlO (U.S. Patente 4.686.191), pLSAl (Exemplo 3 de Befe rência), pGSLl Z”Sexine e outros : Proe. Fatl. Acad. lei. USA,

N2 1+8.699 nado) e o (o termo o PI” significa pBR322 /Bolívar e outros recombinação entre um DNA que codifica o polipéptido hG-CSF óu uso preendem a digestão ce ambos os DNAs com uma pode ^!s de j

I restrição e ligação subsequente utilizando DNA T4-liga.se.

Para ligação, o fragmento de DNA terminal que resulta da digestão com enzima de restrição pode processar-se, quando adequado, fazen do uso da reacção de preenchimento utilizando um fragmento Klenow de DNA polimerase I ou da reacção de rectificação utilizando DNA polimerase T4; Também se pode aplicar a técnica de ligação de DNA.

Exemplos de construção de plasmídeos recombinantes que | contêm um DNA inserido que codifica um derivado polipeptídico de hG-CSF, utilizando-se pCSFl-2 como o cDNA de hu-CSF, pGSLl, pKYPlO, pKYP2ó, pBR322 ou pLSAl como 0 plasmídeo para a incorpora ção do DNA neste e, se necessário, um adaptador de DNA sintetizado quimicamente ou uma técnica de mutagénese de sítio específico como a que segue.

Descrição pormenorizada dos gráficos (Processos de recombinação) | Conforme se apresenta na Fig. 1, efectuou-se a clivagem de pCSFl-2 /(cerca de 4,5 quilobases, ) posteriormente referido per KbA com Apa I e Bam Hl e purificou-se um fragmento de DNA de cerca de 1,5 kb por electrof orese em gel de agarose de baixa tem peratura de gelificação (método LGT) /L. Wieslander: Analytical Biochemistry, 96, 305 (1979) J⁷.

Depois procedeu-se a clivagem de pLSAl com Ban III e

Bam Hl e, purificou-se, pelo método LGT, um fragmento de DNA de cerca de 2,8 kb. Ligaram-se ambos os fragmentos assim obtidos e o DNA de síntese apresentado na Fig. 1 utilizando DNA ligase T4 para proporcionar o pCfTAl.

Depois, conforme se apresenta na Fig. 2, efectuou-se a clivagem do pCfTAl com Bam Hl, converteram-se as extremidades coesivas em extremidades tornadas coincidentes, com fragmento Klenow, e, apds clivagem posterior com EcoRI, purificou-se um fragmento de DNA de cerca de 2,5 kb, pelo método LGT. Efectua-se, separadamente, a clivagem de pCfTAl com EcoRI e Lra.I e purificou-se, pelo método LGT, um fragmento de DNA de cerca de 1,0 kb. Ligaram-se uns aos outros os fragmentos de DNA assim obtidos, utilizando T4 DNA ligase para proporcionar pCfTBLO.

Posteriormente, conforme se apresenta na Fig. 3> efectuou-se a clivagem de pCSFl-2 com Apa I e BamHI e purificou-se pelo método LGT um fragmento de DNA de cerca de 1,5 kb. Separadamente, procedeu-se à clivagem de pGSLl com HindIII , BamHI e PstI e purificou-se pelo método LGT um fragmento de DNA de cerca de 1,7 kb. Além disso, efectuou-se a clivagem de pKYPlO com Pst I e Ban III e purificou-se pelo método LGT um fragmento de DNA de cerca de 1,1 kb. A ligação destes três fragmentos e do DNA de síntese apresentado na Fig. 3 proporciona pCfTL23, pCfTL3Ô, pCfTL35 e pCfTL41 enquanto a ligação destes três fragmentos e do DNA de síntese apresentada na Fig. 4 proporciona pCfTM14, pCfTM17 e pCfTM113.

Além disso, conforme se apresenta na Fig. 5, efectuou-se a clivagem do pCfTAl com Ban III e Stu I e purificou-se pelo método LGT um fragmento de DNA de cerca de 1,3 kb contendo o cDNA de hG-CSF. Separadamepte , procedeu-se à clivagem de pKY2ó com Ban HI_t converteram-se as extremidades coesivas em extremidades coincidentes por tratamento com um fragmento Klenow de DNA poli

merase I e, após clivagem posterior com Pst I , purificou-se pelo método LGT um DNA de cerca de 1,8 kb. Poste rio rmente, em separado, procedeu-se a clivagem de pGSLl com EanlII e Pst I e purificou-se, pelo método LGT, um fragmento de DNA de cerca de 1,0 kb. Ligaram-se uns aos outros os três fragmentos de DNA assim obtidos utilizando Th- DNA ligase para proporcionar pCfWDl.

Posteriormente, conforme se apresenta na Fig. 6, efectuou-se a clivagem de pCfTL38 com HjndlII e Bgl II e purificou-se, peI lo método LGT, um fragmento de DNA de cerca de 2,6 kb. Separada mente, procedeu-se à clivagem de pCfTL38 com Hind III, BamHI e Dpnl e purificou-se um fragmento de DNA de cerca de 3θθ pb (pares de bases) pelo método LGT. Posteriormente, eir. separado, procedeu -se à clivagem de pCfTB20 com Ava I, as extremidades coesivas foram tornadas iguais por tratamento com o fragmento Klenow e após clivagem posterior com BglII. purificou-se, pelo método LGT, um frag. mento de INA de cerca de 480 pb. Ligaram-se os três fragmentos de DNA assim obtidos utilizando T4 DNA ligase para proporcionar | pCfT95K19. Posteriormente, também conforme apresentado na fig.6, efectuou-se a clivagem de pCfT95E19 com Ban III e Bgl I e purificou-se pelo método LGT e um DNA de cerca de 1,0 kb e, separadamen te, procedeu-se à clivagem de pCfT9í>E-19 com Bgl I apenas e, purificou-se um fragmento de DNA de cerca de 1,8 kb pelo referido método. Posteriormente, em separado, procedeu-se à clivagem de pCfT95K com Bgl I e Sau 3A e purificou-se pelo método LGT um fragmento de DNA de cerca de 353 kb. Ligaram-se os três fragmen tos de DNA assim obtidos e o DNA de síntese apresentado no meio da figura 6 (isto é, ao meio da parte inferior) para proporcionar pCfAAl. Depois, conforme também se apresenta na Fig. 6, efectuou

-se a clivagem de pCfAAl com Xho I e Bgl I e purificou-se,pelo método LGT, um fragmento de DNA de cerca de 3,0 kb. Sste fragmento, o fragmento Bgl I - Sau,3A , referido antes, (cerca de 350 bp) de pCfT95K19 e o DNA de síntese apresentado na Fig. 6, ao fundo, foram ligados conjuntamente utilizando Th· DNA ligase para proporcionar pCfAB5 e pCfABlh-. Posteriormente, conforme se apre senta na Fig. 7, procedeu-se à clivagem de pCfAB5 com Ava I e Bgl II e purificou-se, pelo método LGT, um fragmento de DNA de | cerca de 2,8 kb. Separadamente, efectuou-se a clivagem de pCfWDl com Bgl II e Ava I e purificou-se a DNA de cerca de 1,3 kb pelo método LGT, Ligaram-se os dois fragmentos assim obtidos utilizan do Th- DNA ligase para proporcionar pCfBAÔ. Por outro lado, efectuou-se a clivagem de pCfABlh· com Ava I e Bgl II e purificou-se pelo método LGT um fragmento de DNA de cerca de 2,8 kb, e ligou-se este fragmento com o fragmento, referido antes, de DNA de 1,3 kb derivado do pCfNDl por clivagem com Bgl II e Ava I utilizando Th· DNA ligase, para proporcionar pCfBA32. Posteriormente, confor ) me também apresentado na fig. 7, procedeu-se a clivagem de pCfBA8 com Ban III, Bgl II e Xho I e purificou-se pelo método LGT, um fragmento de DNA de cerca de 2,7 kb. A ligação dos dois fragmentos de DNA assim obtidos e o adaptador de DNA de síntese apresentado na Fig. 7,utilizando Th- DNA ligase proporciona pCfBLIOl, pCfBC52, pCfBC59, pCfED28, pCfBD5ó, pCfB0h-2Bl, pCfBCh-5, pCfBC76, pCfBC77, pCfBC93, pCfBC95, pCfBC97 θ pCfBD82.

Conforme se apresenta na Fig. 8 a clivagem de pBR322 com Pst I, tornaram-se coincidentes as extremidades coesivas com Th· DNA polimerase, incorporou-se o adaptador Bgl II , utilizando ThDNA ligase e, após clivagem posterior com BcoRI e Bgl II, purifi cou-se pelo método LGT um fragmento de DNA de cerca de 3 »6 kb. efectuou-se a clivagem de cada um dos plasmídeos pCfBBlOl, pCftíC52, pCfBC59, pCfBD28 e pCfBD5ó, obtidos segundo o procedimen to referido antes, com Bco RI e Bgl II e purificou-se um fragmento de DNA de cerca de 1,8 kb, pelo método LGT. Ligou-se cada fra£ mento de DNA de 1,8 kb com o fragmento de DNA de 3>θ kb derivado de pBR322, utilizando-se Th DNA ligase. Obtiveram-se, assim, o pCfCBlOl, o pCfCC52, o pCfCC59» o pCfCD28 e o pCfCD^ó que corresI pondem aos respectivos plasmídeos referidos antes.

Por outro lado, procedeu-se h clivagem do pCfBAS com Ban III, Bgl II e Xho I e purificou-se um fragmento de ENA de cerca

2,7 kb, pelo método LGT. Separadamente, efectuou-se a clivagem do pCfBA8 com Xho I e Bgl II e purificou-se um fragmento de DNA de cerca de 1,4 kb, pelo método LGT

A ligação dos dois fragmentos assim obtidos e do adaptador de DNA de síntese, apresou ta da na fig. 14 proporciona pCfTN57 θ pCfTAArgAS. Para além disso, conforme se apresenta na Fig. 15» | efectuou-se a. clivagem do pCfTN57 com Pvul e Xhol e purificou-se pelo método LGT, um fragmento de DNA de cerca de 1 kb. Separadamente procedeu-se à clivagem de pCfBA32 com Pvul e Xhol e purificou-se um fragmento de DNA de cerca de 3 kb, pelo método LGT. Ligaram-se conjuntamente os dois fragmentos assim obtidos utilizando T4 DNA ligase para proporcionar pCfTN205. Do mesmo modo, efectuou-se a clivagem do pCfTAArg^S com Pvu I e Xho I, purificou-se um fragmento de cerca de 1 kb, pelo método LGT e, ligou-se este fragmento com o fragmento de DNA de cerca de 3 kb derivado do plasmíden pCfBA32 referido, por clivagem com Pvu I e Xho I, utili zando Τ4 DNA ligase para proporcionar pCfTAArg4.

Posteriormente, procedeu-se à. clivagem do pCfBAS com Ban III, Egl II e purificou-se, pelo método LGT, um fragmento de DNA de cerca de 2,7 kb.

SeParadamente, efectuou-se a clivagem do pCfBAô com Âho I e Bgl III e purificou-se pelo método LGT um fragmento de DNA de cerca de 1,4 kb.

Ligaram-se os dois fragmentos, assim obtidos, e o adapta dor de síntese apresentado na Fig. 16 utilizando T4 DNA ligase para proporcionar pCfTNS301 e pCfTNS401. Para além disso, conforme se apresenta na Fig. 12, efectuou-se a clivagem do pCfBA8 com Xho I, converteram-se as extremidade coesivas em extremidades coincidentes por tratamento com o fragmento klenow e, após clivagem posterior com Pvu I, purificou-se um fragmento de DNA de cerca de 3 kb pelo método LGT. Separadamente, efectuou-se a clivagem do vector pTrS20 de ATG (exemplo 4 de referência) com Saci, seguindo-se a conversão das extremidades coesivas em extremidades coincidentes por tratamento com o fragmento Klenow. A pés clivagem posterior com Pvu I, purificou-se pelo método LGT um fragmen to de DNA de cerca de 1 kb. Ligaram-se os dois fragmentos assim obtidos utilizando T4 DNA ligase para proporcionar pCfTNS^Ol.

Num exemplo em que se utilizou mutagénese de sítio específica, efectuou-se a clivagem do pCfED28 com 'Ban III e Pst I, conforme indicado na Fig. 17 e purificou-se pelo método LGT um fragmento de DNA de cerca de 210 pb. Separadamente, procedeu-se a clivagem do DNA dM13mpl9RF do vector do bacteriófago M13, com Acc I e Pst I purificou-se pelo método LGT um fragmento de DNA de cerca de 7,2¹¼ kb. Ligaram-se os dois fragmentos de DNA assim obtidos utilizando T4 DNA ligase para proporcionar ptl9BD28N. Depois utilizou-se este ptl9BD2ôN para efectuar a transfecção da

S.· coli JM105, e separou-se um ptl9BD28 de cadeia simples, do bacteridfago obtido. De modo semelhante, e também conforme apre sentado na Fig. 17, efectuou-se a clivagem do DNA de M13mpl9RF com Hind III e EcoRI e purificou-se, pelo método LGT, um fragmen to de DNA de cerca de 7,2 kb. Depois disto, misturou-se um fragmento de DNA de cerca de 7,2 kb com o ptl9BD28N obtido segundo o procedimento anterior, originou-se a formação do DNA duplex, aber to, por tratamer.to de desnaturação seguido de reforço e purificou -se o DNA duplex, aberto resultante, pelo método LGT. Depois, re forçou-se este DNA com o DNA de síntese apresentado na Fig. 17 e, em seguida, circularizou-se utilizando 0 fragmento Klenow e T4DNA ligase. Utilizou-se este DNA circularizada para efectuar a transfec ção da E. coll JM105, pelo que se obteve ptl9BD28Nàl7 e ptl9BD28NT17 com mutagenese de sítio específico incorporado. Posteriormente, também conforme apresentado na Fig. 17 procedeu-se à clivagem de ptl9BD28NAT17 e ptl9BD27NT17 com Ava I e Xho I e purificou-se cada fragmento de JM de cerca de 110 pb, pelo método LGT. Separadamente efectuou-se a clivagem do pCÍBD2õ com

Xho I e Bgl II e purificou-se pelo método LGT um fragmento de DNA de cerca de 2,7*+ kb. Posteriormente, separadamente, efectuou-se a clivagem de pCfBD28 com Bgl II e Ava I e purificou-se, pelo mé todo LGT, um fragmento de DNA de cerca de 1,29 kb. A ligação dos fragmentos de DNA assim obtidos, de cerca de 110 pb, cerca de 2,74 kb e 1,29 kb utilizando T+ DNA ligase proporciona pCfBD28A17 θ pCfBD28T17, respectivamente.

As condições de reacção dos procedimentos de recombina’.

ção anteriores foram genericamente, as seguintes.

A reacção de digestão do DNA na presença de enzima ou en zimas de restrição efectuou-se geralmente, utilizando 0,1-20 pg de DNA num meio reaccional que contém 2-200 mM (de preferência 10-40 mM) de Tris~H01 (pH 6,0 - 9,5, de preferência 7,8-8,0),0-200 mM de NaCl e 2-20 mM(de preferência 5-10 mM) de MgC^ a 20-70°C (de. pendendo a variação da temperatura óptima do(s) enzima(s) de res. trição utilizado(s) de 15 minutos a 24 horas . Utiliza-se cada um dos enzimas de restrição numa quantidade de· 0,1-100 unidades (de preferência 1-3 unidades) por micrograma de DNA. Geralmente, põe, -se termo à reacção aquecendo a 55-75°0 durante 5-50 minutos. Também é possível inactivar os enzimas de restrição com um reagente tal como o fenol ou o pirocarbonato de dietilo.

Os fragmentos de DNA formados por digestão com enzimas de restrição ou os DNAs duplex abertos podem purificar-s.e pelo meto do LGT ou por electroforese em gel de poliacrilamida £A.M. Mexam e outros; Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 74, 560 (1977)_7, entre outros.

A reacção de ligação do fragmento DNA efectuou-se num meio reaccional que contém 2-200 mM (de preferência 10-40 mM) de Tris-HCl (pH 6,1-9,5, de preferência 7,8-8,0), 2-20 mM (de prefe rência 5-10 mM) de MgCl^ 0,1-10 mM (de preferência 0,5-2,0 mM) de ATP e 1-50 mM (de preferência 5-10mM) de ditiotreitol a -1-57°C (de preferência 3-20°C) durante 15 minutos a 72 horas (de preferência 2-20 horas, utilizando 0,3-10 unidades de T4 DNA ligase.

DNA plasmídico recombinante obtido por reacção de liga ção pode introduzir-se, se desejado, na 3. coli de acordo com o método de transformação de Cohen e outros (S.N. Cohen e outros: Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 6£, 2110 (1972)).

Introduziram-se os DNA RF do bacteridfago E13 recombinan te, formados pela reacção de ligação, na E. coli JM105 /J. Messing e outros: Gene, 33, 103 (19θ5) utilizando 0 método de transfecção /“Yoshiyuki Kuchino e outros: Tanpakushitsu, Kakusan, Koso (Protein, Nucleic Acid aoà Enzime), 29, 294 (1984) _7 se necessário .

Podem isolar-se os DNA plasnídicos recombinantes e os DNAs RF do bacteridfago K13 recombinante dos respectivos transformantes de E. coli pelo método de Birnboim e outros /Ή. C. Birnboim e outros: Nucleic Acids Res., /, 1513 (1973)-7, por exemplo.

Isolou-se o DNA de cadeia simples a. partir do bacteriófa go Ml3 recombinante pelo método conhecido /loshiyuki Kuchino e outros: Tanpakushitsu, Kakusan, Koso, 29. 294 (1984)

Os DNA plasmídicos examinaram-se por sítios de clivagem por electroforese em gel de agarose e electroforese em gel de poliacrilamida seguindo-se a clivagem com 1-10 enzimas de restrição. Posteriormente, sfectua-se a determinação da sequência de bases do DNA, se necessário, pelo método de sequenciação didesaxi utilizando o bacteriéfago M13 /J. Messing e outros; Gene, 19, 269 (1982)J.

Podem produzir-se os DMs plasmíhcos recombinantes desejados sob as condições atrás refericas.

Podem produzir-se os derivados polipeptídicos hG-CSF da. presente invenção segundo o procedimento seguinte;

f Deste modo , transforma-se a Ξ. coli K-12 HB101 com um plasmídeo adequado (por exemplo pCfED2Ô) e selecciona-se de entre as colónias ampicilina-resistentes (daqui em diante, Ap^r) um plasmídeo (por exemplo), pCfEDPS) que transporta o transforman te da Ξ. coli. 0 crescimento do plasmídeo (por exemplo do pCfLD28) pertencente à estirpe de E. coli, num meio, pode conduzir a formação,na cultura, de um derivado polipeptídico hG-CSF.

Pode utilizar-se qualquer meio, quer de síntese quer natural, desde que seja apropriado para o desenvolvimento da E.coli e para a produção de derivados polipeptíóicos hG-CSF.

As fontes de carbono utilizáveis incluem glucose, frutose, lactose, glicerol, manitol e sorbitol, entre outros, e as fon tes de azoto utilizáveis são NH^Cl, (NH^^SO^, ácidos cusamínicos, extracto de levedura, polipeptona,extracto de carne, ractotriptona, solução de xarope de milho etc, KH^PO^, NaCl, MgSO^, vitamina E·^, MgCl^ e assim por diante, podem utilizar-se como outras fontes nutrientes. Efectua-se a cultura com arejamento e agitação a um pH de θ ^a um® temperatura de 18-40°C. 0 cul tivo durante 5-90 horas conduz a uma acumulação de derivados polipeptídicos de hG-CSF nas células em cultura. Depois, recolhem-se as células da cultura e são desagregadas por tratamento com ultra-sons. A centrifugação proporciona os resíduo celulares.

Os derivados polipeptídicos de hG-CSF extraem-se dos resíduos celulares, purificam-se, solubilizsm-se e regeneram-se pelo método de Marston e outros ZI. A. 0. Marston e outros: EI0/TSCHN0L0GY, 2, 800 (1984-J. Trataram-se as células da medula óssea de um rato com os referidos derivados, e ensaiou-se o derivado polipeptí dico de HG-CSF pelo método que utiliza o número de colónias for18 * _ madas em agar simples como indicador.

Na prática da presente invenção, a actividade do hc-CSF determina-se pelo modo seguinte. Recolhem-se as células da medu la óssea do fémur de uns ratos machos C3k/He de 8-12 semanas de idade (Shizuoka Laboratory Animal Center) e faz-se uma suspensão em ’’^-Minimum Essencial Médium (Flow Laboratories; daqui em diente referido como o(-M3M) enriquecido com soro de feto d.e bovino a 10 % (FBS). Faz-se a impregnação de lã de Nylon (0,3 g; Wako Pure Chemical Industries, Nylon Fiber 146-04231) numa coluna compactada com 1,5 ml da suspensão de células referida antes (cer ca 5 * 10' células) e permite-se que a reacção se processe num incubador com CO^ a 5 / a 37°C durante 90 minutos. Depois, faz-se passar ο ρ( -ΜΞΕ previamente aquecido a 37°C através da coluna e as células da medula óssea não adsorvidas recolhem-se sobre tecido de Nylon como ume fracção efluente. Lavaram-se as células uma vez com o(-MEE e ajustou-se a concentração celular para uma concentração previamente determinada.

Depois disso, determina-se a capacidade de formação de colónias de células de linha mielopoiética, pelo método de Okabe e outros ZT. Okabe e outros: Câncer Research, 44, 4503-4506 (1986) J. Por conseguinte, mistura-se uma suspensão (2 x 10° células/ml de células da medula óssea preparada segundo o modo atrás referido com uma mistura de 0,2 ml de o(-EEM, 0,4 ml de FBS e 0,2 ml de cada amostra diluída 2 vezes. Eistura-se um volume idêntico (1,0 ml) de solução de agar (Difco, Agar Purified 0506-01) a 6 / mantida a 42°C com a mistura anterior e distribui-se a mistura resultante em porções de 0,5 ml numa placa de microtitulação de 24 cavidades (Nunc' hultidisnh ^14398^) (5 x 10^ células/recipiente, n=3).

Após 7 dias de incubação a 37°6 num incubador com CO^ ^a 5 contam-se as colónias que não compreendiam menos do que +0 célu las, num microscópio (Olympus X^C). Após contagem,transfere-se cada colónia, com cuidado, para uma lâmina de vidro, fixa-se com uma solução de uma mistura de acetona/formalina durante 30 minutos e submete-se a coloração dupla de estearase pelo método de Kubota e outros £%· Kubota, e outros: Exp.

Mematology, 8, 339-3^ (1380) J para identificação das colónias.

| A potência de cada amostra calcula-se com base no resul tado no teste da contagem de formação de colónias para a diluição dupla, conforme se segue: A actividade que proporciona metade do valor máximo de formação de colónias obtidas com o G-CSF in tacto utilizada como um padrão definiu-se como 50 unidades. Calcula-se a potência (em unidades) de acordo com esta definição e utilizando 0 factor 20 para multiplicação para conversão para a actividade por mililitro, e também tendo em consideração 0 factor de diluição para a amostra. A actividade específica expressa-se em termos de potência (unidades/mg) por unidade de peso (mg) de proteína.

Os derivados polipeptídicos a que falta um ou mais amino ácidos no N-terminal do polipéptido de hG-CSF, podem também produzir-se por degradação enzimática.

Os derivados podem produzir-se, evidentemente, por degra dação enzimática do hG-CSF natural como material inicial. Contu do, uma vez que o hG-CSF natural possui reactividade reduzida com o enzima (protease), é preferível utilizar para a produção de tais derivados com elevada actividade em boas quantidades, hG-CSF ..modi ficados que possuam reactividade ^crescida contra a protease.

