SU1424744A3 - Способ получени перманентно растущих животных и человеческих клеток - Google Patents

Abstract

Изобретение касаетс  способов приготовлени  перманентно выращиваемых животных и человеческих.клеток и применени  полученных клеток дл  производства клеточных продуктов. Цель изобретени  - упрощение способа, Дл  этого осуществл ют сли ние нормальных животных или человеческих клеток в присутствии объедин ющих веществ (полиэтиленгликол  или вируса Sendai). Получают фрагмент трансформированных клеток. Прорывают стенку клетки (разрушают) путем лизиса в глицерине с внесением в несодержащий глицерин буферный раствор (при этом лопаютс  клеточные мембраны) или механически. Центрифугированием отдел ют фракции  дер от фракций цитоплазмы и используют все фракции. Фракции цитоплазмы обогащают митохондри ми лимфатических или этитоли- альных опухолевых клеток. Приготавливают кариопласты и цитопласты, обрабатыва  клетки цитохалазином. Полученные окруженные клеточными мембранами клеточные  дра (кариопласты) и окруженна  мембраной, лишенна   дра цитоплазма (ц 1топласты) пригодны дл  сли ни . Фрагменты клеток в свежем состо нии используют непосредственно после их приготовлени  или позднее, обеспечива  их сохранение в лиофили- зированном состо нии. 2 з.п. ф-лы, 5. табл. О)

Description

114

Изобретение относитс  к способу приготовлени  перманентно выращиваемых животных и человеческих клеток и к применению полученных линий клеток дл  получени  клеточных продуктов

Цель изобретени  - упрощение способа.

Способ осуществл ют следующим образом.

Сли ние осуществл ют известными методами в присутствии oбъeдин ющ rx веществ - предпочтительно в присутствии поллэтиленгликол  или вируса (Sendai). Получают фрагменты транс- формированных клеток.

Прорывают стенку клетки путем лизиса или механически. Затем путем центрифугировани  отдел ют фракции  дер от фракций цитоплазмы и исполь- зуют все фракции. Осуществл ют лизис путем набухани  клеток в глицерине и последующего внесени  в несодержащий глицерин буферный раствор. Это приводит к тойу, что лопаютс  клеточ- ные мембраны. Приготавливают карио- пласты и цитопласты путем обработки клеток цитохалазином. Полученные окруженные клеточными мембранами клеточные  дра (кариопласты) и окруженна  мембраной, лишенна   дра цитоплазма (цитопласты) пригодны дл  сли ни .

Фрагменты клеток в свежем состо нии используют непосредственно после 1к приготовлени  или позднее дл  осу

нем случае обеспечивают сохранение в лиофилизированном состо нии.

Примен ют фракции клеток, которые могут быть неполностью чистыми, однако не должны содержать никаких ин- тактных, способных размножатьс  клеток .

Дл  образовани  гибрида не используют в качестве вырожденной клетки НАТ-чувствительную клетку, Перманентно линии клеток, которые не обладают НАТ-чувствительностью используют дл  приготовлени  фрагментов дл  сли ни .

При описании конкретных примеров используютс  следующие сокращени  и товарные названи :

антитело; иммуноглобулин;

т жела  или легка  протеинова  цепь Igмолекул;

Q

|5

0 5 0

5

0

5

0

5

пристан НАТ-се- лекционна  среда 2 ,6,10,14-тетраметил- пентадекан;

ТК HGPRT

EBV MuLV

CD

ДМСО ДМЕМ

FKS .Ficoll

ПЭГ PBS

POD ABTS

EBSS

RPM1-1640

Трис

PDL

MNC

hTSH

|5-hTSH FA

CFA IFA

Мето- цель- 1500

питательна  среда, содержаща  гипоксантин, аминоптерин, тимиднн;

тимидин-киназа; гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансфе раза;

Эпштейн-Барр-вирус; лейкемийный ышиный вирус Abelson; цитоплазмин В, антибиотик (ALDRICH BIOCHEMICALS, Milwan- kee, США); диметилсульфоксид; эссенциальна  минимальна  среда Dulbecco; эмбриональна  тел чь  сыворотка;

полимерный тростниковый сахар (сахароза), РНАРчМАС1А; полиэтиленгликоль; буферированный фосфатом рассол; пероксидаза; аммониева  соль 2,2- -азино-ди-(3-зтилбензо- тиазолин-6-сульфокис- лоты);

равновесный солевой раствор Earle; Rosewell Park Memory Institut (среда); трис(оксиметил)-амино- метан;

периферические лимфоциты крови;

мононуклеиновые клетки (лимфоциты, моноциты); человеческий, стимулирующий Thyreoidea гормон; -цепь;

вспомогательное средство Freund; полное вспомогательное средство Freund; неполное вспомогательное средство Freund;

метилцеллюлоза (FL и КА);

пузырек f.)€ M5priHHort цитоплазмы (цитоплазма - мембрана - пузырек ) ;

FITC-Covaspheres

- флуоресцинизотиоцианат в 1аарог1идпой форме (COVAIENT TECHNICAL Ann Arbor, Мич. ClUA); EAZ- асцитные клетки Эрлиха

(АТСС; CCL, 77). П р- и м е р 1 .

