PT90490B - Processo para a preparacao de acidos aromaticos e do dispositivo que os utiliza - Google Patents
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Description
DESCRIÇÃO
DA
PATENTE DE INVENÇÃO
N.° 90 490
REQUERENTE: CIBA-GEIGY AG., suiça, com sede em Klybeck strasse 141, 4002 Basel, Suiça.
EPÍGRAFE:
PROCESSO PARA A PREPARAÇAO DE ÁCIDOS ARO MATICOS E DO DISPOSITIVO QUE OS UTILIZA.
INVENTORES: Jui Yoa Chang.
Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4.° da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883.
Suiça, em 10 de Maio de 1988 sob o n9 . . 1766/88-3 e em 22 de Março de 1989 sob o n9. 1065/89-2 .
INPI MOO. 113 R F 15732
MEMÓRIA DESCRITIVA
Resumo
O presente invento refere-se a um processo para a preparação de novos ácidos aromáticos, em especial de compostos de fórmula (I),
CIBA-GEIGY AG.
PROCESSO PARA A PREPARAÇAO DE ÁCIDOS AROMÁTICOS E DO DISPOSITIVO QUE OS UTILIZA
em que R^ representa alquilo inferior, R£ representa alquilo inferior, Rg representa hidrogénio, carboxi ou sulfo, R^ representa carboxi ou sulfo, G representa um grupo 1,4-feni1eno, eventua1 mente substituído, ou um grupo 1,4-neftileno, eventualmente substituído, e em que Rg e Rg, em conjunto, representam uma ligação adicional e L representa um átomo de oxigénio ou de enxofre, ou em que Rg representa hidrogénio, Rg representa halogenometilo e L representa um átomo de oxigénio, e dos sais destes ácidos. 0 presente invento diz também respeito a um processo para a preparação de compostos de partida e dos seus sais, usados na preparação dos compostos de fórmula (I) e a um processo para o fabrico de um dispositivo no qual se podem utilizar os compostos de fórmula I e os seus sais, e a um processo segundo o qual se pode utilizar o referido dispositivo.
Os compostos de fórmula I-podem ser utilizados como agentes auxiliares para a investigação de proteínas.
processo para a preparação de compostos de fórmula (I) consiste, por exemplo, em, num composto de fórmu1 a (II):
Ri
Ra
-G—N=N- /* z'
-NHz (II) ou num seu sal, se converter o grupo (Ic) num grupo de fórmula \
presente invento refere-se a um processo para a preparação de novos ácidos aromáticos, nomeadamente compostos de fórmula
Ru (I), em que R^ representa alquilo inferior, representa-a 1qui1 o inferior, R^ representa hidrogénio, carboxi ou sulfo, R^ representa carboxi ou sulfo, G representa um grupo 1,4-fenileno, eventualmente substituído, ou um grupo 1 ,4-nafti leno, eventual_ mente substituído, e em que R^ e R^, em conjunto, representam uma ligação adicional e L significa um átomo de oxigénio ou de enxofre, ou em que R^ representa hidrogénio, R^ representa halogenometilo e L representa um átomo de oxigénio, e se refere aos seus sais, e se refere à utilização dos compostos de fórmula I e dos seus sais, a um processo para a preparação de compostos de partida e dos seus sais, para a obtenção dos compostos de fórmula I e dos seus sais, e se refere ainda a um processo para a preparação de um dispositivo apropriado para a utilização dos compostos de fórmula I e dos seus sais, e se refere a um processo no âmbito do qual o referido dispositivo pode ser utilizado.
Grupos 1,4-feni1eno, eventualmente substituídos, são, por ex., grupos 1,4-feni1eno, eventualmente substituídos por carboxi^ e/ou sulfo, em que os grupos 1,4fenileno substituídos poderão conter um número máximo de 4,
em especial 1 ou 2, dos referidos substituintes. Caso os grupos 1,4-fenilo substituídos apresentem mais de um substituinte, então vários ou todos destes substituintes poderão ser idênticos. Mencionem-se, a título de exemplo, o grupo 2-sulfo, 2,3-, 2,5- e 3,5-dissu1f0-2,3,5-trissu1fo- e 2,3,5,6-te trassulfo-1,4-fenileno, o grupo 2-carboxi-, 2,3-, 2,5- e 3,5dicarboxi-, 2,3,5-tricarboxi- e 2,3,5,6-tetracarboxi-1,4-fenileno, o grupo 2-carboxi-3-sulfo-, 2-carboxi-5-sulfo-, 3-carboxi-5-sulfo-, 2,3-dicarboxi-5-su1fo-, 3,5-dicarboxi-2-sulfo-, 5-carboxi-2,3-dissulfo- e 2-carboxi-3,5-dissu1fo-1,4-feni1eno e, em especial, o grupo 1,4-fenileno.
Grupos 1,4-nafti1eno, eventualemen te substituídos, são, por ex., grupos de 1,4-naftileno, eventualmente substituídos por carboxi e/ou sulfo, em que os grupos 1 , 4-nafti1eno substituídos podem conter um número máximo de 1 a 6, em especial, 1 a 3, dos referidos substituintes. Ca^ so os grupos 1,4-nafti1eno substituídos apresentem mais de um substituinte, então vários ou todos esses substituintes podem ser idênticos. Podemos indicar, a título de exemplo, o grupo
2- , 5- e 6-sulfo-, 2,3-, 5,6-, 6,7- e 2,6- dissulfo-, 2,3,5e 2,3,6-trissu1fo- e 2,3,5,7- e 2,3,6,7-tetrasu1fo-1,4-naftileno, o grupo 2-, 5- e 6-carboxi, 2,3-, 5,6-, 6,7- e 2,6-di carboxi-, 2,3,5- e 2,3,6-tricarboxi- e 2,3,5,7- e 2,3,6,7-tetracarboxi-1,4-naftileno, o grupo 2-carboxi-3-sulfo-, 2-carboxi-5-sulfo-, 3-carboxi-6-sulfo-, 5-carboxi-7-sulfo-, 2,3-dicar boxi-5-sulfo-, 3,5-dicarboxi-2-su1fo-, 6,7-dicarboxi- 2-sulfo3- carboxi-6,7-dissu1fo-, 5-carboxi-2,3-dissu1fo- e 2-carboxi3,5-dissu1fo-1,4-nafti1eno e, em especial, o grupo 1,4-nafti1 eno.
presente invento refere-se, por ex., à preparação de compostos de fórmula I, em que R1 representa alquilo inferior, R2 representa alquilo inferior, R^ re presenta hidrogénio, carboxi ou sulfo, R4 representa carboxi ou sulfo, G representa um grupo 1,4-feni1eno, eventua1emnte substituído, ou um grupo 1,4-naftileno, eventualmente substi-
tuido, Rg e Rg, em conjunto, representam uma ligação adicio nal e L significa um átomo de oxigénio ou de enxofre, e se refere aos seus sais.
Os compostos de fórmula I podem estar presentes, em parte, sob a forma de estereoisómeros. Se, por ex., os compostos de fórmula I apresentarem pelo menos um átomo de carbono quiral (átomo C*) por ex., um átomo C* de um corespondente radical R^), eles poderão estar presentes, por ex., como enantiómeros ou misturas enantiómeras, tal como sob a forma de racematos, e, caso ainda esteja presente, pelo menos, mais um centro assimétrico (por ex., um átomo de C de um j correspondente radical R£), eles podem também estar presentes jj sob a forma de diastereómeros, misturas diastereómeras ou misí! turas de racematos.
1' (! :í jj Sais de compostos de fórmula I são em especial sais com bases, de preferência, sais com bases, farmacêuticamente aceitáveis, por ex., sais de metais alcalinos ou de metais alcalino-terrosos, por ex., sais de sódio, potássio ou magnésio, sais de metais de transição, tais como ! os sais de zinco ou de cobre, ou sais com amónia ou aminas orgânicas, tais como aminas cíclicas, tais como mono-, di- ou tri-alquilo infer ior-aminas , como h idrox i-a 1 qu i 1 o infer ior-amj_ nas, por ex., mono-, di- ou tri-hidroxi-alquilo inferior-ami nas, hidroxi-alquilo inferior- alquilo inferior- aminas ou po1ihidroxi-alquilo inferior-aminas.
Aminas cíclicas são, por ex., morfolina, tiomorfolina, piperidina ou pirrolidina. Mono-alquilo inferior-aminas são, por ex., etil- ou jt-but i 1-am i na ; d i a 1 q uj_ lo inferior-aminas são, por ex., dietil- ou diisopropi1-amina; trialquilo inferior-aminas são, por ex., trimetil- ou trietilam i na.
Hidroxi-alquilo inferior-aminas co£ respondentes são, por ex., mono-, di- ou tri-etanolamina , e hidroxi-alquiIo inferior-alquilo inferior-aminas, são, por ex.
N, N-d imet i 1 -ami no- ou N, N-dieti 1 amino-etanol, enquanto polihj_ droxi-a 1qui1 o inferior-aminas são, por ex., g1ucosamina. Os compostos de fórmula I podem também formar sais de adição de ácidos, de preferência sais de adição de ácidos, farmacêuticamente aceitáveis, por ex., com ácidos inorgânicos fortes, tais como ácidos minerais, por ex., ácido sulfúrico, com um ácido fosfórico ou um ácido halídrico, com fortes ácidos carboxíli cos orgânicos, tais como ácidos carboxílicos de alcanos infe riores, por ex., ácido acético, tal como ácidos dicarboxí1icos, eventualmente insaturados, por ex., ácido malónico, ácido ma leico ou ácido fumárico, ou com ácidos hidroxi-carboxí1icos, por ex., ácido tartárico ou ácido cítrico, ou com ácidos sulfô nicos, tais como ácidos sulfónicos de alcanos inferiores ou ácidos benzenossulfónicos, eventua1 mente substituídos, por ex. ácido metano- ou ácido £-tolueno-sulfónico. Os compostos de fórmula I podem também formar sais internos. 0 presente invento refere-se também â preparação de sais de compostos I, menos apropriados para fins farmacêuticos. Estes sais podem ser utilizados, por ex., para o isolamento ou a purificação de compo^ tos de fórmula I, livres, do presente invento, bem como dos seus sais, farmacêuticamente aceitáveis.
Na presente memória descritiva, o termo inferior utilizado em relação com os radicais ou compostos do invento, significa - a não ser que haja qualquer meia ção em contrário - os radicais ou compostos que contêm um núm£ ro máximo de 7 átomos de carbono, em especial, um número máximo de 4 átomos de carbono.
Alquilo inferior representa, por ex., C1-C4-a1qui1 o, tal como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo ou terc.-butilo e abrange ainda radicais de Cg-Cy-alquilo, isto é, radicais pentilo, hexilo ou heptllo.
Ha1ogenometi1 o representa flúoro-, cloro- ou bromo-meti1 o, e em especial, representa iodometilo.
Os compostos de fórmula I e seus sais possuem valiosas propriedades. Assim, por ex., eles podem ser utilizados como agentes auxiliares na análise de proteínas por ex., como reagentes para a modificação química de proteí nas. 0 conceito de proteínas abrange na presente memória de£ critiva tanto péptidos com uma massa molar relativa de 10.000 ou mais, que, geralmente, se designam por proteínas, como também encerra os péptidos com uma massa molar relativa inferior a 10.000, que geralmente, se designam por poli-péptidos, o limite inferior para a massa molar relativa dos polipéptidos varia entre cerca de 1000 e cerca de 2000. Do grande número das aplicações, em que a modificação química de proteínas poderá desempenhar um papel importante, poderemos mencionar a determinação da estrutura e a coloração de proteínas.
Sabe-se que a simples modificação de um único constituinte amino-ácido de uma proteína, ou de a]_ guns poucos dos seus constituintes amino-ácidos, é capaz de aj_ terar significativamente a estrutura espacial de uma proteína e, desta maneira, também a sua função, por ex., a sua activid£ de biológica. Desta forma, existe a possibilidade de aproveitar a modificação química específica dos amino-ácidos consti tuintes como um processos largamente aplicável para a determinação da contribuição destes constituintes estruturais para a estrutura espacial de uma proteína. Põe-se assim, o problema de relaccionar a alteração, eventualmente verificada, em virtu de de uma determinada modificação química de amino-ácidos con£ tituintes com o tipo e a extensão desta modificação química. Para isso, é necessário determinar a estrutura de uma proteína modificada quimicamente e compará-la com a estrutura existente antes da modificação química. Uma das finalidades de uma ae terminação estrutural deste género consiste em verificar como é que a estrutura primária da proteína se alterou pela modificação química, isto é, quais foram os amino-ácidos constituin-9-
tes que sofreram uma modificação química. Frequentemente, nestas determinações da estrutura primária proteica procede-se de forma a tratar uma proteína M. modificada quimicamente, que α
se obtém a seguir à modificação química de uma correspondente proteína não-modifiçada N . e a proteína N, não-modificada, α α eventualmente após realização de uma etapa de desnaturação, eventualmente necessária com a mesma protease, em seguida, as 1 1 misturas peptídicas assim obtidas e N são submetidas à cro α α — matografia líquida de elevada resolução (HPLC), comparando-se 2 os padrões dos picos nos dois cromatogramas resultantes Ma e a N . Utilizam-se, neste caso, geralmente sistemas de detecção α
para o obtenção destes cromatogramas, que analisam o comportamente em termos da absorção da luz dos péptidos. Geralmente, o 2 padrão dos picos no cromatograma PI distingue-se naquelas zonas 3 a em que são detectados péptidos M . que pelo menos contem um α amino-ácido modificado quimicamente, do padrão dos picos no 2 3 cromatograma N . dado que os péptidos M . por via de regra, α α apresentam um comportamento em termos de absorção da luz dife3 rente daquele dos correspondentes péptidos N não-modificados.
a
Separam-se os péptidos F4 e submetem-se estes péptidos a uma α
análise ulterior da sua estrutura primária, por ex., a análise da sequência dos aminoácidos. Num caso ideal, é possível iden_ tificar e caracterizar, desta maneira, qualquer amino-ácido constituinte, quimicamente modificado.
