RS60744B1 - Derivati diarilmetilideni pipiredina i njihova upotreba kao agonista delta opioidnih receptora - Google Patents

Description

Opis

Oblast pronalaska

[0001] Predmetni pronalazak je usmeren na nova jedinjenja, na postupak njihovog dobijanja, njihovu upotrebu i farmaceutske kompozicije koje sadrže nova jedinjenja. Novi selektivni agonisti δ -opioidnih receptora korisni su u terapiji, a posebno u lečenju bola, anksioznosti i depresije. Stanje tehnike

[0002] Delta opioidni receptori (DOR) smatraju se potencijalnim ciljem za ublažavanja stanja bola, depresije i anksioznih poremećaja. Fizički bol je tipično čulno iskustvo koje se može opisati kao neprijatna svest o štetnom stimulansu ili telesnim povredama. Pojedinci osećaju bol različitim svakodnevnim ozledama i bolovima, a ponekad i kroz ozbiljnije povrede ili bolesti. U naučne i kliničke svrhe, Međunarodno udruženje za proučavanje bola (IASP), bol definiše kao "neprijatno čulno i emocionalno iskustvo povezano sa stvarnim ili potencijalnim oštećenjima tkiva ili opisano u smislu takvog oštećenja".

[0003] Bol je čest razlog za savetovanje sa lekarom. To je glavni simptom u brojnim medicinskim stanjima, značajno ometajući kvalitet života i opšte funkcionisanje pojedinca. Dijagnoza se zasniva na karakterizaciji bola na različite načine, u skladu sa trajanjem, intenzitetom, vrstom (tup, intenzivan, pulsirajući ili probadajući) izvorom ili lokacijom u telu. Obično bol prestaje bez lečenja ili reaguje na jednostavne mere kao što su odmor ili uzimanje analgetika, i tada se naziva ,,akutnim“ bolom. Ali može da postane i uporan i pređe u stanje koje se zove hronični bol, pri čemu se bol više ne smatra simptomom već bolešću.

[0004] Bol je najčešći simptom za koji pacijenti traže lekarsku pomoć i lečenje. Bol može biti akutna ili hronična. Iako je akutna bol obično samo-ograničena, hronična bol može trajati 3 meseca ili duže i dovesti do značajnih promena u ličnosti, životnom stilu, funkcionalnoj sposobnosti ili opštem kvalitetu života (K. M. Foley, Pain, in Cecil Textbook of Medicine 100- 107, J. C. Bennett and F. Plum eds., 20th ed.1996).

[0005] Važeće analgetske terapije su efikasne i povezane su sa značajnim neželjenim efektima, posebno što se tiče hroničnih stanja.

[0006] Uticaj hroničnog bola može da varira od blage nelagodnosti do najgoreg mogućeg bola, koji ima razoran učinak na obolele i njihove porodice. Vrste bolova su mnogobrojne i različite i uključuju bolove u donjem delu leđa, artritis (posebno osteoartritis), glavobolju (uključujući i migrenu), fibromijalgiju, oštećenje živaca (neuropatija), neurološku bolest (npr. multipla skleroza) i postvirusnu bolest (npr. herpes zoster).

[0007] Ostale bolesti povezane sa CNS-om, kao što su Alchajmerova i Parkinsonova bolest, imaju veliku raširenost pratećih bolova. Učestalost hroničnog bola raste sa napredovanjem i povezana je i pojačana sa depresivnom bolešću i gubitkom sna.

[0008] DOR-i imaju višestruku ulogu u poremećajima centralnog nervnog sistema, pored bolova, kao što su depresija, anksioznost, epilepsija i stres, kao i kod gastrointestinalnih poremećaja kao što su dijareja, postoperativni ileus, ulceracija i sindrom iritabilnih creva i u srodnim upalnim poremećajima, poput osteoartritisa i reumatoidnog artritisa, i kod drugih, uključujući respiratorni, alkoholizam i gojaznost/ kompulsivno prejedanje.

[0009] Identifikacija najmanje tri različite populacije opioidnih receptora (δ), (μ) i (κ) receptora je sada dobro utvrđena i sve tri su očigledne i u centralnom i perifernom nervnom sistemu mnogih vrsta, uključujući čoveka.