А. Получение кариопластов и цито- пластов из мьшгиньгх миеломных клеток линии РЗ X 63 Ag 8.653 АТС No-CR L 1580.

А.1. Цитохалазин В (СВ, Aldrick Biochemicals, Milwaakee, США) раство р ют в диметилсульфоксиде (ДМСО,, Merek; 2 мг/мл) и хран т в качестве основного раствора при U°C.

Ficoll-400 (Pharmacia; полимери- зованна  сахароза) раствор ют в бидистиллированной воде (1 г/мл), автоклавируют и хран т в виде основного раствора при -20°С.

Однократной и двойной концентраци эссенциальную минимальную среду Dulbecco (ДНЕМ), эмбриональную тел чью сыворотку (FKS), L-глютамин (200 ммоль/л), стрептомицин-пенициллин Boehringer Mannheim целлюлозо- питратных трубочек стерилизуют путем УФ-облучени .

Лини  миеломной клетки Ag 8.653 АТСС CPv L - 1580 : 123, 1548-1550 (1979). Она азагвинин-резистентна, НАТ-чувствительна и не синтезирует ни Н-, ни L- Ig-цепей. Она хранитс  в ДМЕ11 + 15Z FKS + глютамин + пени- циллин-стрептоми11лн + пируват (-ДМЕМ полна  среда) при 37 С в атмосфере с 7% СОг.

А. 2. Методы энуклеации: 8х.10 Ag 8.653 клеток центрифугируют в течени 5 мин при 10 об/мин и повторно суспендируют и 12 мл 1,5%-ного Ficoll- ДПЕМ-СВ-ДМСО-раствора до тех пор, пока не будет получена лишенна  комков клеток суспензи . По 3 мл суспензии . клеток н нос т на предварительно (за 4 и 12ч) препарированные Ficol -градиенты и покрывают 2 мл не содержащего Ficoll ДМЕМ-СВ-ДМСО-раст вора. Пробирки с градиентами центрифугируют в ультраиентрифуге п течени 60 мин при 25 000 об/мин (31°С).

10

15

рп

о

24744

1о окончании цситр .ц угирон ии  CHi j xy раздольно собирают с помощью И1пи ч ци- oiiHi.iro шприца с длинно;; каню.пой макроскопически вилимь1С фракции (полосы ) , кажду:о разбалл ют питательной средой (ДНЕМ без Д1)бапок) , седимен- тируют путем центрифугировани  и снова суспендируют ц свежем ДМЕМ.

Получают следующие А фракции: а) клетки Debnis (на границе межд.у О и 12,5% Ficoll); б) лип1енные  дра цитопласты в области 15-16% Ficoll;

в)  дра без различимого ободка из плазмы и примерно 2% лишенных  дра клеток на границе между 17 и 25% Ficoll; г) содержащие  дра, интакт- ные по морфологическим критери м клетки с хороню различимым ободком из плазмы и немного ндер без ободка из плазмы в качестве седимента на дне пробирок.

Подсчет клеток показывает, что 8x10 Ag 8.653 - клеток в б содержит 1,25x10 цитопластов, в в. - 4x10 кариопластов и Р г)- 1,1x10 предположитель ю интактньгх Клеток.

Б. Сли ние клеток селезенки мыши с изолированными кариопластами миело0 мы, цитопластами миеломы и седимент- ными клетками миеломы из опыта А.

Б.1. Сп особствующее сли нию средство i 20 г полиэтиленгликол  (ПЭГ- 4000) расплавл ют в автоклаве, охлаждают до 56 С и при этой температуре смешивают с 20 мл ДМКМ;

HAT - селекционна  среда: ко всей среде ДНЕМ добавл ют аминоптерин

5

-4

0

5

0

5

(4x10 и), тимидин (1x10 М) и гипо- ксантин (3,1x10 и).

Сосуды дл  культивировани : кластер 24-тканевой культуры и кластер 96-тканевой культуры фирмы Cos tar, Камбридж, Масс., США.

Б. 2. Сли ни . Препарированные в опыте А фракции б, в и г раздельно смешивают с клетками селезенки в соотношении 10:1 и седиментируют путем центрифугировани . Падосадочную жидкость тщательно удал ют. К седименту добавл ют 0,8 мл 50%-ного раствора ПЭГ (при 37 С в течение 1 мин при посто нном м гком встр хивании) и затем 5 мл ДМЕМ (при комнатной температуре в течение 5 мин). Погле добавки следующих 20 мл ДМЕМ клетки седиментируют , повторно суспещгируют в свежей ДМЕМ -полной (полноценной) среде (5 мл) и размешают на ка) 10,

покрытые питающими клетками 24-ые Costar Tupfcl/Costar п тна, . Отдельные культуры корм т на каждый 1, 2, 3, 7, 10 и 13-й день с помощью ДИЕН-ПОЛНОЙ среды.

Клетки питающего организма (макрофаги брюшной полости), За день до сли ни  умерщвл ют инцухтныи мышей (Balb/c) путем выт жки. В стерильных услови х в брющную полость шприцом ввод т 4-5 мл PBS и спуст  1 мин снова отсасывают. Вымытые клетки промывают ДМЕМ, суспендируют в полной среде до плотности клеток 2x10 в 1 мл и порци ми по 0,5 мл размещают на 24-ьпс Costar Tupfel/CoБtar- п т- нах. .