No entanto, o processo atrás referj_ do apresenta ainda mitos defeitos. Assim, por ex., acontece que no caso de uma massa molecular relativa mais elevada da proteína en análise, geralmente, após tratamento com a protease, existem na correspondente mistura peptídica muitos pépti dos diferentes, cuja presença não permite realizar uma separação adequada, por HPLC, desta mistura peptídica. Além disso, a própria modificação química é muitas vezes demasiado complexa, decorre, frequentemente, de forma não-especifica, incide portanto sobre muitos constituintes amino-ácidos de estrutura diferente, ou até em todos os amino-ácidos da proteína em análise. Com vantagem, a modificação química deveria decorrer de
forma bastante específica, isto ê, abranger uma classe circuns. crita de amino-ácidos, com vantagem, uma classe estreitamente definida em termos de tipo e número, de constituintes amino-ácidos da proteína em questão.
Assim, é conveniente que o processo atrás descrito seja aperfeiçoado, eliminando as referidas desvantagens, o que se reveste de grande interesse prático. Os compostos de fórmula I e os seus sais, revelados no âmbito do presente invento, tornam possível a desejada optimização deste processo. 0 aperfeiçoamento/optimização será seguidamente esclarecido com base nos compostos de fórmula I, em que R1 a R4 e G rêm os referidos significados, R$ e Rg, em conjunto, representam uma ligação adicional e L representa um átomo de oxigénio ou de enxofre, e nos seus sais. Estes compostos serão designados, seguidamente, por compostos de fórmula IA.
Na modificação química de uma proteína, isto é, durante a reacção com esta proteína, os compostos IA e os seus sais reagem, em primeiro lugar, e de forma práticamente exclusiva, com os grupos amino na posição e de radicais lisina (elemento estrutural lisina), observando-se uma elevada reactividade. Apenas em casos isolados é que se verifica primeiro uma reacção com o grupo amino do radical aminoácido N-terminal da respectiva proteína. Assim, os radicais amino-ácidos de uma proteína, que sofram a modificação química por um composto de fórmula IA ou por um dos seus sais, encontram-se estreitamente delimitados, quanto ao género e número, de maneira inequívoca e vantajosa. Assim, o número dos elementos estruturais aminoácidos, quimicamente modificados, não é geralmente superior ao número dos radicais lisina presentes na proteína em análise. Apenas num caso especial, aquando de uma modificação N-terminal adicional, este número poderá ainda ser maior pela unidade 1.
Além disso, a utilização de um composto de fórmula IA ou de um dos seus sais para a modificação
química de uma proteína apresenta a vantagem de que, após o tratamento por proteases, da proteína M. resultante, químicaD 1 mente modificada, se obtém uma mistura peptídica M&, a qual, mediante simples cromatografia líquida em fase invertida, de elevada poder de resolução (reversed phase HPLC) é susceptível 3 de separação, geralmente completa, dos péptidos Mb (contendo, pelo menos um aminoácido constituinte, quimicamente modifica3 do) dos restantes péptidos N^.
Além disso, os péptidos M., por um 1 D lado, contidos na mistura peptídica Mb, contendo pelo menos um amino-ácido constituinte, quimicamente modificado, e os pép tidos não-modifiçados, por outro lado, podem ser detectados respectivamente, a diferentes comprimentos de onde, dado que 3 os péptidos Mb apresentam um comportamento em termos de absorção da luz que se distingue nitidamente do observado no caso dos peptídos N, . Esta circunstância facilita muito a identifiD 3 cação dos péptidos Mb.
Assim, os péptidos Mb, sendo coloridos, podem ser detectados, com vantagem, a comprimentos de onda da luz visível, por ex., a comprimentos de onda de 400 a cerca de 800 nm, em solução ácida, por ex., de 535 nm, ou, em solução alcalina, a um comprimento de onda de 465 nm, de preferência, a um comprimento de onda indicado nos exemplos práticos 10 a 15.
Em contrapartida, os péptidos incolores Nb podem ser visualizados a um comprimento de onda de
200, 220 ou 280 nm, não interferindo com a detecção dos pépti3 dos de cor Mb>
Acrescentemos que se reveste de especial interesse o facto de não apenas serem coloridos os pép3 tidos Mb, mas também a correspondente proteína Mb, quimicamente modificada, a partir da qual se formam os péptidos Mb após tratamento por proteases. Dado que a modificação química de
uma proteína por um composto de fórmula IA ou um dos seus sais sempre acompanhada por uma coloração da respectlva proteína, os compostos de fórmula IA e os seus sais podem também ser utilizados como reagentes para a coloração de proteínas. As proteínas Mg coloridas, obtidas através da reacção de grupos fc-amino de radicais de lisina, bem como, nalguns casos, através da reacção adicional do grupo amino do radical amino-ácido N-terminal, de correspondentes proteínas Ng não-modifiçadas, incolores, com um composto de fórmula IA ou um dos seus sais, podem ser utilizadas, de várias maneiras, para fins analíticos e/ou diagnósticos. A separação e detecção das proteínas Mg coloridas, e as indicações correspondentes, atrás mencionadas relativamente à separação e detecção de péptidos de cor
3
Μ^, são equivalentes. Também os péptidos Mg podem ser frequentemente uti 1 izados' para fins analíticos e/ou diagnósticos.
Visto que as análises de proteínas se realizam, geralmente, em solução aquosa ou em soluções contendo água, segue-se que a boa hidrossolubi1 idade inerte aos compostos IA e seus sais constitui mais uma propriedade valiosa destes compostos.
Dado que também as proteínas M. , D quimicamente modificadas, e os péptidos Mg, que contem pelo menos um radical amino-ácidos quimicamente modificado, se distinguem por uma óptima solubilidade na água, torna-se possível realizar a reacção de proteínas Ng com um composto IA ou um dos seus sais, também outras etapas de processo adicionais, eventua1 mente previstas, e usuais aquando da análise de proteínas, por ex., aquelas do género mencionado adiante, em solução aquosa, eventua1 mente com adição de um dissolvente orgânico.
No âmbito da reacção com um composto de fórmula IA ou um dos seus sais, os correspondentes grupos amino de uma proteína Ng, de fórmula geral H^N-R (Ia), em que RY representa o radical da proteína, isto é, os grupos
A
£-amino dos radicais de lisina, bem como, nalguns casos, adicionalmente o grupo amino do radical amino-ácido N-terminal, são convertidos em grupos carbamoílo ou tiocarbamoílo, de modo a obter-se uma proteína, quimicamente modificada, de fórmula
Ri
R2 ^n-g-n=n— \
/
Ru
7— NH-C-NH-R (Ib), em que R1 a R4, Rx e G têm os significados atrás referidos, e L representa um átomo de oxigénio ou de enxofre. A velocidade desta reacção de conversão aumenta á medida que aumentam a temperatura reaccional e o valor do pH, do meio reaccional. Condições reaccionais típicas constam, por ex., dos exemplos práticos 9 a 15. Num caso normal, a estabilidade dos compostos de carbamoílo ou de tiocarbamoílo nas proteínas Ib será de tal ordem que as proteínas Ib possam ser armazenadas durante vários dias sem sofrerem qualquer decomposição importante, e resistem também, sem alteração, a outras etapas de processo, usuais aquando da análise de proteína, tais como a separação cromatográfica, por ex., por meio de cromatografia de separação molecular, tal como a cromatografia em geles, ou HPLC, tal como tratamentos enzimáticos, por ex., o tratamento com uma protease, por ex., com tripsina ou quimotripsina, e ainda outras reacções-padrão, por ex., etapas de desnaturação, por ex., a redução de pontes de dissulfureto e subsequente carboxi-metilação dos grupos mercapto, ou reacções-testemunha para a análise da actividade bioLógica. Estas etapas de processo são conhecidas ou podem realizar-se em analogia às conhecidas
etapas reaccionais. Pormenores específicos relativamente às referidas etapas reaccionais constam igualmente dos exemplos práticos 9 a 15. Quanto à estabilidade dos grupos de carbamoí3 lo ou de tiocarbamoílo, nos pêptidos M&, são aplicáveis as afirmações feitas em relação às proteínas Ib.
Para a optimização, atrás mencionada, do processo para a modificação química de proteínas e para a determinação da estrutura primária destas proteínas, quimicamente modificadas, podem utilizar-se, para além dos compostos de fórmula IA e de seus sais, também compostos de fórmula I, em que R1 a R^, e G têm os referidos significados, R^ representa hidrogénio, R^ representa ha 1ogenometi1 o e L representa um átomo de oxigénio, e os seus sais. Estes compostos serão designados, seguidamente, por compostos de fórmula IB.
As afirmações feitas em relação aos compostos de fórmula IA e seus sais, são também aplicáveis, de forma análoga, aos compostos de fórmula IB e seus sais. No entanto, os compostos IB e os seus sais, aquando da modificação química de uma proteína, isto é, na reacção com esta proteína, não reagem nem com os grupos t-amino de radicais de lisina, nem com o grupo amino do radical amino-ácido N-terminal da respectiva proteína. Pelo contrário, durante a reacção com um composto de fórmula IB ou com um dos seus sais, acontece específicamente de que os grupos mercapto de radicais cisteína contidos numa proteína N , de fórmula geral HS-R (Id) , em que
J
R , em cada caso, representa o radical da proteína, são convertidos em grupos carbonilmeti1tio, de modo a obter uma proteína, quimicamente modificada, de fórmula
-15Ri
Rj r/
-CH2-s-r (Ie), em que a R4, Ry e 6 são tal como atrás quando se utilizam compostos IB e os seus definidos. Assim, sais, geralmente a natureza e o número dos elementos estruturais amino-ácidos, que sofrem uma modificação química, são também definidos de maneira inequívoca e, com vantagem, definidos de forma restrita; o número de amino-ãcidos constituintes, quimicamente modificados, não é superior ao número de resíduo de cisteína contidos na proteína em análise.
Assim, o presente invento refere-se também â utilização de compostos de fórmula I e dos seus sais, como agentes auxiliares na análise de proteínas, por ex., como reagentes para a modificação química de proteínas, em especial como reagentes para a modificação química de proteínas, associada com um processo de coloração. Poderá também estar abrangida a formulação industrial dos agentes auxiliares.
invento refere-se também a um processo correspondente para a modificação química de proteínas, em especial a um processo para a modificação química de proteínas, associada com uma coloração, processo esse que se caracteriza pela reacção da respectiva proteína com um composto de fórmula I ou com um dos seus sais.
-160 presente invento refere-se em especial à preparação de compostos de fórmula I, e dos seus sais, em que representa alquilo inferior, Rg representa alquilo inferior, Rg representa hidrogénio, carboxi ou sulfo, R^ representa carboxi ou sulfo, G representa um grupo 1,4-fenileno insubstituído ou substituído por carboxi e/ou sulfo, ou um grupo 1 ,4-naftileno insubstituído ou substituído por carboxi e/ou sulfo, e em que Rg e Rg, em conjunto, representam uma ligação adicional e L representa um átomo de oxigénio ou de enxofre, ou em que Rg representa hidrogénio, Rg representa halometilo e L significa um átomo de oxigénio.
presente invento refere-se em especial à preparação de compostos de fórmula I e dos seus sais, em que R1 representa alquilo inferior, R2 representa alquilo inferior, Rg significa hidrogénio, carboxi ou sulfo,
R4 representa carboxi ou sulfo, G representa um grupo 1,4-fenileno insubstituído ou substituído por carboxi e/ou sulfo, uo um grupo 1,4-naftileno insubstituído ou substituído por carboxi e/ou sulfo, Rg e Rg, em conjunto, representam uma ligação adicional e L representa um átomo de oxigénio ou de enxofre .