São utilizados, de preferência, como materiais iniciais os hG-CSFs modificados (a), (b), (c) e (d) apresentados no quadro 2 como resultante da substituição de um ou mais aminoácidos no lado da N-terminal do polipéptido hG-CSF. Podem obter-se as modificações (a), (b), (c) e (d) cultivando estirpes bacterianas que alberguem os plasmídeos que possuem as sequências de bases correspondentes, nomeadamente, pCfBC59 (NC59), pCfBD28 (ND28), pCfK95 (NC95) e pCfTAArg4S (Arg4s), respectivamente, seguindo-se o isolamento e purificação por métodos conhecidos.

Utilizam-se como enzimas apropriados as endoproteases tais como a serina. protease e tiol protease. Eais especificamente, podem mencionar-se, por exemplo, a subtilisina A, a subti lisina BPN* , a subtilisina Carlsberg, a subtilisina nove, a proteinase K, nagase, termolisina, endoproteinase Arg-C, tripsina e o(-quimotripsina . Utiliza-se o enzima numa quantidade de

3,4 x 10“ a 8,5 x 10“^J unidades por miligrama do material ini ciai.

I

Çua21

Quadro 2

Exemplos de derivados hG-CSF sensíveis à protease N-ter minal

hG-CSF modificados		Aminoácidos	substituintes	Plasmídeos x
a	Tyr1	, lie3,	!+ Arg ,	Ser^ ......	Ser1'7	NC59
b	Ala1	, Thr3,	L	c Arg-' ......	Ser1'7	ND28
c	lie1	, Thr3,	Arg ,	Ser^ ......	Ser17	NC95
d			4 Arg ,		Ser1?	Arg4s

* Aminoácidos após substituição. Os expoentes indicam os números de posição dos aminoácidos relevantes a partir do N-terminai.

Após dissolução do material de partida uma solução aquosa tal como tampão de cloridrato de Tris ou tampão de fosfato e adição de um enzima, efectua-se a reacção enzimática a 10-37°C durante um intervalo de tempo que varia de 30 minutos a três dias.

Determina-se a quantidade de proteína total e a quantidade de proteína pelos métodos seguintes:

Efectua-se a determinação ds proteína total pelo método de N.M. Bradford M. Bradford: Anal. Biochem. , 72, 248 (1976)

Determina-se a quartidade de proteína pela electroforese em gel de poliacrilamida-SDS pelo método de Laemmli /U. h. Laemmli: Nature, 227, 680 (1970) J seguindo-se a medição num cromatógrafo (Shimadzu CS-930) ·

Determinou-se a sequência de aminoácidos da extremidade

N do peptido obtido após clivagem enzimática, utilizando um sequenciador de aminoácidos automático Modelo Sequenciador de Proteína de Fase-Gás (Appliec niosystems) em associação com um cromatógrafo de líquido de elevada resolução, Spectra Physics.

Descrição dos aspectos preferidos

Os exemplos seguintes ilustram a invenção.

Exemplo 1

Construção do plasmídeo pCfTAl de expressão de hG-CSF (Cf. Fig. 1)

Dissolveu-se uma porção de 2 ^ig de ADN de pGSF'1-2 obtido no exemplo 1 numa quantidade total de 20^11 de uma solução (posteriormente referida como tampão Y-100 contendo 10 mM de Tris-HC1 (pH 7,5) ? 7 ml. de MgCl^, 6 mM de 2-mercaptoetanol e 100 mM de NaCl, adicionaram-se 10 unidades de cada um dos enzimas de res triçao Apal (Boehringer Mannheim) e Eam Hl (Takara Shuso; posteriormente, a menos que se especifique de outro modo, todos os enzimas de restrição utilizados foram obtidos do Takara Shuso) e efectuou-se a reacção a 37°C durante 4- horas. A partir da mistura reaccional purificou-se e recuperou-se 0,4- yag de um fragmento de DNA de 1,5 kb, pelo método LGT.

Separadamente, dissolveram-se 2 jug do plasmídeo pLSAl, preparado pelo método do exemplo 3. em 20 jil de tampão Y-100, adi cionaram-se 10 unidades de cada um dos enzimas de restrição BaniII (Toyobo) e BamHI, e efectuou-se a reacção a 37°c durante

horas. A partir desta mistura reaccional purificaram-se e recuperaram-se 0,8 ^g de um fragmento de INA de 2,8 kb pelo método LGT.

Por outro lado, sintetizou-se o DNA adaptador seguinte para forncecer os codões que codificam do l² ao 5² sminoácidos do N-terminal do polipétido hG-CSF maduro /treonina¹ (ACA ou ACT), prolina (CCA ou CCT), leucina^J (CTA), glicina (GGC) e prolina·' (CCC) J e o codão de iniciação (ATG) necessário para a expressão e o ajustamento da distancia entre a sequencia SB e o ATG a jusan te de um promotor de triptofano (Ptrp) para um comprimento adequa do entre 6-18 pb:

BaniII

Hindi II .

Met Thr Pro^ LeA

Pro·''

5'CGATA AGCTT

Ί“·υ ——	—		— —r-»-
ATG	AC^ | Cc£	CTA	GGC	C

TAC TG^ Gd]· GAT

3’TATTCGA A mer (4mix) mer (4mix)

Em primeiro lugar, sintetizaram-se os DNAs de cadeia simples 26 mer e 20 mer pelo método do fosfotriéster Crea e outros : Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 5765 (1978)/. Dissolveram-se 0 26 mer e o 20 mer (2 jig de cada) em 40 jíL de um tampão (posteriormente referido como tampão T4 quinase) contendo 50 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM de MgCl^, 5 mM de ditiotreitol, 0,1 mM de EDTA e 1 mM de ATP, adicionaram-se 30 unidades de polinucleotido T4 quinase (Takara Shuso; posteriormente aplicar-se-á o mesmo) e efectuou-se a reacção de fosforilação a 37°C durante minutos.

!

Em 25 p.1 de tampão (daqui em diante referido como tampão TL ligase) contendo 20 mM de Tris-HCl (pH 7>6), 10 mM de NgClp, 10 mM de ditiotreitol e 1 mM de ATP, dissolveram-se 0,^ ^ug do fragmento Apal-BamI derivado de pGSFl-2 (1,5 Rb) obtido pelo modo anterior e 0,2 jug do fragmento EanII-BamHI derivado do pLASAl (28 kb) obtido pelo modo anterior. Adicionou-se à mistura 0,1 yig do adaptador do ADN atrás referido. Adicionou-se posteriormente a esta solução mista, 6 unidades de DNA T4 ligase (obtida no Takara Shuso: posteriormente aplicar-se-á 0 mesmo), e efectuou-se a reacção de ligação a 4°C durante 13 horas.

Utilizou-se a mistura de plasmídeo recombinante assim obtida para transformar a E. coli HB101 /'Bolívar e outros: Gene, 2, 75 (1977) .7 pelo método de Cohen e outros /~E. ^TJ. Cohen e outros: Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 69, 2110 (1972) _7 (posteriormente uti lizou-se este método para transformar a 3. coli,) e obteve-se uma colónia Ap^r. Recuperou-se 0 DNA plasmídico a partir de colónias de células em cultura, pelo método conhecido /H. C. Birnboim e | outros: Nucleic Acids Res., 2, 1513 (1979) 7 (posteriormente uti lizou-se este método para a separação do DNA plasmídico). Confir mou-se a estrutura do plasmídeo obtido por clivagem com BaniII, Rsal, Pst I, HindIII e BglII seguindo-se electrofocese em gel de Agarose. Este plasmídeo designa-se por pCfTAl. confirmou-se. pe lo método de sequenciação didesoxi utilizando o bacteriógrafo M13, cuja sequência de bases do pCfTAl na vizinhança dos locais BaniII e HindII era a seguinte:

BanIII HindIII

CGAT AAGCTT ATG ACT

Pro Leu Gly Pro

CCT CTA GGC CcT

Sxemplo

Construção do plasmídeo pCfTB20 que_nã_o possui parte da região 3¹ não traduzida do cDNA_de _hG-CSF.

Dissolveu-se em 20 jal de tampão Y-100, 2 pg do plasmídeo pCfTAl de expressão hG-CSF (4,3 kb) obtido no Exemplo 1, e adieionou-se 4 unidades do enzima de restrição BamHI e efectuou-se a reacção de digestão a 37°G durante 4 horas. Após extracção com um volume idêntico de fenol e clorofórmio (posteriormente referido como extracção com fenol/ciorofórmio), recuperou-se um fragmen to de DNA de 1,8 pg por precipitação com etanol. Eissolveram-se estes fragmentos de DNA em 20 pl de um tampão (referido posterior mente como o tampão de Klenow) contendo 50 mM de Tris-HCl (pH 7,8), 7 mM de MgGl^ e 6 mM de mercaptoetanol, depois adicionou-se dATP, dTTP, dCTP e dGTP, cada um deles numa concentração de 1 mM e, após adição posterior de 4 unidades de um fragmento de Klenow de DNA polimerase I (obtido no Tnkara Shuzo; futuramente aplicar-se-á o mesmo), e efectua-se a reacção à temperatura ambiente durante 1 hora tornando-se coincidentes as extremidades coesivas. Após extracção com fenol/clorofórmio, recuperou-se um fragmento de DNA de 1,6 pg por precipitação com etanol. Dissolveu-se este fragmento de DNA em 20 pl de tampão Y-100, adicionaram-se 10 unidades de EcoRI, efectuou-se a reacção de clivagem a 37°C durante 4 horas. Obteve-se a partir da mistura reaccional 1 pg de um fra& mento de DNA de 2,5 kb (fragmento * amHI (blunt)-EcoRI pelo método LGT.

Separadamente, dissolveram-se 2 pg de pCfTAl em 20 ul de tampão Y-100, adicionaram-se 10 unidades de EcoRI e efectuou-se a reacção de clivagem a 37°C durante h horas. Depois , adiciono u-se NaCl numa concentração de NaCl de 150 mM, adicionaram-se 10 unidades de Era I, e efectuou-se a reacção de clivagem a 37°C durante h horas. Depois de se ter confirmado que a clivagem estava concluída, por electroforese em gel de agarose, purificou-se e recuperou-se pelo método LGT um fragmento de DNA de 1,0 kb que continha cDNA de hu-CSF (fragmento ScoRI-Dral).

Dissolveu-se em 25 jãI de tampão Th ligase, 0,2 pg do fra^ mento BamHI (blunt¹¹ )-5coBI (2,5 kb) e 0,2 ji£ do fragmento ScoBI-Dra I (1,0 kb) cada um deles ootido segundo o procedimento anterior, adicionaram-se 6 unidades de DNA efectuou-se a reacção de ligação a h°C durante 18 horas.

Utilizou-se a mistura de plasmídeo recombinante obtida deste modo para transformar a 1. coli HB101, e obteve-se uma colónia Αρ^Γ. A partir de uma cultura de células derivadas desta cq lónia, recuperou-se um DNA plasmídico. Confirmou-se a estrutura do plasmídeo obtido, por electrofurese em gel de agarose, seguindo-se a clivagem com HindIII e rst I. 0 plasmídeo designou-se pCfTB20.

Exemplo 3

Construção dos plasmídeos que codificam os polioéotidos resultantes da substituição do aminpácido do N-terminal de hG-CSF, nomeadamente pCfTL23, pCfTL38, pÇfTL35 e .pCfTThl (Cf. Fig. 3),.

Dissolveram-se em 60 de tampão Y-100, 3 ug de pCSFl-2 ·>*

(4,5 kb) obtido pelo método do exemplo 1 de referência , adicionaram-se 8 unidades de cada um dos enzimas de restrição Apal (Boehringer Mannheim) e BamHI, e efectuou-se a reacção de clivagem a 37°C durante 3 horas. A partir desta mistura reaccional, obteve-se cerca de 0,4 jig de um fragmento de DNA de cerca de 1,5kb (fragmento Apal - BamI) contendo a maioria dos genes de hu-CSF.

Separadamente, dissolveram-se 2 jig de pGNLl /Sekine e outros: Proc. Natl. Sei, USA, 82, 4306 (I985) 7 (obtido de uma cultura de Ξ. coll IGSLl BP-629 pelo método convencional) em 40 jil de tampão Y-100, adicionaram-se 4 unidades de cada um dos enzimas de restrição HindIII, BamHI e PstI e efectuou-se a reacção de cli vagem a 37°C durante 3 horas. A partir da mistura reaccional obteve-se 0,5 de um fragmento de DN; de cerca de 1,7 kb (fragmen to PstI - BamHI) contendo o terminabr derivado de lipoproteína, pelo método LGT.

Separadamente, dissolveram-se 3 de pKYPlO preparado pe lo método descrito no pedido de Patente de invenção Japonesa (OPI) N2 IIO6OO/83 em 60 μΐ de tampão Y-100, adicionaram-se 6 uni dades de cada um dos enzimas de restrição BanIII (Toyobo) e PstI e efectuou-se a reacção de clivagem a 3/°C durante 3 noras. Obteve-se a partir da mistura reaccional 0,5 jig de um fragmento de DNA de cerca de 1,1 kb (fragmento BanIII - Pst 1) contendo o promotor de triptofano (Ptrp), pelo método LGT.

Por outro lado, tendo em consideração a necessidade de substituição do aminoácido do N-terminal do hG-CSF maduro, nomes damente, Thr, com Ser, Cys, Arg ou Gly e fornecimento, do codão de iniciação (ATG) necessário para expressão e, também, no sentido de ajustar a distância entre a sequência SD o ATG a juzante do

Ptrp para um comprimento adequado de 6-18 pb, e por outras razoes, sintetizou-se o adaptador de DNA de fórmula geral seguinte :

Ser mer (4mix) Cys

Arg

BaniII Eet Gly Pro Leu Gly

5'3'CG ATAAGCTf [Ãtg| |NGT| |ccÃ| |cTa| |gÕc| C -3'

TATTCGAA TAC NCA GGT GAT -5' mer (4mix)

Na qual, N representa uma base escolhida de u, A, T e C.

Primeiro sintetizaram-se os ENAs de cadeia simples de mer e 20 mer pelo método de fosfotriéster habitual. Eissolveram-se o 26-mer e 20-mer (20 picomoles de cada) em 40 pl de tampão de T4 quinase, adicionaram-se 6 unidades de polinucleótido T4 quinase (Takara Shuzo) e a reacção de fosforilação efectuou-se a 37°C durante 60 minutos.

Depois, dissolveram-se 0,3 pg de um fragmento Apal - BamHI derivado de pCSFl-2 (cerca de 1,5 kb), 0,2 pg do fragmen to BanIII-PstI derivado do vector de expressão phYlO (cerca de

1,1 kb), cada um deles obtido segundo o procedimento descrito antes, num total de 3θ pl de tampão de l4 ligase, e adicionou-se cerca de 1 picomole de adaptador de ΓΝΑ a solução da mistura.

Após adição posterior de 6 unidades de 14 DM ligase à sóLução e, efec tuou-se a. reacção de ligação a 4°C durante 18 horas.

Utilizou-se a mistura reaccional que continha o plasmídeo recombinante, para transformar a B. coli CÓGOSrÓ (FGRM BP-107G)

/'Cameron e outros: Proc. Natl. Sei, USA, £2, 3'416 (1975) J e ob· 3?

tiveram-se colónias Ap . A partir destes transformantes, separa ram-se e purificaram-se os DNAs plesmídicos por métodos conhecidos. Confirmou-se a estrutura de cada um dos DNAs plasmídicos por clivagem com PstI BcoRI e BanIII. seguindo-se electrofurese em gel de poliacrilamida. Os plasmídeos obtidos deste modo designam-se por pCfTL23? PCÍTL38, pCfTL35 θ pCfTLhl, conforme indi cado na Fig. 3. Confirmou-se pelo método de sequenciação didesoxi que as sequências na vizinhança do N-terminal dos genes dos derivados hG-CSF nos referidos plasmídeos eram as seguintes

	ket	Gly	Pro	Leu	Gly	Pro	Ala
PCÍ1L23	ATG	GGT	CCA	CTA	GGC	CCT	GCC
	Met	Ser	Pro	Leu	Gly	Pro	Ala
pCfTL38	ATu	AGT	CCA	CTA	GGC	CCT	GCC
	ket	Cys	Pro	Leu	Gly	Pro	Ala
pcfTL35	ATG	TGT	CCA	CTA	GGC	CCT	GCC
	ket	Arg	Pro	Leu	Gly	Pro	Ala
pCfTIÀl	ATG	CGT	CCA	CTA	GGC	r prn	GCC

A substituição da Thr do N-terminal do hG-CSF maduro confirmou-se no derivado hG-CSF codificado pelo pCfTL23, que e desi£ nado por hG-CSF£”Gly^ J, Do mesmo modo, confirmou-se a substituição do aminoácido do N-terminal pela Ser no derivado de hG-CSF codificado pelo pCfTL3tí, que é designado por hu-CSF/Cys^J⁷, e a substituição pela Arg no derivado de hu-CSí? codificado pelo pCfTLh-l, que é designado por hu-CSFZArg^ 7.

Bxemao / /

Exemplo 4

Construção dos plasmídeos pCfTM14, pCfTMl? e pCfTM113 que codificam os polipétidos resultantes da substituição do N-terminal e do terceiro dos aminoácidos de hG-C.SF

Dissolveram-se em 60 ml de tampão Y-100, 3 pg de pCCFl-2 (4,5 kb) obtido pelo processo do exemplo 1 de referência, adicio naram-se 8 unidades de cada um dos enzimas Apal e BamHI e efectuou-se a reacção de clivagem a 37°C durante 3 horas. A partir desta mistura reaccional obteve-se cerca de 0,4 pg de um fragmen to de DNA de cerca de 1,5 kb (fragmento Apal - BamHI), contendo a maior parte dos genes de hG-CSF, determinados pelo método de LGT.

Separadamente, dissolveram-se 2 pg de pGELl em 40 pl de Y-100, adicionaram-se 4 unidades de cada um dos enzimas de restrição fíindIII, BamHI e PstI, e efectuou-se a reacção de clivagem a 37°C durante 3 horas. A partir desta mistura reaccional obteve-se, pelo método LGT, 0,5 pg de um fragmento de DNA de cerca de 1,7 kb (fragmento PstI-BamHI) contendo o terminador lipoproteico.

Posteriormente, em separado, dissolveram-se 3 pig de pKYPlO preparado segundo o processo descrito no Pedido de Patente de Invenção Japonesa (OPI) ^TfQ 110600/83» em 60 pl de tampão Y-100, adi cionaram-se 6 unidades de cada um dos enzimas de restrição BanIII e PstI e efectuou-se a reacção de clivagem a 37°0 durante 3 horas. A partir desta mistura reaccional, obteve-se, pelo método LGT,cer ca de 0,5 jug de um fragmento ce DNA de cerca de 1,1 kb que contém

PtRp (fragmento BaniII - PstI).

Tendo em vista a necessidade de substituição do aminoácido Thr do iN-terminsl do hG-CSF maduro por Ser e do terceiro aminoácido Leu do hG-CSF maduro por uma de Gly, Ser, Cys e Arg e o fornecimento do codão de iniciação (ATG) necessário para a expres são e, considerando ainda a necessidade de se ajustar a distância entre a sequência SD e o ATG a jusante de Ptrp e o comprimento adequado de 6-18 bp θ, por outras razões, sintetizou-se o adaptaI dor de DNa: com a seguinte fórmula geral

(4mix) 26-mer	Met	Gly Ser Cys
Ser	Pro	Arg	Gly
5’ - CG ATA AGCTT	ATG	AGT	CCA	NGT	GGC C - 3
3' - TAT TCGaà	rp r*	TCA	GGT	NCA	- 5'

- mer (4-mix) na qual N representa uma das bases G, A, T ou C.

Em primeiro lugar sintetizaram-se pelo método do fosfotriéster habitual os DNA de cadeia simples de 26-mer e 2C-mer. Dissolveu-se 26-mer e 0 20-mer (20 piccmoles de. cada) , em M-0 μΐ de tampão T4 quinase, adicionaram-se 6 unidade de polinucleótido T4 quinase e efectuou-se a reacção de fosforilação a 37°^ durante 60 minutos.

Depois , dissolveu-se 0,3 dc fragmento Àpal-BamHI deri vado de pCSFl-2 (cerca de 1,5 kb), 0,2 pg do fragmento BamHI-PstI derivado da pGELl (cerca de 1,7 kb) e 0,2 ^ug do fragmento BanlII-Pstl (cerca ce 1,1 h.b) do vector de expressão pKYPlO, obtidos se-

gundo o processo descrito antes, em 3θ /*1 de tampão T4 quinase e adicionou-se a solução mista cerca de 1 picomole do ligante DNA-adaptador referido antes. Após posterior adição de 6 unidades de DNA Te ligase a solução, efectuou-se a reacção de ligação a

4·°0 durante 18 horas.

Utilizou-se a mistura de reacção que continha o plasmíd eo recombinante para transformar a E. coll CóCOSFS (F3RM BP-1070) relo método de Cohen e outros e obtiveram-se colónias Ap . A par tir destes transformantes separaram-se e purificaram-se os DNAs plasmídicos, por métodos habituais . Confirmou-se a estrutura de cada um dos referidos DNas plasmídicos por clivagem com PstI, Ecç I e BanIII seguindo-se a electroforese em gel de poliacrilami da. Os plasmídeos obtidos pelo método referido antes designaram-se por pCfTHlM-, pCfTM17 e pCfTM113, conforme se apresenta na Fig. 4. Confirmou-se, pelo método de sequenciação didesoxi utilizando o bacteriógrafo M13, que as sequências na vizinhança do N-terminal dos genes que codificam o derivado hG-CSF eram as seguintes:

	Met	Ser	Pro	Cys	Gly	Pro	Ala
pCfIM14 -	ATG	AGT	CCA	TGT	GGC	CCT	GCC
	Met	Ser	Pro	Arg	Gly	Pro	Ala
pCfTM17 -	ATG	AGT	CCA	CGT	GGC	CCT	GCC
	Met	Ser	Pro	Ser	Gly	Pro	Ala
pCfTM113 -	ATG	AGT	CCA	AGT	GGC	CCT	GCC
Confirmou-	se a	substituiç	ão de	Thr	do N-	terminal e do tercei
ro aminoãcido Leu do h	G-CSF	maduro por Ser	e Cy	s res	ipectivamente, no

derivado codificado pelo pCfTMlM-, que se designou por hG-CSF y

/Ser , Cys^J J. Do mesmo modo, a substituição do Thr do N-terminal e do terceiro aminoácido Leu por Ser e Arg, respectivamen te, confirmou-s'⁵ ro derivado codificado pelo pCfTMlh, que se designou por hG-CSF /~ Arg³_7, e a substituição do Thr da extremidade e do terceiro aminoácido Leu por Ser e Ser, respectivamente, no derivado codificado pelo pCfTM113, qus se designou por hG-CSF/ Ser¹, Ser³ ].

Exemplo 5 (1) Construção do plasmídeo recombinante pCfGDl (Cf. Fig.5)

Em 50 jul de tampão Y-1CC, dissolveram-se 5 pg de pCfTA. 1, obtido segundo o processo descrito no exemplo 1, adicionaram-se 10 uni dades do enzima de restrição StuI e 10 unidades do enzima de res trição BanIII (Toyobo) e, efectuou-se a reacção de digestão a 37°C durante 1 hora. A partir da mistura reaccional cbteve-se cerca de 0,5 ρζ de um fragmento de DNA com cerca de 1,3 kb que continha o cDNA de hG-CSF, (fragmento BanIII-StuI). Separadamen te, dissolveram-se 3 )ug de pKYP2Ó, produzido de acordo com o pro cesso descrito no exemplo 2, em ?C pl de tampão 7-100, adicionaram-se 6 unidades de BamHI e efectuou-se a reacção de digestão a 30°C durante 1 hora.