Клетки селезенки. У одной Balb/c- мьши непосредственно перед сли нием в асептических услови х удал ют полностью селезенку и ее клетки суспендируют в ДНЕМ. Клеточные агрегаты и кусочки ткани отфильтровывают через марлю,

EL ISA на иммуноглобулине мьш1и. Пластинки дл  микротитра покрывают овечьими антителами на мышиный Ig(IgG- фракци ; 10 мкг/мл, 0,9%-ного раствора NaCl; 150 мкл раствора антител на Tupfel (пора, п тно). По 100 мкл культуральной надосадочной жидкости пипеткой внос т в покрытые п тна (Tupfel) и инкубируют 1 ч при KOMHat- ной температуре. После отсасывани  надосадочной жидкости и 2-кратной промывки Tupfel (пор., п тен) по- крьшают 100 мкл раствора конъюгата РОД с антимьш иным Ig (такое же антитело , как вьш1еуказанное, ковалентно св занное с пероксидазой хрена) и инкубируют 1 ч при комнатной температуре . После 3-х кратной промывки на Tupfel пипеткой нанос т 100 мкл раствора субстрата (ABTS) и фотометрически определ ют по вление ок- . раски.

Б.З. Препарированные согласно опыту А цитопластные, кариопластные и седиментные фракции параллельно подвергают сли нию с клетками селезенки Balb/c-мыши и размещают на каждые 10 по 1 мл культуры. По 5 частичных культур корм т без (пластина I) и по 5 с добавкий HAT (пластина II).

Вплоть до 21-го дн  после сли ни  ни в одной из п тнообразных пластин не обнаруживают макроскопически или микроскопически рост лимфоидных кле

ток, за исключением п тен 4А, 4В, 4С, ЗС и ЗД на пластине I, которые содержали продукт сли ни  (-Fusionat) седиментной фракции без НАТ-среды. В этих п тнах уже спуст  5 дн после сли ни  распознают колонии, которые быстро увеличиваютс . На 8-й день после сли ни  в зти п тна (Tupfel) добавл ют НАТ-среду: в течение 4 дн вследствие этого погибают все видимые колонии. Па 27-й день после сли ни  прежде всего разъедин ютс , затем примерно на всех п тнах станов тс  видимыми колонии, которые состо т из крупных шарообразных, прозрачных , растущих не сросшихс  клеток. На 65-й день после сли ни , за исключением I-3B, II-1A, I1-4A, все п тна зан ты множественными колони ми лимфоидных клеток. Исследование надосадочиой культуральной жидкости на содержание мьппиного Ig на этот день дает (см. табл. 1) от 5 положительньсх до сильно положительных значений в EL ISA во всех частичных культурах, за исключением вьшгеуказан- ных. не

5

0

содержащих колоний п тен,

Таблица 1

EL ISA дп  доказательства мышиного иммуноглобулина в надосадочной жидкости кулЪтуры опыта Б (65-й день после сли ни ) : (Tupfel) П тнообразна  пластина дл  культивировани  I : без ПАТ (исключени : 4А, 4В, 4С, ЗС, ЗД: + ПАТ,8-18 дни; 1 - продукт сли ни  цитоплас- тов; 2 - продукт сли ни  карио- пластов; 3 - продукт сли ни  седиментных клеток

55

f 2f

if

П тнообразна  пластина дл  культивировани  II: с ПАТ (1-14 дни отрицательна  культура 1 (ДМЕМ-полна 

7142А

среда): 010; отрицательна  культура 2 (Д1КМ, без FKS): 040; положительна  культура 1 (мьпиипа  сыворотка ): : 723; положительна  культура 2 (мышина  сыворотка 1x10 ): ISOO

Г

8

8x10 liS Sultan-KJieroK n ШО мл R PMl 1640 - пслиой среды, котора  содержит 20 (Ц М 8-Ag, культивируют 48 ч. Перехчившие клетки помещают в 10 мл PI1I 1640-полиой среды без 8Ag и выращивают 10 ди. Клетки затем высевают на пластины из м гкого агара, которые бьиж приготовлены

с помощью R PMI 1640-полной среды + 20 л М 8-Ag (примерно 500 клеток на чашку Петри), и помещают в .кубатор. Спуст  9 дн стерильно отдел ют изолированно выросшие колоНИИ от поверхности агара и размножают в -R PMI 1640-полной среде + 8-Ag. Клон (обозначаетс  в виде HS- SULTAM-8 Ag-Rl), который вырос при удвоенном времени (примерно 20 ч)

примен етс  дл  следующего опыта. HS-R1 клетки НАТ-чувствительны:

1 2 Как видно из

3

табл. 1, сли ние кариопластов с клетками мьпчиной селезенки приводит к in vitro размножающимс , выдел юпщм иммуноглобулин клеткам. Хот  только мала  часть цитоплазмы злокачественного партнера вводитс  в гибрид, он не приводит к возможной экстинкиии признака пер- мaнe тнoгo роста. При этом полученные с кариопластами гибридные клетк синтезируютс  и выдел ют мышиньц иммуноглобулин в гибридомных количествах . Отсутствие доли цитоплазмы Ag 8.653 не нарушает соответственно этой продукционной и секреционной способности гибридов кариопласта с клеткой селезенки. Кроме того, из сли ни  цитопластов с клетками селезенки также следуют клоны клеток, которые in vitro пролиферируют и выдел ют антитела.

