SE447789B - Forfarande for framstellning av forsommar-meningo-encephalitis-virus-vacciner och genom forfarandet framstellda vacciner - Google Patents

Description

g447 789 slag enligt uppfinningen därigenom, att a) odlingen av viruset företagen i suspensioner av fågel- embryonalceller, i synnerhet hönsenbryonalceller, på i och för sig känt sätt, b) att före reningen av suspensionen företagen en inaktive- ring av viruset genom behandling ned f -propiolacton el- ler formalin och genom tillsats av protaninsulfat ut- fälls beståndsdelar som sedimentarar snabbare än FSME- virus, och som avskiljs genom centrifugering och c) efter ultracentrifugeringen kollar under användning av sackaros som täthetsgradient uppsanlas de fraktioner. vilka vid 260 nm uppvisar en ökad extinktion och vilka innehåller delar med en sedimentationskonstant i områ- det av 200 S.

Genom en föredragen utföringsform avskiljes ur den viruset innehållande suspensionen före den kontinuerliga täthets- gradient-ultracentrifugeringen snabbare såsom ISHB-virus sedimenterande beståndsdelar genom tillsats av protamínsul- fat.

Lämpligen koncentreras virussuspennionen före den kontinuer- liga täthetsgradientultracentrifugeringen genon ultrafilt- rering.

Såsom tâthetsgradient användes företrädesvis en sackaros- lösning av 0 - $0%. vid användning av en sådan sackaros- lösning motsvarar den vid 260 nl en tydlig ökad extinktion uppvisande fraktionen tätheten hos en ungefär 40 procentig sackaroslösning. 447 789 Enligt en föredragen utföringsform utspädes de efter tät- hetsgradient-ultracentrifugeringen erhållna virus-peak- -fraktionerna med en humanalbuminhaltig buffert, varigenom en ökad stabilitet av virus-antigenet àstadkommes.

Den kontinuerliga täthetsgradient-ultracentrifugeringen är en på senare tid utvecklad renings- och koncentrations- metod av minsta delar på grund av sin täthet och sina sedi- mentationsegenskaper. Denna teknik består däri att partiku- lära andelar avlägsnas ur en suspension i en kontinuerlig ultracentrifugeringsprocess, genom att de på grund av på- verkande centrifugalkraft intränger i tätningsgradienterna, medan de under dessa betingelser icke sedimenterbara ande- larna kvarblir i suspensionen (effluent). De i tätningsgra- dienterna inträngda partiklarna vandrar under centrifugerings- processen fram mot det stället som motsvarar dess egen tät- het, varigenom man här uppnår en koncentration av dessa par- tiklar. Detta förfarande användes för första gången för re- ning av influensaviruset, som uppvisar en sedimentations- konstant av ungefär 800 S. Förfarandet beskrives i detalj i “Journal of Virology“, december 1967, sidorna 1207 - 1216, artikel "Purification of Large Quantities of Influenza Virus by Density Gradient Centrifugation" av C. B. Reimer, R. S. Baker, R. M. van Frank, T. E. Newlin, G. B. Cline och N. G. Anderson.

Eftersom FSME-viruset uppvisar en mycket lägre sedimenta- tionskonstant, nämligen ett värde av endast 200 S uppnås en- ligt uppfinningen en relativt ringa genomloppshastighet.

I detalj genomföras förfarandet pà följande sätt: Hönsembryonalceller suspenderas i ett cellkulturmedium (TCM 199) (Tissue Culture Medium 199) infekteras med viruset 447 789 och hàlles under aeroba betingelser vid en temperatur av mellan 25 och 38°C mellan en till fem dagar i suspension.

Därefter avskiljes celler och cellbestándsdelar genom cent- rifugering; den erhållna virussuspensionen inaktiveras me- delst formalin ellerqß-propiolacton och koncentreras där- efter genom ultrafiltrering. Suspensionen innehåller förutom FSME-viruset olika föroreningar, som delvis sedimenterar snabbare respektive långsammare än FSME-viruset. De snabbare sedimenterande andelarna avskiljs genom fällning med prota- minsulfat innan det egentliga kontinuerliga täthetsgradient- ultracentrifugeringsförfarandet genomföres.

Förfarandet genomföres i detalj på det sättet, att hälften av buffertlösníngen i den med buffertlösning, lämpligen med fosfatbuffertlösning fyllda rotorn av ultracentrifugen vid 3 000 varv per minut undantränges genom en 50 procentig sackaroslösning, varigenom en täthetsgradient av 0 - 50% sackaros utbildas. Därefter får den viruset innehållande suspensionen strömma genom rotorn vid ett rotorvarvtal av 000 varv per minut med en genomloppshastighet av lämp- ligen 3 liter/timma. Under de valda betingelserna intränger Iden större delen av viruspartiklarna i täthetsgradienten. rSâ snart hela materialet har passerat apparaten centrifugeras ännu en timma, medan samtidigt en fosfatbuffertlösning brin- 'gas att passera. Därefter stannas rotorn försiktigt och ro- torinnehållet uppdelas i enskilda fraktioner. Därefter be- stämmes extinktionen hos varje fraktion vid 260 nm och sam- tidigt fastställes sackaroshalten i fraktionen. Lokaliseringen av viruset i täthetsgradienten möjliggöres genom dess extink- tion vid 260 nm. Viruset bandar inom området kring 40% sacka- ros och åstadkommer här en tydlig ökning av extinktionen vid 260 nm.