Adicionou-se um volume igual de fenol saturado com 10 mM de Tris-HCl (pH 7,5) θ 1 mM de EDTA. Após agitação vigorosa recolheu- se a camada aquosa por centrifugação a baixa velocidade (33OO rpm, 10 minutosj posteriormente utilizaram-se as mesmas condições). Adicionou-se um volume igual de clorofórmio e, após agitação vigorosa, recolheu-se a camada aquosa ror centrifugação a baixa velocidade. Adicionaram-se 410 volumes de acetato de sódio 3W, depois adicionaram-se 2,5 volumes de etanol e deixou-se a mistura em repouso a -20% durante 1 hora. Recolheu-se o precipitado por centrifugação arrefecida (4%, 11000 rpm, 10 minutos). Dissol veu-se este precipitado em 30 pl de tampão de Klenow e, adicionaram-se dATP, dTTP, dCIP e dGTP, cada um deles numa concentração de 100 pM, adicionaram-se 2 unidades de um fragmento de Klenow de DNA polimerase I, e efectuou-se a reac_yão a 17% durante 15 minutos. Inactivou-se o fragmento de Klenow de DKA polimerase I por tratamento a 68% durante 3θ minutos, e depois adicionou-se NaCl numa concentração de 100 mM, 5 unidades do enzima de restrição PstI, e a reacção de digestão efectuou-se a 37% durante 1 hora. A partir da mistura reaccional obteve-se, pele método de LGT cerca de 0,6 pg de um fragmento de DNA com cerca de 1.8 kb, contendo c terminador lpp Γ fragmento BamEI (blunt)-PstI Separadamente, dissolve ( *« -r-t -v -t \ . ak i *< » ** «rr /* j*. *1 · · - Λ e 10

PstI e efectuou-se a reacção de digestão a 37% durante 1 hora, e a partir da mistura reaccional, pelo método LGT, obteve-se 0,4 pg de um fragmento de DNA de cerca de 1 kb, contendo o promo tor de triptofano (fragmento BaniII - PstI).

Dissolveram-se 0,2 pg do fragmento 3anIII-StuI derivado pCfTAl (cerca de 1,3 nb), cerca de 0,1 ^ug do fragmento BamHI (em botado)-PstI derivado de pKYP2ó (cerca de 1,3 kb) e cerca de

0,1 pg do fragmento BanIJI-PstI derivado de pGLLl (cerca de 1 kb) em tampão de DKA T4 Ugase, adicionaram-se 4 unidades de DNA T4

ras

Utilizou-se a mistura reaccional para transformar a E, coli HB 101, obteve-se uma colónia Ap^r, e, recuperou-se, a partir desta colónia, o DNA plasmídeo, pelo método de Birnboim e outros referi dos antes. Obteve-se,assim o pCfWDl apresentado na Fig. 5· (2) 9onstru2ão_do_pCfT95K19_(çfx_Fig_i_6)

Dissolveram-se em 50 pl de tampão Y-100, 5 pg de pCfTLJ8 obtido segundo o procedimento do Exemplo 3, adicionaram-se 10 uni dades de cada um dos enzimas de restrição Hind III é BglII (ver Fig. 6) e efectuou-se a reacção de digestão a 37°C durante 1 hora. Obteve-se a partir da mistura de reacção, pelo método LGT, cerca de 0,7 pg de um fragmento de DNA de cerca de 2,6 kb contendo o promotor triptofano (fragmento HindlII-BglII (ver Fig. 6)). Sepa. radamente, dissolveram-se 100 pg de pCfTL38 em 1,5 ml de tampão Y-100, adicionaram-se 80 unidades de cada um dos enzimas de reja trição BamHI e HindlII e efectuou-se a reacção de digestão a 37°C durante 6 horas. A partir da mistura reaccional recuperou-se, pe, lo método LGT, um fragmento de DNA contendo cDNA de A hG-CSF, que se purificou utilizando EDUTIP^-d (Schleicher & Schuell). Dissol veu-se este fragmento num volume total de 90 pl de uma solução contendo 10 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 7 de MgCl^, 150 mM de NaCl e 6 mM de 2-mercaptoetanol (posteriormente referido como tampão Y-100), adicionaram-se três unidades do enzima de restrição Dpnl (Boehringer Mannheim) e efectuou-se a reacção de digestão a 37°C durante 15 minutos.A partir da mistura reaccional, obteve-se por electroforese em gel de poliacrilamida, cerca de 1 pg de um frag mento de DNA de cerca de 300 pb contendo o cDNA de hG-CSF (fragmento HindIII-Dpnl).

Separadamente, dissolveram-se cerca de 10 pg de pCfTB20 em 100 jil de tampão Y-100, adicionaram-se 10 unidades do enzima de restrição Aval e efectuou-se a reacção de digestão a 37°C, durante 1 hora. Dissclveu-se o DNA recuperado, a partir do DNA digerido, por extracção em fencl/cloroformio e precipitação com eta nol, em 30 pl de tampão de Klenow, adicionaram-se 2 unidades de um fragmento de Klenow de DNA polimerase I e, efectuou-se a reacção a 17° C durante 30 minutes. Inactivou-se o fra guento de Klenow de DNA polimerase I por tratamento a 6q⁰C durante 10 minutos, adiI cionou-se NaCl até 100 mM, 10 unidades do enzima de restrição

BglII e efectuou-se a reacção de digestão a 37°C, durante 1 hora.

A partir da mistura reaccional, obteve-se, pelo método de LGT, cer ca de 0,3 jag de um fragmento de DNA com cerca de 4ô0 pb contendo a porção de terminação Ipp /”fragmento Aval (blunt)-BglII J.

Dissolveu-se em 30 pl de tampão de T4 DNA ligase, cerca de

0,1 do fragmento HindIII-3glII derivado do pCfTL38 (cerca de

2,6 kb), cerca de 0,2 pg do fragmente HindlII-DpuI derivado do pCfTL38 (cerca de 300 pb) e cerca de 0,15' p~ dc fragmento Aynl (blunt)-BglII derivado do pCfTB2C (cerca de 480 pb), cada um le les obtido segundo o método anterior e, após adição de 4 unidades de T4 DNA ligase efectuou-se a reacção de ligação a 4°C durante horas.

Utilizou-se a mistura reaccional para transformar E. coli HB101 e obteve-se uma colónia Αρ^Γ. A partir desta colónia, recuperou-se o DNA plasmídico pelo método de Birnboim e outros, referido antes. Obteve-se, assim, o pCfT95K19 apresentado na Fig. 6.

(3) Construção do pCfAAl (Cf, Fig. 62

Dissolveram-se em 5Ό pl de tampão Y-1CC, 5 ]λ(ζ de pC ^9513.9

obtido conforme descrito na alínea precedente. Adicionaram-se 7 unidades do enzima de restrição 3anilI (Tcyobo) e 2 unidades de Bgll (Nipon Gene), e efectuou-se a reacção de digestão a 37°C, durante 1 hora. A partir da mistura reaccional, obteve-se, pele método LGI, cerca de 0,6 pg de um fragmento de DNA de cerca de 1 kb contendo a fraeção do promotor de triptefano (fragmento BanlII-Bgll) e cerca de 1 de um fragmento de DNA de cerca de 1,8 xb contendo a porção de terminação Ipp (fragmento _11 —Bglj.) ·

Separadamente, dissolveram-se 15 pg de pCfT95K19 em 150 pl de tampão Y-100, adicionaram-se 6 unidades do enzima de restrição Bgll (Nipon Gene) e 1C unidades de Sau3A e efectucu-se a reacção de digestão a 37°^G durante 1 hora, a electrofurese em gel de poli acrilamida da mistura reaccional proporcionou 0,3 pg de um fragr.en to de DNA contendo a porção de cDNA do hG-CSF, de cerca de 350 pb (fragmento Jrll-Sauerj.

Depois, separadamente, sintetizou-se o ada tador de DNA,se guinte:

Banll!

3'39 mer (2mix) • CGATAAGCTT

TATTCGAA

Met	Thr	Pro	Leu	Gly	Pro	Aoíl
AIG	ACA	CCA	r* CTU	GGC	CCA	AAC
TAC	TGT	GGT	GA?	CCG	GGT	TTG

TGG (2mix) mer xhol

Ser

Sau3A

Ser

AGT CT

-3’

AGC I

CA GACTAG-5’

Primeiro sintetizaram-se os de cadeia simples de

39-mer e 41-mer pelo método de fesfotriester padrão. Dissolveu-se o 39-mer e 41-mer (20 picomoles de cada) num volume total de 40 ul de tampão TA DNA ligase, adicionaram-se 6 unidades de Te- poli-

nucleótido quinase (Takara Shuzo), e efectuou-se a reacção de fo_s forilação a 37°C, durante 60 minutos.

Depois, dissolveram-se 0,1 pg do fragmento BanIII-BglI derivado de pCfT9%19 (cerca de 1 kb), 0,05 pg do fragmento Bgll-Bgll (cerca de 1,8 kb) e 0,1 pg do fragmento BglI-Sau3A (cerca de 350 pb), cada um deles obtido segundo o procedimento anteriormente referido, em 25 pl de tampão de T4 DNA. ligase, seguindo-se 2 picomoles do adaptador de DNA anterior.

Após adição posterior de 6 unidades de T4 DNA ligase, efeç_ tuou-se a reacção de ligação a 4°C durante 18 horas.

Utilizou-se a mistura reaccional para transformar a E.coli HB101 , obteve-se uma colónia Ap^r e, recuperou-se o DNA plasmídico a partir desta colónia pelo método de Birnboim e outros referido antes. Obteve-se,assim o pCfAAl apresentado na Fig. 6. A determinação da sequência de base da porção do adaptador de pCfAAl pe. lo método de sequènciação didesoxi referido antes, revelou que a terceira base do codão que codifica parado quarto aminoácido Leu é A. Neste pCfAAl, falta a porção de DNA que codifica para os 14 aminoácidos a partir do 102 aminoácido Pro até ao 23² aminoáci do Lys do hG-CSF. Mais tarde, introduziu-se esta mutação para substituir-se o 62 aminoácido do hG-CSF Ala por Asn, dando origem a um novo sítio Xhol.

(4) Oonstrução_do_]3CfAB5 (çf. Fig._6)

Em 30 pil de tampão Ϊ-100 dissolveram-se 3 pg de pCfAAl obti do conforme descrito na alínea anterior, adicionaram-se 5 unidades do enzima de restrição Xhol, e efectuou-se a reacção de digestão a 37°C durante 1 hora. Após ter-se confirmado que a clivagem de Xhol

estava completa, por electrofurese em gel de a^arose, adicionou-se 1 unidade do enzima de restrição Bgll (Nippcn Gene) e e ectucu -se a digestão parcial a 37 C durante 25 minutos. Λ partir da mis tura reaccional, obteve-se, pelo métcdo LGT, c^rca de 1 pg de uir. fragmento de DNA de cerca de 3 Kb contendo a porção de terminação Ipp e a porção do promotor de triptofano (fragmento Xhol-Bgll. Separadamente, sintetizou-se o adaptador DNA seguinte:

Xhol

Ser Ser Leu Pro Gin Ser Phe Leu

TCG AGT CTA CCA CAG AGG TTC CT

CA GAT GGT GTC TCG AAG GAAAATTT

Ψ mer mer

/Cys\ Ser
	'Gly /
Leu Lys	Arg Leu Glu
TTTA AAri	NGG TTÀ GAG
T	NCG AAT CTC

Sau3A

Gin Vai Arg Lys

CAA GTG AGG AAl--GTT GAC TCC TTCTAG

Ψ’ mer (4-mix) mer (4-mix) em que N representa G, A, 1 ou C.

Este adaptador de D2JA contém a porção DNA que codifica para os 14· aminoácidos de hG-CSF a partir do 10 2 aminoácido Pro até 232 aminoácido Lys. Esta porção faltava no cDNA de hG-CSF de pCfAAl.

Primeiro, sintetizaram-se os DNAs de cadeia simples de 27-mer, 25-mer (duas espécies) e 23-mer, pelo método do fosfotriéster habitual. Dissolveram-se os pares de DNAs de 27-mer e

25-mer complementares eos DNAs de 25-mer a 23-mer complementares, numa quantidade de 20 picomoles de cada, num volume total de

4-0 de tampão de T4 ções quinase; adicionaram-se a cada uma das solu unidade de T4· polinucleotidoquinase (Takara Shuz-o), e efec tuou-se a reacção de fosforilação a 37°C durante 6C minutos.

Depois, dissolveu-se 0,1 ^tg do fragmento xhol-BglI deriva do de pCfAAl (cerca de 3 hb) obtido conforme descrito antes e 0,1 pg do fragmento Bgll - Sau3^ derivado de pCfT9K19 (cerca de 350 pb) obtido conforme descrito na alínea anterior, em 30 jul de tampão 14 DNA ligase, e adicionaram-se 2 pieomoles de cada uma das porções do adaptador de DNA anterior a solução mista. Fosteriormente, adicionaram-se 6 unidades de T4 DNA ligase e efectuou-se a reacção de ligação 94°C, durante 18 horas.

Utilizou-se a mistura reaccional para transformar E. coli HB101 e obtiveram-se colónias Ap . A partir destas colónias, recuperarm-se os DNAs plasmídicos pelo método de Birnboim e outros referido antes. Obtiveram-se, assim, pCfmB^ e pCfAB14 apresentados na Fig. 6. A determinarão da sequência de bases da fracção do adaptador de DNA de pQfxB5 e de pCfAB14, pelo método de sequêncieção didesoxi referido antes, revelou que a primeira base de codão que codifica para ο 17^δ aminoácido é A no pCfAB? e T no pCfAB14, pelo que o referido codão é, para Ser, (AGT) no primeiro e, para Cys, (TGC) no último, conduzindo a substituição por Ser para o 17^e aminoácido Cys do hG-CSF maduro no pdABy, mas „não havendo qualquer substituição no pCfABl+.

Exemplo. 6 (1) Construção do pCfBAg e do pCfBA32 (Cf. Fig. 7)

Em 4C de tampão ¥-100, dissolveram-se 3 pg de pCfAB5 obtido conforme descrito no exemplo anterior, unidades de cada um dos enzimas de restrição

BglII e efeç f**

tuou-se a reacção de digestão a 37°C durante 1 hora. A partir da mistura reaccional obteve-se ,pelo método LGT, cerca de 1 pg de um fragmento de DNA de cerca de 2,6 kb que continha a porção de terminação lpp e a porção do promotor de triptcfano (fragmento Aval - BglII).

Separadamente, dissolveram-se 6 pg de pCfWDl obtido con forme descrito no exemplo 1 em $Q pl de tampão Y-100, adicionaram -se 5 unidades de enzima de restrição BglII e efectuou-se a reac. ção de digestão a 37°C durante 1 hora. A electroforese em gel de agarose confirmou que a clivagem com BglII estava completa. Depois disso, adicionaram-se 3 unidades de enzima de restrição Aval e efeç. tuou-se a clivagem parcial a 37°C durante 20 minutos. A partir da mistura reaccional obteve-se, pelo método LGT, 0,4 yig de um fra_g mento de DNA (cerca de 1,3 kb) contendo a maior parte de hG-CSF (fragmento BglII-Aval).

Depois dissolveram-se 0,1 pg do fragmento Aval - BglII derivado de pCfÀB5 (cerca de 2,8 kb) e 0,3 pg do fragmento BglII-Aval derivado de pCfWDl (cerca de 1,3 kb), cada um deles obtido conforme descrito antes, em 25 /1 de 14- DNA ligase e, a reacção de ligação efectuou-se a 4 0 durante 18 horas.

Utilizou-se a mistura reaccional para transformar E.coli HB101 e obteve-se uma colonia Ap . A partir desta colonia, recupe_ rou-se o DNA plasmídico pelo método de Birnbcim e outros, referido antes. Obteve-se ass.im,o pCfBA8.

A sequência aminoácida do derivado hG-CSF codificado pelo pCfE8 contém Asn no lugar do 62 aminoácido Ala de hG-CSF maduro e Ser em lugar do 17² aminoácido Cys do referido hG-CSF. Posterior mente referir-se-á este derivado por hG-CSF /”NA8 7,

Por outro lado, dissolveram-se 3 pg de pCfAB14, obtido

conforme descrito anteriormente, em 40 pl de tampão Y-100, adicio naram-se 5 unidades de cada um dos enzimas de restrição Aval e Bgll, e efectuou-se a reacção de digestão a 37°C durante 1 hora. A partir da mistura reaccional obteve-se, pelo método LGT, cerca de 1 pg de um fragmento de DNA de cerca de 2,8 kh contendo a porção de terminação lpp e a porção do promotor de triptofano (fragmento Aval - BglII).

Separadamente, dissolveram-se 6jug de pCfWDl obtido confor me descrito no Exemplo 1, em 50 pl de tampão Y-100, adicionaram-se 5 unidades do enzima de restrição BglII e efectuou-se a reaç ção de digestão a 37°C durante 1 hora. Após ter-se confirmado que a clivagem do BglII estava completa, por electroforese em gel de agarose, adicionaram-se 5 unidades do enzima de restrição Aval e efectuou-se a clivagem parcial a 37°C durante 20 minutos. A partir da mistura reaccional , obteve-se, pelo método LGT, 0,4 jig de um fragmento de DNA (cerca de 1,3 kb) contendo a maioria do cDNA de hG-CSF (fragmento BglII - Aval).

Depois, dissolveram-se 0,1 pg do fragmento Aval - BglII derivado de pCfÀB14 (cerca de 2,8 kb) e 0,3 pg do fragmento BglII - Aval derivado de pCfWDl (cerca de 1,3 kb), obtidos con forme descrito antes, em 25 pl de tampão T4 DNA ligase, adicio naram-se 3 unidades de T4 DNA ligase e a reacção de ligação efec. tuou-se a 4°C durante 18 horas.

Utilizou-se a mistura reaccional para transformar E. coli HB101 e obteve-se uma colónia Ap¹”, e, a partir desta colónia recuperou-se o DNA plasmídico pelo método de Birnboim e outros,referido? antes. Obteve-se assim o pCfBA32 apresentado na Fig.7 A sequência de aminoácidos do derivado de hG-CSF codifi cado por pCfBA32 contém Asn no local do 62 aminoácido Ala de hG-CSF

maduro.

(2) Construção do pGfbBlOl

Em 50 pi de tampão Ϊ-100 dissolveram-se 6 ^ig de pCfb/8 obtido conforme descrito anteriormente , adicionaram-se 10 unidades do enzima de restrição BanIII (Toyobo), 8 unidades de BglII e 8 unidades de XhoI, e efectuou-se a reacção a 37°6 durante 1 hora. A partir da mistura reaccional obtiveram-se, pelo método

I.GT, cerca de 0,6 jig de um fragmento de DBA de cerca de 1,4 kb contendo cDNA de hu-GSF (fragmento Xhol - BglII) e cerca de 0,8 ^ig de um fragmento de ΓΝΑ de ce^ca de 2,7 kb contendo a porção do promotor de triptofano (fragmento BanIII - BglII).

Separadamente, sintetizou-se 0 adaptador de DNA seguinte:

Ahol

BanIII

3'31 mer

TATTGGAA TAC

Met

5'-CGATAAGCTT ATG

Al a	Pro	Thr	Arg	Ser
GCA	GCA	ACA	AGA	AGG
C.iT	GGT	m rm xux	TGT	TGG

Ala

GCG

CGG AGGT

3.5 mer

-3'

Sm primeiro lugar sintetizaram-se os DNAs de cadeia sim pies 31-mer e 33~mer, pelo método habitual do fosfotriéster. Dissolveu-se 31-mer e 33-mer (2 de cada) num total de 40 pl de tampão de T4 quinase, adicionaram-se 3θ unidades de T4 polinucleótido quinase (Takara Shuzo) e efectuou-se a reacção de fosforilaçao ? 37° 0 durante 60 minutos.

Depois, dissolveram-se 0,1 jig do fragmento BanIII - BglII derivado de pCfBAS (fragmento de cerca de 2,7 kb) e 0,1 pg do

fragmento Xhol - BglII derivado de pCfBAo (fragmento de cerca de 1,4 kb), em 25 pl de tampão T4 DNA ligase, adicionaram-se cer ca de 2 picomoles do adaptador de T.NA anterior à mistura em solução. Após adição posterior de 6 unidades de T4 DNA ligase, efectuou-se a reacção de ligação a 4°C durante 18 horas.

Utilizou-se a mistura plasmídica recomfcinante, assin obtida, para transformar 3. coli ΗΒ101 e obteve-se uma colónia Ap . A partir duma cultura de células destat colónia, recuperou-se o DNA plasmídico. Obteve-se, deste modo, o pCfEBlOl apresentado na Big. 7. A sequência de aminoácidos do derivado hG-i.£F codificado pelo pcfEnlOl contém Ala, Thr, Arg, Ser e Ser no local do 12 aminoácido Thr, do 32 aminoácido Leu, do 42 aminoacido uly, do 52 aminoécido Pro e do 17^s aminoácido Cys do hG-C-SF maduro, respectivamente. Posteriormerte referir-se-à este derivado como hG-CSF zTNBlOl 7, (3) Construção de pC^fEcLb2E1? pCfkC45, pC.fBC52, pCfhC59_? pCfBC76, pCfBC77, pCf£C93, PCÍBC95 e pCfBC97 (Cf. Fig.8)

Sm primeiro lugar sintetizaram-se adaptadores de DNA seguintes:

mer (128mix)

BaniII

5’-CGATAAGCTT ATG

3'-rATTCGAA TAC NNA GG ÍNT TCT

Xhol c

Met-(16)-Pro-(8)-Arg

HNT CGA $ÍA AGA

I c ¹ mer (12ômix)

Neste adaptador de DNA de síntese, N representa cada uma

das três bases seleccionada, independentemente, entre A, G,T e C e uma das cases é G ou / (no caso da 31-mer) ou C ou T (no caso da 33-mer) e, portento obteve-se este adaptador como uma mis, tura de um total de 128 adaptadores de DNA . Como resultado a estrutura deste adaptador é tal que, na sequência de aminoácidos do N-terminal codificada por este adaptador, são possíveis 16 aminoácidos diferentes como o aminoácido a seguir a Met e 8 aminoácidos diferentes como o aminoácido a seguir a Pro, pelo que sao possíveis, no total, 128 sequências de aminoácidos.

Primeiro, sintetizaram-se os DNAs de cadeia simples de 31-mer e 33-mer pelo método habitual do fosfotriéster. Dissolveu-se 31~πιθ^Γ θ 33^-nier (2 pg de cada) num volume total de 40 pl de tampão de T4 quinase, adicirnaram-se 30 unidades de T4 polinucleótido quinase (Takara Shuzo ) e a reacção de fosforilação efectuou-se a 37° C durante 60 minutos.

Depois dissolveram-se 0,1 p? do fragmento BanIII - BglII derivado do pCfhiô (fragmento de cerca de 2,7 kb) e 0,1 jig do fragmento Xhol - BglII derivado do pCfBAS (fragmento de cerca de

1,4 kb), obtidos no exemplo 6, em 25 pl de tampão T4 ΓΝΑ ligase e adicionou-se à mistura solúvel cerca de 2 picomoles do adaptador de DNA anterior. Após adição posterior de 6 unidades de T4 DNA ligase, efectuou-se a reacção de ligação a 4°C durante 18 horas.

Utilizou-se a mistura plasmídica recombinante assim obtida para transformar E. coli HB101 e obtiveram-se colónias Ap^r.