Пример 2. Фрагментаци  клеток посредством лизиса глицерином и сли ние с человеческими лимфоцитами крови.

Балансирующий солевой раствор Earle (EBSS), питательна  среда RPMI 1640, эмбриональна  тел чь  сыворотка (FKS) Boehringer Mannheim 8-азагуанин (8-Ag) Serva (Гейдельберг), Агар (бакто-агар 1614 Difco - фирма Гедингер КГ, Штутгарт)

Человеческа  плазмоцитомна  лини  HS SULTAN АТСС СР. L-1484 в виде кри- огфедохраненного клеточного материала оттаиваетс  по предписанию АТСС и культивируетс .

5

 

НАТ-среде с плотностью (1-5)х10 на 1 мл (R PMI-1640-полна  среда с

5 0,1 ммоль гипоксантина, 400 И ами- ноптерина, 31 .иМ тимидина), не размножаютс  и в течение 7 дн полностью погибают.

Человеческие лимфоциты (из пери0 ферической крови: PBL): 300 мл

венозной крови стерильно собирают в гепариновый раствор (2 ед/мл крови) и стандартными методами выдел ют фракцию моно дерных клеток (ШС: лимфоциты, моноциты), 3x10 МКС суспендируют в 100 мл R PMI 1640х х10% FKS и дл  отделени  моноцитов инкубируют 24 ч в сосуде дл  культивировани  при 37 С в атмосфере, со0 держащей 5% СО.

Фрагментаци  клетки нагружаютс  гл;1церином и подвергаютс  лизису путем инкубации в 10 /liM трис-НС1-буфере. Ядра отдел ют от мембранных пузырьков путем центрифугировани  при ускорении 200 g (10 мин, 4 С), эти пузырьки, со своей стороны, седиментируютс  путем центрифугировани  при 5000 g (40 мин, ° 4°С).

Сли ние. Примерно 1x10 729 liS-R I  дер с человеческими лимфоцитами суспендируют в R PMI 1640 в соотношении 1:1 и подвергают сли нию посредством ПЭГ, как в примере 1, п. Б 2.

Седимент мембранных пузырьков

О

примерно из 1x10 HS-R I клеток покрывают суспензией 1x10 человеческих

5

5

лимфоцитов и подвергают сли нию посредством ПЭГ.

В контрольной смеси примерно 2x10 HS-RI  дер поглощаютс  (раствор ютс ) в R PMI 1640-полной среде (без HAT) и культивируютс  в А-х, 2А-Х Costar-Tupfeln (Costar- п тен) в СО -инкубаторе.

Все слившиес  клетки (Fusionate) и контрольные культуры культивируютс на макрофагах брюшной полости мыши, как в примере 1, в качестве клеток питающего организма.

Доказательство человеческого Ig в надосадочной жидкости культуры: микротитр-Elisa, как в примере 1, п. Б.2. Дл  покрыти  примен ют имму- ноадсорбционно очищенное овечье антитело на человеческий Ig. Така  же АК-препараци  используетс  дл  приготовлени  конъюгата POD с человечески анти-Ig. Овечь  АК реагирует со всем классами человеческих Ig и не про вл ет никакой перекрестной реакцион- носпособности с бычьим или мышиным Ig.

Фрагментаци  благодар  лизису с помощью глицерин-трис-НС1. Обработка разлагает HS-RI-клетки на содержащую  дра фракцию, котора  седименти- руетс  при 200 g, и на лишенную  дер цитоплазмамембранную пузырькову фракцию, котора  седиментируетс  при 5000 g. Под микроскопом не видны ни в одной из обеих фракций интактные nS-Rl-клетки. Ядра окружены более или менее нерегул рно ограниченными обрывками цитоплазмы. Подсчет дает выход  дер 85%. Пузырькова  фракци  содержит нар ду с небольшим количеством осколков (остатков) в большом количестве пузырьки величиной 0,5- -2 1цМ без распознавае лк составньсх частей  дер.

Культивирование 2x10  дер в R РМ1-ПОЛНОЙ среде (без ПАТ) не приводит на прот жении 12 дед ни к какому росту HS-RI-клеток.

Культивирование слившихс  клеток. Слившиес  клетки (Fusionate)  дра- пимфоциты и цитоплазма - пузырьки- лимфоциты размешиваютс  на 96, соответственно 102А-Х Costar Tupfeln (Costar- п тен) и культивируютс  каждый наполовину с или без добавки HAT и R PMI-полной среде на макрофагах мышей. С 2-й недели после сли ни  по вл ютс  колонии лимфоидных

клеток, которые непрерывно увеличиваютс  по размеру.

Продуцирование человеческого им- i муноглобулина. Па 21-й день после сли ни  надосадочную жидкость культуры (на 19-й день произведена полна  замена среды) исследовали на содержание человеческого иммуноглобулина. Результаты представлены в табл. 2а и б.