Mais especialmente, o presente invento refere-se à preparação de compostos de fórmula I e dos seus sais, em que R1 representa C1-C4-a 1qui10, tal como metilo ou etilo, Rg representa -C^-alquilo, tal como metilo ou etilo, Rg representa hidrogénio ou sulfo, R^ representa sulfo, G representa um grupo 1,4-fenileno insubstituído ou substituído por sulfo, e em que Rg e Rg, em conjunto, representam uma ligação adicional e L representa um átomo de oxigénio ou de enxofre, ou em que Rg representa hidrogénio, Rg representa iodometilo e L representa um átomo de oxigénio.
presente invento refere-se especialmente à preparação de compostos de fórmula I e os seus sais, em que R1 representa C1-C^-a1qui10, tal como metilo ou
etilo, R2 representa C1-C^-alquilo, tal como metilo ou etilo, Rg representa hidrogénio ou sulfo, R^ representa sulfo, G representa um grupo 1,4-fenileno insubstituído ou substituído por sulfo, Rg e Rg, em conjunto, representam uma ligação adicional e L representa um ãtomo de oxigénio ou de enxofre.
presente invento refere-se especialmente à preparação de compostos de fórmula I e dos seus sais, em que R^ representa C-C^-a1qui1 o, tal como metilo, R2 representa C1-C^-alquilo, tal como metilo, Rg representa hidrogénio, R^ representa sulfo, G representa um grupo 1,4-fenileno insubstituído, e em que Rg e Rg, em conjunto, representam uma ligação adicional e L representa um átomo de enxofre, ou em que Rg representa hidrogénio, Rg representa iodometilo e L representa um átomo de oxigénio.
presente invento refere-se mais especia 1 mente à preparação de compostos de fórmula I, e dos seus sais, em que R1 representa C1-C^-a1quilo, tal como metilo R2 representa C-C^-a1qui10, tal como metilo, Rg representa hidrogénio, R^ representa sulfo, G representa um grupo 1,4-fenileno insubstituído, Rg e Rg, em conjunto, representam uma ligação adicional e L representa um átomo de enxofre.
presente invento refere-se específicamente à preparação dos novos compostos de fórmula I, referidos nos exemplos práticos, e dos seus sais.
processo de acordo com 0 presente invento, para a preparação de um composto de fórmula I ou um dos seus sais, caracterizado, por ex., pelo facto de num composto de fórmula
ou num dos seus sais, se converter o grupo NH2 num grupo de fórmu1 a rr (lc) e, caso se desejar, se separar uma mistura isómera obtida segundo o processo do invento, nos seus componentes e se isolar o desejado isómero de fórmula I, se resolver uma mistura de enantiómeros ou diastereómeros obtida nos enantiómeros ou diastereómeros individuais e se isolar o desejado enantiómero ou diastereómero, e/ou se converter num sal um composto livre de fórmula I ou se converter um sal obtido no composto livre de fórmula I ou num outro sal.
As referidas reacções e as reacções que irão ser apresentadas mais adiante, realizam-se de maneira conhecida per se, por ex., na presença de um catalisador e/ou na ausência ou, geralmente, na presença de um solvente ou di-19-
luente inerte apropriado ou de uma mistura correspondente, geralmente, as reacções realizam-se, conforme as condicionantes, sob arrefecimento, à temperatura ambiente ou sob aquecimento, por ex., numa gama de temperaturas compreendida entre cerca de -809C e o ponto de ebulição do meio reaccional, de preferência entre cerca de -209C e cerca de +1509C e, se for necessário, num reactor fechado, sob pressão, numa atmosfera de um gás inerte e/ou em condições anidras.
São conhecidos ou podem ser preparados segundo processos conhecidos per se, alguns dos componentes de partida de fórmulas II, lia, III, IV, IVa e V, atrás referidos e a mencionar mais adiante, e que são utilizados para a preparação de compostos de fórmula I ou dos seus sais.
Os compostos de partida contendo centros básicos poderão estar presentes sob a forma de sais de ácidos, por ex., com os ácidos atrás mencionados, ao passo que os compostos contendo grupos acídicos podem formar sais com bases, por ex., do gênero atrás referido.
A transformação do grupo amino (NH2) presente num composto de fórmula II ou num dos seus sais, num grupo de fórmula Ic, pode realizar-se, por ex., fazendo reagir o composto de fórmula II ou um dos seus sais com um composto de fórmula
Zi
C=L (lia),
em que L representa um átomo de oxigénio ou de enxofre e e Zg, quer independentemente um do outro, reprrsentam um grupo nucleofófugo de partida G1 ou, em conjunto, representam oxo livre ou modificado na sua função, G£, ou em que L representa um átomo de oxigénio, Z^ representa um grupo nucleófugo de partida G^ e Z^ representa halometilo.
Grupos G.| nucleófugos de saída são por ex., grupos mercapto ou hidroxi livres, eterificados ou esterifiçados, e ainda grupos amino, amónio ou sulfõnio. Hidroxi eterificado representa, por ex., alcoxi inferior, tal como metoxl ou etoxi, ou fenilo-alcoxi inferior insubstitu ido ou substituído, talccomo benziloxi, insubstituído ou substi tuido. Hidroxi esterificado representa sobretudo hidroxi est£ rificado por um ácido mineral ou um ácido sulfônico orgânico, em especial halogênio, tal como cloro, bromo ou iodo, sulfoniloxi, tal como alcano inferior-sulfoniloxi insubstituído ou halosubstituido, por ex., metanossulfoniloxi, ou trifluorometano-su1foni1oxi, cic1 o-a 1cano-su1foni1oxi, por ex., ciclo-he xano-su 1 f on i 1 ox i , ou benzenossu 1 f on i loxi insubstituído ou subs^ tituído por alquilo inferior ou halo, por ex., benzenossu1foniloxi, £-bromofeni1su1foni1oxi ou p-toluenossu1foni1oxi, e ainda alcanoloxi inferior, por ex., acetoxi ou pivaloíloxi. Mercapto eterificado representa, por ex., alquilo inferiortio, tal como metiltio ou etiltio, ou feniltio insubstituído ou substituído, tal como feniltio ou p-toliltio. Grupos mercapto esterificados são, por ex., grupos alcanoíltio inferior, tal como acetiltio. Grupos amino são, por ex., amino, N-alqu_i_ lo inferior amino, N,N-dia 1qui1 o inferior-amino ou N-alcanoilo inferior-amino, e também grupos Ν,Ν-alcileno inferior-amino ou N,N-aza-, Ν,Ν-oxa- ou N,N-tia-alcileno inferior amino, por ex., dimetilamino ou dietilamino, e também pirrolidino, piperidino, morfolino ou tiomorfolino, e ainda anilino. Gru pos amónio são, por ex., grupos amónio terciários ou quaterná_ rios, correspondentes aos grupos amino atrás referidos, tal como trialquilo inferior-amónio ou piridino. Grupos sulfónio são, por ex., grupos dialquilo inferior-sulfónio, tal como
dimet i1su1fÔn io.
Oxo G2, livre ou modificado na sua função, representa, por ex. oxo, tioxo ou um grupo =N-R*. Gri[ pos =N-R' são, por ex., aqueles grupos, em que R' representa hidrogénio, alquilo inferior ou um radical acilo, tal como aj_ canoílo inferior, benzoílo insubstituido ou substituído, piridóilo ou alcano inferior-sulfonilo, por ex., imino, N-alquilo inferior-imino, N-alcanoílo inferior-imino, N-benzoí1imino insubstituido ou substituído, ou grupos N-alcano inferior sulfoni1imino.
Compostos de fórmula lia que se ut_[ lizam, de preferência, para a preparação de compostos de fórmula I, em que Rg e Rg, em conjunto, representam uma ligação adicional, ou os seus sais, são, por ex., tiofosgénio (Z1 =
Z2 = cloro) e dissulfureto de carbono (Z1 e ~ tioxo), que dão origem â formação de compostos de fórmula I, em que L representa um átomo de enxofre, ou dos seus sais, e ainda fosgénio (Z1 = Z2 = cloro), que dá origem à formação de compostos de fórmula I em que L representa um átomo de oxigénio, ou dos seus sais.
Compostos de fórmula lia, que se usam de preferência para a preparação de compostos de fórmula I, em que Rg representa hidrogénio e Rg representa halometiio, ou dos seus sais, são, por ex., ácidos haloacéticos (Z^ = hidroxi; Z2 = halometiio; L = oxigénio) e os correspondentes derivados de ácidos haloacéticos reactivos (Zp por - halogénio, alcoxi inferior ou su1foni1oxi).
A reacção de um composto de fórmula II ou de um dos seus sais com um composto de fórmula I Ia realiza-se de maneira usual, por ex., na presença eventual de um agente de condensação, tal como uma base apropriada, e, no caso da reacção com compostos de fórmula lia, em que Z1 e Z2.
em conjunto, representam tioxo, eventua1 mente na presença de um agente capaz de se combinar com enxofre e, no caso da reacção com compostos de fórmula lia, em que representa G1 , Z2 representa halometilo e L representa um átomo de oxigénio, eventualmente na presença de um agente desidratante, na ausência ou, geralmente, na presença de um solvente ou diluente inerte, apropriado, ou numa mistura correspondente e, segundo as necessidades, sob arrefecimento, à temperatura ambiente ou sob aquecimento, por ex., numa gama de temperaturas compreendida entre cerca de -802C e cerca de +200QC, de preferência, entre cerca de -205C e cerca de +1505C e, se for necessário, num reactor fechado, sob pressão e/ou numa atmosfera de um gás inerte, tal como azoto.
Bases apropriadas são, por ex., hidróxidos, hidretos, amidas alcanolatos, carbonatos, trifenilmetilidas, dialquilo inferior-amidas, amino-alquilo inferior-amidas e alquilo inferior-si 1ilamidas de metais alcalinos, ou naftalenoaminas, alquilo inferlor-aminas, compostos heterocíclicos básicos, hidróxidos de amónio e aminas carbocíc1icas. Exemplos que convém referir são: hidroxido de sódio, hidreto de sódio, amida de sódio, etanolato de sódio ou carbonato de sódio, terc.-butanolato ou carbonato de potássio, trifenilmetilida de litio, diisopropi1amida de litio, 3-(aminopropi1 ) -amida de potássio ou bis-(trimeti1si1i1 )-amida de potássio, ou ainda dimeti1aminonafta 1eno, di- e tri-eti 1 amina , piridina, hidróxido de benzi1-trimeti1amónio, 1,5-diaza-bicic1o/4.3.Qjnon-5-eno (DBN) e 1 ,5-diazabicíc 1 o/*5.4. Ojundec-5-eno (DBU).
Agentes apropriados capazes de se ligar ao enxofre, para a reacção com compostos de fórmula I Ia, em que Z1 e Z2, em conjunto, representam tioxo, são, por ex., óxidos de fósforo, tais como deca-óxido de tetra-fósforo, carbodiimidas, tal como carbodiimida de N,N1-diciclohexilo, bem como derivados do ácido carbónico, tais como ésteres do ácido carbónico, por ex., ésteres de alquilo inferior de ácido halocarbónico, tais como ésteres etílicos de ácido clorocarbónico.
Agentes apropriados, capazes de se combinarem com a água, para a reacção com compostos lia, em que Z1 representa G1, Z2 representa halometilo e L representa oxigénio, são, por ex., óxidos de fósforo, tal como deca-óxido de tetrafósforo, bem como carbodiimidas, tal como carbodiimida de N , N 1 -d i c i c 1 ohex i 1 o ou carbodiimida de N-Z3-(N , N-dimeti1amino)-propi lJ-N1-etilo e os seus saís de adição de ácidos, por ex., o hidrocloreto.
Solventes ou diluentes inertes apro priados são, por ex., água e, também na forma de misturas com a água, éteres cíclicos, hidrocarbonetos, insubstituídos ou halogenados, alcanos inferiores halogenados, amidas de ácido N,N-dia 1qui 1 o inferior-alcanóicos inferiores, alquilo inferior -amidas de ácido fosfórico, dialquilo inferior-sulfóxidos, compostos heterocíc1icos básicos e alcanóis inferiores, tais como tetrahidrofurano, dioxano, benzeno, tolueno, xileno, clorobenzeno, 1,2-dic1orobenzeno, triclorometano, Ν,Ν-dimetilformamida triamida de ácido hexametilfosfórico, sulfóxido de d imetilo, piridina, N-metilmorfolina, metanol e etanol.
composto de partida de fórmula
II ou um dos seus sais podem ser preparados análogamente a processos conhecidos, por ex., por meio de hidrólise, isto é, mediante reacção com água, de um composto de fórmula.
Ri \
• ΞΞΓ · z \
em que Y representa um radical acilo, ou com um dos seus sais.
Radicais acilo Y são, por ex., radicais acilo derivados de um ácido carboxílico ou sulfónico orgânico.