A partir de culturas de células destas colónias recuperaram-se os DNAs plasmídicos . Obtiveram-se deste modo, pCfBC42Bl, pCfEC45, PCfBC52, pCfBC59, PCÍBC76, PCÍBC77, pCfB093, pCfBC95 e pCfBC97.

A determinação da sequência de bases em cada fracção do adaptador de DNA pelo método de sequenciação didesoxi, referido antes, revelou que as sequências de bases no lado do N-terminal dos derivados hG-CSF são as seguintes:

	Met	Thr	Pro	Glu	Lys	Ser	Ala
PCÍBC42Ê1	ATG	ACT	CCA	GAA	AAA	AGC	GCC
	Met	Vai	Pro	Ile	Arg	Ser	Ala
pCfbC45	ATG	GTT	CCA	ATA	AGA	AGC	GCC
	Met	Cys	Pro	11 e	Arg	Ser	Ala
pCfDC52	ATG	TGT	CCA	ATA	AGA	AGC	GCC
	Met	Tyr	Pro	Ile	Arg	Ser	Ala
pCfBG59	ATG	TAT	CCA	ATA	AGA	AGC	GCC
	met	Arg	Pro	Thr	Arg	Ser	Ala
pCfBC7ó	ATG	CGT	CCA	ACA	AGA	AGC	GCC
	Met	Thr	Pro	Thr	Arg	Ser	Ala
pCfBC77	ATG	ACT	CCA	ACA	AGA	AGC	GCC
	Met	Asn	Pro	Glu	Arg	Ser	Ala
PCÍBC93	ATG	AAT	CCA	GAA	AGA	AGC	GCC
	Met	Ile	Pro	Thr	Arg	Ser	Ala
pCfBC95	ATG	ATT	CCA	ACA	AGA	AGC	GCC
	Met	Ser	Pro	Thr	Arg	Ser	Ala
pCfBC97	ATG	AGT	CCA	ACA	AGA	AGC	GCC

Os resíduos de arainoácidos substituintes nos derivados de hG-CSF codificados por estes plasmídeos são respectivamente, comparados com o hG-CSF maduro, conforme segue:

Posição da substituição aminoácido (aminoácido de hG-CSF)

Plasmídeo_	Ifi (Thr)	32 _(Leu)	4°	52 _(£γο)_	17a (Cys)
pCfBC42Bl	-¥	Glu	Lys	Ser	Ser
pCfBC45	Vai	Ile	Arg	Ser	Ser
pCfBC52	Cys	Ile	Arg	Ser	Ser
pCfBC59	Tyr	Ile	Arg	Ser	Ser
pCfBC76	Arg	Thr	Arg	Ser	Ser
pCfBC77	-¥	Thr	Arg	Ser	Ser
pCfBC93	Asn	Glu	Arg	Ser	Ser
pCfBC95	Ile	Thr	Arg	Ser	Ser
pCfBC97	Ser	Thr	Arg	Ser	Ser

¥ - não houve substituição

Os derivados hG-CSF codificados pelo pCfBC42Bl, pCfBC45, pCfBC52, pCfBC5% pCfBC56, pCfBC77, pCfBC93, pCfBC95, e pCfBC97 referir-se-ão, posteriormente, como hG-CSF /~NC42B1hG-CSF 7NC45 7, hG-CSF ZNC52.7, hG-CSF ΖΉΟ59 7, hG-CSF 7NC76 7, hG-CSF 7 NC77 7, hG-CSF Z‘NC93 7, hG-CSF 7NC957, hG-CSF 7NC97 7, respectivamente.

(4) Construção de pCfBD28, 22ίΒρ56_θ_22^®ί^!θ2

Em primeiro lugar, sintetizou-se o adaptador de DNA seguinte:

mer (256mix) Xhol

BanIII Met Ala Pro (4) (4) (4)

5' -jcGATAAGCTT ATG GCA CCA NCA NAT NGC

3’-TATTCGAA TAC CGT GGT NGT NTA NCG (4)

CNG AGCT ®er (25ómix) (em que N representa G, A, T e C)

Neste adaptador de DNA, as quatro bases representadas por

N são seleccionadas, independentemente, entre G, A, T ou C e, por consequência, o adaptador obtém-se como uma mistura de um total de 256 adaptadores diferentes de DNA. Como resultado, a estrutu ra deste adaptador de DNA é t<-l que a sequência de aminoácidos de hG-CSF no N-terminal codificada pelo adaptador de DNA são possíveis quatro aminoácidos para cada uma das quatro posições em questão, pelo que são possíveis 256 sequências de aminoácidos di ferentes.

Primeiro, sintetizaram-se os DNAs de cadeia simples 31-mer e 33-mer pelo método habitual do fosfotriéster. Num total de 40 pl de tampão T4 quinase, dissolveram-se 2 jig de 31-mer e 33-mer adicionaram-se 30 unidades de l4 polinucleótico quinase (Takara Shuzo) e efectuou-se a reacção de fosforilação a 37°C durante 60 minutos.

Depois, dissolveram-se 0,1 pg do fragmento BanIII - BglII derivado de pCfBAÓ (fragmento de cerca de 2,7 kb) e 0,1 jug do fragmento Xhol - BglII derivado de pCfBA8 (fragmento de cerca de

1,4 kb), obtidos no exemplo 6, em 25 jil de tampão de T4 DNA ligase e, adicionou-se à mistura solúvel cerca de 2 picomoles de adaptador de DNA anterior. Após adição posterior de 6 unidades de T4 *+9

DNA ligase, a reacção de ligação efectuou-se a *+⁰C durante 13 horas.

Utilizou-se a mistura plasmídica recombinante obtida pa ra transformar E. coli HB101 e obtiveram-se colónias Αρ^Γ. A par tir de uma cultura, de células destas colónias isolaram-se os plasmídeos , pCf£D28, pCBD5ó e pCf£D32 respectivamente. A deter minação da sequência de bases da fracção do adaptador de DNA revelou que a sequência de bases do lado do N-terminal dos derivados hG-CSF era a seguinte:

	Met	Ala	Pro	Thr	Tyr	Arg	Ala
pCfED28	ATG	GCA	CCA	ACA	TAT	CGC	GCC
	Net	Ala	Pro	Ser	Asn	Ser	Ala
pCfBD5ó	ATG	GCA	CCA	TCA	AAT	AGC	GCC
	het	Ala	Pro	Pro	Asn	Arg	Gly
pCfBD82	ATG	GCA	CCA	GCA	AAT	CGC	GGC

A substituição dos resíduo de aminoácidos nos derivados de hG-CSF codificados por estes plasmídeos quando comparada com o hG-CSF completo é a seguinte:

Posição da substituição de aminoácido (aminoácido de hG-CSF)	pCfBD23	Plasmídeo pCfBDÇó	£C fBl
12 (Thr)	Ala	Ala	Ala
32 (Leu)	Thr	Ser	Pro
M (Gly)	Tyr	Asn	Asn
52 (Pro)	Arg	Ser	Arg
62 (Ala)		-X	Gly
72 (Cys)	£er	Ser	Ser

* não houve substituição

Os derivados de hG-CSF codificados por pcf3D28, pCfBDJjó, pCfBD82, referir-se-ão daqui par diante pa? nG-CSFZ^UDSS J⁷, hG-LSFZ*ND56 J7, hG-CSF/LT^ .7, respectivamente. Uma estirpe de S. coli que alberga, o pGfBDÇó, 2. coli ECfBB^ó, e uma estirpe de E. coli que alberga o pCfBD28, 3. coli ECfBD28, foram depositados no Fermentation Research Institute com os números de depósito FERM BP-1221 e FSBM-1+79, respectivamente, de acordo com o tratado de Budapeste.

(5)

Construção do pCfTNS7 (cf. Fig. 14)

Sintetizou-se o ligante adaptador de LTTA seguinte:

mer

BanIII xhol

5'3'•CGATAAGCT

TATTCGA

Ψ

Met Pro /la
ATG CGA GCC	-3’
TAC CGT CGG	AGGT
	V
20 mer

De acordo com o esquema deste adaptador de LUA, faltam os quatro aminoácidos desde ο l^e aminoácido Thr até ao quarto aminoácido Gly da sequência de aminoácidos do B-terminal de hG-CSF na sequência de aminoácidos do N-terminal codificado pelo adaptador.

Primeiro, sintetizaram-se os DNAs de cadeia simples com 18-mer e 20-mer pelo método habitual do fosfotriéster. Eissolveu-se 18-mer e 20-mer (2 jug de cada) num total de 4o pl de tampão T4 quinase, adicionaram-se 30 unidades de T4 polinucleótido quinase (Takara Shuzo) e efectuou-se a reacção de fosforilação a 37°c du21 rante 60 minutos.

Depois dissolveram-se 0,1 pg do fragmento BaniII - EglII derivado de pCfBAS (fragmento de cerca de 2,7 kb) e 0,1 pg do fragmento Xhol-BglII derivado de pCfBA-S (cerca de 1,4 kb), cada um deles obtido no exemplo 6, em 25 pl de tampão de 14 DNA ligase, adicionou-se a solução da mistura cerca de 2 picomoles do adaptador de DNA anterior, e efectuou-se a reacção de ligação a 37°C durante 18 horas.

Utilizou-se a mistura plasmídica recombinante obtida deste modo para transformar E. coli HB101 e obteve-se uma colónia Αρ^Γ. A partir de uma cultura de células desta colónia isolou-se o DNA plasmídieo. Obteve-se, assim o pCfTNS7. Daqui em diante o derivado de hG-CSF codificado pelo pCfTNS7 será referido por hG-CSFΖΔ1-48 7.

(6) Construção do pCfTAArg4S (cf. Fig. 14)

Sintetizou-se o adaptador DNA seguinte:

mer (4mix)

BanIII

N.et

5'-4'

CGATAAGCTT ATG

ΤΓ’γπ

GU

Thr

A CA

Pro	Leu	Glu	Pro	A ls
CCA	CIA	kkp gga	CCA	GCC	-
GGT	uAT		GGT	CGGAGCT

3' mer (4mix)

Áhol

Neste adaptador de DNA, duas bases são seleccionadas, independentemente, entre A ou G, pelo que o referido adaptador se obtám sob a forma de uma mistura de um total de quatro adapV----'f (

tadores de DNA. Por isso, a estrutura deste fragmento de DNA é tal que são possíveis quatro aminoácidos na posição do 4^ amino ácido de N-terminal da sequência de aminoácidos de hG-CSF codifi cada pelo referido fragmento.

Em primeiro lugar, sintetizaram-se os DNAs de cadeia sim pies 51-mer e 55-mer pelo método habitual de fosfotriéster. Dissolveu-se 51-mer e 55-mer (2 Jig de cada) num volume total de 40 pl de tampão de T4 quinase, adicionaram-se 50 unidades de T4 pollnucleótido quinase (Takara Shuzo), e efectuou-se a reacção de fosforilação a 57°C durante 60 minutos.

Depois¹, dissolveram-se 0,1 pg do fragmento BglII-BanIII derivado do pCfBA8 (fragmento de cerca de 2,7 kb) e 0,1 pg do fragmento Xhol-BglII derivado de pCfBA8 (fragmento de cerca de

1,4 kb), obtidos segundo descrito na secção 1 e, adicionaram-se à mistura solúvel cerca de 2 picomoles do adaptador DNA anterior mente descrito. Após adição posterior de 6 unidades de T4 DNA ligase, efectuou-se a reacção de ligação a 4°C durante 18 horas.

Utilizou-se a mistura plasmídica recombinante obtida pa ra transformar E. coli HB101 e, obteve-se uma colónia de Ap^r. Is£ lou-se a partir de uma coluna de células desta colónia o plasmí deo, pCfTAArg4S. A determinação da sequência de bases da.fracção do adaptador de DNA pelo método de sequenciação didesoxi, re. ferido antes, revelou que a sequência de bases do N-terminal do derivado de hG-CS-^ era a seguinte:

Met 'Thr Pro Leu Arg Pro Ala pCí‘TAArg4S ATG ACA CCA CTA AGA CGA GCC

Daqui em diante, referir-se-á o derivado de hG-CSF codificado por pCfTAArg4S como hG-CSF /^Arg^jSer¹?

/ ί

χ (7) Construção do pCfTN205 (cf. Fig. 15).

Em 40 pl de tempão K-l^O (idêntico ao tempão Y-100 exce£ to na substituição de 1J0 mM de KC1 por 100 mM de NaCl), dissolveram-se 3 pg de pCfTNS7 obtido na secção 5? adicionaram-se 5 unidades de cada um dos enzimas de restrição Pvul e Xhol e efectuou-se a reacção de digestão a 37°C durante 1 hora. A partir da mistura reaccional obteve-se, pelo método de LGT, cerca de I 0,5 pg de um fragmento de DNA de cerca de 1,0 kb contendo a porção do promotor de triptofano (fragmento Pvul-Xhol).

Separadamente, dissolveram-se 3 jig do pCfBA32, obtido na secção 1, em 40 pl de tampão B.-150, adicionaram-se 5 unidades de cada um dos enzimas de restrição Pvul e Xhol e efectuou-se a reacção de digestão a 37° 6 durante 1 hora. A partir da mistura reaccional, obteve-se, pelo método LuT, 2 pg de um fragmento de DNA de cerca de 3,1 kb (fragmento Xhol-Pvul) contendo a maior quantidade de ΓΝΑ de hu-CSF.

Depois, dissolveram-se 0,1 pg do fragmento Pvul-Xhol derivado do pCfTNS7 (ce^ca de 1,0 kb) e 0,3 pg do fragmento Xhol-Pvul derivado do pCfõA32 (cerca de 3,J kb), obtidos segundo 0 método anterior, em 25 pl de tampão de T4 DNA ligase adicionaram-se 3 unidades de T4 DNA ligase e, efectuou-se a reacção de ligação a 4°C durante 13 horas.

Utilizou-se a mistura reaccional para transformar E. coli T»

HB101, obteve-se uma colónia Αρ e, isolou-se DNA plasmídico a partir desta colónia pelo método de Birnboim e outros, referido antes. Obteve-se assim o pCfTB205 apresentado na Fig. 15.

Na sequência de aminoácidos do derivado de hG-CSF codi-

ficado por pCfTN205, faltam os aminoácidos desde o l^e até ao M do hG-CSF completo. Daqui em diante referir-se-á.este derivado como o hG-CSF Δ1A J, (8) Construção do pCfTAArg^- (cf. Fig. 15)

Sm 40 pl de tampão n-150, dissolveram-se 3 pg de pCfTAArgLS obtido na secção 6, adicionaram-se 5 unidades de cada um dos enzi mas de restrição Pvuí e Xhol, e efectuou-se a reacção de digestão a 37°C durante 1 hora. A partir da mistura reaccional, obteve-se, pelo método de LGT, cerca de 0,5 pg de um fragmento de DNA de cer ca de 1,0 kb contendo a porção do promotor de triptofano (fragmen to Pvul-Xhol).

Separadamente, dissolveram-se 3 pg de pCfLA32 obtido na secção 1 em +0 pl de tampão n-150, adicionaram-se 5 unidades de cada um dos enzimas de restrição Pvuí e xhol, e efectuou-se a re~ O acçao de digestão a 37 C durante 1 hora. A partir da mistura reaccional, obteve-se, pelo método de LGT, 2 jig de um fragmento de DNA de cerca de 3>θ kb (fragmento Ahoi - Pvul) contendo a maioria do cDNA de hG-CSF.

Lepois, dissolveram-se 0,1 pig do fragmento Pvul-Ahol deri vado do pCfTAArghS (cerca de 1,0 kb) e 0,3 pg do fragmento Xhol-Pvul derivado do pCfBA32 (cerca de 3?U kb) , obtidos segundo o modo descrito antes, em 2f pl de tampão de Th LUA ligase, adicionaram-se 3 unidades de Th DITA ligase e efectuou-se a reacção de liga ⁰ r, ção a 4 0 durante 18 horas.

Utilizou-se a mistura reaccional para transformar fí. coli HB101, obteve-se ^uma colónia Ap^r e isolou-se o DNA plasmídico a partir des.

ta colónia pelo método de Birnboim e outros, referido antes. Obteve-se, deste modo, o pCfTAArg4 apresentado na Fig. 15.

quarto aminoácido na sequência de aminoácidos do derivado de hG-CSF codificada pelo pCfDlArgk é Arg em lugar de Gly do hG-CSF completo. Daqui em diante, este derivado designa-se por hG-CSF/ Arg^ J⁷.

(9) Construção do pCfTNS3Ol (cf. Fig. 16).

I

Em 50 pl <3e tampão Ϊ-100, dissolveram-se 6 pg de pCfBAô obtido na secção 1, adicionaram-se 10 unidades do enzima de restrição HindIII e 8 unidades de BglII, e efectuou-se a reacção de digestão a 37°C durante 1 hora. Obteve-se a partir da mistura reaccional, pelo método de LGT, cerca de 0,6 pg de um fragmento de DOA de cerca de 1,4 kb contendo cLMA de hu-CSF (fragmento HindIII - BglII) .

Depois sintetizou-se o fragmento de DHA seguinte:

BaniII mer

HindIII

Met Ser Phe Leu Leu Lys

5'- CGATAAGCT ATG TCA TTT CTT TTA AAA

-3'

TATTCGA TAC AGT AAA GAA AAT TTT TCGA

-5’

3'29 mer

A estrutura deste adaptador de III/ é tal que faltam os aminoácidos desde o primeiro aminoácido Thr até ao 112 aminoácido Gin de hG-CSF na sequência de aminoácidos N-terminal codificada pelo referido adaptador.

Primeiro sintetizaram-se os DIAs de cordão simples de

27-mer e 29-mer pelo método habitual do fosfotriéster. Dissol

veu-se 27-mer e 29-mer (2 pg de cada) num total de h-0 jil de tam pão de Th- quinase, adicionaram-se 30 unidades de Th- polinucleótido quinase e efectou-se a reacção de fosforilação ? 37°C du^an te 30 minutos.

Depois dissolveram-se 0,1 jig do fragmento BanIII-EglII derivado do pCfBAÔ (fragmento de cerca de 2,7 kb) e 0,1 jig do fragmento HindiII - BglII derivado do pCfBAtí (fragmento de cerca de l,h- kb), obtidos conforme referido antes, em 25 pl de tampão de Th- DNA ligase e adiciona ram-se à solução da mistura cerca de 2 picomoles de adaptador de DNA anterior. Após adição posterior de 6 unidades de Th- DNA ligase, efectuou-se a reacção de ligação a h-°C durante 18 horas.

A mistura plasmídica recombinante obtida utilizou-se para transformar E. coli HB101 e, obteve-se uma colónia Αρ^Γ. A partir de uma cultura de células desta colónia recuperou-se o DNA plasmí dico. Obteve-se o pCf“TNS301.

derivado de hG-CSF codificado pelo pCFTNS301 cesignar-se-á, daqui em diante, por hu-CSFZ~Z\l-llS_7.

(10) Construção do pCfTNSh-01 (cf. Fig. 16)

Sintetizou-se 0 adaptador de DNA seguinte:

BanIII

5'- CGATÁÀGCT

Met

ATG

39-mer

Ser Leu uln Ser

TCA CTA CCA CAA

HindiII

Lhe Leu Leu Lys

TCA TTT CTA TTA AAA -3

3'TATTCGA TAC AGT GAT GGT GTT AGT AAA GAT AAT TTTTCGA ▼

mer

A estrutura deste adaptador de DNA é tal que faltam 7 ^affiÍ noácidos, desde o primeiro aminoácido Thr ate ao 7² aminoãcido Ser de hG-CSF, na sequência de aminoácidos N-terminal codificada pelo adaptador.

Primeiro, sintetizaram-se os ENAs de cadeia simples de 39-mer e 41-mer, pelo método habitual do fosfotrléster. Dissolve ram-se 39-mer e 41-mer (2 pg de cada) num total de 40 pl de tampão de T4 quinase, adicionaram-se 3θ unidades de T4 polinucleóti do quinase (Takara Shuzo) e efectuou-se a reacção de fosforilaçao a 37°C durante 60 minutos.

Depois dissolveram-se 0,1 jig do fragmento BanIII-BglII derivado do pCfLAS (fragmento de cerca de 2,7 kb) e 0,1 ^ig do fra& mento HindIII-BglII derivado do pCfBAÔ (fragmento de cerca de

1,4 kb), obtidos conforme descrito antes, em 25 jtl de tampão de T4 DNA ligase e adicionaram-se a solução da mistura cerca de 2 picomoles de adaptador ERA, referido antes. Após posterior adição de 6 unidades de T4 DNA ligase, efectuou-se a reacção de ligação a 4°C durante 18 horas.

Utilizou-se a mistura plasmídica recombinante assim obtiT» da para transformar E. coli HB101 e, obteve-se uma colónia Ap .

A partir desta colónia isolou-se o I.-NA plasmídieo, obtendo-se o pCfTT’401. 0 derivado de hG-CSF codificado pelo pCfT?^TS401, designar-se-a posteriormente, por hG-CSF Ζ“ Δ.1-72 _7.

(11) Construção do pCfTNS501 (cf. Fig. 12)

Sm 40 pl de tampão 1-100, dissolveram-se o pCfBA.8 obtido na secção 1, adicionaram-se 10 unidades do enzima de restrição Xhol e efectuou-se a reacção de digestão a 37°O durante 1 hora.

Dissolveu-se o DNA recuperado por extracção com fenol/clorofórmio e precipitação com etanol, em 3θ pl de tampão de klenow, adi cionaram-se 2 unidades do fragmento de Klenow de ENA polimerase I e efectuou-se a reacção a 17°C durante 3θ minutos. Inactivou-se o fragmento de Klenow de DNA polimerase I por tratamento durante 10 minutos a 30°C, adicionou-se nCl, numa concentração de 150 mH, adicionaram-se 8 unidades do enzima de restrição Pvul e, efectuou -se a reacção de digestão a 37°C durante 1 hora. A partir da mis tura reaccional obteve-se, pelo método de LuT, cerca de 2 pg de um fragmento de DNA de cerca de 3 kb contendo cDNA de hG-CSF (fragmento Xhol (coincidente)-Pvul).

Separadamente, dissolveram-se 5 pg ào vector pTrS20 de

ATG (3,8 kb), obtido segundo o procedimento do exemplo 4, em $0 pl de tampão 1-0 (tampão Y-100 menos 100 mM de NaCl), adicionaram-se 16 unidades do enzima de restrição Saci e, efectuou-se a reac ção de clivagem à 37°C durante 3 horas. Dissolveu-seό DNA recu peraao po extracção com fenol/clorofórmio e precipitação com ets nol em 3θ de tampão de rGLenow, adicionaram-se 2 unidades do fragmento de Klenow de DNA polimerase I e efectuou-se a reacção a 17°C durante 3θ minutos. Inactivou-se o fragmento de Klenow de DNA polimerase I por tratamento a 68°C durante 10 minutos, adicionou-se KC1 numa concentração de 150 mk, adicionaram -se 8 unidades do enzima de restrição Pvul e efectuou-se e reacção de digestão a 37°C durante 1 hora. A partir da mistura reaccional obteve-se, pelo método de LGT, cerca de 0,5 pg de um fragmento de DNA de cerca de 1 kb contendo Ptrp Saci(blunt)-PvulJ.

^9

--ζ:

/.«

Dissolveram-se 0,1 pg do fragmento Xhol-(”blunt)-PvuI derivado de pCfBA.8 (cerca de 5 kb) e 0,2 jig do fragmento Saci (blunt”)-PvuI derivado de pTrS20 (cerca de 1 kb), em 25 pl de tampão de T4 DM ligase, adicionaram-se 3 unidades de T4 DM ligase e efectuou-se a reacção de ligação a 4°C durante 13 horas.