Таблица 2а.

EL ISA дл  доказательства человеческого иммуноглобулина в надосадочной жидкости культуры (сли ние кариопластов, 21-й день после сли ни )

I + HAT

II142- 744

Таблица 2б

Сли ние цитопластов , 21 -и день после сли ни ,где 1 -  дерна  контрольна  культура; 2-с HAT; 3 - без ПАТ.

экс риц зна

Таким образом, слившиес  клетки (Fusionate) , которые пригото влены с помощью лизисных фракций, могут культивироватьс  без НАТ-селекции. Способ намного менее требует затрат на работу, чем экструзи  цитохалази- ном В, и дает способный к сли нию материал с высоким выходом. Четкое разделение  дерных и цитоплазма- мембранных фракций не достигаетс  ни одним из обоих способов. Как содержаща  преобладающе  дерный материал , так и также содержаща  преобладающе цитоплазма-мембранные пузырьки фракци  после сли ни  с человеческими лимфоцитами из крови дает in vitro способные размножатьс , АК - продуцирующие клеточные клоны.

Параллельна  смесь  дра - лимфоциты - гибриды с и без добавки HAT показывает отрицательные воздействи  селекционной среды: с HAT 23% первичных культур Ig - отрицательно и

44

1 2

Если устанавливают величины экстинкцин 0-99 как от от - рицательных до сомнительных , значени  100 - 200- как поло жи тельные

значени  более 200

положительные

то

как сильно дл  полбенных путем сли ни   дер культур получаетс  рас - пределение , которое представлено в табл. 3.

Таблица 3

0

только 40% сильно положительно; без HAT свыше 70% сильно положительно и только 4% Ig - отрицательно.

Пример 3. Сли ние клеток селезенки иммунизированной мыши с нативными и фрагментированньши клетками миеломы Ag8.653.

Человеческий стимулирующий Thyrcoi- еа гормон .(hlSll) и его изолированна  р-цепь (p-hTSH) происходит из Boehringer Mannheim, комплек гной и некомплектной добавки Freund (CFA, IFA) Difco, метоцелий 1500 FI и КА- и FITC - covaspheres von covalent Techn. CO. Ann. Arbor. Мичиган, США.

0

Иммунизаци : Balb/c-мыши первично иммунизировались с помощью/5-hTSH gg (40 мкг в CFA, интраперитонеально, 1-й день) и реиммунизировались на 196-й день с помощью hTSH (50 мкг в IFA, интраперитонеально) , на 266-й день с помощью hTSH без добавок интраперито131

иеально, а также на 294-й день с по- моцью hTSH внутривенно.

Клетки селезенки (примерно 1X10 ) получают из одной из иммунизированны мьппей спуст  3 дн после последней реиммулиза1и1и, как в примере 1, п. Б.2, и используют по половине дл  двух сли ний.

Сли ние 1. 5x10 клеток Ag 8.653 смешивают, подвергают сли нию, как примере 1, п. Б.2, и культивируют в 48 2А-Х Tupfel (п тен) с помощью клеток макрофагов мьшей в содержащей ПАТ ДНЕМ-ПОЛНОЙ среде.

Сли ние 2. 1х10 клеток Ag 8.653 подвергают лизису, как в примере 2, благодар  постепенной обработке с помощью глицерина и 10 juM трис-НС1- буфера. Цитоплазма - мембрано-пу- зырькова  (CIIV) фрак1а1  гранулируетс  (5.000 g, АО мин, 4°С). Ядерна  фракци  смешиваетс  с 7x10 клеток селезенки, путем центрифугировани  наслаиваетс  на CHV-седимент и по способу, как в примере 1, п. Б.2, посредством ПЭГ подвергают сли нию. Продукт сли ни  распредел ют в ДМЕМ- полной среде на 24-х 24-ьгх Costar- (Costar- nHTeH)-с макрофагами и культивируют без добавки HAT

Специфическое дл  антигенов маркировки гибридных клеток клонирование : (F1TC) Covaspheres ковалентно нанос т с помощью hTSH (TSH-CS) и хран т в 5%-ном растворе азида натри . Клетки маркируют нанесенными Covaspheres и раскладывают с помощью цитофлю- орографа крупные, обладающие положительной флуоресценцией, клетки отдельно B-Tupfel (п тно) и 96-ые Costar пластины. П тна (Tupfel) i раньше (на 24 ч) покрываютс  мьшины- ми макрофагами в ДМЕМ-полной среде.

EL ISA дл  TSH - специфических антител. Покрытие, инкубаци  культу- ральной надосадочной жидкости, реакци  субстрата и отделение,как в примере 1, п. Б.2. Вместо конъюгата мышиного анти-Ig-POD примен ют TSH- -POD-конъюгат. В качестве положительного контрол  используют сыворотку hTSH - гипериммунизированной мыши, разбавленную в : в качестве отрицательного контрол  служит клон, антитело которого образовано против неприменениого антигена (антидигок- син мыши).

4414

Таким образом, как з культурах из сли ни  1 (с интактными Ag8.653- клетками), так и также таковые из сли ни  5 (с фрагментами Ag 8.653- лиэиса), на 14-й день во всех п тнах по вл ютс  колонии больших лимфоидных клеток.