Acilo derivado de um ácido carboxílico orgânico representa, por ex., o radical de um ácido car boxílico alifático ou monocíclico, aromático, tal como alcano_[ lo Inferior ou benzoílo insubstituido ou substituído, e tam bém piridoílo.
Acilo derivado de um ácido sulfónico orgânico representa, por ex., alcano inferior-sulfonilo.
Alcanoilo inferior é, por ex.,
C2-^5~alcan°í1°, tal como acetilo, propionilo, butirilo, isobutirilo ou pivalóilo.
Benzóilo insubstituido ou substi tuido ê, por ex., benzoílo, £-c1orobenzoí1 o ou p-nitrobenzoílo.
Alcano inferior-sulfonilo é, por ex., C1-C4~alcanossulfonilo, tal como metano- ou etano-sulfon i 1 o.
A hidrólise de um composto de fórmula III ou de um dos seus sais, realiza-se de maneira usual, por ex., na presença de um agente de hidrólise e, eventualmen_ te, na ausência ou, geralmente, na presença de um solvente ou diluente inerte, apropriado, ou numa mistura correspondente, e a operação realiza-se, de acordo com as necessidades, sob arrefecimento, à temperatura ambiente ou sob aquecimento, por ex., numa gama de temperaturas compreendida entre cerca de -809C e cerca de +2009C, de preferência, entre cerca de -209C e cerca de +1509C e, se for necessário, num reactor fechado,
sob pressão e/ou numa atmosfera de um gás inerte, tal como azoto.
Agentes hidrolisantes adequados são, por ex., ácidos ou bases. Ácidos apropriados são, por ex. ácidos protónicos, inorgânicos ou orgânicos, tais como ácidos minerais, por ex., ácido sulfúrico ou ácidos halídricos, por ex., ácido clorídrico, ácidos sulfónicos, por ex., ácidos sulfónicos de alcanos inferiores, ou ácidos benzenossulfónicos insubstituidos ou substituídos, por ex., ácido metano- ou £-to lueno-sulfónico, ou ácidos carboxí1icos, por ex., ácidos car boxílicos, por ex., ácidos carboxílicos de alcanos inferiores, por ex., ácido acético, ao passo que bases apropriadas são, por ex., aquelas atrás mencionadas, em especial hidróxido de sódio ou de potássio.
Diluentes ou dissolventes inertes, apropriados, são sobretudo aqueles referidos atrás, mais especialmente, água e alcanóis inferiores aquosos, tal como meta nol ou etanol aquosos.
compostos de partida de fórmula Ili ou um dos seus sais pode ser preparado análogamente a métodos conhecidos, por ex., por meio da reacção de um sal de fórmu 1 a a® ®n2—ζ nh-y (iv), em que A representa o anião de um ácido protónico, com um composto de fórmula
R1 R2 ou com um dos seus sais.
Aniões A de ácidos protónicos, em sais de fórmula IV, são, por ex., aniões dos ácidos referidos atrás para a formação de sais de adição dos compostos de fórmula I, em especial aniões de fortes ácidos protónicos inorgânicos, tais como aniões de ácidos minerais, por ex., ácido sulfúrico, um ácido fosfõrico ou um ácido halídrico, ou de um ácido tetraf 1 uorobórico, ou aniões de fortes ácidos c-arboxílicos orgânicos, tais como ácidos carboxílicos de alcanos inferiores, por ex., ácido fórmico ou ácido acético, por ex., o ião sulfato, fosfato, cloreto, brometo, tetraf1uoroborato ou acetato.
A reacção de um sal de fórmula IV com um composto de fórmula IVa ou com um dos seus sais, realiza-se análogamente a processos conhecidos, nas usuais condições reaccionais, por ex., num solvente ou diluente inerte, por ex., do gênero atrás mencionado, de preferência, na água, eventua1 mente na presença de um agente acídico, por ex., na presença de um dos ácidos atrás referidos e/ou sob arrefecimento, à temperatura ambiente, sob aquecimento, por ex., numa gama de temperaturas compreendidas entre cerca de -20QC e cerca de +50yC, de preferência, entre cerca de U e cerca de +30^C.
composto de partida de fórmula IV ê conhecido ou pode ser preparado anáiogamente a métodos usuais, por ex., pela reacção de um composto de fórmula r3
H2N— NH-Y
RÍ (V) ou de um dos seus sais, com ácidos nitroso; a reacção decorre nas condições reaccionais normalmente adoptadas, por ex., num solvente ou diluente, de preferência, na água, e/ou sob arrefecimento, à temperatura ambiente ou sob aquecimento, por ex. numa gama de temperaturas compreendida entre cerca de -209C e cerca de +509C. Depreferência, o ácido nitroso produz-se i n s itu, por ex., pela reacção de um hitrito de um metal alcalino, tal como nitrito de sódio, com um forte ácido protónico, por ex., um ácido halídrico, tal como ácido clorídrico, ou um ácido carboxílico de alcanos inferiores, tal como ácido fórmi co ou ácido acético glacial.
Segundo uma forma de realização especia 1 mente preferida, um composto de fórmula V ou um dos seus sais é levado a reagir, tal como atrás se refere, com ácido nitroso, que, pode por ex., se forma i n s i tu, e o sal de fórmula IV, que se obtém em primeiro lugar, continua a rea gir, sem ser isolado e/ou purificado adiciona1 mente, i n s i tu , segundo o processo do invento, com um composto de fórmula IVa ou com um dos seus sais, para se obter o desejado composto de fôrmu1 a III.
Os compostos IVa e seus sais são compostos conhecidos ou podem ser preparados anãlogamente a
-28métodos conhecidos.
Também se conhece o composto de partida de fórmula lia ou este pode ser preparado análogamente a métodos usuais.
Os sais dos compostos de fórmula I podem obter-se de maneira usual. Assim, por ex., obtêm-se sais de adição de ácidos de compostos de fórmula I mediante tratamento com um ácido ou um apropriado reagente permutador de iões. Os compostos acídicos de fórmula I podem ser convertidos em sais com bases, por ex., mediante tratamento com uma base ou com um adequado reagente permutador de iões. Sais de compostos de fórmula I podem ser transformados nos compostos livres de fórmula I, de forma usual; por ex., sais de adição de ácidos podem ser transformados nos compostos livres mediante tratamento com um agente básico apropriado, e sais com bases podem ser transformados nos compostos livres, por ex., mediante tratamento com um agente acídico apropriado.
Consoante a natureza do processo adoptado e as condições reaccionais, os compostos de fórmula I com propriedades halogénicas, em especial, propriedades acídicas, podem obter-se na forma de compostos livres ou na forma de sais.
Em consequência da estreita relação existente entre o novo composto de fórmula I na forma livre e na forma dos seus sais a menção de um composto livre de fórmula I ou dos seus sais implica também a existência dos correspondentes sais ou do composto livre de fórmula I, respectivamente, sempre que isso seja apropriado e útil.
Os novos compostos de fórmula I, inclusivé os seus sais, podem também obter-se na forma dos seus hidratos ou eles podem incluir outros solventes, por ex., aqueles que se utilizam para a cristalização de compostos exis
-29tentes na torma de sólidos.
De acordo com o género de compostos de partida e segundo os processos escolhidos, os novos compostos de fórmula I podem estar presentes sob a forma de um dos isómeros possíveis ou na forma de uma mistura isômera. Consoar^ te a simetria molecular, por ex., segundo o número e a configuração absoluta e relativa dos centros quirais, como átomos de carbono assimétricos, podem obter-se como isómeros puros, por ex., enantiómeros puros e/ou diastereômeros puros, tais como cis-/trans-isómeros puros ou compostos mesógiros.
Assim, por conseguinte, podem obter -se como misturas isómeras, por ex., misturas enantiómeras, tais como racematos, misturas diastereômeras ou misturas de racematos.
As misturas diastereômeras e as mis turas de racematos resultantes podem ser separadas nos diasterómeros puros ou racematos puros, de maneira usual, com base nas diferenças de ordem físico-química entre os componentes, por ex., por meio de cristalização fraccionada.
As misturas enantiómeras resultantes, tais como racematos, podem ser resolvidas nos enantiómeros mediante métodos conhecidos, por ex., por meio de recristalização a partir de um solvente, ópticamente activo, por meio de cromatografia em adsorvantes quirais, com o auxílio de microrganismos apropriados, mediante clivagem por enzimas específicas, imobilizadas, mediante a formação de compostos de inclusão (clatratos), utilizando, por ex., éteres coronários quirais, sendo que, neste caso, apenas se dá complexação de um dos enantiómeros, ou por meio de conversão em sais diastereómeros, por ex., por meio de reacção de um racemato básico como produto final, com um ácido, ópticamente activo, tal como um ácido carboxílico, por ex., ácido tartárico ou ácido málico, ou um ácido sulfónico, por ex., ácido canforossulfónico, e se-30-
paração da mistura de diastereómeros obtida desta maneira, por ex., com base nos seus diferentes graus de solubilidade, nos diastereómeros, a partir dos quais se pode libertar o desejado enantiómero peia acção de agentes apropriados. Com vantagem, isola-se o enantiómero mais activo.
presente invento refere-se também àquelas formas do processo de preparação segundo as quais um composto obtenível como composto intermédio numa qualquer das fases do processo é utilizado como composto de partida e se realizam as respectivas estapas do processo, ou se usa um composto de partida na forma de um derivado ou sal e/ou na forma dos seus racematos ou enantiómeros ou, em especial, se forma o composto de partida nas condições reaccionais.
No processo de preparação-do presente invento prefere-se utilizar aqueles compostos de partida que dêem origem à formação dos compostos de fórmula I, especialmente valiosos, descritos no início da presente memória.
invento refere-se também a um processo para a preparação de novos compostos de partida, especialmente concebidos para a preparação dos compostos de fórmula I, bem como se refere à utilização destes compostos de partida; as variáveis R1 a Rg,
G e L têm os significados referidos para os grupos de compostos de fórmula I, que se preferem, em cada caso.
Neste contexto, convém mencionar sobretudo a preparação de compostos de fórmula
Ri
Rz
Rj ^N-G-N=N-nh2 (II)
Ru
e dos seus sais, à qual se aplicam também as observações atrás feitas em relação aos sais dos compostos de fórmula I. Estes compostos podem ser utilizados, de maneira especialmente vantajosa, como compostos de partida para a preparação de compostos de fórmula I ou dos seus sais, por ex., segundo o processo atrás descrito.
Por conseguinte, o presente invento refere-se também à preparação de compostos de fórmula II, em que R^ representa alquilo inferior, R2 representa alquilo inferior, R3 representa hidrogénio, carboxi ou sulfo, R4 representa carboxi ou sulfo, e G representa um grupo 1,4-fenileno insubstituído ou substituído ou um grupo 1,4-naftileno insubstituído ou substituído, e aos seus sais, e à utilização destes compostos e seus sais.
As variáveis na fórmula II têm, por ex., os significados preferidos, indicados na fórmula I.
Assim, o presente invento refere-se em especial à preparação de compostos de fórmula II, e dos seus sais em que R1 representa alquilo inferior, R2 representa alquilo inferior, R^ representa hidrogénio, carboxi ou sulfo, R4 representa carboxi ou sulfo, e G representa 1,4-fenileno insubstituído ou substituído por carboxi e/ou sulfo, ou um grupo 1,4-nafti1eno insubstituído ou substituído por carboxi e/ou sulfo.
Mais especia 1 mente , o invento refere-se à preparação de compostos de fórmula II e dos seus sais, em que R^ representa -C^-alquilo, tal como metilo ou etilo,
R2 representa Cj-C4-a1qui1 o, tal como metilo ou etilo, R3 representa hidrogénio ou sulfo, R4 representa sulfo e G representa um grupo 1,4-fenileno insubstituído ou substituído por sulfo .
Ainda mais especialmente, o presente invento refere-se à preparação de compostos de fórmula II e dos seus sais, em que R1 representa C1 -C^-alquilo, tal como metilo, Rg representa C1-C4-a1qui1 o, tal como metilo, Rg representa hidrogénio, R^ representa sulfo, e G representa um grupo 1,4-fenileno insubstituído.
Específicamente, o presente invento refere-se à preparação dos novos compostos de fórmula II, referidos nos exemplos práticos, e se refere aos seus sais.
processo do invento para a preparação de um composto II ou de um dos seus sais, caracteriza-se, por ex., pela hidrólise de um composto de fórmula
(III), em que Y representa um radical acilo, ou de um dos seus sais, por ex., tal como se refere atrás, e, caso se desejar, se separa uma mistura isómera obtida nos seus componentes e se isola o desejado isómero de fórmula II, se resolve uma mistura de enantiómeros ou diastereómeros obtidos nos enantiómeros ou diastereómeros individuais e se isola o desejado enantiómero ou diastereómero, e/ou se converte num sal um composto livre de fórmula II obtido ou se transforma um sal obtido segundo o processo do invento no composto livre de fórmula II ou num outro sal.