Utilizou-se a mistura reaccional. para transformar E.coli HB101 e obteve-se uma colónia de Ap³²; recuperou-se o DM plasmídico pelo método de Birnboim e outros referidos antes. Ohteve-se o pCfTNSDOl apresentado na Fig. 12.

No derivado de hG-CSF codificado pelo pCfTNS501 faltam do 12 ao 62 aminoácidos do N-terminal de hG-CSF maduro e o 172 amino ácido é Ser em substituição de Cys. 0 derivado codificado pelo pCfTNS501 designar-se-á, daqui em diante, como hG-CSF £ A 1-6S

Exemplo 7 (1) Construção de pCfCBlOl, pCfCC52, pCfCC59, pCfCD28 e pCfCD56 (cf. Fig. 8)

Em primeiro lugar, dissolveram-se 5 pg de pBR322 £Bolivar e outros: Gene, 2, 95 (1977)J em 40 iil de tampão Y-100, adicionaram-se 5 unidades do enzima de restrição PstI e, efectuou-se a reacção de digestão a 37°C durante 1 hora. Dissolveu-se o DNA obtido por extracção com fenol/clorofórmio e precipitação com eta nol, em 20 pl de uma solução contendo 33 mM de ácido acético (pH 7,9), 66 mM de acetato de potássio, 10 mM de acetato de magné sio, 5 mM de ditiotreitol e dATP, dCTP, dGTP e dTTP (0,4 mM de

ceda) (a seguir referido pca?tampão de 14· 1'NA polimerase), adicionou-se 1 unidade de 14- Ikk polimerase (Takara Shuzo) e efectuou-se a reacção 8 37°C durante 30 minutos. Dissolveu-se o DNA re cuperado por extraeção com fenol/clorofórmio e precipitação cn® etanol em 20 ^1 de tempão de 14- INA ligase. Adicionou-se cerca de 8 picomoles de adaptador de DNA L-glII (Takars Shuzo; d/”pC-A-G-A-T-C-T-G) _/. Após adição posterior de ó unidades de T4 DNA ligase efectuou-se a reacção de ligação a 4-°C durante 18 horas. Dissolveu-se o DNA obtido por extraeção com fenol/clorofór mio e precipitação com etanol, em 4-0 pl de tampão Y-100, adiciona ram-se 10 unidades do enzima de restrição EcoRI e 8 unidades de BglII e, efectuou-se a reacção de digestão a 37°C durante 1 hora. A partir da mistura reaccional obteve-se, pelo método de LGT, cerca de 0,9 pg de um fragmento de DNA de cerca de 3,6 kb contendo a porção de gene resistente à tetraciclina (fragmento IcoRI-EglIlX

Separadamente, dissolveram-se 3.pe de plflBlOl obtido no exemplo 6-(2), pCf^C>2 ou pGfBC59 obtidos no exemplo 6-(3) ou pCfBD28 ou pCfBE'56 obtidos no exemplo 6-(4-) em tampão Y-100 concentrado 10 vezes, adicionaram-se 5 unidades do enzima de restri ção EcoRI e 6 unidades de BglII e efectuou-se a reacção de diges. tão a 37°C durante 1 hora. A partir da mistura reaccional, otte ve-se, para cada caso, pelo método LG7, cerca de 0,4 de um fragmento de DNA de cerca de l,o kb contendo a porção cDNA do hG-CSF (fragmento EcoRX-EglII).

Prepararam-se 5 tubos contendo cada um deles uma solução de cerca de 0,05 pè do fragmento EcoRI-BglII derivado do pEE322 (cerca de 3,6 kb) oc-tido conforme descrito antes, em 20 pl de tampão τ4· DNA ligase. /.cicionaram-se aos tubos cerca de 0,1 pg

do fragmento EcoBI - BglII derivado de pCfBBlOl, pCfEC^S, pCfEC59_} pCfBD28 ou pCfBDJtó (fragmento de cerca de 1,8 kb) e após adição posterior de 4 unidades de T4 DNA ligase, efectuou-se a reacção a 4°C durante 18 horas. As misturas plasmídicas recombinantes obtidas utilizaram-se para transformar Ξ. coli HB101 e obtiveram-se colónias Tc^r. Obteve-se o DNA plasmídio a partir de culturas de células destas colónias. Portento obtive ram-se os pCfCBlOl, pCfCC52, pCfCC59, pCfCD52 e pCfCD5ó apresen tados na Fig. c. As sequências de aminoácidos dos derivados de hG-CSF codificados por esses plasmídeos são idênticas a dos aminoa'cidos dos derivados de hG-CSF codificados pelos pCfBBlOl, pCfBG52, pCfBC59, pCfBD28 e pCfhD56, respectivamente.

Exemplo c

Para a produção e purificação dos transformantes derivados da strA de E. coli #3110 dos derivados de hG-CSF,(designados por ECfTL23, ECfTL35, ECfTL3c, SCfTL41, ECÍTM14, ECfTM17, ECfTM113,ECfBB101, SCf^c42Bl, ECÍBC45, ECfBC52, ECfBC59, SCfBC7ó, ECfBC77, ECDBC93, ECfEC95, ECfEC97, ECfBD28, ECfBD%, ECÍBD82, ECfTNS7, ECfTAArg4S, ECfTNS301, ECfTNS401, SCfTNSÇOl, ECfBD28A17, e ECfBD28T17) que albergam os plasmídeos recombinantes (obtidos nos exemplos 3, 4, 6 e 7) pCfTL23, pCfTL35, pCfTL38, pCfTL41, pCfTE14, pCfTE17, pCfTF113, PCfBBlOl, pCfBC42El, pCfEC45, pCfEC52, pCfEC59, pCfB(J76, pCfEC77, pCfEG93, pGfbC95, pCfBC97, PCÍBD28, pCfBD56, pCfBD82, pCfTI’S7, pCfAArg4s, pCfTNS301, pCfTN401, pCfTNSSOl, pCfBD28A17 e pCfED2oA17, efectuou-se a cultura de cada um deles, em meio LG (preparado pela dissolução de lOg

i * de bactotriptona, 5 g de extracto de levedura, 5 â de NaCl e g de glucose num litro de água e ajustou-se o pH para 7,0 com NaOH) a 37°C durante 18 horas. Inoculou-se uma porção de 5' ml do caldo de cultura em 100 ml de meio KCG (0,6 de Na^HPO^, 0,3 X de KH₂P0^, 0,5 X âe NaCl, 0,5 X de casaminoácidos , 1 mK de MgSO^, 0,4 pg/ml de vitamina Bp pE 7,2) contendo 25 pg/ml de triptofano e 50 pg/ml de ampicilina. Após incubação a 30°C durante 4-8 horas, adicionaram-se 10 pg/ml de ácido 3^-indoleacrílico (daqui em diante IAA) um indutor do triptofano, e a incubação prosseguiu durante mais 2-12 horas. Recolheram-se as células submetendo o caldo de cultura a centrifugação a 8000 rpm durante 10 minutos e lavaram-se com tampão NaCl 30 mN/Tris-HCl 30 mM (a pH 7,5). Sfectuou-se uma suspensão das células lavadas com 30 ml do tampão, referido antes e depois, despedaçaram-se por tratamento com ultra-sons a 3°C (BRANSON SONIC POWER C0MPANY’S SONIFIER G2LL DISRUPTOR 200. Controlo de Saída 2, durante 10 minutos). A centrifugação a 9.000 rpm durante 30 minu tos proporcionou uma massa residual de células. Utilizando o método de Marston e outros/F. A. 0. Marston e outros: BIO/TECHNOLOGY, 2, 800 (1984) 7, extraíu-se o derivado de hG-CSF da massa residual de células, purificou-se, solubilizou-se e regenerou-se. Determinou-se a quantidade de proteína utilizando o equipamento de ensaio de proteína dos Nippon Bio-Bad Iaboratories (método de ensaio normalizado) /f.M. Eradford: Anal. Biochem., Zi? 24ê (1976) J,

Determinou-se a actividade de G-GS’F do seguinte mo do; Recolheram-se, assepticamente, células da medula óssea do femur de ratos machos CE3/Ke de o-12 semanas de idade (Shizuoka f

Laboratory Animal Center) e efectuou-se uma suspensão em χ -NEM enriquecido com soro de feto de bovino a 10 (FBS). Lã de Nylon de Fibra de .Nylon 146-04231 (Wako Pure Chemical Industries) (0,3 g) compactada em uma coluna foi impregnada, com 1,5 ml desta suspensão (cerca de p ^x 10' células) e permitiu-se que a reacção se efectuasse num incubador com 00~ a 5 Λ a 37°C duran te 90 minutos. Depois, fez-se passar c{ -EEM aquecido previamente a 37O°C, através da coluna e obtiveram-se as células da medula óssea não adsorvidas na lã de nylon na fracção eluída. Lavaram-se estas células uma vez com CK-KEE e ajustaram-se para uma concentração previamente determinada.

Em seguida determinou-se a capacidade de formação de colónias de células mielopoiéticas pelo método de Okabe e outros /Okabe , T. e outros: Câncer Researeh, 44, 4503-^506 (1936) J⁷. Depois misturou-se 0,2 ml da suspensão de células da medula pre6 parada conforme descrito antes (2 x 10 células/ml) com uma mistura de 0,2 ml de o( 0,4 ml de FBS e 0,2 ml de cada amostra diluída 2^d vezes. Nisturou-se um volume igual (1,0 ml) de agar a 6 λ (Difco, Agar purificado #£0560-01) aquecido a 44°C,a mistura e distribuiu-se a mistura total em porções de 0,5 ml em caixas de uma placa de 24 caixas (kunc's Nultidish #143982) (5 x 10** células/caixa, n=3). Após incubação num incubador com C0₂ a 5 7- a 37°C durante 7 dias, contaram-se ao microscópio (Olimpus á40), cada uma das colónias com o mínimo de 40 células. Após contagem das colónias, retiraram-se as células, cuidadosamente, para uma lamina de vidro e fixaram-se com uma solução de acetona/formalina, durante 30 segundos. Após coloração dupla de estearase das células pelo método de Kabota e outros /Fubota K. e outros $ Sxp.

Hematology, δ, 339-344 (1930) identificou-se cada colónia.

Calculou-se a potência de cada colónia com base no resul tado da contagem para a diluição dupla no ensaio de formação de colónias, conforme se segue. Definiu-se a actividade que propor ciona metade do valor de formação máxima de colónias para o hG-CSF intacto utilizado como padrão, como 50 unidades . Calculou -se a potência (em unidades) multiplicando por 20, inclusive o factor de diluição para cada amostra, para conversão para activi dade por mililitro. L actividade específica expressou-se em ter mos de potência por unidade de peso (mg) de potência, ou seja, em umidades/mg.

No quadro 3 apresentam-se as potências para o G-CSF intac to e derivados de G-CSF.

^uaQuadro 3

Estirpe

Plasmídeo

Produto codificado Actividade ·ργοώογο2ο pelo pasmídeo específica de activi (unidades/ dade esoe /mg) cífica

ECfTAl	pCfTAl	G-CSF(intact)	X108	1.0
ECÍTL38	pCfTI,38	E-CSF (Ser ’)	4.0X10’	1.8
ECÍTL41	PCÍTL41	G-CSF (Arg’)	3.7X10’	1.7
ECÍTL23	pCfTL23	G-CSF (Gly’)	3.1X10’	‘l.”4
ECfTL35	pCfTL35	G-CSF (Cys *)	2.9X10’	1.3
ECfBBlOl	pCfBBlOl	G-CSF(NB1O1)	7.9X10’	3.6
ECfBC42B1	pCfBC42B1	G-CSF(NC42B1)	--5.1ΧΊ0’	2.3
ECfBC45	pCfBC45	G-CSF(NC45)	7.0X10’	3.2
ECÍBC52	pCfBC52	G-CSF(NC52)	6.2X10’	2.8
ECÍBC59	pCfBC59	G-CSF (NC59)	5.9x10’	2.-7
ECfBC76	pCfBC76	G-CSF(NC76)	6.2X10’	2.8
ECfBC77	pCf BC77	G-CSF (NC77)	7.7X10’	3.5
ECÍBC93	PCÍBC93	G-CSF(NC93)	9.2X10’	4.2
ECfBC95	PCfBC95	G-CSF(NC95)	* 9.5X10’	4.3
ECfBC97	PCfBC97	G-CSF(NC97)	8.6x10’	3.9
ECfBD28	pCfBD28	G-CSF(ND28)	7.9X10’	3.6
ECÍBD56	PCfBD56	G-CSF(ND56)	5.1X10’	2.3
ECfBD82	pCfBD82	G-CSF(ND82)	4.6X10’	2.Ί
ECÍTM14	pCfTM14	G-CSF(Ser \ Cys3)	3.1X10’	1.4
ECÍTM17	PCÍTM17	G-CSF (Ser Arg3)	3.7x10’	1.7
ECÍTM113	PCÍTM113	G-CSF (Ser Ser3)	2.9X10’	1.3
ECfTNS7	pCfTNST	G-CSF(Δ1-4S)	7.7 X Í0 ’	3.5
ECfTAArg4S	pCfTAArg4S	G-CSF (Arg\Ser”)	5.7X 10’	2.6
ECÍTNS301	pCfTNS301	G-CSF (ΔΙ-llS) .	3.1 x 10’	1.4
ECÍTNS401	PCÍTKS401	G-CSF (Δ1-7S)	5.5χ 10’	2.5
ECfTNS501	pCfTNS501	G-CSF (ΔΙ-GS)	4.4 X10’	2. 0
ECfBD28A17	PCfBD28A17	G-CSF(ND28A17)	6.8X 10'	3. 1
ECfBD28T17	pCfBD28T17	G-CSF (ND28T17)	5.9X 10'	2.7
ECfTN205	pCfTN205	G-CSF(Δ1-4)	4.2 X 10'	1.9

Exemplo 9

Medição das actividades dos derivados de hG-CSF a nti-células da medula óssea

Recolheu-se o líquido medular do osso ilíaco de seres hu manos normais com 20-30 anos de idade. Adicionou-se igual volume de (X-MSM e misturou-se com o líquido medular. Colocaram-se em camadas 4 ml do líquido anterior da medula óssea, sobre 3 ml de solução Ficoll-Paque (Pharmacia Fine Chemicals , gravidade específica 1,077) e, após centrifugação a 400 x g durante 3^ minutos, separaram-se as células que se apresentavam na camada intermédia. Lavaram-se duas vezes as células com PBS (preparado por dissolução de 8 g de NaCl, 0,2 g de KC1, 1,15 g de NaJSPO^ e 0,2 de LH₂P0^ em agua para prefazer um litro de solução) e, então efectuou-se uma suspensão em οζ,-MSM enriquecido com soro fetal de bovino a 10 / (FBS) e ajustou-se a concentração celular para um máximo de 2 x 10^ células/ml. Colocou-se uma porção de 10 ml da suspensão de células numa placa de plástico (Falcon 3003) e fez-se a incubação num incubador com (XL· a 5 λ a 37°C durante 90 minutos. Recolheram-se as células não adsorvidas ao recipiente de plástico, lavaram-se uma vez com após correcção da concentração para um nível previamente determinado, submeteram-se à actividade promotora do crescimento de células da linha mielopoiética humana e a testes de formação de colónias. Depois distribuiu-se X-MEM enriquecido com FBS a 10 %, em porções de 100 pl em recipientes de uma microplaca de fundo plano com 96 cavidades (NUNC, 16/008).

Depois, adicionaram-se amostras

de hG-CSF e de derivados de hG-CSF obtidos segundo o método descrito no exemplo 8, em porções de 100 pl, dentro das cavidades da primeira fila. Aipos mistura cuidadose, transferiram-se 100 pl de cada mistura para cada uma das cavidades da 2a fila para a pre paração de uma diluição dupla. Prosseguiu-se com as diluições duplas pelo mesmo método até à 12& fila (n=3). Num grupo, utilizou-se apenas ο(-ΥΕΝ como controlo negativo.

Depois, efectuou-se a sementeira de 100 pl (5 x 10 células eucariótas ) da suspensão de células da medula óssea preparada, conforme descrito antes, em cada cavidade. Efectuou-se a incubação num incubador com CCL· a 5 ^s 37° C durante 3 dias. Euran te o período de 20 horas que precedeu as últimas 18 horas, adicio nou-se 10 pl de ó-^H-timidina (Amersham Japan, código TRkól, 107 mci/mg). Recolheram-se as células sobre um filtro d.e vidro utilizando equipamento de recolha de células apropriado (Labo-Science), secaram-se e, mediu-se a radioactividade libertada pelas células utilizando um contador de cintilação de líquido (Packard, Tricarb 3320).

Por outro lado, efectuou-se 0 ensaio de formação da colónia de células de linha mielopoiética e a identificação da colónia, conforme descrito no exemplo 8.

Para calcular a potência de cada amostra, definiu-se, como 1 unidade, a actividade capaz de originar a formação de uma colónia de células. Depois, determinou-se o valor Half Eax” (metade do valor máximo de apreensão) com base na curva de respos. ta à dose que apresenta linearidade para os resultados da contagem das séries de diluições duplas , e, calculou-se a. potência de cada amostra.

/ ( Expressou-se a actividade específica em termos de potên cia por unidade de peso (mg) de proteína, isto e, em unidades/ /mg.

No quadro 4 apresentam-se as potências do hG-CSF intac to e dos derivados de hG-CSF.

Quadro 4

	Plasmídeo de	Produto codifi cado pelo	Actividade	Proporção i actividade
Estirpe	suporte	plasmídeo	específica	específica
			(unidades/mg)
ECfTAl	pCfTAl	G-CSF(intacto)	2,8 x 108	1,0
ECfBC59	pofEC59	G-CSF(NC59)	7,7 x 10	2.8
ECfBC93	pGfBC93	G-CSFCNC93)	7,0 x 10°	2,5
ECfBC95	pCfBC95	G-CSF(NC95)	9,5 x 10d	3Λ
ECfBD28	pCfBD28	G-CSF (CIPÓ)	10,4 x 10ô	3,7
ECfTAArg4	pCfTAArg4	G-CSF(Arg4)	5,3 x 10d	1,9
ECfTNS^Ol	pCfTNSSOl	G-CSF(AI-ÓC)	6,2 x 10ô	2,2

Exemplo 10

Produção do derivado de hG-CSF que não possui desde o 12 até ao 7² aminoécidos no N-terminal, possuindo a serina como o 172 aminoácido (a seguir referido por M-7S)

A 50 ml 8e uma solução de 10 mp de Tris/ECl 100 mM de

NaCl, (pH 8,0) contendo 0 derivado (a) apresentado no quadro 2 (13^ pg/ml) obtido pela cultura de uma estirpe de E. coli &

/ (ECÍBC59) que transporta o plasmídeo recombinante pCfBC59 obtido no exemplo 6, seguida de purificação, adicionou-se 0,7 Jig (3,5 unidades/mg de proteína) (Sigma), e efectuou-se a incubação a 25°C durante 40 horas. Após diluição tripla com 10 ml·! de Tris-HCl (pH 8,0), colocou-se a mistura, de incubação numa eolúnâ DEAE Toyoperal 65OM'* (Toyo Soda Manufacturing) til i sina BPN’ de sub(1,7 cm x 4,4 cm) cheia com 10 mM de Tris-HCl (pH 3,0) numa propor ção de fluxo de 10 ml/hora luna 20 ml de Tris HC1 5mN

Depois, fez-se passar através da co(pH 8,0), numa proporção ds fluxo,de ml/hora. Depois, eluiu-se com um sistema tampão de Tris-HCl mM que apresenta um gradiente linear de concentração de NaCl compreendido entre 0 N e 0,4 N para a mesma proporção de fluxo (volume eluente total de 50 ml). 0 derivado M-7S eluiu-se a con centraçoes de NaCl compreendidas entre 100-150 mH (produção de

0,7 mg? ou 10 . A pureza não foi inferior a 90 /·

Exemplo 11

Produção do M-75

- . . ,-.111-: τ - -I i ..r l:i JT~.

A 50 ml de uma solução de 10 ml·: de Tris-HúlZL00ml4 de NaCl (pH 8,0) contendo o derivado (b) apresentado no quadro 2 (132 jig/ /ml) obtido a partir da cultura da estirpe de Ξ. coli (,EOfBC59) portadora do plasmídeo recombinante pGfBG59 obtido no exemplo 6, seguida de purificação, adicionou-se 0,7 pg de subtilisina. BB;:’ (8,5 unidades/mg .de proteína) (Sigma) e efectuou-se a incubação a 25°C durante 14 horas. Após diluição tripla com tris-ECl 10 mh (pH 3,0), aplicou-se a mistura de incubação numa coluna ”DEí.E

-Toyopehal 6501·?' (Toyo Soda Manufacturing) (1,7 cm x cm) cheia com 10 mM de Tris-HCl (pH 8,0) a uma proporção de fluxode ml/hora. Depois, fez-se passar através da coluna 20ml de

Tris-HCl 10 mH (pH 8,0) numa proporção de fluxo de 5 ml/hora. Depois, eluíu-se entre 0 M e 0,*+ M à .mesma proporção de fluxo(50 ml de volume de eluente total). Eluiu-se o derivado M-7S comcon centrações de NaCl compreendidas entre 100-150 mM (produção de

4,2 mg, ou 63 ., ). A pureza não foi inferior a 90 /.

Exemplo 12

Produção de M-7S

A 50 pí de uma solução de 10 mM de Tris-HCl/ 100 mM de

NaCl (pH 8,0) contendo 0 derivado (d) apresentado no quadro 2 (I32 jig/ml) obtido pela cultura da estirpe da E. coli (ECfTAZrg4) portadora do plasmídeo recombinante pCfTAArz4) obtido no exemplo 6, seguida de purificação, adiciona ram-se .,-,7 pg de subtil is ina BPN’ (8,5 unidades/mg de proteína) (Sigma) e, efectuou-se a incubação a 25°C durante 40 horas. Após ter-se ajustado a concentração de NaCl para 0,5 M, aplicou-se a. mistura de incubação numa coluna de quelato de zinco/Sepharose (Pharma.cia Fine Chemicals) (1,7 cm x 2,6 cm) cheia com 0,5 M de NaCl/10 mM de Tris-HCl (pH 8,0) com 0 débito de 6 ml/hora. Depois fez-se passar através da coluna 12 ml de Tris-HCl 10 mh/NaCl 0,5 M (pH -:.,0) numa propor ção de fluxo de 3 ml/h^ra. lepois, efectuou-se s eluição com um volume total de 30 ir.1 de tampão Tris-HCl 10 mM/hCl 0,5 M a um gra d lente linear de pH compreendido entre 8,0 e 6,0 com a mesma velocidade de fluxo. Eluiu-se o derivado 1:-76 na. vizinhança de pE

7,0 (produção de 0,6 mg ou $ ,.) . A pureza não foi inferior a 90%.

Exemplo lj

Produção do derivado de hu-if que não possui do J2ao 62 aminoácidos do N-terminal e que possui serina como o 17^s aminoácido (a seguir referido por M-óS).

A 50 ml de uma solução d.o derivado (a) apresentado no quadro 2 (I32 pg/ml) em 10 mM de Tris-HCl/lOO mM de NaCl (pH 8,0), adicionaram-se 0,7 pg de subtilisina IPN' (8,5 unidades/mg de pro teína) (Sigma) e, efectuou-se a incubação a 25°C durante 2 horas. Após diluição tripla com 10 mM de Tris-HCl (pH 8,0), aplicou-se a mistura de incubação numa coluna peral 650

M (Toyo Soda) cheia com um débito de ml/hora. Depois, fez-se passar através da c-oluna

Em ma te ml de Tris-HCl 10 mH (pH 8,0) com um débito de 5 ml/hora.

seguida, efectuou-se a eluição com um volume total de um siste tampão de 10 mM de Tris-HCl (pfí o,0), que apresenta um gradien linear de concentração de NaCl compreendido entre OMe 0,4 M, com a mesma velocidade de fluxo. Eluiu-se o derivado M-6S em con centraçÕes de ’^TaCl compreendidas entre 100-15'0 mM (produção de

2,6 mg ou 40 '). A pureza não foi inferior a 90 /.