Результаты осуществленного на

14-й день с культуральной надосадочной жидкостью ELISA дл  доказательства TSH - специфических антител эксперимента представлены в табл. 4 (во всех частичных культурах про вл етс  анти-TSH).

Таблица 4

ELISA дл  доказательства анти- TSH в культуральной надосаточной жидкости на 14-й день после сли ни  (синтеза): а) сли ние 1 (интактный Ag 8.653); б) сли ние (синтез) 2(фрагменты Ag 8.653); отрицательный контроль

(даШМ-полна  среда):000; положительный контроль (анти-TSH - мьшинна  сыворотка) : 362

30

а)

IIIIIIIIl22I 3 4lIIIIlIIIl

А 235 236 212 149 119 212

В109221 119 104176068

С116108 135 139093135

D171128 120 228137145

45 А 271 268 267 286 191 .291 В 288 278 362 317 280 305

С 207 292 252 226 292 271

D 295 376 370 338 310 333

На 15-й день неслившиес  клетки 55 из отдельных п тен сли ни  1 и 2 вымывают и раздельных основани х маркируют специфически TSH-антигеном (основание: гибридомы как правило в качестве В-лимфоцитов несут скрепленно часть синтезированных ими молекул антител н клеточных мембранах, вместе с направленными наружу местами св зывани  антигенов) и клонируют с помощью клеточного классификатора .

Пример 4. Сли ние человеческого PBL с интактными и фрагменти рованными Ag 8.653 клетками.

Инактивированный на поверхности Hepatisis-В-антиген (НВ,; биотест) очищаетс  путем иммуноадсорбции, протеинов сыворотки. EL ISA дл  доказательства человеческих EBg -антител пластины дл  микротитра покрывают очищенным ЕВ 5; (20 ед./мл, 0,9%-ный раствор NaCl) Инкубаци  культураль- ной надосадочной жидкости, реакции конъюгата и субстрата, а также отторжение , как в примере 1, п. Б.2. Вместо антимышиного Ig-POD используют овечий-античеловеческш Ig-POD.

HPBL донора с высоким анти-НВ - титром вьщел ют из 200 мл венозной крови пу тем центрифугировани  по градиентам Ficoll. Дл  увеличени  (количества) В-лимфоцитов Т-клеткам придают форму с помощью овечьих эритроцитов и отдел ют розетки с помощью второго центрифугировани  с градиентами по Ficoll. Фракцию необразующих розетки клеток (HPBL(B)) культивируют при плотност 5x10 клеток в R PHI 1640 + 10% аутологичной плазмы (активируетс  в течение 30 мин при нагревании до 56°С) примерно с 10 мкг в инкубаторе (смена среды каждые 12ч).

Сли ние 1:1x10 предварительно обработанного HPBL(B) смешивают с 1x10 Ag 8.653 и, как в примере 1, п. В.2, подвергают сли нию посредством ПЭГ. Продукт сли ни  культивируют в R PMI 1640 10% человеческой плазмы + HAT в 4-х 24-ых Costar-Tu pfeln (Costaг- п тeн) .

Сли ние 2x1,1x10 Ag 8.653 клеток фрагментируют с помощью глицеринового лизиса. 1x10 Ag 8.653  дер смешивают с 1x10 HPBL(B) и нанос т на седимент пузырьков мем- бранной цитоплазмы (из 1x10 Ag 8.653 клеток). После сли ни  с ПЭГ продукт сли ни  культивируют в 4-х 24-ых Costar-Tu pf eln в R PMI 1640 + + lOZ человеческой плазмы (без добавки ПАТ) .

Во всех п тнах сли ни  1 и 2 на З-й день по вл етс  сильный рост очень крупных слипшугхс  клеток, На 5-й день основную массу не сл1т- шихс  клеток осторожно суспендируют и распредел ют на две новые 24-е Costar Tupfelo (например, в Al, В1 и С1). На 28-й день в сли нии 1: ма- ленькие колонии в А2 и A3, в остальных п тнах только слипшиес  клетки; в сли нии 2: массивньй рост множественных колоний во всех п тнах, за исключением СЗ. Осуществленный с культуральной надосадочной жидкостью на день ELISA дл  доказательства человеческого иммуноглобулина со специфичностью против Hepatitis-В-анти- гена дает (см. табл. 5) результат: сли ние 1 (интактные Ag 8.653 клетки, культивирование в НАТ-среде) не дает никакой положительной культуры; напротив , 5 из 12 культур сли ни  2 (Ag 8.653 фрагменты, культивирование в нормальной среде) отчетливо анти- НВд положительны.

Таблица 5

EL1SA дл  доказательства человеческой анти-HBs в культуральной надосадочной жидкости в день 35 после сли ни : а) сли ние 1 (ин- тактный Ag 8.653)j сли ние 2 (фрагменты Ag 8.653); отрицательный контроль (анти-НВ - отрицательна  человеческа  сыворотка): :000; положительный контроль (анти-НВд - положительна  человеческа  сыворотка) : 185. а)

б)

5

А 010 В 000 С 000

000 003 173

189 553 198 032 000 107

17

Пример 5. Сли ние liPBL с фрагментами из линии челонечоской плазмацитомы IIS SUl.TAN.