A preparação de compostos III ou dos seus sais descrevem-se atrás.
Operações subsequentes que, caso se desejar, podem ser efectuadas sobre os compostos II ou seus sais, obteníveis segundo o processo ou por outros métodos, são em especial, separações de enantiómeros ou diastereõmeros e a mútua transformação de sais e compostos livres de fórmula II, análogas àquelas referidas para os compostos I, operações essas que se realizam também de forma análoga.
presente invento refere-se também à utilização de compostos de fórmula II ou dos seus sais como compostos de partida para a preparação de compostos de fórmula I ou dos seus sais.
processo optimizado, atrás referido, para a modificação química de proteínas e para a análise da estrutura primária destas proteínas quimicamente modificadas, isto é, a sequência, constituída pela modificação química por meio de um composto de fórmula I ou de um dos seus sais, desnaturação eventual, tratamento com uma protease e HPLC, pode também ser efectuado de forma automático, mediante um dispositivo específicamente concebido para este fim.
A estrutura do referido dispositivo automático está apresentada, esquemáticamente, na figura 1. 0 referido dispositivo é constituído por uma bomba de injecção (24), que serve para fornecer ao reactor (15) uma amostra da proteína, que se pretende modificar quimicamente mediante um composto I ou um dos seus sais, solventes, reagentes e/ou catalisadores, que são necessários para as mencionadas etapas da modificação química mediante um composto de fórmula I ou um dos seus sais, desnaturação eventual e tratamento com uma protease, gás inerte e solução de purificação (lavagem), através do elemento de ligação (1); o reactor (15), é constituído por uma tampa roscada (16) e encontra-se instalado no interior de
-34um invólucro aquecedor (14); por uma bomba de vácuo (25), que, através do elemento de ligação (2), permite a evacuação do reactor (15) para a concentração do conteúdo do reactor (15), por um elemento de ligação (3), que, através de uma ligeira sobrepressão de um gás inerte fornecido a partir da bomba de injecção (24), por meio do elemento de ligação (1), serve para fornecer o conteúdo do reactor (15), à unidade de dessalgação (19), uma vez efectuada a etapa da modificação química ou da desnaturação eventual, através da válvula (26), do elemento de ligação (5), da válvula (27) e do elemento de ligação (9), ou serve para transportar o conteúdo do reactor (15), para a unidade de HPLC (21), após a realização da etapa do tratamento com uma protease, através da válvula (26), do elemento de ligação (5), da válvula (27) e do elemento de ligação (7); a unidade de HPLC (21) apresenta um dispositivo de registo (1p1ot ter') (22) e, através do elemento de ligação (8), um colector de fracções (20), ou serve para fornecer ao depósito de líquidos residuais (17) a solução de lavagem contida no reactor (15) através da válvula (26) e do elemento de ligação (11); uma bomba (23) que fornece à unidade de dessalgação (19) o eluente através do elemento de ligação (6), da válvula (27) e do elemento de ligação (9); um elemento de ligação (10), que serve para transmitir ao detector (18)o eluato eluído a partir da unidade de dessalgação (19); o referido detector (18) serve para regular a válvula (28) de modo tal que o eluato eluído a partir da unidade de dessalgação (19), quando contenha a proteína quimicamente modificada, preparada na etapa de modificação química ou, eventualmente, a proteína desnaturada, quimicamente modificada, preparada na etapa de desnaturação facultativa, seja fornecido ao reactor (15), através do elemento de ligação (4), e se não contiver uma proteína quimicamente modificada ou uma proteína desnaturada, quimicamente modificada, o eluato seja fornecido ao depósito de líquidos residuais (17), através do elemento de ligação (12), bem como apresenta um elemento de ligação (13), que serve para fornecer o eluato do detector (18) à válvula (28). 0 resíduo dispositivo abrange os componentes (1) a (28).
Em termos de tamanho e forma, o reactor (15) pode ser comparado a um tubo de Eppendorf (1,5 ml). 0 reactor (15) pode ser feito de qualquer material inerte, por ex., de vidro, material plástico práticamente inerte, tal como politetrac1uroetileno, ou de aço inoxidável de boa qualidade, de preferência de um material transparente, por ex., de vidro ou material plástico transparente, práticamente inerte. As etapas de modificação química, desnaturação facultativa e tratamento com uma protease, realizam-se na parte inferior, pontiaguda, do reactor, com um volume reaccional total de cerca de 100 a cerca de 300 pl. 0 reactor pode ser tapado mediante a tampa roscada (16) que, de preferência, é feita do mesmo material que o reactor (15). 0 elemento de ligação (3) deverá aproximar-se o mais possível do fundo do reactor, a fim de permitir uma evacuação, práticamente completa, do reactor (15).
A bomba injectora (24) pode introduzir no reactor (15) o eduto (a proteína que se pretende modificar quimicamente), os necessários solventes, reagentes, por ex., o composto de fórmula I ou um dos seus sais, utilizado na etapa da modificação química, e/ou catalisadores, bem como gás inerte e solução de lavagem. A bomba injectora (24) é um dispositivo que se pode adquirir ao comércio da especialidade, e cuja configuração permita dosear, em qualquer altura, e de forma independente, o género e a quantidade do agente que se pretende introduzir no reactor (15). Mediante uma válvula praticada na bomba injectora (24), o elemento de ligação (1), que conduz ao reactor (15), pode ser obstruído em qualquer altura, por ex., logo que a desejada quantidade do agente tiver sido bombeada para dentro do reactor (15).
As quantidades que podem ser bombeadas, numa única etapa, para dentro do reactor (15) poderão variar dentro de largos limites volumétricos, por ex., entre cerca de 1 pl e cerca de 200 pl.
Como bomba de vácua (25) serve qualquer bomba industrial, de preferência, uma bomba de óleo.
A unidade de dessalgação (19) serve para remover o excesso de reagentes e produtos secundários contidos na mistura reaccional, que se formam a seguir à etapa da modificação química e à etapa da modificação química e à etapa da desnaturação facultativa. Para a unidade de dessalgação (19) podem utilizar-se dispositivos de separação cromatográfica usuais, por ex., dispositivos usados para a cromatografia em coluna, tal como cromatografia de exclusão molecular, por ex., cromatografia em gele. 0 detector (18) funciona de preferência com base no comportamento em termos de absorção de luz das moléculas, por ex., no comportamento em termos de absorção de luz a comprimentos de onda que se situem no ultravioleta ou, em especial, na zona de luz visível. Comprimento de onda típicos são aqueles que se indicam atrás em relação ao detector do sistema de HPLC. Componentes industriais apropriados podem ser utilizados para servirem de camisa de aquecimento (14), depósito de águas residuais (17), colector de fracções (20), componente de HPLC (21), aparelho de registo ('plotter') (22) e bomba (23), que fornece o eluente à unidade de dessalgação (19).
Por um lado, a válvula (26) pode abrir os elementos de ligação (3) e (5) e, ao mesmo tempo, fechar o elemento de ligação (11).
Por outro lado, a válvula (26) pode abrir os elementos de ligação (3) e (11) e, simultâneamente, fechar o elemento de ligação (5). A válvula (27) poderá abrir os elementos (5) e (9) e, ao mesmo tempo, fechar os elementos (6) e (7), ou pode abrir os elementos (5) e (7) e, ao mesmo tempo, fechar os elementos (6) e (9), ou também abrir os elementos (6) e (9) e, ao mesmo tempo, fechar os elementos (5) e (7) . A válvula (28) pode abrir os elemntos de ligação (4) e (13) e, ao mesmo tempo, fechar os elementos (12), ou pode abrir os elementos de ligação (12) e (13) e, ao mesmo tempo, fechar o elemento de ligação (4). Podem usar-se válvulas industriais,
de tipo adequado.
Os elementos de ligação (1) e (3) podem ser fabricados de qualquer material inerte, por ex., vidro ou material plástico, práticamente inerte, tal como politetrafluoroetileno, de preferência, de um material transparente, por ex., de vidro ou de um material plástico transparente, práticamente inerte. 0 elemento de ligação (2) é feito de um tubo resistente ao vácuo.
Em mais pormenor, realiza-se da seguinte maneira a sequência de reacções: Uma solução da proteína, que se pretende modificar quimicamente por um composto de fórmula I ou um dos seus sais, é introduzida no reactor (15), por actuação da bomba injectora (24), através do elemento de ligação (1). Em seguida, uma solução do reagente (um composto de fórmula I ou um dos seus sais) é guiada para o reactor (15) da mesma maneira.
Terminada a etapa da modificação química, gera-se uma ligeira sobrepressão de um gás inerte, por ex., árgon, no reactor (15) (o gás inerte é fornecido a partir da bomba injectora (24), através do elemento de ligação (1)). A sobreposição faz com que o conteúdo do reactor (15) seja transportado para à unidade de dessalgação (18), através dos elementos (3), (26), (5), (27) e (9). Procede-se â regulação apropriada das válvulas (26) e (27). 0 elemento de ligação (4) é fechado mediante a válvula (28). Depois de a totalidade do conteúdo do reactor (15) ter sido transferida para a unidade de dessalgação (19), alivia-se a sobrepressão. Em seguida, a amostra atravessa a unidade de dessalgação (19), para ser purificada, e a bomba (23) fornece o eluente por meio dos elementos (6), (27) e (9). (a válvula (27) é regulada de forma apropriada). Por meio dos elementos (10), (18), (13), (28) e (4), a proteína purificada, quimicamente modificada, é reenviada ao reactor (15), tendo sido ajustada a válvula (28) de forma apropriada para este fim. 0 detector (18) serve
-38para regular a válvula (28) de modo tal que apenas aquela fracção do eluato que contém o produto desejado seja fornecida ao reactor (15), enquanto as restantes fracções são directamente transmitidas, através do elemento de ligação (12), para o depósito de líquidos residuais (17), 0 conteúdo do rea£ tor (15) (eluato com proteína purificada, quimicamente modificada) é concentrado, gerando-se, através do elemento de ligação (2), um vácuo pela acção da bomba de vácuo (25).
Durante a criação do vácuo, o elemento de ligação (1) é fechado pela acção da válvula que se encontra na bomba injectora. Estão igualmente fechados os elementos de ligação (3) e (5) (mediante a válvula (27) e o elemento de ligação (4), mediante a válvula (28).
Quando se pretende realizar o processo de desnaturação, procede-se de modo análogo ao referido em relação à etapa da modificação química, utilizando-se os reagentes e dissolventes apropriados. A esta etapa de desnaturação segue-se então de novo uma etapa de purificação, em que se usa de forma análoga a unidade de dessalgação (19). 0 resultanto eluato é de novo enviado ao reactor (15), onde é concentrado.
Por último, realiza-se no reactor (15) o passo do tratamento com uma protease de maneira análoga à indicada para o passo da modificação química, utilizando-se, igualmente, os reagentes e solventes apropriados. Uma vez terminado o tratamento com a protease, o conteúdo do reactor (15) ê transferido para o componente de HPLC do sistema (21), por via dos elementos (3), (26), (5), (27) e (7) (as válvulas (26) e (27) são reguladas de maneira adequada), procedendo-se de maneira análoga à descrita atrás (gerando-se uma ligeira sobrepressão do gás inerte). A seguir à realização da HPLC, o correspondente cromatograma aparece no dispositivo de registo ('pletter') (22). As fracções obtidas na HPLC podem ser colhi-39das mediante o colector de fracções (20).
As condições reaccionais (temperatura, volume, período reaccional, etc.) bem como o gradiente da HPLC são controladas por meio de um programa préviamente estabelec ido.