[0010] Nedavno istraživanje više od 45.000 ljudi u 16 zemalja otkrilo je da skoro 1 od 5 stanovnika Evrope trpi umerene ili jake bolove koji traju duže od 6 meseci. Hronični bol, prema tome, predstavlja ogroman teret za nacionalnu ekonomiju i kvalitet života pacijenata. S obzirom na broj različitih stanja hroničnih bolova, populacija pacijenata je izuzetno raznolika, mada je vrlo verovatno da će biti pomerena prema gornjem slarosnom rasponu sa neuropatijama i bolovima u zglobovima koji su posebno istaknuti. Na primer, kod institucionalizovanih starijih pacijenata, do 80% je prijavljen trenutni problem bola, iako značajan procenat prima adekvatnu analgetsku terapiju. Stoga postoji hitna potreba za novim terapijama za bol koje su efikasne u dužem periodu sa niskim rizikom od štetnih efekata.

[0011] Obično korišćeni opioidi, kao što su kodein, dihidrokodin (za blagi do umereni bol) i oksikodon, tramadol itd. (za jake bolove) su ili neselektivni, delujući na sve tri podtipove opioidnih receptora ili su donekle pristrasni μ-receptoru i oni proizvode čitav spektar i korisnih i neželjenih efekata.

[0012] Široka distribucija podtipova opioidnih receptora u CNS-u i perifernim tkivima rezultira u pratećim sporednim efektima i to mučninom, zatvorom, svrabom i opasnošću po život opasne respiratorne depresije, izazvane mešovitim opioidnim ligandima. Razvoj tolerancije dodatno ograničava njihovu kliničku efikasnost.

[0013] Razvoj tolerancije dodatno ograničava njihovu kliničku efikasnost. Dokazi izvedeni metaanalizama u pogledu kliničke efikasnosti tradicionalnih opioida i drugih najčešće korišćenih analgetika u hroničnim bolestima su slabi ili negativni; amitriptilin (analgetik prve linije za neuropatski bol) koristi manje od 40% pacijenata i samo oko jedne trećine pacijenata lečenih gabapentinom dobija značajno olakšanje. Trenutno dostupni naponski aktivirani blokatori natrijumovih kanala takođe imaju veoma ograničenu efikasnost i značajan rizik od CNS-a i kardiotoksičnosti.

[0014] Ova zajednička karakteristika pruža mogućnost da se modifikovanje aktivnost pojedinačnih ciljeva, kao što je da δ -opioidni receptor (DOR) obezbedi korist u lečenju bola.

Kratak opis pronalaska

[0015] Jedinjenja predmetnog pronalaska pokazuju visoku selektivnu potenciju za DOR.

Jedinjenja predmetnog pronalaska pružaju proširen terapeutski raspon i imaju potencijal, za razliku od postojećih analgetika koji daju samo umereno ublažavanje bola, da proizvedu održavanu analgeziju u stanjima bola sa manjim rizikom od neželjenih efekata, uključujući respiratornu depresiju i zatvor.

[0016] Jedinjenja predmetnog pronalaska će značajno proširiti mogućnosti lečenja za kliničare i povećati kvalitet života za ogroman broj pacijenata.

[0017] Predmetni pronalazak obezbeđuje jedinjenje formule (I)

[0021] Prema aspektu predmetnog pronalaska, jedinjenje formule 1a se koristi u terapiji bola, kao što je lečenje akutnog i hroničnog bola.

[0022] Jedinjenja predmetnog pronalaska su veoma potentna i zadržaće analgetsku jačinu pri ponovljenoj primeni. Jedinjenja pronalaska će biti korisna u terapiji, posebno za lečenje različitih stanja bola, kao što su hronični bol, neuropatski bol, akutni bol, bol od karcinoma, bol prouzrokovan reumatoidnim artritisom, osteoartritisom, fibromijalgijom, migrenom, visceralni bol, dijabetski bol itd.

[0023] Jedinjenja ovog pronalaska su podjednako korisna za lečenje depresije i anksioznosti kao i za razne vrste bolnog stanja , kao što je prethodno pomenuto.

[0024] Jedinjenja pronalaska su korisna za lečenje urinarne inkontinencije, različitih mentalnih bolesti, kašlja, edema pluća, raznih gastrointestinalnih poremećaja (sindrom iritabilnog kolona, bolest nadražanih creva), povrede kičme i zavisnosti od lekova, uključujući lečenje zloupotreba alkohola, nikotina, opioida i drugih droga i za poremećaje simpatičkog nervnog sistema, na primer hipertenzije.