Exemplo 14

A 50 ml de uma solução tampão de 10 mM de Tris-HCl/100 mM de NaCl (pH j,0) contendo 0 derivado (a) apresentado no quadro 2

132 pg/ml), adicionaram-se 0,7 pg de Epolozyme (4120 unldades/mg de proteína) (Kyowa Hakko Kogyo) e, efectuou-se a incubação a 25°C durante 20 horas. Após ter-se ajustado a concentração do NaCl para 0,5 M_} aplicou-se a mistura de incubação numa. coluna (1,7 cm x 2,6 cm) quelato de zinco Sepharose (Pharmacia Fine Chemicals), cheia com 10 ml de Tris-HCl 10 mN/feGl 0,5 M (pH 8,0) com um debito numa proporção de .6 ml/hora. Depois fez-se passar através da coluna com um fluxo de de 3 ml/hora, 12 ml de Tris-HCl 10 mM/NaCl 0,5 mM. Depois cisto efectuou-se a eluição com um volume total de 3θ ml de tampão Tris-HCl 0,10 mM/NaCl 0,5 M em um gradiente linear de ρΗ compreendido entre c,0 e 6,0 com o mesmo fluxo. Sluiu-se o derivado k-6S na vizinhança de pH 7,0 (produção de 2,5 mg, ou 38 /). A pureza não foi inferior a 90 /.

Exemplo 15

Produção de M-6S

A 50 ml de ama solução de 10 mM de Tris-HCl/100 mK de NaCl (pH 0,0) contendo o derivado (b) apresentado no quadro 2 (I32 pg/ /ml), adicionaram-se 0,7 pg de subtilisina amilossacolítiea e, efectuou-se a incubação a 25°C durante 20 horas. Após correcção da concentração de Naul para 0,5 N, aplicou-se ? mistura de incu bação numa coluna de quelato de Zn-Êepharose (Pharmacia Fine Chemicals) (1,7 cmx 2,6 cm)cheia com 10 mk de Tris-HCl/0,5 K de NaCl (pH 6,0) com um fluxo de 6 ml/hora. Depois, fez-se passar através da coluna com um fluxo de 3 ml/hora., 12 ml de Tris-HCl

1C mk/NaCl 0,5 M (pH 8.0). Depois disso, efectuou-se a eluição

Ώ /

ί / com um volume total de 30 ml de tampão Tris-HCl 10 m’'.Z'.aul. 0,5 mM (pH .:,0) num gradiente linear de pH compreendido entre c·,? e 6,0 com o mesmo fluxo. Q derivado I\-6s eluiu-se na vizinhança de pH 7,0 (produção de 2,5 mg, ou 3d ,. ). A pureza não foi inferior a 90 %.

Exemplo 16

Produção de M-6S

A 5θ ml de ums solução de 10 mM de Tris-HCl/100 mM de NaCl (pH õ,0) contendo o derivado (d) apresentado no quadro 2 (132 pg/ml), adicionaram-se 0,7 pg de subtilisina Carlsberg (0,034 unidades/mg de proteína) (Novo) e, efectuou-se a incubação a 25°C durante 20 horas. Após correcção a concentração de NaCl para 0,5 M, aplicou-se a mistura, de incubação numa co luna (1,7 cm x 2,6 cm) de quelato de Zn/Sepharose (Pharmacia Pine Chemlcals) com um débito de 6 ml/hora. Depois, fez-se passar 10 mM de Tris-HCl/0,5 M de NaCl (pH 3,0) através da coluna com um débito de 3 ml/hora. Depois disso, eluiu-se com um volume total de 30 ml de um sistema tampão de 10 mM de Tris-HCl/0,5 M de NaCl apresentando um gradiente linear de pH compreendido entre 6,0 e 6,0 com o mesmo fluxo. Eluiu-se o derivado :--6s na vizinhança de pH 7,0 (produção de 3 mg, ou 45 λ). A pureza não foi inferior a 90 x.

.uXemΔ

Exemplo 17

Produção de M-6S

A 50 ml de uma solução de 10 mM de Tris-HCl/100 mM de

NaCl (pH 8,0) contendo 0 derivado (a) apresentado no quadro 2 (I32 pg/ml), adicionou-se 0,7 pg de proteína K (0,027 unidades/ /mg de proteína) (Sigma) e efectuou-se a incubação a 27°C duran horas. Após diluição tripla em 10 mM de Tris-HCl (pH 8,0), aplicou-se a mistura de incubação numa coluna (1,7 cm x 4,4 cm) DEAE-Toyoperal 650 M” (Toyo Soda) cheia com 10 mM de Tris-HCl (pH 8,0) com um fluxo de 1G ml/hora. Fez-se passar através da coluna com um débito de 5 ml/hora, 20 ml de Tris-HCl 10 mH (pH 8,0). Depois eluiu-se comum volume total de $0 ml de um sistema tampão de Tris-HCl 10 mM (pH 8,0) apresentando um gradiente linear de concentração de aCl compreendido entre 0 M e 0,4 M com o mesmo fluxo. Eluiu-se 0 derivado M-6S em concentrações de NaCl compreendidos entre 100-1J0 mM (produção de 2,6 mg ou 39 A pureza não foi inferior a 90 /.

xemplo 18

Produção do derivado de hG-CSF que não possui do l^s ao 5^S aminoácidos do N-terminal e possui serina como ο 17^Ω amiácido (a seguir referido por M-5S)

A 50 ml de solução de 10 mM de Tris-HCl/100 mH de

NaCl (pH 8,0) contendo o derivado (b) apresentado na Tabela 1 (I32 pg/ml), adicionaram-se de tripsina (267 unidades/mg

22 y

' ,s {' de proteína) (Sigma) e, efectuou-se a incubação a 25°C durante horas. Após correcção da concentração de NaCl para 0,5 M? aplicou-se a mistura de incubação numa coluna (1,7 cm x 2,6 cm) de quelato de Zn/Sepharose (Pharmacia Fine Chemicals) cheia com 10 mM de Tris-HCl/0,5 M de NaCl (pH 8,0) com o fluxo de 6 ml/ho ra. Então, fez-se passar através da coluna. 12 ml de Tris-HCl 10 mM/NaCl 0,5 Μ (pH 8,0) com um fluxo de 3 ml/hora. Depois dis so, eluiu-se com um volume total de 30 ml de um sistema tampão de Tris-HCl 10 mk/MaCl 0,5 M (pH 8,0) apresentando um gradiente linear de concentração de imidazol compreendido entre 0 M e 0,3 M com o mesmo fluxo. Eluiu-se o derivado h-5S com 0,1 k de imidazol (produção de 2,7 mg, ou 44 ;). A pureza não foi inferior a $0 /.

Exemplo 19

Produção do derivado de hG-CSF que não possui do 1^Ω ao 4^Ω aminoácidos no N-terminal e possui serina como l/² aminoácido (a seguir referido por k-4S)

A 50 ml de uma solução de 10 mk de Tris-HCl/100 mk de NaCl (pH 8,0) contendo o derivado (d) apresentado no quadro 1 (132 pg/ml) adicionaram-se 5 pê de tripsina (267 unidades/mg de proteína) (Sigma) e, efectuou-se a incubação a. 25°C durante 20 ho ras. Após correcção da concentração de NaCl para 0,5 M, aplicou-se a mistura de incubação a uma coluna (1,7 cm x 2,6 cm) de quelato de Zn/Sepharose (Pharmacia. Fine Chemicals) cheia com 10 mk de Tris-HCl/0,5 N de NaCl (pH 8,C) com um fluxo de 6 ml/hora. Então, fez-se passar através da coluna 12 ml de Tris-HCl 10 mk/ /

p •f

/NaCl 0,5 M (PH c-,0) com o débito de 3 mlAora. Depois, eluiu-se num volume total de 30 ml de um sistema tampão de 1G mk de T_ris-HCl/0,5 M de NaCl (pH 6,0) apresentando um gradiente linear de concentração de imidazol compreendido entre 0 M e 0,3 M com o mesmo débito. Eluiu-se o derivado M-h-S em 0,1 k de imidazol (produção de 2,7 mg, ou rendimento de h-l 7). A pureza não foi inferior a 90 p .

Exemplo 20

Produção de M-h-S

A 50 ml óe uma solução de NaCl contendo o derivado (pH b,G) de 10 mM de Tris-HCIAOO mM (d) apresentado no quadro 2 (132 fê/ /ml) adicionaram-se 5 JJ-g de -quino tripsina (267 unidades/mg de proteína) (Sigma) e efectuou-se a incubação a 25°C durante 20 ho ras. Após ter-se ajustado a concentração de NaCl para 0,5 M, aplicou-se a mistura de incubação a uma coluna (1,7 cm x 2,6 cm) de quelato de Zn-Sepbarose (Pharmacia Pine Chemicals) cheia com mM de Tris-HCl/0,5 M de NaCl (pil o,0) com o fluxo de 6 ml/ho ra. Depois fez-se passar 12 ml de Tris-HCl 10 mMZiaCl 0,5 M (pH

8,0) através da coluna com o fluxo de 3 ml/hora. Depois, eluiu-se com um volume total J0 ml de um sistema de tampão de 10 mM de Tris HCi/ /0,5 M de NaCl (p , apresentando um gradiente linear de concentração de imidazol compreendido entre 0 M e 0,3 M com o mes mo fluxo. Eluiu-se o derivado M-hS em 0,1 N de imidazol (produção de 2,3 mg ou 35 : ). A pureza não foi inferior a 90 á.

ixems / 22 '^Z

Exemplo 21

Conforme se verificou nos exemplos de 10a 20, podem obter-se os derivados de hG-CSF que possuem serinn com um substituinte para ο 17^Q aminoãcido e carecem de 4(K-4s) ,5(M-5S). 6(M-6S) e 7(M-7S) aminoácidos no N-terminal. A utilização ca tecnologia do DNA recombinante resulta, geralmente, na adição de metionina ao N-terminal e, esta é uma das desvantagens dos produtos produzidos por recombinação. Pelo contrário, a utilização da técnica de clivagem enzimática, de acordo com a presente invenção, é van tajosa uma vez que tais produtos podem ser produzidos sem adição de metionina ao N-terminal.

Ensaiou-se, para comparação, a actividade de G-CSF dos derivados obtidos de acordo com esta técnica.

Os resultados obtidos apresentam-se no Quadro 5 .

Quadro 5

Comparação da actividade entre os derivados de G-CSF formados pela técnica de clivagem enzimática

Derivado de hG — USí¹

Intacto

M-4S

M-5S

M-óS

M-7S

Actividade Relativa

Derivado/intacto _

1,0

4,0

3,0

3,3

2.8

A partir dos resultados apresentados no quadro 5, descobriu-se que , na avaliação anterior, os derivados que não possuíam os 4-7 aminoácidos do lado N-terminal possuíam activi dade 2 a 4 vezes superior em comparação com hG-CSF intacto.

Contudo, os derivados que carecem de aminoácidos no lado N-terminal que podem ser produzidos, de acordo com a presente invenção, não possuem metionina adicionada à. extremidade N e possuem actividade 2 a 4 vezes superior a do produto intacto.

Os exemplos seguintes ilustram a aquisição de reactivida de (susceptibilidade) à clivagem por enzimas hidrolíticos como um resultado de mutação na. porção N-terminal.

Exemplo 1 de Ensaio

Comparação na reactividade com a subtilisina. Carlsberg entre hu-CSF intacto e mutantes de N-terminal de hG-CSF.

Fez-se a incubação dos derivados apresentados no quadro 2 e de hG-CSF intacto, na presença de 3,6 x 10^-4- unidades,^zmg de G-CSF de subtilisina Carlsberg (NOVO) a 2J°C durante 14 horas, pelo método descrito no exemplo 16. Enquanto os derivados apresentados no quadro 2 proporcionaram os derivados M-óS, o hG-CSF intacto permaneceu sem reacção. Além disso, mesmo quando se uti liza este enzima numa quantidade 100 x superior (3,6 a ÍO”^ unidades/mg de G-CSF) o produto intacto falhou na produção de N-6S mas de preferência,sofreu reacções de decomposição global.

Exem

Exemplo 2 de Ensaio

Comparação na reactividade com tripsina entre hG-CSF intacto e mutantes deN-terminal ds hu-CSF

Incubou-se o derivado (a) apresentado no quadro 2 e o hG-CSF intacto na presença de 0,22 unidades/mg de G-GSF de tripsina (Sigma) a 25°O durante 20 horas. Enquanto o derivado (a) apresentado no quadro 2 proporcionou o derivado K-4S, o hG-CSF intacto não reagiu. Além disso, mesmo quando a quantidade de enzima era 100 vezes superior (22 unidades/mg de G-CSF) o hG-CSF intacto não proporcionou k-4S, mas, de preferência sofreu reacções de decomposição global.

Exemplo 3 de Snsaio

Estabilidade térmica dos derivados de hG-CSF

Dissolveu-se uma porção de 20 ml de cada um dos diversos derivados da presente invenção, apresentados no quadro 6, em 1 ml de uma solução de cloreto de sódio fisiológica tamponada com tam pão de fosfato (PBS) (pH 7,2) ou em enriquecido com soro fetal de bovino a 10 / (FBS). Efectuou-se a incubação a 5é⁰C e recolheram-se as amostras em intervalos regulares e ensaiou-se a actividade de CSF através de ensaios de formação de colónias uti lizando células da medula óssea de rato (método, descrito antes, de Okabe e outros).

Diluiu-se cada amostra pela técnica da diluição dupla a partir de 40 ng/ml para proporcionar 10 níveis de diluição.

3ο

Para cada nível, efectuou-se o ensaio de actividade, e determinou-se a actividade residual comparando a actividade a uma determinada concentração para a qual se obteve uma boa curva dose-resposta, com a actividade antes de aquecimento (minuto ze ro).

Os dados da actividade residual (que correspondem à estabilidade térmica) obtidos no PBS e no X-MEK enriquecido com FBS a. 10 p, apresentam-se no quadro 6 (A) e no quadro 6 (E), res pectivamente.

Actividade Residual (;'.)

Amostra	30 min.	60 min.	120 min.
G-CSF intacto	kc p ,c	16,4	12,7
NC93	98,0	93 j 3	90,6
ND 28	68,7	52,8	33,9
Arg4	33,3	1 c o	12,9
M-7S	t4,ô	72,0	57,0
1-4S	39,7	/2,4	61,6

quadro 6 (E)

Actividade Eiesidual (;.)

Amostra	30 min.	60 min.	120 min.
G-CSF intacto	9,1	6,7	3,9
ND28	55,6	46,5	32,4
NC59	^5,1	35; 6	24,9

Exemplo 22

Construção do pCfBD28A17 θ do pCfBD28T17 utilizando mutagenes de sítio específico (cf. Big. 17)

a) Construção de matriz de ENA de cadeia simples

Em 50 ml de tampão Ϊ-100, dissolveram-se 3 pg do pCfBD28 obtido segundo o procedimento descrito no exemplo 6-(4), adicionaram-se 10 unidades de cada um dos enzimas de restrição BanIII (Toyobo) e Pstl e, efectuou-se a reacção de clivagem a 37°C durante 2 horas. A partir da mistura reaccional obteve-se, pelo método LGT, cerca de 0,1 pg de um fragmento de ENA de cerca de 210 pb (fragmento BanIII - Pstl) que codifica a porção I.-terminal do derivado de hG-CSF (ΝΓ28).

Separadamente, dissolveu-se 1 pg do ENA do vector E13mpl9RF do bacteriofago M13 (Takara Shuzo ) num total de p3 yjl de tampão Y-JO, aaicionaram-se 10 unidades do enzima de restrição Accl (Toyobo) e, efectuou-se a reacção de clivagem a 37°C durante 2 horas. Depois, adicionou-se NaCl a una concentração de NaCl de 100 mM·, adicionaram-se 10 unidades do enzima de restrição Pstl, e efectuou-se a reacção de clivagem a 37°C durante 2 horas. A partir da mistura reaccional, obteve-se, pelo método de LGT, cerca de 0,8 pg de um fragmento de DNA de cerca de 7,24 kb (fragmento Accl - Pstl).

Em 50 pl de tampão T4 ΠΙΑ ligase, dissolveram-se 0,2 pg do fragmento BanIII - Pstl (cerca de 210 pb) e 0,05 p'â do fragmen 4° Accl - Pstl (cerca de 7,24 kb), obtidos conforme descrito an-

tes. Adicionou-se Th ΓΝΑ ligase (10 unidades) ã solução da mistura e efectuou-se a reacção de ligação a 12°C durante 16 horas.

Depois, utilizou-se a mistura reaccional anterior para efectuar a transfecção de E. coli 411105 por métodos conhecidos. Obteve-se, assim um bacteriófago recombinante. A partir da cultura de células de um transformante derivado de S. C21i JM105 infectado com o bacteriófago recombinante, recuperou-se o DNA BF do bacteriófago M13. Confirmou-se a. estrutura deste DNA RF (a seguir referido por ptl9H^r2tíN) por clivagem com PstI,ScoRI, Aval e Xhol. seguindo-se electrofu.^ese em gel de poliacrilamida. Depois isolou-se o ptl9BD28N de cadeia simples, a partir do bacteriófago recombinante por um método conhecido e, utilizou-se como matriz.

b) Construção do DNA de cadeia dupla aberta.

Em 30 pl de tampão Ϊ-100, dissolveram-se 3 jag de DNA RF de M13mpl9 (Takara Shuzo ), adicionaram-se 10 unidades de cada um dos enzimas de restrição EcoRI e HindIII e, efectuou-se a reacção de clivagem a 37°G dura_nte 2 horas. A partir da mistura reaccional, obteve-se, pelo método de LGT, cerca de 2,5 pg de um fragmento de DNA de cerca de 7,2 kb (fragmento EcoRI - HindIII).

Dissolveu-se este fragmento EcoRI - HindIII derivado do DNA RF de M13mpl9 (cerca de 7,2 kb) e 1 pg do DNA ptl9BD28N matriz, de cadeia simples, obtido conforme descrito na secção prece dente, em 27 pl de tampão de Klenow e originou-se a desnaturação por ebulição a 100°C durante 6 minutos. Depois, deixou-se a mis, tura em repouso a 65°C durante 10 minutos, a 37°C durante hO minu tos,a 4°C durante 40 rrfhutos e en gelo durante 10 ndrcZcs para se processar areacçã

de circúLarização, pela qual se formou um ΓΝΑ de cadeia dupla no qual apenas a porção do gene de G-CSF na matriz, era de cadeia simples. Os DNAs de cadeia dupla aberta, assim obtidos, recolhe rarn-se pelo método LGT.

c) Mutagénese (construção do ptl9BD28NA17 e do ptl9BD28NT17)

Sintetizaram-se, pelo método habitual do fosfotriéster um DNA de cadeia simples (D-l) necessário para a substituição de Ala do 17² aminoácido (a partir da extremidade N), isto é, Ser, do derivado de hG-CSF (FD28) obtido no exemplo 6 e um DNA de cadeia simples (D-2) necessário para a substituição de Thr por Ser. As sequências de bases de L-l(33-nier) e D-2 (33-mer) apresentam-se a seguir.

D-l

Ala

I

		12	13	14	15	16 17 18	19	20	21	22
17		Ser	Fhe	Leu	Leu	Lys Ser Leu	Glu	Gin	Vai	Arg
(Ser—>Ala)	Cf 1 y	-AGC	TTC	CTT	TTA	AAG GCC TTA	GAG	CAA	GTG	AGG
						StuI		-3’	(33	mer)
						Thr f
		12		14	15	1 16 1? 18	19	20	21	/Λ i’·* zz
17		Ser	Phe	Leu	Leu	Lys Ser Leu	GlU	Gin	Vai	Arg
(Ser—»Thr)	R I y	-AGC	TTC	CTT	TTA	AAA ACT CTA		CAA	GTG	AGG
						Xbal		-3’	(33	mer)
As	es'	t ruturas	dOS	ADN	anteriores s	ã.o t	;ais	que	a mutagéne
se utilizando	D-l	pode	í originar a formação	de	um novo	sítio StuI

e a mutagénese utilizando D-2 pode proporcionar um novo sítio / 84 /

'1*/ s v

Xbal. Contudo, podem identificar-se os mutantes por clivagem com estes enzimas de restrição.

Dissolveram-se, individualmente, D-l e Γ—2 numa quantida de de 1 yug, em 50 jal de tampão T4 quinase, adicionaram-se 30 uni dades de T4 polinucleótido quinase e, efectuou-se a reacção de fosforilação a 37°C durante 60 minutos.

Então, dissolveram-se, 0,2 pg do D-l ou E-2 fosforilado e 0,1 pg do DNA de cadeia dupla aberta, obtido conforme descrito na secção de abertura, em 34 pl de tampão contendo 6,5 mM de Tris-HCl (pE 7?5)> 8 mM de MgCl^., 1 mM de 2-mercaptoetanol e 100 mM de NaCl, deixou-se a solução eni repouso a 65°C durante 60 minutos e, depois, a uma temperatura ambiente durante 3θ minutos, pelo que D-l e E-2 foram circularizados com o DNA de cadeia dupla aberta.

Adicionou-se ã solução dATP, dTTP, dGTPe dGEP,numa concentra çao de 0,5 mM de cada. Após posterior adição de 1,5 unidades do fragmento de Klenow de DNA polimerase I e de 10 unidades de T4 DN/· ligase, efectuou-se a reacção de extensão a 4°C durante 16 ho ras.

Utilizou-se a mistura reaccional, assim! obtida, para efeç tuar a transfecçao da E. coli JM105 e obtiveram-se bacteriófagos mutantes. Recuperaram-se os ENAs RF a partir de transformantes de Ξ. coli JM105 infectados pelo bacteriófago mutante, e, icenticaram-se por clivagem, com Aval, Xhol e StuI(quando se utilizou o D-l) ou com Xbal (quando se utilizou o D-2), seguida por electroforese em gel de poliacrilamida.

DNA RF no qual se introduziu a mutação por meio de E-l designou-se por ptl9BD28NA17 e o DNA RF no qual se introduziu a

mutação por meio de D-2 designou-se por ptl9ED28NT17. Confirmou-se pelo método de sequenciação didesoxi utilizando o bacteriófago M13, que as sequências de bases do ptl9ED28NA17 e ptl9BD2ÔKT17 na vizinhança do sítio StuI e do sítio Xbal, res pectivamente, eram as seguintes:

ptl9BD28NA17

12	13	14	15	16 17	18	19 20	21	22
Ser	Phe	Leu	Leu	Lys Ala.	Leu	Glu	Gin	Vai	Arg
AGC	TTC	OTT	L-qi £	AAG GCC	TTA	Λ Γ	CAA	GTG	AGG
				StuI

ptl9BD28NT17

12	13	14	15	16	17	18	19	20 21	22
Ser	Phe	Leu	Leu	Lys	Thr	Leu	Glu	Gin Vai	Ar
AGC	TTC	CTT	TTA	AAA	ACTÍ	CTA	GAG	CAA GTG	AG

Xbal

d) Construção de pí.fED28A17 θ de pCfLL28T17

3m 50 P1 de tampão x-100, dissolveram-se 3 pS de ptl9BD28NA17 ou de ptl.9BD28lTT17, obtidos conforme descrito antes, adicionaram-se 10 unidades de cada um dos enzimas de restrição Aval e Xbal e, efectuou-se a reacção de clivagem a 37°C durante 2 horas. A partir da mistura reaccional, obteve-se, pelo método d.e LGT, 0,05 Jttg de um fragmento de DNA de cerca de 110 pb conten do o local de mutação introduzido conforme descrito na secção precedente (fragmento Avai-Xhol).