I det bifogade diagrammet visas detta sammanhang, av vilket extinktionen av de enskilda fraktionerna framgår i relation 447 789 till täthetsgradienten. Täthetsgradienten hos sackaros- lösningen ligger mellan 0 - 50 %.

Den streckpunkterade kurvan återger fördelningen av ex- tinktionen vid 260 nm i de enskilda fraktionerna. Inom området kring 40 % sackaros har fraktionerna 10, ll och 12 en ökad, fraktionen ll, den maximala extinktionen. I denna fraktion befinner sig nästan uteslutande 200 S virus-par- tiklar utan märkbart snabbare eller långsammare än viruset sedimenterande föroreningar. Peaken motsvarar en sackaros- koncentration av 39 %. Den ytterligare peaken vid fraktions- numret 25, som motsvarar en sackaroskoncentration av mindre än 10 %, tyder på föroreningar, som bortkastas. I diagrammet visas också den relativa protektiva medverkan, Eastställd i direkta *mösskyddsförsök) hos de enskilda fraktionerna genom olika höga pelare. Fraktionen ll har således den högsta relativa skyddseffekten.

De uppsamlade virushaltiga fraktionerna utspädes nu med för- del med en humanalbuminhaltig buffert för att förbättra sta- biliteten hos virusantigenet och vidarebearbetas därefter på vanligt sätt till vacciner.

De utvunna vaccinerna har en högre renhet och kunna betydligt bättre fördragas av människor än de efter kända förfaranden ' framställda preparaten. Detta framgår av den följande tabel- len, i vilken i den första spalten - procentuellt uttryckt - uppspaltas rekatünmxna med vacciner enligt kända förfaranden och i den andra spalten enligt det föreliggande förfarandet.

Vid fräschningsympningar med enligt uppfinningen framställda vacciner har inga som helst oönskade reaktioner varken lokalt eller systematiskt, kunnat iakttagas.

G1 447 789 Enligt kända metoder framställda preparat- Enligt uppfümflræn Lakal smärta upp till 72 z 36 z Allmänna reaktioner Huvudvärk, trötthet upp till 64 % 25 % Feber (totalt) upp till 68 % 19 % 37,3 till 3s°c upp till se i 14 f: 38 till 39°c upp till 27 i 4 æ mer än 39°c upp till 9 i 1 i De enligt det föreslagna förfarandet framställda vaccinerna utmärker sig genom en ringa proteinhalt, bortsett från till- satt hnmanalbumin. Denna proteinhalt är vid samma antigena effekt många gånger, åtminstone l0 gånger mindre än vid hit- tills använda preparat. Även den specifika proteinhalten = proteinhalt (humanalbumin icke inräknad) i mikrogram per immuniseringsdos] är tydligt lägre vid enligt uppfinningen framställda vacciner, såsom framgår av följande jämförelser.

Enligt uppfinningen erhållna speciffl charger immuniseringsdos l 12 2 3 4 7 15 I förhållande härtill ligger värdena vid kända preparat inom området mellan 250 och 500 pg protein per immuniseringsdos.

Claims (5)

10 15 20 25 447 789 P a t e n t k r a v

1. l. Förfarande för framställning av en försommar-meningo- encephalitis-virus (FSME-virus)-vaccin genom odling av vi- ruset i vävnadskulturer, avskiljning av cellerna och cell- beståndsdelarna genom centrifugering, koncentrering och rening av viruset genom kontinuerlig täthetsgradientultra- centrifugering samt upparbetning av substratet till ett vaccin, k ä n n e t e c k n a t av att a) odlingen av viruset företages i suspensioner av fågel- embryonalceller, i synnerhet hönsembryonalceller, på i och för sig känt sätt, b) att före reningen av suspensionen företages en inaktive- ring av viruset genom behandling med /Û-propiolacton el- ler formalin och genom tillsats av protaminsulfat ut- fälls beståndsdelar som sedimenterar snabbare än FSME- virus, och som avskiljs genom centrifugering och c) efter ultracentrifugeringen kommer under användning av sackaros som täthetsgradient uppsamlas de fraktioner, vilka vid 260 nm uppvisar en ökad extinktion och vilka innehåller delar med en sedimentationskonstant i områ- det av 200 S.

2. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t av att virussuspensionen före den kontinuerliga täthetsgra- dientultracentrifugeringen koncentreras genom ultrafiltre- ring.

3. Förfarande enligt krav l eller 2, k ä n n e t e c k - n a t av att den efter den kontinuerliga täthetsgradient- ultracentrifugeringen erhållna virus-peak-fraktionen ut- spädes med en humanalbuminhaltig buffertlösning. 447 789

4. Vaccin framställt enligt kraven l - 3, k ä n n e - t e ç k n a t av att vaccinet förutom humanalbumin inne- håller maximalt 20 /ug/ml protein.

5. Vaccin enligt krav 4, k ä. n n e t e c k n a t av att den specifika proteinhalten - bortsett från humanalbumin - dvs. proteinhalten i fug per immuniseringsdos, uppgår till högst 20 .