[0025] Jedinjenja pronalaska su korisna kao imunomodulatori, naročito za autoimunske bolesti, kao što su artritis, za transplantacije (graft) kože i transplantacije organa.

[0026] Jedinjenja pronalaska su korisna u bolesnim stanjima gde je prisutna degeneracija ili disfunkcija opioidnih receptora ili je umešana u takvu promenu. Ovo može da obuhvati upotrebu izotopno obeleženih verzija jedinjenja pronalaska u dijagnostičkim tehnikama i imidžinga, kao što je pozitronska emisiona tomografija (PET).

[0027] Jedinjenja ovog pronalaska su korisna kao analgetsko sredstvo za upotrebu tokom opšte anestezije i praćenje anestezije. Kombinacije sredstava sa različitim svojstvima često se koriste za postizanje ravnoteže efekata potrebnih za održavanje stanja anestezije (npr. amnezija, analgezija, opuštanje mišića i sedacija). U ovu kombinaciju spadaju inhalacioni anestetici, hipnotici, anksiolitici, neuromuskularni blokatori, blokatori neuropeptidnih receptora i drugi opioidi.

[0028] Jedinjenja predmetnog pronalaska mogu da se upotrebe u kombinovanoj terapiji sa drugim jedinjenjima protiv bolova.

[0029] U obimu predmetnog pronalaska je upotreba gore navedenog jedinjenja formule I, za proizvodnju leka za lečenje bilo kog od gore navedenih slanja.

[0030] Sledeći aspekt predmetnog pronalaska je postupak za lečenje subjekta koji je oboleo od bilo kog od gore navedenih stanja, pri čemu se efikasna količina jedinjenja prema gornjoj formuli 1 daje pacijentu kome je takav tretman potreban.

[0031] Sledeći aspekt predmetnog pronalaska je farmaceutska kompozicija koja sadrži barem jedinjenje formule I kao aktivni sastojak, ili njegovu fiziološki prihvatljivu so, zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačem.

Načini dobijanja

[0032] Jedinjenja fonnula (I) dobijena su kao što je dato na šemi 1.

[0034] korišćene su sledeće skraćenice:

Dppf = (difenilfosfino)ferocen

HATU = l-[Bis(dimetilamino)metilen]-lH-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridinium-3-oksid heksafluorfosfat

Primeri

[0035] Pronalazak je ilustrovan sledećim primerima;

Referentni primer la.4-[(3-karbamoilfenil)(1-([6-(trifluormetil)piridin-3-il]metil)piperidin- 4-iliden)metil]-N,N-dimetilbenzamid

[0036] 4-[(3-Karbamoilfenil)(piperidin-4-iliden)metil]-N,N-dimetilbenzamid (40 mg, 11 mmol) i 6-(trifluormetil)piridin-3-karbaldehid (21.2 mg, 0,12 mmol) rastvoreni su u dihloretanu (1,5 mL). Dodata je srićetna kiselina (6,3 μL, 0,11 mmol) i reakciona smeša je mešana 10 minuta na sobnoj temperaturi pre nego što je dodat NaBH(OAc)3(37,3 mg, 0,18 mmol). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 2 dana. Dodat je metilen hlorid (1 mL) i smeša je isprana vodom (1 mL). Vodena faza je ekstrahovana metilen hloridom (1 mL х 3). Kombinovane organske faze su osušene sa Na2SO4, profiltrirane i uparene. Sirov proizvod je prečišćen preparativnom HPLC (30 do 65% CH3CN u 50 mM NH4HCO3(aq)) dajući traženo jedinjenje (19,0 mg, prinos 33%) kao svetlo žutu čvrstu supstancu. MS ESI+ m/z 523 [M+H]+ .