US SULTAN относитс  к американской коллекции типов культур (ЛТСС) под кодовым номером CR L-148A в качестве криопредохран ющегос  клеточного материала и оттаиваетс  по АТСС-пред- писанию и культивируетс .ю

HPBL, как в примере 4, приготовл етс  одинаковыми донорами и реимму- низируетс  in vitro с НВ

ют 1 мл растрора ПЭГ, После минутого воздействи  ПЭГ - раствор разбавл ют путем добавк и К I flI-1640- питательной среды и путем центрифугировани  отдел ют от клеток. Клетки внос т в R РМ1-среду с 20% плодной (зародьшшвой) тел чьей сыворотки

(FKS, ВМ), распредел ют на 12 п тен

Ч;

15

35

Сли ние: 4x10 MS SULTAN клеток фрагментируют посредством лизиса с глицерином. Пузырьковые фракции мембранной цитоплазмы ссдиментируют при 5500 g (АО мин) и затем нанос т смесь примерно 4x10 HS SULTAN  дер и Ах 10 liPBL(B). ПЭГ - сли ние осуществл етс  по примеру 4, Посев продукта сли ни  осуиествл етс  на 12 2А-НЫХ Costar-fupfeln в R PMI 16АО + 20% FKS + пируват + инсулин (NOVO 2 ед/мл) + 1% не основных аминокислот (ВМ) 1% метоцели  1500 без добавки HAT.

Па 1А-Й день после сли ни : рост больших, неслипшихс  лимфо1щных лоний клеток.

Пример 6. Обессмертивание человеческих Т-лимфош1тов.

Т-лимфоциты выдел ют с помощью стандартного способа (придание формы розетки с помощью овечьих эритроцитов, центрифугирование с градиентами по Ficoll) из общей фракции лимфоцитов и тотчас или после 3-дневного культивировани  обрабатывают Ehrlich асцитные клетки (АТСС; CCL 77) культивируют в ДМЕИ с 10%-ной лошадиной сыворо -кой и они служат в качестве донора трансформирующих фрагментов. Фрагментацию EAZ осуществл ют с помощью глицеринового лизиса. Содержащую преобладающе материал  дер фракцию отдел ют путем центрифугировани  и отбрасывают . Дл  трансформации используют обогащенную митохондри ми цитоплазма- тическую мембрана-пузырьковую фракцию .(QIV) 5x10 Т-лимфоцитов, нагружают избытком РИА-лектина (Difco), смешивают с СГЛ -фракцией из EAZ и ий- кубируют 20 мин при комнатной температуре . Смесь седиментируют путем центрифугировани , остаточную над- осадочную жидкость удал ют и замен дл  культивировани  по 1 мл и культивируют при 37°С в содержащей 5% COj-атмосфере. Охарактеризовывание клеток осуществл ют руководству сь поверхностными признаками посредством овечьих эритроцитов (Е) - розе- тировапис и посредством иммунофлу- оресценции при применении обоих специфических дл  Т-клеток антител ОКТ-3 и флуоресцентно маркированного 20 античеловеческого иммуноглобулина (Ig, фирма Дако) дл  доказательства типичного дл  В-клеток мембранного Ig.

В течение первых 1А дн больша  25 часть клеток в культурах погибает. На 21-й день в клеточных остатках колоний про вл ютс  от маленьких до средних размеров клетки, которые непрерывно размножаютс . Рост колоний ко- 30 обнаружен во всех 12 Tupfе1п- п тнах , а именно вплоть до 50 колоний на п тно. На 30-й день колонии nepie- вод т в более крупные сосуды дл  культивировани  и размножают далее. Клетки анализируют, руководству сь их поверхностной маркировкой, и получают следующие результаты, %:

Е-розетки - положительные

ОКТ-3 - положительные

А-11 - положительные

Igs положительный

Фрагменты, которые могут получатьс  из EAZ (перманентна  лини  клеток мышей) с помощью глицеринового

лизиса, после ПЭГ-сли ни  с изолированными Т-лимфоцитами производ т перманентно растущие в культуре клетки, которые на основании их поверхностной характеристики четко идентифицируютс  как Т-лимфоциты.

Пример 7. Придание бессмертности человеческим клеткам эндотели .

Все сосуды дл  культивировани  перед посевом клеток покрывают желатиной , Питательна  среда состоит из (1:1) смеси R PMI-16AO и среды 199 (ВМ) с 20% FKS. ЧeJroвeчecкиe клетки эндотели  получают посредством раствора коллагеназы (Cibco) из вен

40

95 90 90 5,

45

50

4Д18

ют 1 мл растрора ПЭГ, После минутого воздействи  ПЭГ - раствор разбавл ют путем добавк и К I flI-1640- питательной среды и путем центрифугировани  отдел ют от клеток. Клетки внос т в R РМ1-среду с 20% плодной (зародьшшвой) тел чьей сыворотки