Separadamente dissolveram-se 2 pg de pCfEE28 obtido no exemplo 6—(4) em 5θ jnl de tampão Y-100. adicionaram-se 10 unidades de cada um dos enzimas de restrição Xhol s BglI.T e, efec-

tuou-se a reacção de clivagem a 37°C durante 2 horas. A partir da mistura reaccional obteve-se, pelo método LGT, cerca de 1 pg de um fragmento de DNA de cerca de 2,74 kb contendo a porção do promotor de triptofano (fragmento Xhol - BglII).

Posteriormente, em separado, dissolveram-se 2 pg de pCfBD28 em 5θ pl de tampão Y-100, adicionaram-se 10 unidades do enzima de restrição BglII. e, efectuou-se a reacção'· dé'clivagem a 37°C durante 2 horas. Após confirmação do termo da clivagem de BglII, por electroforese em gel de agarose, adicionaram-se 5 unidades do enzima de restrição Aval e, efectuou-se a clivagem parcial a 37°C durante 10 minutos. A partir da mistura reaccio nal, obteve-se, pelo método de LGT, 0,4 pg de um fragmento de DNA de cerca de 1,29 kb (fragmento BglII - Aval) contendo a maio, ria do DNA de hG-CSF maduro com a porção de terminação lpp.

Depois, dissolveram-se 0,1 pg do fragmento Xhol - BglII (cerca de 2,74 kb) derivado de pCfED28,.do fragmento BglII - Aval derivado do pCfBD28 (cerca de 1,29 kb) e 0,02 pg do fragmento Aval’ - Xhol derivado de ptl9BD28NA17 ou ptl9BD28NT17 (cerca de 110 pb), em 60 pl de T4 DNA ligase, adieioharam-se 10 unidades de T4 DNA ligase e, efectuou-se a reacção de liga ção & 12°C durante 16 horas.

A mistura reaccional assim obtida utilizou-se para transformar E. coli HB101 e obteve-se uma colónia Ap^r. Isolou-se o DNA plasmídeo a partir da cultura de células desta colónia. 0 plasmídeo construído pela utilização de ptl9BD28NA17 designa-se por pCfBD28A17 e o construído pela utilização do pCfBD28NT17 designa-se por pCfBD28T17· A- estrutura do pCfBD28A17 confirmou-se por clivagem em Aval, Sid, BglII e StuI, se

guida de electrofurese em gel. de- agarose.

A estrutura do pCfED28T17

Aval, Xhol, EglII e Abai, seguida rose.

Os resíduos de aminoácido;

confirmou-se por clivagem com de electrofurese,em gel de aga substituintes nos derivados codificados por estes dois plasmídeos quando comparados com o hG-CSF maduro são os seguintes:

Posição de substituição de aminoácidos (aminoácido de hG-CSF)

1- (Thr)

3° (Leu) (Gly) (Pro)

1/2 (Cys)

Plasmídeo

pCfBD2óA17	pCfBE2cT17
/i 1G.	Ala
Thr	Thr
Tyr	Tyr
Arg	Arg
Ala	Thr

Os deriv-dos de hG-CSF codificados pelo pCfbD28T17 designar-se-ão, a seguir por hG-CSF/pCf3D2oAl7 _/ θ hG-CSF/ND28T17_7, respectivamente.

Exemplo 1 de Referência

Isolamento do plasmídeo pCSFl-2 que transporta o cLNA de hG-CSF

1) Preparação de BNA poli(A) de macrófago de sangue periférico humano normal

Isolaram-se macrófagos, que são células aderentes, por cultura de leucócitos obtidos por centrifugação de sangue pe, ··** .riférico humano normal num tubo de plástico e por remoção das células não aderentes por lavagem. Preparou-se um RNA. que pos, sui poli(A) a partir dos macrófagos pelo método de cloreto de lítio/tiocinato de gaanidina /”Catala e outros:, B, 2_, 329 (1983) 7 conforme segue.

Centrifugou-se sangue periférico humano normal (400 ml) num rotor Itachi RPR10 a 1800 rpm durante 20 minutos. Efectuou-se uma suspensão do precipitado de células sanguíneas resultante, em 50 ml de solução de cloreto de sódio tamponada com zf8 g/litro de NaCl, 0,2 g/litro KC1, 1,15 g/litro de Na^EPO^ anidro, 0,2 g/litro de KH^PO^ (pH 7,2), a seguir abreviado por PBS Acamou-se 25 ml desta suspensão sobre 25 ml de líquido de separação de linfécitos (BIONETICS), e centrifugou-se tudo num rotor Hitachi RPR10¹' a 1800 rpm durante 30 minutos. Recolhe ram-se os leucócitos da camada intermédia, lavaram-se com uvolume igual de PBS (num rotor Hitachi RPKLO a 1500 rpm, duran te 10 minutos), depois, efectuou-se uma suspensão em 20 ml de meio ΚΡΙΈ 1640 (Niseui Seiyaku) contendo 5 % de soro fetal bovino e, efectuou-se a cultura utilizando um recipiente de cultura de tecidos (Corning). Após crescimento a 37°C durante

1,5 horas, removeu-se o sobrenadante da cultura‘conjuntamente com as células não aderentes . Adicionou-se uma porção de 20 ml, recente do mesmo meio e lipopolissacáridos (LPS) derivados de E. coli (numa quantidade para proporcionar uma concentração de 0,3 tng/ml) e a cultura prosseguiu a 37°C durante mais 4 horas. Depois recolheram-se as élulas da cultura por centrifugação a 1100 x g a 4°C durante 10 minutos, lavaram-se com 80 ml de PBS e solubilizaram-se em 10 ml de uma solução constituída por 5 M de tiocianato de guanidina, 10 mM de EDTA, 50 mM de Tris-HCl

8£ (pH 7) e 8 % (y/v) de 2-mercaptoetanol, utilizando um misturador vortex. Transferiu-se este produto solúvel para um tubo centrífugo, adicionaram-se 80 ml de LiCl 4 M e agitou-se a mistura, depois deixou-se em repouso a 4°C durante 20 horas e centrifugou-se num rotor Eitachi BPRIO a £0G0 rpm durante 90 minutos. Depois disto, isolou-se um precipitado de BNA. Fez-se uma suspensão do precipitado de BNA em 50 ml de uma solução cons tituída por 4 X de ureia 2 X de cloreto de lítio, e centrífugo u-se a suspensão num rotor Eitacni BPRIO a 9000 rpm durante 60 minutos e, recolheu-se novamente um precipitado de RNA. Dissolveu-se o precipitado de RNA em 10 ml de uma solução constituída por 0,1 / de lauril sulfato de sódio, 1 ml·' de 3DTA e 10 mh de Tris-ECl (pH 7,5) θ obteve-se o RNA por extracção com fenol/clorofórmio e precipitação com etanol. lissolveu-se o

RNA obtido em 1 ml de uma solução constituída por 10 mk de Tris-HC1 (pH 8,0) e 1 mX de EDTA. Após incubação a 65°C durante 5 minutos, adicionou-se 0,1 ml de ria.cl 5 H. Submeteu-se a mistura a cromatografia em coluna celulose oligo (dT) ( P-I, Biochemicals). Eluiu-se o adsorvido, mRNA contendo poli(A), com uma solução constituída por 10 mM de Tris-HCl (pH 7,5) θ 1 mM de 3DTA para proporcionar cerca de 30 ug de mRNA contendo i

poli(A).

2) Síntese do cDNA e inserção de DNA num vector.

Utilizou-se o método de Okayama—Berg Γmol. Cell.

Biol., 2, 161 (1982) para a síntese do cDNA e construção do plasmídeo recombinante por inserção de cDNA obtido. Os processos para esse fim esquematizam-se na Fig. 9.

A 300 μΐ de uma solução constituída por 1C mi. de Tris-HC1 (pH 7,5), 6 irM de MgCl- e 10 mM de NaCl, adicionaram-se 400 pg de pCDVl /Oksyama â Berg: Mol. Gell. biol., J, 280 (I983) 7 e, ^aPÓs adição de mais 500 unidades de KonL· efectuou-se a reacção a 37°C durante 6 horas, pelo que se cindiu 0 plasmídeo no local hpnl. Recolheu-se ο ο DNA por extracção com fenol/clorofórmio e precipitação com etanol. Adicionaram-se cerca de 200 pg de DNA clivado em Kpnl a 200 pl de uma solução preparada pela adição de dTTP numa concentração de 0,25 mM a um tampão (a seguir designado por TdT) constituído por 40 irli de cacodilato de sódio, 30 mM de Tris-HCl (pH 6,8, 1 mM de CaCl^ e 0,1 mM de ditiotreitol (a seguir abreviado para ΓΤΤ) e após adição de mais 81 unidades de desoxinucleotidil tra.nsferase terminal (a seguir abreviado para TdT) (P-L Biochemicals), efectuou-se a reacção a 37°C durante 11 minutos, pelo que se adicionou uma cadeia de poli(dT) constituída por cerca de 67 resíduos dT a cada um- dos sítios de clivagem Kpnl da extremidade 3’ de pCDVl. Isolou-se' cerca de 100 pg do DNA de pCDVl adicionado à cadeia de poli(dT), a partir da mistura reaccional, referida antes, por extracção com fenol)clorofórmio e precipitação com etanol.

Adicionou-se DNA a 150 pl de um tampão constituído por 10 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM de MgCl^ e 100 mM de NaCl, adicionaram-se, posteriormente, 360 unidades de EcoRI e efectuou-se a reacção a 37°C durante 2 horas. Tratou-se a mistura reaccional pelo método de LGT e, recolheu-se um fragmento de DNA de cerca de

3,1 kb. Obtiveram-se, assim cerca de 60 pg do pCDVl da cauda da cadeia de poli(dT). Dissolveu-se o ENA em 500 pl de uma solução

32/

I.

constituída por 10 mM de Tris-HCl (pH 8,0) e 1 mM de EDTA, in cubou-se a solução a 65°C durante 5 minutos e depois, arrefe ceu-se com gelo e, adicionou-se 50 Jil de NaCl. Submeteu-se a mistura a cromatografia em coluna de celulose (Collaborative

Research)/oligo (dA). As moléculas que possuíam um comprimento de cadeia de poli(dT) suficiente, foram adsorvidas sobre a eluiram-se com uma solução constituída por 10 mM de coluna e

Tris-HCl (pH 8,0) e 1 mM de EDTA. Obtiveram-se assim 27 pg de pCDVl da cauda da cadeia de poli(dT) ( a seguir referido como vector iniciador).

Depois, sintetizou-se um adaptador de DNA.

A 200 pl de tampão constituído por 10 mM de Tris-HCl (pH 7,5)? 6 mM de MgCl^ e 50 mM de NaCl, adicionaram-se cerca de 14 pg de pLl £Okayama & Berg: Mol, Cell. Biol., 3.1 280 (1983)5⁷. Adicionou-se posteriormente 50 unidades de PstI e, efectuou-se a reacção a 37°C durante 4 horas, pela qual se clivou o DM pLl no sítio PstI. Submeteu-se a mistura reaccional a extracção fenol/clorofórmio, seguida por precipitação com etanol pelo com que se recuperou cerca de 13 jig de DNA pLl clivado em PstI. Adicionou -se o DNA (cerca de 13 jdg) dGTP numa concentração riormente, 54 unidades mistura a 37°C durante a 50 /11 de tampão TdT enriquecido com final de 0,85 mM, adicionaram-se, nostede TdT (P-L Biochemicals) e, incubou-se a minutos uma cadeia (dG) contendo cerca pelo qual se adicionou de 14 resíduos DG a pLl nos sítios de clivagem PstI de cada uma das extremidades 3'·

Isolou-se DNA por extracção com fenol/clorofórmio seguida de precipitação com etanol. Adicionou-se 0 DNA a 100 ]il de um tampão constituído'por 10 mM de Tris-HCl (pH 7,5), δ mM de MgClp e 60 mM de NaCl, adicionaram-se posteriormente, 80 unidades de HindIIIe

incubou-se a mistura a 37°C durante 3 horas, pelo que se clivou o DNA de pLl no sítio HindIII. Fraccionou-se a mistuca reaceional por electrofurese em gel de agarose e, recuperou-se um fra£ mento de DNA de cerca de 0,5 kb pelo método de papel-DEAS /'Dretzen e outros: Anal, rio chem., 112, 295 (19'51) J⁷. Obteve-se assim o adaptador de DNA, da extremidade da cadeia, oligo (dG), (a seguir referido, simplesmente, por adaptador de DNA).

Sm 22,3 pl de uma solução constituída por 50 mk de Tris-HC1 (pH 8,3), 8 mM de MgCl₂ , 30 mM de RC1, 0,3 ml·. de DTT, 2 mM de dNTP (dATP, dlTP, dGTP, e dCTP) e 10 unidades ribonuclease

-inibidora (P-L Biochemicals), dissolveram-se cerca de 3 p-S de RNA de poli(A) e cerca de 1,4 pg do vector iniciador (primer, , cada um preparado conforme descrito antes, adicionaram-se 10 uni. dades de trsnscriptase inversa (Seikagaku Kogyo) e processou-se o mRNA para sintetizar o DNA complementar incubando-se de imedia to a mistura a 41°C durante 90 minutos. Submeteu-se a mistura a extracção com fenol/clorofórmio e recolheu-se, po¹” precipita adicionado do BNA. 1issolveu-se este DNA em contendo 66 juN de dCTP e 0,2 pg de poli(A), a 37% durante 2 minutos, pelo que se adicionou uma cadeia (dC) cconten

Extraiu-se a mistuvector cDNA cb caida da cadeia (dC) por precipitação issolveu-se em 4jo pi de por 10 nk de

Tris-HCl (pE

7,5) 6 mM de unidades de HindiII efectuou-se a incubação a 37°C durante

horas para provocar a clivagem no sítio HindiII. A extracção da mistura reaccional com fenol/clorofórmio e a. precipitação sub sequente com etanol proporcionou .),5 picomol.es do

u. iniciador vr do vector de cDNA da extremidade da cadeia (dC).

3m 100 ml de uma solução constituída por 10 mM de Tris-ECl (pH

7,5), 0,1 V de de DNA e 0,4 picomoles do adaptador de DNA, referido incubação a 6p°C, 42°C e 0°C durante 10 antes s, efectuou-se a minutos, 25 minutos, e minutos, respectivamente. Preparou-se um volume total de

0,1 M de KC1 e Q ,1 mM de β - NAD.

A este meio reaccional adioioderivada de tuou-se a incubação a 11°G durante horas. 2nriqueceu-se o meio reaccional com 40 jT de ÕOT? e concentração final ce p-.'AD para proporcionar uma adicionaram-se 10 unidades de DNA com ligase de 3. coli, A0 ae

ANA polirnerase 1 de 3. coli (P-L Biochemicals) e unidades de Biòonuclease Ή de 3. coli a incubação a 12°C durante 1 ho (P-L Biochemicals) e, ra e, depois a 25°C durante 1 hora. 0 procedimento de reacção an· efectuou-se terior provocou a circularizaçao do ΣΤΑ recombinante contendo eLNA e a substituição da porção de BNA do ΒΝΛ-ΙΤΑ de cadeia dupla pelo

8forma de DNA de cadeia dupla completa.

3) Selecção do DNA recombinante contendo 0 cDIIA do hG-CSF

Utilizou-se 0 plasmídeo recombinante obtido conforme des94 / crito em 2), para transformar E. coli C600SF8 segundo o método de Scott e outros /“Katsuya Shigesada: Saibo Kogaku (Cell Technology), 2, 616 (1983)7· Fixaram-se cerca de 9200 colónias obtidas, num filtro de nitrocelulose. Seleccionou-se 7 método de Grunstein-Hogness; Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 72, 5961 (1975)71 uma estirpe capaz de se associar fortemente a 60°C com um ensaio preparado pela marcação de ^^p, do-DNA de sín tese , de 27 bases, 5'—AcCGCCCTGGGOCCTGCCAGCTGCCTG-3¹, que cor responde aos 9 aminoácidos do N-terminal, da proteína de hG-CSF maduro, conforme isolado por Nagata e outros /7Nagata e outros. Nature, 519 , 415, (1986 ) 7· sequência total de bases do DNA contida no plasmídeo pCSFl-2 transportado por estas estirpes, determinou-se pelo método de sequenciação didesoxi utilizando um bacteriófago Ml3 (Tabela 1). Como resultado, descobriu-se que o cDNÂ. contido no pCSFl-2 codifica o hG-CSF.

Depositou-se. esta estirpe bacteriana no FRI seb a designação de E. coli ECSF1-2 (FEEM BP-1220) conforme referido antes.

Exemplo_2_de< referência

Isolamento e purificação do plasmídeo pKYP26

Cultivou-se uma estirpe do E, coli portadora do ρΚϊΡ26 /~E, coli ΙΚΪΡ26 (EEEM BP-863) 7 em 10 ml de meio L (1 % de Bacto-triptona, 0,5 % de extracto de levedura, 1 % de NaCl, a pH 7,5), contendo 50 yug/ml de ampioilina a 37°C durante 18 horas. Transferiu-se a totalidade da cultura para 1 litro de meio D con tendo 50 /ig/ml de ampioilina, e efectuou-se a cultura a 37°C.

/ recorridas 4 horas, adicionou-se cloranfenicol numa concentração de 170 pg/ml e a cultura prosseguiu a 37°C durante mais 16 horas. Recolheram-se as células por centrifugação (5000 rpm, 10 minutos), lavaram-se com NaCl a 0,ê / e efectuou-se uma sus pensão em 25 ml de Tris-HCl 50 ml< (pH c,0), e arrefeceu-se a suspensão em gelo. Adicionou-se lisozina (10 mg/ml, 8 ml) e após repouso em gelo durante 10 minutos, adicionaram-se 9,6 ml de EDTA 0,5 M. Após permanência em gelo durante 10 minutos, adi cionaram-se 2,3 ml de Triton X-100 a 2 / (Weko Pure Chemical Industries) seguindo-se nova permanência em gelo durante 1 hora. A ultracentrifugação a 50 000 X g a 4°C durante 1 hora proporciona cerca de 40 ml de um sotrenadante. Depois, ajustou-se es_ te sobrenadante para pH 12,5 por adição de 3 M de N?0H e agitou-se levemente à temperatura ambiente durante 10 minutos. Fez-se regressar o pH a 0,5 pela adição de 2 N de Tris-HCl (pH 7,5), seguida de posterior agitação durante 3 minutos. Neste momento,o volume do líquido era de cerca de 55 ml· Adicionou-se 1/9 volu mes de NaCl 5 X ®, então efectuou-se a extracção com fenol. Adi cionou-se I/250 volumes de 5 mg/ml de RNase A (Sigma), efectuou-se a reacçao de degra.daçao de mNA a 37 C durante 1 hora, depois, adicionou-se 1/3 volumes de PEm 6000 a 30 /' (Nakarai Chemicals). A mistura resultante permaneceu a -20°C durante 2 horas. Recolheu-se o precipitado resultante por centrifugação e dissolveu-se em 2 ml de uma solução constituída por 10 mL: de Tris-HCl (pH 7,5) e 1 mM de EDTA, adicionou-se dodecilsulfato de sódio (SDS) numa concentração de 0,5 , adicionou-se proteínase K (Si£ ma) numa concentração de 5θ pl/ml e, efectuou-se a reacção pro-

teolítica s 37°C durante 1 hora. Após três repetições da extrac çao com fenol.recolheu-se UNA por extracção com clorofórmio e precipitação com etanol, e, dissolveu-se em 1 ml de uma solução constituída por 10 mM de Tris-ECl (pH 7,5) e 1 mM de EDTA.

Deste modo, obtiveram-se oOO pg de pkYj?26. Confirmou-se a estru tura. de pKYP2ó, por clivagem, com EcoRI, Kpnl, BamEI, BglII e Pstl, seguindo-se a electrofurese err. gel de agarose.

Exemplo de Referência 3

Isolamento do plasmídeo pLTl que transporta o cDN

1)

Seguiu-se o método de cloreto de lítio/tiocinato de guanidina /Cathala e outros: DNA, 2, 329 (1903) 7, psra preparar um RNA portador de poli(A) a partir duma linha Lukll de células linfoblastoides humanas do seguinte modo: fez-se uma sementeira de celuLas linÊtlastades humanas Lukll fèerish 1. Rubin e outros: Proc. Natl. A.cad. Sei. USA, 82, 6637 (19θ5)7 num litro de meio RPM 1640 (Nissui Seiyaku) contendo soro fetal bovino a 5 X e 1 mM de ácido N-l-hidroxi-etil-piperszine/í⁷' -etanossulfónico (HEPES), numa concentração celular de 8 x 10^y células/ml e, ali se desenvolveram. Utilizou-se para, a- cultura um recipiente de cultura giratória. Após cultura a 37°C durante 48 horas, recolheram-se as células por centrifugação e transferiram-se para uma porção de 1 litro de meio RPMI 1640 recente, contendo soro fetal bovino a 5 % e mM de HEPES e efectuou-se a cultura s 37°C por mais 48 horas. Então recolheram-se as células de uma porção ,χ.

f ϊ

(250 ml) desta suspensão celular por centrifugação a 11Ò0 x g a 4°C durante 10 minutos, lavaram-se com 80 ml de fosfato tampão e solubilizaram-se em 10 ml de uma solução constituída por 5 N de tiocinato de guanidina, 10 mX de EDTA, 50 mN 8e Tris-HCl (pH 7) e 2 $ (v/v) de 2-mercaptoetanol, utilizando um misturador turbi lhonar. Transferiu-se o produto de snlubilização para um tubo da centrífuga, adicionaram-se 80 ml de LiCl 4 M e agitou-se a mistura e, depois, deixou-se em repouso a 4°C durante 20 horas Após centrifugação num rotor Hitachi RPR10 a 9000 rpm, durante 90 minutos recuperou-se um precipitado de BNA. Efectuou-se a ressuspensão do precipitado de BNA em 5θ &1 óe uma solução cons tituída por 4 N de ureia e 2 X de cloreto de lítio e, após centrl fugação num rotor “Hitachi RPR10” a 9000 rpm durante 60 minutos, recuperou-se novamente o RNA sob a forma de um precipitado.

rissolveu-s.e o precipitado de REA em 10 ml de uma solução consti sódio a

0,1 >, 1 mX de ml de Tris-HCl (pH 7,5) θ recuperou-se nol/clorofórmio seguida de precipitação

-se cerca de 2,5 mg do BNA assim obtido ο·γ·rj constituída por 10 nX de Tris-HCl (pH 8, incubação a Ó5°C durante 5 minutos, adicionou-se 0,1 ml de aCl contendo poli(A) adsorvido, eluiu-se com uma solução constituída de mRNA contendo poli(A) (2)

Síntese do

inserção

Λ

.. s

Seguiu-se ο método de Okayama-F.erg /kol. Cell. Eiol., 2,

161 (1982) J para, a síntese do cENA e construção do plasmídeo recombinante por inserção do cENA obtido. Os proces sos para esse efeito encontram-se esquematizados na Fig. 9. A 300 pl de ume solução constituída por 10 mM de Tris-HCl (PH 7>5), 6 ml·: de MgCl^ e 10 ml·. de NaCl, adicionaram-se

400 jug de pCIVl /Okayama 5: Lerg; Xol. Cell. Eiol., 3? 280 (1983) J θ, após adição posterior de unidades de ilpnl | efectuou-se a reacção a 37°C durante 6 horas, pelo que se efectuou a clivagem do plasníceo no sítio kpnl.