Primer 1b.4-[(3-Karbamoilfenil)[1-(1,3-tiazol-5-ilmetil)piperidin-4-iliden]metil]-N,N-dimetilbenzamid

[0037] 4-[(3-Karbamoilfenil)(piperidin-4-iliden)metil]-N,N-dimetilbenzamid (40 mg, 11 mmol) i 1,3-tiazol-5-karbaldehid (13,7 mg, 0,12 mmol) rastvoreni su u dichloretanu (1.5 mL). Dodata je sirćetna kiselina (6,3 μL, 0,11 mmol) i reakciona smeša je mešana 10 minuta na sobnoj temperaturi pre nego što je dodat NaBH(OAc)3(37,3 mg, 0,18 mmol). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi 2 dana. Dodat je metilene hlorid (1 mL) i smeša je isprana vodom (1 mL). Vodena faza je ekstrahovana metilene hloridom (1 mL х 3). Kombinovane organske faze su osušene sa Na2SO4, profiltrirane i uparene. Sirov proizvod je prečišćen preparativnom HPLC (25 do 65% CH3CN u 50 mM NH4HCO3(aq)) dajući traženo jedinjenje (8,2 mg, prinos 16%) kao belu čvrstu supstancu. MS ESI+ m/z 461 [M+H]+ .

Referentni primer Ic.4-[(3-karbamoilfenil)({1-[(4-metil-lH-imidazol-5-il)metil]piperidin-4-iliden}]metal]-N,N-dimetilbenzamid

[0038] 4-[(3-karbamoilfenil)(piperidin-4-iliden)metil]-N,N-dimetilbenzamid (40 mg, 11 mmoi) i 4-metil-l H-imidazol-5-karbaldehid (13,3 mg, 0,12 mmol) rastvoreni su u dihloretanu (1,5 mL). Dodata je sirćetna kiselina (6,3 μL, 0,11 mmol) i reakciona smeša je mešana l0 minut na sobnoj temperaturi pre dodavanja NaBH(OAc)3(37,3 mg, 0,18 mmol). Reakciona smeša je 2 dana mešana na sobnoj temperaturi. Dodat je metilen hlorid (1 mL) i smeša je isprana vodom (1 mL). Vodena faza je ekstrahovana metilen hloridom (1 mL х 3). Kombinovane organske faze su osušene sa Na2SO4, profiltrirane i upaprene. Sirov proizvod je prečišćen preparativnom HPLC (10 do 50% CH3CN u 50 mM NH4HCO3(aq)) dajući traženo jedinjenje (14 mg, prinos 28%) kao belu čvrstu supstancu. MS ESI+ m/z 458 [M+H]+ .

Dobijanje intermedijera

[0039]

Primer III. terc-Butil 4-{brom[4-(dimetilkarbamoil)fenil]metiliden}piperidin-1- karboksilat [0040] U 4-({ l-[(terc-butoksi)karbonil]piperidin-4-iliden}(3-karbamoilfenil)metil)benzoevu kiselinu (1,00 g, 2,52 mmol) u DMF (8,0 mL) dodati su HATU (1,15 g, 3,02 mmol) i N,N-diizopropiletilamin (1,8 mL, 10,1 mmol) i reakciona smeša je mešana 6 min na sobnoj temperaturi. Zatim je dodat dimetilamin-HCI (0,617 g, 7,57 mmol) i reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi preko noći. Dodat je etil acetat i rastvor je ispran ledeno hladnim 1 M HCl, NaHCO3(zas. aq.) i rastvorom soli, osušen (Na2SO4), profiltriran i koncentrovan dajući 1,33 g sirovog proizvoda koji je upotrebljen u narednom koraku, bez prečišćavanja. MS ESI+ m/z 367 [M+H]4-t-Bu.

Primer IV. terc-butil 4-|(3-karbamoilfenil)]4-(dimetilkarbamoil) fenil]metiliden]piperidin- 1-karboksilat

[0041] terc-Butil 4-{brom[4-(dimetilkarbamoil)fenil]metiliden}piperidin-1-karboksilat (0,533 g, 1,26 mmol) i (3-karbamoilfenil)boronska kiselina (0,249 g, 1,51 mmol) rastvoreni su u dimetoksietanu (17 mL) i pod azotom su dodati 2 M K2CO3(aq) (0,6 mL) i PdCl2(dppf) (0,051 g, 0,063 mmol) i reakcija je zagrevana 3,5h na 80 °C. Reakciona smeša je ohlađena na sobnu temperaturu i ostavljena preko vikenda. Dodati su metilen hlorid i voda i faze su razdvojene. Vodena faza je ekstrahovana metilen hloridom (3х). Kombinovane faze su isprane rastvorom soli, osušene (MgSCO4), profiltrirane i koncentrovane dajući 0,630 g sirovog proizvoda, kao braon ulje, koje je upotrebljeno u narednom koraku bez dodatnog prečišćavanja. MS ESI+ m/z 408 [M+H]4-t-Bu.