Quaisquer catalisadores ou outros aditivos agentes ou auxiliares, necessários para a realização das referidas reacções podem ser introduzidas no reactor (15) mediante a bomba injector (24), passando pelo elemento de ligação (1).
dispositivo do invento é utilizado de modo que, por um lado, a unidade de dessalgação (19) seja lavada continuamente com o eluente aduzido da bomba (23), enquanto uma reacção (modificada química, desnaturação facultaiva ou tratamento com protease) está a decorrer no reactor (15), e, por outro lado, o reactor (15) seja depurado com a solução de lavagem (introduzida pela bomba injectora (24) atra vés do elemento (1)), enquanto a amostra (proteína quimicamente modificada ou proteína quimicamente modificada e eventualmente desnaturada) está a ser purificada na unidade de dessalgação (19). A solução de lavagem da unidade de dessalgação (19) é introduzida no depósito de águas residuais (17) através dos elementos (10), (18), (13), (28) e (12), e a solução de lavagem do reactor (15) é introduzida no depósito de águas residuais (17) através dos elementos (3), (26) e (11); procede-se, em cada caso, tal como se refere no caso da transferência dos produtos e eluatos.
presente invento refere-se também a um processo para a preparação de um dispositivo do género descrito atrás, e que se destina específicamente à realização automática da sequência de etapas, constituída pela modificação química de um proteína por meio de um composto de fórmula I ou de um dos elementos e dos seus sais, pela desnatura-40-
ção facultativa da proteína quimicamente modificada, pelo tratamento com uma protease da proteína quimicamente modificada e eventualmente desnaturada, e pela HPLC da mistura péptidica resultante do passo do tratamento com a protease, processo caracterizado por se combinarem os componentes do referido dispositivo da maneira atrás mencionada, a fim de se obter o desejado dispositivo.
presente invento refere-se também a um processo para a modificação química automática de uma proteína e para a análise automática da estrutura primária de uma proteína quimicamente modificada, constituída pela sequência de passos atrás referida, processo caracterizado por se tratar a proteína mediante o dispositivo atrás descrito.
invento refere-se também â utilização do dispositivo atrás descrito para a realização automática da sequência atrás referida, bem como se refere à utilização de um composto de fórmula I ou um dos seus sais, como reagente na etapa da modificação química realizada mediante o referido dispositivo.
invento refere-se igualmente aos seguintes exemplos práticos, que servem para ilustrar melhor o invento, sem, no entanto, limitar-lhe o alcance inventivo. As temperaturas estão referidas em graus centígrados. HPLC significa cromatografia líquida de elevado rendimento. Lis representa lisina. Vai representa valina.
EXEMPLO 1 ml de uma solução 0,24M de carbonato de sódio e 0,91 g (7,9 mmoles; 0,5 ml) de tiofosgénio são adicionados a 1 g (3,1 mmoles) de ãcido 4-amino-41 -(N,N-dimetiIamino)-azobenzeno-2-sulfónico. A mistura reaccional é agitada, durante 30 minutos, a 70QC. Após o arrefecimento até à temperatura ambiente, o produto resultante é filtrado, mediante um filtro de vidro fritado e o filtrado é lavado enér gicamente, com ácido clorídrico 1N, tolueno e novamente com ácido clorídrico 1N. Em seguida, os cristais negros são secos num vazio, à temperatura ambiente, obtendo-se o ácido 4’-(N,N-dimetilamino)-4-isotiocianato-azobenzeno-2-sulfónico. Quando aquecido, o produto começa a decompor-se e não apresenta qualquer ponto de fusão definido; o espectro do infra-verme 1ho apresenta uma banda nítida, a 2110 cm“\ causada pela vibração de distensão assimétrica do grupo N=C=S.
ácido 4-amino-4'-(N,N-dimeti1amino )-azobenzeno-2-su1fónico pode obter-se, por ex., da seguinte maneira:
0,9 g (8,5 mmoles) de carbonato de sódio anidro e 38 ml de água são adicionados a 3,5 g (15 mmoles) de ácido 5-(N-acetilamino)-2-aminobenzenossulfónico. A mistura reaccional é agitada até se obter uma solução límpida. Em seguida, esta solução é arrefecida até +10QC, mediante um banho de gelo. A seguir à adição de 1,22 g (17, 7 mmoles) de nitrito de sódio sólido, a mistura ê agitada durante mais 2 minutos. Em seguida, a mistura reaccional é deitada sobre uma mistura de 3,5 ml de ácido clorídrico concentrado e 25 g de gelo triturado. Continua-se a agitar durante um período adicional de 30 minutos, a 0-C e, seguidamente, junta-se, à mistura reaccional, uma solução de 2,01 g (15,6 mmoles; 2,1 ml) de N , N-dimeti1ani1ina, em 3 ml de ãcido acético glacial. Deixa-se que a temperatura da
-42mistura aumente até à temperatura ambiente, durante um período de 3 a 4 horas. 0 produto precipitado é filtrado e é seco, durante a noite, num vazio, à temperatura ambiente, obtendo-se ácido 4-(N-acetilamino)-4'-(N,N-dimetilamino)-azobenzeno-2-sulfónico sob a forma de cristais negro-purpúreos, que se decompõem quando aquecidos e que não apresentam qualquer ponto de fusão definido.
g (5,5 mmoles) De ácido 4-(N-acetilamino)-41-(Ν,Ν-dimetilamino)-azobenzeno-2-sulfónico são dissolvidos em 8 ml de etanol. Após adição de 4 ml de uma solução 1 IN de hidróxido de sódio, a mistura é agitada durante 60 minutos, a 90QC. Em seguida, a mistura é deixada em repouso para arrefecer até à temperatura ambiente, juntando-se, seguidamente, 5 ml de ácido clorídrico 11,5 N. Em seguida, a mistura reaccional é deixada em repouso, durante uma noite, a +4Q. 0 produto precipitado é separado, por filtração, e ê lavado exaustivamente, com ácido clorídrico 1N. Após a secagem num vácuo, à temperatura ambiente, obtém-se o ácido 4-amino-4 '-(N , N-dimeti1amino)-azobenzeno-2-su1fónico sob a forma de cristais negros a purpúreos, que se decompõem quando aquecidos, e que não apresentam ponto de fusão definido.
EXEMPLO 2
0,67 g (2,1 mmoles) De ácido 4-amino-4'-(N,N-dimetilamino)-azobenzeno-2-sulfônico (exemplo 1) são dissolvidos em 5 ml de piridina absoluta. Em seguida, a solução é gotejada, sob agitação, e sob arrefecimento com gelo/cloreto de sódio, para uma mistura de 424 mg (2,1 mmoles) de carbodiimida de N,N1-diciclohexiIo, 5 ml de piridina anidra e 1,26 g (16,6 mmoles; 1 ml) de dissulfureto de carbono. Se-43guidamente, a mistura reaccional é agitada durante 3 a 4 horas sem remover o banho de refrigeração. A mistura é deixada em repouso, à temperatura ambiente, durante um período de 17 horas. A piridina e o excesso do dissulfureto de carbono são removidos da maneira mais completa possível, sob pressão reduzida. A seguir à cromatografia em coluna do resíduo, sobre sílica-gel (150 a 200 melhas) (eluente:benzeno), obtém-se ácido 4 1 - (N,N-dImetilamino)-4-isotiocianato-azobenzeno-2-sulfónico, que começa a cristalizar quando o eluato é concentrado, por evaporação.
EXEMPLO 3
0,67 g (2,1 mmoles) De ácido 4-amino-4'-(N,N-dimeti1amino)-azobenzeno-2-su1fónico (Exemplo 1) são dissolvidos em 5 ml de piridina absoluta. Juntam-se, sob agitação e arrefecimento, com gelo, 1,26 g (16,6 mmoles; 1 ml) de dissulfureto de carbono e 0,22 g (2,2 mmoles; 0,3 ml) de trieti1amina. Em seguida, a mistura reaccional é agitada, durante 3 a 4 horas, sem remover o banho de refrigeração. A mistura ê deixada em repouso, durante 17 horas, à temperatura ambiente, e, em seguida, é concentrada, até à secagem, por evaporação.
ditiocarbamato de trieti1amónio remanescente (resíduo) é seco durante a noite, num vácuo e, em seguida, é dissolvido em 12 ml de tric1orometano. Juntam-se, à solução, 0,22 g (2,2 mmoles; 0,3 ml) de trieti1amina, sob arrefecimento com gelo. Em seguida, juntam-se a esta mistura, gota a gota, dentro de um período de 4 minutos, 0,34 g (3,1 mmoles; 0,3 ml) de c1orocarbonato de etilo, sob agitação e arrefecimento com gelo. A mistura reaccional é deixada em
repouso durante 3 a 4 horas, sem remover o banho de refrigeração e, em seguida, é concentrada, até à secagem, por evaporação, sob pressão reduzida. 0 produto bruto remanescente (resíduo) ê purificado por meio de cromatografia em coluna, tal como se refere no exemplo 2, obtendo-se ácido 4'-(N,N-dimetilamino)-4-isotiocianato-2-sulfónico.
EXEMPLO 4
Procedendo de maneira análoga à descrita nos exemplo 1 a 3, e partindo de ácido 4-amino-4'-(N,N-dimeti1amino)-azobenzeno-2,6-dissu1fónico e ácido 4-(N,N-dimetilamino)-naftaleno-1-azo-(4,-aminobenzeno-2l-sulfónico, é também possível obterem-se, respectivamente, ácido 4'-(N,N-dimetilamino)-4-isotiocianato-azobenzeno-2,6-dissulfónico e ácido 4-(N , N-dimeti1amino)-nafta 1eno-1-azo-(41 -isotiocianatobenzeno-2'-sulfónico).
Os compostos de partida podem obte_r -se de maneira análoga à referida no Exemplo 1, partindo-se de ácido 4-(N-aceti1amino)-4'-(N,N-dimeti1amino)-azobenzeno-2,6-dissu1fónico e ácido 4-(N,N-dimetilamino)-naftaleno-1-azo-/4'-(N-acetilamino)-benzeno-2'-sulfónico7, respectivamente .
EXEMPLO 5 ml de ciorobenzeno são arrefecidos até O5, com gelo/cloreto de sódio. Introduzem-se no ciorobenzeno arrefecido 1,1 g (11,1 mmoles) de fosgênio, por condensação, observando-se os cuidados usuais. Sem remover o banho de refrigeração e sob agitação enérgica, adiciona-se uma solução de 1,79 g (5,6 mmoles) de ácido 4-amino-4'-(N,N-dimetilamino)-azobenzeno-2-sulfónico (Exemplo 1), em 30 ml de ciorobenzeno, gota a gota, a uma velocidade tal que a temperatura da mistura reaccional não ultrapasse os +252C. Terminada a adição gota a gota, substitui-se o banho de refrigeração por um banho de aquecimento, através do qual a mistura reaccional é aquecida até 1305C, dentro de um período de 90 minutos; continua-se sempre a manter uma agitação constante. Durante esta operação, e logo que a mistura reaccional tenha atingido uma temperatura de 75eC, introduz-se lentamente mais fosgênio, até se formar uma solução límpida. A mistura reaccional ê aquecida, ao refluxo, faz-se passar nitrogénio através da mistura, até na corrente de gás evacuada já não se detectar a presença de fosgênio (cerca de 2 horas). Depois de arrefecer até à temperatura ambiente, a mistura reaccional é concentrada da maneira mais exaustiva possível, sob pressão reduzida. Após cromatografia em coluna do resíduo, em sílica-gei (150 a 200 mesh), com benzeno como eluente, obtém-se ácido 4'-(N,N-dimetilamino)-4-isocianato-azobenzeno-2-sulfónico, que começa a cristalizar quando se concentra o eluato, por evaporação
EXEMPLO 6
Procedendo de maneira análoga à in dicada no exemplo 5, e partindo de ácido 4-amino-41-(N,N-dime ti1amino)-azobenzeno-2,6-dissu1fónico e de ácido 4-(N,N-dimetilamino)-naftaleno-1-azo(4'-aminobenzeno-2' - sulfônico) podem obter-se ácido 4'-(N,N-dimeti1amino)-4-isocianato-azobenzeno-2,6-dissu1fónico e ácido 4-(N,N-dimeti1amino)-nafta 1eno-1 -azo-(4'-isocianatobenzeno-2'-sulfónico), respectivamente.
Cada um dos compostos de partida podem obter-se de maneira análoga à referida no exemplo 4.
EXEMPLO 7
1,8 g (9,7 mmoles) De ácido iodoacético e 1,2 g (6,3 mmoles) de hidrocloreto de N-/3-(N,N-dimeti1amino)-propi1J-N'-eti1 carbodiimida são dissolvidos em 9 ml de água. A solução resultante é misturada, imediatamente, sob agitação, com uma solução de 0,5 g (1,6 mmoles) de ácido
4-amino-4'-(N,N-dimetilamino)-azobenzeno-2-suifónico (Exemplo 1), em 7,6 ml de uma solução-tampão (pH = 9), constituída por 50 mM de uma solução de hidrogenocarbonato de sódio e 50 mM de uma solução de carbonato de sódio. Em seguida, gotejam-se 0,4 ml de uma solução 11N de hidróxido de sódio para a mistura obtida, que, em seguida, é agitada durante 10 minutos, à temperatura ambiente. Em seguida, junta-se, gota a gota, ácidoclorídrico IN, até a mistura reaccionai apresentar uma coio ração purpúrea. 0 produto precipitado é separado por filtração, é lavado enérgicamente com 100 ml de ácido clorídrico 0,1N e é seco num vazio. 0 produto seco, bruto, é dissolvido
-Wnuma mistura de 16 ml de N,N-dimeti1 formamida e 0,4 ml de trietilamina. A seguir à precipitação subsequente, com ácido clorídrico 1N, da maneira atrás referida, após filtragem e secagem do conteúdo do filtro, num vácuo, obtém-se o ácido 4 1 -(N , N-d imet iiamino)-4-(N-lodoacetil)-amino-azobenzeno-2-sulfónico puro, que se decompõe quando aquecido e que não apresenta ponto de fusão definido.