(FKS, ВМ), распредел ют на 12 п тен

Е-розетки - положительные

ОКТ-3 - положительные

А-11 - положительные

Igs положительный

95 90 90 5,

свеж1гх пуповин и перед трансформацией размножаютс  в течение 14 дн благодар  предрасположению первичной культуры. Дл  трансформации растущие как слипшиес  клетки эндотели  отдел ют посредством растворм трипсина с EDTA (ВМ) и в суспензии, как описано в примере 6, подвергаютс  сли нию с С1(У-фракцией из EAZ. Таким образом обработанные клетки высевают в сосуд дл  культивировани  емкостью 75 см при плотности клеток 5x10 на один сосуд и культивируют в COj-инкубаторе . Дл  контрол  при необходимости аликвотную часть клеток эндотели  из первичных культур без фракции CIIV обрабатывают ПЭГ-раствором (кажущеес  сли ние) и повторно культивируют. Как только клетки на дне сосуда дл  культивировани  образуют сплошные клеточные газоны, то их отдел ют с помощью трипсин-EDTA - раствора и в соотношении 1:3 перенос т в свежи сосуд дл  культивировани  (-пассаж).

Подвергнутые с помощью CMV-фракци сли нию клетки эндотели  после посева прилипают с эффективностью 20-30% и вырастают в течение 2-3 дн до сливающихс  клеточных газонов. Кажущиес  слившимис  клетки прикрепл ютс  примерно с одинаковой эффективностью , однако они едва размножаютс  и в течение 21 дн полностью погибают, не образу  сливаюш хс  клеточных: газонов. Совершенно необработанные клетки эндотели  размножаютс  до максимальной величины при 3-м пассаже, затем рост останавливаетс , их освобождают при скатывании со дна сосуда дл  культивировани  и подвергают лизису. В 8 различных сосудах с клетками эндотели  из в целом 18 различных пуповин вырастают, без вс ких проблем CIIV-обработанные клетки .в течение 10-го пассажа. Трансформированные клетки эндотели  без потерь в жизнеспособности и способности к делению могут утверждатьс  в жидком азоте..

Человеческий пуповинные клетки эндотели  без трансформирующей мани- пул щт согласно изобретению могут культивироватьс  в течение не более 3-х пассажей. Путем сли ни  обогащенной митохондри ми CMV-фракции из ас- цитных клеток Эрлиха свойства культуры клеток эндотели  измен ютс  так, что они без вс кой, проблемы

размножаютс  свыше критического 3-го пассажа (найдено, что в 23-ем пассаже

клетки наход тс  без  влений усталости ) .

Пример 8. Придание бессмертности человеческим меланомным клеткам .

Содержащую клетки меланомы ткань получают путем хирургического иссе- кани  метастаз подвздошных лимфатических узлов, разрезают в стерильных услови х на маленькие кубики и хран т вплоть до сли ни  в сжиженном азоте. СМУ-фракции из EAZ готов т, как в примере 6.

Перед сли нием содержащий меланом- ные клетки материал оттаивают и посредством обработки трипсином готов т суспензию из отдельньк клеток. Фракцию больших, пигментированных в красно-коричневый цвет меланомных клеток путем центрифугировани  с градиентами по Ficoll освобождают от сопровождающих лимфоцитов и как в примере 6 подвергают сли нию с CMV-фракцйей при воздействии ПЭГ (примерно 4х10 меланомных клеток с CMV из примерно 1x10 EAZ). Дл  контролировани  сли ни  служат 4x10 меланомных клеток, которые обрабатываютс  без CMV с помощью ПЭГ. Клетки после сли ни  высевают при их плотности 1x10 на Tupfel (п тно) в R PMI 1640 + 20% FKS и культивируют при в содержащей 5% COj -атмосфере.

40

45

50

55

Во всех 4-х частичных культурах подвергнутые сли нию с CMV-клетки меланомы на 28-й день вырастают в колонии типично пигментированных клеток в форме полуслипшихс  клеточных груд, которые непрерывно увеличиваютс . В контрольной культуре псевдослившиес  клетки не дают никакого размножени  клеток, напротив, клетки на 8-й день показывают уве- личива1бщсес  гранулирование и на 22-й день в культуре наблюдают только обломки клеток.

Человеческие меланомные клетки из криопредохраненной метастазной ткани путем CriV-сли ии  могут трансформироватьс  в способные размножатьс  и культивироватьс  in vitro клетки . Псевдослившиес  меланомные клетки равного происхождени , напротив, по211

гибают даже при идентичных услови х культивировани .

Claims (3)

1. Способ получени  перманентно растущих животных и человеческих клеток путем сли ни  нормальных животных или человеческих клеток в присутствии полиэтиленгликсл  или вируса , отличающийс  тем, что, с целью упрощени  способа, нормальные животные или человеческие клетки подвергают сли нию только с кариопластами,.цитопластами,  дерной фракцией и фракцией цитоплазмы.

2474422

обогащенной митохондри ми лимфатических или эпителиальных опухолевых клеток.

2. Способ по п. 1, отличающий с   тем, что перед сли нием кариопласты и цитопласты обрабатывают цитохалазином.

10

3. Способ по п. 1,отличаю- щ и и с   тем, что  дерную фракцию и фракцию цитоплазмы получают путем механического разрушени  или лизиса в глицерине,

15 Приоритет по пунктам 04.05.82 по пп. 1-3; 09.12.82 по п. 1.