Primer V.4-[(3-karbamoilfcnn)(piperidin-4-ilidene)metil]-N,N-dimetilbenzamid

[0042] terc-Butil 4-[(3-karbamoilfenil)[4-(dimetilkarbamoil)fenil]metiliden]piperidin-1- karboksilat (0,630 g, 1,36 mmol) je rastvoren u metilen hloridu (3 mL) i dodata je smeša trifluorsirćetne kiseline /metilen hlorida (3,5mL). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 1 h 15 min. Reakciona smeša je uparena i ostatak je ponovo rastvoren u metilen hloridu. Organska faza je isprana zas. vod. K2CO3(2x), osušena (MgSO4), profiltrirana i koncentrovana dajući 0,550 g sirovog proizvoda kao braon ulje koje je upotrebljeno u narednom koraku bez dodatnog prečišćavanja. MS ESI+ m/z 364 [M+H]+ .

Farmaceutske kompoziciie

[0043] Obezbeden je postupak za lečenje stanja pri čemu postupak uključuje davanje terapeutski efikasne količine jedinjenja formule I osobi koja pati ili je podložna takvom stanju. Jedinjenja pronalaska će se normalno davati oralnim, topikalnim, parenteralnim, intravenskim, intramuskularnim, potkožnim, intra artikularnim ubrizgavanjem (injekcijom) ili na druge načine ubrizgavanjem, bukalnim, sublingvalnim, rektalnim, vaginalnim, transdermalnim i / ili nazalnim putem i / ili inhalacijom, u obliku farmaceutskih preparata koji sadrže aktivni sastojak ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, u farmaceutski prihvatljivom doznom obliku. U zavisnosti od poremećaja i pacijenta koji se leči i načina primene, kompozicije se mogu davati u različitim dozama.

[0044] Pogodne dnevne doze jedinjenja ovog pronalaska za terapeutski tretman ljudi su oko 0,0001-100 mg / kg telesne težine, poželjno 0,01-10 mg / kg telesne težine.

[0045] Oralne formulacije su tablete ili kapsule koje mogu da se formulišu postupcima poznatim stručnjacima da bi se obezbedile doze aktivnog jedinjenja u rasponu od 0,007 mg do 700 mg, na primer 1 mg, 3 mg, 5 mg, 10 mg, 25 mg, 50 mg, 100 mg, 250 i 500 mg.

[0046] Optimalna doza i učestalost primene zavisiće od određenog stanja koje se leči i njegove težine; vrsta pacijenta; starosti, pola, veličine i težine, ishrane i opšteg fizičkog stanja određenog pacijenta; odnosa težine mozga i telesne težine; drugih lekova koje pacijent možeda uzima; načina davanja; formulacije; i raznih drugih faktora koji su poznati lekarima i drugim prosečnim stručnjacima iz obalsti tehnike.

[0047] Prema sledećem aspektu pronalaska, na taj način je obezbeđena farmaceutska formulacija koja uključuje bilo koje jedinjenje pronalaska ili njegove farmaceutski prihvatljive derivate, u smeši sa farmaceutski prihvatljivim adjuvansima, razblaživačima i / ili nosačima.

[0048] Jedinjenja pronalaska mogu biti prisutna u farmaceutskoj formulaciji u koncentraciji od 0,1 do 99,5%, kao što je od 0,5 do 95%, težine ukupne formulacije.

[0049] Za oralnu primenu, jedinjenje pronalaska može se pomešati sa adjuvansom ili nosačem, na primer laktozom, saharozom, sorbitolom, manitom; skrob, na primer, krompirovim skrobom, kukuruznim skrobom ili amilopektinom; derivatom celuloze; vezivom, na primer, želatinom ili polivinilpirolidonom; i / ili lubrikansom, na primer, magnezijum stearatom, kalcijum stearatom, polietilen glikolom, voskom, parafinom i slično, a zatim presovati u tablete. Ako su potrebne obložene tablete, jezgra, pripremljena kako je gore opisano, mogu da budu obložena koncentrovanim rastvorom šećera koji može da sadržavi, na primer, gumi arabiku, želatin, talk i titan dioksid. Alternativno, tableta može da bude presvučena pogodnim polimerom rastvorenim u lako isparljivom organskom rastvaraču.