EXEMPLO 8
Procedendo de maneira análoga à referida no exemplo 7, e partindo de ácido 4-amino-41 -(N,Ndimeti1amino)-azobenzeno-2,6-dissu1fónico e de ácido 4-(N,N-dimetilamino)-naftaleno-1-azo-(4'-aminobenzeno-2'-sulfónico, podem também obter-se ácido 4'-(N,N-dimetilamino)-4-(N-iodoaceti1)-amino-azobenzeno-2,6-dissulfónico e ácido 4-(N,N-dimetilaminoj-naftaleno-l-azo-pr-CN-iodoacetiH-aminobenzeno-2 1-sulfónico}, respectivamente.
Cada um dos compostos de partida podem obter-se de maneira análoga ã referida no exemplo 4.
EXEMPLO 9
Anticorpos monoclonais que actuam de forma específica sobre a eglina C, são quimicamente modificados, à temperatura ambiente, durante um período de 18 ho-48-
ras, numa solução de 50 mM de hidrogenocarbonato de sódio, pela acção de uma solução 2 mM de ácido 4'-(N,N-dimeti1amino)-4-isotiocianato-azobenzeno-2-sulfónico. A análise estrutural seguinte mostra de que cada molécula de anticorpo foi modificada quimicamente por 30 moléculas de ácidos 4'-(N,N-dimetilamino)-4-isotiocianato-azobenzeno-2-su1fónico. Com este grau de modificação, os anticorpos possuem uma especificidade e afinidade para a eglina C recombinante, que são inalteradas em relação aos anticorpos não-modifiçadas. Esses anticorpos, quimicamente modificados, que foram também colorados, ao mesmo tempo, podem utilizar-se para comprovar a presença de eglina C por meio do teste de 'sandwich dot1. No referido ensaio é possível detectar concentrações de 1 pg/ml e concentrações mais elevadas.
EXEMPLO 10
Hirudina, um agente inibitório específico da trombina, é quimicamente modificada, a 37QC, durante um período de 7 horas, numa solução 50 mM de hídrogenocarbonato de sódio, pela acção de uma solução 2mM de ácido 4'-(N,N-dimetilamino)-4-isotiocianato-azobenzeno-2-sulfónico.
A hirudina modificada desta maneira é submetida a cromatografia em gel, numa coluna Sephadex G 25. Durante a modificação do referido agente inibidor, reagem 1,96 mmoles de ácido 4'-(N,N-dimetilamino)-4-isotiocianato-azobenzeno-2-sulfónico por cada mole de hidrudina. Procede-se à analise da estrutura do agente inibitório modificado e ã sua actividade biológica, sendo reveladas as seguintes características:
a) A hirudina, quimicamente modificada, apresenta uma reduzida actividade inibitória relativamente à trombina
-49conforme se pode inferir do facto de a correspondente constante de dissociação ser 300 vezes maior.
b) Anticorpos monoclonados que actuam sobre hirudina nativa agem igualmente sobre a hirudina, quimicamente modificada.
c) Procede-se à carboximetilação e ao tratamento com a protease V8 de hirudina quimicamente modificada. Os péptidos resultantes são submetidos a HPLC. Detectam-se dois péptidos a um comprimento de onda de 536 nm. A análise estrutural mostra de que esses dois péptidos coloridos correspondem aos elementos constituintes amino-ácidos 1 a 7 e 18 a 37, e que os blocos constitutivos Val-1 e Lis-27 são modificados de forma selectiva por ácido 4'-(N,N-dimeti1amino)-4-isotiocianato-azobenzeno-2-sulfônico.
EXEMPLO 11
Modifica-se quimicamente a antitrom bina, à temperatura ambiente, durante um período de 15 minutos, numa solução 50 mM de hidrogenocarbonato de sódio, pela acção de uma solução 1 mM de ácido 41 -(N,N-dimeti1amino)-4-isotiocianato-azobenzeno-2-suIfónico. A antitrombina modificada desta forma ê submetida a cromatografia em gel, numa coluna de Sephadex G 25. Analisam-se a estrutura da antitrombina modificada e a sua actividade biológica, reveiando-se as seguintes características;
a) A antitrombina, quimicamente modificada, conserva apenas 25% da sua actividade em termos de cofactor para heparina, enquanto que a sua acção inibitória sobre a trombina,
-50na ausência de heparina (acção inibitória progressiva) fica práticamente inalterada.
b) Procede-se à carboximeti1 ação e ao tratamento com tripsina de antitrombina quimicamente modificada. Os péptidos resultantes são submetidos a HPLC. Detectam-se 3 péptidos a um comprimento de onda de 436 nm. A análise estrutural mestra de que esses 3 péptidos coloridos correspondem aos radicais amino-ácidos 91 a 111, 115 a 129 e 133 a 139, e que os blocos estruturais Lis-107, Lis-125 e Lis-136 são modificados de fo/ ma selectiva por ácido 4'-(N,N-dimeti1amino)-4-isotiocianato-azo-benzeno-2-sulfónico.
c) Ao incubar a antitrombina com heparina, antes daquela ser submetida à acção do ácido 4'-(N,N-dimeti1amino)-4-iso tiocianato-azobenzeno-2-sulfónico, a modificação quimica dos blocos estruturais Lis-107, Lis-125 e Lis-136 fica inibida em respectivamente 98%, 88% e 93%.
d) Por conseguinte, os blocos estruturais Lis-107, Lis-125 e Lis-136 da antitrombina humana são especialmente impor tantes para a combinação com a heparina.
EXEMPLO 12
Procedendo de maneira análoga à re ferida nos exemplos 9 a 11, podem também usar-se um outro com posto de fórmula I ou um dos seus sais, por ex., procedendo de acordo com os exemplos 1 a 8, para a modificação quimica de uma proteína.
-51EXEMPLO 13
A análise do local para a combinação com a heparina da antitrombina humana, mediante um dispositivo do género representado na figura 1, pode realizar-se do seguinte modo:
a) A antitrombina humana (432 amino-ácidos) e o com plexo de heparina-antitrombina são tratados, sucessivamente, da maneira descrita nos passos (b) a (g). 0 dispositivo utilizado nesses passos contém os componentes apresentados de forma esquemática na figura 1. 0 reactor (15) é constituído por vidro. 0 detector (18) funciona com base na absorção de luz de um comprimento de onda de 436 nm. Os elementos de 1 iga_ ção (1) e (3) a (13) são feitos de vidro. 0 elemento de ligação (2) ê constituído por um tubo resistente a vácuo. Como bomba de vazio (25) utiliza-se uma bomba de óleo. A unidade de dessalgação (18) compreende uma coluna Sephadex G 25.
b) Passo de modificação química
Dissolvente: solução 50mM de hidrogenocarbonato de sódio (pH = 8,3);
Amostra 1: antitrombina, 250 pg;
Amostra 2: complexo de heparina-antitrombina (2:1, partes em peso), 750 pg (250 pg de antitrombina e 500 pg de heparina) Reagente de fórmula I para a modificação química:
solução 1mM de ácido 41 -(N,N-dimeti1amino)-4-isotiocianatoazobenzeno-2-sulfónico, no solvente mencionado.
Volume de reacção: 200 pi;
Temperatura reaccional: +25e;
Tempo de reacção: 7,5 minutos.
c) Passo de dessalgação
Coluna: Sephadex G 25 (comprimento: 3,5 cm; diâmetro interno: 1 cm) ;
Eluente: solução 50 mM de hidrogenocarbonato de amónio (pH = 8,0).
d) Passo de desnaturação
Solvente: Solução 0,5M de hidrocloreto de cv ,ο/,χ-tri s-(h idroximeti1)-metilamina (Tris-hidroc1oreto) (pH = 8,4) e solu ção 5M de hidrocloreto de guanidínio.
Volume de reacção: 200 pl;
Reagente redutor: treo-1,4-dimercapto-2,3-butanodiol (ditiotreítol, DIT), 1 mg;
Temperatura de redução: + 37SC;
Tempo de redução: 2 horas;
Reagente de carboximeti1 ação: ácido iodoacético, 2 mg; Temperatura de carboximeti1 ação: + 379C;
Duração da carboximeti1 ação: 15 minutos.
e) Passo da dessalgação
Coluna: Sephadex G 25 (comprimento: 3,5 cm; diâmetro interno; 1 cm) ;
Eluente: solução 50 mM de hidrogenocarbonato de amónio (pH = 8,0).
-53f) Passo de tratamento com protease
Protease: tripsina, 10 ug;
Solvente: solução 50 mM de hidrogenocarbonato de amónio (pH = 8,0);
Volume de reacção: 100 pl;
Temperatura da reacção: +37-C;
Período reaccional: 2 horas.
g) Passo da HPLC
Coluna: Vydac C-18, para pêptidos e proteínas;
Temperatura da coluna: + 25-C;
Solvente A: acetato de sódio 15,5 mM (pH - 5,0);
Solvente B: acetonitrilo;
Gradiente: linear, de 10% de B até 70% de B, dentro de 30 minutos;
Débito: 1 ml por minuto;
Detector: absorção de luz de comprimento de onda de 436 nm.
h) A comparação dos padrões dos picos nos dois cromatogramas obtidos da amostra 1 e da amostra 2, respectivamente, bem como a análise da sequência dos pêptidos de cor, que correspondem aos picos que apenas figuram no cromatograma da amos^ tra 1, revelam de que os radicais amino-ácidos Lis-107, Lis125 e Lis-136 se situam dentro da zona do local da combinação com heparina, na antitrombina humana.
EXEMPLO 14
Procedendo da maneira referida no exemplo 13, a análise do local da combinação com hirudina, na trombina humana, pode realizar-se mediante o dispositivo descrito no exemplo 13 . A trombina humana (amostra 1; 250 ug) e o complexo de hirudina-trombina /amostra 2; 750 ug; razão molar (hirud1 na:trombina) = (1,2 : 1 )] são tratados, sucessivamente, da forma referida nos passos b) a g) do exemplo 13.
A comparação dos padrões dos picos nos dois cromatogramas obtidos da amostra 1 e a amostra 2, respectivamente, bem como a análise da sequência dos péptidos de cor, que correspondem aos picos que apenas surgem no cromatograma da amostra 1, revelam de que os radicais amino-ácidos Lis-21 , Lis-52, Lis-65, Lis-106, Lis-107 e Lis-154 se emcontram dentro da área do local da combinação com a hirudina, na trombina humana.
EXEMPLO 15
Procedendo de maneira análoga à referida nos exemplos 13 e 14, pode também usar-se um outro composto de fórmula I ou um dos seus sais, por ex., de acordo com os exemplo 1 a 8, como reagente para a modificação química no passo b) da sequência de tratamento realizada mediante o dispositivo descrito no exemplo 13.
Claims (38)
- REIVINDICAÇOE S:1-. - Processo para a preparação de um composto de fórmulaRiRz ^N-G-N=N\ zR^ (I), em que R^ representa alquilo inferior, R£ representa alquilo inferior, Rg representa hidrogénio, carboxi ou sulfo, R^ representa carboxi ou sulfo, G representa um grupo 1,4-fenileno eventualmente substituído, ou um grupo 1 ,4-nafti1eno, eventua/ mente substituído, e em que Rg e Rg, em conjunto representam uma ligação adicional e L significa um átomo de oxigénio ou de enxofre, ou em que Rg representa hidrogénio, Rg representa ha 1ogenometi1 o e L representa um átomo de oxigénio, ou de um dos seus sais, caracterizado por, num composto de fórmula R\ \-g-n=n-Z RÍ zRu-NH2 (II)-56ou num dos fórmu1 a seus sais, se converter o grupoNH2 no grupo de (Ic) e, caso se desejar, se separar uma mistura isómera obtida nos isómeros individuais e se isolar o isómero desejado de fórmula I, se resolver uma mistura enantiómera ou diastereómera obtida nos enantiómeros ou diastereómeros individuais, e se isolar o enantiómero ou diastereómero desejado, e/ou se converter num sal um composto livre obtido, de fórmula I, ou se transformar um sal obtido no composto livre de fórmula I ou num outro sal.
- 2-. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar um composto de fórmula I ou um dos seus sais, em que R1 representa alquilo inferior, R2 representa alquilo inferior, R^ representa hidrogénio, carboxi ou sulfo, R^ representa carboxi ou sulfo, G representa um grupo 1,4-feni1eno, eventualmente substituído, ou um grupo 1 ,4-nafti 1 eno , eventualmente substituído, Rg e R6 em conjunto, representam uma ligação adicional e L representa um átomo de oxigénio ou de enxofre.
- 3Γ - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar um composto de fórmula I ou um dos seus sais, em que Rj representa alquilo-57inferior, R2 representa alquilo inferior, Rg representa hidrogénio, carboxi ou sulfo, R^ representa carboxi ou sulfo,G representa um grupo 1,4-fenileno insubstituído ou substituído por carboxi e/ou por sulfo, e?em que Rg e Rg, em conjunto representam uma ligação adicional, e L representa um ãtomo de oxigénio ou de enxofre, ou em que Rg representa hidrogénio,Rg representa halogenometilo e L representa um átomo de oxigén io.