Recuperou-se ο NNA por extracção com fenol/clorofórmio seguida de precipitação cem etanol.

ir*' centração 0,25 de 81 unidades de 67 resíduos a 37°C durante

mE	a tampão	TdT e, após adição posterior.	, adição
de	TdT (?-L	Eiochemicals), efectuou-se a	reacção
11	minutos,	pelo que ums cadeia poli(dT)	(cerca
dT;	se acres	centou a caca extremidade 31	no sítio

de clivagem com Kpnl do pCLVl. Recolheu-se, a partir da cadeia eipitação com etar.ol seguindo-se a extracção com fenol/clorofórmio. Adicionou-se 0

'.HA a 150 pl de uma solução constituída por ml· de Tris-HCl (p após adição posterior de 36) unidades de ScoRI. efectuou-se a reacção a 37°C durante 2 horas. Tratou-se a mistura reaccional pelo método de LGT e isolou-se um fragmento de ENA de cerca de 3,1 kb. Obteve-se assim cerca de um

constituída por 10 mk de Tris-HCl (pH c,Q) e 1 mk de EETA, incubou- se a solução a 65 % durante 5 minutos e arrefeceu-se com gelo e, adicionaram-se $0 pl de NaCl 5 k. Submeteu-se a mistura, a cromatografia em coluna de oligo(dA)/celulose (Collaborative

Eesearch). As moléculas que possuíam um coirprimento suficiente

de cadeia poli(A) foram	adsorvidas na coluna e eluiram-se com uma
solução constituída por	10 mk de Tris/HCl (pB -:,0) e 1 mk de ED7A
para proporcionar 27 pg	de pCIVl da cauda da cadeia de poli(dT)
(a seguir referenciado	por vector iniciador).

do DNA pLl /õkayama. 7 fcerg:

Mol C_ell. Hiol. J, 28o (1933) ,7 ⁵ ^^J0 de um tampão constituíe, após adição posterior reacção a 37°C durante 4 de unidades de %stl efectuou-se s local PstI. Submeteu-se com fe clivacerca >4 unicades de re s íd uo s

PstI.

por precipitação com etanol. Adicionou-se o DNA a 100 yil de um tampão constituído por 10 mk de Tris-HCl (pH 7,5), 6 mH de ’-.gOle 60 mk de NaCl e, após adição posterior de cO unidades de HindlII, e efectuou-se a reacção a 37°C durante 3 horas para pro

vocar a clivagem do DNA de pLl no sítio HindIII. Fraccionou-se a mistura reaccional por electrofurese em colheu-se

Γ3/Α /Dretzen e outros: Anal

Eiochem., 112, 295 (1981) 7.

Obteve-se assim o adaptador de

DNA da cauda da cade 1,4 pg do vector iniciador em 22,3 de uma solução constituída por 50 mM de Iris/Hcl (pH 8,3), 8 mM de NgCl^, 30 mk ce unidades de inibidor de ribonuclease (?-L Diochemicals) adicio narem-se 10 unidades de transcriptase inversa e, efectuou-se a reacção a 41°C durante minutos para proporcionar a síntese, pelo irRNA, de urr. DNA complementar. Submeteu-se a mistura reaccional a extraeção com fenol/clorofórmio seguida de precipitação com etanol, isolando-se o

ΓΝΑ iniciador vector com uma cadeia du pia de DNA. D is solveu-se 0

DNA-RNA em2j pl de tampão TclT contendo poli(A), adicionaram-se 14 unidades de hctuou-se a incubação a 37°C durante minutos para originar a duos dC) na extremidade 3’ de cDNA. Submeteu-se a mistura reacr_ · cional a extraeção com feno1/clorofórmio e, depois, recolheu-se o DNA iniciador vector de cDNA da cauda da cadeia(dC), por preci pitação com etanol. lissolveu-se constituída por 10 ml de Iris-HCl ml de de NaCl, adicionaram-se 20 unidades de HindiII efectuou-se a reacção a 37°C durante 2 horas para clivagem no sítio HindiII

A extraeção com fenol/clorofórmio da mistura reaccional e preci-

pitação com etanol, proporcionou 0,5 pieomole de ΓΝΑ iniciador vector de cDN/ da cauda da cadeia(dt). Pissolveu-se o IN/:. (0,2

Τ' picomoles) em 100 jil de uma solução constituída por 10 ml·, de

Tris-HCl (pH 7,5), 0,1 l· de NaCl e 1 ml· de ELTA e, efectuou-se a incubação a 65°C, 42°C e 0°C durante 10 minutos, 25 minutos e minutos, respectivamente, por esta ordem. Preparou-se um vo lume total de 100 pl de um meio reaccional, de acordo com a seguinte composição: 20 ml· ce Tris-HCl (pH 7,5), 4 10 ml· defNH^Sfy 0,1 M (fe _íkCl e 0,1 ml· de f?-NAP.

Adicionou-se a este meio reaccional 25 unidades de INA ligase de E. coli (New England Eio-Labs), e, efectuou-se a incubaç te 18 horas. Enriqueceu-se o meio reaccional dNTP e com β-ΝΑΓ) numa concentração final de ção de 10 unidades de DUA. ligase de E. coli, . com 40 0 de cada

0,15 ml· e, após adi unidades de INA polimerase I de E. coli (P-I Biochemicals) e bonuclease H de E. coli (?-L Liochemicals), ção a 12°C durante 1 hora e, depois, e 25°C efectuou-se a incubadurante 1 hora. 0 cl · procedimento de reacção anterior originou a circularizaçao do

LNA recombinante contendo o cDNA e a substituição da porção RUA de cadeia dupla de DNA-RNA pelo IO correspondente. Assim se formou o plasmídeo recombinante sob a forma de um UNA de cadeia dupla completo.

3)

Selecção do

INA recombinante contendo o cDKA do LT humano.

Utilizou-se o plasmídeo recombinante obtido conforme des crito em (2) para transformar o E. coli CÓOOSFS /Cameron: Proc. Natl, Acad. Sei. USA, 72, 3416 (1975)-7 Ρθΐο método de Scott e outros /'Katsuya Shigesada: Saibo Kogaku (Cell technology), 2,

102

616 (I983) 7. Fixaram -se num filtro de nitrocelulose cerca de

30.000 colónias obtidas. Seleccionou-se Tmétodo ce GrunsteinHogness: Proc. Katl. Acad. Sei. USA, £2, 3961 (1975)7: ^{u ;p} estirpe capaz de se associar fortemente, com uma sonda preparada por marcação com com ο ΓΝΑ sintético de 17 bases

Γ t

que corresponde sequência de bases de parte da região 5’ não traduzida do cl·KA do LT humano isolado por Genentech /Patrick X. Jray e outros: Nature, 312. 721 (1984)Τ’· feterminou-se toda a sequência de bases do cENA do plasmídeo pLTl transportado por esta estirpe, ceio método de se quenciação didesoxi utilizando o bacteriófago N13. Gomo resultado, descobriu-se que 0 pLTl codifica para o LT humano.

(4) Construção do plasmídeo recombinante pLAl.

Num total de 50 pl de uma solução (a seguir referenciado como tampão Y-0) contendo 10 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 7 mM de EgCl^ θ 6 mE de 2-mercaptoetanol, dissolveram-se 5 pg de pLTl (4,7 kb) obtido segundo 0 procedimento descrito na secção precedente, adicionaram-se 10 unidades do enzima de restrição XhoII (Boehringer Mannheim) e efectuou-se a reacção de clivagem a 37°C durante 2 horas. Então, adicionou-se NaCl numa concentração final de 150 mM, adicionaram-se 1G unidades do enzima de res trição NSil (Kew England Eio-Labs) e, efectuou-se a reacção de clivagem a 37°0 durante mais 3 noras. A partir da mistura reac cional, obteve-se, pelo método LGT, cerca de 0,3 pg de um fragmento de DNA de cerca de 750 pb (fragmento XhoII - Nsill) contendo a maioria do DNA do LT humano. Separadamente, dissolveram -se 20 pl de pLTl em 200 pl de tampão Y-50, adicionaram-se 40 unidades do enzima de restrição HaeIII e, efectuou-se a reacção

de clivagem 8 37°C durante 2 horas. Então adicioneram-se NaCl numa concentração final de 150 mX, adicionaram-se 40 unidades de Nsil e efectuou-se a reacção de clivagem a 37°C durante mais horas. A electrofurese eir. gel de poliacrilamida da mistura reaccional proporcionou 40 ng de um fragmento de DNA de cerca de 50 pb (fragmento HaelII - Nsil) contendo a porção H-terminal do LT humano.

Sm seguida, dissolveram-se, separsdamente 3 de pGSLl (3,4 kb) num total de 30 pl de tampão N-1G0, adicionaram-se 6 unidades de cada um dos enzimas de restrição StuI e EglII e, efectuou-se a reacção de clivagem a 37°C durante 3 horas.

A partir da mistura reaccional obteve-se, pelo método de LGT, cerca de 1,0 pg de um fragmento de DNA de cerca de 2,3 kb contendo 0 gene de Ap (fragmento StuI-fcglII).

Depois, dissolveram-se 0,2 pg do fragmento XhoII-Nsil derivado de pLTl (cerca de 75'0 pb), 20 ng do fragmento HeelII-Nsil derivado de pLTl (cerca de 50 pb) e 0,6 pg do fragmento Stul-BglII derivado de pGEDl (cerca de 2,3 kb), num total de 20 pl de tampão de T4 ligase, posteriormente adicionaram-se a esta solução de mistura 2 unidades de Τ4ΊΜ liga se e efectuou-se a. reacção a 4'C durante 18 horas.

Utilizou-se o

recombinante para transformar 2. coli 1X430 pelo método de Cohen e outros e, obteve-se uma colónia Ap^x. A partir deste transformante, isclou-se e purifi cou-se 0 DNA plasmídico, por um método corrente e ana.lizou-se a estrutura do referido com enzimas de restrição tal como StuI. Como resultado, confirmou-se que se tinha obtido plasmídeo desejado. Este plasmídeo recombinante designou-se

por pLal.

(5) Construção do plasmídeo pLSAl de expressão de LT.

Efectuou-se uma cultura de um transformante de E. coli

KM430 que alberga 0 pIAl (3,1 kb) obtida conforme descrito na secção precedente e 0 DNA de pIAl preparou-se a partir de células dessa cultura pelo procedimento convencional. Em 30 pl de tampão Y-100 dissolveram-se 3 pg de DNA do pIAl obtido, adicionaram -se 3 unidades de StuI e BglII e efectuou-se a reacção de clivagem a 37°O durante 3 horas. A partir da mistura de reacção obteve-se, pelo método de LGT, cerca de 0,5 pg de um fragmento de DNA de 790 pb (fragmento StuI-BglII contendo a maioria dos genes do LT humano.

Separadamente, dissolveram-se 3 pg de pKYLlO preparado pe_ lo procedimento descrito na patente de invenção norte-americana N° 4.686.191, em 30 pl de tampão Y-100, e adicionaram-se 6 unidades de cada um dos enzimas de restrição BanIII e PstI e efectuou-se a reacção de clivagem a 37°C durante 3 horas. A partir da mis tura reaccional obteve-se, pelo método de LGT, um fragmento de cer ca de 1,1 kb de DNA contendo 0 promotor de triptofano (Ptrp).Poste riormente, dissolveram-se 2 pg de pGELl (3,4 kb) em 20 pl de tampão Y-100, adicionaram-se 4 unidades de cada um dos enzimas de re_s trição HindIII, BaníHI e PstI e efectuou-se a reacção de clivagem a 37°C durante 3 horas. A partir da mistura reaccional obteve-se, pelo método de LGT, cerca de 0,7 pg de um fragmento de cerca de

1,7 kb contendo a porção de terminação derivada de li.poproteína (fragmento Pstl-BamHl).

Separadamente, por razões tais como a necessidade de forneoer a sequência do N-terminal do polipéptido de LT humano madiro, nomea damente Leu (CTA) à segunda base (GG) do 5- aminoácido Gly (GGC)

105

bem como o codão de iniciação necessário para expressão e a ne

r.tre a sequência SI a jusante zou-se o adaptador de DNA seguinte:

. 1 ...

f C ^m x

v a 1

cc

Em primeiro lugar sintetizaram-se os

DNA de 27-mer e 25-mer pelo método habitual do fosfotriéste?. Di solveram-se 27-raer pl de tampão de 14 quinase, adicionaram-se 6 unidades de 14 polinucleótido quinase (Takara Shuzo) e, efectuou-se a reacção de 37°C durante 60 minutos.

fosforilação a.

Depois de 790 pb),

3,4 pg do fragmento BanlII-rstI do vector pKYPlO de expressão e 0,6 pg do fragmento Ps.tl-BamHI derivado de pGELl (cerca de 1,7 kb), ceda um deles obtido conforme des crito antes, em 25 e adicionou-se a esta cerca de 1 picomole do adaptador de posterior de 6 unidades de 14 DNd ligase, a es efectuou-se a reacção de ligação a 4°i, durante 18 ho ras.

Utilizou-se a mistura reaccional contendo o plasmídeo re combinante, para transformar d, coli xuAjO, e obteve-se uma co106 lónia Ap^r

DNA plssmídico recuperou-.se de células deo obtido

PstI, HindiII e BglII seguida por electrofurese em gel de a_oarnse

Designou-se este plesmíàeo por pLSAl. Confirmou-se que do pLSAl na vizinhança de BaniII e HindIII, pelo método ã sequen de kaxam-Gilbert 7 (A. 3

Sei

USA, /4,

560 (1977)7 era

BanIII

' TT ATG CTA

Met Leu

Pro de Beferênci·

Construção do pTrSSO vector de ATG construiu-

-se o plrSLO vector de ATG, no qual a distancia entre a sequência c<

r»

Cx.

SI e o codão de iniciação ATG é de 14 bases e que possui um sítio

Saci imediatamente antes do codão ATu

Primeiro, dissolveram-se 3 jug ds pnYnlO pelo método descri to na Patente de invenção norte-americana 4.686.191 em 36 Jtl de tampão Y-100, adicionaram-se 6 unidades de caca um dos enzimas de restrição BanIII e NruI (I:ew England Eio-Labs) e efectuou-se a reacção de clivagem a 37°C durante 3 horas. A partir da mistura reaccional, obteve-se, pelo método de LGT, cerca de 0,5 pg de um fragmento de DNA de cerca de 3,3 kb contendo Ptrp (fragmento

BanIII-NruI).

Separadamente sintetizou-se, pelo método do

BanIII HindIII Saci

NruI

Vaf

CGATA

3’AGCTTATGAjCT ν'

ATACTCGA . r~ uC (17

Dissolveram-se (10 picomoles de cada) mer) merj jusante de e 17-mer de ume solução cnnten- polinucleótido quinase (Takara Shuzo ) e a reacção de fosfori lação efectuou-se a . 37°G durante 60 minutos.

kb) BanIII - NruI derivado de pilíPlO, obtido conforme descrito antes e cerca, de 0,5 picomole pl de T4 de tampão de 14.ligase, adicionaram-se, depois, te 18 noras (1977)7 e obteve-se uma colónia Ap^r. Becuperou-se DNA plasmídico a par tir da cultura de células desta colónia. Confirmou-se a estrutu ra do plasmídeo obtido por clivagem com os enzimas de restrição

BcoFI BanIII, HindIII, S^cl e Nrui. seguida por electrofure

Confirmou-se, pelo método de sequenciação didesoxi utilizando o

107-A bacteriófago νίβ, que a sequência de ça dos sítios Eanll

BanIII HindiII

SD Sequência AAGG GBAT	CGATA	A et
f « f · φη XX ‘JTQz -L -L ZÉ Λ M	A ' ' i Π1
						X

Claims (24)

1. Reivindicações

   1. - Processo para a preparação de um novo polipeptídio com uma sequência de amino-ãcidos derivada da sequência de amino-ãcidos do polipeptídio do factor de estimulação da colónia de granulócitos humanos (hG-CSF) pela substituição de pelo menos um amino-ãcido por um amino-ácido diferente, caracterizado pelo facto:

   a) de se cultivar em um meio um microrganismo que suporta um plasmídeo recombinante que compreende um DNA de plasmídeo e, como um suplemento, um fragmento de DNA que codifica o polipeptídio referido para assim provocar a formação e a acumulação do referido polipeptídio na cultura; e

   b) de se recuperar o referido polipeptídio da cultura citada.
2. 2. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteri zado por o referido microrganismo pertencer ã espécie Escherichia coli.
3. 3. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido plasmídeo recombinante ser escolhido no grupo que consiste em, pCfTL38, pCfTL41, pCfTL23, pCfTL35, pCfBBlOl, pCfBC42Bl, pCfBC45, pCfBC52, pCfBC59, pCfBC76, pCfBC77, pCfBC93, pCfBC95, pCfBC97, pCfBD28, pCfBD56, pCfBD82, pCfTM14, pCfTM17, pCfTM113, pCfTAArg4S, pCfTAArg4, pCfBD28A17 e pCfBD28T17.
4. 4. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por pelo menos um amino-ãcido da porção N-terminal diferir do amino-ãcido na posição correspondente do polipeptídio de hG-CSF.
5. 5. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracte- rizado por pelo menos um amino-ácido não compreendido no intervalo

   -109do 19 ao 179 amino-ácido na porção N-terminal diferir do amino-ãcido na posição correspondente do polipeptídio hG-CSF.
6. 6. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de pelo menos um amino-ãciô.c não compreendido no intervalo do 19 ao 69 amino-ãcidos na porção N-terminal e o seu 179 amino-ácido diferir do amino-ácido na posição correspondente do polipeptídio hG-cSF.
7. 7. - Plasmídeo recombinante, caracterizado por compreender um DNA de plasmídeo e, como um suplemento, um fragmento de DNA que codifica um polipeptídio gu~ tem uma sequência derivada da sequência de amino-ãcidos do polipeptídio do hG-CSF pela substituição de pelo menos um amino-ácido por um amino-ácido diferente.
8. 8. - Plasmídeo recombinante de acordo com a reivindicação

   7, caracterizado por o DNA do plasmídeo ser um DNA de plasmídeo contendo um promotor de triptofano, com o referido fragmento de DNA inserido no referido DNA de plasmídeo num sítio a jusante do promotor de triptofano.
9. 9. - Plasmídeo recombinante de acordo com as reivindicações

   7 ou 8, caracterizado por o referido fragmento de DNA ter uma sequência tal que pelo menos uma base não compreendida no intervalo da 1 a 51 bases da sequencia de bases foi substituído por uma base diferente.
10. 10.- Plasmídeo recombinante de acordo com a reivindicação

    7, 8 ou 9, caracterizado por ser escolhido no grupo que consiste

    em pCfTL38, pCfTL41, pCfTL23, pCfTL35, pCfBBlOl, pCfBC42Bl, pCfBC45, pCfBC52, pCfBC59, pCfBC76, pCfBC77, pCfBC93, pCfBC95, pCfBC97, pCfBD28, pCfBD56, pCfBD82, pCfTM14,

    -110 pCfTM17, pCfTM113, pCfTAArg4S, pCfTAArg4, pCfBD28A17 e pCfBD28T17.
11. 11. - Microrganismo, caracterizado por suportar um plasmídeo recombinante que compreende um DNA de plasmídeo e, como suplemento, um fragmento de DNA que codifica um polipeptídio que tem uma sequência de amino-ãcidos derivada da sequência de amino-ãcidos do polipeptídio do hG-CSF pela substituição de pelo menos um amino-ácido por um amino-ácido diferente.
12. 12. - Microrganismo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo facto de pertencer ã espécie Escherichia coli.
13. 13. - Microrganismo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por o referido plasmídeo recombinante ser escolhido no grupo que consiste em pCfTL38, pCfTL41, pCfTL23, pCfTL35, pCfBBlOl, pCfBC42Bl, pCfBC45, pCfBC52, pCfBC59, pCfBC76, pCfBC77, pCfBC93, pCfBC95, pCfBC97, pCfBD28, pCfBD56, pCfBD82, pCfTM14, pCfTM17, pCfTM113, pCfTAArg4S, pCfTAArg4, pCfBD28A17 e pCfBD28T17.
14. 14. - Processo para a preparação de um polipeptídio com uma sequência de amino-ãcidos derivada da sequência de amino-ãcidos do polipeptídio do hG-CSF por anulação de pelo menos um amino-ácido, caracterizado pelo facto de se cultivar em um meio um microrganismo que suporta um plasmídeo recombinante que compreende um DNA de plasmídeo e, como suplemento, um fragmento de DNA que codifica o referido polipeptídio para se provocar assim a formação e a acumulação do referido polipeptídio na cultura, e de se recuperar o referido polipeptídio da cultura citada.
15. 15.- Processo para a preparação de um novo polipeptídio com

    -111/ * .-^χ ί - uma sequência de amino-ácidos derivada da sequência de amino-âcidos do polipeptídio do hG-CSF por substituição do 179 amino-ãcido (cisteína) pela serina e anulação do 49 ao 79 amino-ãcidos na porção N-terminal correspondente, caracterizado pelo facto de se submeter um polipeptídio derivado do polipeptídio do hG-CSF por substituição do 179 amino-ãcido (cisteína) pela serina e de pelo menos um amino-ãcido não compreendido no intervalo do 19 ao 69 amino-ãcidos na sua porção N-terminal por um amino-ãcido diferente, à acção de protease no seio de um meio aquoso pelo que se provoca a formação do referido novo polipeptídio na mistura reaccional, e de se recuperar o referido novo polipeptídio da referida mistura reaccional.
16. 16. - Processo para a preparação de um polipeptídio derivado do polipeptídio hG-CSF, caracterizado pelo facto de se eliminar pelo menos um amino-ãcido.
17. 17. - Processo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por faltar pelo rnenosm aminoácido fora do intervalo do 19 ao 179 amino-ácidos na porção N-terminal do polipeptídio do hG-CSF.
18. 18. - Processo de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por faltar o peptídio no intervalo do 19 ao 49, 19 ao 59, 19 ao 69, 19 ao 79 ou do 19 ao 119 amino-ãcidos na porção N-terminal do polipeptídio hG-CSF.
19. 19. - Plasmídeo recombinante, caracterizado por compreender um DNA de plasmídeo e, como suplemento, um fragmento de DNA que codifica um polipeptídio derivado do polipeptídio do hG-CSF por anulação de pelo menos um amino-ãcido.
20. 20. - Plasmídeo recombinante de acordo com a reivindicação

    -11219, caracterizado por compreender um DNA de plasmídeo e, como suplemento, um fragmento.de DNA que codifica um polipeptídio derivado do polipeptídio do hG-CSF por anulação de pelo menos um amino-ácido fora do intervalo do 19 ao 119 amino-ãcidos na porção N-terminal correspondente.
21. 21. - Plasmídeo recombinante de acordo com a reivindicação 20, caracterizado por compreender um DNA de plasmídeo e, como suplemento, um fragmento de DNA que codifica um polipeptídio derivado do polipeptídio hG-CSF por anulação de um pêptido que compreende do 19 ao 119 amino-ãcidos na porção N-terminal correspondente.
22. 22. - Plasmídeo recombinante de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por o DNA do plasmídeo que contêm o promotor dotriptofano ser utilizado como o DNA do plasmídeo referido, com o referido fragmento de DNA inserido no DNA do plasmídeo num sítio a jusante do promotor de triptofano.
23. 23. - Plasmídeo recombinante de acordo com a reivindicação 22, caracterizado por ser escolhido no grupo que consiste em pCfTNS7, pCfTNS301, pCfTNS401 e pCfTNSáOl.
24. 24. - Processo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por, além de se anular o amino-ácido, se substituir o 179 amino-ácido cisteína (Cys) pela serina (Ser).