[0050] Za dobijanje mekih želatinskih kapsula, jedinjenje pronalaska može da se pomeša, na primer, sa biljnim uljem ili polietilen glikolom. Tvrde želatinske kapsule mogu da sadrže granule ovog jedinjenja koristeći bilo koje pomenute pomoćne eksipijense za tablete. Takođe tečne ili polučvrste formulacije jedinjenja predmetnog pronalaska mogu da se pune u tvrde želatinske kapsule.

[0051] Tečni preparati za oralnu primenu mogu biti u obliku sirupa ili suspenzija, na primer, rastvori koji sadrže jedinjenje pronalaska, u uravnoteženom odnosu sa šećerom i smešom etanola, vode, glicerola i propilen glikola. Po izboru, takvi tečni preparati mogu da sadrže sredstva za bojenje, arome, saharin i / ili karboksimetilcelulozu kao sredstvo za zgušnjavanje ili druge pomoćne eksipcijense poznate stručnjacima u ovoj oblasti tehnike.

Biološka procena

In vitro

[0052] δ-opioidni receptori (DOR) su kuplovani sa inhibitomim G proteinima (Gi/o) koji inhibiraju aktivnost adenilil ciklaze, otvaraju K kanale i blokiraju Ca2+ kanale. Takođe mogu da se kupluju, na način koji zavisi od agonista, za β--arestinin 2, što dovodi do desenzibilizacije i fosforilacije MAP kinaze (ERK).

[0053] In vitro procena jačine δ -opioidnog agonista: ln vitro procena potencijata δ -opioidnog agonista: merenja cAMP će se izvršiti u CHO ćelijama koje eksprimuju δ -opioid izložene povećanim koncentracijama agonista korišćenjem kompleta za proveru DiscoveRx cAMP Hunter™. Angažovanje β -arestina meri će se u prisustvu povećanja koncentracije agonista korišćenjem DiscoveRx PathunterR kompleta. Selektivnost mu- i kapa-opioidnih receptora biće izvršena korišćenjem Cerep cAMP ref.1392 i 2071 (Cerep Le Bois l'Eveque, 86600 Celle l'Evescault, France).

ln Vivo

Hronični bol, model Seltzer

[0054] Seltzer-ova procena koristi se za procenu hroničnog bola. U istraživanje je uključeno trideset mužjaka CDl miševa (29-37 g). Nabavljeni su od kompanije Charles-River Ltd. i čuvani su u odeljenju za životinje na Animal Facility of the Department of Pharmacology and Pharmacotherapy at the University of Pécs na 24-25 ° C, obezbeđeni standardnom hranom i vodom ad libitum. Sve eksperimentalne procedure su se sprovodile u skladu sa 1998/XXVIII Act of the Hungarian Parliament on Animal Protection and Consideration Decree of Scientific Procedures of Animal Experiments (243/1988) i u skladu sa preporukama iz Helsinške deklaracije. Studije je odobrila Ethics Committee on Animal Research of Pécs University prema the Ethical Codex of Animal Experiments i data je dozvola (licenca br .: BA 02 / 2000-11-2006). Nakon merenja uslova određena su tri pouzdana kontrolna mehano- nociceptivna praga, tri uzastopna dana za sve miševe i operacija se izvodi posle. Sedmog dana nakon ligacije nerva određeni su mehano-nociceptivni pragovi neposredno pre i 15 min nakon i.p. davanja leka kako bi se uočila razlika između pragova pre injekcije i nakon injekcije. U istraživanje su uključeni samo miševi sa najmanje 30% hiperalgezije pre injekcije.

[0055] Uzorci krvi i mozga su uzeti 60 minuta nakon primene leka pod dubokom anestezijom ketamin-kilazin i poslati na dalju analizu. Krv (0,5-1,5 ml) uzima se srčanom punkcijom u epruvete koje sadrže EDTA i centrifugira se. Uzorci plazme se čuvaju na -70 ° C. Celi mozak sa moždanim mozgom i mozgom seciraju se, stavljaju se u eppendorf epruvete, odmah zamrzavaju u tečnom azotu i čuvaju se na -70 ° C.