- 4a. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar um composto de fórmula I ou um dos seus sais, em que R1 representa alquilo inferior, R2 representa alquilo inferior, Rg representa hidrogénio, carboxi ou sulfo, R4 representa carboxi ou sulfo, G representa um grupo 1,4-fenileno insubstituído ou substituído por carboxi e/ou por sulfo, ou um grupo 1,4-nafti1eno insubstituído ou substituído por carboxi e/ou por sulfo, Rg e Rg em conjunto, representam uma ligação adicional, e L representa um átomo de oxigénio ou de enxofre.
- 5a. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar um composto de fórmula I ou um dos seus sais, em que R^ representa C^-C^-alquilo, R2 representa C1-C4-a1qui1 o, Rg representa hidrogénio ou sulfo, R^ representa sulfo, G representa um grupo 1,4-fenileno insubstituído ou substituído por sulfo, e em que Rg e Rg, em conjunto representam uma ligação adicional ou de enxofre, ou em que Rg representa hidrogénio, Rg representa iodometilo e L representa um átomo de oxigénio.
- 6a. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar um composto de fórmula I ou um dos seus sais, em que R1 representa C^-C^-al-58- quilo, R2 representa -C^-alquilo, Rg representa hidrogénio ou sulfo, R^ representa sulfo, G representa um grupo 1,4-fenileno insubstituído ou substituído por sulfo, Rg e Rg, em conjunto representam uma ligação adicional e L representa um átomo de oxigénio ou de enxofre.
- 7a. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar um composto de fórmula I ou um dos seus sais, em que R1 representa C-j-C^-alquilo, R2 representa C1-C^-alquilo, Rg representa hidrogénio, R^ representa sulfo, G representa um grupo 1,4-fenileno insubs^ tituído, e em que Rg e Rg, em conjunto, representam uma ligação adicional e L representa um átomo de enxofre, ou em que Rg representa hidrogénio, Rg significa iodometilo e L representa um átomo de oxigénio.
- 8a. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar um composto de fórmula I ou um dos seus sais em que R1 representa C^-C^, R2 representa C1-C^-alquilo, Rg representa hidrogénio, R^ representa sulfo, G representa um grupo 1,4-fenileno insubstituído, Rg e Rg em conjunto, representam uma ligação adicional e L representa um átomo de enxofre.
- 9a. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar ácido 4'-(N,N-dimetilamino)-4-isotiocianato-azobenzeno-2-sulfónico ou um dos seus sais.
- 10a. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar ácido 4'-(N,N-dimetilamino)-4-isotiocianato-azobenzeno-2,6-dissulfónico ou um dos seus ;sais.-59113. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar ácido 4-(N,N-dimetilamino)-naftaleno-1-azo-(4'-isocianatobenzeno-2l - sulfónico) ou um dos seus sais.
- 123. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar ácido 4'-(N,N dimeti1amino)-4-isocianato-azobenzeno-2-su1fónico ou um dos seus sais.
- 135. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar ácido 4'-(N,N -dimetilamino)-4-isocianato-azobenzeno-2,6-dissulfón ico ou um dos seus sais.
- 14â. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar ácido 4-(N,N-dimetilamino)-naftalen-1-azo-(4'-isocianatobenzeno-2'-sulfó nico) ou um dos seus sais.
- 153. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar ácido 4'-(N,N -dimetilamino)-4-(N-iodoacetil)-amino-azobenzeno-2-sulfónico ou um dos seus sais.15-. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar ácido 4'-(N,N -d imet ilamino)-4-(N-iodoacetil)-amino-azobenzeno-2,6-dissulfónico ou um dos seus sais.-6017-. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar ácido 4-(N,N-dimetilamino)-naftaleno-1-azo-£4'-(N-iodoacetil)-aminobenzeno-2 '-su 1 fón ico_7 ou um dos seus sais.
- 185. - Processo para a preparação de um composto de fórmula geralRi \G—N=NRÍ —nh2 (II), em que R1 representa alquilo inferior, R2 representa alquilo inferior, R^ representa hidrogénio, carboxi ou sulfo, R4 representa carboxi ou sulfo e G representa um grupo 1,4-fenileno, eventualmente substituído, ou um grupo 1 ,4-naftileno, even tualmente substituído, ou para a preparação de um dos seus sais, caracterizado por se hldrolisar um composto de fórmulaRiR3 \-G-N=NRz z* \NH-Y (III), ou um dos seus sais, em que Y representa um radical acilo, e caso se desejar, se separar uma mistura isómera obtida nos seus componentes individuais e se isolar o isómero de fórmula II, desejado se resolver uma mistura enantiómera ou diastereómera obtida nos enantiómeros ou diastereómeros individuais e se isolar o enantiômero ou diastereómero desejado, e/ou se converter num sal um composto livre obtido, de fórmula II, ou se transformar um sal obtido no composto livre de fórmula II, ou num outro sal.
- 193. - Processo de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por se preparar um composto de fórmula II ou um dos seus sais, em que R1 representa alquilo inferior, R2 representa alquilo inferior, Rg representa hidrogénio, carboxi ou sulfo, R^ representa carboxi ou sulfo, e G representa um grupo 1,4-fenileno insubstituído ou substituído por carboxi e/ou sulfo, ou um grupo 1,4-nafti1eno insubstituído ou substituído por carboxi e/ou sulfo.
- 205. - Processo de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por se preparar um composto de fórmula II ou um dos seus sais, em que R1 representa CpC^-alquilo, R2 representa C1-C4-a 1qui1 o, Rg representa hidrogénio ou sulfo, R^ representa sulfo e G representa um grupo 1,4-fenileno insubstituído ou substituído por sulfo.
- 211. - Processo de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por se preparar um composto de fórmula II ou um dos seus sais, em que R^ representa C^-C^-alquilo, R2 representa C1-C^-alquilo, Rg representa hidrogénio, R4 representa sulfo e G representa um grupo 1,4-fenileno insubstituído.
- 223. - Processo de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por se preparar ácido 4-amino-62--41 -(Ν,N-dimetί1amino)-azobenzeno-2-su1fónico ou um dos seus sais.
- 235. - Processo de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por se preparar ãcido 4-amino-4'-(N,N-dimeti1amino)-azobenzeno-2,6-dissulfónico ou um dos seus sais.
- 24®. _ Processo de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por se preparar ácido 4-(N,N-dimetilamino)-naftaleno-1-azo-(4'-aminobenzeno-2l-sulfónico) ou um dos seus sais.
- 255. - Processo para a modificação química de uma proteína, caracterizado por se fazer reagir a respectiva proteína cum um dos compostos de fórmula I ou um dos compostos de fórmula I ou um dos seus sais, obtidos de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 17.
- 26?. - Processo para a modificação química de uma proteína, que envolve também uma coloração, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado por se proceder tal como se indica na reivindicação 25.
- 27?. - Processo para a modificação química dos radicais de lisina de uma proteína, caracterizado por se fazer reagir a respectiva proteína com ácido 4'-(N,N-dimetilamino)-4-isotiocianato-azobenzeno-2-sulfónico.
- 28?. - Processo para a modificação química dos radicais de lisina de uma proteína, que envolve uma coloração, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado por se proceder da maneira indicada na reivindicação 27.
- 29a. - Processo para a modificação química dos radicais de cisteina de uma proteína, caracterizado por se fazer reagir a proteína com ácido 4'-(N,N-dimetilamino)-4-(N-iodoacetil)-amino-azobenzo-2-sulfónico.
- 30a. - Processo para a modificação química dos radicais de cisteína de uma proteína, que envolve uma coloração, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado por se proceder tal como se indica na reivindicação 29.
- 31a. - Processo para a investigação de uma proteína, caracterizado por se utilizar, na referida investigação, como agente auxiliar, um composto de fórmula 1, ou um dos seus sais, obtenível de acordo com qualquer uma das re i v i nd icações 1 a 17.
- 32a. - Processo para a modificação química de uma proteína, caracterizado por se utilizar, na referida modificação, como reagente, um composto de fórmula I, ou um dos seus sais, obtenível de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17.
- 33a. - Processo para a modificação química de uma proteína, de acordo com a reivindicação 31 ou 32, caracterizado por a referida modificação estar associada com coloração.
- 34a. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 33, caracterizado por por se utilizar o ácido 41-(Ν,Ν-dimetilamino)-4-isotiocianato-azobenzeno-2-sulfónico.
- 35?. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 33, caracterizado por por se utilizar o ácido 4'-(N,N-dimetilamino)-4-(N-iodoacetil)-amino-azobenzeno-2-sulfÓnico.
- 365. - Processo para a preparação de um composto de fórmula II, obtenível segundo o processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 24, ou de um seu sal, caracterizado por se utilizar nesse processo, como material de partida, um composto de fórmula I, ou um seu sal.
- 37?. - Processo para o fabrico de um dispositivo para efectuar automaticamente a sequência que consiste na modificação química de uma proteína por meio de um composto de fórmula I que se pode obter de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 17, ou de um seu sal; na eventual desnaturação da proteína quimicamente modificada e na cromatografia líquida de alta resolução (HPLC) da mistura peptídica resultante do tratamento com protease, caracterizado por compreender a combinação dos seguintes componentes: uma bomba injectora que serve para fornecer uma amostra da proteína que se pretende modificar quimicamente por meio de um composto I ou de um seu sal, solventes, reagentes e/ou catalisadores necessários aos referidos passos de modificação química por meio de um composto I ou de um seu sal, da desnaturação facultativa e do tratamento com protease gás inerte e solução de lavagem, através de uma primeira ligação até um reactor componente essa que está equipada com uma tampa roscada e está instalada dentro de uma manga de aquecimento, uma bomba de vácuo componente essa que permite através de uma segunda ligação a evacuação do referido reactor fim de concen-65trar o conteúdo do referido reactor uma terceira ligação, compente essa que através de um ligeiro excesso de pressão de gás inerte fornecido pela referida bomba injectora através da referida primeira ligação que serve para libertar o conteúdo do referido reactor uma vez efectuada a modificação química ou a desnaturação facultativa através de uma primeira válvula, de uma quarta ligação, de uma segunda válvula e uma quinta ligação para uma unidade de dessa 1inização, ou que serve para libertar o conteúdo do referido reactor quando se efectuou o tratamento com protease através da referida primeira válvula, da referida quarta ligação, da referida segunda válvula e de uma sexta ligação a uma componente de HPLC componente essa a que estão ligados um tracejador (plotter) e, através de uma sétima ligação um recolher da fracções, ou que serve conduzir a solução da lavagem contida no referido reactor através da referida primeira válvula e de uma oitava ligação para um reservatório de resíduos, uma bomba componente essa que fornece eluente através de uma nona ligação a referida segunda válvula e a referida quinta ligação para a referida unidade de dessalinização, um décima ligação, componente essa que serva para conduzir o eluato que é eluído de referida unidade de dessalinização para um detector, componente esse que serve para controlar uma terceira válvula de modo que o eluato que é eluj_ do a partir da referida unidade de dessa1inização , quando contém a proteína quimicamente modificada no passo de modificação química ou eventua1 mente a proteína quimicamente modificada desnaturada preparada no passo de desnaturação facultativo, seja fornecido através de uma décima primeira ligação ao referido reactor e que, quando não contém essa proteína quimicamente modificada ou essa proteína quimicamente modificada desnaturada, seja conduzida através de décima segunda ligação para o referido reservatório de resíduos, e uma décima terceira ligação, componente essa que serve para conduzir o eluato do referido detector para a referida terceira válvula.
- 383. - Processo para preparar automáticamente a sequência mencionada na reivindicação 37, caracterizado por a referida proteína ser processada com o auxílio de um dispositivo fabricado de acordo com a reivindicação 17.
- 39«. _ Processo de acordo com a reivindicação 38, caracterizado por, no passo de modificação química se fazer reagir a proteína com ácido 4 1 -(N , N-dimeti1amino)-4-isotiocianato-azobenzeno-2-sulfónico.
- 403. - Processo de acordo com a reivindicação 38, caracterizado por, no passo de modificação química se fazer reagir a proteína com ácido 4'-(N,N-dimeti1amino)-4-(N-iodoacetil)-amino-azobenzeno-2-sulfónico.
- 413. - Processo para efectuar automáticamente a sequência mencionada na reivindicação 37, caracterizado por se utilizar nesse processo um dispositivo babricado de acordo com a reivindicação 37.-ξ>Ί42á. - Processo para realizar o passo de modificação química mencionado na reivindicação 37, e efectuado num dispositivo fabricado de acordo com a reivindicação 37, caracterizado por se utilizar nesse processo, como reagente, um composto obtenível de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17.
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