Model hroničnog bola MNX OA

[0056] Štakori su anestezirani koristeći 2,5% izofluran (Abbott, Maidenhead, Velika Britanija) u kiseoniku sa protokom od 1 L u minuti. Leva noga je obrijana i hirurški pripremljena. Otkriven je medijalni kolateralni ligament i odstranjen je njegov deo da bi se razotkrio meniskus.

Meniskus je presečen u najužoj tački duž cele debljine. Sloj vezivnog tkiva i koža su zatim zatvoreni obloženim šavovima Vicril 8-0 i 4-0 (Ethicon, Livingstone, UK). Nije dat analgetik nakon operacije, jer je ponašanje izazvano bolom rezultat eksperimenta. Lažno operisane životinje podvrgnute su identičnoj proceduri, s izuzetkom što meniskus nije presečen. Uticaj tretmana na raspodelu težine kroz levo (ipsilateralno) i desno (kontralateralno) koleno procenjuje se korišćenjem merača onesposobnosti (Linton Instruments UK). Promena raspodele težine na zadnjoj šapi definisana je kao razlika u količini težine između desnog kontralateralnog kontrolnog uda i levog ipsilateralnog lečenog uda podijeleno sa zbirom težine desnog i levog uda х 100. Pragovi povlačenja zadnje šape na mehaničku stimulaciju mereni su kalibrisanim von Frey monofilmentima pomoću metode up and down. Zivotinje su nastanjene najmanje dva puta pre početka eksperimenata. Merenja polaznih vrednosti bola u ponašanju vrše se na dan 0 pre indukcije modela, a zatim u dane 14, 28, 35 i 49.

Akutni inflamatroni bol indukovan karagenanom

[0057] A-karagenan (100 μL 2% u fiziološkom rastvoru; Sigma, Poole, UK) je ubrizgan u plantarnu površinu zadnje šape pacova. Mehanički podražaji (8-100 g von Frey monofilamenti) su primenjeni (uzlaznim redosledom) na periferno receptivno polje u razmacima od 10 minuta, u trajanju od 180 minuta, nakon ubrizgavanja karagenana i zabeleženih povlačenja kao odgovora. Opseg zadnje šape meri se pomoću šava sa petljom oko šape na metatarzalnom nivou i blago zategnutog. Zatim je šav otvoren i odmeren na najbliži milimetar. Merenja se vrše pre ubrizgavanja karagenana, a zatim u intervalima od 60 minuta.

Ispitivanja ponašanja

Rotarod

[0058] Koordinacija (Rotarod); rotarod procena je primenjena za procenu opšteg ponašanja koordinatora. Procenjivaće se performansama na rotarod aparatu (Ugo Basile) na kome će se trenirati miševi tokom 3 dana, a svaki miš će primiti četiri probna ispitivanja na dan koja se sastoje od postavljanja miševa na 2 min na štap koji se rotira brzinom do 24 o / min, latencija za padanje sa rotaroda na oblogu od penaste gume, mereno je završnim probnim vremenom nakon 2 min ako miš nije pao.

Test otvorenog polja

[0059] Ponašanje na otvorenom polju; procena na otvorenom polju se primenjuje za procenu opšteg društvenog ponašanja. Zivotinje će biti smeštene u standardnu arenu na otvorenom terenu i ponašanje če se pratiti računarskim praćenjem (Ethovision) do 2 sata dnevno. Meriće se ukupno kretanje, a vreme provedeno u središnjem delu arene i u povlačenju će dati indikacuju ponašanja sličnog anksioznosti.

Claims (1)

1. 2. Jedinjenje formule I prema zahtevu 1 za upotrebu u stanjima bola. 3. Jedinjenje formule I prema zahtevu 2, naznačeno time, što su stanja bola usmerena prema akutnom bolu. 4. Jedinjenje formule 1 prema zahtevu 2, naznačeno time, što su stanja bola usmerena prema hroničnom bolu. 5. Jedinjenje formule I prema zahtevu 4, naznačeno time, što su stanja bola usmerena prema hroničnom bolu zglobova, kao što je bol izavan osteoartritisom ili fibromijalgijom. 6. Farmaceutska kompozicija koja sadrži kao aktivni sastojak barem jedinjenje formule I prema zahtevu 1, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačem. Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5